JP2015536647A

JP2015536647A - 安定な非ポリアデニル化ｒｎａの生成

Info

Publication number: JP2015536647A
Application number: JP2015537026A
Authority: JP
Inventors: ジェレミーイー．ウィルシュ，; フィリップエー．シャープ，
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 2012-10-16
Filing date: 2013-10-16
Publication date: 2015-12-24
Also published as: KR20150070307A; CA2888215A1; WO2014062801A1; CN104955951A; EP2909321A4; MX2015004853A; US9717749B2; EP2909321A1; US20180140625A1; US10946035B2; HK1213294A1; US20150315574A1; IL238256A0; AU2013331351A1

Abstract

本発明は、複数の態様において、ポリＡテイルを欠くハイブリッドＲＮＡ、およびＲＮＡを発現させるための核酸ベクターに関する。一部の例では、これらのハイブリッドＲＮＡは、３’末端を安定化させる三重らせん構造を有する。ｉｎｖｉｖｏおよびｉｎｖｉｔｒｏでこれらのＲＮＡを発現させるための関連の方法もまた、開示される。他の態様では、ｍＲＮＡではない機能的ＲＮＡを生成するための方法が提供される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡではない機能的ＲＮＡは、標的ｍＲＮＡと塩基対合し得、標的ｍＲＮＡの発現を調節し得る、アンチセンスＲＮＡである。この調節は、上方調節または下方調節であり得る。

Description

関連出願
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２０１２年１０月１６日に出願された表題「ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮＯＦＳＴＡＢＬＥＮＯＮ−ＰＯＬＹＡＤＥＮＹＬＡＴＥＤＲＮＡＳ」の米国仮出願第６１／７１４，６９７号、２０１２年１０月２２日に出願された表題「ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮＯＦＳＴＡＢＬＥＮＯＮ−ＰＯＬＹＡＤＥＮＹＬＡＴＥＤＲＮＡＳ」の米国仮出願第６１／７１６，７６４号および２０１２年１２月１９日に出願された表題「ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮＯＦＳＴＡＢＬＥＮＯＮ−ＰＯＬＹＡＤＥＮＹＬＡＴＥＤＲＮＡＳ」の米国仮出願第６１／７３９，１５３号（これらは、それらの全体が参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。

政府によって資金援助を受けた研究
この発明は、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈによって付与された助成金番号ＧＭ３４２７７およびＣＡ１３３４０４の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、この発明に一定の権利を有する。

新生転写物の３’末端をプロセシングすることは、ＲＮＡポリメラーゼの終結および成熟ＲＮＡの適切な機能性を確実にするために重要である。正常な発生の間およびがんなどの疾患の進行において、３’末端切断部位の用法は頻繁に変化し、成熟ＲＮＡの３’末端において、転写物の安定性、細胞内局在または機能に影響を与え得るさらなる配列モチーフが含まれる（または排除される）という結果を生じる（ＬｕｔｚおよびＭｏｒｅｉｒａ２０１１年において概説される）。事実上全ての長いＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）転写物は、鋳型なしの様式でのアデノシン（Ａ）残基の付加が後に続く、エンドヌクレアーゼ的（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）切断によって生成されるポリＡテイルで終結する（ＭｏｏｒｅおよびＳｈａｒｐ、１９８５年；ＣｏｌｇａｎおよびＭａｎｌｅｙ、１９９７年において概説される；Ｚｈａｏら、１９９９年；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ２００４年）。しかし、最近のヒトトランスクリプトームの大規模研究は、転写がゲノム中にいきわたっていることを示し（Ｗｉｌｕｓｚら、２００９年において概説される）、細胞中に存在する長いＰｏｌＩＩ転写物の顕著な割合（おそらく＞２５％）が正準のポリＡテイルを欠き得ることを示唆している（Ｃｈｅｎｇら、２００５年；Ｗｕら、２００８年；Ｙａｎｇら、２０１１年ａ）。これらの転写物の一部は、分解中間体である可能性が高いが、ポリＡテイルを欠く、十分特徴付けられた安定なＰｏｌＩＩ転写物、例えば、複製依存的ヒストンｍＲＮＡが存在する。その３’末端におけるＵ７ｓｎＲＮＡにガイドされたエンドヌクレアーゼ的切断の後に、ヒストンｍＲＮＡは、ＲＮＡ安定性を確実にし、翻訳効率を増強するので、その３’非翻訳領域（ＵＴＲ）中に、ポリＡテイルと機能的に類似した高度に保存されたステム−ループ構造を有する（Ｍａｒｚｌｕｆｆら、２００８年において概説される）。

近年の研究は、非正準の３’末端プロセシング機構に供されるさらなるＰｏｌＩＩ転写物を同定している（ＷｉｌｕｓｚおよびＳｐｅｃｔｏｒ２０１０年において概説される）。特に、プレｍＲＮＡスプライシング（Ｂｏｘら、２００８年）およびｔＲＮＡ生合成などの他のＲＮＡプロセシング事象において周知の役割を有する酵素は、成熟３’末端を生成するために、特定の新生転写物を切断することが示されている。その十分特徴付けられた役割において、ＲＮａｓｅＰは、ｔＲＮＡ前駆体をエンドヌクレアーゼ的に切断して、機能的ｔＲＮＡの成熟５’末端を生成する（Ｋｉｒｓｅｂｏｍ２００７年において概説される）。ＲＮａｓｅＰはまた、近傍のポリアデニル化シグナルの存在にもかかわらず、ＮＥＡＴ２としても公知の長い非コードＲＮＡＭＡＬＡＴ１（転移関連肺腺癌転写物１）の成熟３’末端を生成することが示された（Ｗｉｌｕｓｚら、２００８年）。ＲＮａｓｅＰによる切断は、約６．７ｋｂのＭＡＬＡＴ１非コードＲＮＡの成熟３’末端および小さいｔＲＮＡ様転写物の５’末端を同時に生成する。ＲＮａｓｅＺおよびＣＣＡ付加酵素を含む、ｔＲＮＡ生合成に関与するさらなる酵素は、ｍａｓｃＲＮＡ（ＭＡＬＡＴ１関連小細胞質ＲＮＡ（ＭＡＬＡＴ１−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｓｍａｌｌｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃＲＮＡ））として公知の、６１ヌクレオチド（ｎｔ）の成熟転写物を生成するために、このｓｍａｌｌＲＮＡをさらにプロセシングする（Ｗｉｌｕｓｚら、２００８年）。

長いＭＡＬＡＴ１転写物は、核スペックルにおいて核中に保持され（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら、２００７年）、この場所で、選択的スプライシング（Ｔｒｉｐａｔｈｉら、２０１０年）、転写活性化（Ｙａｎｇら、２０１１年ｂ）およびｉｎｃｉｓでの近傍の遺伝子の発現（Ｎａｋａｇａｗａら、２０１２年；Ｚｈａｎｇら、２０１２年）を調節すると提唱されている。ＭＡＬＡＴ１遺伝子座は、マウスの発生にはなくてもよいようであるが（Ｅｉｓｓｍａｎｎら、２０１２年；Ｎａｋａｇａｗａら、２０１２年；Ｚｈａｎｇら、２０１２年）、ＭＡＬＡＴ１は、多くのヒトがんにおいて過剰発現され（Ｊｉら、２００３年；Ｌｉｎら、２００７年；Ｌａｉら、２０１１年）、これは、ＭＡＬＡＴ１ががんの進行の間に重要な機能を有し得ることを示唆している。さらに、がんに関連する染色体転座の分断点（Ｄａｖｉｓら、２００３年；Ｋｕｉｐｅｒら、２００３年；Ｒａｊａｒａｍら、２００７年）ならびに点変異および短い欠失（Ｅｌｌｉｓら、２０１２年）が、ＭＡＬＡＴ１内で同定されている。

正準のポリＡテイルを欠いているにもかかわらず、ＭＡＬＡＴ１は、マウスおよびヒトの細胞における最も豊富な長い非コードＲＮＡのなかで最たるものである。実際、ＭＡＬＡＴ１は、β−アクチンまたはＧＡＰＤＨを含む多くのタンパク質コード遺伝子と匹敵するまたはそれより高いレベルで発現される（Ｚｈａｎｇら、２０１２年）。

Ｚｈａｎｇら、ＣｅｌｌＲｅｐ（２０１２年）２：１１１〜１２３Ｅｌｌｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ（２０１２）４８６：３５３〜３６０

本発明は、一部の態様では、ハイブリッドＲＮＡ、このＲＮＡを発現させるための発現ベクター、およびそれらの使用の方法に関する。このハイブリッドＲＮＡは、内因性ＲＮＡのポリＡテイルを置き換える、安定化させる３’末端を含む。従って、一部の態様では、本発明は、末端配列に連結された、ポリＡテイルを欠くＲＮＡ分子を含むハイブリッド核酸である。

他の態様では、ｍＲＮＡではない機能的ＲＮＡを生成するための方法が提供される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡではない機能的ＲＮＡは、標的ｍＲＮＡと塩基対合し得、標的ｍＲＮＡの発現を調節し得る、アンチセンスＲＮＡである。この調節は、上方調節または下方調節であり得る。

一部の実施形態では、この末端配列は、三重らせんコンフォメーションを有する、異種ＲＮＡ安定化末端配列である。他の実施形態では、この末端配列は、ＭＡＬＡＴ１末端配列またはＭＥＮβ末端配列である、異種ＲＮＡ安定化末端配列である。なお他の実施形態では、この末端配列は、Ｕリッチ配列、Ａリッチ配列、ＵリッチおよびＡリッチ配列、またはＣリッチおよびＧリッチ配列である、異種ＲＮＡ安定化末端配列である。

他の実施形態では、この末端配列は、リガンド結合ドメインを有する。例えば、このリガンド結合ドメインは、組織特異的エレメントであり得る。一部の実施形態では、この組織はがん性組織であり、この組織特異的エレメントは、がん性組織における翻訳の調節に関与する。

このＲＮＡ分子は、任意の型のＲＮＡ分子であり得る。例えば、このＲＮＡ分子は、細胞質ＲＮＡ、核ＲＮＡ、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡであり得る。一部の実施形態では、このＲＮＡ分子は、真核生物ＲＮＡ、哺乳動物ＲＮＡ、植物ＲＮＡ、またはより具体的にはヒトＲＮＡである。一部の例では、このＲＮＡ分子は、レポーター分子に対応する。

ＲＮＡ分子に対応する核酸、このＲＮＡ分子に対応する核酸の上流のプロモーター、およびこのＲＮＡ分子に対応する核酸の下流の末端配列に対応する核酸を有するベクターが、本発明の他の態様に従って提供される。一部の実施形態では、このベクターはプラスミドである。

一部の実施形態では、このＲＮＡ分子に対応する核酸は、例えば緑色蛍光タンパク質などのレポータータンパク質をコードする核酸である。

他の実施形態では、このベクターは、本明細書に記載されるハイブリッド核酸のいずれかを生成する核酸配列を含む。

このプロモーターは、一部の実施形態では、異種プロモーターである。他の実施形態では、このプロモーターはＣＭＶプロモーターである。

本発明の他の態様では、ＲＮＡの翻訳を増強するための方法が提供される。この方法は、ポリＡテイルを欠く単離された細胞質ＲＮＡを、細胞において発現させるステップを含み、この細胞質ＲＮＡは、細胞におけるＲＮＡの翻訳を増強するのに有効な３’末端配列を有する。

一部の実施形態では、３’末端配列を有しポリＡテイルを欠く単離された細胞質ＲＮＡは、本明細書に記載されるハイブリッド核酸である。他の実施形態では、本明細書に記載されるベクターのいずれかが、ポリＡテイルを欠く単離された細胞質ＲＮＡを発現させるために、細胞に投与される。

３’異種末端配列を有しポリＡテイルを欠くＲＮＡを含む単離された核酸を細胞において発現させることにより、ポリＡテイルを欠くＲＮＡを発現させるための方法が、本発明の他の態様に従って提供される。一部の実施形態では、この単離された核酸は、本明細書に記載されるハイブリッド核酸のいずれかである。他の実施形態では、本明細書に記載されるベクターのいずれかが、単離された核酸を発現させるために、細胞に投与される。

一部の実施形態では、この核酸は、少なくとも１つの化学的改変または天然の改変を含む。

他の態様では、本発明は、ＲＮＡを精製するための方法である。この方法は、３’異種末端配列を有しポリＡテイルを欠くＲＮＡを含む単離された核酸の混合物を、アフィニティー精製ステップまたはサイズ排除精製ステップに供して、ポリＡテイルを欠く精製されたＲＮＡを得るステップを含む。

一部の実施形態では、この単離された核酸は、本特許出願内の至る所に開示されるハイブリッド核酸である。他の実施形態では、精製されたＲＮＡは、ｉｎｖｉｔｒｏ、ｅｘｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｖｏの方法において使用される。

３’異種末端配列を有しポリＡテイルを欠くＲＮＡを含む単離された核酸を、被験体においてタンパク質を発現させるのに有効な量で被験体に投与することにより、被験体において疾患を処置するための方法であって、このタンパク質は、被験体における疾患の処置において有用である、方法が、本発明の他の態様に従って提供される。一部の実施形態では、この疾患は、機能喪失に関連する疾患、例えば筋ジストロフィーまたは嚢胞性線維症である。他の実施形態では、この疾患は、がん、自己免疫、心血管疾患、神経変性疾患および皮膚疾患からなる群より選択される疾患である。

他の態様によれば、本発明は、組織生成のための方法であって、３’異種末端配列を有しポリＡテイルを欠くＲＮＡを含む単離された核酸を細胞において発現させるステップ、この細胞を増殖条件下で足場において増殖させて組織を形成させるステップを含む方法である。一部の実施形態では、この組織は身体中に移植される。

本発明は、本明細書に記載される方法に従って生成された組織もまた包含する。

本発明の他の態様では、幹細胞を生成するための方法が提供される。この方法は、３’異種末端配列を有しポリＡテイルを欠くＲＮＡを含む単離された核酸を、分化した細胞の集団において発現させるステップであって、このＲＮＡは、再プログラミングタンパク質をコードする、ステップ、再プログラミングを促進する条件下でこの分化した細胞を増殖させて、多能性幹細胞を形成させるステップを含む。

本明細書に記載される方法に従って生成された多能性幹細胞が、本発明の他の態様に従って提供される。

分化した細胞を生成するための方法が、本発明の態様に従って提供される。この方法は、３’異種末端配列を有しポリＡテイルを欠くＲＮＡを含む単離された核酸を、幹細胞の集団において発現させるステップであって、このＲＮＡは、分化タンパク質をコードする、ステップ、分化を促進する条件下でこの幹細胞を増殖させて、分化した細胞を形成させるステップを含む。

本発明は、他の態様では、３’異種末端配列を有しポリＡテイルを欠くＲＮＡを含む単離された核酸を含む単離された細胞の治療有効量を被験体に投与することにより、それを必要とする被験体において遺伝的欠陥を訂正する方法であって、このＲＮＡは、遺伝的欠陥を訂正するタンパク質をコードする、方法である。一部の実施形態では、この遺伝的欠陥は、免疫系障害を引き起こす遺伝的欠陥；神経学的障害を引き起こす遺伝的欠陥；心障害を引き起こす遺伝的欠陥；循環障害を引き起こす遺伝的欠陥および呼吸障害を引き起こす遺伝的欠陥からなる群より選択される。

３’異種末端配列を有しポリＡテイルを欠くＲＮＡを含む単離された核酸を含む単離された細胞の治療有効量を被験体に投与することにより、それを必要とする被験体において遺伝障害を処置する方法であって、このＲＮＡは置き換えタンパク質をコードし、この置き換えタンパク質の欠如は、遺伝障害に関連する、方法が、本発明の他の態様において提供される。

本発明は、他の態様では、異種ＲＮＡ安定化末端配列に連結された、ポリＡテイルを欠くＲＮＡ分子のハイブリッド核酸であって、このＲＮＡ分子は、免疫原性タンパク質をコードする、ハイブリッド核酸である。被験体にこのハイブリッド核酸を、この免疫原性タンパク質に対する獲得免疫応答を惹起するための有効量で投与することにより、被験体をワクチン接種するための方法が、他の実施形態において提供される。

他の態様では、本発明は、その動物の１つまたは複数の細胞中に、異種ＲＮＡに連結された、ポリＡテイルを欠く外因性ＲＮＡ分子、および安定化させる末端配列を含む、非ヒト動物である。一部の実施形態では、このＲＮＡ分子は、治療タンパク質または免疫原性タンパク質をコードする。

本発明は、その適用において、以下の説明において示されるまたは図面中に例示される構成要素の構築および配置の詳細に限定されない。本発明は、他の実施形態が可能であり、種々の方法で実行または実施されることが可能である。上記実施形態および態様の各々は、任意の他の実施形態または態様と関連付けられ得る。また、本明細書で使用される言葉遣いおよび専門用語は、説明を目的としており、限定として解釈すべきではない。本明細書中での「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」およびそれらのバリエーションの使用は、その後に列挙される項目およびそれらの等価物ならびにさらなる項目を包含する意味である。

添付の図面は、一定の拡大縮小比で描くことを意図していない。図面中、種々の図面中に例示される同一またはほぼ同一の各構成要素は、同様の数字で示される。明確さを目的として、全ての構成要素が全ての図面において標識され得るわけではない。

