JP2016014660A - 免疫調節物質の同定方法及びシステム - Google Patents
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Abstract
【解決手段】候補細菌物質を、T細胞と接触させることと、IL−10、Foxp3、TGFβ1、TGFβ2、パーフォリン及びグランザイムBからなる群より選択される一つ以上の抗炎症性バイオマーカーの発現、或いは、IFNγ、IFNα、IFNβ、IL−1β、IL−4、IL−5、IL−6、IL−8、IL−9、IL−13、IL−21、IL−22、IL−23、IL−17及びTNFαからなる群より選択される一つ以上の炎症性バイオマーカーの減少濃度若しくは発現を検出すること、及び接触の後の、一つ以上の抗炎症性バイオマーカーの発現の増加、或いは、一つ以上の炎症性バイオマーカーの発現の減少の検出を通じて候補細菌物質の抗炎症性能を決定する工程を含む。
【選択図】図11
Description
本出願は、2009年4月23日に出願され、“抗炎症性特性を有する細菌のためのハ
イスループットスクリーン”と題名を付された米国仮出願第61/172,101号(事
件整理番号CIT−5354−P)の優先権を主張するものであり、その開示の全てを参
照して本明細書に組み込む。
国立衛生研究所から与えられた助成金第DK078938号に従って、アメリカ合衆国
政府はこの発明において所定の権利を有する。
関するものである。
ステムの発達と機能とに大きな影響を有する非常に多くの微生物(腸内細菌叢として知ら
れる)を宿している。哺乳類の消化管に生息する細菌の無数の種のうち、バクテロイデス
門は最も豊富なグラム陰性菌の門である。
共生微生物である。特に、バクテロイデス・フラジリスの免疫調節特性は、該細菌による
多糖類A(PSA)の産生に関連している。
疫システムへ伝え、そして免疫調節特性を発揮するメカニズム及び/又は分子トリガーの
同定は困難とされている。
方法並びにシステムがここに提供される。特に、本明細書に提供されるのは、いくつかの
実施形態において、バクテロイデス・フラジリスの免疫調節応答に匹敵する免疫調節応答
を個体中に引き起こすことができる細菌物質の同定を可能にする方法及びシステムである
。
記載される。前記方法は、候補細菌物質を、単独で、或いは、抗原提示細胞の存在下でT
細胞と接触させることと、IL−10、Foxp3、TGFβ1、TGFβ2、パーフォ
リン及びグランザイムBからなる群より選択される一つ以上の抗炎症性バイオマーカー、
並びに、IFNγ、IFNα、IFNβ、IL−1β、IL−4、IL−5、IL−6、
IL−8、IL−9、IL−13、IL−21、IL−22、IL−23、IL−17若
しくはTNFαからなる群より選択される一つ以上の炎症性バイオマーカーの、少なくと
も一つの発現を検出することとを含む。前記方法は、前記接触の後の、一つ以上の前記抗
炎症性バイオマーカーの前記発現の増加、或いは、一つ以上の前記炎症性バイオマーカー
の前記発現の減少の検出を通じて前記候補細菌物質の抗炎症性能を決定することを更に含
む。
記載される。前記方法は、候補細菌物質を抗原提示細胞と接触させることと、前記接触の
後に前記抗原提示細胞をT細胞とインキュベートすることを含む。前記方法は、IL−1
0、Foxp3、TGFβ1、TGFβ2、パーフォリン及びグランザイムBからなる群
より選択される一つ以上の抗炎症性バイオマーカー、並びに、IFNγ、IFNα、IF
Nβ、IL−1β、IL−4、IL−5、IL−6、IL−8、IL−9、IL−13、
IL−21、IL−22、IL−23、IL−17若しくはTNFαからなる群より選択
される一つ以上の炎症バイオマーカーの、少なくとも一つの発現を検出することを更に含
む。また、前記方法は、前記インキュベートの後の、一つ以上の前記抗炎症性バイオマー
カーの前記発現の増加、或いは、一つ以上の前記炎症性バイオマーカーの前記発現の減少
の検出を通じて前記候補細菌物質の抗炎症性能を決定することを更に含む。
として方法が記載される。前記方法は、トランスジェニックマーカー非ヒト動物を、候補
細菌物質で処理することを含み、前記トランスジェニックマーカー非ヒト動物は、遺伝子
的に修飾されて、IL−10、Foxp3、TGFβ1、TGFβ2、パーフォリン及び
グランザイムBからなる群より選択される一つ以上の標識化抗炎症性バイオマーカー、並
びに、IFNγ、IFNα、IFNβ、IL−1β、IL−4、IL−5、IL−6、I
L−8、IL−9、IL−13、IL−21、IL−22、IL−23、IL−17又は
TNFαからなる群より選択される一つ以上の標識化炎症性バイオマーカーの、少なくと
も一つを発現する。前記方法は、前記処理の後の、一つ以上の前記抗炎症性バイオマーカ
ー、或いは、少なくとも一つの前記炎症性バイオマーカーの少なくとも一つの、トランス
ジェニックマーカー非ヒト動物における発現を検出することと、前記処理の後の、一つ以
上の前記抗炎症性バイオマーカーの前記発現の増加、或いは、一つ以上の前記炎症性バイ
オマーカーの前記発現の減少の検出を通じて前記候補細菌物質の抗炎症性能を決定するこ
ととを更に含む。
テムは、本明細書に記載された抗炎症性細菌物質を同定する方法における同時、組み合わ
せまたは連続使用のために、T細胞と、抗原提示細胞と、IL−10、Foxp3、TG
Fβ1、TGFβ2、パーフォリン及びグランザイムBからなる群より選択される一つ以
上の抗炎症性マーカー、並びに、IFNγ、IFNα、IFNβ、IL−1β、IL−4
、IL−5、IL−6、IL−8、IL−9、IL−13、IL−21、IL−22、I
L−23、IL−17又はTNFαからなる群より選択される一つ以上の標識化炎症性バ
イオマーカーの少なくとも一つの検出するための試薬と、の少なくとも二つを備える。
能な、医学的、薬学的、獣医学的な用途、並びに、基礎生物学研究及び様々な用途に関連
して使用されることができ、ここで、物質の免疫調節能、特に抗炎症性能を調査すること
が望ましい。
らかにされている。他の特徴、目的、および利点は、説明及び図面、並びに特許請求の範
囲から明らかになる。
の一つ以上の実施形態を示し、発明の詳細な説明及び実施例の部分と共に、本開示の原理
および実装を説明するために役に立つ。
ている。
態を促進する能力を意味する。具体的な免疫調節特性は抗炎症性特性を含み、ここで、用
語“抗炎症性”は、炎症を防ぐ若しくは低減する物質又は処理の特性を指す。
損傷細胞、又は刺激物質などの有害な刺激に対する、個体の維管束組織の複雑な生物学的
応答を意味し、またサイトカイン、より具体的には炎症誘発性サイトカイン(すなわち、
ミクログリアなどの活性化免疫細胞によって主に産生され、炎症性応答の増幅に伴われる
サイトカイン)の分泌を含む。例示的な炎症誘発性サイトカインは、限定されないが、I
L−1、IL−6、TNF−α、IL−17、IL−21、及びIL−23を含む。例示
的な炎症は、急性炎症及び慢性炎症を含む。本明細書で使用される単語“急性炎症”は、
血漿及び白血球による組織の浸潤に起因する、炎症の典型的兆候(腫れ、発赤、痛み、熱
、および機能の喪失)を特徴とする短期的過程を意味する。急性炎症は、一般的に傷害性
刺激が存在するかぎり発生し、そして刺激が、瘢痕化(線維症)によって除去され、壊滅
され、又は遮断されると急性炎症が止む。本明細書で使用される単語“慢性炎症”は、同
時発生性活動性炎症、組織破壊、及び修復の試みを特徴とする状態を意味する。慢性炎症
は、上記の急性炎症の典型的兆候によって特徴付けられない。代わりに、慢性的に炎症を
起こした組織は、単核免疫細胞(単球、マクロファージ、リンパ球、および形質細胞)の
浸潤、組織破壊、並びに血管新生及び線維症を含む治療の試みにより特徴付けられる。
。用語“細菌物質”とは、生きた細菌、死んだ細菌、及び特に加熱死菌、細菌抽出物、細
菌由来の精製分子、細菌から精製された分子の組み合わせ、又は細菌から若しくは細菌由
来の精製小胞から精製された一つの分子を若しくは分子の組み合わせを含む小胞などの細
菌由来の物質を意味する。特に、細菌物質は、細菌の表面から放出される小胞であって、
遠隔の標的細胞へ一連の積み荷分子を運ぶ膜外小胞により形成され得る。細菌物質は、同
じ細菌から誘導した物質及び二つ以上の異なる細菌から誘導した物質を含む。
