JP2015536681A - 人乳の殺菌装置及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
10個の人乳の冷凍サンプルが、過剰母乳が出る母親から供与された。乳は実験前に−20℃の冷凍庫で保管された。人乳サンプル中の全固形分を、中赤外分析装置(HMA-Human Milk Analyser, Miris AB, Uppsala, Sweden)を使用して測定した。その後、サンプルを遠心分離し(Allegra X-12R, Beckman Coulter Inc., Brea, CA, USA)、除去又は同一の人乳サンプルのクリームを添加して全固形分含有量を調節した。サンプルの最終の全固形分含有量は、10個のサンプルで107〜146g/lの範囲であった。概要を表1に示す。
表皮ブドウ球菌(ATCC 12228)、エンテロバクター・クロアカエ(ATCC 27508)、セレウス菌(ATCC 10702)(American Type Culture Collection Inc, Manassas, VA, USA)及び大腸菌K12(ATCC 1498, Southern Biological, Nunawading, Vic, Australia)を、ニュートリエントブロス(Nutrient Broth No.2, Oxoid Australia Pty Ltd, Adelaide, SA, Australia)中で33℃で一晩培養した。黄色ブドウ球菌(ATCC 6538)(American Type Culture Collection Inc, Manassas, VA, USA)をトリプチックソイブロス(BBL Trypticase Soy Broth, Becton Dickinson & Co, Franklin Lakes, NJ, USA)中で33℃で一晩培養した。その後、予め描かれた標準曲線を用いて、吸光度法を使用して細菌を数えた。培地を希釈して、全固形分を調節した人乳サンプルに植菌して、母乳バンクの最大許容濃度105CFU/ml(ミリットル当たりコロニー形成単位)にした。
人乳中の胆汁酸塩刺激リパーゼ(BSSL)活性を、リパーゼアッセイキット(QuantiChrom Lipase Assay Kit, BioAssay Systems, Hayward, CA, USA)を使用して判定した。実施例1と同様の冷凍(−80°C)人乳サンプル(n=10)を解凍して37℃にし、DDI(1/100、v/v)で希釈し、キットの説明書に従い、アッセイを二重に(in duplicate)行った。吸光度を分光光度計(PowerWave, Biotek, Winooski, VT, USA)で測定し、キットの説明書の式に基づき、ミリリットル当たりBSSL活性(U/ml)に変換した。キットの直線検出範囲は、96ウェルプレートアッセイで40〜1600U/mlリパーゼ活性である。ユニットの定義:アッセイ条件下(pH8.5)で1分間に1.0μΜの基質の切断を触媒する酵素を1ユニットとする。グループ内の変動係数(CV)は7%未満であった。
アルカリホスファターゼ(ALP)はp−ニトロフェニルリン酸を加水分解させ、黄色の合成物を形成し、405nmで測定されたその強度は、サンプル中のALPの濃度と正比例する。ALP活性を、Walter and Schuett(23)に基づいて酵素アッセイを用いて分析した。実施例1と同様の冷凍(−80℃)人乳サンプルを解凍して37℃にし、DDI(1/4、v/v)で希釈して、サンプルを5μlずつ、96ウェルプレートに入れた135μlの基質(1M ジエタノールアミン、0.5mM MgCI2、pH10.3)に添加した。その後、10μlの発色試薬(10mM p−ニトロフェニルリン酸)をウェルに添加して、プレートを37℃で30分間培養した。吸光度を405nmで分光光度計(PowerWave, Biotek, Winooski, VT, USA)を使用して測定し、標準曲線を用いて1ミリリットル当たりのアルカリホスファターゼ活性(U/ml)に変換した。ユニット定義:アッセイ条件下で1分間に1.0mMのp−ニトロフェニルリン酸を加水分解する酵素を1ユニットとする。リカバリアッセイは94±9%、イントラ−アッセイ変動は6%未満であった。
脂肪酸(FA)を、Mitoulas et al.(24)に基づいて抽出及びエステル交換方法を用いて分析した。抗酸化剤としてブチル化ヒドロキシアニソールを使用し、クロロホルム/メタノール(2/1、v/v)を用いてFAを抽出した。1%H2SO4メタノール溶液を使用した酸トランスメチル化により、乳脂質抽出物からFAメチルエステルを調製した。その後、内径0.32mm、コーティング0.25μmのBPX−70(SGE Pty Ltd., Ringwood, VIC, Australia)の50mキャピラリーカラムを使用して、ガス・クロマトグラフィー(GC-2010、Shimadzu Co., Kyoto, Japan)により脂肪酸メチルエステルを分離、定量した。