図１は、ＭＡＬＡＴ１の３’末端が、高度に保存され、ＲＮａｓｅＰによって切断されることを示す図である。（Ａ）ＭＡＬＡＴ１遺伝子座の３’末端にはポリアデニル化シグナルが存在するが、ＭＡＬＡＴ１は、ｔＲＮＡ生合成機械によって媒介される上流の切断機構を介して、主にプロセシングされる。ＲＮａｓｅＰ切断は、ＭＡＬＡＴ１の成熟３’末端およびｍａｓｃＲＮＡの５’末端を同時に生成する。ｔＲＮＡ様のｓｍａｌｌＲＮＡが、ＲＮａｓｅＺによって引き続いて切断され、ＣＣＡ付加に供される。示される配列は配列番号７０である。（Ｂ）ＭＡＬＡＴ１のＲＮａｓｅＰ切断部位（矢印によって示される）の直ぐ上流は、高度に進化的に保存されたＡリッチトラクトである。さらに上流には、予測されたステム−ループ構造によって分離されたほぼ完全に保存された２つのＵリッチモチーフが存在する。示される配列は、上から下に配列番号７１〜７８である。（Ｃ）類似のモチーフが、ＭＥＮβのＲＮａｓｅＰ切断部位の上流に存在する。示される配列は、上から下に配列番号７９〜８４である。（Ｄ）ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’センス発現プラスミドを、マウスＭＡＬＡＴ１のｎｔ６５８１〜６７５４をｃＧＦＰオープンリーディングフレームの下流に置くことによって生成した。３’末端にはポリアデニル化シグナルは存在しない。示される配列は配列番号７０である。（Ｅ）ＨｅＬａ細胞中にプラスミドをトランスフェクトした後、ノザンブロットを実施して、ｍａｓｃＲＮＡおよびｃＧＦＰＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡの発現を検出した。ｃＧＦＰＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡの３’末端が正確に生成されたことおよびさらなるヌクレオチドが転写後に付加されなかったことを検証するために、ＲＮａｓｅＨ消化を、ノザンブロット分析の前に実施した。図１は、ＭＡＬＡＴ１の３’末端が、高度に保存され、ＲＮａｓｅＰによって切断されることを示す図である。（Ａ）ＭＡＬＡＴ１遺伝子座の３’末端にはポリアデニル化シグナルが存在するが、ＭＡＬＡＴ１は、ｔＲＮＡ生合成機械によって媒介される上流の切断機構を介して、主にプロセシングされる。ＲＮａｓｅＰ切断は、ＭＡＬＡＴ１の成熟３’末端およびｍａｓｃＲＮＡの５’末端を同時に生成する。ｔＲＮＡ様のｓｍａｌｌＲＮＡが、ＲＮａｓｅＺによって引き続いて切断され、ＣＣＡ付加に供される。示される配列は配列番号７０である。（Ｂ）ＭＡＬＡＴ１のＲＮａｓｅＰ切断部位（矢印によって示される）の直ぐ上流は、高度に進化的に保存されたＡリッチトラクトである。さらに上流には、予測されたステム−ループ構造によって分離されたほぼ完全に保存された２つのＵリッチモチーフが存在する。示される配列は、上から下に配列番号７１〜７８である。（Ｃ）類似のモチーフが、ＭＥＮβのＲＮａｓｅＰ切断部位の上流に存在する。示される配列は、上から下に配列番号７９〜８４である。（Ｄ）ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’センス発現プラスミドを、マウスＭＡＬＡＴ１のｎｔ６５８１〜６７５４をｃＧＦＰオープンリーディングフレームの下流に置くことによって生成した。３’末端にはポリアデニル化シグナルは存在しない。示される配列は配列番号７０である。（Ｅ）ＨｅＬａ細胞中にプラスミドをトランスフェクトした後、ノザンブロットを実施して、ｍａｓｃＲＮＡおよびｃＧＦＰＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡの発現を検出した。ｃＧＦＰＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡの３’末端が正確に生成されたことおよびさらなるヌクレオチドが転写後に付加されなかったことを検証するために、ＲＮａｓｅＨ消化を、ノザンブロット分析の前に実施した。図１は、ＭＡＬＡＴ１の３’末端が、高度に保存され、ＲＮａｓｅＰによって切断されることを示す図である。（Ａ）ＭＡＬＡＴ１遺伝子座の３’末端にはポリアデニル化シグナルが存在するが、ＭＡＬＡＴ１は、ｔＲＮＡ生合成機械によって媒介される上流の切断機構を介して、主にプロセシングされる。ＲＮａｓｅＰ切断は、ＭＡＬＡＴ１の成熟３’末端およびｍａｓｃＲＮＡの５’末端を同時に生成する。ｔＲＮＡ様のｓｍａｌｌＲＮＡが、ＲＮａｓｅＺによって引き続いて切断され、ＣＣＡ付加に供される。示される配列は配列番号７０である。（Ｂ）ＭＡＬＡＴ１のＲＮａｓｅＰ切断部位（矢印によって示される）の直ぐ上流は、高度に進化的に保存されたＡリッチトラクトである。さらに上流には、予測されたステム−ループ構造によって分離されたほぼ完全に保存された２つのＵリッチモチーフが存在する。示される配列は、上から下に配列番号７１〜７８である。（Ｃ）類似のモチーフが、ＭＥＮβのＲＮａｓｅＰ切断部位の上流に存在する。示される配列は、上から下に配列番号７９〜８４である。（Ｄ）ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’センス発現プラスミドを、マウスＭＡＬＡＴ１のｎｔ６５８１〜６７５４をｃＧＦＰオープンリーディングフレームの下流に置くことによって生成した。３’末端にはポリアデニル化シグナルは存在しない。示される配列は配列番号７０である。（Ｅ）ＨｅＬａ細胞中にプラスミドをトランスフェクトした後、ノザンブロットを実施して、ｍａｓｃＲＮＡおよびｃＧＦＰＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡの発現を検出した。ｃＧＦＰＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡの３’末端が正確に生成されたことおよびさらなるヌクレオチドが転写後に付加されなかったことを検証するために、ＲＮａｓｅＨ消化を、ノザンブロット分析の前に実施した。図１は、ＭＡＬＡＴ１の３’末端が、高度に保存され、ＲＮａｓｅＰによって切断されることを示す図である。（Ａ）ＭＡＬＡＴ１遺伝子座の３’末端にはポリアデニル化シグナルが存在するが、ＭＡＬＡＴ１は、ｔＲＮＡ生合成機械によって媒介される上流の切断機構を介して、主にプロセシングされる。ＲＮａｓｅＰ切断は、ＭＡＬＡＴ１の成熟３’末端およびｍａｓｃＲＮＡの５’末端を同時に生成する。ｔＲＮＡ様のｓｍａｌｌＲＮＡが、ＲＮａｓｅＺによって引き続いて切断され、ＣＣＡ付加に供される。示される配列は配列番号７０である。（Ｂ）ＭＡＬＡＴ１のＲＮａｓｅＰ切断部位（矢印によって示される）の直ぐ上流は、高度に進化的に保存されたＡリッチトラクトである。さらに上流には、予測されたステム−ループ構造によって分離されたほぼ完全に保存された２つのＵリッチモチーフが存在する。示される配列は、上から下に配列番号７１〜７８である。（Ｃ）類似のモチーフが、ＭＥＮβのＲＮａｓｅＰ切断部位の上流に存在する。示される配列は、上から下に配列番号７９〜８４である。（Ｄ）ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’センス発現プラスミドを、マウスＭＡＬＡＴ１のｎｔ６５８１〜６７５４をｃＧＦＰオープンリーディングフレームの下流に置くことによって生成した。３’末端にはポリアデニル化シグナルは存在しない。示される配列は配列番号７０である。（Ｅ）ＨｅＬａ細胞中にプラスミドをトランスフェクトした後、ノザンブロットを実施して、ｍａｓｃＲＮＡおよびｃＧＦＰＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡの発現を検出した。ｃＧＦＰＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡの３’末端が正確に生成されたことおよびさらなるヌクレオチドが転写後に付加されなかったことを検証するために、ＲＮａｓｅＨ消化を、ノザンブロット分析の前に実施した。図１は、ＭＡＬＡＴ１の３’末端が、高度に保存され、ＲＮａｓｅＰによって切断されることを示す図である。（Ａ）ＭＡＬＡＴ１遺伝子座の３’末端にはポリアデニル化シグナルが存在するが、ＭＡＬＡＴ１は、ｔＲＮＡ生合成機械によって媒介される上流の切断機構を介して、主にプロセシングされる。ＲＮａｓｅＰ切断は、ＭＡＬＡＴ１の成熟３’末端およびｍａｓｃＲＮＡの５’末端を同時に生成する。ｔＲＮＡ様のｓｍａｌｌＲＮＡが、ＲＮａｓｅＺによって引き続いて切断され、ＣＣＡ付加に供される。示される配列は配列番号７０である。（Ｂ）ＭＡＬＡＴ１のＲＮａｓｅＰ切断部位（矢印によって示される）の直ぐ上流は、高度に進化的に保存されたＡリッチトラクトである。さらに上流には、予測されたステム−ループ構造によって分離されたほぼ完全に保存された２つのＵリッチモチーフが存在する。示される配列は、上から下に配列番号７１〜７８である。（Ｃ）類似のモチーフが、ＭＥＮβのＲＮａｓｅＰ切断部位の上流に存在する。示される配列は、上から下に配列番号７９〜８４である。（Ｄ）ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’センス発現プラスミドを、マウスＭＡＬＡＴ１のｎｔ６５８１〜６７５４をｃＧＦＰオープンリーディングフレームの下流に置くことによって生成した。３’末端にはポリアデニル化シグナルは存在しない。示される配列は配列番号７０である。（Ｅ）ＨｅＬａ細胞中にプラスミドをトランスフェクトした後、ノザンブロットを実施して、ｍａｓｃＲＮＡおよびｃＧＦＰＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡの発現を検出した。ｃＧＦＰＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡの３’末端が正確に生成されたことおよびさらなるヌクレオチドが転写後に付加されなかったことを検証するために、ＲＮａｓｅＨ消化を、ノザンブロット分析の前に実施した。図２は、ＵリッチモチーフがＭＡＬＡＴ１の３’末端のウリジル化および分解を阻害することを示す図である。（Ａ）本研究で使用されるｃＧＦＰ発現プラスミドの模式図。示される配列は配列番号７０である。正準のポリＡテイルで終わるｃＧＦＰ転写物を生成するために、ｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域を、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）またはＳＶ４０ポリアデニル化シグナルのいずれかで置き換えた（中）。核保持されるｃＧＦＰ転写物を生成するために、ｍＭＡＬＡＴ１のｎｔ１６７６〜３５９８を、ｃＧＦＰの上流に置いた（下）。（Ｂ）トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を分画して、核および細胞質の総ＲＮＡを単離し、次いで、ｃＧＦＰＯＲＦに対するプローブを用いたノザンブロット分析に供した。内因性ＭＡＬＡＴ１に対するプローブを、分画効率についての対照として使用した。（Ｃ）ＳｐｅｃｋｌｅＦ２−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物は、核中で効率的に保持された。（Ｄ）変異または欠失（赤色で示される）を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミドのｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域中に導入した。示される配列は、上から下に配列番号８５〜８９である。（Ｅ）野生型（ＷＴ）または変異体プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ノザンブロットを実施した。ＲＮａｓｅＨ処理を、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡを検出したノザンブロットの前に実施した。（Ｆ）ライゲーション媒介性の３’ＲＡＣＥアプローチを使用して、分解を受けているｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡ転写物の３’末端を試験した。転写後に付加されたヌクレオチドは、赤色で示される。示される配列は、上から下に配列番号９０〜１００である。（Ｇ）ＲＮａｓｅＨ処理とその後のノザンブロッティングを使用して、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’（図２Ｄ中に示されるｃｏｍｐ１４）転写物が安定であることを示した。５１ｎｔを欠失させてＣｏｍｐ．１４転写物を生成したので、１３９ｎｔのバンドのみが予測される。図２は、ＵリッチモチーフがＭＡＬＡＴ１の３’末端のウリジル化および分解を阻害することを示す図である。（Ａ）本研究で使用されるｃＧＦＰ発現プラスミドの模式図。示される配列は配列番号７０である。正準のポリＡテイルで終わるｃＧＦＰ転写物を生成するために、ｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域を、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）またはＳＶ４０ポリアデニル化シグナルのいずれかで置き換えた（中）。核保持されるｃＧＦＰ転写物を生成するために、ｍＭＡＬＡＴ１のｎｔ１６７６〜３５９８を、ｃＧＦＰの上流に置いた（下）。（Ｂ）トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を分画して、核および細胞質の総ＲＮＡを単離し、次いで、ｃＧＦＰＯＲＦに対するプローブを用いたノザンブロット分析に供した。内因性ＭＡＬＡＴ１に対するプローブを、分画効率についての対照として使用した。（Ｃ）ＳｐｅｃｋｌｅＦ２−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物は、核中で効率的に保持された。（Ｄ）変異または欠失（赤色で示される）を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミドのｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域中に導入した。示される配列は、上から下に配列番号８５〜８９である。（Ｅ）野生型（ＷＴ）または変異体プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ノザンブロットを実施した。ＲＮａｓｅＨ処理を、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡを検出したノザンブロットの前に実施した。（Ｆ）ライゲーション媒介性の３’ＲＡＣＥアプローチを使用して、分解を受けているｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡ転写物の３’末端を試験した。転写後に付加されたヌクレオチドは、赤色で示される。示される配列は、上から下に配列番号９０〜１００である。（Ｇ）ＲＮａｓｅＨ処理とその後のノザンブロッティングを使用して、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’（図２Ｄ中に示されるｃｏｍｐ１４）転写物が安定であることを示した。５１ｎｔを欠失させてＣｏｍｐ．１４転写物を生成したので、１３９ｎｔのバンドのみが予測される。図２は、ＵリッチモチーフがＭＡＬＡＴ１の３’末端のウリジル化および分解を阻害することを示す図である。（Ａ）本研究で使用されるｃＧＦＰ発現プラスミドの模式図。示される配列は配列番号７０である。正準のポリＡテイルで終わるｃＧＦＰ転写物を生成するために、ｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域を、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）またはＳＶ４０ポリアデニル化シグナルのいずれかで置き換えた（中）。核保持されるｃＧＦＰ転写物を生成するために、ｍＭＡＬＡＴ１のｎｔ１６７６〜３５９８を、ｃＧＦＰの上流に置いた（下）。（Ｂ）トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を分画して、核および細胞質の総ＲＮＡを単離し、次いで、ｃＧＦＰＯＲＦに対するプローブを用いたノザンブロット分析に供した。内因性ＭＡＬＡＴ１に対するプローブを、分画効率についての対照として使用した。（Ｃ）ＳｐｅｃｋｌｅＦ２−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物は、核中で効率的に保持された。（Ｄ）変異または欠失（赤色で示される）を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミドのｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域中に導入した。示される配列は、上から下に配列番号８５〜８９である。（Ｅ）野生型（ＷＴ）または変異体プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ノザンブロットを実施した。ＲＮａｓｅＨ処理を、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡを検出したノザンブロットの前に実施した。（Ｆ）ライゲーション媒介性の３’ＲＡＣＥアプローチを使用して、分解を受けているｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡ転写物の３’末端を試験した。転写後に付加されたヌクレオチドは、赤色で示される。示される配列は、上から下に配列番号９０〜１００である。（Ｇ）ＲＮａｓｅＨ処理とその後のノザンブロッティングを使用して、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’（図２Ｄ中に示されるｃｏｍｐ１４）転写物が安定であることを示した。５１ｎｔを欠失させてＣｏｍｐ．１４転写物を生成したので、１３９ｎｔのバンドのみが予測される。図２は、ＵリッチモチーフがＭＡＬＡＴ１の３’末端のウリジル化および分解を阻害することを示す図である。（Ａ）本研究で使用されるｃＧＦＰ発現プラスミドの模式図。示される配列は配列番号７０である。正準のポリＡテイルで終わるｃＧＦＰ転写物を生成するために、ｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域を、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）またはＳＶ４０ポリアデニル化シグナルのいずれかで置き換えた（中）。核保持されるｃＧＦＰ転写物を生成するために、ｍＭＡＬＡＴ１のｎｔ１６７６〜３５９８を、ｃＧＦＰの上流に置いた（下）。（Ｂ）トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を分画して、核および細胞質の総ＲＮＡを単離し、次いで、ｃＧＦＰＯＲＦに対するプローブを用いたノザンブロット分析に供した。内因性ＭＡＬＡＴ１に対するプローブを、分画効率についての対照として使用した。（Ｃ）ＳｐｅｃｋｌｅＦ２−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物は、核中で効率的に保持された。（Ｄ）変異または欠失（赤色で示される）を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミドのｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域中に導入した。示される配列は、上から下に配列番号８５〜８９である。（Ｅ）野生型（ＷＴ）または変異体プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ノザンブロットを実施した。ＲＮａｓｅＨ処理を、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡを検出したノザンブロットの前に実施した。（Ｆ）ライゲーション媒介性の３’ＲＡＣＥアプローチを使用して、分解を受けているｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡ転写物の３’末端を試験した。転写後に付加されたヌクレオチドは、赤色で示される。示される配列は、上から下に配列番号９０〜１００である。（Ｇ）ＲＮａｓｅＨ処理とその後のノザンブロッティングを使用して、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’（図２Ｄ中に示されるｃｏｍｐ１４）転写物が安定であることを示した。５１ｎｔを欠失させてＣｏｍｐ．１４転写物を生成したので、１３９ｎｔのバンドのみが予測される。図２は、ＵリッチモチーフがＭＡＬＡＴ１の３’末端のウリジル化および分解を阻害することを示す図である。（Ａ）本研究で使用されるｃＧＦＰ発現プラスミドの模式図。示される配列は配列番号７０である。正準のポリＡテイルで終わるｃＧＦＰ転写物を生成するために、ｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域を、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）またはＳＶ４０ポリアデニル化シグナルのいずれかで置き換えた（中）。核保持されるｃＧＦＰ転写物を生成するために、ｍＭＡＬＡＴ１のｎｔ１６７６〜３５９８を、ｃＧＦＰの上流に置いた（下）。（Ｂ）トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を分画して、核および細胞質の総ＲＮＡを単離し、次いで、ｃＧＦＰＯＲＦに対するプローブを用いたノザンブロット分析に供した。内因性ＭＡＬＡＴ１に対するプローブを、分画効率についての対照として使用した。（Ｃ）ＳｐｅｃｋｌｅＦ２−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物は、核中で効率的に保持された。（Ｄ）変異または欠失（赤色で示される）を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミドのｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域中に導入した。示される配列は、上から下に配列番号８５〜８９である。（Ｅ）野生型（ＷＴ）または変異体プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ノザンブロットを実施した。ＲＮａｓｅＨ処理を、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡを検出したノザンブロットの前に実施した。（Ｆ）ライゲーション媒介性の３’ＲＡＣＥアプローチを使用して、分解を受けているｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡ転写物の３’末端を試験した。転写後に付加されたヌクレオチドは、赤色で示される。示される配列は、上から下に配列番号９０〜１００である。（Ｇ）ＲＮａｓｅＨ処理とその後のノザンブロッティングを使用して、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’（図２Ｄ中に示されるｃｏｍｐ１４）転写物が安定であることを示した。５１ｎｔを欠失させてＣｏｍｐ．１４転写物を生成したので、１３９ｎｔのバンドのみが予測される。図２は、ＵリッチモチーフがＭＡＬＡＴ１の３’末端のウリジル化および分解を阻害することを示す図である。（Ａ）本研究で使用されるｃＧＦＰ発現プラスミドの模式図。示される配列は配列番号７０である。正準のポリＡテイルで終わるｃＧＦＰ転写物を生成するために、ｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域を、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）またはＳＶ４０ポリアデニル化シグナルのいずれかで置き換えた（中）。核保持されるｃＧＦＰ転写物を生成するために、ｍＭＡＬＡＴ１のｎｔ１６７６〜３５９８を、ｃＧＦＰの上流に置いた（下）。（Ｂ）トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を分画して、核および細胞質の総ＲＮＡを単離し、次いで、ｃＧＦＰＯＲＦに対するプローブを用いたノザンブロット分析に供した。内因性ＭＡＬＡＴ１に対するプローブを、分画効率についての対照として使用した。（Ｃ）ＳｐｅｃｋｌｅＦ２−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物は、核中で効率的に保持された。（Ｄ）変異または欠失（赤色で示される）を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミドのｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域中に導入した。示される配列は、上から下に配列番号８５〜８９である。（Ｅ）野生型（ＷＴ）または変異体プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ノザンブロットを実施した。ＲＮａｓｅＨ処理を、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡを検出したノザンブロットの前に実施した。（Ｆ）ライゲーション媒介性の３’ＲＡＣＥアプローチを使用して、分解を受けているｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡ転写物の３’末端を試験した。転写後に付加されたヌクレオチドは、赤色で示される。示される配列は、上から下に配列番号９０〜１００である。（Ｇ）ＲＮａｓｅＨ処理とその後のノザンブロッティングを使用して、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’（図２Ｄ中に示されるｃｏｍｐ１４）転写物が安定であることを示した。５１ｎｔを欠失させてＣｏｍｐ．１４転写物を生成したので、１３９ｎｔのバンドのみが予測される。図３は、Ｕリッチモチーフ２とＡリッチトラクトとの間の塩基対合が、ＭＡＬＡＴ１安定性のために必要ではあるが、十分ではないことを示す図である。（Ａ）成熟Ｃｏｍｐ．１４転写物（配列番号１０１）の３’末端の予測された二次構造。パネルＣ、ＤおよびＥ中の変異したＵリッチモチーフ２とＡリッチトラクトとの間の塩基対は、紫色で示される。（Ｂ）変異（赤色で示される）を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミド中に導入した。示される配列は、上から下に配列番号１０２〜１１１である。らせんの原子構造は、示された予測される構造から細部においては変動し得るが、二次構造の形成は強く支持される。完全１７４ｎｔｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域がこれらのプラスミド中に存在したが、Ｕリッチモチーフ２とＡリッチトラクトとの間の領域のみが示される。（Ｃ〜Ｅ）野生型（ＷＴ）または変異体プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ノザンブロットを実施した。ＲＮａｓｅＨ処理を、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡを検出するノザンブロットの前に実施した。図３は、Ｕリッチモチーフ２とＡリッチトラクトとの間の塩基対合が、ＭＡＬＡＴ１安定性のために必要ではあるが、十分ではないことを示す図である。（Ａ）成熟Ｃｏｍｐ．１４転写物（配列番号１０１）の３’末端の予測された二次構造。パネルＣ、ＤおよびＥ中の変異したＵリッチモチーフ２とＡリッチトラクトとの間の塩基対は、紫色で示される。（Ｂ）変異（赤色で示される）を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミド中に導入した。示される配列は、上から下に配列番号１０２〜１１１である。らせんの原子構造は、示された予測される構造から細部においては変動し得るが、二次構造の形成は強く支持される。完全１７４ｎｔｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域がこれらのプラスミド中に存在したが、Ｕリッチモチーフ２とＡリッチトラクトとの間の領域のみが示される。（Ｃ〜Ｅ）野生型（ＷＴ）または変異体プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ノザンブロットを実施した。ＲＮａｓｅＨ処理を、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡを検出するノザンブロットの前に実施した。図３は、Ｕリッチモチーフ２とＡリッチトラクトとの間の塩基対合が、ＭＡＬＡＴ１安定性のために必要ではあるが、十分ではないことを示す図である。（Ａ）成熟Ｃｏｍｐ．１４転写物（配列番号１０１）の３’末端の予測された二次構造。パネルＣ、ＤおよびＥ中の変異したＵリッチモチーフ２とＡリッチトラクトとの間の塩基対は、紫色で示される。（Ｂ）変異（赤色で示される）を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミド中に導入した。示される配列は、上から下に配列番号１０２〜１１１である。らせんの原子構造は、示された予測される構造から細部においては変動し得るが、二次構造の形成は強く支持される。完全１７４ｎｔｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域がこれらのプラスミド中に存在したが、Ｕリッチモチーフ２とＡリッチトラクトとの間の領域のみが示される。（Ｃ〜Ｅ）野生型（ＷＴ）または変異体プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ノザンブロットを実施した。ＲＮａｓｅＨ処理を、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡを検出するノザンブロットの前に実施した。図３は、Ｕリッチモチーフ２とＡリッチトラクトとの間の塩基対合が、ＭＡＬＡＴ１安定性のために必要ではあるが、十分ではないことを示す図である。（Ａ）成熟Ｃｏｍｐ．１４転写物（配列番号１０１）の３’末端の予測された二次構造。パネルＣ、ＤおよびＥ中の変異したＵリッチモチーフ２とＡリッチトラクトとの間の塩基対は、紫色で示される。（Ｂ）変異（赤色で示される）を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミド中に導入した。示される配列は、上から下に配列番号１０２〜１１１である。らせんの原子構造は、示された予測される構造から細部においては変動し得るが、二次構造の形成は強く支持される。完全１７４ｎｔｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域がこれらのプラスミド中に存在したが、Ｕリッチモチーフ２とＡリッチトラクトとの間の領域のみが示される。（Ｃ〜Ｅ）野生型（ＷＴ）または変異体プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ノザンブロットを実施した。ＲＮａｓｅＨ処理を、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡを検出するノザンブロットの前に実施した。図４は、ＭＡＬＡＴ１の３’末端において三重らせんが形成することを示す図である。（Ａ）三重塩基（破線によって示される）は、成熟Ｃｏｍｐ．１４転写物の３’末端において形成する。示される配列は、配列番号１０１である。この構造は、保存されたステムループの配向が９０度回転されていることを除いて、図３Ａ中に示したものと類似である。この予測された構造は、利用可能な場合には原子構造から細部において変動し得るが、三重らせんの形成は強く支持される。パネルＥ中の変異したＵ−Ａ・Ｕ三重塩基を、紫色で示す。（Ｂ）Ｕ−Ａ・ＵおよびＣ−Ｇ・Ｃ三重塩基は、ワトソン−クリック塩基対合したらせんの主溝に対するフーグスティーン水素結合を介して形成する。（Ｃ）漫画表示の、ＭＡＬＡＴ１Ｃｏｍｐ．１４３’末端のＲｏｓｅｔｔａモデル。塩基１〜５は、モデル化の収束を達成するために含めていない。パネルＡと同様、Ｕリッチモチーフ１は緑色であり、Ｕリッチモチーフ２は赤色であり、Ａリッチトラクトは青色である。残りの塩基は灰色である。（Ｄ）非結合塩基Ｃ−１１（パネルＡと同様の番号付け）を取り囲む三重らせんの拡大図。塩基は、黒色のワトソン−クリック水素結合、赤色のフーグスティーン水素結合と共に、スティック表示で示される。（Ｅ）４つのＵ−Ａ・Ｕ三重塩基を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミド中で、Ｃ−Ｇ・Ｃ三重塩基に漸進的に変換した。各構築物の名称において、^＊は、フーグスティーン水素結合を示す。次いで、野生型（ＷＴ）または変異体プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ウエスタンブロットを実施して、ｃＧＦＰタンパク質発現を検出した。ビンキュリンをローディング対照として使用した。（Ｆ）変異（赤色で示される）を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミド中に導入した。完全１７４ｎｔｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域がこれらのプラスミド中に存在したが、Ｕリッチモチーフ１周囲の領域のみが示される。パネルＡ中の構造との直接比較を可能にするために、各転写物の５’末端は右側にあることに留意のこと。示される配列は、上から下に配列番号１１２〜１１７である。次いで、ＷＴまたは変異体プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ノザンブロットを実施した。図４は、ＭＡＬＡＴ１の３’末端において三重らせんが形成することを示す図である。（Ａ）三重塩基（破線によって示される）は、成熟Ｃｏｍｐ．１４転写物の３’末端において形成する。示される配列は、配列番号１０１である。この構造は、保存されたステムループの配向が９０度回転されていることを除いて、図３Ａ中に示したものと類似である。この予測された構造は、利用可能な場合には原子構造から細部において変動し得るが、三重らせんの形成は強く支持される。パネルＥ中の変異したＵ−Ａ・Ｕ三重塩基を、紫色で示す。（Ｂ）Ｕ−Ａ・ＵおよびＣ−Ｇ・Ｃ三重塩基は、ワトソン−クリック塩基対合したらせんの主溝に対するフーグスティーン水素結合を介して形成する。（Ｃ）漫画表示の、ＭＡＬＡＴ１Ｃｏｍｐ．１４３’末端のＲｏｓｅｔｔａモデル。塩基１〜５は、モデル化の収束を達成するために含めていない。パネルＡと同様、Ｕリッチモチーフ１は緑色であり、Ｕリッチモチーフ２は赤色であり、Ａリッチトラクトは青色である。残りの塩基は灰色である。（Ｄ）非結合塩基Ｃ−１１（パネルＡと同様の番号付け）を取り囲む三重らせんの拡大図。塩基は、黒色のワトソン−クリック水素結合、赤色のフーグスティーン水素結合と共に、スティック表示で示される。（Ｅ）４つのＵ−Ａ・Ｕ三重塩基を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミド中で、Ｃ−Ｇ・Ｃ三重塩基に漸進的に変換した。各構築物の名称において、^＊は、フーグスティーン水素結合を示す。次いで、野生型（ＷＴ）または変異体プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ウエスタンブロットを実施して、ｃＧＦＰタンパク質発現を検出した。ビンキュリンをローディング対照として使用した。（Ｆ）変異（赤色で示される）を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミド中に導入した。完全１７４ｎｔｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域がこれらのプラスミド中に存在したが、Ｕリッチモチーフ１周囲の領域のみが示される。パネルＡ中の構造との直接比較を可能にするために、各転写物の５’末端は右側にあることに留意のこと。示される配列は、上から下に配列番号１１２〜１１７である。次いで、ＷＴまたは変異体プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ノザンブロットを実施した。図４は、ＭＡＬＡＴ１の３’末端において三重らせんが形成することを示す図である。（Ａ）三重塩基（破線によって示される）は、成熟Ｃｏｍｐ．１４転写物の３’末端において形成する。示される配列は、配列番号１０１である。この構造は、保存されたステムループの配向が９０度回転されていることを除いて、図３Ａ中に示したものと類似である。この予測された構造は、利用可能な場合には原子構造から細部において変動し得るが、三重らせんの形成は強く支持される。パネルＥ中の変異したＵ−Ａ・Ｕ三重塩基を、紫色で示す。（Ｂ）Ｕ−Ａ・ＵおよびＣ−Ｇ・Ｃ三重塩基は、ワトソン−クリック塩基対合したらせんの主溝に対するフーグスティーン水素結合を介して形成する。（Ｃ）漫画表示の、ＭＡＬＡＴ１Ｃｏｍｐ．１４３’末端のＲｏｓｅｔｔａモデル。塩基１〜５は、モデル化の収束を達成するために含めていない。パネルＡと同様、Ｕリッチモチーフ１は緑色であり、Ｕリッチモチーフ２は赤色であり、Ａリッチトラクトは青色である。残りの塩基は灰色である。（Ｄ）非結合塩基Ｃ−１１（パネルＡと同様の番号付け）を取り囲む三重らせんの拡大図。塩基は、黒色のワトソン−クリック水素結合、赤色のフーグスティーン水素結合と共に、スティック表示で示される。（Ｅ）４つのＵ−Ａ・Ｕ三重塩基を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミド中で、Ｃ−Ｇ・Ｃ三重塩基に漸進的に変換した。各構築物の名称において、^＊は、フーグスティーン水素結合を示す。次いで、野生型（ＷＴ）または変異体プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ウエスタンブロットを実施して、ｃＧＦＰタンパク質発現を検出した。ビンキュリンをローディング対照として使用した。（Ｆ）変異（赤色で示される）を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミド中に導入した。完全１７４ｎｔｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域がこれらのプラスミド中に存在したが、Ｕリッチモチーフ１周囲の領域のみが示される。パネルＡ中の構造との直接比較を可能にするために、各転写物の５’末端は右側にあることに留意のこと。示される配列は、上から下に配列番号１１２〜１１７である。次いで、ＷＴまたは変異体プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ノザンブロットを実施した。図４は、ＭＡＬＡＴ１の３’末端において三重らせんが形成することを示す図である。（Ａ）三重塩基（破線によって示される）は、成熟Ｃｏｍｐ．１４転写物の３’末端において形成する。示される配列は、配列番号１０１である。この構造は、保存されたステムループの配向が９０度回転されていることを除いて、図３Ａ中に示したものと類似である。この予測された構造は、利用可能な場合には原子構造から細部において変動し得るが、三重らせんの形成は強く支持される。パネルＥ中の変異したＵ−Ａ・Ｕ三重塩基を、紫色で示す。（Ｂ）Ｕ−Ａ・ＵおよびＣ−Ｇ・Ｃ三重塩基は、ワトソン−クリック塩基対合したらせんの主溝に対するフーグスティーン水素結合を介して形成する。（Ｃ）漫画表示の、ＭＡＬＡＴ１Ｃｏｍｐ．１４３’末端のＲｏｓｅｔｔａモデル。塩基１〜５は、モデル化の収束を達成するために含めていない。パネルＡと同様、Ｕリッチモチーフ１は緑色であり、Ｕリッチモチーフ２は赤色であり、Ａリッチトラクトは青色である。残りの塩基は灰色である。（Ｄ）非結合塩基Ｃ−１１（パネルＡと同様の番号付け）を取り囲む三重らせんの拡大図。塩基は、黒色のワトソン−クリック水素結合、赤色のフーグスティーン水素結合と共に、スティック表示で示される。（Ｅ）４つのＵ−Ａ・Ｕ三重塩基を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミド中で、Ｃ−Ｇ・Ｃ三重塩基に漸進的に変換した。各構築物の名称において、^＊は、フーグスティーン水素結合を示す。次いで、野生型（ＷＴ）または変異体プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ウエスタンブロットを実施して、ｃＧＦＰタンパク質発現を検出した。ビンキュリンをローディング対照として使用した。（Ｆ）変異（赤色で示される）を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミド中に導入した。完全１７４ｎｔｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域がこれらのプラスミド中に存在したが、Ｕリッチモチーフ１周囲の領域のみが示される。パネルＡ中の構造との直接比較を可能にするために、各転写物の５’末端は右側にあることに留意のこと。示される配列は、上から下に配列番号１１２〜１１７である。次いで、ＷＴまたは変異体プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ノザンブロットを実施した。図４は、ＭＡＬＡＴ１の３’末端において三重らせんが形成することを示す図である。（Ａ）三重塩基（破線によって示される）は、成熟Ｃｏｍｐ．１４転写物の３’末端において形成する。示される配列は、配列番号１０１である。この構造は、保存されたステムループの配向が９０度回転されていることを除いて、図３Ａ中に示したものと類似である。この予測された構造は、利用可能な場合には原子構造から細部において変動し得るが、三重らせんの形成は強く支持される。パネルＥ中の変異したＵ−Ａ・Ｕ三重塩基を、紫色で示す。（Ｂ）Ｕ−Ａ・ＵおよびＣ−Ｇ・Ｃ三重塩基は、ワトソン−クリック塩基対合したらせんの主溝に対するフーグスティーン水素結合を介して形成する。（Ｃ）漫画表示の、ＭＡＬＡＴ１Ｃｏｍｐ．１４３’末端のＲｏｓｅｔｔａモデル。塩基１〜５は、モデル化の収束を達成するために含めていない。パネルＡと同様、Ｕリッチモチーフ１は緑色であり、Ｕリッチモチーフ２は赤色であり、Ａリッチトラクトは青色である。残りの塩基は灰色である。（Ｄ）非結合塩基Ｃ−１１（パネルＡと同様の番号付け）を取り囲む三重らせんの拡大図。塩基は、黒色のワトソン−クリック水素結合、赤色のフーグスティーン水素結合と共に、スティック表示で示される。（Ｅ）４つのＵ−Ａ・Ｕ三重塩基を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミド中で、Ｃ−Ｇ・Ｃ三重塩基に漸進的に変換した。各構築物の名称において、^＊は、フーグスティーン水素結合を示す。次いで、野生型（ＷＴ）または変異体プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ウエスタンブロットを実施して、ｃＧＦＰタンパク質発現を検出した。ビンキュリンをローディング対照として使用した。（Ｆ）変異（赤色で示される）を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミド中に導入した。完全１７４ｎｔｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域がこれらのプラスミド中に存在したが、Ｕリッチモチーフ１周囲の領域のみが示される。パネルＡ中の構造との直接比較を可能にするために、各転写物の５’末端は右側にあることに留意のこと。示される配列は、上から下に配列番号１１２〜１１７である。次いで、ＷＴまたは変異体プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ノザンブロットを実施した。図４は、ＭＡＬＡＴ１の３’末端において三重らせんが形成することを示す図である。（Ａ）三重塩基（破線によって示される）は、成熟Ｃｏｍｐ．１４転写物の３’末端において形成する。示される配列は、配列番号１０１である。この構造は、保存されたステムループの配向が９０度回転されていることを除いて、図３Ａ中に示したものと類似である。この予測された構造は、利用可能な場合には原子構造から細部において変動し得るが、三重らせんの形成は強く支持される。パネルＥ中の変異したＵ−Ａ・Ｕ三重塩基を、紫色で示す。（Ｂ）Ｕ−Ａ・ＵおよびＣ−Ｇ・Ｃ三重塩基は、ワトソン−クリック塩基対合したらせんの主溝に対するフーグスティーン水素結合を介して形成する。（Ｃ）漫画表示の、ＭＡＬＡＴ１Ｃｏｍｐ．１４３’末端のＲｏｓｅｔｔａモデル。塩基１〜５は、モデル化の収束を達成するために含めていない。パネルＡと同様、Ｕリッチモチーフ１は緑色であり、Ｕリッチモチーフ２は赤色であり、Ａリッチトラクトは青色である。残りの塩基は灰色である。（Ｄ）非結合塩基Ｃ−１１（パネルＡと同様の番号付け）を取り囲む三重らせんの拡大図。塩基は、黒色のワトソン−クリック水素結合、赤色のフーグスティーン水素結合と共に、スティック表示で示される。（Ｅ）４つのＵ−Ａ・Ｕ三重塩基を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミド中で、Ｃ−Ｇ・Ｃ三重塩基に漸進的に変換した。各構築物の名称において、^＊は、フーグスティーン水素結合を示す。次いで、野生型（ＷＴ）または変異体プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ウエスタンブロットを実施して、ｃＧＦＰタンパク質発現を検出した。ビンキュリンをローディング対照として使用した。（Ｆ）変異（赤色で示される）を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミド中に導入した。完全１７４ｎｔｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域がこれらのプラスミド中に存在したが、Ｕリッチモチーフ１周囲の領域のみが示される。パネルＡ中の構造との直接比較を可能にするために、各転写物の５’末端は右側にあることに留意のこと。示される配列は、上から下に配列番号１１２〜１１７である。次いで、ＷＴまたは変異体プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ノザンブロットを実施した。図５は、ＭＡＬＡＴ１三重らせんが翻訳エンハンサーエレメントとして機能することを示す図である。（Ａ）指定された３’末端配列で終わるｃＧＦＰ転写物を発現するプラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトした。ｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域およびポリアデニル化シグナルを、示されたように、センス方向またはアンチセンス方向のいずれかで挿入した。ウエスタンブロットを実施して、ｃＧＦＰタンパク質発現を検出した。ビンキュリンをローディング対照として使用した。（Ｂ）２色蛍光レポーター発現系の模式図。（Ｃ）２色発現プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中に一過的にトランスフェクトし、フローサイトメトリーを使用して、単一細胞中のｍＣｈｅｒｒｙおよびｅＹＦＰのタンパク質発現を測定した。代表的実験（ｎ＝３）からの個々のトランスフェクトされた細胞において測定したｅＹＦＰタンパク質発現に対するｍＣｈｅｒｒｙタンパク質発現の比率のボックスプロットが示される（水平線、中央値；ボックス、２５〜７５パーセンタイル；エラーバー、１．５×四分位範囲）。（Ｄ）ＱＰＣＲを使用して、２色発現プラスミドをトランスフェクトした細胞の集団における、ｅＹＦＰｍＲＮＡに対するｍＣｈｅｒｒｙｍＲＮＡの比率を測定した。データを、ポリアデニル化構築物に対して正規化し、３つの独立した実験の平均および標準偏差値として示す。（Ｅ）変異または欠失（赤色で示される）を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミドのｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域中に導入した。示される配列は、上から下に配列番号８５および１１８〜１２２である。（Ｆ）次いで、野生型（ＷＴ）または変異体プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ノザンブロットを実施した。ＲＮａｓｅＨ処理を、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡを検出するノザンブロットの前に実施した。（Ｇ）ウエスタンブロッティングを使用して、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞中のｃＧＦＰ発現を検出した。（Ｈ）トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を分画して、核および細胞質の総ＲＮＡを単離し、次いで、ノザンブロット分析に供した。（Ｉ）翻訳を促進することにおいて機能するヌクレオチド（紫色で示される）は、ＭＡＬＡＴ１の３’末端において三重らせん領域に隣接する。示される配列は、配列番号１０１である。図５は、ＭＡＬＡＴ１三重らせんが翻訳エンハンサーエレメントとして機能することを示す図である。（Ａ）指定された３’末端配列で終わるｃＧＦＰ転写物を発現するプラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトした。ｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域およびポリアデニル化シグナルを、示されたように、センス方向またはアンチセンス方向のいずれかで挿入した。ウエスタンブロットを実施して、ｃＧＦＰタンパク質発現を検出した。ビンキュリンをローディング対照として使用した。（Ｂ）２色蛍光レポーター発現系の模式図。（Ｃ）２色発現プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中に一過的にトランスフェクトし、フローサイトメトリーを使用して、単一細胞中のｍＣｈｅｒｒｙおよびｅＹＦＰのタンパク質発現を測定した。代表的実験（ｎ＝３）からの個々のトランスフェクトされた細胞において測定したｅＹＦＰタンパク質発現に対するｍＣｈｅｒｒｙタンパク質発現の比率のボックスプロットが示される（水平線、中央値；ボックス、２５〜７５パーセンタイル；エラーバー、１．５×四分位範囲）。（Ｄ）ＱＰＣＲを使用して、２色発現プラスミドをトランスフェクトした細胞の集団における、ｅＹＦＰｍＲＮＡに対するｍＣｈｅｒｒｙｍＲＮＡの比率を測定した。データを、ポリアデニル化構築物に対して正規化し、３つの独立した実験の平均および標準偏差値として示す。（Ｅ）変異または欠失（赤色で示される）を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミドのｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域中に導入した。示される配列は、上から下に配列番号８５および１１８〜１２２である。（Ｆ）次いで、野生型（ＷＴ）または変異体プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ノザンブロットを実施した。ＲＮａｓｅＨ処理を、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡを検出するノザンブロットの前に実施した。（Ｇ）ウエスタンブロッティングを使用して、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞中のｃＧＦＰ発現を検出した。（Ｈ）トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を分画して、核および細胞質の総ＲＮＡを単離し、次いで、ノザンブロット分析に供した。（Ｉ）翻訳を促進することにおいて機能するヌクレオチド（紫色で示される）は、ＭＡＬＡＴ１の３’末端において三重らせん領域に隣接する。示される配列は、配列番号１０１である。図５は、ＭＡＬＡＴ１三重らせんが翻訳エンハンサーエレメントとして機能することを示す図である。（Ａ）指定された３’末端配列で終わるｃＧＦＰ転写物を発現するプラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトした。ｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域およびポリアデニル化シグナルを、示されたように、センス方向またはアンチセンス方向のいずれかで挿入した。ウエスタンブロットを実施して、ｃＧＦＰタンパク質発現を検出した。ビンキュリンをローディング対照として使用した。（Ｂ）２色蛍光レポーター発現系の模式図。（Ｃ）２色発現プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中に一過的にトランスフェクトし、フローサイトメトリーを使用して、単一細胞中のｍＣｈｅｒｒｙおよびｅＹＦＰのタンパク質発現を測定した。代表的実験（ｎ＝３）からの個々のトランスフェクトされた細胞において測定したｅＹＦＰタンパク質発現に対するｍＣｈｅｒｒｙタンパク質発現の比率のボックスプロットが示される（水平線、中央値；ボックス、２５〜７５パーセンタイル；エラーバー、１．５×四分位範囲）。（Ｄ）ＱＰＣＲを使用して、２色発現プラスミドをトランスフェクトした細胞の集団における、ｅＹＦＰｍＲＮＡに対するｍＣｈｅｒｒｙｍＲＮＡの比率を測定した。データを、ポリアデニル化構築物に対して正規化し、３つの独立した実験の平均および標準偏差値として示す。（Ｅ）変異または欠失（赤色で示される）を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミドのｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域中に導入した。示される配列は、上から下に配列番号８５および１１８〜１２２である。（Ｆ）次いで、野生型（ＷＴ）または変異体プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ノザンブロットを実施した。ＲＮａｓｅＨ処理を、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡを検出するノザンブロットの前に実施した。（Ｇ）ウエスタンブロッティングを使用して、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞中のｃＧＦＰ発現を検出した。（Ｈ）トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を分画して、核および細胞質の総ＲＮＡを単離し、次いで、ノザンブロット分析に供した。（Ｉ）翻訳を促進することにおいて機能するヌクレオチド（紫色で示される）は、ＭＡＬＡＴ１の３’末端において三重らせん領域に隣接する。示される配列は、配列番号１０１である。図５は、ＭＡＬＡＴ１三重らせんが翻訳エンハンサーエレメントとして機能することを示す図である。（Ａ）指定された３’末端配列で終わるｃＧＦＰ転写物を発現するプラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトした。ｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域およびポリアデニル化シグナルを、示されたように、センス方向またはアンチセンス方向のいずれかで挿入した。ウエスタンブロットを実施して、ｃＧＦＰタンパク質発現を検出した。ビンキュリンをローディング対照として使用した。（Ｂ）２色蛍光レポーター発現系の模式図。（Ｃ）２色発現プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中に一過的にトランスフェクトし、フローサイトメトリーを使用して、単一細胞中のｍＣｈｅｒｒｙおよびｅＹＦＰのタンパク質発現を測定した。代表的実験（ｎ＝３）からの個々のトランスフェクトされた細胞において測定したｅＹＦＰタンパク質発現に対するｍＣｈｅｒｒｙタンパク質発現の比率のボックスプロットが示される（水平線、中央値；ボックス、２５〜７５パーセンタイル；エラーバー、１．５×四分位範囲）。（Ｄ）ＱＰＣＲを使用して、２色発現プラスミドをトランスフェクトした細胞の集団における、ｅＹＦＰｍＲＮＡに対するｍＣｈｅｒｒｙｍＲＮＡの比率を測定した。データを、ポリアデニル化構築物に対して正規化し、３つの独立した実験の平均および標準偏差値として示す。（Ｅ）変異または欠失（赤色で示される）を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミドのｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域中に導入した。示される配列は、上から下に配列番号８５および１１８〜１２２である。（Ｆ）次いで、野生型（ＷＴ）または変異体プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ノザンブロットを実施した。ＲＮａｓｅＨ処理を、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡを検出するノザンブロットの前に実施した。（Ｇ）ウエスタンブロッティングを使用して、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞中のｃＧＦＰ発現を検出した。（Ｈ）トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を分画して、核および細胞質の総ＲＮＡを単離し、次いで、ノザンブロット分析に供した。（Ｉ）翻訳を促進することにおいて機能するヌクレオチド（紫色で示される）は、ＭＡＬＡＴ１の３’末端において三重らせん領域に隣接する。示される配列は、配列番号１０１である。図５は、ＭＡＬＡＴ１三重らせんが翻訳エンハンサーエレメントとして機能することを示す図である。（Ａ）指定された３’末端配列で終わるｃＧＦＰ転写物を発現するプラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトした。ｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域およびポリアデニル化シグナルを、示されたように、センス方向またはアンチセンス方向のいずれかで挿入した。ウエスタンブロットを実施して、ｃＧＦＰタンパク質発現を検出した。ビンキュリンをローディング対照として使用した。（Ｂ）２色蛍光レポーター発現系の模式図。（Ｃ）２色発現プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中に一過的にトランスフェクトし、フローサイトメトリーを使用して、単一細胞中のｍＣｈｅｒｒｙおよびｅＹＦＰのタンパク質発現を測定した。代表的実験（ｎ＝３）からの個々のトランスフェクトされた細胞において測定したｅＹＦＰタンパク質発現に対するｍＣｈｅｒｒｙタンパク質発現の比率のボックスプロットが示される（水平線、中央値；ボックス、２５〜７５パーセンタイル；エラーバー、１．５×四分位範囲）。（Ｄ）ＱＰＣＲを使用して、２色発現プラスミドをトランスフェクトした細胞の集団における、ｅＹＦＰｍＲＮＡに対するｍＣｈｅｒｒｙｍＲＮＡの比率を測定した。データを、ポリアデニル化構築物に対して正規化し、３つの独立した実験の平均および標準偏差値として示す。（Ｅ）変異または欠失（赤色で示される）を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミドのｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域中に導入した。示される配列は、上から下に配列番号８５および１１８〜１２２である。（Ｆ）次いで、野生型（ＷＴ）または変異体プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ノザンブロットを実施した。ＲＮａｓｅＨ処理を、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡを検出するノザンブロットの前に実施した。（Ｇ）ウエスタンブロッティングを使用して、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞中のｃＧＦＰ発現を検出した。（Ｈ）トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を分画して、核および細胞質の総ＲＮＡを単離し、次いで、ノザンブロット分析に供した。（Ｉ）翻訳を促進することにおいて機能するヌクレオチド（紫色で示される）は、ＭＡＬＡＴ１の３’末端において三重らせん領域に隣接する。示される配列は、配列番号１０１である。図５は、ＭＡＬＡＴ１三重らせんが翻訳エンハンサーエレメントとして機能することを示す図である。（Ａ）指定された３’末端配列で終わるｃＧＦＰ転写物を発現するプラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトした。ｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域およびポリアデニル化シグナルを、示されたように、センス方向またはアンチセンス方向のいずれかで挿入した。ウエスタンブロットを実施して、ｃＧＦＰタンパク質発現を検出した。ビンキュリンをローディング対照として使用した。（Ｂ）２色蛍光レポーター発現系の模式図。（Ｃ）２色発現プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中に一過的にトランスフェクトし、フローサイトメトリーを使用して、単一細胞中のｍＣｈｅｒｒｙおよびｅＹＦＰのタンパク質発現を測定した。代表的実験（ｎ＝３）からの個々のトランスフェクトされた細胞において測定したｅＹＦＰタンパク質発現に対するｍＣｈｅｒｒｙタンパク質発現の比率のボックスプロットが示される（水平線、中央値；ボックス、２５〜７５パーセンタイル；エラーバー、１．５×四分位範囲）。（Ｄ）ＱＰＣＲを使用して、２色発現プラスミドをトランスフェクトした細胞の集団における、ｅＹＦＰｍＲＮＡに対するｍＣｈｅｒｒｙｍＲＮＡの比率を測定した。データを、ポリアデニル化構築物に対して正規化し、３つの独立した実験の平均および標準偏差値として示す。（Ｅ）変異または欠失（赤色で示される）を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミドのｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域中に導入した。示される配列は、上から下に配列番号８５および１１８〜１２２である。（Ｆ）次いで、野生型（ＷＴ）または変異体プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ノザンブロットを実施した。ＲＮａｓｅＨ処理を、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡを検出するノザンブロットの前に実施した。（Ｇ）ウエスタンブロッティングを使用して、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞中のｃＧＦＰ発現を検出した。（Ｈ）トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を分画して、核および細胞質の総ＲＮＡを単離し、次いで、ノザンブロット分析に供した。（Ｉ）翻訳を促進することにおいて機能するヌクレオチド（紫色で示される）は、ＭＡＬＡＴ１の３’末端において三重らせん領域に隣接する。示される配列は、配列番号１０１である。図５は、ＭＡＬＡＴ１三重らせんが翻訳エンハンサーエレメントとして機能することを示す図である。（Ａ）指定された３’末端配列で終わるｃＧＦＰ転写物を発現するプラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトした。ｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域およびポリアデニル化シグナルを、示されたように、センス方向またはアンチセンス方向のいずれかで挿入した。ウエスタンブロットを実施して、ｃＧＦＰタンパク質発現を検出した。ビンキュリンをローディング対照として使用した。（Ｂ）２色蛍光レポーター発現系の模式図。（Ｃ）２色発現プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中に一過的にトランスフェクトし、フローサイトメトリーを使用して、単一細胞中のｍＣｈｅｒｒｙおよびｅＹＦＰのタンパク質発現を測定した。代表的実験（ｎ＝３）からの個々のトランスフェクトされた細胞において測定したｅＹＦＰタンパク質発現に対するｍＣｈｅｒｒｙタンパク質発現の比率のボックスプロットが示される（水平線、中央値；ボックス、２５〜７５パーセンタイル；エラーバー、１．５×四分位範囲）。（Ｄ）ＱＰＣＲを使用して、２色発現プラスミドをトランスフェクトした細胞の集団における、ｅＹＦＰｍＲＮＡに対するｍＣｈｅｒｒｙｍＲＮＡの比率を測定した。データを、ポリアデニル化構築物に対して正規化し、３つの独立した実験の平均および標準偏差値として示す。（Ｅ）変異または欠失（赤色で示される）を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミドのｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域中に導入した。示される配列は、上から下に配列番号８５および１１８〜１２２である。（Ｆ）次いで、野生型（ＷＴ）または変異体プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ノザンブロットを実施した。ＲＮａｓｅＨ処理を、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡを検出するノザンブロットの前に実施した。（Ｇ）ウエスタンブロッティングを使用して、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞中のｃＧＦＰ発現を検出した。（Ｈ）トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を分画して、核および細胞質の総ＲＮＡを単離し、次いで、ノザンブロット分析に供した。（Ｉ）翻訳を促進することにおいて機能するヌクレオチド（紫色で示される）は、ＭＡＬＡＴ１の３’末端において三重らせん領域に隣接する。示される配列は、配列番号１０１である。図６は、リボソームフットプリントが、マウス胚性幹細胞においてＭＡＬＡＴ１の５’末端の近傍で観察されることを示す図である。Ｉｎｇｏｌｉａら、２０１１年によって決定される、マウス胚様体およびマウス胚性幹細胞（白血病抑制因子ＬＩＦの存在下または非存在下で増殖させた）におけるＭＡＬＡＴ１のｍＲＮＡ−ｓｅｑおよびリボソームフットプリントプロファイルが示される。ＭＡＬＡＴ１転写開始部位は、図の右側に矢印で示される。図７は、ＭＡＬＡＴ１三重らせんで終わる転写物が、ｍｉｃｒｏＲＮＡによってｉｎｖｉｖｏで効率的に抑制されることを示す図である。（Ａ）ｍＣｈｅｒｒｙの３’ＵＴＲ中に挿入したものは、ｌｅｔ−７または２つのバルジ化ｌｅｔ−７結合部位に対して完全に相補的な配列のいずれかであった。ｌｅｔ−７ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列は青色で示される。示される配列は、上から下に配列番号１２３〜１２５、および２回反復した配列番号１２４である。（Ｂ）ＨｅＬａ細胞に、ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位ありまたはなし（０×で示される）の、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルまたはｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域のいずれかで終わる２色蛍光レポータープラスミドをトランスフェクトした。