を有している単細胞、原核細胞、微生物の大きなグループを意味する。特に、本開示の意
味における細菌は、ヒトフローラの細菌、すなわち、ヒト組織の表面上並びに内部及び体
液中、例えば、皮膚の深層、唾液中、口腔又は膣粘膜中及び消化管中に宿る微生物の集合
を含む。細菌フローラは、腸フローラ(ヒト消化管において検出可能な細菌)、膣内フロ
ーラ(女性ヒトにおいて子宮から身体外側へつながる線維筋管路中において検出可能な細
菌)及び皮膚フローラ(ヒト皮膚において検出可能な細菌)を含む。さらに、特に、本開
示の意味における細菌とは、腸フローラの一つ以上のバクテロイデス門、特に、一つ以上
のバクテロイデス属(ヒトと共生し、当業者によって識別可能である、グラム陰性の非芽
胞形成嫌気性桿菌の属)により形成され得る。代表的なバクテロイデス属の細菌は、バク
テロイデス・フラジリスである。
マーカーおよび/または抗炎症性バイオマーカーの検出により決定され得る。本明細書で
使用される用語“バイオマーカー”は、細胞周期の段階、生物学的プロセス、並びに健康
状態及び疾患状態のような、生物学的状態の指標として使用される物質または特徴を意味
する。バイオマーカーの存在、欠如、減少、発現上昇は、特定の状態に関連しており、ま
た特定の状態を表示している。特に、本明細書に使用される用語“炎症性バイオマーカー
”は、炎症状態の存在を表示しており、IFNγ、IFNα、IFNβ、IL−1β、I
L−4、IL−5、IL−6、IL−8、IL−9、IL−13、IL-21、IL-22
、IL−23、IL-17、TNFα、並びに当業者により同定可能な追加の細胞マーカ
ー及びサイトカインを含むバイオマーカーを意味する。本明細書に使用される用語“抗炎
症性バイオマーカー”は、炎症状態がないことを表示し、Foxp3、IL−10、TG
Fβl、TGFβ2、パーフォリン及びグランザイムB並びに当業者により同定可能な追
加の細胞マーカー及びサイトカインを含むバイオマーカーを意味する。
は多くの遺伝子工学的操作のうちの任意の操作により移植された非天然の遺伝子材料を有
する動物を指す。そのような非天然の遺伝子材料(又は導入遺伝子)は、“バイオマーカ
ー”(本明細書で定義される)として作用し得、及び/又は非ヒト動物においてRNA若
しくはタンパク質を産生する能力を保持し得る。
細胞により、炎症性又は抗炎症性バイオマーカーの発現を検出することにより実行される
。
、リンパ球(白血球の一種)の亜群を意味する。本開示によるヘルパーT細胞は、エフェ
クターTh細胞(Th1、Th2、及びTh17など)とサプレッサーT細胞(Treg
など)とを含み、エフェクターTh細胞は即ち、ヘルパーT細胞を含む、他の白血球と刺
激し又は相互作用するサイトカイン、タンパク質又はペプチドを分泌するヘルパー細胞で
あり、サプレッサーT細胞は即ち、免疫システムの活性を抑制し、それにより免疫システ
ムの恒常性と自己抗原への耐性とを維持するT細胞である。
合体(MHC)を用いて外来抗原複合体を提示する細胞を意味する。特に、抗原提示細胞
は、樹状細胞、マクロファージ、B細胞及び当業者により同定可能な追加の細胞を含む。
抗原提示細胞存在下でT細胞と、接触することを含む。一実施形態において、本明細書に
記載される方法は、候補細菌物質が抗原提示細胞と接触し、該接触の後の、前記抗原提示
細胞をT細胞とインキュベートすることを含む。
くとも一つの相互関係のある動作若しくは影響、又は相互関係のない動作若しくは影響が
発揮されうるような状況の下に、一時的に与えられた二つの項目間で空間的関係の創造へ
指向される動作を意味する。特に、インキュベートすることは、細菌物質と細胞との間で
実行されることができ、細菌物質と細胞との間で直接的接触及び/若しくは直接的相互作
用という結果になり、又は細菌物質の間接的作用の後に(例えば、細胞と直接的相互作用
する他の物質の活性化又は修飾の後に)細胞の修飾という結果になる。
胞との間で実行され得、その結果、第1の細胞と第2の細胞との間の直接的接触及び/又
は直接的相互作用の結果になり得、又は第1の細胞の間接的作用の後に(例えば、第2の
細胞と直接的な相互作用するサイトカイン又は他の分子の分泌の後に)第2の細胞の修飾
の結果になり得る。
特異的な細菌物質に依存し、本開示を読む当業者により同定可能である適当な条件下で、
細菌物質を含有する溶液内において、一つ以上の細胞種を含む全試料を溶液槽により、生
体外で実行され得る。さらなる例示的な、細菌物質と、T細胞又は抗原提示細胞との接触
は、適した条件下で精製細胞の細胞培養液へ細菌物質を生体外で誘導することによって、
及び個体(標識化炎症性バイオマーカー又は抗炎症性バイオマーカーを発現するために遺
伝子的に修飾されているヒト以外の遺伝子移植の動物)を細菌物質を用いて生体内処理す
ることによって、実行され得る。処理は、細菌物質を、局所投与又は全身投与することに
よって実行され得る。全身投与は、腸内投与(例えば、経口投与、胃栄養管による投与、
十二指腸栄養管による投与、胃瘻造設、経腸栄養、および直腸投与)および非経口投与(
例えば静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、膀胱内
注入)を含む。局所投与は、限定されないが、経皮投与、吸入投与(例えば、喘息治療薬
内に)、浣腸、点眼(例えば、結膜上に)、点耳、鼻腔内経路(例えば、うっ血除去点鼻
薬)、及び膣内投与を含む。
液と抗原提示細胞を含む細胞培養液とを生体外混合することにより、T細胞の培養液に精
製抗原提示細胞を生体外で添加することにより、又は抗原提示細胞の培養液に精製T細胞
を生体外で添加することにより実行され得る。さらなる例示的な、生体内でのT細胞と抗
原提示細胞とのさらなるインキュベートすることは、個体組織への抗原提示細胞の移植、
T細胞を含む組織、又は抗原提示細胞を含む個体組織の組織へのT細胞の移植を含む。一
実施形態において、個体は、標識化炎症性バイオマーカーまたは抗炎症性バイオマーカー
を発現するように遺伝子的に修飾されたヒト以外のトランスジェニック動物である。
ートを実行するための適切なさらなる手順や手法は、本開示を読むことにより当業者によ
って生体外又は生体内で同定することができる。
り、例えば、適した生育環境を細胞に与えるために、温度、また任意に大気のCO2、N
2及び/又はO2の濃度、相対湿度、栄養量並びにその他の適した条件を調整し、監視す
るロボットの細胞培養器を使用することによって、生体外又は適当な環境下での細胞培養
に適した環境の提供を含む。また、生体外又は生体内での、物質及び細胞の接触を行うた
めのさらなる適当な手順や手法は、本開示を読むことにより当業者によって同定され得る
。
フレームは、特定の細菌物質、特定のT細胞、抗原提示細胞、処理される動物、関連する
適当な条件及び実験計画の実験的な観点において、当業者によって決定され得る。
オマーカーの発現の検出は、標識化バイオマーカー若しくはバイオマーカーに対し特異的
な標識化分子又はそれらに関連した分子を含む、標識化分子の使用を含む、当業者にとっ
て同定可能な手法により、生体外又は生体内で実行され得る。
混合物、分子複合体及び物質を含む、空間の限られた部分において分析又は関連する信号
の実在、存在又は事実の決定を示す。検出は、分析物の数量若しくは量又は関連する信号
の測定を参照し、測定に関連し、測定を含むとき(定量において同様に参照される)、“
定量的”であり、限定されないが、分析物若しくは関連する信号の量又は比率を決めるた
めに計画された任意の分析を含む。検出は、他の分析物又は関連する信号の相対的存在量
に関して、分析物若しくは関連する信号の質又は種類の同定を、参照し、関連し、又は含
むとき、“定性的”であり、定量化されない。
として本明細書で使用される用語は、限定されないが、放射性同位元素、蛍光物質、化学
発光染料、発色団、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、染料、金属イオン、ナノ
粒子、金属ゾル、リガンド(ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン又はハプテンなど
)などを含む。用語“蛍光物質”は、検出可能な画像中に蛍光を示すことができる物質又