その後、各サンプル(3μl)を、オートインジェクタ(AOC-20i,Shimadzu Co., Kyoto, Japan)を使用して、分割比20:1でカラムに注入した。インジェクタ温度を250℃に、検出器(フレームイオン化)温度を300℃に設定した。初期オーブン温度は130℃であった。この温度は、5分以内で155℃に上昇し、その後1分以内で徐々に165℃に、その後5分以内で230℃に、そして最終的に10分以内で250℃に上昇して5分間維持されるよう最初にプログラムされた。ヘリウムを速度4ml/分でキャリアガスとして使用した。認証脂質基準(Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA)に対する保持時間に基づいて、脂肪酸を同定した。個々のFAピークをFAピーク下の総面積として定量化した。5つの別々の抽出に対してFAピーク下の面積の変動係数は、4.2%未満であった。
マウス又は人のCMVを細胞培地又は殺菌した母乳に植菌し、容器に注入して0.5mmの層を設けた。その後、サンプルをUV光源に10、20、30又は60秒間、UV光源から1、2、3、4cmの距離で曝した。UV光源の距離の違いにより、サンプルに異なる量の紫外線を届けることが容易になる。続いて、プラークアッセイ又は組織培養感染値量(TCID)50アッセイを用いて、サンプル中に存在するウイルスの不活化を評価した。
ホルダー殺菌:
母親から供与された(実施例1)10個の人乳冷凍サンプルそれぞれの一部(1.6ml;n=10)を、2mlポリプロピレンマイクロチューブに移した。その後、サンプルを予熱した水槽(CC−1,Huber GmbH. Offenburg, Germany)内に置き、30分間で62.5℃にし、その直後に氷槽で冷却した。実験室分析を行うまで、サンプルを−80℃で冷凍保存した。
大腸菌K12(ATCC1498, Southern Biological, Nunawading, Vic, Australia)と黄色ブドウ球菌(ATCC6538, American Type Culture Collection Inc, Manassas, VA, USA)をニュートリエントブロス(Nutrient Broth No.2, Oxoid Australia Pty Ltd, Adelaide, SA, Australia)で37℃で一晩培養した。予め描かれた標準曲線を用いて吸光度法を使用して数えた後、培地を希釈して、未処理のサンプル、UV−C照射したサンプル及びホルダー殺菌したサンプルに植種して、大腸菌及び黄色ぶどう球菌の細菌負荷を2000CFU/ml(ミリットル当たりコロニー形成単位)にした。植菌直後と37℃で2時間培養した後に、全てのサンプルを、複数、エオシンメチレンブルー寒天培地とマンニット食塩寒天培地(Oxoid Australia Pty Ltd, Adelaide, SA, Australia/Plain agar, Southern Biological, Nunawading, Vic, Australia)の上に蒔いた。その後、プレートを37℃で一晩培養して、コロニーの数を数えて、ミリットル当たりコロニー形成単位(CFU/ml)に基づいて細菌数を判定した。
UV−C照射した人乳(4683J/l)の細菌成長速度は毎時3.1±0.9倍であった。この成長速度は未処理の人乳と大きく違わなかった(p=0.75)。
10個の人乳のサンプルに、実施例1及び7にそれぞれ記載したように、UV処理又はホルダー殺菌を行った。
さまざまな処理(未処理、UV−C照射、ホルダー殺菌)が与え得る影響を考慮しても、分泌型IgA(p<0.001)、ラクトフェリン(p<0.001)及びリゾチーム(p<0.019)の濃度が個別に高くなれば、また、これら3つの合計(p<0.001)の濃度が高くなっても、1時間あたりの細菌成長速度は低下した(図9)。人乳のサンプルは、分泌型IgAとラクトフェリン(p<0.001)の濃度の間に高い相関を示したが、分泌型IgAとリゾチーム(p=0.35)及びラクトフェリンとリゾチーム(p=0.25)の間に有意な相関は見られなかった(図10)。
搾り出した人乳を、搾乳中及び貯蔵中に酸素、光、電離放射線、及び温度変化に曝す。殺菌等の環境ストレスは人乳中の活性酸素種(ROS)の生成の原因となり得る。温度上昇により細胞ROSの生成が高くなり、細胞の抗酸化能力を超え、次いで、その結果、ROS濃度が増加し得る。
図13の配置のように、各人乳サンプルの一部(150μl)を、UV−Cランプ(4W 波長254nm、40mW/cm2@1メーター、GPH287T5L、Infralight Technology, Helensburgh, NSW, Australia)の下に8mmの距離で0.4mm層に置き、3分間照射した。これらの条件下で、人乳中のサイトメガロウイルスを減少するのに10秒の処理時間が必要である(Marchant, 2011)。
各人乳サンプルの一部(1.6ml)を2mlポリプロピレンマイクロチューブに移した。サンプルを予熱した水槽(CC-1, Huber GmbH. Offenburg, Germany)内に置き、62.5℃にして、30分間維持し、その後すぐに氷槽で4℃に冷却し、分析又はさらなる処理のいずれかを施した。