さらに、４０ｎＭの対照ｓｉＲＮＡまたは外因性ｌｅｔ−７ｍｉｃｒｏＲＮＡを、示されたように共トランスフェクトした。次いで、フローサイトメトリーを使用して、ｍＣｈｅｒｒｙおよびｅＹＦＰのタンパク質レベルを測定した。相対的抑制倍率を、非標的化（０×）レポーターについての当量比に対して正規化した、標的化された構築物の平均ｅＹＦＰシグナルに対する平均ｍＣｈｅｒｒｙシグナルの比率として計算した。データは、３回の独立した実験の平均および標準偏差値として示される。（Ｃ）ＱＰＣＲを使用して、細胞の集団にわたるｍＣｈｅｒｒｙおよびｅＹＦＰ転写物レベルを測定し、ｍＣｈｅｒｒｙＲＮＡ発現の相対的抑制倍率を、上記と同様に計算した。データは、３回の独立した実験の平均および標準偏差値として示される。図７は、ＭＡＬＡＴ１三重らせんで終わる転写物が、ｍｉｃｒｏＲＮＡによってｉｎｖｉｖｏで効率的に抑制されることを示す図である。（Ａ）ｍＣｈｅｒｒｙの３’ＵＴＲ中に挿入したものは、ｌｅｔ−７または２つのバルジ化ｌｅｔ−７結合部位に対して完全に相補的な配列のいずれかであった。ｌｅｔ−７ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列は青色で示される。示される配列は、上から下に配列番号１２３〜１２５、および２回反復した配列番号１２４である。（Ｂ）ＨｅＬａ細胞に、ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位ありまたはなし（０×で示される）の、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルまたはｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域のいずれかで終わる２色蛍光レポータープラスミドをトランスフェクトした。さらに、４０ｎＭの対照ｓｉＲＮＡまたは外因性ｌｅｔ−７ｍｉｃｒｏＲＮＡを、示されたように共トランスフェクトした。次いで、フローサイトメトリーを使用して、ｍＣｈｅｒｒｙおよびｅＹＦＰのタンパク質レベルを測定した。相対的抑制倍率を、非標的化（０×）レポーターについての当量比に対して正規化した、標的化された構築物の平均ｅＹＦＰシグナルに対する平均ｍＣｈｅｒｒｙシグナルの比率として計算した。データは、３回の独立した実験の平均および標準偏差値として示される。（Ｃ）ＱＰＣＲを使用して、細胞の集団にわたるｍＣｈｅｒｒｙおよびｅＹＦＰ転写物レベルを測定し、ｍＣｈｅｒｒｙＲＮＡ発現の相対的抑制倍率を、上記と同様に計算した。データは、３回の独立した実験の平均および標準偏差値として示される。図７は、ＭＡＬＡＴ１三重らせんで終わる転写物が、ｍｉｃｒｏＲＮＡによってｉｎｖｉｖｏで効率的に抑制されることを示す図である。（Ａ）ｍＣｈｅｒｒｙの３’ＵＴＲ中に挿入したものは、ｌｅｔ−７または２つのバルジ化ｌｅｔ−７結合部位に対して完全に相補的な配列のいずれかであった。ｌｅｔ−７ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列は青色で示される。示される配列は、上から下に配列番号１２３〜１２５、および２回反復した配列番号１２４である。（Ｂ）ＨｅＬａ細胞に、ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位ありまたはなし（０×で示される）の、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルまたはｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域のいずれかで終わる２色蛍光レポータープラスミドをトランスフェクトした。さらに、４０ｎＭの対照ｓｉＲＮＡまたは外因性ｌｅｔ−７ｍｉｃｒｏＲＮＡを、示されたように共トランスフェクトした。次いで、フローサイトメトリーを使用して、ｍＣｈｅｒｒｙおよびｅＹＦＰのタンパク質レベルを測定した。相対的抑制倍率を、非標的化（０×）レポーターについての当量比に対して正規化した、標的化された構築物の平均ｅＹＦＰシグナルに対する平均ｍＣｈｅｒｒｙシグナルの比率として計算した。データは、３回の独立した実験の平均および標準偏差値として示される。（Ｃ）ＱＰＣＲを使用して、細胞の集団にわたるｍＣｈｅｒｒｙおよびｅＹＦＰ転写物レベルを測定し、ｍＣｈｅｒｒｙＲＮＡ発現の相対的抑制倍率を、上記と同様に計算した。データは、３回の独立した実験の平均および標準偏差値として示される。図８は、構造的に不安定なｍａｓｃＲＮＡ変異体が、ｉｎｖｉｖｏでの分解のために、その３’末端でマークされることを示す図である。（Ａ）その５’末端にＧＧを有し、かつ不安定なアクセプターステムを含有するｔＲＮＡ（およびｔＲＮＡ様転写物）が、ＣＣＡ付加酵素によるＣＣＡＣＣＡの付加によって、迅速な分解のために標的化されることが示された（Ｗｉｌｕｓｚら、２０１１年）。示される配列は、共に配列番号１２６である。精製されたＣＣＡ付加酵素を使用することで、アクセプターステムにおける４つの変異（赤色で示される）の導入を介した、ｉｎｖｉｔｒｏでＣＣＡからＣＣＡＣＣＡ標的へのｍａｓｃＲＮＡの変換が可能になった（Ｍｕｔ１０転写物を生じる）。対照的に、不安定なアクセプターステムを有するがその５’末端においてＧＡを有するｍａｓｃＲＮＡ変異体（Ｍｕｔ７）は、ｉｎｖｉｔｒｏでＣＣＡ標的を保持した。ｉｎｖｉｖｏでのＣＣＡＣＣＡ付加のためのこれらの配列要件を確認するために、これら２つの変異体ｍａｓｃＲＮＡ転写物を発現するＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’プラスミドを生成した。（Ｂ）野生型（ＷＴ）または変異体発現プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ノザンブロットを使用して、ｍａｓｃＲＮＡおよびｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡの発現を検出した。ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡは、両方の変異体プラスミドから効率的に生成されたので、ｍａｓｃＲＮＡ変異のいずれも、ＲＮａｓｅＰ切断に影響を与えなかった（下）。対照的に、いずれの変異体ｍａｓｃＲＮＡ転写物も、ノザンブロット分析によって検出可能でなく（上）、これは、両方が、ＲＮａｓｅＰ切断後に効率的に分解されたことを示している。（Ｃ）ライゲーションベースの３’ＲＡＣＥＰＣＲアプローチを実施することによって、ＣＣＡＣＣ（Ａ）が、ｉｎｖｉｖｏでｍａｓｃＲＮＡＭｕｔ１０転写物に付加されたことが見出された。転写後に付加されたヌクレオチドは赤色で示される。示される配列は、上から下に配列番号１２７〜１３１である。（Ｄ）対照的に、かつ以前のｉｎｖｉｔｒｏ結果（Ｗｉｌｕｓｚら、２０１１年）と一致して、ＣＣＡＣＣＡで終わるｍａｓｃＲＮＡＭｕｔ７転写物は検出されなかった。その代り、Ｍｕｔ７転写物の３’末端に付加された短いＵリッチテイルがしばしば観察され、これは、分解プロセスにおけるウリジル化を暗示する。示される配列は、上から下に配列番号１３２〜１３８である。いくつかのＲＡＣＥクローンについて、これらのＵリッチテイルは、アクセプターステム内で始まっており、これは、３’−５’エキソヌクレアーゼが、この二本鎖領域内で立ち往生した可能性が高いこと、およびこのＵリッチテイルが、崩壊プロセスを認識および再開するためにエキソヌクレアーゼのための新たな一本鎖テイルを提供するために付加されたことを示している。これは、短い一本鎖テイルが、ｉｎｖｉｖｏの多重化機構によって、構造的に不安定なｔＲＮＡおよびｔＲＮＡ様転写物の３’末端に付加されて、転写物分解を生じることを示している。図８は、構造的に不安定なｍａｓｃＲＮＡ変異体が、ｉｎｖｉｖｏでの分解のために、その３’末端でマークされることを示す図である。（Ａ）その５’末端にＧＧを有し、かつ不安定なアクセプターステムを含有するｔＲＮＡ（およびｔＲＮＡ様転写物）が、ＣＣＡ付加酵素によるＣＣＡＣＣＡの付加によって、迅速な分解のために標的化されることが示された（Ｗｉｌｕｓｚら、２０１１年）。示される配列は、共に配列番号１２６である。精製されたＣＣＡ付加酵素を使用することで、アクセプターステムにおける４つの変異（赤色で示される）の導入を介した、ｉｎｖｉｔｒｏでＣＣＡからＣＣＡＣＣＡ標的へのｍａｓｃＲＮＡの変換が可能になった（Ｍｕｔ１０転写物を生じる）。対照的に、不安定なアクセプターステムを有するがその５’末端においてＧＡを有するｍａｓｃＲＮＡ変異体（Ｍｕｔ７）は、ｉｎｖｉｔｒｏでＣＣＡ標的を保持した。ｉｎｖｉｖｏでのＣＣＡＣＣＡ付加のためのこれらの配列要件を確認するために、これら２つの変異体ｍａｓｃＲＮＡ転写物を発現するＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’プラスミドを生成した。（Ｂ）野生型（ＷＴ）または変異体発現プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ノザンブロットを使用して、ｍａｓｃＲＮＡおよびｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡの発現を検出した。ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡは、両方の変異体プラスミドから効率的に生成されたので、ｍａｓｃＲＮＡ変異のいずれも、ＲＮａｓｅＰ切断に影響を与えなかった（下）。対照的に、いずれの変異体ｍａｓｃＲＮＡ転写物も、ノザンブロット分析によって検出可能でなく（上）、これは、両方が、ＲＮａｓｅＰ切断後に効率的に分解されたことを示している。（Ｃ）ライゲーションベースの３’ＲＡＣＥＰＣＲアプローチを実施することによって、ＣＣＡＣＣ（Ａ）が、ｉｎｖｉｖｏでｍａｓｃＲＮＡＭｕｔ１０転写物に付加されたことが見出された。転写後に付加されたヌクレオチドは赤色で示される。示される配列は、上から下に配列番号１２７〜１３１である。（Ｄ）対照的に、かつ以前のｉｎｖｉｔｒｏ結果（Ｗｉｌｕｓｚら、２０１１年）と一致して、ＣＣＡＣＣＡで終わるｍａｓｃＲＮＡＭｕｔ７転写物は検出されなかった。その代り、Ｍｕｔ７転写物の３’末端に付加された短いＵリッチテイルがしばしば観察され、これは、分解プロセスにおけるウリジル化を暗示する。示される配列は、上から下に配列番号１３２〜１３８である。いくつかのＲＡＣＥクローンについて、これらのＵリッチテイルは、アクセプターステム内で始まっており、これは、３’−５’エキソヌクレアーゼが、この二本鎖領域内で立ち往生した可能性が高いこと、およびこのＵリッチテイルが、崩壊プロセスを認識および再開するためにエキソヌクレアーゼのための新たな一本鎖テイルを提供するために付加されたことを示している。これは、短い一本鎖テイルが、ｉｎｖｉｖｏの多重化機構によって、構造的に不安定なｔＲＮＡおよびｔＲＮＡ様転写物の３’末端に付加されて、転写物分解を生じることを示している。図８は、構造的に不安定なｍａｓｃＲＮＡ変異体が、ｉｎｖｉｖｏでの分解のために、その３’末端でマークされることを示す図である。（Ａ）その５’末端にＧＧを有し、かつ不安定なアクセプターステムを含有するｔＲＮＡ（およびｔＲＮＡ様転写物）が、ＣＣＡ付加酵素によるＣＣＡＣＣＡの付加によって、迅速な分解のために標的化されることが示された（Ｗｉｌｕｓｚら、２０１１年）。示される配列は、共に配列番号１２６である。精製されたＣＣＡ付加酵素を使用することで、アクセプターステムにおける４つの変異（赤色で示される）の導入を介した、ｉｎｖｉｔｒｏでＣＣＡからＣＣＡＣＣＡ標的へのｍａｓｃＲＮＡの変換が可能になった（Ｍｕｔ１０転写物を生じる）。対照的に、不安定なアクセプターステムを有するがその５’末端においてＧＡを有するｍａｓｃＲＮＡ変異体（Ｍｕｔ７）は、ｉｎｖｉｔｒｏでＣＣＡ標的を保持した。ｉｎｖｉｖｏでのＣＣＡＣＣＡ付加のためのこれらの配列要件を確認するために、これら２つの変異体ｍａｓｃＲＮＡ転写物を発現するＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’プラスミドを生成した。（Ｂ）野生型（ＷＴ）または変異体発現プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ノザンブロットを使用して、ｍａｓｃＲＮＡおよびｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡの発現を検出した。ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡは、両方の変異体プラスミドから効率的に生成されたので、ｍａｓｃＲＮＡ変異のいずれも、ＲＮａｓｅＰ切断に影響を与えなかった（下）。対照的に、いずれの変異体ｍａｓｃＲＮＡ転写物も、ノザンブロット分析によって検出可能でなく（上）、これは、両方が、ＲＮａｓｅＰ切断後に効率的に分解されたことを示している。（Ｃ）ライゲーションベースの３’ＲＡＣＥＰＣＲアプローチを実施することによって、ＣＣＡＣＣ（Ａ）が、ｉｎｖｉｖｏでｍａｓｃＲＮＡＭｕｔ１０転写物に付加されたことが見出された。転写後に付加されたヌクレオチドは赤色で示される。示される配列は、上から下に配列番号１２７〜１３１である。（Ｄ）対照的に、かつ以前のｉｎｖｉｔｒｏ結果（Ｗｉｌｕｓｚら、２０１１年）と一致して、ＣＣＡＣＣＡで終わるｍａｓｃＲＮＡＭｕｔ７転写物は検出されなかった。その代り、Ｍｕｔ７転写物の３’末端に付加された短いＵリッチテイルがしばしば観察され、これは、分解プロセスにおけるウリジル化を暗示する。示される配列は、上から下に配列番号１３２〜１３８である。いくつかのＲＡＣＥクローンについて、これらのＵリッチテイルは、アクセプターステム内で始まっており、これは、３’−５’エキソヌクレアーゼが、この二本鎖領域内で立ち往生した可能性が高いこと、およびこのＵリッチテイルが、崩壊プロセスを認識および再開するためにエキソヌクレアーゼのための新たな一本鎖テイルを提供するために付加されたことを示している。これは、短い一本鎖テイルが、ｉｎｖｉｖｏの多重化機構によって、構造的に不安定なｔＲＮＡおよびｔＲＮＡ様転写物の３’末端に付加されて、転写物分解を生じることを示している。図９は、ＭＡＬＡＴ１ｔＲＮＡ様構造が、ｉｎｖｉｖｏのＲＮａｓｅＰ動員およびｍａｓｃＲＮＡ生合成に十分であることを示す図である。（Ａ）ＣＭＶ駆動性転写物からのｍａｓｃＲＮＡ生合成に必要とされる最小の配列エレメントを同定するために、漸進的な欠失を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミド中に導入した（上）。ｃＧＦＰオープンリーディングフレームを最初に除去して、ＣＭＶ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミドを生成した（中）。このプラスミドは、なおも完全１７４ｎｔｍＭＡＬＡＴ１＿３’断片（ｎｔ６５８１〜６７５４）を含有しており、従って、ＲＮａｓｅＰ切断部位の上流に、ＵリッチモチーフおよびＡリッチモチーフを含む。次いで、ｍａｓｃＲＮＡｔＲＮＡ様構造自体がｍａｓｃＲＮＡ生合成に十分であるかどうかを決定するために、ＭＡＬＡＴ１ＲＮａｓｅＰ切断部位の上流の領域を、無関係の１２ｎｔ配列で置き換えて、ＣＭＶ−Ｌｅａｄｅｒ−ｍｍａｓｃＲＮＡ発現プラスミドを生成した（下）。この１２ｎｔ配列は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのプレ−ｔＲＮＡ（Ｔｙｒ）由来の５’リーダーである。各々のプラスミドについてのアンチセンス対照（示さず）を、アンチセンス配向でＭＡＬＡＴ１／ｍａｓｃＲＮＡ領域を置くことによって生成した。示される配列は、上から下に配列番号１３９、１３９および１４０である。（Ｂ）これらの発現プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、総ＲＮＡを２４時間後に単離した。次いで、ノザンブロットを実施して、ｍａｓｃＲＮＡ発現を検出した。Ｕ６ｓｎＲＮＡをローディング対照として使用した。ｍａｓｃＲＮＡは、３つ全てのセンスプラスミドから効率的に生成されたので、これは、ｉｎｖｉｖｏでのｍａｓｃＲＮＡ生成に必要とされるＭＡＬＡＴ１の唯一の領域が、ｔＲＮＡ様構造自体であることを示している。図９は、ＭＡＬＡＴ１ｔＲＮＡ様構造が、ｉｎｖｉｖｏのＲＮａｓｅＰ動員およびｍａｓｃＲＮＡ生合成に十分であることを示す図である。（Ａ）ＣＭＶ駆動性転写物からのｍａｓｃＲＮＡ生合成に必要とされる最小の配列エレメントを同定するために、漸進的な欠失を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミド中に導入した（上）。ｃＧＦＰオープンリーディングフレームを最初に除去して、ＣＭＶ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミドを生成した（中）。このプラスミドは、なおも完全１７４ｎｔｍＭＡＬＡＴ１＿３’断片（ｎｔ６５８１〜６７５４）を含有しており、従って、ＲＮａｓｅＰ切断部位の上流に、ＵリッチモチーフおよびＡリッチモチーフを含む。次いで、ｍａｓｃＲＮＡｔＲＮＡ様構造自体がｍａｓｃＲＮＡ生合成に十分であるかどうかを決定するために、ＭＡＬＡＴ１ＲＮａｓｅＰ切断部位の上流の領域を、無関係の１２ｎｔ配列で置き換えて、ＣＭＶ−Ｌｅａｄｅｒ−ｍｍａｓｃＲＮＡ発現プラスミドを生成した（下）。この１２ｎｔ配列は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのプレ−ｔＲＮＡ（Ｔｙｒ）由来の５’リーダーである。各々のプラスミドについてのアンチセンス対照（示さず）を、アンチセンス配向でＭＡＬＡＴ１／ｍａｓｃＲＮＡ領域を置くことによって生成した。示される配列は、上から下に配列番号１３９、１３９および１４０である。（Ｂ）これらの発現プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、総ＲＮＡを２４時間後に単離した。次いで、ノザンブロットを実施して、ｍａｓｃＲＮＡ発現を検出した。Ｕ６ｓｎＲＮＡをローディング対照として使用した。ｍａｓｃＲＮＡは、３つ全てのセンスプラスミドから効率的に生成されたので、これは、ｉｎｖｉｖｏでのｍａｓｃＲＮＡ生成に必要とされるＭＡＬＡＴ１の唯一の領域が、ｔＲＮＡ様構造自体であることを示している。図１０は、ＭＥＮβの３’末端がＲＮａｓｅＰによって切断され、効率的な翻訳を支持することを示す図である。（Ａ）使用した発現プラスミドの模式図。ｃＧＦＰオープンリーディングフレームの下流に挿入したものは、ｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域（上）、ＳＶ４０もしくはｂＧＨポリアデニル化シグナル（中）、またはＭＥＮβのｔＲＮＡ様構造ならびに保存された上流のＵリッチモチーフおよびＡリッチモチーフを含むマウスＭＥＮβ遺伝子座の３’末端由来の１７４ｎｔ領域（下）であった。示される配列は、共に配列番号１３９である。（Ｂ）ＨｅＬａ細胞中にこれらのプラスミドをトランスフェクトした後、ノザンブロットを実施して、ｍａｓｃＲＮＡおよびｃＧＦＰｍＲＮＡの発現を検出した。種々の構築物によるｃＧＦＰｍＲＮＡ３’末端プロセシングの精度を検証するために、ＲＮａｓｅＨ消化を、ノザンブロット分析の前に実施した。ＳＶ４０またはｂＧＨのポリＡ部位で終わるｃＧＦＰ転写物について、付加されたポリＡテイルの長さにおけるバリエーションを示すスメアが観察された。対照的に、予測されたサイズ（１９０ｎｔ）の明確なバンドが、ＭＡＬＡＴ１またはＭＥＮβの３’末端で終わるｃＧＦＰ転写物について観察され、これは、さらなるヌクレオチドがＲＮａｓｅＰ切断後に付加されなかったことを示している。（Ｃ）ウエスタンブロットを実施して、トランスフェクトされたプラスミドからのｃＧＦＰタンパク質発現を検出した。ビンキュリンをローディング対照として使用した。結果は、ＭＡＬＡＴ１およびＭＥＮβの３’末端が、類似のレベルの翻訳を支持することを示す。図１０は、ＭＥＮβの３’末端がＲＮａｓｅＰによって切断され、効率的な翻訳を支持することを示す図である。（Ａ）使用した発現プラスミドの模式図。ｃＧＦＰオープンリーディングフレームの下流に挿入したものは、ｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域（上）、ＳＶ４０もしくはｂＧＨポリアデニル化シグナル（中）、またはＭＥＮβのｔＲＮＡ様構造ならびに保存された上流のＵリッチモチーフおよびＡリッチモチーフを含むマウスＭＥＮβ遺伝子座の３’末端由来の１７４ｎｔ領域（下）であった。示される配列は、共に配列番号１３９である。（Ｂ）ＨｅＬａ細胞中にこれらのプラスミドをトランスフェクトした後、ノザンブロットを実施して、ｍａｓｃＲＮＡおよびｃＧＦＰｍＲＮＡの発現を検出した。種々の構築物によるｃＧＦＰｍＲＮＡ３’末端プロセシングの精度を検証するために、ＲＮａｓｅＨ消化を、ノザンブロット分析の前に実施した。ＳＶ４０またはｂＧＨのポリＡ部位で終わるｃＧＦＰ転写物について、付加されたポリＡテイルの長さにおけるバリエーションを示すスメアが観察された。対照的に、予測されたサイズ（１９０ｎｔ）の明確なバンドが、ＭＡＬＡＴ１またはＭＥＮβの３’末端で終わるｃＧＦＰ転写物について観察され、これは、さらなるヌクレオチドがＲＮａｓｅＰ切断後に付加されなかったことを示している。（Ｃ）ウエスタンブロットを実施して、トランスフェクトされたプラスミドからのｃＧＦＰタンパク質発現を検出した。ビンキュリンをローディング対照として使用した。結果は、ＭＡＬＡＴ１およびＭＥＮβの３’末端が、類似のレベルの翻訳を支持することを示す。図１０は、ＭＥＮβの３’末端がＲＮａｓｅＰによって切断され、効率的な翻訳を支持することを示す図である。（Ａ）使用した発現プラスミドの模式図。ｃＧＦＰオープンリーディングフレームの下流に挿入したものは、ｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域（上）、ＳＶ４０もしくはｂＧＨポリアデニル化シグナル（中）、またはＭＥＮβのｔＲＮＡ様構造ならびに保存された上流のＵリッチモチーフおよびＡリッチモチーフを含むマウスＭＥＮβ遺伝子座の３’末端由来の１７４ｎｔ領域（下）であった。示される配列は、共に配列番号１３９である。（Ｂ）ＨｅＬａ細胞中にこれらのプラスミドをトランスフェクトした後、ノザンブロットを実施して、ｍａｓｃＲＮＡおよびｃＧＦＰｍＲＮＡの発現を検出した。種々の構築物によるｃＧＦＰｍＲＮＡ３’末端プロセシングの精度を検証するために、ＲＮａｓｅＨ消化を、ノザンブロット分析の前に実施した。ＳＶ４０またはｂＧＨのポリＡ部位で終わるｃＧＦＰ転写物について、付加されたポリＡテイルの長さにおけるバリエーションを示すスメアが観察された。対照的に、予測されたサイズ（１９０ｎｔ）の明確なバンドが、ＭＡＬＡＴ１またはＭＥＮβの３’末端で終わるｃＧＦＰ転写物について観察され、これは、さらなるヌクレオチドがＲＮａｓｅＰ切断後に付加されなかったことを示している。（Ｃ）ウエスタンブロットを実施して、トランスフェクトされたプラスミドからのｃＧＦＰタンパク質発現を検出した。ビンキュリンをローディング対照として使用した。結果は、ＭＡＬＡＴ１およびＭＥＮβの３’末端が、類似のレベルの翻訳を支持することを示す。図１１は、ＵリッチモチーフおよびＡリッチモチーフが、核中でＭＡＬＡＴ１の３’末端を安定化するために重要であることを示す図である。（Ａ）Ｕリッチモチーフ１、Ｕリッチモチーフ２またはＡリッチトラクト中の変異（赤色で示される）を、図２Ｃに示される核保持される長い転写物を生成するＣＭＶ−ＳｐｅｃｋｌｅＦ２−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミド中に導入した。示される配列は、上から下に配列番号８５、８６、１４１および１４２である。（Ｂ）野生型（ＷＴ）または変異体ＣＭＶ−ＳｐｅｃｋｌｅＦ２−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトした。対照として、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミドもまた使用した（レーン２）。次いで、ノザンブロットを実施して、ｍａｓｃＲＮＡおよびＳｐｅｃｋｌｅＦ２−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物（またはレーン２中のｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物）の発現を検出した。長いＳｐｅｃｋｌｅＦ２−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物の３’末端が正確に生成されたこと、およびさらなるヌクレオチドが転写後に付加されなかったことを検証するために、ＲＮａｓｅＨ消化を、ノザンブロット分析の前に実施した。ＳｐｅｃｋｌｅＦ２−ＭＡＬＡＴ１＿３’変異体転写物は、分析によるノザンにより検出不能であったので、本発明者らは、ＵリッチモチーフおよびＡリッチモチーフが全て、核中でＭＡＬＡＴ１を安定化するために必要とされると結論付けた。（Ｃ）ライゲーション媒介性の３’ＲＡＣＥアプローチを使用して、分解を受けているＳｐｅｃｋｌｅＦ２−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物の３’末端を試験した。ウリジル化された崩壊中間体を示す３つのクローン（配列決定した１５のうち）が検出され、これは、ウリジル化もまた核中で発生することを示唆している。示される配列は、上から下に配列番号８５および１４３〜１４５である。興味深いことに、これら３つのウリジル化された転写物は、短いＵテイルの付加の前に、３’末端から顕著に分解されていた。図１１は、ＵリッチモチーフおよびＡリッチモチーフが、核中でＭＡＬＡＴ１の３’末端を安定化するために重要であることを示す図である。（Ａ）Ｕリッチモチーフ１、Ｕリッチモチーフ２またはＡリッチトラクト中の変異（赤色で示される）を、図２Ｃに示される核保持される長い転写物を生成するＣＭＶ−ＳｐｅｃｋｌｅＦ２−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミド中に導入した。示される配列は、上から下に配列番号８５、８６、１４１および１４２である。（Ｂ）野生型（ＷＴ）または変異体ＣＭＶ−ＳｐｅｃｋｌｅＦ２−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトした。対照として、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミドもまた使用した（レーン２）。次いで、ノザンブロットを実施して、ｍａｓｃＲＮＡおよびＳｐｅｃｋｌｅＦ２−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物（またはレーン２中のｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物）の発現を検出した。長いＳｐｅｃｋｌｅＦ２−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物の３’末端が正確に生成されたこと、およびさらなるヌクレオチドが転写後に付加されなかったことを検証するために、ＲＮａｓｅＨ消化を、ノザンブロット分析の前に実施した。ＳｐｅｃｋｌｅＦ２−ＭＡＬＡＴ１＿３’変異体転写物は、分析によるノザンにより検出不能であったので、本発明者らは、ＵリッチモチーフおよびＡリッチモチーフが全て、核中でＭＡＬＡＴ１を安定化するために必要とされると結論付けた。（Ｃ）ライゲーション媒介性の３’ＲＡＣＥアプローチを使用して、分解を受けているＳｐｅｃｋｌｅＦ２−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物の３’末端を試験した。ウリジル化された崩壊中間体を示す３つのクローン（配列決定した１５のうち）が検出され、これは、ウリジル化もまた核中で発生することを示唆している。示される配列は、上から下に配列番号８５および１４３〜１４５である。興味深いことに、これら３つのウリジル化された転写物は、短いＵテイルの付加の前に、３’末端から顕著に分解されていた。図１１は、ＵリッチモチーフおよびＡリッチモチーフが、核中でＭＡＬＡＴ１の３’末端を安定化するために重要であることを示す図である。（Ａ）Ｕリッチモチーフ１、Ｕリッチモチーフ２またはＡリッチトラクト中の変異（赤色で示される）を、図２Ｃに示される核保持される長い転写物を生成するＣＭＶ−ＳｐｅｃｋｌｅＦ２−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミド中に導入した。示される配列は、上から下に配列番号８５、８６、１４１および１４２である。（Ｂ）野生型（ＷＴ）または変異体ＣＭＶ−ＳｐｅｃｋｌｅＦ２−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトした。対照として、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミドもまた使用した（レーン２）。次いで、ノザンブロットを実施して、ｍａｓｃＲＮＡおよびＳｐｅｃｋｌｅＦ２−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物（またはレーン２中のｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物）の発現を検出した。長いＳｐｅｃｋｌｅＦ２−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物の３’末端が正確に生成されたこと、およびさらなるヌクレオチドが転写後に付加されなかったことを検証するために、ＲＮａｓｅＨ消化を、ノザンブロット分析の前に実施した。ＳｐｅｃｋｌｅＦ２−ＭＡＬＡＴ１＿３’変異体転写物は、分析によるノザンにより検出不能であったので、本発明者らは、ＵリッチモチーフおよびＡリッチモチーフが全て、核中でＭＡＬＡＴ１を安定化するために必要とされると結論付けた。（Ｃ）ライゲーション媒介性の３’ＲＡＣＥアプローチを使用して、分解を受けているＳｐｅｃｋｌｅＦ２−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物の３’末端を試験した。ウリジル化された崩壊中間体を示す３つのクローン（配列決定した１５のうち）が検出され、これは、ウリジル化もまた核中で発生することを示唆している。示される配列は、上から下に配列番号８５および１４３〜１４５である。興味深いことに、これら３つのウリジル化された転写物は、短いＵテイルの付加の前に、３’末端から顕著に分解されていた。図１２は、ＭＡＬＡＴ１の３’末端におけるモチーフが、転写物安定性を確実にするために協働することを示唆する、変異分析を示す図である。（Ａ）ＭＡＬＡＴ１の３’末端領域中に種々の欠失を含有するＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミドを生成した。^＊は、各構築物中の欠失されたヌクレオチドを示す。示される配列は、上から下に配列番号１４６〜１６０である。（Ｂ）複合変異を含有する種々のＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、総ＲＮＡを２４時間後に単離した。次いで、ノザンブロットを実施して、ｍａｓｃＲＮＡまたはｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１の発現を検出した。ＲＮａｓｅＨ消化を、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１ＲＮＡについてのノザンブロット分析の前に実施して、各構築物についてのＲＮａｓｅＰプロセシングの精度を確証した。興味深いことに、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物は安定であり、これは、保存されたステムループの１０ｎｔのみがＲＮＡ安定性に必要とされることを示唆している。しかし、Ｃｏｍｐ．１転写物からさらなるヌクレオチドを欠失することを試みた場合（Ｃｏｍｐ．２、Ｃｏｍｐ．３、Ｃｏｍｐ．４またはＣｏｍｐ．５を生成するため）、このｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物は不安定になった。それにもかかわらず、保存されたステムループ中に１８以上のヌクレオチドが存在する場合（Ｃｏｍｐ．１２）、さらなるヌクレオチドを、ＭＡＬＡＴ１の３’末端の他の部分から欠失させることができた。保存されたステムループ中およびＵリッチモチーフ２とＡリッチトラクトとの間の領域中のヌクレオチドは、おそらくは構造的安定性の閾値に達することを確実にすることによって、ＭＡＬＡＴ１ＲＮＡ安定性を確実にするために重複して協働することが見出された。しかし、三重らせん形成は、ＭＡＬＡＴ１３’末端安定性を確実にすることにおいてかなり重要な役割を果たすことを指摘することは重要である。図１２は、ＭＡＬＡＴ１の３’末端におけるモチーフが、転写物安定性を確実にするために協働することを示唆する、変異分析を示す図である。（Ａ）ＭＡＬＡＴ１の３’末端領域中に種々の欠失を含有するＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミドを生成した。^＊は、各構築物中の欠失されたヌクレオチドを示す。示される配列は、上から下に配列番号１４６〜１６０である。（Ｂ）複合変異を含有する種々のＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、総ＲＮＡを２４時間後に単離した。次いで、ノザンブロットを実施して、ｍａｓｃＲＮＡまたはｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１の発現を検出した。ＲＮａｓｅＨ消化を、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１ＲＮＡについてのノザンブロット分析の前に実施して、各構築物についてのＲＮａｓｅＰプロセシングの精度を確証した。興味深いことに、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物は安定であり、これは、保存されたステムループの１０ｎｔのみがＲＮＡ安定性に必要とされることを示唆している。しかし、Ｃｏｍｐ．１転写物からさらなるヌクレオチドを欠失することを試みた場合（Ｃｏｍｐ．２、Ｃｏｍｐ．３、Ｃｏｍｐ．４またはＣｏｍｐ．５を生成するため）、このｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物は不安定になった。それにもかかわらず、保存されたステムループ中に１８以上のヌクレオチドが存在する場合（Ｃｏｍｐ．１２）、さらなるヌクレオチドを、ＭＡＬＡＴ１の３’末端の他の部分から欠失させることができた。保存されたステムループ中およびＵリッチモチーフ２とＡリッチトラクトとの間の領域中のヌクレオチドは、おそらくは構造的安定性の閾値に達することを確実にすることによって、ＭＡＬＡＴ１ＲＮＡ安定性を確実にするために重複して協働することが見出された。しかし、三重らせん形成は、ＭＡＬＡＴ１３’末端安定性を確実にすることにおいてかなり重要な役割を果たすことを指摘することは重要である。図１２は、ＭＡＬＡＴ１の３’末端におけるモチーフが、転写物安定性を確実にするために協働することを示唆する、変異分析を示す図である。（Ａ）ＭＡＬＡＴ１の３’末端領域中に種々の欠失を含有するＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミドを生成した。^＊は、各構築物中の欠失されたヌクレオチドを示す。示される配列は、上から下に配列番号１４６〜１６０である。（Ｂ）複合変異を含有する種々のＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、総ＲＮＡを２４時間後に単離した。次いで、ノザンブロットを実施して、ｍａｓｃＲＮＡまたはｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１の発現を検出した。ＲＮａｓｅＨ消化を、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１ＲＮＡについてのノザンブロット分析の前に実施して、各構築物についてのＲＮａｓｅＰプロセシングの精度を確証した。興味深いことに、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物は安定であり、これは、保存されたステムループの１０ｎｔのみがＲＮＡ安定性に必要とされることを示唆している。しかし、Ｃｏｍｐ．１転写物からさらなるヌクレオチドを欠失することを試みた場合（Ｃｏｍｐ．２、Ｃｏｍｐ．３、Ｃｏｍｐ．４またはＣｏｍｐ．５を生成するため）、このｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物は不安定になった。それにもかかわらず、保存されたステムループ中に１８以上のヌクレオチドが存在する場合（Ｃｏｍｐ．１２）、さらなるヌクレオチドを、ＭＡＬＡＴ１の３’末端の他の部分から欠失させることができた。保存されたステムループ中およびＵリッチモチーフ２とＡリッチトラクトとの間の領域中のヌクレオチドは、おそらくは構造的安定性の閾値に達することを確実にすることによって、ＭＡＬＡＴ１ＲＮＡ安定性を確実にするために重複して協働することが見出された。しかし、三重らせん形成は、ＭＡＬＡＴ１３’末端安定性を確実にすることにおいてかなり重要な役割を果たすことを指摘することは重要である。図１２は、ＭＡＬＡＴ１の３’末端におけるモチーフが、転写物安定性を確実にするために協働することを示唆する、変異分析を示す図である。（Ａ）ＭＡＬＡＴ１の３’末端領域中に種々の欠失を含有するＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミドを生成した。^＊は、各構築物中の欠失されたヌクレオチドを示す。示される配列は、上から下に配列番号１４６〜１６０である。（Ｂ）複合変異を含有する種々のＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、総ＲＮＡを２４時間後に単離した。次いで、ノザンブロットを実施して、ｍａｓｃＲＮＡまたはｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１の発現を検出した。ＲＮａｓｅＨ消化を、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１ＲＮＡについてのノザンブロット分析の前に実施して、各構築物についてのＲＮａｓｅＰプロセシングの精度を確証した。興味深いことに、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物は安定であり、これは、保存されたステムループの１０ｎｔのみがＲＮＡ安定性に必要とされることを示唆している。しかし、Ｃｏｍｐ．１転写物からさらなるヌクレオチドを欠失することを試みた場合（Ｃｏｍｐ．２、Ｃｏｍｐ．３、Ｃｏｍｐ．４またはＣｏｍｐ．５を生成するため）、このｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物は不安定になった。それにもかかわらず、保存されたステムループ中に１８以上のヌクレオチドが存在する場合（Ｃｏｍｐ．１２）、さらなるヌクレオチドを、ＭＡＬＡＴ１の３’末端の他の部分から欠失させることができた。保存されたステムループ中およびＵリッチモチーフ２とＡリッチトラクトとの間の領域中のヌクレオチドは、おそらくは構造的安定性の閾値に達することを確実にすることによって、ＭＡＬＡＴ１ＲＮＡ安定性を確実にするために重複して協働することが見出された。しかし、三重らせん形成は、ＭＡＬＡＴ１３’末端安定性を確実にすることにおいてかなり重要な役割を果たすことを指摘することは重要である。図１３は、Ｕリッチモチーフ２とＡリッチトラクトとの間の塩基対合が、ＭＡＬＡＴ１の３’末端を安定化するために必要であることを示す図である。（Ａ）Ｕリッチモチーフ２中の変異を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’プラスミド中に導入して、Ｕリッチモチーフ２とＡリッチトラクトとの間の塩基対を選択破壊した。完全１７４ｎｔｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域がこれらのプラスミド中に存在したが、Ｕリッチモチーフ２のみが示される。ｍＭＡＬＡＴ１＿３’Ｃｏｍｐ．１４の二次構造予測において、パネルＢの各レーン中の変異したヌクレオチドは、紫色で示される。示される配列は、上から下に配列番号１６１〜１６８および１０１である。（Ｂ）野生型（ＷＴ）または変異体プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ノザンブロットを実施した。ＲＮａｓｅＨ処理を、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡを検出するノザンブロットの前に実施した。ＭＡＬＡＴ１３’末端から最も遠いＵ−Ａ塩基対（ＭｕｔＵ２．５、レーン９）を除いて、Ｕリッチモチーフ２とＡリッチトラクトとの間の全ての塩基対が、ｉｎｖｉｖｏでＭＡＬＡＴ１３’末端を安定化することにおいて顕著な役割を果たす。図１３は、Ｕリッチモチーフ２とＡリッチトラクトとの間の塩基対合が、ＭＡＬＡＴ１の３’末端を安定化するために必要であることを示す図である。（Ａ）Ｕリッチモチーフ２中の変異を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’プラスミド中に導入して、Ｕリッチモチーフ２とＡリッチトラクトとの間の塩基対を選択破壊した。完全１７４ｎｔｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域がこれらのプラスミド中に存在したが、Ｕリッチモチーフ２のみが示される。ｍＭＡＬＡＴ１＿３’Ｃｏｍｐ．１４の二次構造予測において、パネルＢの各レーン中の変異したヌクレオチドは、紫色で示される。示される配列は、上から下に配列番号１６１〜１６８および１０１である。（Ｂ）野生型（ＷＴ）または変異体プラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ノザンブロットを実施した。ＲＮａｓｅＨ処理を、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡを検出するノザンブロットの前に実施した。ＭＡＬＡＴ１３’末端から最も遠いＵ−Ａ塩基対（ＭｕｔＵ２．５、レーン９）を除いて、Ｕリッチモチーフ２とＡリッチトラクトとの間の全ての塩基対が、ｉｎｖｉｖｏでＭＡＬＡＴ１３’末端を安定化することにおいて顕著な役割を果たす。図１４は、ＭＡＬＡＴ１３’末端の構造モデリングを示す図である。（Ａ）全長（ｎｔ１〜５９）ＭＡＬＡＴ１Ｃｏｍｐ．１４３’末端に関する５つの個々のモデルのオーバーレイ。モデルは、漫画表示で示され、青色、赤色、緑色、橙色およびマゼンダで着色される。（Ｂ）青色で着色されたモデル（パネルＡから）の５’末端の拡大図。三重らせんの最初の三重塩基は、そのワトソン−クリック塩基対およびフーグスティーン塩基対を介して示される。Ｇ−５とＡ−４５との間の可能な水素結合は、橙色で示され、Ｕリッチモチーフ２とＡリッチトラクトとの間のループを介したこの領域の５’末端に関する安定化の可能性を強調する。（Ｃ）ＲｏｓｅｔｔａｄｅｎｏｖｏＲＮＡフォールディングによって生成した、２，０００個のＭＡＬＡＴ１Ｃｏｍｐ．１４３’末端モデル（ｎｔ１〜５を欠く）の散布プロット。このプロットは、Ｘ軸上の参照モデルに対する全てのモデルの距離（Å）およびＹ軸の個々の構造のスコアを示す。図１４は、ＭＡＬＡＴ１３’末端の構造モデリングを示す図である。（Ａ）全長（ｎｔ１〜５９）ＭＡＬＡＴ１Ｃｏｍｐ．１４３’末端に関する５つの個々のモデルのオーバーレイ。モデルは、漫画表示で示され、青色、赤色、緑色、橙色およびマゼンダで着色される。（Ｂ）青色で着色されたモデル（パネルＡから）の５’末端の拡大図。三重らせんの最初の三重塩基は、そのワトソン−クリック塩基対およびフーグスティーン塩基対を介して示される。Ｇ−５とＡ−４５との間の可能な水素結合は、橙色で示され、Ｕリッチモチーフ２とＡリッチトラクトとの間のループを介したこの領域の５’末端に関する安定化の可能性を強調する。（Ｃ）ＲｏｓｅｔｔａｄｅｎｏｖｏＲＮＡフォールディングによって生成した、２，０００個のＭＡＬＡＴ１Ｃｏｍｐ．１４３’末端モデル（ｎｔ１〜５を欠く）の散布プロット。このプロットは、Ｘ軸上の参照モデルに対する全てのモデルの距離（Å）およびＹ軸の個々の構造のスコアを示す。図１５は、ＭＡＬＡＴ１三重らせんが効率的なタンパク質翻訳を支持することを示す図である。（Ａ）指定された２色蛍光レポーターベクター（ｍＣｈｅｒｒｙの下流の配列が、各プロットについて注記される）をＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした後、フローサイトメトリーを使用して、各細胞の生のｅＹＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙの強度を決定した。モックトランスフェクトした試料は、観察されたｅＹＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙの背景（自己蛍光）レベルを示す。全ての引き続く分析において、背景レベルの蛍光を発現する細胞を、材料および方法に記載した通りに除去した。（Ｂ〜Ｄ）ｍＣｈｅｒｒｙが指定した通りのＳＶ４０ポリアデニル化シグナルまたはＷＴ／変異体ｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域で終わる２色ベクターをトランスフェクトした各細胞について、ｅＹＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙの強度を比較する散布プロット。背景レベルの蛍光のみを発現する細胞は除去した。（Ｅ）種々の構築物によるｍＣｈｅｒｒｙｍＲＮＡ３’末端プロセシングの精度を検証するために、ＲＮａｓｅＨ消化を、ノザンブロット分析の前に実施した。ＳＶ４０ポリＡ部位で終わるｍＣｈｅｒｒｙ転写物について、付加されたポリＡテイルの長さにおけるバリエーションを示すスメアが観察された。対照的に、予測されたサイズ（１８０ｎｔ）の明確なバンドが、ｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域で終わるｍＣｈｅｒｒｙについて観察され、これは、さらなるヌクレオチドがＲＮａｓｅＰプロセシング後に付加されていないことを示している。図１５は、ＭＡＬＡＴ１三重らせんが効率的なタンパク質翻訳を支持することを示す図である。（Ａ）指定された２色蛍光レポーターベクター（ｍＣｈｅｒｒｙの下流の配列が、各プロットについて注記される）をＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした後、フローサイトメトリーを使用して、各細胞の生のｅＹＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙの強度を決定した。モックトランスフェクトした試料は、観察されたｅＹＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙの背景（自己蛍光）レベルを示す。全ての引き続く分析において、背景レベルの蛍光を発現する細胞を、材料および方法に記載した通りに除去した。（Ｂ〜Ｄ）ｍＣｈｅｒｒｙが指定した通りのＳＶ４０ポリアデニル化シグナルまたはＷＴ／変異体ｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域で終わる２色ベクターをトランスフェクトした各細胞について、ｅＹＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙの強度を比較する散布プロット。背景レベルの蛍光のみを発現する細胞は除去した。（Ｅ）種々の構築物によるｍＣｈｅｒｒｙｍＲＮＡ３’末端プロセシングの精度を検証するために、ＲＮａｓｅＨ消化を、ノザンブロット分析の前に実施した。ＳＶ４０ポリＡ部位で終わるｍＣｈｅｒｒｙ転写物について、付加されたポリＡテイルの長さにおけるバリエーションを示すスメアが観察された。対照的に、予測されたサイズ（１８０ｎｔ）の明確なバンドが、ｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域で終わるｍＣｈｅｒｒｙについて観察され、これは、さらなるヌクレオチドがＲＮａｓｅＰプロセシング後に付加されていないことを示している。図１５は、ＭＡＬＡＴ１三重らせんが効率的なタンパク質翻訳を支持することを示す図である。（Ａ）指定された２色蛍光レポーターベクター（ｍＣｈｅｒｒｙの下流の配列が、各プロットについて注記される）をＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした後、フローサイトメトリーを使用して、各細胞の生のｅＹＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙの強度を決定した。モックトランスフェクトした試料は、観察されたｅＹＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙの背景（自己蛍光）レベルを示す。全ての引き続く分析において、背景レベルの蛍光を発現する細胞を、材料および方法に記載した通りに除去した。（Ｂ〜Ｄ）ｍＣｈｅｒｒｙが指定した通りのＳＶ４０ポリアデニル化シグナルまたはＷＴ／変異体ｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域で終わる２色ベクターをトランスフェクトした各細胞について、ｅＹＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙの強度を比較する散布プロット。背景レベルの蛍光のみを発現する細胞は除去した。（Ｅ）種々の構築物によるｍＣｈｅｒｒｙｍＲＮＡ３’末端プロセシングの精度を検証するために、ＲＮａｓｅＨ消化を、ノザンブロット分析の前に実施した。ＳＶ４０ポリＡ部位で終わるｍＣｈｅｒｒｙ転写物について、付加されたポリＡテイルの長さにおけるバリエーションを示すスメアが観察された。対照的に、予測されたサイズ（１８０ｎｔ）の明確なバンドが、ｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域で終わるｍＣｈｅｒｒｙについて観察され、これは、さらなるヌクレオチドがＲＮａｓｅＰプロセシング後に付加されていないことを示している。図１６は、ＭＡＬＡＴ１三重らせんで終わる転写物が、ｍｉｃｒｏＲＮＡによって効率的に抑制されることを示す図である。指定された２色蛍光レポーターベクター（ｍＣｈｅｒｒｙの下流の配列が、各プロットについて注記される）をＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした後、フローサイトメトリーを使用して、各細胞の生のｅＹＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙの強度を決定した。ｍＣｈｅｒｒｙ転写物は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（Ａ）またはｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域（Ｂ）で終わった。背景レベルの蛍光のみを発現する細胞は、全ての分析から除去し、示していない。図１６は、ＭＡＬＡＴ１三重らせんで終わる転写物が、ｍｉｃｒｏＲＮＡによって効率的に抑制されることを示す図である。指定された２色蛍光レポーターベクター（ｍＣｈｅｒｒｙの下流の配列が、各プロットについて注記される）をＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした後、フローサイトメトリーを使用して、各細胞の生のｅＹＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙの強度を決定した。ｍＣｈｅｒｒｙ転写物は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（Ａ）またはｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域（Ｂ）で終わった。背景レベルの蛍光のみを発現する細胞は、全ての分析から除去し、示していない。図１７は、他の高度に構造化されたＲＮＡテイルが、長い転写物の３’末端を安定化できることを示す図である。（Ａ）他の高度に構造化されたＲＮＡテイルが長いｃＧＦＰ転写物の３’末端を安定化するのに十分であり得るかどうかを試験するために、ＲＮａｓｅＰ切断部位の上流のＭＡＬＡＴ１の領域（三重らせんを形成するＵリッチモチーフおよびＡリッチモチーフを含有する）を、十分特徴付けられたリボスイッチの配列で置き換えた（Ｓｅｒｇａｎｏｖら、２００４年；ＫｌｅｉｎおよびＦｅｒｒｅ−Ｄ’Ａｍａｒｅ２００６年；ＭｏｎｔａｎｇｅおよびＢａｔｅｙ２００６年；Ｓｕｄａｒｓａｎら、２００８年）。示される配列は、配列番号１３９である。ｍａｓｃＲＮＡｔＲＮＡ様構造は、リボスイッチの３’末端の直ぐ下流に存在するので、ＲＮａｓｅＰ切断は、リボスイッチ配列で終わる成熟ｃＧＦＰ転写物をｉｎｖｉｖｏで生成する。（Ｂ）ｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域またはリボスイッチ＋ｍａｓｃＲＮＡで終わるＣＭＶ−ｃＧＦＰプラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ノザンブロットを実施した。ＲＮａｓｅＨ処理を、ｃＧＦＰｍＲＮＡを検出するノザンブロットの前に実施した。試験した５つのリボスイッチのうち、グルコサミン−６リン酸を感知するＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓｇｌｍＳ触媒的リボスイッチのみが、ＭＡＬＡＴ１三重らせんよりもかなり弱くではあるが、ｃＧＦＰメッセージの３’末端を安定化することができたことが見出された。（Ｃ）ウエスタンブロットは、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓｇｌｍＳリボスイッチが、翻訳もまた弱く支持することを示した。試験した構造的モチーフは、このｉｎｖｉｖｏ発現系が、ＲＮＡ転写物の３’末端を安定化するのに十分なＲＮＡ配列についてスクリーニングするための理想的な方法を提供することを示す。図１７は、他の高度に構造化されたＲＮＡテイルが、長い転写物の３’末端を安定化できることを示す図である。（Ａ）他の高度に構造化されたＲＮＡテイルが長いｃＧＦＰ転写物の３’末端を安定化するのに十分であり得るかどうかを試験するために、ＲＮａｓｅＰ切断部位の上流のＭＡＬＡＴ１の領域（三重らせんを形成するＵリッチモチーフおよびＡリッチモチーフを含有する）を、十分特徴付けられたリボスイッチの配列で置き換えた（Ｓｅｒｇａｎｏｖら、２００４年；ＫｌｅｉｎおよびＦｅｒｒｅ−Ｄ’Ａｍａｒｅ２００６年；ＭｏｎｔａｎｇｅおよびＢａｔｅｙ２００６年；Ｓｕｄａｒｓａｎら、２００８年）。示される配列は、配列番号１３９である。ｍａｓｃＲＮＡｔＲＮＡ様構造は、リボスイッチの３’末端の直ぐ下流に存在するので、ＲＮａｓｅＰ切断は、リボスイッチ配列で終わる成熟ｃＧＦＰ転写物をｉｎｖｉｖｏで生成する。（Ｂ）ｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域またはリボスイッチ＋ｍａｓｃＲＮＡで終わるＣＭＶ−ｃＧＦＰプラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ノザンブロットを実施した。ＲＮａｓｅＨ処理を、ｃＧＦＰｍＲＮＡを検出するノザンブロットの前に実施した。試験した５つのリボスイッチのうち、グルコサミン−６リン酸を感知するＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓｇｌｍＳ触媒的リボスイッチのみが、ＭＡＬＡＴ１三重らせんよりもかなり弱くではあるが、ｃＧＦＰメッセージの３’末端を安定化することができたことが見出された。（Ｃ）ウエスタンブロットは、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓｇｌｍＳリボスイッチが、翻訳もまた弱く支持することを示した。試験した構造的モチーフは、このｉｎｖｉｖｏ発現系が、ＲＮＡ転写物の３’末端を安定化するのに十分なＲＮＡ配列についてスクリーニングするための理想的な方法を提供することを示す。図１７は、他の高度に構造化されたＲＮＡテイルが、長い転写物の３’末端を安定化できることを示す図である。（Ａ）他の高度に構造化されたＲＮＡテイルが長いｃＧＦＰ転写物の３’末端を安定化するのに十分であり得るかどうかを試験するために、ＲＮａｓｅＰ切断部位の上流のＭＡＬＡＴ１の領域（三重らせんを形成するＵリッチモチーフおよびＡリッチモチーフを含有する）を、十分特徴付けられたリボスイッチの配列で置き換えた（Ｓｅｒｇａｎｏｖら、２００４年；ＫｌｅｉｎおよびＦｅｒｒｅ−Ｄ’Ａｍａｒｅ２００６年；ＭｏｎｔａｎｇｅおよびＢａｔｅｙ２００６年；Ｓｕｄａｒｓａｎら、２００８年）。示される配列は、配列番号１３９である。ｍａｓｃＲＮＡｔＲＮＡ様構造は、リボスイッチの３’末端の直ぐ下流に存在するので、ＲＮａｓｅＰ切断は、リボスイッチ配列で終わる成熟ｃＧＦＰ転写物をｉｎｖｉｖｏで生成する。（Ｂ）ｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域またはリボスイッチ＋ｍａｓｃＲＮＡで終わるＣＭＶ−ｃＧＦＰプラスミドを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、ノザンブロットを実施した。ＲＮａｓｅＨ処理を、ｃＧＦＰｍＲＮＡを検出するノザンブロットの前に実施した。試験した５つのリボスイッチのうち、グルコサミン−６リン酸を感知するＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓｇｌｍＳ触媒的リボスイッチのみが、ＭＡＬＡＴ１三重らせんよりもかなり弱くではあるが、ｃＧＦＰメッセージの３’末端を安定化することができたことが見出された。（Ｃ）ウエスタンブロットは、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓｇｌｍＳリボスイッチが、翻訳もまた弱く支持することを示した。試験した構造的モチーフは、このｉｎｖｉｖｏ発現系が、ＲＮＡ転写物の３’末端を安定化するのに十分なＲＮＡ配列についてスクリーニングするための理想的な方法を提供することを示す。図１８は、本発明のＲＮＡの半減期測定を示す図である。上のパネルは、ノザンブロットの写真であり、下のパネルは、三重らせんで終わるｃＧＦＰ転写物の半減期がＨｅＬａ細胞において約５時間であることを示すデータのグラフである。図１９は、間葉系細胞中での三重らせん含有ｍＲＮＡの翻訳を示す模式図およびグラフである。（１９Ａ）２色蛍光レポーター発現系の模式図。（１９Ｂ）２色発現プラスミドを、マウス間葉系幹細胞中に一過的にトランスフェクトし、フローサイトメトリーを使用して、単一細胞中のｍＣｈｅｒｒｙおよびｅＹＦＰのタンパク質発現を測定した。代表的実験（ｎ＝３）からの個々のトランスフェクトされた細胞において測定したｅＹＦＰタンパク質発現に対するｍＣｈｅｒｒｙタンパク質発現の比率のボックスプロットが示される（水平線、中央値；ボックス、２５〜７５パーセンタイル；エラーバー、１．５×四分位範囲）。（１９Ｃ）ｍＣｈｅｒｒｙが指定した通りのＳＶ４０ポリアデニル化シグナルまたはｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域で終わる２色ベクターをトランスフェクトした各細胞について、ｅＹＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙの強度を比較する散布プロット。背景レベルの蛍光のみを発現する細胞は除去した。図１９は、間葉系細胞中での三重らせん含有ｍＲＮＡの翻訳を示す模式図およびグラフである。（１９Ａ）２色蛍光レポーター発現系の模式図。（１９Ｂ）２色発現プラスミドを、マウス間葉系幹細胞中に一過的にトランスフェクトし、フローサイトメトリーを使用して、単一細胞中のｍＣｈｅｒｒｙおよびｅＹＦＰのタンパク質発現を測定した。代表的実験（ｎ＝３）からの個々のトランスフェクトされた細胞において測定したｅＹＦＰタンパク質発現に対するｍＣｈｅｒｒｙタンパク質発現の比率のボックスプロットが示される（水平線、中央値；ボックス、２５〜７５パーセンタイル；エラーバー、１．５×四分位範囲）。（１９Ｃ）ｍＣｈｅｒｒｙが指定した通りのＳＶ４０ポリアデニル化シグナルまたはｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域で終わる２色ベクターをトランスフェクトした各細胞について、ｅＹＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙの強度を比較する散布プロット。背景レベルの蛍光のみを発現する細胞は除去した。図２０は、三重らせんが複数の異なるｍＲＮＡの３’末端上に置かれ得、翻訳を支持し得ることを実証する、模式図およびグラフのセットである。（２０Ａ）Ｌ１ｍＲＮＡの模式図（Ｂｅｃｋら、２０１１年から改変）。Ｌ１ｍＲＮＡは通常、ポリ（Ａ）テイルで終わるが（上、配列番号１７４として示される）、Ｌ１ポリアデニル化シグナルをｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域で置き換えて成熟Ｌ１転写物を三重らせんで終わるようにしたさらなる構築物を生成した（下）。（２０Ｂ）ＨｅＬａ細胞に、ＧＦＰを発現する対照ベクターまたはポリ（Ａ）テイルもしくは三重らせんで終わるＬ１ｍＲＮＡを発現するエピソームベースのベクターをトランスフェクトした。１レーン当たり１５μｇの総ＲＮＡを使用するノザンブロットを実施して、Ｌ１ｍＲＮＡの発現を検出した。（２０Ｃ）Ｌ１ｍＲＮＡの３’末端が正確に生成されたことを検証するために、ＲＮａｓｅＨ消化を、ノザンブロット分析の前に実施した。三重らせんで終わるＬ１ｍＲＮＡについて単一バンドが観察されるが、ポリ（Ａ）テイルで終わるＬ１ｍＲＮＡは、およそ３００〜４００ｎｔを流れるスメアを生じる。（２０Ｄ）ウエスタンブロットを実施して、トランスフェクトされた発現ベクターからのＯＲＦ１タンパク質およびＯＲＦ２タンパク質の発現を検出した。ｐ１１０をローディング対照として使用した。（２０Ｅ）免疫蛍光を使用して、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞におけるＯＲＦ１タンパク質およびＯＲＦ２タンパク質の発現を検出した。図２０は、三重らせんが複数の異なるｍＲＮＡの３’末端上に置かれ得、翻訳を支持し得ることを実証する、模式図およびグラフのセットである。（２０Ａ）Ｌ１ｍＲＮＡの模式図（Ｂｅｃｋら、２０１１年から改変）。Ｌ１ｍＲＮＡは通常、ポリ（Ａ）テイルで終わるが（上、配列番号１７４として示される）、Ｌ１ポリアデニル化シグナルをｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域で置き換えて成熟Ｌ１転写物を三重らせんで終わるようにしたさらなる構築物を生成した（下）。（２０Ｂ）ＨｅＬａ細胞に、ＧＦＰを発現する対照ベクターまたはポリ（Ａ）テイルもしくは三重らせんで終わるＬ１ｍＲＮＡを発現するエピソームベースのベクターをトランスフェクトした。１レーン当たり１５μｇの総ＲＮＡを使用するノザンブロットを実施して、Ｌ１ｍＲＮＡの発現を検出した。（２０Ｃ）Ｌ１ｍＲＮＡの３’末端が正確に生成されたことを検証するために、ＲＮａｓｅＨ消化を、ノザンブロット分析の前に実施した。三重らせんで終わるＬ１ｍＲＮＡについて単一バンドが観察されるが、ポリ（Ａ）テイルで終わるＬ１ｍＲＮＡは、およそ３００〜４００ｎｔを流れるスメアを生じる。（２０Ｄ）ウエスタンブロットを実施して、トランスフェクトされた発現ベクターからのＯＲＦ１タンパク質およびＯＲＦ２タンパク質の発現を検出した。ｐ１１０をローディング対照として使用した。（２０Ｅ）免疫蛍光を使用して、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞におけるＯＲＦ１タンパク質およびＯＲＦ２タンパク質の発現を検出した。図２０は、三重らせんが複数の異なるｍＲＮＡの３’末端上に置かれ得、翻訳を支持し得ることを実証する、模式図およびグラフのセットである。（２０Ａ）Ｌ１ｍＲＮＡの模式図（Ｂｅｃｋら、２０１１年から改変）。Ｌ１ｍＲＮＡは通常、ポリ（Ａ）テイルで終わるが（上、配列番号１７４として示される）、Ｌ１ポリアデニル化シグナルをｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域で置き換えて成熟Ｌ１転写物を三重らせんで終わるようにしたさらなる構築物を生成した（下）。（２０Ｂ）ＨｅＬａ細胞に、ＧＦＰを発現する対照ベクターまたはポリ（Ａ）テイルもしくは三重らせんで終わるＬ１ｍＲＮＡを発現するエピソームベースのベクターをトランスフェクトした。１レーン当たり１５μｇの総ＲＮＡを使用するノザンブロットを実施して、Ｌ１ｍＲＮＡの発現を検出した。（２０Ｃ）Ｌ１ｍＲＮＡの３’末端が正確に生成されたことを検証するために、ＲＮａｓｅＨ消化を、ノザンブロット分析の前に実施した。三重らせんで終わるＬ１ｍＲＮＡについて単一バンドが観察されるが、ポリ（Ａ）テイルで終わるＬ１ｍＲＮＡは、およそ３００〜４００ｎｔを流れるスメアを生じる。（２０Ｄ）ウエスタンブロットを実施して、トランスフェクトされた発現ベクターからのＯＲＦ１タンパク質およびＯＲＦ２タンパク質の発現を検出した。ｐ１１０をローディング対照として使用した。（２０Ｅ）免疫蛍光を使用して、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞におけるＯＲＦ１タンパク質およびＯＲＦ２タンパク質の発現を検出した。図２０は、三重らせんが複数の異なるｍＲＮＡの３’末端上に置かれ得、翻訳を支持し得ることを実証する、模式図およびグラフのセットである。（２０Ａ）Ｌ１ｍＲＮＡの模式図（Ｂｅｃｋら、２０１１年から改変）。Ｌ１ｍＲＮＡは通常、ポリ（Ａ）テイルで終わるが（上、配列番号１７４として示される）、Ｌ１ポリアデニル化シグナルをｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域で置き換えて成熟Ｌ１転写物を三重らせんで終わるようにしたさらなる構築物を生成した（下）。（２０Ｂ）ＨｅＬａ細胞に、ＧＦＰを発現する対照ベクターまたはポリ（Ａ）テイルもしくは三重らせんで終わるＬ１ｍＲＮＡを発現するエピソームベースのベクターをトランスフェクトした。１レーン当たり１５μｇの総ＲＮＡを使用するノザンブロットを実施して、Ｌ１ｍＲＮＡの発現を検出した。（２０Ｃ）Ｌ１ｍＲＮＡの３’末端が正確に生成されたことを検証するために、ＲＮａｓｅＨ消化を、ノザンブロット分析の前に実施した。三重らせんで終わるＬ１ｍＲＮＡについて単一バンドが観察されるが、ポリ（Ａ）テイルで終わるＬ１ｍＲＮＡは、およそ３００〜４００ｎｔを流れるスメアを生じる。（２０Ｄ）ウエスタンブロットを実施して、トランスフェクトされた発現ベクターからのＯＲＦ１タンパク質およびＯＲＦ２タンパク質の発現を検出した。ｐ１１０をローディング対照として使用した。（２０Ｅ）免疫蛍光を使用して、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞におけるＯＲＦ１タンパク質およびＯＲＦ２タンパク質の発現を検出した。図２１は、ｉｎｖｉｔｒｏで転写された、三重らせんで終わるＧＦＰｍＲＮＡが、ｉｎｖｉｔｒｏで翻訳され得ることを示すグラフである。等量のｉｎｖｉｔｒｏ転写されたキャップされた（５’−ｍ^７ＧｐｐｐＧ）ルシフェラーゼｍＲＮＡを、野生型酵母抽出物中でインキュベートした。ルシフェラーゼｍＲＮＡは、示されるように、その３’末端においてポリ（Ａ）テイル、野生型ＭＡＬＡＴ１三重らせんまたはＣｏｍｐ．２７変異体ＭＡＬＡＴ１三重らせんで終わった。キャップされたｍＲＮＡの翻訳からの平均ルシフェラーゼ活性が示される。エラーバーは標準偏差を示す。