はその部分を指す。結果として、本明細書で使用する言葉“信号”又は“標識信号”は、
標識検出を可能にする標識から放出される信号を意味し、限定されないが、放射能、蛍光
、化学発光、酵素反応の結果物中の化合物の生産などを含む。
物の発現のレベルを検出することにより実行され得る。二つの項目に参照して本明細書で
使用される言葉“に関連する”は、第一の項目の出現が、第二の項目の出現によって同時
に伴われるような二つの項目間の関係を示し、限定されないが、因果関係及び兆候/症状
−病気の関係を含む。特に、検出は、定性的又は定量的に実行され、RNA、タンパク質
、その前駆体、異なる種類(すなわちmRNA、tRNA、及びrRNA)及び/若しく
は分解生成物などの分子の検出、並びに/又はそれらに関連する検出若しくは測定可能な
特性を含み得る。検出を実行するための技術および手順は、本開示を読む当業者により同
定可能である。
、Q−PCRと、FACSによって検出される細胞内サイトカイン染色とを含む、当業者
に周知の方法を含む。いくつかの実施形態において、バイオマーカーの発現は、蛍光物質
で標識された、バイオマーカーに又はそれに関連する分子に特異な抗体を使用して実施さ
れる細胞培養液上の蛍光に基づく読み出しによって検出され、蛍光物質としては、網羅的
でないが、低分子色素、タンパク質の発色団、量子ドット、及び金ナノ粒子を含む。一実
施形態において、バイオマーカーの発現は、生体内で(例えば、動物組織内で)又は生体
外で(例えば、細胞培養液中で)、バイオマーカープロモーターの転写制御下で標識の発
現の検出により、検出され得る。それらのいくつかの実施形態において、バイオマーカー
は、具体的にはIL−10又はFoxp3であり得る。さらなる手法は、本開示を読むこ
とで当業者により同定可能であり、またさらなる詳細について説明されないだろう。
び/又はインキュベートに続く、一つ以上の抗炎症性バイオマーカーの発現の増加又は一
つ以上の炎症性バイオマーカーの発現の減少の検出を通じて決定され得る。バイオマーカ
ー発現の増加及び/又は減少を決定することは、接触及び/又はインキュベートの後のバ
イオマーカーの検出発現と、接触及び/又はインキュベートがない状態で、同じバイオマ
ーカーの予め決定された検出発現とを比較することにより実行される。バイオマーカーの
発現の増加及び/又は減少を決定することは、検出された発現マーカーと、接触及び/又
はインキュベートがない状態においてコントロール細胞で同じバイオマーカーの検出され
た発現とを、比較することにより実行されることができる。
Foxp3、TGFβ1、TGFβ2、パーフォリン及びグランザイムBの発現の増加並
びに炎症性バイオマーカーのTNF−αまたはIL−17Aの発現の減少が、上記発現様
式とバクテロイデス・フラジリスの生物学的活性との関連性を支持する、バクテロイデス
・フラジリスの作用の機構に関連する。バクテロイデス・フラジリスの抗炎症性能は、当
業者により同定可能であり、限定されないが、特許文献1、特許文献2、特許文献3、特
許文献4及び特許文献5を含む、様々な出版物や特許に説明されており、各々のその全体
が本明細書において参照され援用される。当業者は、候補細菌物質の特定の抗炎症性能が
、産生されたサイトカインと、本明細書に記載の方法によって同定された候補細菌物質に
よって活性化された細胞との特定のセットのさらなる決定に基づいて、決定される可能性
があることを理解するであろう。
の発現の低下の検出は、IL−10、Foxp3、TGFβl、TGFβ2、パーフォリ
ン及びグランザイムB又はそれらの組み合わせなどの抗炎症性分子を誘導する物質の能力
、または、IFNγ、IFNα、IFNβ、IL−1β、IL−4、IL−5、IL−6
、IL−8、IL−9、IL−13、IL−21、IL−22、IL−23、IL−17
若しくはTNFα又はそれらの組み合わせなどの炎症性サイトカインを抑制する物質の能
力を示す。
又は抗原提示細胞存在下でT細胞と接触させることとし、またIL−10、Foxp3、
TGFβl、TGFβ2、パーフォリン及びグランザイムBからなる群より選択される少
なくとも一つの抗炎症性バイオマーカーの発現を検出することを含み、ここで、接触の後
の抗炎症性バイオマーカーの発現の増加は候補細菌物質の抗炎症性能を意味する。特に、
それらのいくつかの実施形態において、IL−10、TGFβl、TGFβ2、パーフォ
リン及び/又はグランザイムBの発現は、Foxp3を発現するT細胞上で、また特にF
oxp3を発現する制御性T細胞上で実行される。
の後に抗原提示細胞をT細胞とインキュベートすることを含む。この方法は、Foxp3
、IL−10、TGFβl、TGFβ2、パーフォリン及びグランザイムBからなる群よ
り選択される少なくとも一つの抗炎症性バイオマーカーの発現を検出することをさらに含
み、ここで、インキュベートの後のバイオマーカー発現の増加の検出が候補物質の抗炎症
性能を意味する。特に、それらのいくつかの実施形態において、IL−10、パーフォリ
ン及び/又はグランザイムBはFoxp3を発現するT細胞上で、また特に、Foxp3
を発現する制御性T細胞上で実行される。
胞と接触させることと、IL17及びTNFαからなる群より選択される少なくとも一つ
の炎症性バイオマーカーの発現を検出することを含み、ここで、接触の後に炎症性バイオ
マーカーの発現の減少は候補細菌物質の抗炎症性能を意味する。特に、それらのいくつか
の実施形態において、IL17及びTNFαの発現は、Foxp3を発現するT細胞上で
、また特に、Foxp3を発現する制御性T細胞上で実行される。
の後に抗原提示細胞をT細胞とインキュベートすることを含む。該方法は、IL17及び
TNFαからなる群より選択される少なくとも一つの抗炎症性バイオマーカーの発現を検
出することをさらに含み、ここで、接触の後の炎症性バイオマーカー発現の減少が候補物
質の抗炎症性能を意味する。特に、それらのいくつかの実施形態において、IL17及び
TNFαは、Foxp3を発現するT細胞上で、また特に、Foxp3を発現する制御性
T細胞上で実行される。
いて、候補細菌物質は混成のプール内の細菌を含む。細菌は生きた菌、死んだ菌、細菌か
ら分離された抽出物若しくは産生物、又はそれぞれの組み合わせとすることができる。細
菌はまた、実験室株、ATCCなどのリポジトリからの分離株、動物からの分離株、ヒト
からの分離株、またはそれぞれの組み合わせであってもよい。
物又は排泄物及び他の腸内容物の組み合わせを由来とすることができる。一実施形態にお
いて、ヒトからの分離株は排泄物から分離される。分離株はまた、腸内容物又は排泄物及
び他の腸内容物の組み合わせを由来とすることができる。
ス又はラットのようなトランスジェニックマーカー非ヒト哺乳類を、候補物質で処理する
ことを含み、トランスジェニックマーカー非ヒト動物は一般的に、IL−10及びFox
p3だけでなくパーフォリン及びグランザイムB、IL17及びTNFαからなる群から
選択される標識化抗炎症性バイオマーカー又は炎症性バイオマーカーを発現するように遺
伝子的に修飾されており、処理後にトランスジェニックマーカー非ヒト動物におけるバイ
オマーカー発現を検出する。
経口に若しくは静脈内に処理され得、又は強制経口により生きた菌を恒久的にコロニー化
され得、バイオマーカー発現のFoxp3又はIL10発現の量が、物質の免疫調節能の
測定として、脾臓、腸間膜リンパ節、小腸及び大腸、肺、膵臓、および骨髄を含むマウス
の様々なコンパートメントにおいて観察されるだろう。
、IL−10(若しくは、T細胞の分析の場合にはFoxp3)の発現が蛍光体である緑
色蛍光タンパク質(GFP)でマークされているマウスから精製され又は分化される。こ
れらの実施形態において、候補細菌物質は、前記細胞種のいずれかと接触させられ、GF
Pの発現量が、試験される物質の免疫調節能を意味することを決定される。また、樹状細
胞または他の抗原提示細胞は物質とインキュベートすることができ、物質が洗浄されるこ
とができ、その後、樹状細胞は、T細胞から免疫調節活性を誘発するために樹状細胞の免
疫調節能を決定するためにT細胞とインキュベートすることができる。GFPの発現は、
蛍光標示式細胞分取器(FACS)またはマイクロプレートリーダーを用いて決定される
ことができる。