未処理、UV−C照射した、及びホルダー殺菌した人乳サンプルのそれぞれ一定分量を10U/mlのカタラーゼ(Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA)で処理し、室温で15分間培養した。未処理、UV−C照射した、及びホルダー殺菌した人乳サンプルのそれぞれの別の一部を、10μΜのH2O2で処理し、室温で15分間培養した。
アンプレックスレッドアッセイ(Amplex red assay)(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)を使用して過酸化水素活性を検出し、544nmで励起を、590nmで発光と10のフラッシュを示した。
Claims (15)
- 人乳製品中の生物学的汚染物質の量を減少させる又は不活化する方法であって、該方法は、200nm〜280nmの波長を有する紫外線(UV)光に前記人乳を曝露させる、及び、前記汚染物質の前記UV光への曝露を促進するために前記乳製品に渦流を与える、ことを含み、
前記曝露が、前記乳製品中の前記汚染物質の量を減少させ又は不活化し、前記乳製品中に存在する生理活性成分の活性を実質的に減少させない方法。 - 前記渦流が渦によって前記人乳に与えられる、請求項1に記載の方法。
- 前記UV光が250nm〜270nm、好ましくは254nmの波長を有する、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記渦流が撹拌手段を使用して与えられる、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記渦流が、前記生理活性成分の活性を実質的に減少させずに、前記生物学的汚染物質を前記UV光に曝露させるのに十分な速度で与えられる、請求項4に記載の方法。
- 前記生物学的汚染物質の量が、少なくとも1−Log10オーダーで、好ましくは5−Log10オーダーで、減少される又は不活化される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記人乳に加えられる紫外線量が100〜10000J/lの範囲である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記汚染物質が、大腸菌(E. coli)、ブドウ球菌属(Staphylococcus spp.)、ストレプトコッカス属(Streptococcus spp.)、バシラス属(Bacillus spp.)、エンテロコッカス属(Enterococcus spp.)及びエンテロバクター属(Enterobacter spp.)を含む群から選択されるか、サイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、又はヒトTリンパ球向性ウイルスである、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生理活性成分が、炭水化物、脂質、蛋白質、脂肪酸、酵素、抗体、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗菌化合物、又は代謝産物である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生理活性成分が、胆汁酸塩刺激リパーゼ、アルカリホスファターゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ラクトフェリン、リゾチーム及び分泌型IgAを含む群から選択される蛋白質、ミエロペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、カタラーゼ、スーパーオキシド・ジスムターゼ、又はラクトフェリンであり、好ましくは胆汁酸塩刺激リパーゼ、アルカリホスファターゼ、ラクトフェリン、リゾチーム、分泌型IgA、より好ましくは胆汁酸塩刺激リパーゼ、アルカリホスファターゼ、ラクトフェリンである、請求項9の記載の方法。
- 前記人乳製品の静菌性、又は、生理活性成分若しくは抗酸化活性の濃度が、実質的に減少しない、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記人乳製品が人乳である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 人乳製品中の生物学的汚染物質の量を減少させる又は不活化する装置において、
ある体積の人乳製品を収容するための容器であって、UV光源が前記人乳製品をUV光に曝露させるように連結される容器と、
前記汚染物質の前記UV光源への曝露を促進するために、前記容器内に保持された前記人乳製品に渦流を与える手段と、を備えた装置。 - 前記渦流を与える手段が撹拌手段である、請求項13に記載の装置。
- 請求項1〜12のいずれか1項の方法によって調製される人乳製品。
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