通常、長いＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写物は、ＲＮＡ安定性および効率的なタンパク質翻訳に必要とされる、転写後に付加されたポリアデニル酸（ポリＡ）テイルで終わる。ポリＡテイルが存在しない場合、この転写物は一般に、細胞において迅速に分解される。ポリＡテイルを欠くがなおも安定でありかつ効率的に翻訳される転写物を生成するための方法が、本明細書に記載される。本発明は、ＲＮＡのポリＡテイルが、ポリＡテイルの非存在下でＲＮＡの安定性を増強する、および一部の例ではＲＮＡ内にコードされたタンパク質の翻訳さえ増強する機能的末端ドメインまたは配列によって置き換えることができるという発見に、少なくとも一部基づく。

例えば、ＲＮＡへと転写される場合に、ｔＲＮＡ様構造が後に続く三重らせん構造へと折り畳まるＭＡＬＡＴ１の長い非コードＲＮＡおよびＭＥＮβの長い非コードＲＮＡ由来の配列、ならびにそれらの変異および改変の使用は、本明細書に提供される実施例において実証される。ＭＡＬＡＴ１遺伝子座は、多くのヒトがんにおいて誤調節され、豊富な長い核保持される非コードＲＮＡを生成する。ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写されるにもかかわらず、ＭＡＬＡＴ１の３’末端は、正準の切断／ポリアデニル化によっては生成されないが、その代り、ＲＮａｓｅＰによるｔＲＮＡ様構造の認識および切断によって生成される。従って、成熟ＭＡＬＡＴ１は、ポリＡテイルを欠くが、多くのタンパク質コード遺伝子よりも高いレベルでｉｎｖｉｖｏで発現される。このｔＲＮＡ様構造は、エンドヌクレアーゼＲＮａｓｅＰによってその５’末端で認識され、効率的に切断されてポリＡではない成熟転写物を生じるが、その代り、ｉｎｖｉｖｏでその３’末端において三重らせんを有する。

ＲＮａｓｅＰによる切断は、約６．７ｋｂのＭＡＬＡＴ１非コードＲＮＡの成熟３’末端および小さいｔＲＮＡ様転写物の５’末端を同時に生成する（図１Ａ）。この成熟ＭＡＬＡＴ１転写物は、その３’末端上に短いＡリッチトラクトを有する（Ｗｉｌｕｓｚら、２００８年；ＷｉｌｕｓｚおよびＳｐｅｃｔｏｒ２０１０年）。ポリアデニル化の間に生じるように転写後に付加されるのではなく、ＭＡＬＡＴ１ポリＡテイル様部分は、ゲノム中にコードされ、従って、新生転写物の一部である（図１Ａ）。ヒトから魚まで、２つの上流のＵリッチモチーフおよび１つのステムループ構造と共に、このＡリッチモチーフは、進化的に高度に保存されている（図１Ｂ）。類似の高度に保存されたＡリッチモチーフおよびＵリッチモチーフは、ＲＮａｓｅＰによってその３’末端においてまたプロセシングされる、ＮＥＡＴ１＿２としても公知の、ＭＥＮβの長い核保持される非コードＲＮＡの３’末端において存在する（Ｓｕｎｗｏｏら、２００９年）（図１Ｃ）。しかし、これらのモチーフの機能、ならびにＭＡＬＡＴ１およびＭＥＮβの３’末端を保護して高いレベルまで転写物を蓄積させる分子機構は、本発明の前には公知ではなかった。

一部の態様では、本発明は、ハイブリッドＲＮＡ、これらのＲＮＡを発現させるための発現ベクター、およびその使用の方法に関する。これらのハイブリッドＲＮＡは、例えば、その３’末端において三重らせん構造を形成する高度に保存されたＡリッチモチーフおよびＵリッチモチーフを備えて、ｉｎｖｉｖｏでＭＡＬＡＴ１３’末端プロセシングを効率的に再現する。三重らせんの形成は、ＲＮａｓｅＰプロセシングまたはｍａｓｃＲＮＡ生合成には影響を与えないが、その代り、３’−５’エキソヌクレアーゼからＭＡＬＡＴ１の３’末端を保護するために重要である。驚くべきことに、ＭＡＬＡＴ１またはＭＥＮβの３’末端が、実施例に示されたようにオープンリーディングフレームの下流に置かれた場合、この転写物は、ポリＡテイルの非存在にもかかわらず、ｉｎｖｉｖｏで効率的に翻訳された。従って、この三重らせん構造は、ＲＮＡ安定性および翻訳の両方を強力に促進し、これは、これらの長い非コードＲＮＡが、タンパク質合成機械と相互作用し得るか、または特定の条件下で翻訳さえされ得ることを示唆している。さらに、変異分析を使用して、ＲＮＡ安定性および翻訳制御機能が分離され得ることを示した。この発現系は、ポリＡテイルを欠く安定な転写物をｉｎｖｉｖｏで生成するための独自の方法を提供するので、本発明者らは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ媒介性の抑制におけるポリＡテイルの役割を調査した。これらおよび他の研究方法は、本発明によって包含される。これらの結果は、ＭＡＬＡＴ１、ＭＥＮβ、およびおそらくはポリＡテイルを欠く他の転写物が如何にして安定化され、調節され、従って重要な細胞機能を実施することが可能であるかについての、重要な新たな洞察を提供する。

この三重らせん構造は、成熟非ポリＡＲＮＡの３’末端をｉｎｖｉｖｏで効率的に安定化するのに十分である。さらに、三重らせんで終わる転写物は、ｉｎｖｉｖｏでタンパク質を生成するために、効率的に翻訳される。この末端配列またはドメインは、ポリＡテイルを欠く種々の安定なＲＮＡ分子を構築するために使用され得る。これらの安定なＲＮＡ分子は、発現ベクターからｉｎｖｉｖｏで生成され得る。以下の実施例で実証されるように、転写されたＲＮＡは、次いで、細胞質に送達され、タンパク質を効率的に生成する。一部の例では、核ＲＮＡが、本発明に従って使用される。その場合、このＲＮＡは、核中に保持され、その場所で機能的である。

ｔＲＮＡ様構造／ＲＮａｓｅＰ切断部位の上流の配列は、任意の他の配列で置き換えることができるので、本発明の方法は、その３’末端において任意の所望の配列を有する成熟ＲＮＡを生成するために使用され得る。これらの配列は、例えば、特定の刺激に応答してＲＮＡ安定性および／または翻訳を調節し得、調節された遺伝子発現を生じる。本明細書に記載される方法および構築物は、ポリＡテイルの効果、および発現の代替的機構、ならびに一部の例ではｉｎｖｉｖｏ調節される発現機構の設計の研究を可能にする。

従って、本発明は、一部の実施形態では、異種ＲＮＡ安定化末端配列に連結されたＲＮＡ分子から構成されるハイブリッド核酸である。このＲＮＡ分子は、天然に存在するまたは合成のＲＮＡの任意の形態であり得るが、ポリＡテイルを欠く。ポリＡテイルとは、本明細書で使用する場合、８、９、１０、１１、１２またはそれより多く連続するＡの核酸を指す。典型的には、核から細胞質に輸送されるＲＮＡ、細胞質ＲＮＡは、ポリＡテイルを含む。ポリＡテイルが存在しない場合、このＲＮＡは非常に不安定である。ポリＡテイルを本発明の末端配列で置き換えることによって、このＲＮＡは安定化され、翻訳は増強され、ＲＮＡからの特定のタンパク質の生成を生じる。このＲＮＡ分子には、例えば、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡならびに細胞質ＲＮＡおよび核ＲＮＡが含まれる。ｍＲＮＡは典型的に、タンパク質に対応する。本発明の方法の目的に依存して、このＲＮＡに対応するタンパク質は、治療タンパク質もしくは診断タンパク質またはレポーターまたは他の研究タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質であり得る。

このＲＮＡ分子は、任意の型の種または生物由来のＲＮＡ分子に対応し、そしてその任意の化学的改変または天然の改変を含む、ＲＮＡ分子であり得る。例えば、このＲＮＡは、真核生物ＲＮＡ、哺乳動物ＲＮＡ、植物ＲＮＡまたはより具体的にはヒトＲＮＡであり得る。ＲＮＡの特定の型は、ＲＮＡのための使用に依存する。例えば、ＲＮＡが、哺乳動物細胞における特定のタンパク質の発現の影響を研究するために使用される場合、このＲＮＡは、哺乳動物のその型に対応し得る。他の状況では、このＲＮＡは、治療目的のためにｉｎｖｉｖｏでヒトにおいて発現され得る。その場合、ヒトＲＮＡを発現させることが望ましい。

化学的改変または天然の改変は、当技術分野で周知である。かかる改変には、例えば、標的鎖への結合を増加させる（即ち、その融解温度を増加させる）ため、オリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド−標的複合体の同定を補助するため、細胞貫通を増加させるため、オリゴヌクレオチドを分解するまたはオリゴヌクレオチドの構造もしくは活性を妨害するヌクレアーゼおよび他の酵素に対して安定化するため、標的に対して一旦配列特異的に結合すると、ある様式の破壊（終結事象）を提供するため、ならびにオリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するために設計された、改変が含まれる。

改変には、例えば、（ａ）末端改変、例えば、５’末端改変（リン酸化脱リン酸化、結合体化、逆連結（ｉｎｖｅｒｔｅｄｌｉｎｋａｇｅ）など）、３’末端改変（結合体化、ＤＮＡヌクレオチド、逆連結など）、（ｂ）塩基改変、例えば、改変塩基、安定化塩基、不安定化塩基、または拡張されたレパートリーのパートナーと塩基対合する塩基、または結合体化塩基による置き換え、（ｃ）糖改変（例えば、２’位もしくは４’位における）または糖の置き換え、ならびに（ｄ）ホスホジエステル連結の改変または置き換えを含む、ヌクレオシド間連結改変、が含まれるがこれらに限定されない。かかる改変が翻訳を妨害する（即ち、例えば、ウサギ網状赤血球ｉｎｖｉｔｒｏ翻訳アッセイにおいて、改変の欠如と比較して、翻訳における５０％、６０％、７０％、８０％または９０％またはそれを超える低減を生じる）程度まで、この改変は、本明細書に記載される方法および組成物には適切でない可能性がある。

改変されたヌクレオシド間連結の非限定的な例には、ホスホロチオエート、不斉ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネートおよび不斉ホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに正常な３’−５’連結を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’連結アナログ、ならびにヌクレオシド単位の隣接する対が３’−５’から５’−３’または２’−５’から５’−２’で連結された、逆の極性を有するもの、が含まれる。種々の塩、混合塩および遊離酸形態もまた含まれる。

その中にリン原子を含まない改変されたヌクレオシド間連結は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合型ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または１つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間連結、によって形成されるヌクレオシド間連結を有する。これらには、モルフォリノ連結（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）を有するもの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチル（ｆｏｒｍａｃｅｔｙｌ）およびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合されたＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ_２構成要素部分を有する他のものが含まれる。

置換された糖部分には、２’位における以下のうち１つ：Ｈ（デオキシリボース）；ＯＨ（リボース）；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、が含まれるがこれに限定されず、ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換されたまたは非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。

化学的にまたは天然に改変されたＲＮＡには、例えば、糖の２’位において改変された少なくとも１つのヌクレオチド、最も好ましくは、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキルもしくは２’−フルオロ−改変ヌクレオチドまたは末端キャップを含み得る。他の実施形態では、ＲＮＡ改変には、ピリミジンのリボース上の２’−フルオロ、２’−アミノおよび２’Ｏ−メチル改変、ＲＮＡの３’末端における脱塩基残基または逆塩基（ｉｎｖｅｒｔｅｄｂａｓｅ）が含まれる。

本発明に従って有用なＲＮＡは、単一の改変ヌクレオシドを含み得る。他の実施形態では、このＲＮＡは、最大でオリゴヌクレオチドの全長までの、少なくとも２つの改変ヌクレオシド、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個またはそれより多いヌクレオシドを含み得る。

ヌクレオシドまたは核酸塩基には、天然のプリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が含まれる。改変ヌクレオシドには、他の合成および天然の核酸塩基、例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアニシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎｅ）、２−（ハロ）アデニン、２−（アルキル）アデニン、２−（プロピル）アデニン、２（アミノ）アデニン、２−（アミノアルキル）アデニン、２（アミノプロピル）アデニン、２（メチルチオ）Ｎ６（イソペンテニル）アデニン、６（アルキル）アデニン、６（メチル）アデニン、７（デアザ）アデニン、８（アルケニル）アデニン、８−（アルキル）アデニン、８（アルキニル）アデニン、８（アミノ）アデニン、８−（ハロ）アデニン、８−（ヒドロキシル）アデニン、８（チオアルキル）アデニン、８−（チオール）アデニン、Ｎ６−（イソペンチル）アデニン、Ｎ６（メチル）アデニン、Ｎ６，Ｎ６（ジメチル）アデニン、２−（アルキル）グアニン、２（プロピル）グアニン、６−（アルキル）グアニン、６（メチル）グアニン、７（アルキル）グアニン、７（メチル）グアニン、７（デアザ）グアニン、８（アルキル）グアニン、８−（アルケニル）グアニン、８（アルキニル）グアニン、８−（アミノ）グアニン、８（ハロ）グアニン、８−（ヒドロキシル）グアニン、８（チオアルキル）グアニン、８−（チオール）グアニン、Ｎ（メチル）グアニン、２−（チオ）シトシン、３（デアザ）５（アザ）シトシン、３−（アルキル）シトシン、３（メチル）シトシン、５−（アルキル）シトシン、５−（アルキニル）シトシン、５（ハロ）シトシン、５（メチル）シトシン、５（プロピニル）シトシン、５（プロピニル）シトシン、５（トリフルオロメチル）シトシン、６−（アゾ）シトシン、Ｎ４（アセチル）シトシン、３（３アミノ−３カルボキシプロピル）ウラシル、２−（チオ）ウラシル、５（メチル）２（チオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−２（チオ）ウラシル、４−（チオ）ウラシル、５（メチル）４（チオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−４（チオ）ウラシル、５（メチル）２，４（ジチオ）ウラシル、５（メチルアミノメチル）−２，４（ジチオ）ウラシル、５（２−アミノプロピル）ウラシル、５−（アルキル）ウラシル、５−（アルキニル）ウラシル、５−（アリルアミノ）ウラシル、５（アミノアリル）ウラシル、５（アミノアルキル）ウラシル、５（グアニジニウムアルキル）ウラシル、５（１，３−ジアゾール−１−アルキル）ウラシル、５−（シアノアルキル）ウラシル、５−（ジアルキルアミノアルキル）ウラシル、５（ジメチルアミノアルキル）ウラシル、５−（ハロ）ウラシル、５−（メトキシ）ウラシル、ウラシル−５オキシ酢酸、５（メトキシカルボニルメチル）−２−（チオ）ウラシル、５（メトキシカルボニル−メチル）ウラシル、５（プロピニル）ウラシル、５（プロピニル）ウラシル、５（トリフルオロメチル）ウラシル、６（アゾ）ウラシル、ジヒドロウラシル、Ｎ３（メチル）ウラシル、５−ウラシル（すなわち、プソイドウラシル）、２（チオ）プソイドウラシル、４（チオ）プソイドウラシル、２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、５−（アルキル）プソイドウラシル、５−（メチル）プソイドウラシル、５−（アルキル）−２−（チオ）プソイドウラシル、５−（メチル）−２−（チオ）プソイドウラシル、５−（アルキル）−４（チオ）プソイドウラシル、５−（メチル）−４（チオ）プソイドウラシル、５−（アルキル）−２，４（ジチオ）プソイドウラシル、５−（メチル）−２，４（ジチオ）プソイドウラシル、１置換プソイドウラシル、１置換２（チオ）−プソイドウラシル、１置換４（チオ）プソイドウラシル、１置換２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−２（チオ）−プソイドウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）−４（チオ）プソイドウラシル、１アミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１（アミノ（ａｒｎｉｎｏ）アルキルアミノカルボニルエチレニル）−プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノ−カルボニルエチレニル）−２（チオ）−プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−４（チオ）プソイドウラシル、１（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）プソイドウラシル、１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７置換１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７置換１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７置換１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７置換１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキル−ヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、１，３，５−（トリアザ）−２，６−（ジオキサ）−ナフタレン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、イノシニル、２−アザ−イノシニル、７−デアザ−イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、３−（メチル）イソカルボスチリリル、５−（メチル）イソカルボスチリリル、３−（メチル）−７−（プロピニル）イソカルボスチリリル、７−（アザ）インドリル、６−（メチル）−７−（アザ）インドリル、イミジゾピリジニル、９−（メチル）−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−（プロピニル）イソカルボスチリリル、プロピニル−７−（アザ）インドリル、２，４，５−（トリメチル）フェニル、４−（メチル）インドリル、４，６−（ジメチル）インドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニル、ジイルオロトリル、４−（イルオロ）−６−（メチル）ベンゾイミダゾール、４−（メチル）ベンゾイミダゾール、６−（アゾ）チミン、２−ピリジノン、５ニトロインドール、３ニトロピロール、６−（アザ）ピリミジン、２（アミノ）プリン、２，６−（ジアミノ）プリン、５置換ピリミジン、Ｎ２置換プリン、Ｎ６置換プリン、Ｏ６置換プリン、置換１，２，４−トリアゾール、ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、パラ−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、オルト−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ビス−オルト−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、パラ−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、オルト−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ビス−オルト−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３−イル、ピリドピリミジン−３−イル、２−オキソ−７−アミノ−ピリドピリミジン−３−イル、２−オキソ−ピリドピリミジン−３−イル、または任意のＯ−アルキル化もしくはＮ−アルキル化されたそれらの誘導体が含まれる。

ハイブリッドＲＮＡまたはこのＲＮＡを発現させるためのベクターの末端配列は、典型的には、三重らせん構造を有する、異種ＲＮＡ安定化末端配列である。本明細書で使用する場合、用語「異種」とは、ＲＮＡの３’末端または「末端配列を安定化させるＲＮＡ」の文脈で使用する場合、天然に存在するＲＮＡの３’末端において見出される天然に存在する配列ではない任意のヌクレオチド配列を指す。長いＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写物の３’末端におけるポリＡテイルは、成熟ＲＮＡが安定であり、細胞質に輸送され、効率的に翻訳されることを確実にするように機能する（Ｚｈａｏら、１９９９年において概説される）。本発明によれば、ＭＡＬＡＴ１およびＭＥＮβの長い非コードＲＮＡの３’末端における三重らせん構造が、ポリＡテイルを機能的に置き換えることができることが実証されている。類似の三重らせん構造がポリＡテイルを置き換えることができることもまた実証されている。転写物安定性を支持することに加えて、これらの三重らせんは、レポーター転写物の効率的な輸送（図２Ｂ）および翻訳（図５）を支持する。しかし、転写物中の他の場所の核保持シグナル（図２Ｃ）が、３’末端に存在する任意の輸送シグナルを何らかの形で無効にするので、実施例における内因性非コードＲＮＡは輸送されない。三重らせん領域に帰せられる種々の機能は、効率的に翻訳されない安定な輸送される転写物を生成する変異の同定に基づいて、互いに分離されている。