2、パーフォリン及びグランザイムBからなる群より選択される一つ以上の抗炎症性バイ
オマーカー、並びにIL17及びTNFαからなる群より選択される一つ以上の標識化炎
症性バイオマーカーの少なくとも一つの検出をするための試薬とは、本明細書に記載の方
法にしたがって免疫調節能を有する細菌物質を同定するためのシステムを含み得る。
はマクロファージを含み、いくつかの実施形態において、樹状細胞、T細胞、制御性T細
胞、B細胞及び/又はマクロファージがIL−10(若しくは、T細胞の分析の場合には
Foxp3)の発現が蛍光体である緑色蛍光タンパク質(GFP)でマークされているマ
ウスから精製され又は分化されることができる。
するためのマルチリガンド捕捉剤および他の試薬は、キット内で独立的に含まれ得る。抗
原提示細胞、T細胞及び試薬は、一つ以上の構成物中に含められ得、また各々の細胞及び
試薬は、適当な媒体と共に構成物にし得る。
イオマーカーに特異的な標識化捕捉剤、又はその発現に関連する分子、マイクロ流体チッ
プ、標準試料、並びに本開示を読むことで当業者により同定可能なさらなる格子得部分を
含むことができる。
す。第一の分子に対する第二の分子への結合を参照するときの本明細書で使用される単語
“特異的な”“特異的に”又は“特異性”は、第一の分子と第二の分子との安定した複合
体の認識、接触及び形成とともに、第一の分子と第二の分子とのそれぞれが、存在し得る
他の分子と一緒に安定な複合体の認識をせず、接触をせず及び形成をしないことが実質的
に少ないことを指す。例示的な特異な結合としては、抗体−抗原相互作用、分子レセプタ
ー−リガンド相互作用、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、酵素基質の相互作
用などである。“安定な複合体”は、検出可能であり、安定性の任意のレベルを必要とせ
ず、しかしより大きな安定が通常好ましい。いくつかの実施形態において、キットは標識
化ポリヌクレオチド又は標識化抗体を含みうる。
の必要な試薬を与え得る。キットは通常、別々の容器に構成物を含むだろう。指示(例え
ば、解析するにために、書面上に又はテープ若しくはCD−ROMのように電子的に対応
されているもの上に、記載された指示又は音声指示)は、キット内に通常含まれるだろう
。キットはまた、特定の使用の方法、他のパッケージ化試薬及び材料(すなわち洗浄用バ
ッファーなど)に応じて含めることができる。
な製造及び包装は、本開示を読む当業者により同定され得る。
いてさらに示され、実施例は、例示のために提供され、制限されることを意図されていな
い。
0、Foxp3、TGFβl、TGFβ2、パーフォリン、グランザイムB、TNFα、
IL17Aの発現を検出するための方法を示している。当業者は、本開示に従うことによ
り、PSA及びバクテロイデス・フラジリスの追加物質に対する免疫調節活性を検出する
ために適した、PSA及びバクテロイデス・フラジリス並びに細胞/培養液/動物のシス
テムのために、詳細において述べられている特徴の適応性を理解するだろう。同様に、当
業者は、本明細書に記載された他のバイオマーカーへの、IL−10、Foxp3、TG
Fβl、TGFβ2、パーフォリン、グランザイムB、TNFα、IL17Aのようなバ
イオマーカーの検出の適応性を理解するだろう。
以下の材料および方法は、本明細書に例示した免疫調節物質の検出を目的に全ての方法
及びシステムのために使用された。
バクテロイデス・フラジリス株 NCTC 9343は、アメリカ合衆国培養細胞系統
保存機関から得、その同質遺伝子的PSA欠損変異株及びmpi44変異株(PSAのみ
を産生し、他の多糖類を産生しない)は、「MJ.Coyne,A.O.Tzianab
os,B.C.Mallory,V.J.Carey,D.L.Kasper and
L.E.Comstock,(2001)Polysaccharide biosyn
thesis locus required for virulence of B
acteroides fragilis,Infect.Immun.69:4342
−4350」に記載されている。細菌は、1LのddH2O中に37gBHI(BD社#
237200)、0.5μg/mlヘミン(Sigma社 H5533)、及び0.5μ
g/mlビタミンK(Sigma社 V3501)を含む富栄養培地、又は1LのRPM
I(Invitrogen社 SKU#11835−030)中に8gグルコース、1%
FBS、0.5μg/mlヘミン、及び0.5μg/mlビタミンKを含むカスタマイズ
した最小培地(MM)のいずれかで生育された。C57BL/6及びBalb/c株のS
PFマウスはTaconic Farms社(ニューヨーク州ジャーマンタウン)から購
入された。TLR2−/−及びIL−10ノックアウトマウスは、Jacksom la
boratories社から購入された。IL−10GFPマウスはthe labor
atory of Christopher Karp from Cincinnat
i Childrens medical hospitalから調達し、また、Fox
p3GFPマウスはthe laboratory of Talal Chatila
from the University of California Los A
ngelesから得られた。
パーコール(GE Healthcare社#17−0891−01)不連続密度勾配
遠心分離は、野生型バクテロイデス・フラジリス及びバクテロイデス・フラジリスΔPS
Aの両方におけるEDL分離のために用いられた(Patrick S, Reid J
H.(1983)Separation of capsulate and non−
capsulate Bacteroides fragilis on a disc
ontinuous density gradient. J Med Microb
iol.16(2):239−41)。簡単に言えば、20%、40%、60%、80%
のパーコール勾配(PBSで希釈)は14ml試験管に作製された(各層2ml)。その
後、PBSに再懸濁されたバクテロイデス・フラジリス培養液は20%パーコール層の上
部に慎重に加えられた。続いて、勾配は、室温、800g、20分間の条件で遠心分離さ
れた。EDL富化細菌は、分離後勾配の40%−60%の境界面から回収され得る。
この方法は、E.coliからOMVを調製するために、以前記載された手順(Ama
nda L. Horstman and Meta J.Kuehn.(2000)E
nterotoxigenic Escherichia coli secretes
active heat−labile enterotoxin via oute
r membrane vesicles.J Biol Chem.275:1248
9−12496)に適応された。簡単に言えば、EDL富化バクテロイデス・フラジリス
は、カスタマイズ化されたMMの中で生育された。OMVは、4000g、2時間、4℃
の条件で遠心により培養液中の細菌が取り除かれた上澄みから回収され、PBSで二回洗
浄され、0.45μmスピンカラム(Millipore社 #20−218)によりろ
過された。精製されたOMVの総タンパク質濃度はBradford分析(Biorad
社 #500−0205)により測定した。FITC標識化OMVは、以前記載されたよ
うに調製された(Nicole C. Kesty and Meta J.Keuhn
.(2004)Incorporation of heterologous out
er membrane and periplasmic proteins int
o Escherichia coli outer membrane vesicl
es.J Biol Chem.279:2069−2076)。簡単に言えば、OMV
は、室温で1時間、染色緩衝液(lmg/ml FITC (Thermo Scien
tific社 #46424),100mM NaCl,50mM Na2CO3,pH
9.2)中でインキュベートされた。標識化OMVは、4℃、30分、40,000gの
条件で遠心分離により収集され、PBS+200mM NaClで2回洗浄された。
EDL富化バクテロイデス・フラジリスの超薄切片は、以前記載されたように調製され