ＰＡＮ（ポリアデニル化核）ＲＮＡ、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスによって生成される豊富な長い非コードＲＮＡもまた、その３’末端に三重らせんを有することが以前に示されている（Ｍｉｔｔｏｎ−Ｆｒｙら、２０１０年）。ＭＡＬＡＴ１およびＭＥＮβとは異なり、ＰＡＮＲＮＡは、正準の切断／ポリアデニル化に供され、ＰＡＢＰを結合する（Ｂｏｒａｈら、２０１１年）。それにもかかわらず、５つの連続するＵ−Ａ・Ｕ三重塩基は、ＰＡＮＲＮＡポリＡテイルの一部と、ポリＡテイルのおよそ１２０ｎｔの上流のＵリッチ領域との間で形成する（Ｍｉｔｔｏｎ−Ｆｒｙら、２０１０年）。この三重らせんの形成は、ＲＮＡ崩壊を阻害し、ＰＡＮＲＮＡの核保持に必要とされることが提唱されている。対照的に、本発明者らは、ＭＡＬＡＴ１／ＭＥＮβ三重らせんが核保持に必須ではないことを見出している（図２Ｂ）。ガイドとしてＰＡＮＲＮＡ三重らせん構造を使用して、最近のコンピュータでの研究により、三重らせんを形成する可能性が高い６つのさらなる転写物が同定されたが、そのうち２つは単に、関連のガンマヘルペスウイルスにおけるＰＡＮＲＮＡホモログであった（Ｔｙｃｏｗｓｋｉら、２０１２年）。ＭＡＬＡＴ１およびＭＥＮβ三重らせんは、ＰＡＮＲＮＡ三重らせんと比較したこれらの構造における僅かな差異におそらくは起因して、この研究では同定されなかった。三重塩基が、転写物の一次配列において互いに遠く離れたヌクレオチドによって形成され得る（またはさらには別々の独立した転写物上にコードされ得る）ことを考慮すると、さらなる機能的ＲＮＡ三重らせんが、本発明に従って企図され、本発明によって包含される。

従って、ヒストンステム−ループ構造およびＭＡＬＡＴ１／ＭＥＮβ三重らせんに加えて、他のＲＮＡ構造モチーフが、ポリＡテイルを機能的に置き換えることができる可能性がある。例えば、ｔＲＮＡ様構造は、いくつかの一本鎖ＲＮＡウイルス、例えばカブ黄化モザイクウイルスおよびバクテリオファージＱβの３’末端を安定化することが公知である（Ｆｅｃｈｔｅｒら、２００１年において概説される）。実施例に提示される研究は、ＲＮＡ構造を安定化する他のものについてのスクリーニングを含む。これらのスクリーニングを使用して、改変されたＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミドは、細胞代謝物に結合し精緻な構造へと折り畳まる場合が多いＲＮＡエレメントである種々のリボスイッチの配列によって、ＲＮａｓｅＰ切断部位の上流のＭＡＬＡＴ１の領域を置き換えることによって、生成されてきた（ＳｅｒｇａｎｏｖおよびＰａｔｅｌ２０１２年において概説される）（データは実施例中に示される）。ｍａｓｃＲＮＡｔＲＮＡ様構造は、リボスイッチの３’末端の直ぐ下流に存在するので、ＲＮａｓｅＰ切断は、リボスイッチ配列で終わる成熟ｃＧＦＰ転写物をｉｎｖｉｖｏで生成する。興味深いことに、グルコサミン−６リン酸を感知するＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓｇｌｍＳ触媒的リボスイッチ（ＫｌｅｉｎおよびＦｅｒｒｅ−Ｄ’Ａｍａｒｅ２００６年）は、ｃＧＦＰメッセージの３’末端を安定化でき、翻訳を支持できたが、その効果は、ＭＡＬＡＴ１三重らせんを用いて得られたものよりも弱かった。それにもかかわらず、これらの結果は、非ポリアデニル化転写物の３’末端を安定化するのに十分な種々のＲＮＡ配列が実際に存在することを実証している。本発明は、さらなる配列を同定するためのｉｎｖｉｖｏスクリーニングのための方法もまた含む。

従って、異種ＲＮＡ安定化末端配列は、ＭＡＬＡＴ１末端配列もしくはＭＥＮβ末端配列またはそれらの機能的バリアントであり得る。バリアントは、本明細書に提供される遺伝子の選択的スプライシングまたは対立遺伝子バリエーションから生じ得る。一般に、ホモログおよび対立遺伝子は、典型的に、それぞれ公知の三重らせん形成性核酸およびポリペプチドの配列に対して、少なくとも９０％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を共有し、一部の場合には、少なくとも９５％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９７％のアミノ酸同一性を共有し、他の場合には、少なくとも９７％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９８％のアミノ酸同一性を共有し、他の場合には、少なくとも９９％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９９％のアミノ酸同一性を共有し、他の場合には、少なくとも９９．５％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９９．５％のアミノ酸同一性を共有する。相同性は、インターネットを介して入手可能な、ＮＣＢＩ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）によって開発されたものなどの、当技術分野で公知の種々の公に入手可能なソフトウェアツールを使用して計算され得る。例示的なツールには、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈのＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイトから入手可能なＢＬＡＳＴシステム（例えば、デフォルト核酸（Ｂｌａｓｔｎ）またはタンパク質（Ｂｌａｓｔｐ）検索パラメーターを使用する）が含まれる。

代替的に、異種ＲＮＡ安定化末端配列は、ＵリッチもしくはＡリッチ配列またはそれらの組合せであり得る。Ｕリッチ配列とは、本明細書で使用する場合、ごく接近した少なくとも５つのＵ、一部の実施形態では、５つの連続したＵを含むヌクレオチド配列のセットを指す。Ａリッチ配列とは、本明細書で使用する場合、ごく接近した少なくとも５つのＡ、一部の実施形態では、５つの連続したＡを含むヌクレオチド配列のセットを指す。この末端配列は、複数のＵリッチおよび／またはＡリッチの配列またはモチーフを含み得る。例えば、末端配列は、２つ、３つもしくは４つのＵリッチ配列および／または２つ、３つもしくは４つのＡリッチ配列あるいはそれらの任意の組合せを含み得る。好ましくは、このＵリッチおよび／またはＡリッチ配列は、三重らせん構造を生成する様式で配置される。

この末端配列は、同様に、Ｃリッチおよび／またはＧリッチ配列から構成され得る。Ｃリッチ配列とは、本明細書で使用する場合、ごく接近した少なくとも５つのＣ、一部の実施形態では、５つの連続したＣを含むヌクレオチド配列のセットを指す。Ｇリッチ配列とは、本明細書で使用する場合、ごく接近した少なくとも５つのＧ、一部の実施形態では、５つの連続したＧを含むヌクレオチド配列のセットを指す。この末端配列は、複数のＣリッチおよび／またはＧリッチの配列またはモチーフを含み得る。例えば、末端配列は、２つ、３つもしくは４つのＣリッチ配列および／または２つ、３つもしくは４つのＧリッチ配列あるいはそれらの任意の組合せを含み得る。好ましくは、このＣリッチおよび／またはＧリッチ配列は、三重らせん構造を生成する様式で配置される。

この末端配列は、リガンド結合ドメインもまた有し得る。リガンド結合ドメインは、リガンドの存在または非存在に対して感受性のドメインである。リガンドが存在する場合、ＲＮＡは、活性化または阻害され得る。代替的に、リガンドが存在しない場合、ＲＮＡは、そのＲＮＡ中の特定のリガンドおよびエレメントに依存して、活性化または阻害され得る。一部の場合には、リガンド結合ドメインは、組織特異的エレメントを有する。例えば、リガンドは、特定の型のがんに対して特異的であり得、その特定の型のがんが存在する状態において活性化または阻害され得る。

本発明のＲＮＡは、ベクターを使用して発現され得る。遺伝子の発現をもたらすために、核酸は、ベクター中で送達され得る、ならびに／または異種プロモーターおよび転写ターミネーターに作動可能に連結され得る。発現ベクターは、例えば制限およびライゲーションによって、調節配列に作動可能に接続されるように所望の配列が挿入され得、ＲＮＡ転写物として発現され得る、ベクターである。ベクターは、このベクターで形質転換もしくはトランスフェクトされたかもしくはされていない細胞の同定における使用のため、または末端配列およびハイブリッドＲＮＡの発現ならびに効果を研究するために適した、１つまたは複数のマーカー配列をさらに含有し得る。マーカーには、例えば、抗生物質または他の化合物に対する耐性または感受性のいずれかを増加または低下させるタンパク質をコードする遺伝子、その活性が当技術分野で公知の標準的なアッセイによって検出可能な酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）をコードする遺伝子、ならびに形質転換またはトランスフェクトされた細胞、宿主、コロニーまたはプラークの表現型に目に見えて影響を与える遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質）が含まれる。

本明細書に開示される方法における使用のための核酸配列を同定および取得するための方法は、当技術分野で慣用的である。例えば、当業者は、本明細書に記載されるハイブリッドＲＮＡまたはベクターの創出のためのＲＮＡ配列を同定するために、標的のＧｅｎｅＩＤまたはＧｅｎｅＡｌｉａｓを使用してＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅデータベースを検索し得る。ほとんどの場合、転写物を含有するｃＤＮＡの供給業者（例えば、ＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）へのリンクは、１コピーのｃＤＮＡクローンを入手するために利用され得るＥｎｔｒｅｚＧｅｎｅウェブインターフェースにおいて提供される。他の場合、供給業者（例えば、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）と直接連絡できる。

クローニングベクターは、宿主細胞中で複製することができ、ベクターが決定可能な様式で切断され得、所望のＤＮＡ配列がライゲーションされ得、その結果新たな組換えベクターが宿主細胞中で複製するその能力を保持する、１つまたは複数のエンドヌクレアーゼ制限部位によってさらに特徴付けられる、ベクターである。発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列が制限およびライゲーションによって挿入され得、その結果調節配列と作動可能に接続され、ＲＮＡ転写物として発現され得る、ベクターである。

本明細書で使用する場合、コード配列および調節配列は、調節配列の影響下または制御下にコード配列の発現または転写を置くような方法で共有結合により連結される場合、「作動可能に接続される」と言われる。本明細書で使用する場合、「作動可能に接続される」および「作動可能に連結される」は、相互交換可能に使用され、同じ意味を有すると解釈すべきである。コード配列が機能的タンパク質へと翻訳されることが望まれる場合、２つのＤＮＡ配列は、５’調節配列中のプロモーターの誘導がコード配列の転写を生じる場合、および２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の導入を生じない、（２）プロモーター領域がコード配列の転写を指向する能力を妨害しない、または（３）対応するＲＮＡ転写物がタンパク質へと翻訳される能力を妨害しない場合に、作動可能に接続されると言われる。従って、プロモーター領域は、得られた転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドへと翻訳され得るように、プロモーター領域がそのＤＮＡ配列の転写をもたらすことが可能である場合に、コード配列に作動可能に接続される。

遺伝子発現に必要な調節配列の正確な性質は、種間または細胞型間で変動し得るが、必要に応じて、それぞれ転写および翻訳の開始と関連する５’非転写配列および５’非翻訳配列、例えば、ＴＡＴＡボックス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列などを一般に含むものとする。しばしば、かかる５’非転写調節配列は、作動可能に接続された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。調節配列は、所望される場合、エンハンサー配列または上流のアクチベーター配列もまた含み得る。本発明のベクターは、任意選択で、５’リーダー配列またはシグナル配列を含み得る。適切なベクターの選択および設計は、当業者の能力および裁量の範囲内である。

一部の実施形態では、核酸分子を送達するためのウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスおよび弱毒化ポックスウイルスを含むポックスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルスおよびＴｙウイルス様粒子からなる群より選択される。外因性核酸を送達するために使用されてきたウイルスおよびウイルス様粒子の例には、以下が含まれる：複製欠陥アデノウイルス（例えば、Ｘｉａｎｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２１９巻：２２０〜２２７頁、１９９６年；Ｅｌｏｉｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７巻：５３７５〜５３８１頁、１９９７年；Ｃｈｅｎｇａｌｖａｌａら、Ｖａｃｃｉｎｅ１５巻：３３５〜３３９頁、１９９７年）、改変レトロウイルス（Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１巻：３３６５〜３３７４頁、１９９７年）、非複製性レトロウイルス（Ｉｒｗｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８巻：５０３６〜５０４４頁、１９９４年）、複製欠陥セムリキ森林ウイルス（Ｚｈａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２巻：３００９〜３０１３頁、１９９５年）、カナリアポックスウイルスおよび高度に弱毒化されたワクシニアウイルス誘導体（Ｐａｏｌｅｔｔｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３巻：１１３４９〜１１３５３頁、１９９６年）、非複製性ワクシニアウイルス（Ｍｏｓｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３巻：１１３４１〜１１３４８頁、１９９６年）、複製性ワクシニアウイルス（Ｍｏｓｓ、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．８２巻：５５〜６３頁、１９９４年）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０巻：３７８１〜３７８７頁、１９９６年）、シンドビスウイルス（Ｐｕｇａｃｈｅｖら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２１２巻：５８７〜５９４頁、１９９５年）、レンチウイルスベクター（ＮａｌｄｉｎｉＬら、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．１９９６年１０月１５日；９３巻（２１号）：１１３８２〜８頁）およびＴｙウイルス様粒子（Ａｌｌｓｏｐｐら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ２６巻：１９５１〜１９５９頁、１９９６年）。

特定の適用に有用な別のウイルスは、アデノ随伴ウイルス、二本鎖ＤＮＡウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、広範な細胞型および種に感染することが可能であり、複製欠損になるように操作され得る。アデノ随伴ウイルスは、熱および脂質溶媒安定性、造血細胞を含む多様な系統の細胞における高い形質導入頻度、ならびに重複感染阻害の欠如、従って複数のシリーズの形質導入を可能にするなどの利点をさらに有する。アデノ随伴ウイルスは、部位特異的様式でヒト細胞ＤＮＡ中に組み込むことができ、それにより、挿入的変異誘発の可能性および挿入された遺伝子発現の可変性を最小化する。さらに、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、選択圧の非存在下で１００継代よりも多く組織培養物中で追跡されており、これは、アデノ随伴ウイルスのゲノム組込みが比較的安定な事象であることを示している。アデノ随伴ウイルスは、染色体外様式でも機能し得る。

他の有用なウイルスベクターは、非必須遺伝子が目的の遺伝子で置き換えられた、非細胞障害性真核生物ウイルスに基づく。非細胞障害性ウイルスには、その生活環が、ゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写と、宿主細胞ＤＮＡ中への引き続くプロウイルス組込みとを含む、特定のレトロウイルスが含まれる。一般に、レトロウイルスは、複製欠損性である（即ち、所望の転写物の合成を指向することは可能であるが、感染性粒子を製造することは不可能である）。かかる遺伝的に変更されたレトロウイルス発現ベクターは、ｉｎｖｉｖｏでの遺伝子の高効率な形質導入のための一般的有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを作製するための標準的なプロトコール（外因性遺伝子材料のプラスミド中への取り込み、プラスミドによる株化されたパッケージング細胞のトランスフェクション、パッケージング細胞株による組換えレトロウイルスの産生、組織培養培地からのウイルス粒子の収集、およびウイルス粒子による標的細胞の感染のステップを含む）は、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．、「ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」、Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎＣｏ．、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９０年）およびＭｕｒｒｙ，Ｅ．Ｊ．編、「ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ」、第７巻、ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ（１９９１年）中に提供されている。

別の一実施形態では、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞中で発現される。この組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型において優先的に核酸の発現を指向することが可能であり得る（例えば、組織特異的調節エレメントが、核酸を発現させるために使用される）。組織特異的調節エレメントは、当技術分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例には、ミオシン重鎖プロモーター、アルブミンプロモーター、リンパ系特異的プロモーター、ニューロン特異的プロモーター、膵臓特異的プロモーターおよび乳腺特異的プロモーターが含まれる。発生的に調節されるプロモーター、例えば、マウスｈｏｘプロモーターおよびα−フェトプロテインプロモーターもまた包含される。

本発明は、ＲＮＡの翻訳を増強するためまたはＲＮＡを発現させるための方法もまた含む。これらの方法は、本明細書に記載されるように、細胞または生物においてｉｎｖｉｖｏでハイブリッドＲＮＡを発現させることによって達成される。

これらの方法は、生物とも呼ばれる被験体において疾患を処置するのに有用であり得る。本明細書で使用する場合、被験体は、哺乳動物、例えばヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコまたはげっ歯類である。全ての実施形態において、ヒト被験体が好ましい。本発明の方法に従って処置可能な疾患は、ＲＮＡの安定なバージョンおよび任意選択でそのＲＮＡに対応するタンパク質を発現させることが望ましい、任意の疾患である。

本発明の核酸は、典型的には単離された核酸である。核酸に関して本明細書で使用する場合、用語「単離された」は以下を意味する：（ｉ）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってｉｎｖｉｔｒｏで増幅されること；（ｉｉ）クローニングによって組換え生成されること；（ｉｉｉ）切断およびゲル分離などによって精製されること；または（ｉｖ）例えば化学合成によって合成されること。単離された核酸は、当技術分野で周知の組換えＤＮＡ技術によって容易に操作可能な核酸である。従って、５’および３’の制限部位が公知であるかまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー配列が開示されたベクター中に含有されるヌクレオチド配列は、単離されたとみなされるが、その天然の宿主中にその天然の状態で存在する核酸配列は、単離されたとみなされない。単離された核酸は、実質的に精製されていてもよいが、精製されている必要はない。例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター内の単離された核酸は、それが属する細胞中の材料の僅かなパーセンテージしか構成しない可能性があるという点で、純粋ではない。かかる核酸は、単離されているが、当業者に公知の標準的な技術によって容易に操作可能であるので、この用語が本明細書で使用される。

本発明の態様は、細胞（単数または複数）の表現型特性を変更させるための方法に関する。これらの方法は、細胞または組織中での所望のタンパク質の発現を生じる、本発明のＲＮＡの細胞への投与を含み、これは、他のタンパク質、核酸もしくは因子の上方調節、下方調節、活性化もしくは非活性化を生じ得、またはさらには、別の所望の細胞型へと、細胞の分化した表現型を変化させる。本発明の方法は、ＤＮＡでもタンパク質でもなくＲＮＡの投与を含むので、これらの方法は、ゲノムの永久的な改変を引き起こさすことも、意図しない変異誘発効果の可能性を有することもない。

従って、本発明の態様は、細胞を改変するための、ｉｎｖｉｔｒｏ、ｉｎｖｉｖｏまたはｅｘｖｉｖｏでの細胞中でのタンパク質発現の誘導を含む。薬剤を導入するためまたは遺伝子発現を誘導するための伝統的な方法は、外因性ＤＮＡまたは組換えウイルスベクターを利用してきた。しかし、遺伝子治療法は、潜在的なリスクを有する。本発明の方法は、遺伝子治療関連のリスクを回避し、効率的かつ特異的なタンパク質発現を提供する。

一部の実施形態では、本発明は、本発明の核酸を使用して疾患を処置するための方法を提供する。処置される疾患の型は、発現されているＲＮＡに依存し、その逆もまた然りである。本発明に従って処置可能な疾患には、増殖性疾患、自己免疫、神経変性疾患、心血管疾患、ミオパチー、リソソーム蓄積症（ｌｉｐｏｓｏｍａｌｓｔｏｒａｇｅｄｉｓｅａｓｅ）、皮膚疾患、遺伝的欠陥または機能喪失と関連する疾患、および感染性疾患が含まれるがこれらに限定されない。

本発明のＲＮＡは、細胞の１つまたは複数の表現型特性を変更させるために、細胞においてタンパク質を発現させるためにも有用であり、例えば、このタンパク質は、組織生成もしくは再生に関与し得、または疾患の処置のための治療タンパク質もしくは阻害タンパク質であり得る。例えば、このタンパク質は、がんまたは他の増殖障害、神経変性疾患、自己免疫、心血管疾患、筋肉の疾患および障害の処置において有用であり得る。

従って、これらの方法は、目的のタンパク質をコードするＲＮＡを、被験体における疾患および障害の処置のために細胞に送達するために、有用である。例えば、これらの方法は、ｉｎｖｉｖｏのタンパク質代償療法のための方法において使用され得る。一部の実施形態では、目的のタンパク質をコードする本発明のＲＮＡは、タンパク質発現が望まれる種々の異なる疾患の処置のための方法において、ｉｎｖｉｖｏでのタンパク質発現のために組織および／または臓器に送達され得る。例えば、機能喪失に関与する疾患、例えば、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、または特定のタンパク質に関する低レベルのタンパク質発現に関与する他の疾患が、本発明に従って処置可能である。

従って、一部の実施形態では、これらの方法および組成物は、筋ジストロフィーの処置のための方法において有用である。筋ジストロフィーは、筋肉の遺伝性疾患のファミリーを示す。いくつかの形態は、小児が罹患し（例えば、デュシェンヌ型ジストロフィー）、２０〜３０年以内に致死である。成人形態は、より緩徐に進行する傾向がある。デュシェンヌ型ジストロフィー（ジストロフィン遺伝子中の変異によって引き起こされる）ならびにティーンエイジおよび成人発症型三好型ジストロフィーまたはそのバリアント、肢帯型ジストロフィー２ＢまたはＬＧＭＤ−２Ｂ（ジスフェリン遺伝子中の変異によって引き起こされる）を含む、いくつかのジストロフィーに関する遺伝子が同定されている。これらは、筋肉中での関連するタンパク質の発現を防止し、それによって筋肉の機能不全を引き起こす、「機能喪失」変異である。本発明の核酸は、疾患に関連する欠陥タンパク質を置き換えるために、１つまたは複数の筋肉組織標的に送達される。例えば、ジストロフィンタンパク質をコードするＲＮＡは、デュシェンヌ型／ベッカー型筋ジストロフィーの処置のために送達され得る。代替的に、エメリンおよび／またはラミンタンパク質をコードするＲＮＡは、エメリ・ドレフュス型（Ｅｍｅｒｙ−Ｄｒｅｙｆｕｓｓ）筋ジストロフィーを有する被験体に投与され得る。

ＲＮＡは、治療的利益を達成するために、全身的または局所的に送達され得る。局所投与は、例えば、ジストロフィンおよび／またはエメリンおよび／またはラミンタンパク質をコードするＲＮＡを、その状態に特に関連する筋肉組織に送達することを含む。例えば、これらの疾患は、弱まった横隔膜に起因する不十分な呼吸および弱い姿勢筋（ｐｏｓｔｕｒａｌｍｕｓｃｌｅ）に起因して歩き回ることができないことと関連する。横隔膜注射に関して、胸腔鏡下アプローチが、横隔膜筋肉中にＲＮＡを送達するために使用され得る。代替的に、骨格筋中への直接注射、例えば、それぞれ姿勢の維持および大きな腕の動きに関連する下肢帯および上肢帯の筋肉中への直接注射が、実施され得る。

嚢胞性線維症の処置のために、ＣＦＴＲタンパク質をコードするＲＮＡが、被験体の組織、例えば横隔膜に投与され得る。一部の実施形態では、ＣＦＴＲをコードするＲＮＡは、直接的な実質注射および／または気管支内注射によって送達され得る。

これらの方法は、心血管疾患を処置するためにも有用である。心血管疾患には、うっ血性心不全、心筋症、心筋梗塞、組織虚血、心虚血、血管疾患、後天性心臓疾患、先天性心臓疾患、アテローム動脈硬化症、心筋症、機能不全性伝導系（ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ）、機能不全性冠状動脈、肺心臓高血圧症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙｈｅａｒｄｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）、冠状動脈疾患、心筋梗塞、心筋虚血、アテローム動脈硬化症、心筋症、特発性心筋症、心不整脈、筋ジストロフィー、筋肉量異常、筋肉変性、感染性心筋炎、薬物または毒素誘導性の筋肉異常、過敏性心筋炎および自己免疫性心内膜炎が含まれるがこれらに限定されない。

いくつかのタンパク質が、心臓疾患の処置において有用であることが公知である。本発明のＲＮＡは、この疾患を処置するために、これらのタンパク質をｉｎｖｉｖｏで産生するために投与され得る。心血管疾患の処置に有用なタンパク質の例には、ＶＥＧＦポリペプチド、例えば、ヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ）、アルファ１アンチトリプシンポリペプチド、心細胞の生存および／または増殖を促進するための任意の心臓作用性（ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｃ）因子または増殖因子、ＴＧＦ−ベータリガンド、例えばアクチビンＡ、アクチビンＢ、インスリン様増殖因子、骨形成タンパク質、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子ナトリウム利尿因子、インスリン、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＴＧＦアルファ、ＢＭＰまたはクリプト経路の産物ならびに細胞分化剤、例えばサイトカインおよび増殖因子が含まれるがこれらに限定されない。心臓作用性因子は、当技術分野で周知であり、これには、心臓作用性剤、クレアチン、カルニチンおよびタウリンが含まれるがこれらに限定されない。ＲＮＡは、本明細書に記載される任意の疾患の処置においてと同様、局所的または全身的に送達され得る。送達のいくつかの局所的方法の例には、心内膜心筋、心筋外膜（ｅｐｉｍｙｏｃａｒｄｉａｌ）、心室内、冠内、後洞（ｒｅｔｒｏｓｉｎｕｓ）、動脈内、心膜内または静脈内投与経路を介した、被験体への投与が含まれる。

一部の場合には、本発明に従って処置可能な疾患は、機能喪失疾患である。機能喪失疾患は、低減または破壊されたタンパク質機能を引き起こす遺伝子中の変異と関連する疾患である。「機能喪失」とは、本明細書で使用する場合、遺伝子または遺伝子産物の正常な活性の低減または排除を指す。活性の喪失は、ＲＮＡの転写および／もしくはプロセシングにおける減少、遺伝子産物の翻訳、安定性、トランスポートもしくは活性における減少、またはそれらの任意の組合せに起因し得る。機能喪失遺伝子には、腫瘍サプレッサー遺伝子、またはＤＮＡ修復、細胞分裂周期チェックポイント、細胞運動性、転写調節およびアポトーシスを担う遺伝子における変異が含まれるがこれらに限定されない。腫瘍サプレッサー遺伝子および腫瘍サプレッサー遺伝子であることが疑われる遺伝子には、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＡＰＨＢ２、ＩＮＩ１、ＡＸＩＮ１、ＡＸＩＮ２、ＭＬＬ３、ＥＰ３００、ＮＦ１、ＴＰ５３、ＡＰＣ、ＶＨＬ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＫＥＡＰ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＲＢＩ、ＭＥＮ、ＮＦ２／ＳＣＨ、ＰＴＣＨ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＡＶＣＲ２、ＭＲＥ１１、ＭＡＰ２Ｋ４およびＬＫＢ１／ＳＴＫ１１が含まれるがこれらに限定されない。機能喪失疾患には、ａ−サラセミア、ベータ−サラセミア、ターナー症候群、網膜芽細胞腫が含まれる。

本発明の方法は、神経変性障害を処置するためのＲＮＡの使用もまた包含する。本明細書で使用する場合、用語「神経変性疾患」または「神経変性障害」は、新たなニューロンの生成を刺激する薬剤によって逆転、阻止、管理、処置、改善または排除され得る任意の障害を含意する。神経変性障害の例には以下が含まれる：（ｉ）慢性神経変性疾患、例えば家族性および散発性の筋萎縮性側索硬化症（それぞれＦＡＬＳおよびＡＬＳ）、家族性および散発性のパーキンソン病、ハンチントン病、家族性および散発性のアルツハイマー病、多発性硬化症、オリーブ橋小脳萎縮症、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、びまん性レビー小体病、大脳皮質歯状核黒質（ｃｏｒｔｉｃｏｄｅｎｔａｔｏｎｉｇｒａｌ）変性、進行性家族性ミオクローヌスてんかん、線条体黒質変性、ねじれ失調症、家族性振戦、ダウン症候群、ジル・ドゥ・ラ・トゥレット症候群、ハラーホルデン・スパッツ病、糖尿病性末梢神経障害、拳闘家認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａｐｕｇｉｌｉｓｔｉｃａ）、ＡＩＤＳ認知症、加齢性認知症、加齢に伴う記憶障害、ならびにアミロイドーシス関連神経変性疾患、例えば、伝染性海綿状脳症（クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群、スクレイピー（ｓｃｒａｐｉｃ）およびクールー）に関連するプリオンタンパク質（ＰｒＰ）によって引き起こされるもの、および過剰なシスタチンＣ蓄積によって引き起こされるもの（遺伝性シスタチンＣ血管障害）；ならびに（ｉｉ）急性神経変性障害、例えば外傷性脳損傷（例えば、手術関連脳損傷）、脳浮腫、末梢神経損傷、脊髄損傷、リー病、ギラン・バレー症候群、リソソーム蓄積障害、例えばリポフスチン沈着症、アルパース病、ＣＮＳ変性の結果としてのめまい；例えば青斑核および小脳中のニューロンの変性を含む、慢性アルコールまたは薬物の乱用によって生じる病理；認知障害および運動障害をもたらす小脳ニューロンおよび皮質ニューロンの変性を含む、加齢に伴って生じる病理；ならびに運動障害をもたらす基底核ニューロンの変性を含む、慢性アンフェタミン乱用に伴って生じる病理；局所外傷、例えば脳卒中、局所虚血、血行不全、低酸素性虚血性脳症、高血糖症、低血糖症または直接的外傷から生じる病理学的変化；治療薬または処置の負の副作用として生じる病理（例えば、ＮＭＤＡクラスのグルタミン酸受容体に対するアンタゴニストの抗痙攣用量に応答した帯状回皮質および嗅内皮質のニューロンの変性）、およびウェルニッケ・コルサコフ関連認知症。感覚ニューロンを侵す神経変性疾患には、フリードライヒ運動失調症、糖尿病、末梢神経障害および網膜ニューロン変性が含まれる。他の神経変性疾患には、脊髄損傷に関連した神経の損傷または外傷が含まれる。辺縁系および皮質系の神経変性疾患には、大脳アミロイドーシス、ピック萎縮およびレット症候群が含まれる。上述の例は、網羅的であることを意味せず、用語「神経変性障害」の例示としてのみ機能する。

パーキンソン病は、筋肉がこわばって緩慢になる、随意運動の変調である。この疾患の症状には、震えまたは振戦を生じる、筋肉の群の困難で制御不能な律動的攣縮が含まれる。目下、この疾患は、脳、特に脳幹中のシナプス前ドパミン作動性ニューロンの変性によって引き起こされる。変性の結果として、化学伝達物質ドパミンの不適切な放出が、ニューロン活動の間に発生する。

ルー・ゲーリック病とも呼ばれる筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、進行性の致死的な神経学的疾患である。ＡＬＳは、随意運動を制御する脳および脊髄中の特定の神経細胞が、徐々に変性し、その制御下にある筋肉を弱めてまたは衰弱させて運動麻痺をもたらす場合に発生する。１４ｋＤａの血管新生リボヌクレアーゼをコードするＡＮＧは、ＡＬＳにおいて同定された機能喪失遺伝子である。本発明の方法は、本発明のＲＮＡを使用したＡＬＳの処置における、この１４ｋＤａの血管新生リボヌクレアーゼの送達を企図する。

現在、パーキンソン病は、いくつかの異なる化合物および組合せで処置されている。脳においてドパミンに変換されるレボドパ（Ｌ−ドーパ）は、筋肉の制御を回復するためにしばしば与えられる。血液脳関門を横切るＡＣＥ阻害剤であるペリンドプリルは、Ｌ−ドーパに対する患者の運動応答を改善するために使用される。カルビドパは、Ｌ−ドーパが脳に達するまでＬ−ドーパのドパミンへの変換を遅延させるために、Ｌ−ドーパと共に投与され、また、Ｌ−ドーパの副作用を低下させる。パーキンソン病処置において使用される他の薬物には、ドパミン模倣物Ｍｉｒａｐｅｘ（プラミペキソール二塩酸塩）およびＲｅｑｕｉｐ（ロピニロール塩酸塩）、ならびにＴａｓｍａｒ（トルカポン）、脳に達する前にレボドパを分解することを担う重要な酵素を遮断するＣＯＭＴ阻害剤、が含まれる。

アルツハイマー病は、認知性および非認知性の精神神経症状を特徴とする変性性の脳障害である。精神医学的症状は、罹患患者のおよそ５０パーセントに存在する精神病（幻覚および妄想）と共に、アルツハイマー病において一般的である。統合失調症と同様に、陽性精神病性症状は、アルツハイマー病において一般的である。妄想は典型的に、幻覚よりも頻繁に発生する。アルツハイマー患者は、陰性症状、例えば、離脱、感情鈍麻、減退した感情的応答性、意志の喪失および減少した自発性もまた示し得る。実際、統合失調症の精神病を軽減するために使用される抗精神病性剤もまた、アルツハイマー患者における精神病を緩和する際に有用である。本明細書で使用する場合、用語「認知症」とは、知覚または意識の障害を伴わない、認知機能および知的機能の喪失を指す。認知症は典型的に、見当識障害、記憶障害、判断障害および知力障害、ならびに浅く不安定な情動を特徴とする。

自閉症（自閉症スペクトラム障害またはＡＳＤとも呼ばれる）は、個体の機能を重篤に損なう障害である。自閉症は、自己専念（ｓｅｌｆ−ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）、外界とコミュニケートする能力または外界に応答する能力の低減、儀式および強迫現象、ならびに精神遅滞を特徴とする。自閉症個体はまた、発作障害、例えばてんかんを発症するリスクが増大している。自閉症の実際の原因は未知であるが、合致率が二卵性双生児よりも一卵性双生児においてより高いという事実によって示されるように、１つまたは複数の遺伝因子を含むようであり、免疫および環境因子、例えば、食餌、毒性化学物質および感染もまた関与し得る。

神経変性障害を処置するために有用なタンパク質には、プレセニリンタンパク質およびＡＮＧが含まれるがこれらに限定されない。プレセニリンタンパク質は、アルツハイマー病の処置において有用である。

目的のタンパク質をコードするＲＮＡは、例えば、白斑、湿疹（フィラグリン遺伝子の機能喪失と関連する場合が多い）、白皮症、例えば、ヘルマンスキー・パドラック症候群（とりわけ、ＨＰＳ１およびＨＰＳ３遺伝子における変異に関連する）、色素失調症（１ＫＢＫＧ遺伝子における変異に関連する）、眼皮膚白皮症（ＭＣ１Ｒ、ＯＣＡ２、ＳＬＣ４５Ａ２、ＴＹＲ、ＳＬＣ４５Ａ２およびＴＹＲＰ１遺伝子のうち１つまたは複数における変異に関連する）、ワールデンブルグ症候群（ＥＤＮ３、ＥＤＮＲＢ、ＭＩＴＦ、ＰＡＸ３、ＳＮＡＩ２およびＳＯＸ１０遺伝子における変異に関連する）または色素性乾皮症（ＥＲＣＣ２、ＥＲＣＣ３、ＰＯＬＨ、ＸＰＡおよびＸＰＣ遺伝子における変異に関連する）などの皮膚障害の処置においても使用され得る。従って、本発明は、皮膚障害に関連するタンパク質のｉｎｖｉｖｏ発現によるかかる障害の処置に関連する。任意選択で、投与は、皮膚に対して外用であり得る。

本明細書に記載される方法および組成物は、増殖性疾患の処置において有用である。一部の実施形態では、この増殖性疾患は固形腫瘍である。一部の実施形態では、この増殖性疾患は血液学的悪性疾患である。ある特定の実施形態では、この増殖性疾患は良性新生物である。他の実施形態では、この新生物は悪性新生物である。ある特定の実施形態では、この増殖性疾患はがんである。一部の実施形態では、腫瘍細胞の少なくとも一部は、例えば、腫瘍がそこから発生したと考えられる型の細胞、および／または正常細胞において観察される典型値と比較して、タンパク質を過剰発現する。その場合、本発明の方法は、例えば、過剰発現されたタンパク質の発現または活性を妨害または遮断するタンパク質を送達するために利用され得る。代替的に、またはさらに、これらの方法は、リガンド結合ドメインを有するＲＮＡ分子の送達を含み得、このリガンドは、過剰発現されたタンパク質であり、過剰発現されたタンパク質との接触に応答して産生されたタンパク質は、細胞を死滅させる際またはがんを他の方法で処置する際に、有用であり得る。他の場合には、がん細胞は、タンパク質を過小発現し得る。その場合、本発明の方法は、そのタンパク質の送達および発現の増加を生じ得る。

一部の実施形態では、この腫瘍は、種々の臓器系のうち１つの悪性疾患（例えば、肉腫、腺癌または癌腫）、例えば、肺、乳房、リンパ系、消化管（例えば、結腸）および尿生殖器（例えば、腎、尿路上皮または精巣腫瘍）管、膵臓、咽頭、前立腺ならびに卵巣の悪性疾患である。一部の実施形態では、この腫瘍は、間質層を有する腫瘍であり得る。一部の実施形態では、このがんは非小細胞肺がんである。一部の実施形態では、このがんは腺癌である。一部の実施形態では、このがんは、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）である。腺癌の例には、結腸直腸がん、腎細胞癌、肝臓がん、肺の非小細胞癌および小腸のがんが含まれるがこれらに限定されない。さらなる例示的な固形腫瘍には以下が含まれる：線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｓａｒｃｏｎｉａ）、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、消化管系癌、結腸癌、膵臓がん、乳がん、尿生殖器系癌、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌（ｃｙｓｔａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｒｎａ）、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、内分泌系癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺がん、膀胱癌、上皮癌、グリオーマ、星状細胞腫、髄芽腫（ｍｅｄｕｉｌｏｂｉａｓｏｍａ）、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫（ｈｅｍａｎｇｉｏｈｌａｓｔｏｍａ）、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽腫および網膜芽細胞腫。

ＲＮＡは、単独で、または標準的な化学療法剤と併せて使用され得る。一部の場合には、このＲＮＡによって発現されるタンパク質は、がん細胞の化学療法感受性表現型に寄与するタンパク質である。例えば、このタンパク質は、耐性がん細胞を、化学療法剤に対して感受性にし得る。代替的に、このタンパク質は、がん細胞が化学療法耐性表現型を発達させるのを防止するために有用であり得る。本明細書で使用する場合、「化学療法剤」とは、異常な細胞増殖を特徴とする疾患の処置において治療有用性を有する、任意の化学的または生物学的薬剤を指す。かかる疾患には、腫瘍、新生物およびがん、ならびに過形成性増殖を特徴とする疾患が含まれる。化学療法剤には、アルキル化剤／アルカロイド剤、代謝拮抗剤、ホルモンまたはホルモンアナログ、および種々の抗新生物薬が含まれるがこれらに限定されない。化学療法剤は、当技術分野で周知である（例えば、ＳｌａｐａｋおよびＫｕｆｅ、ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ、第８６章、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＩｎｔｅｒｎａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ、第１４版；Ｐｅｒｒｙら、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、第１７章、Ａｂｅｌｏｆｆ、ＣｌｉｎｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ第２版、２０００年、ＣｈｕｒｃｈｉｌｌＬｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｉｎｃ；ＢａｌｔｚｅｒＬ、ＢｅｒｋｅｒｙＲ（編）：ＯｎｃｏｌｏｇｙＰｏｃｋｅｔＧｕｉｄｅｔｏＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、第２版、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏｓｂｙ−ＹｅａｒＢｏｏｋ、１９９５年；ＦｉｓｃｈｅｒＤＳ、ＫｎｏｂｆＭＦ、ＤｕｒｉｖａｇｅＨＪ（編）：ＴｈｅＣａｎｃｅｒＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙＨａｎｄｂｏｏｋ、第４版、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏｓｂｙ−ＹｅａｒＢｏｏｋ、１９９３年を参照）。

従って、本発明のＲＮＡは、細胞において有用な任意のタンパク質をコードし得る。細胞の操作または疾患の処置において使用されるＲＮＡ／タンパク質の特定の型は、疾患の型に依存する。本発明の方法における発現のために有用な例示的なタンパク質およびそのタンパク質をコードする遺伝子には、ＶＥＧＦタンパク質、アルファ１アンチトリプシンポリペプチド、心臓作用性因子、例えばクレアチン、カルニチンおよびタウリン、心細胞の生存および／または増殖を促進する増殖因子、ＴＧＦ−ベータリガンド、例えばアクチビンＡ、アクチビンＢ、インスリン様増殖因子、骨形成タンパク質、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子ナトリウム利尿因子、インスリン、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＴＧＦアルファ、ＢＭＰまたはクリプト経路の産物ならびに細胞分化剤、例えばサイトカイン増殖因子、ＴＤＧＦ１、ｖＷＦ、ＧＡＴＡ−４、ＧＡＴＡ−６、Ｎｋｘ２．５、Ｍｅｆ２−ｃ、ＬＧＭＤ−２Ｂ、ジスフェリン、ジストロフィン、エメリン、ラミンＡ／Ｃ、アルファ−１アンチトリプシン、ＣＦＴＲ、ＡＮＧ、プレセニリン（ｐｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ）、ＩＳｌ１、ＳＥＲＣＡ１ａまたは２ａ、ホスホランバン、ベータ−ＡＲＫ、ベータ−アドレナリン受容体、Ａｋｔ、アデニルシクラーゼＶ１、ニューレグリン１、ＥｒｂＢ４、ペリオスチン、ＨＡＮＤ１、Ｅ２Ｆ４、Ｓｋｐ２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、ＡＰＨＢ２、ＩＮＩ１、ＡＸＩＮ１、ＡＸＩＮ２、ＭＬＬ３、ＥＰ３００、ＮＦ１、ＴＰ５３、ＡＰＣ、ＶＨＬ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＫＥＡＰ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＲＢＩ、ＭＥＮ、ＮＦ２／ＳＣＨ、ＰＴＣＨ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＡＶＣＲ２、ＭＲＥ１１、ＭＡＰ２Ｋ４、ＬＫＢ１／ＳＴＫ１１、ＨＥＲＧ、ＫＣＮＱ１、ＳＣＮ５Ａ、ＡＮＫ２、ＫＣＮＥ１、ＫＣＮＥ２、ＫＣＮＪ２、ＣＡＣＮＡ１ｃ、ＳＣＮ４ＢＳＥＲＣＡ、ＫＣＮＱ２、ＳＣＮ１ＢならびにＫＣＮＥ３が含まれるがこれらに限定されない。

本明細書に記載される方法は、ｉｎｖｉｖｏ、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｅｘ−ｖｉｖｏの適用を包含する。上で議論したように、目的のタンパク質は、被験体へのＲＮＡ組成物のｉｎｖｉｖｏ投与によって、標的の組織または臓器において治療的に発現され得る。本発明は、１つまたは複数の細胞をＲＮＡ組成物とｅｘ−ｖｉｖｏで接触させるステップ、および次いで、かかる細胞を治療、診断または研究目的のために被験体に投与するステップを含む、治療方法もまた包含する。これらの細胞は、伝統的なｅｘｖｉｖｏアプローチにおいて、細胞中にＲＮＡをトランスポートすることが可能な任意の方法、例えばエレクトロポレーションまたはリポフェクションによってトランスフェクトされた被験体から最初に取り出され得、被験体に再導入され得る。代替的に、これらの細胞は、異なる供給源から取得され得、次いで、ＲＮＡが細胞中に導入された後に初めて被験体中に導入され得る。

本発明は、研究のための動物モデルの開発においても有用である。例えば、本発明のＲＮＡは、臓器全体および全身性の病態生理学の研究、ならびに薬物のスクリーニングおよび試験のための動物モデルを生成するために、動物に投与され得る。これらの方法は、治療剤の試験および／または開発のための、小動物モデルおよび大型動物モデルの両方、例えばマウスモデル、霊長類モデルおよびブタモデルの開発を含む。

従って、本発明は、非ヒト脊椎動物、例えば、非ヒト哺乳動物を生成する方法を提供する。本発明の非ヒト脊椎動物は、広範な種々の目的のために使用され得る。一部の実施形態では、非ヒト脊椎動物は、状態の研究を促進するために、その状態のためのモデルとして使用される。一部の実施形態では、非ヒト脊椎動物は、予防薬または治療薬が求められる状態のためのモデルとして使用される。候補薬物が、状態が動物モデル中に存在する程度を低減させるまたは状態を進行させるまたは状態を（部分的にまたは全体的に）逆転させる場合、この候補薬物は、その状態を処置するために投与される薬物である。

本発明は、再生医学方法論もまた包含する。例えば、組織を形成することが可能な細胞の集団が、一部の実施形態では、細胞のその集団による組織の形成に寄与するタンパク質をコードするＲＮＡで処置され得る。細胞の集団は、ｉｎｖｉｖｏでＲＮＡで処理され得るか、または移植直前にｉｎｖｉｔｒｏで処理され得るか、またはｉｎｖｉｔｒｏで処理され、足場上に播種され、移植前に培養物中で増殖され得る。一部の実施形態では、細胞集団は幹細胞集団である。

従って、本発明は、組織生成、組織再生および組織工学の方法を包含する。「組織再生」とは、疾患または外傷後の細胞集団、臓器または組織の再増殖を指す。用語「組織生成」とは、開始細胞集団からの組織の増殖を指す。

組織工学は、細胞および足場または支持体材料を使用した、組織または組織構造の生成を含む。かかる操作された組織または組織構造は、生物学的機能を改善または置き換えるという治療目的のために、例えば、組織（例えば、皮膚、心臓、心組織、骨、軟骨、膵臓、肝臓、腎臓、血管、膀胱など）の一部分もしくは組織全体の修復もしくは置き換えにおいて、または被験体からかかる臓器を取得する必要性なしに、臓器の一部または臓器全体の機能を改変する薬剤を同定するためのアッセイにおいて、有用である。

「足場」または「支持体」とは、本明細書に記載される方法および組成物を使用して生成された細胞がそれ自体を付着させるまたは接着することが可能な任意の適切な担体材料を指す。この足場または支持体は、平坦であり得るか、または３次元形態を有し得る。この足場は、修復または置き換えを必要とする所望の構造へと成形され得る表面を有するポリマーであり得、その結果、この足場は、細胞がその足場に付着しその上で増殖することを可能にする支持的フレームワークを提供する。この足場は、任意の所望の幾何的コンフォメーション、例えば平坦なシート、らせん状、錐体、またはｖ様構造であり得る。細胞の培養された集団は、次いで、細胞−細胞相互作用に必要とされる適切な間隙距離、ならびに後の移植のための適切なサイズおよび形状を提供する足場上で増殖され得る。典型的には、足場が被験体中に移植される場合、この足場は、生体適合性足場である。「生体適合性足場」は、非毒性であり、その結果、被験体中に一旦移植されると毒性効果を引き起こさない。

この足場は、分化または分化転換（ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を受けている細胞の制御を補助するように設計され得る。例えば、この足場は、特定の組織への細胞の分化を制御および指向する環境合図を含み得る。環境合図を提供するように操作された足場は、例えば、ナノメートルからマイクロメートルからミリメートルから巨視的長さまでを含み得、ならびに／または例えば、材料の機械的特性、材料の溶解度、生物活性化合物の空間的パターン形成、トポロジー的特徴の空間的パターン形成、可溶性生物活性化合物、機械的撹乱（周期性または静的なひずみ、応力、剪断など）、電気的刺激および熱的撹乱であるがこれらに限定されない因子に基づき得る。

この足場は、典型的にはポリマー性である。足場の生成において有用なポリマーの例には、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ−Ｌ−乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリ−Ｄ−乳酸（ＰＤＬＡ）、ポリグリコリド、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド（ＰＬＧＡ）、ポリジオキサノン、ポリグルコネート、ポリ乳酸−ポリエチレンオキシドコポリマー、改変セルロース、コラーゲン、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシプロピオン酸（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｐｒｉｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ）、ポリホスホエステル、ポリ（アルファ−ヒドロキシ酸）、ポリカプロラクトン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリ酸無水物、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、分解性ウレタン、脂肪族ポリエステルポリアクリレート、ポリメタクリレート、アシル置換酢酸セルロース、非分解性ポリウレタン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリビニルイミダゾール、クロロスルホン化ポリオレフィン（ｐｏｌｙｏｌｉｆｉｎ）、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、Ｔｅｆｌｏｎ（商標）、ナイロンシリコンおよび形状記憶材料、例えばポリ（スチレン−ブロック−ブタジエン）、ポリノルボルネン、ヒドロゲル、金属合金、ならびに切り替えセグメントとしてのオリゴ（ｅ−カプロラクトン）ジオール／物理的架橋としてのオリゴ（ｐ−ジオキサノン（ｄｉｏｘｙａｎｏｎｅ））ジオールが含まれるがこれらに限定されない。他の適切なポリマーは、ＴｈｅＰｏｌｙｍｅｒＨａｎｄｂｏｏｋ、第３版（Ｗｉｌｅｙ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年）を参照して取得でき、この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

これらのポリマーはまた、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質（例えば、細胞の接着および機能を指向するためのコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなど）、増殖因子（例えば、神経増殖因子、骨形成タンパク質、血管内皮増殖因子など）、脂質、脂肪酸、ステロイド（例えば、グリセリド、非グリセリド、飽和および不飽和脂肪酸、コレステロール、コルチコステロイド、性ステロイドなど）、糖および他の生物学的に活性な炭水化物（例えば、モノサッカライド、オリゴサッカライド、スクロース、グルコース、グリコーゲンなど）、プロテオグリカン（コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸および／またはケラタン硫酸の側鎖が付着したタンパク質コア）；糖タンパク質［例えば、セレクチン、免疫グロブリン、ホルモン（例えば、タンパク質同化ステロイド、性ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、インスリン、アンジオテンシンなど）、アルファ−フェトプロテインおよびエリスロポエチン（ＥＰＯ）など］；プロテオリピド（例えば、Ｎ−ミリストイル化、パルミトイル化およびプレニル化タンパク質）；および糖脂質（例えば、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、グリコホスファチジルイノシトールなど）、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、ホルモン、細胞表面リガンドおよび受容体（例えば、インテグリン、セレクチン、カドヘリンなど）、細胞骨格フィラメント、モータータンパク質（例えば、中間径フィラメント、微小管、アクチンフィラメント、ダイニン、キネシン、ミオシンなど）、絹、酵素（型：オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ；例：トリプシン、コラゲナーゼ（ｃｏｌｌｅｇｅｎａｓｅ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）など）、ポリタンパク質（例えば、ポリ（リシン）、ポリ乳酸およびポリグリコール酸ならびにポリ−Ｌ−リシン）またはそれらの任意の組合せなどのバイオポリマーで被覆またはかかるバイオポリマーと混合され得る。

細胞は、足場上に播種される前に、本発明のＲＮＡで処理される。代替的には、これらの細胞は、ＲＮＡで事前処理されることに加えて、またはＲＮＡによる事前処理ではなく、足場上に播種された後に、ＲＮＡで処理され得る。一部の実施形態では、本発明のＲＮＡは、足場に付着されるまたは足場内に取り込まれる。さらに、治療剤は、足場中にまたは足場上に取り込まれ得る。代替的に、足場上に播種された細胞は、本発明のＲＮＡに加えて、治療剤で処理され得る。

治療剤には、抗ウイルス剤；抗菌剤および／または抗生物質、例えばエリスロマイシン、バシトラシン、ネオマイシン、ペニシリン、ポリミキシン（ｐｏｌｙｍｙｃｉｎ）Ｂ、テトラサイクリン、バイオマイシン（ｂｉｏｍｙｃｉｎ）、クロロマイセチン、およびストレプトマイシン、セファゾリン、アンピシリン、アザクタム、トブラマイシン、クリンダマイシンおよびゲンタマイシンなど；殺生物性／生物静止性（ｂｉｏｓｔａｔｉｃ）糖、例えばデキストラン、グルコースなど；アミノ酸；ペプチド；ビタミン；無機元素；タンパク質合成のための補因子；ホルモン；内分泌組織または組織断片；シンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）；酵素、例えばアルカリホスファターゼ、コラゲナーゼ、ペプチダーゼ、オキシダーゼなど；血管新生剤；コラーゲン格子；抗原性剤；細胞骨格剤；軟骨断片；生細胞、例えば軟骨細胞、骨髄細胞、間葉系幹細胞；天然抽出物；遺伝子操作された生細胞または他の方法で改変された生細胞；増殖または培養された細胞；脱灰骨粉末；自家組織、例えば血液、血清、軟組織、骨髄など；生体接着剤；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；骨誘導因子（ＩＦＯ）；フィブロネクチン（ＦＮ）；内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ）；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；セメント質付着抽出物（ｃｅｍｅｎｔｕｍａｔｔａｃｈｍｅｎｔｅｘｔｒａｃｔ）（ＣＡＥ）；ケタンセリン；ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）；動物成長ホルモン；上皮増殖因子（ＥＧＦ）；インターロイキン、例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）；ヒトアルファトロンビン；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−ベータ）；インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２）；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ、ＢＦＧＦなど）；歯周靭帯走化性因子（ＰＤＬＧＦ）；エナメル基質タンパク質；増殖分化因子（ＧＤＦ）；ヘッジホッグファミリーのタンパク質；タンパク質受容体分子；上記増殖因子由来の小ペプチド；骨プロモーター；サイトカイン；ソマトトロピン；骨消化剤；抗腫瘍剤；細胞誘引物質および付着剤；免疫抑制剤；透過エンハンサー、例えば、脂肪酸エステル、例えば、ポリエチレングリコールのラウリン酸（ｌａｕｒｅａｔｅ）、ミリスチン酸およびステアリン酸のモノエステル、エナミン誘導体、アルファ−ケトアルデヒドなど；ならびに核酸が含まれるがこれらに限定されない。

細胞の発生上の潜在性は、本発明のＲＮＡ組成物を使用して変更され得る。例えば、本発明の外因性ＲＮＡからタンパク質を発現させる能力は、細胞の発生上の潜在性の変更または逆転の両方、即ち、細胞の再プログラミングと、より分化した表現型への細胞の指向された分化とを可能にする。細胞の発生上の潜在性を変更させるプロセスの重要な構成要素は、細胞における１種または複数の発生上の潜在性を有する再プログラミング因子の持続性または延長された発現のための必要条件である。典型的には、この持続性の発現は、外因性ＤＮＡまたはウイルスベクターを使用して達成され得る。しかし、本発明のＲＮＡは、細胞に直接送達されて、ＤＮＡまたはウイルスベクターを使用する必要性を迂回できることが発見されている。

従って、本発明のＲＮＡは、分化した表現型を有する細胞から多能性幹細胞を生成するために使用され得る。この実施形態を達成するために、ＲＮＡは、分化した表現型を有する細胞に送達される。一旦ＲＮＡが細胞内に入ると、このＲＮＡは、あまり分化していない表現型を細胞に生じさせる再プログラミング因子へと翻訳される。次いで、未処理の細胞よりも大きい発生上の潜在性を有する得られた細胞は、さらなる操作のための幹細胞の供給源となり得る。

上記のように生成された幹細胞または幹細胞の任意の他の供給源もまた、より分化した細胞を生成するために、本発明に従って処理され得る。例えば、この幹細胞は、タンパク質発現の誘導によって、所望の細胞型へと幹細胞を分化させることによって操作され得る。この型の指向された分化は、所望の表現型を有する細胞を創出するために使用される。これらの幹細胞は、分化した表現型を細胞に生じさせる分化因子へと翻訳される、本発明のＲＮＡで処理される。

従って、本明細書に記載されるテクノロジーを使用して、幹細胞は、分化した細胞から生成され得、幹細胞は、１つまたは複数の所望の細胞型へと分化し得る。「幹細胞」は、本明細書で使用する場合、自己更新する能力を有し、複数の細胞型へと分化する発生上の潜在性を有する、未分化細胞または部分的に分化した細胞である。多能性細胞は、異なる条件下で、３つ全ての細胞胚葉、即ち、内胚葉（例えば、腸組織）、中胚葉（血液、筋肉および血管を含む）および外胚葉（例えば、皮膚および神経）に特徴的な細胞型へと分化する発生上の潜在性を有する細胞である。

多分化能細胞は、３つ全てではないが、１つまたは複数の胚葉の細胞へと分化する発生上の潜在性を有する細胞である。これらの細胞には、例えば、成体幹細胞、例えば造血幹細胞および神経幹細胞などが含まれる。幹細胞は、分化した表現型への性向を有し得る。しかし、これらの細胞は、幹細胞表現型を逆転および再発現させるために誘導され得る。このプロセスは、「脱分化」または「再プログラミング」と呼ばれる。

幹細胞は、自己更新性前駆体、非更新性前駆体および終末分化した細胞を含む後代細胞を生成するために、自己更新および分化の両方を単一細胞レベルで行う能力によって規定される未分化細胞である。幹細胞は、その分化のレベルに依存して、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）から種々の細胞系統の機能的細胞へとｉｎｖｉｔｒｏで分化する能力、ならびに移植後に複数の胚葉の組織を生じる能力もまた特徴とする。幹細胞は、胚性幹細胞または体性幹細胞であり得る。用語「胚性幹細胞」は、典型的には、３つの一次胚葉：外胚葉、内胚葉および中胚葉、の全ての派生物への発生の間に生じ得る胚性胚盤胞の内部細胞塊の多能性幹細胞を指すために使用される。対照的に、「体性幹細胞」とは、本明細書で使用する場合、胎仔、幼若および成体の組織を含む非胚性組織由来の任意の多能性または多分化能幹細胞を指す。天然の体性幹細胞は、血液、骨髄、脳、嗅上皮、皮膚、膵臓、骨格筋および心筋を含む広範な種々の成体組織から単離されている。対照的に、「分化した細胞」は、多能性でない体性細胞である。

用語「再プログラミング」とは、本明細書で使用する場合、細胞または細胞（例えば、体性細胞）の集団の発生上の潜在性を逆転させるプロセスを指す。従って、再プログラミングとは、より高い発生上の潜在性を有する状態、即ち、あまり分化していない状態に後退するように、細胞を駆動するプロセスを指す。再プログラミングされる細胞は、再プログラミングの前に、部分的に分化または終末分化され得る。一部の実施形態では、再プログラミングは、多能性状態を有する細胞への、分化状態の完全なまたは部分的な逆転、即ち、細胞の発生上の潜在性における増加を包含する。一部の実施形態では、再プログラミングは、多能性状態へと体性細胞を駆動することを包含し、その結果、細胞は、胚性幹細胞の発生上の潜在性、即ち、胚性幹細胞表現型を有する。一部の実施形態では、再プログラミングは、多分化能状態への、体性細胞もしくは単能性細胞などの細胞の分化状態の部分的逆転または発生上の潜在性の部分的増加もまた、包含する。再プログラミングは、さらなる操作に供される場合の多能性状態への完全な再プログラミングに対して細胞をより感受性にする状態への、細胞の分化状態の部分的逆転もまた包含する。

「再プログラミング因子」とは、本明細書で使用する場合、発生上の潜在性を変更する因子を指し、その発現は、あまり分化していない状態または未分化状態への、例えば、多能性状態または部分的多能性状態の細胞への、体性細胞などの細胞の再プログラミングに寄与する。再プログラミング因子には、ＯＣＴ４、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、ＳＯＸ１５、ＳＯＸ１８、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５、ＮＲ５Ａ２、ｃ−ＭＹＣ、１−ＭＹＣ、ｎ−ＭＹＣ、ＲＥＭ２、ＴＥＲＴおよびＬＩＮ２８が含まれるがこれらに限定されない。

本明細書で使用する場合、用語「分化因子」とは、その用語が本明細書で規定される場合、発生上の潜在性を変更する因子、例えば、所望の細胞型へと分化するように細胞を誘導するタンパク質、ＲＮＡまたは小分子を指し、即ち、分化因子は、細胞の発生上の潜在性を低減させる。特定の細胞型への分化は、１種より多い分化因子の同時および／または逐次的発現を含み得る。これは、１つまたは複数の分化因子をコードする１つまたは複数のＲＮＡを細胞に送達し、任意選択で、タンパク質の形態で１つまたは複数の分化因子を細胞に送達することによって、達成され得る。

一部の態様では、本発明は、本発明の方法に従って操作された細胞に関する。かかる細胞は、単離された細胞である。用語「単離された細胞」とは、その細胞が元々見出された生物から取り出された細胞、またはかかる細胞の子孫を指す。これらの細胞は、第２の生物中に後に導入され得るか、またはその細胞（またはその子孫である細胞もしくは細胞の集団）が単離された生物中に再導入され得る。しかし、かかる細胞は、一旦本発明の方法に従って操作されると、単離された細胞であるとなおもみなされる。幹細胞は、目的の特異的マーカーの存在または非存在に基づいて単離され得る。例えば、薬剤が、幹細胞マーカーを認識するために使用され得、例えば、所望の幹細胞上の細胞表面マーカーまたは抗原を認識し結合する標識された抗体が、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）、パニング法、磁性粒子選択、粒子ソーター選択および密度分離を含む当業者に公知の他の方法を使用して、所望の幹細胞を分離および単離するために使用され得る。

一部の実施形態では、本発明に従って処理される幹細胞は、がん幹細胞である。がん幹細胞は、ある種のヒト腫瘍中に存在する。これらの細胞は、腫瘍の総細胞塊のごく少数を表すが、腫瘍の増殖を担う腫瘍細胞の下位集団であると考えられる。がん幹細胞は、広範に増殖し、さらなる腫瘍幹細胞ならびに腫瘍原性能を欠く他の腫瘍細胞を生じる。がん幹細胞のさらなる形質は、化学療法などの治療に対するその耐性である。がん幹細胞は、腫瘍幹細胞のごく一部、ならびに増殖しおよび最終的に致死的であることが判明するその直接の娘細胞集団である。本発明のがん幹細胞は、細胞の化学療法耐性を逆転または他の方法で妨害する因子を研究するために使用され得る。

幹細胞は、任意の哺乳動物種、例えばヒト、霊長類、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、げっ歯類、例えばマウス、ラット、ハムスターなどから取得され得る。

本発明の方法に従って処理される分化したまたは多能性細胞集団は、これらの細胞型のための標準的な条件下で操作され得る。細胞の処理は、ｉｎｖｉｔｒｏ、ｅｘｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｖｏで実施され得る。例えば、これらの細胞は、身体中または培養培地中に存在し得る。これらの操作は、高酸素条件下または低酸素条件下で実施され得る。

「培養培地」は、細胞生存度を維持し増殖を支持する栄養素を含む。典型的な培養培地は以下を含む：塩、緩衝剤、アミノ酸、グルコースもしくは他の糖（複数可）、抗生物質、血清もしくは血清代替物（ｓｅｒｕｍｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、および／または他の構成要素、例えばペプチド増殖因子など。多能性細胞を誘導および維持する際に使用するための細胞培養培地は、当技術分野で公知である。培養培地は、細胞特異的増殖因子、例えば、アンジオゲニン、骨形成タンパク質−１、骨形成タンパク質−２、骨形成タンパク質−３、骨形成タンパク質−４、骨形成タンパク質−５、骨形成タンパク質−６、骨形成タンパク質−７、骨形成タンパク質−８、骨形成タンパク質−９、骨形成タンパク質−１０、骨形成タンパク質−１１、骨形成タンパク質−１２、骨形成タンパク質−１３、骨形成タンパク質−１４、骨形成タンパク質−１５、骨形成タンパク質受容体ＩＡ、骨形成タンパク質受容体ＩＢ、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ）、毛様体神経栄養因子受容体−アルファ、サイトカイン誘導性好中球走化性因子１、サイトカイン誘導性好中球、走化性因子２−アルファ、サイトカイン誘導性好中球走化性因子２−ベータ、ベータ−内皮細胞増殖因子、内皮１、上皮増殖因子、上皮由来好中球誘引物質、線維芽細胞増殖因子４、線維芽細胞増殖因子５、線維芽細胞増殖因子６線維芽細胞増殖因子７、線維芽細胞増殖因子８、線維芽細胞増殖因子ｂ、線維芽細胞増殖因子ｃ、線維芽細胞増殖因子９、線維芽細胞増殖因子１０、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリア細胞株由来好中球因子受容体−アルファ−１、グリア細胞株由来好中球因子受容体−アルファ−２、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質−アルファ、増殖関連タンパク質−ベータ、増殖関連タンパク質−ガンマ、ヘパリン結合性上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、インスリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子ＩＩ、インスリン様増殖因子結合性タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体−アルファ、神経増殖因子、神経増殖因子受容体、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子２、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子Ａ鎖、血小板由来増殖因子ＡＡ、血小板由来増殖因子ＡＢ、血小板由来増殖因子Ｂ鎖、血小板由来増殖因子ＢＢ、血小板由来増殖因子受容体−アルファ、血小板由来増殖因子受容体−ベータ、プレ−Ｂ細胞増殖刺激因子、幹細胞因子、幹細胞因子受容体、トランスフォーミング増殖因子−アルファ、トランスフォーミング増殖因子−ベータ、トランスフォーミング増殖因子−ベータ−１、トランスフォーミング増殖因子−ベータ−１−２、トランスフォーミング増殖因子−ベータ−２、トランスフォーミング増殖因子−ベータ−３、トランスフォーミング増殖因子−ベータ−５、潜在型トランスフォーミング増殖因子−ベータ−１、トランスフォーミング増殖因子−ベータ結合性タンパク質Ｉ、トランスフォーミング増殖因子−ベータ結合性タンパク質ＩＩ、トランスフォーミング増殖因子−ベータ結合性タンパク質ＩＩＩ、腫瘍壊死因子受容体Ｉ型、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ型、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター受容体、血管内皮増殖因子、ならびにキメラタンパク質、および生物学的または免疫学的に活性なそれらの断片もまた含み得る。

細胞の分化状態は、かかる評価を行うための当技術分野で公知の任意の方法を使用して評価され得る。例えば、本明細書に記載される方法に従って処理される細胞の分化状態は、未処理の細胞、または同じ再プログラミング因子もしくは分化因子の発現を生じるＤＮＡを送達するためのウイルスベクターを使用してＤＮＡで処理された細胞と、比較され得る。

本発明の方法は、ワクチン接種のためにも有用である。本発明のＲＮＡは、細胞または被験体に対する抗原を発現させるために使用され得る。例えば、細胞に送達されるＲＮＡは、抗原、例えば、免疫応答が望まれる抗原をコードし得る。例示的な抗原には、病原性生物、例えば、細菌またはウイルスまたは他の微生物由来のタンパク質またはその断片、ならびに細胞、例えばがん細胞由来のタンパク質またはその断片が含まれる。この抗原は、単に免疫原性タンパク質もしくはその断片であり得るか、または担体ペプチドと融合された抗原性タンパク質もしくはその断片を包含する融合タンパク質であり得る。担体ペプチドは、第２の抗原性ペプチドであり得るか、または非免疫原性であり得る。

この抗原は、完全タンパク質またはエピトープ、例えば、ＭＨＣクラスＩエピトープ、ＭＨＣクラスＩＩエピトープ、またはＢ細胞もしくはＴ細胞エピトープであり得る。ＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるＴ細胞エピトープは、およそ８〜１１アミノ酸のペプチドであり得る。ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されるＴ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩ分子よりも長くてもよい。エピトープは、種々のウェブベースの予測ツール、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／ｍａｉｎ／ｈｔｍｌ／ｔｃｅｌｌ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌを使用して予測され得る。

ウイルス抗原は、ウイルス由来の免疫原性タンパク質またはその断片である。慢性ヒトウイルス感染におけるいくつかの重要なウイルスには、ＨＰＶ、ＨＢＶ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、レトロウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）、ヘルペスウイルス、例えばエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２、ならびにインフルエンザウイルスが含まれるがこれらに限定されない。有用な抗原には、ＨＢＶ表面抗原もしくはＨＢＶコア抗原；ＣＭＶのｐｐＵＬ８３もしくはｐｐ８９；ＨＩＶ−１のｇｐ１２０、ｇｐ４１もしくはｐ２４タンパク質の抗原；ＨＳＶのＩＣＰ２７、ｇＤ２、ｇＢ；またはインフルエンザ赤血球凝集素もしくは核タンパク質（Ａｎｔｈｏｎｙ，ＬＳら、Ｖａｃｃｉｎｅ１９９９年；１７巻：３７３〜８３頁）が含まれる。他のウイルスには以下が含まれる：エーベルソン白血病ウイルス、エーベルソンマウス白血病ウイルス、エーベルソンウイルス、急性喉頭気管気管支炎ウイルス、アデレードリバー（ＡｄｅｌａｉｄｅＲｉｖｅｒ）ウイルス、アデノ随伴ウイルス群、アデノウイルス、アフリカ馬疫ウイルス、アフリカブタ熱ウイルス、ＡＩＤＳウイルス、アリューシャンミンク症パルボウイルス、アルファレトロウイルス、アルファウイルス、ＡＬＶ関連ウイルス、アマパリ（Ａｍａｐａｒｉ）ウイルス、アフトウイルス、アクアレオウイルス、アルボウイルス、アルボウイルスＣ、アルボウイルス群Ａ、アルボウイルス群Ｂ、アレナウイルス群、アルゼンチン出血熱ウイルス、アルゼンチン出血熱ウイルス、アルテリウイルス、アストロウイルス、クモザルヘルペスウイルス群、オーエスキー（Ａｕｊｅｚｋｙ）病ウイルス、アウラ（Ａｕｒａ）ウイルス、オースダク（Ａｕｓｄｕｋ）病ウイルス、オーストラリアコウモリリッサウイルス、トリアデノウイルス、トリ赤芽球症ウイルス、トリ感染性気管支炎ウイルス、トリ白血病ウイルス、トリ白血症ウイルス、トリリンパ腫症ウイルス、トリ骨髄芽球症ウイルス、トリパラミクソウイルス、トリ肺脳炎（ｐｎｅｕｍｏｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）ウイルス、トリ細網内皮症ウイルス、トリ肉腫ウイルス、トリＣ型レトロウイルス群、トリヘパドナウイルス、トリポックスウイルス、Ｂウイルス、Ｂ１９ウイルス、ババンキ（Ｂａｂａｎｋｉ）ウイルス、ヒヒヘルペスウイルス、バキュロウイルス、バーマフォレストウイルス、ベバル（Ｂｅｂａｒｕ）ウイルス、ベリマー（Ｂｅｒｒｉｍａｈ）ウイルス、ベータレトロウイルス、ビルナウイルス、ビットナーウイルス、ＢＫウイルス、ブラッククリークカナルウイルス、ブルータングウイルス、ボリビア出血熱ウイルス、ボルナ（Ｂｏｍａ）病ウイルス、ヒツジのボーダー病ウイルス、ボルナウイルス、ウシアルファヘルペスウイルス１、ウシアルファヘルペスウイルス２、ウシコロナウイルス、ウシ流行熱ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ウシ白血症ウイルス、ウシ乳頭炎ウイルス、ウシパピローマウイルス、ウシ丘疹性口炎ウイルス、ウシパルボウイルス、ウシ合胞体ウイルス、ウシＣ型オンコウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、バギークリーク（ＢｕｇｇｙＣｒｅｅｋ）ウイルス、弾丸型ウイルス群、ブニヤムウェラウイルススーパーグループ、ブニヤウイルス、バーキットリンパ腫ウイルス、ブワンバ熱（ＢｗａｍｂａＦｅｖｅｒ）、ＣＡウイルス、カリシウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、ラクダ痘ウイルス、カナリアポックスウイルス、イヌヘルペスウイルス、イヌコロナウイルス、イヌジステンパーウイルス、イヌヘルペスウイルス、イヌ微小ウイルス、イヌパルボウイルス、カノデルガディト（ＣａｎｏＤｅｌｇａｄｉｔｏ）ウイルス、ヤギ関節炎ウイルス、ヤギ脳炎ウイルス、ヤギヘルペスウイルス、カプリポックスウイルス、カルジオウイルス、テンジクネズミ（ｃａｖｉｉｄ）ヘルペスウイルス１、オナガザル科ヘルペスウイルス１、オナガザルヘルペスウイルス１、オナガザルヘルペスウイルス２、チャンディプラウイルス、チャングイノラ（Ｃｈａｎｇｕｉｎｏｌａ）ウイルス、アメリカナマズウイルス、チャールビル（Ｃｈａｒｌｅｖｉｌｌｅ）ウイルス、水痘ウイルス、チクングニアウイルス、チンパンジーヘルペスウイルス、チャブ（ｃｈｕｂ）レオウイルス、シロザケウイルス、コカル（Ｃｏｃａｌ）ウイルス、ギンザケレオウイルス、媾疹ウイルス、コロラドダニ熱ウイルス、コルティウイルス、コロンビアＳＫウイルス、風邪ウイルス、伝染性膿瘡（ｃｏｎｔａｇｉｏｕｓｅｅｔｈｙｍａ）ウイルス、伝染性膿胞性皮膚炎ウイルス、コロナウイルス、コリパルタ（Ｃｏｒｒｉｐａｒｔａ）ウイルス、コリーザウイルス、牛痘ウイルス、コクサッキーウイルス、ＣＰＶ（細胞質多角体病ウイルス）、コオロギ麻痺ウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、クルップ随伴（ｃｒｏｕｐａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ウイルス、種子伝染性潜伏ウイルス、サイポウイルス、サイトメガロウイルス、サイトメガロウイルス群、細胞質多角体病ウイルス、シカパピローマウイルス、デルタレトロウイルス、デングウイルス、デンソウイルス、ディペンドウイルス、ドーリ（Ｄｈｏｒｉ）ウイルス、ディプロマ（ｄｉｐｌｏｍａ）ウイルス、ショウジョウバエＣウイルス、アヒルＢ型肝炎ウイルス、アヒル肝炎ウイルス１、アヒル肝炎ウイルス２、ドゥオウイルス（ｄｕｏｖｉｒｕｓ）、ドゥベンヘイジ（Ｄｕｖｅｎｈａｇｅ）ウイルス、チヂレバネウイルス（Ｄｅｆｏｒｍｅｄｗｉｎｇｖｉｒｕｓ）ＤＷＶ、東部ウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス、ＥＢウイルス、エボラウイルス、エボラ様ウイルス、エコー・ウイルス、エコーウイルス、エコーウイルス１０、エコーウイルス２８、エコーウイルス９、エクトロメリアウイルス、ＥＥＥウイルス、ＥＩＡウイルス、ＥＩＡウイルス、脳炎ウイルス、脳心筋炎群ウイルス、脳心筋炎ウイルス、エンテロウイルス、酵素上昇（ｅｎｚｙｍｅｅｌｅｖａｔｉｎｇ）ウイルス、酵素上昇ウイルス（ＬＤＨ）、流行性出血熱ウイルス、流行性出血熱ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ウマアルファヘルペスウイルス１、ウマアルファヘルペスウイルス４、ウマヘルペスウイルス２、ウマ流産ウイルス、ウマ動脈炎ウイルス、ウマ脳症ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、ウマモルビリウイルス、ウマ鼻肺炎ウイルス、ウマライノウイルス、ユベナング（Ｅｕｂｅｎａｎｇｕ）ウイルス、ヨーロッパエルクパピローマウイルス、ヨーロッパブタ熱ウイルス、エバーグレイズ（Ｅｖｅｒｇｌａｄｅｓ）ウイルス、イヤチ（Ｅｙａｃｈ）ウイルス、ネコ科ヘルペスウイルス１、ネコカリシウイルス、ネコ線維肉腫ウイルス、ネコヘルペスウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、ネコ白血病／肉腫ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ネコ肉腫ウイルス、ネコ合胞体ウイルス、フィロウイルス、フランダース（Ｆｌａｎｄｅｒｓ）ウイルス、フラビウイルス、口蹄疫ウイルス、フォートモーガン（ＦｏｒｔＭｏｒｇａｎ）ウイルス、フォーコーナーズ（ＦｏｕｒＣｏｒｎｅｒｓ）ハンタウイルス、トリアデノウイルス１、鶏痘ウイルス、フレンドウイルス、ガンマレトロウイルス、ＧＢ肝炎ウイルス、ＧＢウイルス、風疹ウイルス（Ｇｅｒｍａｎｍｅａｓｌｅｓｖｉｒｕｓ）、ゲタウイルス、テナガザル白血病ウイルス、腺熱ウイルス、山羊痘ウイルス、ゴールデンシャイナー（ｇｏｌｄｅｎｓｈｉｎｎｅｒ）ウイルス、ゴノメタ（Ｇｏｎｏｍｅｔａ）ウイルス、ガチョウパルボウイルス、顆粒病ウイルス、グロスウイルス（Ｇｒｏｓｓ’ ｖｉｒｕｓ）、地リスＢ型肝炎ウイルス、群Ａアルボウイルス、グアナリト（Ｇｕａｎａｒｉｔｏ）ウイルス、モルモットサイトメガロウイルス、モルモットＣ型ウイルス、ハンタンウイルス、ハンタウイルス、ホンビノスガイレオウイルス（ｈａｒｄｃｌａｍｒｅｏｖｉｒｕｓ）、ノウサギ線維腫ウイルス、ＨＣＭＶ（ヒトサイトメガロウイルス）、赤血球吸着ウイルス２、センダイウイルス、出血熱ウイルス、ヘンドラウイルス、ヘニパウイルス、ヘパドナウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス群、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、デルタ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、Ｆ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝炎ウイルス、非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス、肝炎ウイルス、肝炎ウイルス（非ヒト）、肝脳脊髄炎（ｈｅｐａｔｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）レオウイルス３、ヘパトウイルス、アオサギＢ型肝炎ウイルス、ヘルペスＢウイルス、単純ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス１、単純ヘルペスウイルス２、ヘルペスウイルス、ヘルペスウイルス７、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓａｔｅｌｅｓ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｈｏｍｉｎｉｓ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｓａｉｍｉｒｉ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｓｕｉｓ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｖａｒｉｃｅｌｌａｅ、ハイランドＪウイルス（ＨｉｇｈｌａｎｄｓＪｖｉｒｕｓ）、ヒラメラブドウイルス、ブタコレラウイルス、ヒトアデノウイルス２、ヒトアルファヘルペスウイルス１、ヒトアルファヘルペスウイルス２、ヒトアルファヘルペスウイルス３、ヒトＢリンパ球向性ウイルス、ヒトベータヘルペスウイルス５、ヒトコロナウイルス、ヒトサイトメガロウイルス群、ヒト泡沫状ウイルス、ヒトガンマヘルペスウイルス４、ヒトガンマヘルペスウイルス６、ヒトＡ型肝炎ウイルス、ヒトヘルペスウイルス１群、ヒトヘルペスウイルス２群、ヒトヘルペスウイルス３群、ヒトヘルペスウイルス４群、ヒトヘルペスウイルス６、ヒトヘルペスウイルス８、ヒト免疫不全ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１、ヒト免疫不全ウイルス２、ヒトパピローマウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩＩ、ヒトＴ細胞リンパ腫ウイルスＩ、ヒトＴ細胞リンパ腫ウイルスＩＩ、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス１型、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス２型、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩＩ、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩＩＩ、イクノウイルス（Ｉｃｈｎｏｖｉｒｕｓ）、乳児胃腸炎ウイルス、感染性ウシ鼻気管炎ウイルス、感染性造血壊死ウイルス、感染性膵壊死ウイルス、インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢ、インフルエンザウイルスＣ、インフルエンザウイルスＤ、インフルエンザウイルスｐｒ８、昆虫イリデセント（ｉｒｉｄｅｓｃｅｎｔ）ウイルス、昆虫ウイルス、イリドウイルス、日本Ｂウイルス（ＪａｐａｎｅｓｅＢｖｉｒｕｓ）、日本脳炎ウイルス、ＪＣウイルス、フニンウイルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、ケメロボ（Ｋｅｍｅｒｏｖｏ）ウイルス、キルハムラットウイルス、クラマス（Ｋｌａｍａｔｈ）ウイルス、コロンゴ（Ｋｏｌｏｎｇｏ）ウイルス、朝鮮出血熱ウイルス、クンバ（ｋｕｍｂａ）ウイルス、キャサヌール森林病（Ｋｙｓａｎｕｒｆｏｒｅｓｔｄｉｓｅａｓｅ）ウイルス、キジラガッチェ（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ）ウイルス、ラクロス（ＬａＣｒｏｓｓｅ）ウイルス、乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス、乳酸デヒドロゲナーゼウイルス、ラゴス（Ｌａｇｏｓ）コウモリウイルス、ラングールウイルス、ラピーヌ（ｌａｐｉｎｅ）パルボウイルス、ラッサ熱ウイルス、ラッサウイルス、潜在性ラットウイルス、ＬＣＭウイルス、リーキー（Ｌｅａｋｙ）ウイルス、レンチウイルス、レポリポックスウイルス、白血病ウイルス、ロイコウイルス、ランピースキン病ウイルス、リンパ節腫大関連ウイルス、リンホクリプトウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、リンパ増殖性ウイルス群、マチュポウイルス、狂掻痒症ウイルス（ｍａｄｉｔｃｈｖｉｒｕｓ）、哺乳動物Ｂ型オンコウイルス群、哺乳動物Ｂ型レトロウイルス、哺乳動物Ｃ型レトロウイルス群、哺乳動物Ｄ型レトロウイルス、乳癌ウイルス、マプエラ（Ｍａｐｕｅｒａ）ウイルス、マールブルグウイルス、マールブルグ様ウイルス、マソン・ファイザー・サルウイルス