た(Patrick S, McKenna JP, O’Hagan S, Derm
ott E.(1996)A comparison of the haemaggl
utinating and enzymic activities of Bact
eroides fragilis whole cells and outer m
embrane vesicles.Microb Pathog.20(4):191
−202)。簡単に言えば、試料は、2.5%(v/v)グルタルアルデヒド(Sigm
a社 G5882)のカコジル酸緩衝液中で、4℃で、一晩かけて固定化され、そして、
四酸化オスミウム(1%、w/v)中で、3時間、室温、暗所でさらに固定化された。ル
テニウムレッド(lmg/ml、Sigma社 R2751)は、固定化手順の両方に含
有された。その後、固定化試料は、アルコールによる一連の段階的脱水後、エポキシ樹脂
に包埋された。TEMにより可視化する前に、超薄切片(100−200nm)は切断さ
れ、ホルムバール/炭素被膜銅格子上で2%の酢酸ウラニル及びクエン酸鉛でネガティブ
染色された。
この方法は、以前記載された手順(Patrick S,McKenna JP,O’
Hagan S,Dermott E.(1996)A comparison of
the haemagglutinating and enzymic activi
ties of Bacteroides fragilis whole cells
and outer membrane vesicles.Microb Path
og.20(4):191−202)に適応された。簡単に言えば、ごく少量の精製OM
Vは、ホルムバール/炭素被膜金格子(EMS社 #FF200−Au)に塗られ、空気
で乾燥された。免疫金標識は、“OMV”が付された格子の側面が下になるように浮かし
た状態にされ、一連の抗体及び洗浄溶液の滴下により、室温で実行された。具体的には、
試料は、0.12%グリシン中で5分間のインキュベートの後、10%FBS中で10分
間ブロックされ、続いて、PBSで3分間の洗浄が5回実施された。その後、5nm 金
粒子を有する第二の抗体−IgG結合体(Dr.Paul Webster、House
Ear Institute、Los Angelesからの親切な寄贈品)は20分
間試料に適用され、続いて、再度、PBSを用いて4分間の洗浄を5回実施された。標識
後、試料は1%グルタルアルデヒド中で5分間固定化され、PBSの1分間×4回の滴下
へ、またH2O1分間×4回の滴下へ格子が移されることで十分に洗浄された。対比染色
は、氷上で10分間、3−5%酢酸ウラニルが2%メチルセルロースに溶解した溶液の滴
下に格子が配置されることにより実施された。最後に、格子は、ワイヤーループにより染
色液から取り除かれ、空気乾燥された。メチルセルロースの薄膜で覆われた試料は、ルー
プから取り除かれ、透過型電子顕微鏡(TEM)によって可視化するために使用された。
全細胞抽出物またはOMV(バクテロイデス・フラジリス変異株mpi44由来)から
精製したPSAはSDS−PAGEに供され、続いて、ゲルは、PSAの存在を示すため
の糖タンパク質染色キット(G bioscience社 #786−254)により染
色された。
この手順は、以前記載された方法(Scheiffele and Fuss.(20
01)Induction of TNBS colitis in mice.Cur
rent Protocols in Immunology.15.19.1−15.
19.14)に適応された。簡単に述べると、野生型(Balb/c)雄マウスは、TN
BS投与される前に、PBS、WT−OMV(5μg)又はΔPSA−OMV(5μg)
を一日おきに一週間、経口処理された。処理されたマウスは、イソフルランで麻酔され、
2%TNBS(50%EtOH中、Sigm社 P2297)の直腸投与が3.5Fカテ
ーテル(Instech Solomon社 SIL−C35)を通じて適用された。T
NBS投与の後、経口処理はさらに二回続けられ、最後の処置後1−2日にマウスは分析
された。
マウスの大腸は、10%中性緩衝ホルマリン液(ScyTek Laboratori
es社 CAS#50−00−0)に固定され、H&E染色のためにPacific P
athology社により処理された。各大腸断片の大腸炎スコアは、病理学者(Dr.
Gregory Lawson, David Geffen School of
Medicine, UCLA, Los Angeles)によって盲検方式で評価さ
れた。組織学的画像は光学顕微鏡(Zeiss社)を使用して20倍率で撮影された。
RNAは、TRizol(Invitrogen社 #15596−018)を用いて
マウス組織から、又はRNeasy Mini Kit(Qiagen社 #74104
)を用いて精製細胞から、いずれかにより収集された。iSCRIPT cDNA合成キ
ット(バイオラッド社 #170−8890)はcDNAの変換に使用され、IQ SY
BR Green supermix(BioRad社 #172−8882)は、リア
ルタイムPCRに使用された。本研究で使用されたプライマーは、TNFα(F−5’A
CG GCA TGG ATC TCA AAG AC 3’(配列番号:1)、R−5
’ GTG GGT GAG GAG CAC GTA GT 3’)(配列番号:2)
、IL−17(F−5’TTA AGG TTC TCT CCT CTG AA 3’
(配列番号:3)、R−5’TAG GGA GCT AAA TTA TCC AA
3’)(配列番号:4)IL−10(F−5’GGT TGC CAA GCC TTA
TCG GA 3’(配列番号5)、R−5’ACC TGC TCC ACT GC
T TGC T 3’)(配列番号6)、Foxp3(F−5’GCA ATA GTT
CCT TCC CAG AGT TCT 3’(配列番号7)、R−5’GGA T
GG CCC ATC GGA TAA G 3’(配列番号:8))である。
生体外で分化されたBMDCは、50,000細胞/ウェルでLab−Tek II
8ウェルチャンバースライド(Nunc社 #154534)に蒔かれた。FITC標識
化OMVは10μg/mlで細胞培養液に添加された。2時間のインキュベートの後、細
胞は室温で20分間、4%PFAで固定された。5分間のPBS洗浄が3回された後に、
細胞膜は、1μg/mlのWGA(Invitrogen社 W849)結合テトラメチ
ルローダミンで、4℃で1時間染色された。プロロングゴールド褪色防止剤(P3693
0)は、細胞膜の染色を、膜染色に続く広範な洗浄後に、試料に対し適用された。蛍光画
像は、LSM 510顕微鏡とPlan−Neofluar 63x/1.25油浸対物
レンズとを用いて撮影した。
OMV取込み解析またはOMV活性化解析の結果のBMDCは採取され、氷上で30分
間、5%のマウス血清でブロックされた。ブロックした後、細胞は、氷上で30分間抗C
D11c−APC、抗MHCII−FITC又は抗CD86−PE(eBioscien
ce社)で染色され、フローサイトメトリー分析の前にFACS緩衝液(HBSS(Ca
2+/Mg2+不含有)、1%FBS、2mM EDTA、10mM HEPES)を用
いて4℃で2回洗浄された。同様に、生体外でのBMDC−T細胞の共培養由来の細胞は
、ブロックされ、採取される前に4−4.5時間PMA/イオノマイシンを用いて細胞を
再刺激したことを除いて同じ方法で、抗CD4−APC/抗CD25−PEを用いて染色
された。全てのフローサイトメトリーは、BD FACSCaliburを用いて行われ
、結果はFlowJoを用いて分析された。
骨髄は、マウスの異なる株から採取され、従来の記載のように(Mazmanian,
Liu,Tzianabos,and Kasper(2005)An Immunom
odulatory Molecule of Symbiotic Bacteria
Directs Maturation of the Host Immune S
ystem.Cell 122:1 107−118)20ng/mlのGM−CSF(
Miltenyi Biotec社#9517571)存在下で生体外で8日間分化され
た。(細胞の純度>90%)。CD4+脾臓T細胞は、磁気マイクロビーズ精製(Mil
tenyi Biotec社#130−090−860)(細胞の純度>95%)により
単離された。OMVが振動されたBMDC(10μl/ml OMV、100,000細
胞/ml、12時間から24時間)は、HBSSで洗浄され、CD4+T細胞(1,00
0,000細胞/ml)が、0.01μl/ml抗CD3(0日目、図3D、E、F、図
4Aに示されるように図3C)と、2ng/ml TGFβ(0日目、図3C、D及びF
、図4A)の追加と、5ng/ml IL−2(1日目とで3日目、生体外で全てのDC
−T細胞共培養分析)丸底96ウェルプレート内でインキュベートした。合計4日の培養
後、上清をELISA(#88−7104−77 eBioscience社)又は細胞
は、染色及びフローサイトメトリーの解析のために採取された。
BMDC(WT−OMV又はΔPSA−OMVと振動されている)−T細胞の共培養か
ら精製したCD4+CD25+細胞は、制御性T細胞(Miltenyi Biotec
社, #130−091−041)の供給源として使用された。マイトマイシンC(Si
gma社 M4278)で処理し、CD4除去マウスの脾細胞は、APC(100,00
0細胞/ml)として使用された。マウスの脾臓から直接精製したCD4+CD25−T
細胞は、10分間、37℃でCFSEと振動され、続いて、まずPBSで次に培養液で洗
浄され、レスポンダー細胞(エフェクターT細胞)として(500,000細胞/ml)
をすぐに使用された。この分析は、200μl体積の5μg/mlの抗CD3(eBio
science社 #16−0031−86)追加により、丸底96ウェルプレートで行
われた。エフェクターT細胞と制御性T細胞との比を滴定により測定され、細胞はFAC
S分析のための培養2−3日後に採取された。
ステューデントのt検定及び一元配置分散分析法は、一対比較及び二つを超えるグルー
プ間の比較にそれぞれ適用された。分散分析により検出されたグループ間の有意差は、統
計学的有意差を示すグループを識別するために、事後テストとしてニューマン−クールズ
の検定を用いて分析した。すべての誤差棒はSEMを示す。NS:有意でない。*p<0
.05。***p<0.01。***p<0.001。
活発に局在化される。
EDL富化バクテロイデス・フラジリスの超薄切片は、材料及び方法に記載されたよう
に調製され、透過型電子顕微鏡により画像化された。
、より高倍率)からの出芽を観測されることができたことを示す。出願人らこれまでの研
究では、PSA欠損が、バクテロイデス・フラジリスの免疫調節能を抑制することを示し
ている(Mazmanian,Liu,Tzianabos,and Kasper(2
005)An Immunomodulatory Molecule of Symb
iotic Bacteria Directs Maturation of the
Host Immune System.Cell 122:1 107−118.)
(Mazmanian,Round, and Kasper(2008)A micr
obial symbiosis factor prevents intestin
al inflammatory disease.Nature. 453(7195
)620−625)。PSA変異株(バクテロイデス・フラジリス ΔPSA)の電子顕
微鏡写真は、OMV合成において欠陥のないことを示し、そして、産生されたOMVの大
きさ、形状及び豊富さは、野生型細菌(図1A及び図5)と識別不能であった。特に、図
1Aに示される結果は、小胞が細菌の表面から活発に出芽していることを明らかにした。
型細菌及びΔPSA細菌から精製した小胞は、材料及び方法の部分で記載したように分析
され免疫ブロットが行われた。
由来のOMVとは異なり、PSAへの免疫反応性を表示することを示す。バクテロイデス
・フラジリスは、細菌細胞の表面を覆っている、PSA〜PSHという名称の、少なくと
も8つの異なる莢膜多糖を産生する。PSBも小胞の標本内で検出されたが、PSGは存
在せず、OMVで包まれるために特定の多糖類に対する選択性を示す(図1B)。したが
って、図1Bの結果は、PSGのみが細菌表面上で検出される一方で、PSA及びPSB
は、小胞に関連することを示している。莢膜多糖体に対する欠損変異株は、各抗血清の特
異性を確認する。
標識の実験により確認された。精製小胞の免疫ブロット標識の結果は図1Cに示され、P
SAが物理的にOMVに関連していること、及び野生型バクテロイデス・フラジリス株か
らのOMVの大半が、PSAに対し陽性に染色していることを確認する(図6)。PSA
の不存在がOMVの分子構成物を変化しなかったかったことを確かめるため、プロテオー
ム分析は、野生型細菌からの又はPSA変異細菌からの小胞間のタンパク質構成物におい
て、質的または量的な違いはないことを明らかにした質量分析法により、実行された(図
7)。
り全細胞抽出物から回収されたPSAのサイズ分離は、材料及び方法において示されてい
るような、全細胞由来の、及び精製OMV由来の莢膜多糖標本の抗PSAを用いた免疫ブ
ロット分析と同様に実行された。
ていることを示し、小胞へのPSA包み込みの特異性を表している。特に、図1Dの結果
は、低分子量PSA(L−PSA)は、細菌細胞外被に関連し維持している高分子量(H
−PSA)種とは異なり、小胞に包み込まれることを示している。
Vへ活発に局在化されていることを明らかにしている。
。
OMVが疾患の臨床症状を改善できるか調査するために、マウスは、TNBS(2,4
,6−トリニトロベンゼンスルホン酸)誘発性大腸炎の期間中にOMV強制経口投与によ
って処理された。
の直腸投与後に体重が急速に減少しており、媒体処理されたマウス(図2A;ETOH+
PBS)と比較し、コントロール動物の体重が回復しなかったことを示している。驚くべ
きことに、TNBS動物にOMV経口投与すると、体重減少(図2A;TNBS+WT−
OMV)から大きく保護された。最も重要なことは、バクテロイデス・フラジリスΔPS
A由来のOMVを投与した場合、体重減少がTNBS動物(図2A;TNBS+ΔPSA
−OMV)と区別できなく、PSAが、消耗性疾患を抑えることに完全に関連することを
実証した。
ように無菌マウスでさえ(データは示されず)、宿主由来の小胞の観測によって混乱され
た。
し、長さの定量化(グラフ)した後、直ちに、媒体(EtOH)処理されたグループ及び
TNBSグループ(n=4匹/グループ)からの大腸の長さの検出は、未操作の大腸にお
いて、実行された。具体的に、測定は屠殺の時(疾患誘導から4日目)に実行された。
あることを示し、しかしPSA欠乏OMVで処理した動物においては通常の腸の長さでな
いことを示している(図2B)。
シリンおよびエオシン(H&E)染色した、各処理グループの大腸断片の代表物を挙げ、
図2Cに示す。大腸組織の組織学的分析により、重篤な疾患がTNBS処理動物において
観測され、TNBS処理動物がPSA含有小胞の経口投与によって改善されたことを、図
2Cの画像は示している。
認された。TNBS大腸炎は、クローン病で観察される病状を模倣した、大腸全域の限局
性病巣においてそれ自体を明らかにする。定量的に疾患を評価するために、臨床症状が標
準得点システムを用いて盲検化病理学者によって評価された(Scheiffele a
nd Fuss.(2001)Induction of TNBS colitis
in mice. Current Protocols in Immunology
.15.19.1−15.19.14)。図2Dに示される結果は、TNBS及びΔPS
A−OMVを投与されたすべての動物が深刻な影響を受けた一方で、WT−OMVがほと
んどの動物において疾病を劇的に減少させることを示している。野生型細菌由来のOMV
で処理された動物は、遥かに少ない病状の限局的サイトを有していたが、病巣が観察され
た時、ΔPSA−OMVを与えられた動物と比べて、病巣が小さく、相当正常な組織構造
を保持していた。
を高める。
大腸炎に関連し標準的な炎症促進性及び抗炎症性サイトカインの産生は、実施例2に例
示されるように処理されたマウスにおいて測定された。具体的には、サイトカインの転写
産物の分析は、大腸全体より回収され又は腸間膜リンパ節由来の精製CD4+T細胞より