、マストアデノウイルス、マヤロ（Ｍａｙａｒｏ）ウイルス、ＭＥウイルス、麻疹ウイルス、メナングル（Ｍｅｎａｎｇｌｅ）ウイルス、メンゴ・ウイルス、メンゴウイルス、ミデルブルグ（Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ）ウイルス、ミルカー結節（ｍｉｌｋｅｒｓｎｏｄｕｌｅ）ウイルス、ミンク腸炎ウイルス、マウスの微小ウイルス、ＭＬＶ関連ウイルス、ＭＭウイルス、モコラウイルス、モルシポックスウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、サルＢウイルス、サル痘ウイルス、モノネガウイルス目、モルビリウイルス、マウントエルゴン（ＭｏｕｎｔＥｌｇｏｎ）コウモリウイルス、マウスサイトメガロウイルス、マウス脳脊髄炎ウイルス、マウス肝炎ウイルス、マウスＫウイルス、マウス白血病ウイルス、マウス乳癌ウイルス、マウス微小ウイルス、マウス肺炎ウイルス、マウス灰白髄炎ウイルス、マウスポリオーマウイルス、マウス肉腫ウイルス、マウス痘ウイルス、モザンビーク（Ｍｏｚａｍｂｉｑｕｅ）ウイルス、ムカンボウイルス、粘膜疾患ウイルス、ムンプスウイルス、ネズミ科ベータヘルペスウイルス１、ネズミ科サイトメガロウイルス２、マウスサイトメガロウイルス群、マウス脳脊髄炎ウイルス、マウス肝炎ウイルス、マウス白血病ウイルス、マウス結節誘導性ウイルス、マウスポリオーマウイルス、マウス肉腫ウイルス、ムロメガロウイルス、マレー渓谷脳炎ウイルス、粘液腫ウイルス、ミクソウイルス、Ｍｙｘｏｖｉｒｕｓｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ、Ｍｙｘｏｖｉｒｕｓｐａｒｏｔｉｔｉｄｉｓ、ナイロビヒツジ病ウイルス、ナイロウイルス、ナニルナウイルス（Ｎａｎｉｒｎａｖｉｒｕｓ）、ナリバ（Ｎａｒｉｖａ）ウイルス、ンデュモ（Ｎｄｕｍｏ）ウイルス、ニースリング（Ｎｅｅｔｈｌｉｎｇ）ウイルス、ネルソンベイ（ＮｅｌｓｏｎＢａｙ）ウイルス、向神経性ウイルス、新世界アレナウイルス、新生児間質性肺炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ニパーウイルス、非細胞障害性ウイルス、ノーウォークウイルス、核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）、ニップルネック（ｎｉｐｐｌｅｎｅｃｋ）ウイルス、オニョンニョンウイルス、オケルボ（Ｏｃｋｅｌｂｏ）ウイルス、腫瘍ウイルス、腫瘍ウイルス様粒子、オンコルナウイルス、オルビウイルス、オルフウイルス、オロプーシェ（Ｏｒｏｐｏｕｃｈｅ）ウイルス、オルトヘパドナウイルス、オルソミクソウイルス、オルソポックスウイルス、オルトレオウイルス、オルンゴ（Ｏｒｕｎｇｏ）、ヒツジパピローマウイルス、ヒツジカタル熱ウイルス、ヨザルヘルペスウイルス、パリアムウイルス、パピローマウイルス、Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｓｙｌｖｉｌａｇｉ、パポーバウイルス、パラインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス１型、パラインフルエンザウイルス２型、パラインフルエンザウイルス３型、パラインフルエンザウイルス４型、パラミクソウイルス、パラポックスウイルス、パラワクシニアウイルス、パルボウイルス、パルボウイルスＢ１９、パルボウイルス群、ペスチウイルス、フレボウイルス、アザラシジステンパーウイルス、ピコドナウイルス（Ｐｉｃｏｄｎａｖｉｒｕｓ）、ピコルナウイルス、ブタサイトメガロウイルス−−鳩痘ウイルス、ピリ（Ｐｉｒｙ）ウイルス、ピクスナ（Ｐｉｘｕｎａ）ウイルス、マウスの肺炎ウイルス、ニューモウイルス、灰白髄炎ウイルス、ポリオウイルス、ポリドナウイルス、多角体ウイルス、ポリオーマ・ウイルス、ポリオーマウイルス、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓｂｏｖｉｓ、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｉ、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓｈｏｍｉｎｉｓ２、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓｍａｃｃａｃａｅ１、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓｍｕｒｉｓ１、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓｍｕｒｉｓ２、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓｐａｐｉｏｎｉｓ１、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓｐａｐｉｏｎｉｓ２、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓｓｙｌｖｉｌａｇｉ、オランウータン（Ｐｏｎｇｉｎｅ）ヘルペスウイルス１、ブタ伝染性下痢症ウイルス、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、ブタパルボウイルス、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス、ブタＣ型ウイルス、ポックス・ウイルス、ポックスウイルス、ｐｏｘｖｉｒｕｓｖａｒｉｏｌａｓ、プロスペクトヒル（ＰｒｏｓｐｅｃｔＨｉｌｌ）ウイルス、プロウイルス、偽牛痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、オウム痘（ｐｓｉｔｔａｃｉｎｅｐｏｘ）ウイルス、ウズラ痘（ｑｕａｉｌｐｏｘ）ウイルス、ウサギ線維腫ウイルス、ウサギ腎臓空胞化（ｖａｃｕｌｏｌａｔｉｎｇ）ウイルス、ウサギパピローマウイルス、狂犬病ウイルス、アライグマパルボウイルス、アライグマ痘（ｒａｃｃｏｏｎｐｏｘ）ウイルス、ラニケート（Ｒａｎｉｋｈｅｔ）ウイルス、ラットサイトメガロウイルス、ラットパルボウイルス、ラットウイルス、ラウシャーウイルス、組換えワクシニアウイルス、組換えウイルス、レオウイルス、レオウイルス１、レオウイルス２、レオウイルス３、爬虫類Ｃ型ウイルス、呼吸器感染ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、呼吸器ウイルス、細網内皮症ウイルス、ラブドウイルス、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓｃａｒｐｉａ、ラジノウイルス、ライノウイルス、リジディオウイルス（Ｒｈｉｚｉｄｉｏｖｉｒｕｓ）、リフトバレー熱ウイルス、ライリー（Ｒｉｌｅｙ）ウイルス、牛疫ウイルス、ＲＮＡ腫瘍ウイルス、ロスリバーウイルス、ロタウイルス、麻疹（ｒｏｕｇｅｏｌｅ）ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、風疹ウイルス（ｒｕｂｅｌｌａｖｉｒｕｓ）、はしかウイルス、ルビウイルス、ロシア秋脳炎ウイルス、ＳＡ１１サルウイルス、ＳＡ２ウイルス、サビアウイルス、サギヤマ（Ｓａｇｉｙａｍａ）ウイルス、サイミリ（Ｓａｉｍｉｒｉｎｅ）ヘルペスウイルス１、唾液腺ウイルス、三日熱ウイルス群、サンジンバ（Ｓａｎｄｊｉｍｂａ）ウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ＳＤＡＶ（唾液腺涙腺炎（ｓｉａｌｏｄａｃｒｙｏａｄｅｎｉｔｉｓ）ウイルス）、アシカ痘（ｓｅａｌｐｏｘ）ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ソウルウイルス、羊痘ウイルス、ショープ線維腫ウイルス、ショープパピローマウイルス、サル泡沫状ウイルス、サルＡ型肝炎ウイルス、サルヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、サルパラインフルエンザウイルス、サルＴ細胞リンパ増殖性ウイルス、サルウイルス、サルウイルス４０、シンプレックスウイルス、シンノンブルウイルス、シンドビスウイルス、痘瘡ウイルス、南米出血熱ウイルス、スズメ痘（ｓｐａｒｒｏｗｐｏｘ）ウイルス、スプーマウイルス、リス線維腫ウイルス、リスザルレトロウイルス、ＳＳＶ１ウイルス群、ＳＴＬＶ（サルＴリンパ球向性ウイルス）Ｉ型、ＳＴＬＶ（サルＴリンパ球向性ウイルス）ＩＩ型、ＳＴＬＶ（サルＴリンパ球向性ウイルス）ＩＩＩ型、丘疹性口炎（ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓｐａｐｕｌｏｓａ）ウイルス、顎下ウイルス、ブタアルファヘルペスウイルス１、ブタヘルペスウイルス２、スイポックスウイルス、沼地熱（ｓｗａｍｐｆｅｖｅｒ）ウイルス、ブタポックスウイルス、スイスマウス白血病ウイルス、ＴＡＣウイルス、タカリベコンプレックス（Ｔａｃａｒｉｂｅｃｏｍｐｌｅｘ）ウイルス、タカリベウイルス、タナポックス（Ｔａｎａｐｏｘ）ウイルス、タテラポックス（Ｔａｔｅｒａｐｏｘ）ウイルス、テンチレオウイルス、タイラー脳脊髄炎ウイルス、タイラーウイルス、ソゴトウイルス、トッタパラヤム（Ｔｈｏｔｔａｐａｌａｙａｍ）ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ティオマン（Ｔｉｏｍａｎ）ウイルス、トガウイルス、トロウイルス、腫瘍ウイルス、ツパイ属ウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、シチメンチョウ痘（ｔｕｒｋｅｙｐｏｘ）ウイルス、Ｃ型レトロウイルス、Ｄ型オンコウイルス、Ｄ型レトロウイルス群、潰瘍性疾患ラブドウイルス、ウナ（Ｕｎａ）ウイルス、ウークニエミウイルス群、ワクシニアウイルス、空胞化ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、バリセロウイルス、バリコラ（Ｖａｒｉｃｏｌａ）ウイルス、大痘瘡ウイルス、痘瘡ウイルス、ウアシン・ギシュ病（ＶａｓｉｎＧｉｓｈｕｄｉｓｅａｓｅ）ウイルス、ＶＥＥウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス、ベネズエラ出血熱ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ベシクロウイルス、ビリュイスク（Ｖｉｌｙｕｉｓｋ）ウイルス、バイパーレトロウイルス、ウイルス性出血性敗血症ウイルス、ビスナ・マエディウイルス、ビスナウイルス、ハタネズミ痘（ｖｏｌｅｐｏｘ）ウイルス、ＶＳＶ（水疱性口内炎ウイルス）、ウォーラル（Ｗａｌｌａｌ）ウイルス、ウォリゴ（Ｗａｒｒｅｇｏ）ウイルス、いぼウイルス、ＷＥＥウイルス、西ナイルウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳脊髄炎ウイルス、ワタロア（Ｗｈａｔａｒｏａ）ウイルス、冬季嘔吐ウイルス、ウッドチャックＢ型肝炎ウイルス、ウーリーサル肉腫ウイルス、創傷腫瘍ウイルス、ＷＲＳＶウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス、ヤバウイルス、ヤタポックスウイルス、黄熱ウイルスまたはユグ・ボグダノヴァツ（ＹｕｇＢｏｇｄａｎｏｖａｃ）ウイルス。

細菌抗原は、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｕｒａｎｔｉｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｉｓｒａｅｌｉｉ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、Ａｎａｐｌａｓｍａｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｍｅｌａｍｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｍｅｌａｍｉｎｏｇｅｎｉｃａ）、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａｈｅｎｓｅｌａｅ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａｑｕｉｎｔａｎａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａａｂｏｒｔｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａｓｕｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅｐａｃｉａ、Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｃｏｌｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｆｅｔｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａｐｓｉｔｔａｃｉ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｐｓｉｔｔａｃｉ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（以前にはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｗｅｌｃｈｉｉと呼ばれた）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｅｔａｎｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｕｓｉｆｏｒｍｅ、Ｃｏｘｉｅｌｌａｂｕｒｎｅｔｉｉ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌｏａｃａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓａｖｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｄｕｒａｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｇａｌｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｍａｌｏｒａｔｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｄｕｃｒｅｙｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｘｔｒｏｑｕｅｎｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｈｌｅｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｏｍｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｐｅｎｅｔｒａｎｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｐｎｅｕｍｏｎｉａ、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓＢｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｐｓｉｔｔａｃｉ、ＲｉｃｋｅｔｔｓｉａＱｕｉｎｔａｎａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｔｒａｃｈｏｍａｓ、Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａｈｅｎｓｅｌａｅ、Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａｑｕｉｎｔａｎａ、Ｒｏｔｈｉａｄｅｎｔｏｃａｒｉｏｓａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｖｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｃｒｉｃｅｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｆａｃｅｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｆｅｒｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｉｔｉｏｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｏｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｒａｔｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓａｎｇｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｏｂｒｉｎｕｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａ、Ｖｉｂｒｉｏｃｏｍｍａ、Ｖｉｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、ＹｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓまたはＹｅｒｓｉｎｉａｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓなどの細菌由来である。

真菌抗原は、Ａｂｓｉｄｉａｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ、Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａｂｅｎｈａｍｉａｅ、Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａｆｕｌｖｕｍ、Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａｇｙｐｓｅｕｍ、Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａｉｎｃｕｒｖａｔｕｍ、Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａｏｔａｅ、Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａｖａｎｂｒｅｕｓｅｇｈｅｍｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｅｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ、Ｃｌａｄｏｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａｃａｒｒｉｏｎｉｉ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓｉｍｍｉｔｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ種、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎｆｌｏｃｃｏｓｕｍ、Ｅｘｏｐｈｉａｌａｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｆｏｎｓｅｃａｅａｐｅｄｒｏｓｏｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｎｄｉｄｕｍ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｈｏｒｔａｅａｗｅｒｎｅｃｋｉｉ、Ｉｓｓａｔｓｃｈｅｎｋｉａｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｍａｄｕｒｅｌｌａｇｒｉｓａｅ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａｆｕｒｆｕｒ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａｇｌｏｂｏｓａ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａｏｂｔｕｓｅ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａｒｅｓｔｒｉｃｔａ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａｓｌｏｏｆｆｉａｅ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａｓｙｍｐｏｄｉａｌｉｓ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍｃａｎｉｓ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍｆｕｌｖｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍｇｙｐｓｅｕｍ、Ｍｕｃｏｒｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｎｅｃｔｒｉａｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓｖａｒｉｏｔｉｉ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｍａｒｎｅｆｆｅｉ、Ｐｉｃｈｉａａｎｏｍａｌａ、Ｐｉｃｈｉａｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓｃａｒｉｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａｂｏｙｄｉｉ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓｏｒｙｚａｅ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｒｕｂｒａ、Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍａｐｉｏｓｐｅｒｍｕｍ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍｃｏｍｍｕｎｅ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎｒｕｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎａｓａｈｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｃｕｔａｎｅｕｍ、ＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｉｎｋｉｎおよびＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｍｕｃｏｉｄｅｓなどの真菌由来である。

寄生生物抗原には、寄生生物アカントアメーバ、アフリカトリパノソーマ症、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｏｃｃｕｓｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓｍｕｌｔｉｌｏｃｕｌａｒｉｓ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｃｒｕｚｉ、Ａｓｃａｒｉｓｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ、Ａｎｇｉｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓｃａｎｔｏｎｅｎｓｉｓ、ａｎｉｓａｋｉｄｎｅｍａｔｏｄｅ、Ｂａｂｅｓｉａｍｉｃｒｏｔｉ、Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍｃｏｌｉ、Ｃｉｍｅｘｌｅｃｔｕｌａｒｉｕｓ、Ｂａｌａｍｕｔｈｉａｍａｎｄｒｉｌｌａｒｉｓ、Ｂａｙｌｉｓａｓｃａｒｉｓ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａｍａｎｓｏｎｉ、Ｓ．ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ、Ｓ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａｍａｓｏｎｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａｉｎｔｅｒｃａｌａｔｕｍ、Ｂ．ｈｏｍｉｎｉｓ、コロモジラミ、Ｃａｐｉｌｌａｒｉａｈｅｐａｔｉｃａ、Ｃａｐｉｌｌａｒｉａｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｎｓｉｓ、Ａｕｓｔｒｏｂｉｌｈａｒｚｉａｖａｒｉｇｌａｎｄｉｓ、Ｃｈｉｌｏｍａｓｔｉｘｍｅｓｎｉｌｉ、Ｅｎｄｏｌｉｍａｘｎａｎａ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａｃｏｌｉ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａｄｉｓｐａｒ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａｈａｒｔｍａｎｎｉ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａｐｏｌｅｃｋｉ、Ｉｏｄａｍｏｅｂａｂｕｅｔｓｃｈｌｉｉ、Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａｂｒａｚｉｌｅｎｓｅ、Ａ．ｃａｎｉｎｕｍ、Ａ．ｃｅｙｌａｎｉｃｕｍ、Ｕｎｃｉｎａｒｉａｓｔｅｎｏｃｅｐｈａｌａ、シラミ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ、Ｔａｅｎｉａ、Ｃｙｓｔｏｉｓｏｓｐｏｒａｂｅｌｌｉ、Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂａｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍｌａｔｕｍ、Ｄｉｐｙｌｉｄｉｕｍｃａｎｉｎｕｍ、Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓｍｅｄｉｎｅｎｓｉｓ、Ｇｉａｒｄｉａｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｂｒｕｇｉａｍａｌａｙｉ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｆａｓｃｉｏｌａｈｅｐａｔｉｃａ、Ｆａｓｃｉｏｌａｇｉｇａｎｔｉｃａ、Ｆａｓｃｉｏｌｏｐｓｉｓｂｕｓｋｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｇｉａｒｄｉａｌａｍｂｌｉａ、Ｇｉａｒｄｉａｄｕｏｄｅｎａｌｉｓ、Ｇｎａｔｈｏｓｔｏｍａｓｐｉｎｉｇｅｒｕｍ、Ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｅｓｈｅｔｅｒｏｐｈｙｅｓ、Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓｎａｎａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｐｒｏｍａｓｔｉｇｏｔｅｓ、Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓｈｕｍａｎｕｓｃａｐｉｔｉｓ、Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓｈｕｍａｎｕｓｃｏｒｐｏｒｉｓ、Ｐｔｈｉｒｕｓｐｕｂｉｓ、Ｌｏａｌｏａ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｏｖａｌｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｍａｌａｒｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｙｏｅｌｉｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｂｕｂａｌｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｊｕｘｔａｎｕｃｌｅａｒｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｃｉｒｃｕｍｆｌｅｘｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｒｅｌｉｃｔｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｒｅｌｉｃｔｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｖａｕｇｈａｎｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｍｉｎａｓｅｎｓｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍａｇａｍａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｄｏｍｉｎｉｃｕｍ、Ｂｒａｃｈｉｏｌａａｌｇｅｒａｅ、Ｂ．ｃｏｎｎｏｒｉ、Ｂ．ｖｅｓｉｃｕｌａｒｕｍ、Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎｃｕｎｉｃｕｌｉ、Ｅ．ｈｅｌｌｅｍ、Ｅ．ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、ＥｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎｂｉｅｎｅｕｓｉＭｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｃｅｙｌｏｎｅｎｓｉｓ、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｎｏｓｅｍａｏｃｕｌａｒｕｍ、Ｐｌｅｉｓｔｏｐｈｏｒａ種、Ｔｒａｃｈｉｐｌｅｉｓｔｏｐｈｏｒａｈｏｍｉｎｉｓ、Ｔ．ａｎｔｈｒｏｐｏｐｈｔｈｅｒａ、Ｖｉｔｔａｆｏｒｍａｃｏｒｎｅａｅ、Ｓａｒｃｏｐｔｅｓｓｃａｂｉｅｉｖａｒ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｄｅｒｍａｔｏｂｉａｈｏｍｉｎｉｓ、Ｎａｅｇｌｅｒｉａｆｏｗｌｅｒｉ、Ｔｏｘｏｃａｒａｃａｎｉｓ、Ｔｏｘｏｃａｒａｃａｔｉ、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａｖｏｌｖｕｌｕｓ、Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓｆｅｌｉｎｅｕｓ、Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓｗｅｓｔｅｒｍａｎｉ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓｊｉｒｏｖｅｃｉｉ、Ｓａｐｐｉｎｉａｄｉｐｌｏｉｄｅａ、Ｓａｐｐｉｎｉａｐｅｄａｔａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｂｒｕｃｅｉ、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓｔｒｉｃｈｉｕｒａ、Ａｓｃａｒｉｓｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ、Ａｎｃｌｏｓｔｏｍａｄｕｏｄｅｎａｌｅ、Ｎｅｃａｔｏｒａｍｅｒｉｃａｎｕｓ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓｆｉｉｌｌｅｂｏｒｎｉ、Ｃａｐｉｌｌａｒｉａｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｎｓｉｓ、Ｔａｅｎｉａｓａｇｉｎａｔａ、Ｔａｅｎｉａｓｏｌｉｕｍ、Ｔａｅｎｉａａｓｉａｔｉｃａ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉ、ＴｒｉｃｈｉｎｅｌｌａまたはＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓｖａｇｉｎａｌｉｓ由来の免疫原性タンパク質またはそれらの断片が含まれるがこれらに限定されない。

がん抗原は、個々の腫瘍に対して特異的な、タンパク質またはその断片である。例えば、同じ個体もしくは正常組織由来の対照試料または公知の標準的な対照値と比較して、腫瘍試料において過剰発現されるタンパク質は、腫瘍特異的抗原とみなされる。腫瘍特異的抗原をコードするＲＮＡは、腫瘍特異的抗原を産生するために細胞に投与され得る。腫瘍特異的抗原もしくはがん抗原またはそれらの断片は、例えば以下を含み得る：ＨＥＲ２、ＢＲＣＡ１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、前立腺血清抗原（ＰＳＡ）、扁平上皮癌抗原（ＳＣＣＡ）、卵巣がん抗原（ＯＣＡ）、膵臓がん関連抗原（ＰａＡ）、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ−３、ＭＵＣ−１８、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、多形性上皮ムチン（ＰＥＭ）、トムゼン−フリーデンライヒ（Ｔ）抗原、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＤＫ−４、ｂ−カテニン、ＭＵＭ−１、カスパーゼ−８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ７、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２、ＰＲＡＭＥ、ＢＡＧＥ−１、ＤＡＧＥ−１、ＲＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ１２５、変異型ｐ２１ｒａｓ、変異型ｐ５３、ＨＰＶ１６Ｅ７、ＲＣＣ−３．１．３、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−１１、ＧＡＧＥ−Ｉ、ＧＡＧＥ−６、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＴＦ、ｓＴｎ、ｇｐ７５、ＥＢＶ−ＬＭＰ１、ＥＢＶ−ＬＭＰ２、ＨＰＶ−Ｆ４、ＨＰＶ−Ｆ６、ＨＰＶ−Ｆ７、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＯ１７−１Ａ、ＧＡ７３３、ｇｐ７２、ｐ−ＨＣＧ、ｇｐ４３、ＨＳＰ−７０、ｐ１７ｍｅｌ、ＨＳＰ−７０、ｇｐ４３、ＨＭＷ、ＨＯＪ−１、ＨＯＭ−ＭＥＬ−５５、ＮＹ−ＣＯＬ−２、ＨＯＭ−ＨＤ−３９７、ＨＯＭ−ＲＣＣ−１．１４、ＨＯＭ−ＨＤ−２１、ＨＯＭ−ＮＳＣＬＣ−１１、ＨＯＭ−ＭＥＬ−２．４、ＨＯＭ−ＴＥＳ−１１、メラノーマガングリオシド、ＴＡＧ−７２、前立腺酸ホスファターゼ、タンパク質ＭＺ２−Ｅ、葉酸結合タンパク質ＬＫ２６、切断型上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＧＭ−２およびＧＤ−２ガングリオシド、多形性上皮ムチン、葉酸結合タンパク質ＬＫ２６、膵臓腫瘍胎児性抗原、がん抗原１５−３、がん抗原１９−９、がん抗原５４９、がん抗原１９５またはそれらの断片から選択される抗原。

本発明のＲＮＡは、アルツハイマー病抗原またはその断片もまたコードし得る。アルツハイマー病抗原は、アルツハイマー病を有する被験体において選択的に発現される抗原である。アルツハイマー病を有する被験体において選択的に発現される抗原は、アルツハイマー病を有する被験体において発現されるが、アルツハイマー病を有さない被験体においては発現されないまたはより低いレベルまで発現される、抗原である。代替的に、これは、アルツハイマー病を有さない被験体と比較して、アルツハイマー病を有する被験体において過剰発現される抗原である。アルツハイマー病抗原は、例えば、Ａ６８、Ａβ４０、Ａβ４２またはそれらの断片であり得る。

送達ビヒクルまたはトランスフェクション試薬、例えばリポソーム、ナノカプセル、マイクロ粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などが、細胞および生物中への本発明の核酸の導入のために使用され得る。特に、核酸は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェアまたはナノ粒子などのいずれか中にカプセル化されて、送達のために製剤化され得る。

トランスフェクション試薬には、カチオン性脂質、例えばリポフェクチン、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリカチオン性分子、例えばポリリシンが含まれるがこれらに限定されない。市販のトランスフェクション試薬の例には、例えば以下が含まれる：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥＱ２ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ；Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＴＡＰＬｉｐｏｓｏｍａｌＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＳＰＥＲＬｉｐｏｓｏｍａｌＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、またはＦｕｇｅｎｅ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰｒｏｍｅｇａＭａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商標）ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（ＰｒｏｍｅｇａＭａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）−２０Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰｒｏｍｅｇａＭａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）−５０Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰｒｏｍｅｇａＭａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）（ＯＺＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）、ＥｃｏＴｒａｎｓｆｅｃｔ（ＯＺＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）、ＴｒａｎｓＰａｓｓ^３ＤｌＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）、ＬｙｏＶｅｃ（商標）／ＬｉｐｏＧｅｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＰｅｒＦｅｃｔｉｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ２Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＣｙｔｏｆｅｃｔｉｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＢａｃｕｌｏＰＯＲＴＥＲＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＴｒｏｇａｎＰＯＲＴＥＲ（商標）ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＲｉｂｏＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）、ＰｌａｓＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）、ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ（Ｂ−ＢｒｉｄｇｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＳｕｒｅＦＥＣＴＯＲ（Ｂ−ＢｒｉｄｇｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）、またはＨｉＦｅｃｆ（商標）（Ｂ−ＢｒｉｄｇｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）または非カチオン性脂質ベースの担体（例えば、Ｔｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯＴＭ（商標）、ＭｉｎｉｓＢｉｏＬＬＣ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）。

かかる製剤は、本明細書に開示される核酸の薬学的に許容される製剤の導入のために好まれ得る。リポソームの形成および使用は、当業者に一般に公知である。最近、改善された血清安定性および循環半減時間を有するリポソームが開発された（米国特許第５，７４１，５１６号）。さらに、潜在的な薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様調製物の種々の方法が、記載されている（米国特許第５，５６７，４３４号；米国特許第５，５５２，１５７号；米国特許第５，５６５，２１３号；米国特許第５，７３８，８６８号および米国特許第５，７９５，５８７号）。

リポソームは、他の手順によるトランスフェクションに対しては通常抵抗性の、いくつかの細胞型で首尾よく使用されてきた。さらに、リポソームは、ウイルスベースの送達系に典型的なＤＮＡ長さ制限から解放されている。リポソームは、種々の培養細胞株および動物中に遺伝子、薬物、放射線療法剤、ウイルス、転写因子およびアロステリックエフェクターを導入するために効率的に使用されてきた。さらに、リポソーム媒介性の薬物送達の有効性を試験するいくつかの首尾よい臨床試験が企図されてきた。

リポソームは、水性媒体中に分散され、自発的に多重膜の同心円状の二重層小胞（多重膜小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を形成するリン脂質から形成される。ＭＬＶは一般に、２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、コア中に水性溶液を含有する、２００〜５００Åの範囲の直径を有する小型単層小胞（ＳＵＶ）の形成を生じる。

一部の実施形態では、核酸は、ナノ粒子またはマイクロ粒子を使用して、生物または被験体に送達され得る。用語ナノ粒子またはマイクロ粒子とは、本明細書で使用する場合、それぞれナノメートル以下またはマイクロメートル以下の平均粒径（即ち、直径）を有する粒子を指す。これらの用語は、中実および多孔性粒子、ならびに中空球体およびカプセル、ならびにハイブリッドおよび多相粒子を含む、全ての形態の粒子を含む。例えば、これらの粒子は、架橋され得るか、または脂質の層もしくは二重層によって別の方法で取り囲まれ得る、ポリマー性シェル（ナノカプセル）、ポリマーマトリックス（ナノスフェア）またはブロックコポリマーを含み得る。

本発明の核酸は、粒子中に取り込まれ得る、粒子上に分散され得る、粒子と結合体化され得る、または他の方法で粒子に付着され得る。

多数のポリマーが、ポリアミノ酸、ポリサッカライド、例えばデキストリンまたはデキストラン、および合成ポリマー、例えばＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）コポリマーを含むポリマー−薬剤結合体の合成のために提案されてきた。調製の適切な方法は、例えば、Ｖｅｒｏｎｅｓｅら（１９９９年）ＩＬＦａｒｍａｃｏ５４巻：４９７〜５１６頁中に、当技術分野で記載されている。他の適切なポリマーは、医薬品の分野で公知の任意のものであり得、これには、天然に存在するポリマー、例えばヒドロキシエチルデンプン、タンパク質、糖ペプチドおよび脂質が含まれるがこれらに限定されない。合成ポリマーは、直鎖または分枝鎖の、置換または非置換の、ホモポリマー性の、２種以上の異なる合成モノマーのコポリマーまたはブロックコポリマーであってもよい。

ナノカプセルは一般に、安定かつ再現性のある方法で、物質を封入し得る。細胞内のポリマー過負荷に起因する副作用を回避するために、かかる超微細粒子（約０．１μｍのサイズ）が、ｉｎｖｉｖｏで分解されることが可能なポリマーを使用して設計され得る。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子が、使用のために企図される。

以下の実施例は、本発明の実施の具体例を例示するために提供されているのであって、本発明の範囲を限定することは意図しない。当業者に明らかなように、本発明は、種々の組成物および方法において適用を見出す。

材料および方法：
発現プラスミド構築
ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現構築物を生成するために、ＣＭＶプロモーターおよびｃＧＦＰオープンリーディングフレームを、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のマルチクローニング部位中にクローニングして、以前に記載されたプラスミドを改変した（Ｇｕｔｓｃｈｎｅｒら、２０１１年）。ｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＦ１７７３８０のｎｔ６５８１〜６７５４）を、（ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’センスを生成するために）センス方向で、または（ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’アンチセンスを生成するために）アンチセンス方向で、ＮｏｔＩクローニング部位中に、ｃＧＦＰの下流に挿入した。このＮｏｔＩクローニング部位を同様に使用して、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ｂＧＨポリアデニル化シグナル、ｍＭＥＮβ＿３’領域、および全ての変異体ｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域で終わるＣＭＶ−ｃＧＦＰ発現プラスミドを生成した。ＣＭＶ−ＳｐｅｃｋｌｅＦ２−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミドを生成するために、マウスＭＡＬＡＴ１のｎｔ１６７６〜３５９８を、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’センスプラスミドのＥｃｏＲＶおよびＢｓｔＥＩＩクローニング部位中に挿入した。全てのプラスミドについての挿入物の配列を表１に提供する（上から下に配列番号１〜６１）。

トランスフェクションおよびＲＮＡ分析
ＨｅＬａ細胞を、ペニシリン−ストレプトマイシンおよび１０％胎仔ウシ血清を補充した高グルコース含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、３７℃、５％ＣＯ_２で増殖させた。ＣＭＶ−ｃＧＦＰ発現プラスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してトランスフェクトし、総ＲＮＡを、製造業者の指示に従ってＴｒｉｚｏｌ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して単離した。ノザンブロットを、以前に記載されたように実施した（Ｗｉｌｕｓｚら、２００８年）。ＲＮａｓｅＨ処理のために、９μｇの総ＲＮＡを、２０ｐｍｏｌのアンチセンスオリゴと最初に混合し、６５℃で１０分間加熱した。アンチセンスオリゴを緩徐な冷却によってアニーリングさせた後に、ＲＮＡを、ＲＮａｓｅＨ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）で３７℃で３０分間処理し、次いでノザンブロット分析に供した。核および細胞質分画を、以前に記載されたように実施した（Ｗｉｌｕｓｚら、２００８年）。全てのオリゴヌクレオチドプローブ配列を表２に提供する（上から下に配列番号６２〜６９）。ｍｉｃｒｏＲＮＡＣｌｏｎｉｎｇＬｉｎｋｅｒ３（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用する３’ＲＡＣＥＰＣＲを、以前に記載されたように実施した（Ｗｉｌｕｓｚら、２００８年）。

タンパク質分析
ウエスタンブロットを、製造業者の指示に従ってＮｕ−ＰＡＧＥＢｉｓ−ＴｒｉｓＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施した。ｃＧＦＰ抗体はＧｅｎＳｃｒｉｐｔから取得し、ビンキュリン抗体はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから取得した。

２色蛍光レポーター系
２色蛍光レポーターベクターは以前に記載されており（Ｍｕｋｈｅｒｊｉら、２０１１年）、ｍＣｈｅｒｒｙの３’ＵＴＲ中にＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含有する。このポリアデニル化シグナルをｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域で置き換えるために、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルに隣接するＥｃｏＲＶおよびＡａｔＩＩクローニング部位を使用した。ｌｅｔ−７のための標的部位を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩクローニング部位を使用してｍＣｈｅｒｒｙの３’ＵＴＲ中に挿入した。配列を表１に提供する。ＨｅＬａ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用した当量（２５０ｎｇ）のレポータープラスミドおよびｒｔＴＡのトランスフェクションの前に２０時間にわたって、１２ウェルプレートの１ウェル当たり１７５，０００細胞で播種した。トランスフェクションの時点で、培地を、２μｇ／ｍＬドキシサイクリン（Ｓｉｇｍａ）を補充した完全ＤＭＥＭに交換した。示される場合、対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＥＮＯＭＥＮｏｎ−ＴａｒｇｅｔｉｎｇｓｉＲＮＡ＃２、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）またはマウスｌｅｔ−７ｇのｓｉＲＮＡ等価物（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を、４０ｎＭの最終濃度で共トランスフェクトした。フローサイトメトリーまたはＲＮＡ単離を、トランスフェクションの１８〜２０時間後に実施した。フローサイトメトリー、ＱＰＣＲおよび生データ処理を、以前に記載されたように実施した（Ｍｕｋｈｅｒｊｉら、２０１１年）が、これらは本明細書中にさらに記載される。

構造モデル予測
ｄｅｎｏｖｏＲＮＡフォールディングを、ＲｏｓｅｔｔａＶｅｒｓｉｏｎ３．４（ｒｏｓｅｔｔａｃｏｍｍｏｎｓ．ｏｒｇ）を使用して実施した（ＤａｓおよびＢａｋｅｒ２００７年；Ｄａｓら、２０１０年）。ＭＡＬＡＴ１Ｃｏｍｐ．１４転写物の３’末端に関する収束モデルのために、最初の５ヌクレオチド（ＡＡＧＧＧ）を除去した。疑わしいらせん相互作用を規定し（９つ全てのＵ−Ａ・Ｕ三重塩基を規定した）、２，０００個のモデルを計算した。このモデルは、３〜４Åの間に収束した（図１４Ｃを参照のこと）。全長（５９ｎｔ）Ｃｏｍｐ．１４３’末端を同じ手順に供したが、収束は、５’末端の高い柔軟性に起因して達成できなかった。