回収されたRNAについて、定量RT−PCRを用いて実施された。
腸間膜リンパ節から精製されたCD4+T細胞)で報告されている。これらの結果は、腫
瘍壊死因子(TNF−α及びIL−17A)の転写レベルがTNBS処理動物において高
められ、しかし、OMV投与によりPSA−依存的方法(図2E)で減少させられたこと
を示す。病状からの保護と矛盾しないで、ΔPSA−OMV経口投与動物と比較して、O
MVは増加したIL−10濃度の産生を誘発する(図2F)。腸間膜リンパ節(MLN)
由来の精製CD4+T細胞によって産生されたサイトカインの分析は、IL−10が、T
細胞のPSAへの応答により実際に産生されていることを確認した(図2F)。強力な炎
症誘発性マーカーTNF−α濃度のように、Thl7細胞の浸潤は、疾患のために必要で
あるが、OMVにより劇的に減少した(図2F)。我々は、バクテロイデス・フラジリス
OMV中へのPSAの包み込みが、実験的大腸炎の病理学的および免疫学的症状発現から
動物を保護すると結論付ける。
誘導する。
樹状細胞(DC)は、腸管内腔へ突起を伸ばし、腸の粒子を採取し、続いてT細胞の反
応を開始するためにMLNに移行する。確かに、動物へPSAの経口投与は、MLNにお
けるCD11c+DCに関連している。したがって、出願人は、PSAを含むOMVが同
様に樹状細胞に取り込まれ得るかどうかの研究に努めた。
り込みを阻害したため、骨髄由来のDCが急速にアクチン依存的方法でOMVを内部移行
したことを示す(図3A及び図8)。細胞間の局在は共焦点顕微鏡により確認された(図
9)。
示される結果は、T細胞活性化マーカー(MHCII、CD86)の発現が、WT−OM
V及びΔPSA−OMVの両方の内部移行に続いて、同等に上昇させられたことを示した
(図3B及び図10)。
PSAが、T細胞応答に影響を与え得ることを示している。
0発現を誘導する。
実施例1〜3に例示した実験に示すように、大腸炎におけるPSA保護の役割に照らし
て、抑制性T細胞応答の誘導にOMVの生物学的効果は試験された。特に、様々な制御性
T細胞(Treg)集団が大腸炎を抑制することが知られているので、Tregの発達を
促進するOMVの能力は検討された。
−10の発現を誘導し、一方、同条件下でIL−10がDCのみからでは産生されないこ
とを示している。増加が媒体コントロールを超えて検出されているが、バクテロイデス・
フラジリスΔPSAから精製された小胞は、WT−OMVよりIL−10を有意に低く誘
導していた。DCからのIL−10の産生は、生体内及び生体外におけるCD4+IL−
10+T細胞の発達を支援することが知られている。したがって、IL−10−/−の動
物から分化されたDCを含み、図3Cに示されている結果と同様のELISA分析は実行
された。
、DC−T細胞の共培養において大幅に減少したIL−10を示しており、DCによるI
L−10発現が、パラクリン的方法でCD4+T細胞からIL−10を誘導するために必
要とされることを示している。
Cをプログラムする。
微生物のリガンドは、パターン認識受容体のいくつかのクラスによって感知され、Th
1サイトカイン産生を惹起するために、PSAがToll様受容体2(TLR2)を通じ
た信号へ示されている。一連の実験は、したがって、最近の報告が、Tregの機能及び
IL−10発現がTLR2の影響を受けていることを示しているように、TLR2が、P
SAによるIL−10の誘導に必要であるかどうかを試験するために実行された。
R2−/−動物由来のDC)が、完全にOMVに応答してIL−10産生を阻害すること
を示している。両方のDCはスーパー抗原(SEA)刺激に同様に応答し、PSAセンシ
ングにおける特異的な欠陥ではなく、TLR2−/−DCによるT細胞活性化の一般的な
欠如を実証している(図3D)。転写因子Foxp3を発現するCD4+CD25+T細
胞は、重要なTregの亜集団である。最近の研究では、示されているCD4+CD25
+Foxp3+TregはIL−10を発現することができ、TregからのIL−10
の産生は腸の炎症を抑制するために必要とされる。
25+T細胞及びCD4+CD25−T細胞は、DCとの共培養に続いて精製され、そし
てIL−10及びFoxp3の発現は定量RT−PCRによって測定された。
く、CD4+CD25+Treg集合内でIL−10発現を大幅に誘導することを示して
いる。バクテロイデス・フラジリスΔPSAから精製したOMVは、媒体コントロールと
同じ濃度で、どちらのT細胞集団からであってもIL−10産生を促進することができな
かった。Foxp3の発現はまた、OMVによって、PSA依存的方法でもっぱらCD4
+CD25+T細胞において有意に増加した(図3E)。
由来のCD4+T細胞を使用した。OMVを振動されたDCで4日培養した後、細胞は、
抗CD4で染色され、FCを使用してGFPの発現によりFoxp3が検出された。
増加したFoxp3転写と一致し、CD4+Foxp3+T細胞の割合は、ΔPSA−O
MV処理でなく、WT−OMV処理への応答において増加した(図3F)。まとめると、
完全なる生体外培養システムにおいてPSA含有OMVは、Tregの発達および/また
は増殖をする方向へDCをプログラムする。
10を誘発する。
細胞治療としてのTregの使用は、IBD、自己免疫及びアレルギーのために提案さ
れている。OMVで処理されたDCとの4日間共存培養後のCD4+T細胞亜集団による
IL−10の発現は調査された。脾臓CD4+T細胞はIL−10−GFPマウスから精
製され、共培養後に抗CD4及び抗CD25で染色され、IL−10の発現がGFPによ
り測定された。
CD25+Tregからの特異的なIL−10産生を促進することを明らかにしているこ
とを示す。
SA−OMVで処理したDCとの共培養に続いて、精製したCD4+CD25+T細胞に
より、単純な応答細胞の生体外でのTegの抑制能を促進するために調査された。CD4
+CD25−応答細胞(エフェクター細胞; Teff)は、野生型マウスの脾臓から精製
され、細胞内の色素のCFSE(カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル)
で振動され、Tregとインキュベートされ、3日間抗CD3で刺激を与えられた。細胞
増殖はCFSE希釈のFCにより測定された。
収されたTregが、ΔPSA−OMVに対応したCD4+CD25+T細胞と比較して
、大幅に強化された抑制能力を表示することを示す。
ンなど)を含むOMVからのPSAの特異的欠落は、機能的なTregを誘導するための
、バクテロイデス・フラジリスの小胞の能力を抑制する。
わせを誘導する。
Foxp3−GFPマウスは、一日おきに6日間精製PSAで経口処理された。MLN
は抽出され、CD4+Foxp3+T細胞又はCD4+Foxp3−T細胞は、±GFP
の発現に基づいたFACSにより精製された(純度>99%)。RNAは抽出され、定量
−PCRに使用された。
ランザイムAを含む複数の抗炎症性遺伝子の誘導と、TNFαおよびIL17(特にIL
17A)の阻害とを調整することを実証する。
細胞の発達へシグナル伝達する自然免疫受容体を結合する微生物リガンドのための独創的
な例を明らかにする。特に上記の結果は、PSAが、外膜小胞(OMV)によって、及び
細菌分子を宿主細胞へ標的とする分泌構造によって、宿主に運ばれることを示している。
PSAを含むOMVは、宿主免疫システムの樹状細胞によって内部移行される。OMVの
取り込みに続いて、PSAは、Foxp3及び抗炎症性サイトカインのインターロイキン
−10(IL−10)を発現する制御性T細胞(Treg)の分化を誘導するために樹状
細胞をプログラムする。OMVによるTregの発達は、樹状細胞によるToll様受容
体2(TLR2)の発現及びIL−10の産生を必要とする。驚くべきことに、精製OM
Vは、PSA依存的方法で強力な抑制活性を持つ、機能的なTregの生体外分化を指示
する。PSA含有OMVを用いた動物の処理は、実験的大腸炎を防ぎ、腸内の炎症誘発性
サイトカイン応答を抑制する。これらの知見は、IBDのための生菌治療が運ぶという新
しいアプローチに設計され得るプロセスである小胞の分泌を通じて、共生細菌が有益な微
生物の因子を提供することが明らかにする。
し、培養中のT細胞の活性化を阻害することを示している。これは、微生物のリガンドに
よる生体外Tregの発達についての最初の実証であり、自然免疫受容体シグナル伝達が
Tregの機能を調節することが広く推測される観念に対する原理証明を提供する。IB
Dのための現在の治療は、効果がない又は重篤な副作用を持っているかのどちらかである
ので、活性免疫調節のためのよく進化したメカニズムを利用することによる、有望な新し
い治療の選択肢を生菌が表している。Tregが複数の組織において免疫応答を抑制する
ことを考えると、PSAによる生体外Tregの発達の私たちの独創性に富んだ実証は、
自己免疫、喘息及びアレルギーを含む多数の炎症性疾患のための新規細胞治療の心躍る可
能性を示唆している。
部が精製され得、全細菌が使用されるとき、純粋な化合物がどのその成果を模倣するのか
を発見されるまで、同じ解析が上記のように実施される。また、上記のアプローチは、こ
の活性を有する菌株のそれぞれのクローンにおいて欠損されている免疫調節分子を識別す
るために、関心のある微生物の変異体ライブラリーをスクリーンするために使用されるだ
ろう。
製若しくは生成された産生物及び/又は他の細菌物質をスクリーニングするための方法並
びにシステムが提示される。
を生成する方法および使用方法の完全な開示並びに説明を与えるために提供されており、
本発明者らがそれらの開示としてみなすことの範囲を制限するために意図されていない。
当業者に明白な開示を行うための上記の様式の変更は、以下の特許請求の範囲内であるこ
とを意図している。明細書に記載されている全ての特許および刊行物は、開示が属する当
業者の技術の水準を示している。それぞれの参照が個々にその全体が参照として援用され
たかのように、この開示における引用のすべての参照は、同じ程度に参照として援用され
る。
、雑誌論文、抄録、実験マニュアル、書籍、またはその他の開示を含む)の開示内容全体
は、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、配列表のハードコピーは、これに提出
し、対応するコンピュータ読み取り可能な書式は、その全体が参照により本明細書に両方
とも組み込まれている。
理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明
する目的のためであり、限定することに意図されないことを理解すべきである。本明細書
および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形は、内容が別途明確に指示しな
い限り、複数の参照対象を含む。内容が別途明確に指示しない限り、用語“複数”は、二
つ以上の参照対象を含む。他に定義しない限り、本明細書に使用されているすべての技術
用語および科学用語は、開示の属する技術分野における当業者により一般的に理解される
ものと同じ意味を持っている。
細書に記載されている適当な材料および方法の特定の実施例を試験するために実際に使用
されることができる。
の精神および範囲から逸脱することなく行われることができることは理解されるであろう
。したがって、他の実施形態は以下の特許請求の範囲内である。
Claims (15)
- 免疫調節能を有する細菌物質を同定する方法であって、該方法は、
候補細菌物質を、単独で又は抗原を示す細胞の存在下でT細胞と接触させることと、
IL−10、Foxp3、TGFβ1、TGFβ2、パーフォリン及びグランザイムB
からなる群より選択される一つ以上の抗炎症性バイオマーカーの発現、或いは、IFNγ
、IFNα、IFNβ、IL−1β、IL−4、IL−5、IL−6、IL−8、IL−
9、IL−13、IL−21、IL−22、IL−23、IL−17及びTNFαからな
る群より選択される一つ以上の炎症性バイオマーカーの減少濃度若しくは発現の、少なく
とも一つの発現を検出することと、
前記接触の後の、一つ以上の前記抗炎症性バイオマーカーの前記発現の増加、或いは、
一つ以上の前記炎症性バイオマーカーの前記発現の減少の検出を通じて前記候補細菌物質
の抗炎症性能を決定することと、を含む方法。 - 免疫調節能を有する細菌物質を同定する方法であって、該方法は、
候補細菌物質を抗原提示細胞と接触させることと、
前記接触の後、前記抗原提示細胞をT細胞とインキュベートすることと、
IL−10、Foxp3、TGFβ1、TGFβ2、パーフォリン及びグランザイムB
からなる群より選択される一つ以上の抗炎症性バイオマーカー、及び、IFNγ、IFN
α、IFNβ、IL−1β、IL−4、IL−5、IL−6、IL−8、IL−9、IL
−13、IL−21、IL−22、IL−23、IL−17及びTNFαからなる群より
選択される一つ以上の炎症バイオマーカーの、少なくとも一つの発現を検出することと、
前記インキュベートの後の、一つ以上の前記抗炎症性バイオマーカーの前記発現の増加
、或いは、一つ以上の前記炎症性バイオマーカーの前記発現の減少の検出を通じて前記候
補細菌物質の抗炎症性能を決定することと、を含む方法。 - 前記検出が、Foxp3の発現を、単独で、或いは、IL−10、Foxp3、TGF
β1、TGFβ2、パーフォリン及び/又はグランザイムBとの組み合わせで検出するこ
とにより実行される請求項1又は2に記載の方法。 - 前記検出が、Foxp3の発現を、単独で、或いは、IFNγ、IFNα、IFNβ、
IL−1β、IL−4、IL−5、IL−6、IL−8、IL−9、IL−13、IL−
21、IL−22、IL−23、IL−17及び/又はTNFαとの組み合わせで検出す
ることにより実行される請求項1又は2に記載の方法。 - 前記検出が、Foxp3及びIL−10の発現を検出することにより実行される請求項
1又は2に記載の方法。 - 前記T細胞が制御性T細胞である請求項1ないし5のいずれかに記載の方法。
- 前記抗原提示細胞が、原発性又は細胞培養由来のいずれかである請求項1ないし6のい
ずれかに記載の方法。 - 前記抗原提示細胞が樹状細胞である請求項1ないし7のいずれかに記載の方法。
- 前記候補細菌物質が、生きた細菌、死んだ細菌、細菌抽出物、細菌由来の精製分子、細
菌から精製された分子、及び分子を内包する小胞からなる群より選択され、或いは、それ
らの組み合わせである請求項1ないし8のいずれかに記載の方法。 - 前記候補細菌物質が外膜小胞を備える請求項1ないし8のいずれかに記載の方法。
- 動物において、免疫調節能を有する細菌物質を同定する方法であって、該方法は、
トランスジェニックマーカー非ヒト動物を、候補細菌物質で処理し、ここで、当該トラ
ンスジェニックマーカー非ヒト動物は、IL−10、Foxp3、TGFβ1、TGFβ
2、パーフォリン及びグランザイムBからなる群より選択される一つ以上の標識化炎症性
バイオマーカー、並びに、IFNγ、IFNα、IFNβ、IL−1β、IL−4、IL
−5、IL−6、IL−8、IL−9、IL−13、IL−21、IL−22、IL−2
3、IL−17及びTNFαからなる群より選択される一つ以上の標識化炎症性バイオマ
ーカーの、少なくとも一つを発現するために遺伝子的に修飾されており、
前記処理の後の、一つ以上の前記抗炎症性バイオマーカー又は少なくとも一つの前記炎
症性バイオマーカーの少なくとも一つの前記トランスジェニックマーカー非ヒト動物にお
ける発現を検出することと、
前記処理の後の、一つ以上の前記抗炎症性バイオマーカーの前記発現の増加又は一つ以
上の前記炎症性バイオマーカーの前記発現の減少の検出を通じて前記候補細菌物質の抗炎
症性能を決定することと、を含む方法。 - 前記トランスジェニックマーカー非ヒト動物が、マウスである請求項11に記載の方法
。 - 前記マウスが、IL−10−GFPマウス及びFoxp3−GFPマウスからなる群よ
り選択される請求項12に記載の方法。 - 前記処理が、前記候補細菌物質を経口又は静脈内投与することにより実施される請求項
11ないし13のいずれかに記載の方法。 - 前記候補細菌物質が生きた細菌を含み、
前記処理が、強制経口により前記トランスジェニックマーカー非ヒト動物を前記生きた
細菌で恒久的にコロニー化することにより実施される請求項11ないし13のいずれかに
記載の方法。
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