フローサイトメトリー、ＱＰＣＲおよびデータ処理
フローサイトメトリーおよび生データ処理を、以前に記載されたように実施した（Ｍｕｋｈｅｒｊｉら、２０１１年）。簡潔に述べると、約１００，０００細胞を、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを使用してＬＳＲＩＩ分析器（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）にかけた。ＦｌｏｗＪｏを使用して、生存単細胞集団を、前方散乱プロファイルおよび側方散乱プロファイルに従ってゲートした。背景蛍光について制御するために、トランスフェクトしていない細胞の平均自己蛍光＋標準偏差×２を、トランスフェクトした試料由来の各細胞についてのｅＹＦＰ値およびｍＣｈｅｒｒｙ値から差し引いた。背景から識別不能な細胞（背景差し引き後に０未満の蛍光値）を、さらなる分析から排除した。背景差し引きおよび下流の分析を、カスタムＭＡＴＬＡＢスクリプト（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ）を使用して実施した。

総ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌを使用して単離し、ＴＵＲＢＯＤＮＡ−フリーキット（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理し、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してランダムヘキサマーで逆転写した。得られたｃＤＮＡに対するＱＰＣＲ反応を、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００Ｒｅａｌ−ＴｉｍｅＰＣＲ機器で行って、ＰｏｗｅｒＳＹＢＲＧｒｅｅｎ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、三連で実施した。ＱＰＣＲプライマー配列（配列番号１６９〜配列番号１７１）：ｅＹＦＰフォワード（５’−ＣＣＡＣＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣ）、ｅＹＦＰリバース（５’−ＧＧＴＡＧＣＧＧＧＣＧＡＡＧＣＡＣＴ）、ｍＣｈｅｒｒｙフォワード（５’−ＧＡＡＣＧＧＣＣＡＣＧＡＧＴＴＣＧＡＧＡ）およびｍＣｈｅｒｒｙリバース（５’−ＣＴＴＧＧＡＧＣＣＧＴＡＣＡＴＧＡＡＣＴＧＡＧＧ）。

（実施例１）
ＭＡＬＡＴ１３’末端プロセシングを正確に再現する発現プラスミドの生成
ＭＡＬＡＴ１が切断されてｍａｓｃＲＮＡを生成することは明らかであるが（Ｗｉｌｕｓｚら、２００８年）、ｉｎｖｉｖｏでこのプロセシング事象を再現するプラスミド発現系は、報告されていない。ＣＭＶプロモーターの下流にサンゴ緑色蛍光タンパク質（ｃＧＦＰ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を挿入し、その後にマウスＭＡＬＡＴ１遺伝子座の３’末端の１７４ｎｔ断片（ｍＭＡＬＡＴ１のｎｔ６５８１〜６７５４）を挿入することによって、かかるプラスミドを生成することが可能であった（図１Ｄ）。ｍＭＡＬＡＴ１＿３’と称されるこの領域は、ヒトからゼブラフィッシュまで進化的に高度に保存されており（図１Ｂ）、よく保存されているＵリッチモチーフおよびＡリッチモチーフ、ＲＮａｓｅＰ切断部位（ｎｔ６６９０の後ろ）、ならびにｍａｓｃＲＮＡ（ｎｔ６６９１〜６７４８）を含む。対照として、アンチセンス方向でｃＧＦＰの下流にクローニングされたｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域を有するプラスミドを生成して、ｍａｓｃＲＮＡ発現がＣＭＶ駆動性転写物からのプロセシングに依存することを検証した。

ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’のセンスおよびアンチセンスプラスミドを、ヒトＨｅＬａ細胞中に一過的にトランスフェクトし、総ＲＮＡを２４時間後に単離した。この系がＭＡＬＡＴ１３’末端プロセシングを正確に再現するためには、２つの転写物を生成する必要がある：約８５０ｎｔのｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡ、ならびにＲＮａｓｅＰおよびＺならびにＣＣＡ付加酵素によってプロセシングされた成熟（６１ｎｔ）マウスｍａｓｃＲＮＡ（図１Ｄ）。マウスｍａｓｃＲＮＡとヒトｍａｓｃＲＮＡとの間には、４つの配列変化が存在し（Ｗｉｌｕｓｚら、２００８年）、これにより、ノザンブロット分析によってホモログ間を識別するオリゴプローブ（図１Ｅ中で「マウスｍａｓｃＲＮＡのみ」と称されるプローブ）またはマウスおよびヒトの両方のｍａｓｃＲＮＡを検出するオリゴプローブ（図１Ｅ中で「全ｍａｓｃＲＮＡ」と称されるプローブ）のいずれかを設計することが可能である。センス発現プラスミドでトランスフェクトしたがアンチセンス発現プラスミドではトランスフェクトしていない細胞中で、成熟ｍａｓｃＲＮＡが生成され、モック処理細胞において観察されるレベルよりも約１６倍多く発現された（図１Ｅ）。３’ＲＡＣＥＰＣＲを使用して、プラスミドから生成されたｍａｓｃＲＮＡが適切にプロセシングされ、転写後にその３’末端に付加されたＣＣＡを有することを確認した（データ示さず）。並行して、このプラスミドを使用して発現された変異体ｍａｓｃＲＮＡ転写物を、ＣＣＡＣＣＡ付加に供したところ、ｉｎｖｉｖｏで迅速に分解され（図８）、ＣＣＡ付加酵素がｔＲＮＡの品質制御において重要な役割を果たすという以前の知見を確認した（Ｗｉｌｕｓｚら、２０１１年）。これらの結果は、このプラスミドが真正のｍａｓｃＲＮＡを生成することを示している。

センスプラスミドが、ｉｎｖｉｖｏでその３’末端においてＲＮａｓｅＰによって適切にプロセシングされた安定なｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡを発現するかどうかを決定するために、トランスフェクションからの総ＲＮＡを、ｃＧＦＰＯＲＦの３’末端の近傍に対して相補的なオリゴと最初にハイブリダイズさせ、ＲＮａｓｅＨ消化に供した。より小さいサイズへの転写物の切断は、高分解能を有するノザンブロットが、ＲＮａｓｅＰ切断の精度を検証するために実施されるのを可能にした。予測されたサイズ（１９０ｎｔ）の単一バンドがセンスプラスミドで観察されたが、アンチセンスプラスミドでは観察されなかった（図１Ｅ）。これらの結果は、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’センス一次転写物が、ＲＮａｓｅＰによって効率的に切断されて、予測された成熟転写物を生成すること（図１Ｄ）、および従ってｉｎｖｉｖｏでのＭＡＬＡＴ１の３’末端プロセシングを正確に再現することを示している。アンチセンスプラスミドは、転写物が機能的ポリアデニル化シグナルを含まなかったために、核の監視経路によって転写物が迅速に分解されるようになり、安定なｃＧＦＰｍＲＮＡを生成できなかった可能性が高い。

ｍａｓｃＲＮＡは、ＣＭＶプロモーター駆動性転写物から効率的に生成されるので（図１Ｅ）、ＭＡＬＡＴ１プロモーターは、新生ＲＮＡへのＲＮａｓｅＰまたは任意の他のｔＲＮＡプロセシング因子の動員に必要とされないことが見出された。さらに、ｉｎｖｉｖｏでのｍａｓｃＲＮＡ生成に必要とされるＭＡＬＡＴ１一次転写物の唯一の領域は、ｔＲＮＡ様構造自体であることが見出された（図９）。ＲＮａｓｅＰによる基質認識の現在のモデル（Ｋｉｒｓｅｂｏｍ２００７年）と一致して、この酵素は、転写物を生成するために使用されるプロモーターとは無関係に、任意のｔＲＮＡ様構造をおそらく認識および切断する。実際、本発明者らの発現系においてｃＧＦＰの下流にＭＥＮβのｔＲＮＡ様構造を置くことで、効率的なＲＮａｓｅＰ切断が同様に生じた（図１０）。

（実施例２）
保存されたＵリッチモチーフは、ＭＡＬＡＴ１の３’末端を分解から保護する。

ＭＡＬＡＴ１ＲＮａｓｅＰ切断部位の直ぐ上流に存在する高度に保存されたＵリッチモチーフおよびＡリッチモチーフは、ｍａｓｃＲＮＡ生合成に必要とされなかったので（図１Ｂおよび図９）、その代り、これらは、ＭＡＬＡＴ１の核外輸送を防止するようにおよび／またはＲＮａｓｅＰ切断後に長い非コードＲＮＡを安定化するように機能し得ると仮説を立てた。トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞から核および細胞質の総ＲＮＡを分離するために生化学的分画を使用して、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’レポーターＲＮＡが、細胞質に効率的に輸送されたことが見出された（図２Ｂ）。実際、この転写物は、正準のポリＡテイルで終わるｃＧＦＰ転写物として効率的に輸送された（図２Ａ、Ｂ）。従って、ＭＡＬＡＴ１の３’末端は、核保持においては機能しない。その代り、発現構築物中に挿入された場合（ＣＭＶ−ＳｐｅｃｋｌｅＦ２−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’プラスミドを生成するため、図２Ａ）に核保持を引き起こすのに十分な領域が、マウスＭＡＬＡＴ１の本体（ｎｔ１６７６〜３５９８）内で同定された（図２Ｃ）。これは、この領域が核スペックルへの内因性ＭＡＬＡＴ１の標的化に重要であるということを示した以前の報告と一致している（Ｔｒｉｐａｔｈｉら、２０１０年；Ｍｉｙａｇａｗａら、２０１２年）。

その代りに、ＭＡＬＡＴ１ＲＮＡ安定性における高度に保存されたＵリッチモチーフについての可能性のある役割を調査するために、Ｕリッチモチーフ１、Ｕリッチモチーフ２または両方のモチーフ中に５ｎｔの変異を含有するｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミドを生成し、トランスフェクトした（図２Ｄ）。これらの変異は、ＲＮａｓｅＰ切断に対してもｍａｓｃＲＮＡ生合成に対しても影響を有さなかったが（図２Ｅ、下）、成熟ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡを効率的に分解させた（図２Ｅ、上）。核保持されるレポーター転写物中に類似の変異を導入することもまた、ＲＮＡをノザンブロット分析によっては検出不能にし（ｌ図１１Ｂ）、これは、Ｕリッチモチーフ１および２が共に、核および細胞質においてＭＡＬＡＴ１の３’末端を安定化させるために必要とされることを示している。

ライゲーションベースの３’ＲＡＣＥＰＣＲアプローチを使用して、変異体転写物が分解される機構についての洞察を得た。その３’末端から単純に分解された転写物を種々の程度まで検出することに加えて、転写後に付加された短いＵリッチテイルで終わる多数のｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物（５６個の配列決定したＲＡＣＥクローンのうち１０個）が驚くべきことに検出され、これは、野生型および変異体の両方のＭＡＬＡＴ１３’末端の分解におけるウリジル化を暗示する（図２Ｆ）。いくつかの分解パターンが観察された：（１）ウリジル化前の、ＭＡＬＡＴ１３’末端の鋳型なしのアデニル化（例えばＭｕｔＵ１ＲＡＣＥ＃１）、（２）全長転写物へのＵリッチテイルの付加（例えばＭｕｔＵ２ＲＡＣＥ＃１）、および（３）ウリジル化前の３’末端の部分的分解（例えばＷＴＲＡＣＥ＃１）（図２Ｆ）。この最後のパターンは、ＭＡＬＡＴ１３’末端を分解していたときに３’−５’エキソヌクレアーゼが立ち往生したことを示唆するので、特に興味深い。次いで、Ｕテイルは、崩壊プロセスを認識および再開するためにエキソヌクレアーゼのための新たな一本鎖テイルを提供するために付加された可能性が高い（Ｈｏｕｓｅｌｅｙら、２００６年）。ウリジル化された崩壊中間体は、核保持されるレポーター転写物を使用して検出され（図１１Ｃ）、これは、ウリジル化が核および細胞質の両方において発生する可能性が高いことを示している。これらの結果は、Ｕリッチモチーフ１および２が、ウリジル化および３’−５’エキソヌクレアーゼによる分解を防止することによって、ＭＡＬＡＴ１の３’末端を安定化するために重要である可能性を示す。

（実施例３）
三重らせんは、ＭＡＬＡＴ１およびＭＥＮβの３’末端において形成する。

Ｕリッチモチーフ１および２を、ＭＡＬＡＴ１３’末端安定性に重要であると同定し、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物の３’末端を安定化するために必要とされる最小の配列エレメントを調査した。大規模な変異誘発を使用して、ＭＡＬＡＴ１の３’末端における１１０ｎｔのうち５１ｎｔ（Ｃｏｍｐ．１４、図２Ｄ）が、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡ安定性に対してほとんどまたは全く影響なしに除去され得ることが見出された（図２Ｇおよび図１２）。ＭＡＬＡＴ１（図１Ｂ）およびＭＥＮβ（図１Ｃ）の進化的保存パターンと一致して、十分保存されたＡリッチモチーフおよびＵリッチモチーフ、ならびに保存されたステムループの下半分が、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’安定性に必要とされる（図２Ｄおよび図３Ａ）。対照的に、Ｕリッチモチーフ２とＡリッチトラクトとの間の配列などのより多様な領域は、ＭＡＬＡＴ１の３’末端を安定化する際に、なくても済むまたは小さい支持的役割のみを有する（図１２）。

Ｍｆｏｌｄを使用した最小機能的ＭＡＬＡＴ１３’末端の二次構造予測は、ＡリッチトラクトがＵリッチモチーフ２と塩基対合するはずであることを示した（図３Ａ）。これらの潜在的塩基対は、進化を通じて完全に保存されているので（図１Ｂ、Ｃ）、特定の塩基対が破壊されたｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミドを生成した（図３Ｂおよび図１８）。図３Ｃおよび３Ｄに示されるように、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡは、２つのミスマッチがＵリッチモチーフ２またはＡリッチトラクトのいずれか中に導入された場合、蓄積しなかった。塩基対合が両方のモチーフにおける変異の導入によって再確立された場合、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡのレベルにおける顕著なレスキューが検出された（図３Ｃ、Ｄ）。これは、Ｕリッチモチーフ２とＡリッチトラクトとの間の塩基対合が、ＭＡＬＡＴ１の３’末端を安定化するために重要であることを示す。興味深いことに、Ａリッチトラクト中のＧＣがＡＡに変異されたことに起因して短いホモポリマー性ポリＡテイルで終わるｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’もまた、ｉｎｖｉｖｏで分解され（データ示さず）、これは、短いポリＡテイルがＭＡＬＡＴ１の３’末端において塩基対合を機能的に置き換えることができないことを示している。予測されるように、６塩基対を破壊した場合、変異型ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物はｉｎｖｉｖｏで蓄積できなかった（図３Ｅ）。しかし、予想外に、これらの６塩基対を再確立する補償的変異の導入は、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物レベルをレスキューすることができず（図３Ｅ）、これは、Ｕリッチモチーフ２とＡリッチトラクトとの間の塩基対合が、ＭＡＬＡＴ１安定性に必要ではあるが十分ではないことを示している。

Ｕリッチモチーフ１もまたＭＡＬＡＴ１３’末端安定性に必要とされ（図２Ｅ）、高度に保存されており（図１Ｂ、Ｃ）、Ｕリッチモチーフ２およびＡリッチトラクトとごく接近して存在すると予測されるので（図３Ａ）、本発明者らは、Ｕリッチモチーフ１もまた、例えば三重らせん中の二重鎖とも相互作用し得ると考えた（図４Ａ）。１９５７年のＦｅｌｓｅｎｆｅｌｄ、ＤａｖｉｅｓおよびＲｉｃｈによる先駆的研究が、ポリ（Ｕ）の第３の鎖がポリＡ／ポリ（Ｕ）のワトソン−クリック塩基対合したらせんの主溝に対するフーグスティーン水素結合を形成する、Ｕ−Ａ・Ｕ三重らせん構造を最初に記載した（Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄら、１９５７年）（図４Ｂ）。天然に存在するＵ−Ａ・ＵＲＮＡ三重らせん構造は、テロメラーゼＲＮＡ中で（ＱｉａｏおよびＣｅｃｈ２００８年）、ならびにカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスおよび関連のガンマヘルペスウイルスによって生成される非コードＲＮＡの３’末端において（Ｍｉｔｔｏｎ−Ｆｒｙら、２０１０年；Ｔｙｃｏｗｓｋｉら、２０１２年）、最近同定された。後者の場合、この構造は、ＲＮＡの安定化のために重要である。Ｃ−Ｇ・Ｃ三重らせんは、Ｕ−Ａ・Ｕと構造的に類似しているが、第３の鎖中のシトシンのプロトン化が、この構造を完全に安定化するために必要とされ、Ｃ−Ｇ・Ｃ三重鎖を酸性条件下で好ましいものにする（図４Ｂ）。重要なことに、ＭＡＬＡＴ１およびＭＥＮβの３’末端では、ＵリッチモチーフおよびＡリッチモチーフは、Ｕリッチモチーフ２およびＡリッチトラクトによって形成されるワトソン−クリック塩基対合したらせんの主溝に対するＵリッチモチーフ１のフーグスティーン水素結合によって、分子内三重らせん構造が形成するのを可能にするように、適切に配向される（図４Ａ）。

ＭＡＬＡＴ１の３’末端が三重らせんを形成する能力を評価するために、ＦＡＲＦＡＲとして公知の完全な原子精密化を用いたＲＮＡの断片アセンブリを使用した（Ｄａｓら、２０１０年）。このＲｏｓｅｔｔａベースのアルゴリズムは、原子分解能近くまで、低エネルギーの三次ＲＮＡ構造をｄｅｎｏｖｏで予測する（ＤａｓおよびＢａｋｅｒ２００７年）。図４Ｃに示されるように、５９ｎｔのＣｏｍｐ．１４ｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域は、連続的なワトソン−クリック塩基対合したらせんの各末端においてループを有するバーベル様構造へと折り畳まることができると予測され、その一部は、主溝におけるＵリッチモチーフ１の結合を有する三重らせん構造をさらに形成する。９つのＵ−Ａ・Ｕ三重塩基が、Ａリッチトラクト中のＡヌクレオチドのフーグスティーン面と、Ｕリッチモチーフ１のＵヌクレオチドのワトソン−クリック面との間の塩基対合によって形成可能である（図４Ｃ、Ｄおよび図１４）。Ｃ−Ｇ・Ｃ三重が形成するかどうかは、モデル化からは不明である。ＦＡＲＦＡＲは、フーグスティーン塩基におけるプロトン化シチジン残基のモデル化を可能にしないが（図４Ｄ）、他の立体上の制約が、このＣ−Ｇ・Ｃ三重の形成を防止し得る。この予測された構造は、鎖の破断を欠き、合理的な立体化学を有しており、これは、三重らせんの形成を遮断する構造的制約が存在しないことを示している。申し分なく、ＭＡＬＡＴ１３’末端安定性にとって重要でなく、従ってＣｏｍｐ．１４転写物から欠失されたヌクレオチド（図２Ｄ）は、コア三重らせんから物理的に分離された、バーベル様構造の末端におけるループ領域中にあると全て予測された（図４Ａ、Ｃ）。さらに、構造モデルは、ＭＡＬＡＴ１の３’末端ヌクレオチドが、コア三重らせんの一部であること、および従って、鋳型なしのヌクレオチドの付加またはエキソヌクレアーゼのいずれかから良好に保護されることを示している。かなりの自由エネルギーが、この三重らせんをほぐすために必要である可能性が高い。このモデルと一致して、３’ＲＡＣＥにより、３’−５’エキソヌクレアーゼがこの構造内で休止する場合が多いことが明らかになった（図２Ｆ）。

この構造モデルは、三重らせん構造が形成し得ることを予測するが、三重らせんがｉｎｖｉｖｏで形成することは判明していない。それにもかかわらず、いくつかの独立した系列の証拠が、ｉｎｖｉｖｏでの三重らせんの存在および機能的重要性を支持する。第１に、全ての三重塩基は、ＭＡＬＡＴ１（図１Ｂ）およびＭＥＮβ（図１Ｃ）の両方の３’末端において、進化を通じてほぼ完全に保存されている。第２に、図３中の変異分析により、Ｕリッチモチーフ２とＡリッチトラクトとの間の塩基対合が、ＭＡＬＡＴ１の３’末端を安定化するために必要であるが十分ではないことが明らかになった。Ｕリッチモチーフ２とＡリッチトラクトとの間の塩基対合のうち６つを形成するヌクレオチドがらせんを横断して交換されたＭｕｔＵ２／Ａ−ＣＧＡＡＡＡ転写物（図３Ｂ、Ｅ）が、特に興味深い。これらのヌクレオチド交換は、二重らせんの構造的完全性を変更しないはずであるが、三重塩基を形成する潜在性を排除するはずであり、これが、ＭＡＬＡＴ１の安定化におけるこの構造の間接的支持を提供する。第３に、ｉｎｖｉｖｏで三重らせんの存在について直接試験するために、本発明者らは、ＭＡＬＡＴ１の３’末端におけるＵ−Ａ・Ｕ三重塩基のうち４つ（図４Ａにおいて紫色で示される）をＣ−Ｇ・Ｃ三重塩基に変換することの影響を調査した（図４Ｅ）。４つの連続するＡヌクレオチドをＧに変異させると（レーン４、図４Ｅ）、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物は不安定になり、ｉｎｖｉｖｏで翻訳されなくなる（翻訳についてのさらなる情報については以下を参照のこと）。Ｃ−Ｇ塩基対を有する二重らせんを形成することが可能なだけの転写物（レーン５）と比較して、Ｃ−Ｇ・Ｃ三重塩基が形成できた場合、有意により高いタンパク質発現が観察された（レーン６、図４Ｅ）。これは、機能的三重らせんがｉｎｖｉｖｏで形成することの強い証拠である。

次いで、三重らせん構造全体がＭＡＬＡＴ１の３’末端をｉｎｖｉｖｏで安定化するために必要であるかどうかを調査するために、選択された三重塩基がＵリッチモチーフ１を変異させることによって破壊された、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’発現プラスミドを生成した（図４Ｆ）。興味深いことに、Ｕリッチモチーフ１の中央部にある変異（ＭｕｔＵ１．１およびＭｕｔＵ１．２）は、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物レベルに対して影響を有さなかったことが見出された（図４Ｆ）。この結果は、この中央領域中でのＵリッチモチーフ２とＡリッチトラクトとの間の塩基対合が、ＲＮＡ安定性のために必要であるが、二重らせんのいずれかの側のヌクレオチドの正体（および従って三重塩基を形成するまたは形成しない能力）は重要でないという、図３Ｃおよび３Ｄからのデータと一致する。対照的に、三重らせんの両方の末端の三重塩基は、ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’が安定であるのに重要である（ＭｕｔＵ１．３〜ＭｕｔＵ１．５、図４Ｆ）。これらの結果は、ＭＡＬＡＴ１三重らせんの各末端におけるＵ−Ａ・Ｕ三重塩基が、全体的構造の構造的安定性を確実にし、３’−５’エキソヌクレアーゼによる転写物分解を防止するというモデルを支持する。

（実施例４）
三重らせん構造は、翻訳エンハンサーエレメントとしても機能する。

ｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’レポーターｍＲＮＡは、安定でありかつ細胞質に効率的に輸送されるので（図２Ｂ）、ｃＧＦＰオープンリーディングフレームが翻訳されるかどうかを調査した。驚くべきことに、類似のレベルのタンパク質発現が、ポリＡテイルで終わるものと比較して、ｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域で終わるｃＧＦＰ転写物から観察された（図５Ａ）。これは、ＭＡＬＡＴ１の３’末端が、翻訳を促進するようにも機能し得ることを示している。ＭＥＮβの３’末端は、顕著なｃＧＦＰタンパク質発現を同様に支持した（図１０Ｃ）。これらの結果は、内因性のＭＡＬＡＴ１およびＭＥＮβが、核保持された転写物であり、従って、翻訳機械と相互作用しないと考えられることを考慮すると、特に驚くべきことである。

ＭＡＬＡＴ１３’末端で終わる転写物から得られた翻訳アウトプット対ポリＡテイルで終わる転写物から得られた翻訳アウトプットをより良く定量するために、２色蛍光レポーター系を使用して、単一の哺乳動物細胞における遺伝子発現の測定を可能にした（Ｍｕｋｈｅｒｊｉら、２０１１年）。この構築物は、核局在化配列でタグ化された蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙおよび強化黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）の発現を駆動する双方向性Ｔｅｔ誘導性プロモーターからなる（図５Ｂ）。ｍＣｈｅｒｒｙの３’ＵＴＲ中に、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルまたはｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域のいずれかを挿入した。対照的に、ｅＹＦＰの３’ＵＴＲは、通常ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルで終わり、双方向性プロモーターからの転写および翻訳活性の感受性レポーターであるので、ｅＹＦＰ発現が内部正規化対照として機能することを可能にする。単一細胞におけるタンパク質発現をモニタリングするためにフローサイトメトリーを使用して、両方の転写物が正準のポリＡテイルで終わる場合の得られたｍＣｈｅｒｒｙおよびｅＹＦＰタンパク質のレベルを比較した。各分析した細胞中で検出されたｅＹＦＰタンパク質に対するｍＣｈｅｒｒｙタンパク質の比率を計算することによって、蛍光タンパク質の発現が、予測されたように、高度に相関することが見出された（０．９１＋／−０．０５の比率）（図５Ｃおよび図１５Ａ）。この相関は、定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）によって細胞の集団にわたって測定した場合、転写物レベル上に反映された（図５Ｄ）。ｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域をｍＣｈｅｒｒｙの下流に挿入した場合に得られたｍＣｈｅｒｒｙおよびｅＹＦＰのタンパク質およびｍＲＮＡのレベルを、次に比較した。図５Ａ中のｃＧＦＰレポーターを用いた結果と一致して、ｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域は、強い翻訳を支持した（１．００＋／−０．０５のｍＣｈｅｒｒｙ／ｅＹＦＰタンパク質比率）（図５Ｃ、Ｄおよび図１５Ｂ）。ノザンブロットにより、ｍＣｈｅｒｒｙ転写物が、ＲＮａｓｅＰによって生成されるようなｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域で終わることが確認され、従って、観察された効率的な翻訳を潜在性ポリアデニル化シグナルが担うという可能性を排除する（図１５Ｅ）。次に、２色蛍光レポーター（図５Ｂ）を、マウス間葉系幹細胞中にトランスフェクトして、三重らせんがさらなる無関係の細胞型において翻訳を支持する能力を決定した。単一細胞におけるタンパク質発現をモニタリングするためにフローサイトメトリーを使用して、両方の転写物が正準のポリ（Ａ）テイルで終わる場合またはｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域がｍＣｈｅｒｒｙの下流に挿入された場合の得られたｍＣｈｅｒｙおよびｅＹＦＰタンパク質のレベルを比較した。両方の場合において、蛍光タンパク質の発現は、高度に相関していることが見出され（図１９）、これは、ＭＡＬＡＴ１三重らせんがＨｅＬａ細胞およびマウス間葉系幹細胞の両方において効率的な翻訳を促進することを示している。

効率的な翻訳に必要とされるｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域中の配列エレメントを決定するために、ＲＮＡ安定性（図２Ｇおよび図５Ｆ）および効率的な翻訳（図５Ｇ）に必要とされる最小エレメントを含有するｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’Ｃｏｍｐ．１４転写物を変異させて（図２Ｄ）、安定であるがあまり翻訳されない転写物が同定できるかどうかを試験した。コア三重らせん領域中に存在しないＭＡＬＡＴ１の３’末端における全てのヌクレオチドを変異させる（保存されたステムループ中の塩基対合は維持するが）ことによって（図５Ｅ中に示されるＣｏｍｐ．１５）、安定である（図５Ｆ）があまり翻訳されない（図５Ｇ）ｃＧＦＰ転写物が同定された。Ｃｏｍｐ．１５として示される転写物は、Ｃｏｍｐ．１４と同様に効率的に細胞質に輸送され、これは、翻訳効率におけるこの減少が、転写物の核保持の増加には起因しないことを示している（図５Ｈ）。これらの結果を確認すると、ｍＭＡＬＡＴ１＿３’Ｃｏｍｐ．１５領域を２色蛍光レポーター系中のｍＣｈｅｒｒｙの下流においた場合（図５Ｂ）、翻訳効率における約１／５の減少が、ＷＴｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域と比較した場合に観察されたが、ｍＲＮＡのレベルは約１／２だけ減少した（図５Ｃ、Ｄおよび図１５Ｃ、Ｄ）。

次いで、さらなる変異誘発を実施して、Ｃｏｍｐ．１５領域中に存在する２７の変異のうちどれが翻訳効率におけるこの減少に必要とされたかを決定した（図５Ｅ）。興味深いことに、この分析により、２７の変異に関する特定のサブセット（Ｃｏｍｐ．２７、図５Ｅ）が、転写物をもはや安定でなくすることが明らかになった（図５Ｆ）。それにもかかわらず、あまり翻訳されない（図５Ｇ）安定なｃＧＦＰ転写物（図５Ｆ）を生成する他のサブセットの変異（Ｃｏｍｐ．２５およびＣｏｍｐ．２６、図５Ｅ）を同定することが可能であった。これは、コア三重らせん領域の各側に直接隣接するヌクレオチドが、翻訳を促進する際に重要な役割を有することを示している（図５Ｉ）。

これらの結果は、強い翻訳エンハンサーエレメントがＭＡＬＡＴ１およびＭＥＮβの３’末端において存在することを示すので、これらの内因性非コードＲＮＡの翻訳の任意の証拠が存在するかどうかを調査した。ＭＥＮβ転写物は、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞において低く発現されるが（データ示さず）、ＭＡＬＡＴ１は高度に発現され、リボソームプロファイリング（Ｉｎｇｏｌｉａら、２０１１年）は、ＭＡＬＡＴ１の５’末端の近傍の再現可能な非ランダム領域がリボソームによって保護されることを示唆している（図６）。本発明者らは、これらの領域中によく保存されている明らかなオープンリーディングフレームを同定することができなかったが、リボソームが濃縮された領域のうちいくつかの近傍にマウスにおける潜在的な開始コドンが存在するので、種特異的な短いペプチドが、ＭＡＬＡＴ１の５’末端から産生される可能性がある。

三重らせん構造は、ヒトＬＩＮＥ−１ｍＲＮＡのＲＮＡ安定性および翻訳を促進する。

ＭＡＬＡＴ１三重らせんが種々のメッセンジャーＲＮＡ配列の３’末端においてポリ（Ａ）テイルを機能的に置き換えることができるかどうかを決定するために、いくつかのレポーターｍＲＮＡを試験した。既に示したように、蛍光レポータータンパク質ＧＦＰ（図５Ａ）またはｍＣｈｅｒｒｙ（図５Ｃ）をコードする２つの異なるｍＲＮＡの３’末端に三重らせんを置いた場合、ポリアデニル化バージョンのレポーターｍＲＮＡを用いて得られたレベルから識別できないレベルの翻訳が観察された。

次いで、ＭＡＬＡＴ１三重らせんを、ヒト長鎖散在反復配列（ＬｏｎｇＩｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄＥｌｅｍｅｎｔ）−１（ＬＩＮＥ−１またはＬ１）ｍＲＮＡの下流で試験した。Ｌ１配列は、ヒトゲノム中の自律的レトロトランスポゾンの優勢なクラスである。Ｌ１エレメントの９９．９％超は、レトロ転位による可動化がもはや可能でないが、平均ヒトゲノムは、およそ８０〜１００のレトロ転位コンピテントなＬ１エレメントを保有する（Ｂｅｃｋら、２０１１年において概説される）。複製コンピテントなＬ１は、およそ６ｋｂ長であり、２つの重複しないオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１およびＯＲＦ２）を含有し、ポリ（Ａ）テイルが後に続く３’ＵＴＲで終わる（図２０Ａ）。Ｌ１のポリ（Ａ）テイルをＭＡＬＡＴ１三重らせんで置き換えることの効果を決定するために、以前に記載されたＬ１エピソームベースの発現ベクター（ｐＡＤ２ＴＥ１）（Ｄｏｕｃｅｔら、２０１０年）を使用した。このベクターは、ＯＲＦ１のＣ末端にＴ７エピトープタグを含み、ＯＲＦ２のＣ末端にＴＡＰタグを含有して、ＯＲＦ１タンパク質およびＯＲＦ２タンパク質の発現の検出を促進する。

ｐＡＤ２ＴＥ１Ｌ１発現ベクター、または（三重らせんで終わるＬ１ｍＲＮＡを生成するために）Ｌ１ポリアデニル化シグナルをｍＭＡＬＡＴ１＿３’配列で置き換えた改変バージョンを、ＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、Ｔｒｉｚｏｌを使用して総ＲＮＡを単離した。ノザンブロット分析によって決定されるように、ＭＡＬＡＴ１三重らせんで終わるＬ１ｍＲＮＡは、ポリアデニル化Ｌ１ｍＲＮＡと類似のレベルまで蓄積した（図２０Ｂ、プローブ配列（配列番号１７２）：５’−ＧＣＧＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＡＴＴＴＡＧＣ）。Ｌ１−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡがＲＮａｓｅＰによってその３’末端においてｉｎｖｉｖｏで適切にプロセシングされたことを検証するために、トランスフェクションからの総ＲＮＡを、ＯＲＦ２の３’末端近傍のオリゴ（５’−ＧＣＧＣＴＴＴＧＧＣＴＴＧＧＧＴＣＡＴＣ）（配列番号１７３）に最初にハイブリダイズさせ、ＲＮａｓｅＨ消化に供した。より小さいサイズへの転写物の切断は、高分解能を有するノザンブロットが、ＲＮａｓｅＰ切断の精度を検証するために実施されるのを可能にした。予測されたサイズ（２３４ｎｔ）の単一バンドが、Ｌ１−ＭＡＬＡＴ１＿３’ＲＮＡについて観察された（図２０Ｃ）。対照的に、ポリアデニル化Ｌ１ｍＲＮＡについては、付加されたポリ（Ａ）テイルの長さにおけるバリエーションを示すスメアが観察された。これらの結果は、ＭＡＬＡＴ１三重らせんがＬ１ｍＲＮＡを効率的に安定化できることを示している。

次いで、ＭＡＬＡＴ１三重らせんがＬ１ｍＲＮＡ翻訳を支持することができるかどうかを決定するために、ＯＲＦ１およびＯＲＦ２タンパク質の産生を定量した。Ｌ１発現ベクターから翻訳された（ゲノム中の任意の内因性Ｌ１エレメントから翻訳されたのではない）タンパク質のみが定量されたことを確実にするために、イムノブロッティングおよび免疫蛍光を、（それぞれＯＲＦ１タンパク質またはＯＲＦ２タンパク質の発現を測定するために）Ｔ７またはＴＡＰエピトープタグを認識する抗体を使用して実施した。図２０Ｄ中のイムノブロットによって示されるように、類似のレベルのＯＲＦ１タンパク質およびＯＲＦ２タンパク質が、Ｌ１転写物がポリ（Ａ）テイルまたはＭＡＬＡＴ１三重らせんで終わる場合に観察された。これらの結果を、免疫蛍光によって確認したところ、ＯＲＦ１タンパク質およびＯＲＦ２タンパク質が、Ｌ１ｍＲＮＡ上の３’末端配列に関わりなく、細胞の細胞質中で高レベルまで蓄積することが実証された（図２０Ｅ）。総合すると、これらの結果は、三重らせんが、Ｌ１ｍＲＮＡの３’末端を安定化することができ、両方のコードされたＬ１タンパク質の効率的な産生を確実にすることができることを示している。

（実施例５）
ＭＡＬＡＴ１三重らせんで終わる転写物は、ｍｉｃｒｏＲＮＡによって効率的に抑制される。

ポリＡテイルを欠くほとんどの長い転写物は、細胞中で迅速に分解されるので、ポリＡテイルまたはポリＡ結合性タンパク質（ＰＡＢＰ）についてｉｎｖｉｖｏでの調節的役割を規定することは、一般に困難であった。現在、ＭＡＬＡＴ１の３’末端の周囲で構築された発現系は、ポリＡテイルを欠く安定な転写物をｉｎｖｉｖｏで生成するので、これらの問題に対処するための独自かつ有益なツールを提示する。その３’末端にｍＭＡＬＡＴ１＿３’配列を有する転写物は、ＰＡＢＰと相互作用する可能性が低いが、これは、このタンパク質が、結合のために少なくとも１２個連続するＡ残基を必要とするからである（Ｓａｃｈｓら、１９８７年）。非ポリアデニル化転写物がｉｎｖｉｖｏで如何にして調節されるかを調査するためのこの系の有用性を実証するためにｍｉｃｒｏＲＮＡが、ＭＡＬＡＴ１三重らせんで終わる転写物を、ポリアデニル化転写物がするのと同様に効率的に抑制するかどうかを調査した。ｍｉｃｒｏＲＮＡは、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）の一部として機能し、標的ｍＲＮＡ中の部分的に相補的な部位に結合し、翻訳抑制および／または転写物分解を引き起こす（Ｂａｒｔｅｌ２００９年）。コアＲＩＳＣタンパク質構成要素ＧＷ１８２は、ＰＡＢＰおよびデアデニラーゼ（ｄｅａｄｅｎｙｌａｓｅ）と直接相互作用できるので（Ｂｒａｕｎら、２０１１年）、ＲＩＳＣとＰＡＢＰとの間の相互作用がｍｉｃｒｏＲＮＡによる最大抑制に必要とされるモデルが浮かび上がった（Ｆａｂｉａｎら、２００９年；Ｈｕｎｔｚｉｎｇｅｒら、２０１０年；Ｍｏｒｅｔｔｉら、２０１２年）。しかし、これらの相互作用の機能的重要性は議論されてきた（ＦｕｋａｙａおよびＴｏｍａｒｉ２０１１年；Ｍｉｓｈｉｍａら、２０１２年）。

ｉｎｖｉｖｏでのｍｉｃｒｏＲＮＡ媒介性の抑制におけるポリＡテイルの役割を調査するために、２色蛍光レポーター系を利用し、ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位を、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルまたはｍＭＡＬＡＴ１＿３’領域のいずれかの上流で、ｍＣｈｅｒｒｙの３’ＵＴＲ中に挿入した（図７Ａ）。特に、２つのバルジ化ｌｅｔ−７結合部位（ｌｅｔ−７ｂｇと示す）またはｌｅｔ−７に対して完全に相補的な配列（ｌｅｔ−７ｐｆと示す）のいずれかを挿入し、こうして、標的とｍｉｃｒｏＲＮＡとの間の相互作用を、触媒的なＲＮＡ干渉型の抑制に変換した。ｌｅｔ−７ｍｉｃｒｏＲＮＡを天然に発現するＨｅＬａ細胞を使用して、ｍＣｈｅｒｒｙが正準のポリＡテイルで終わる場合に、２つのバルジ化ｌｅｔ−７結合部位の付加が、タンパク質発現によって測定した場合、３．２＋／−０．２倍の抑制を引き起こしたことが見出された（図７Ｂおよび図１６Ａ）。驚くべきことに、２．９＋／−０．４倍の抑制が、２つのバルジ化ｌｅｔ−７部位をＭＡＬＡＴ１三重らせんで終わるｍＣｈｅｒｒｙに付加した場合に観察され（図７Ｂおよび図１６Ｂ）、これは、ポリＡテイルが存在する場合に得られたレベルと統計的に異ならないレベルの抑制である。ｍＣｈｅｒｒｙがポリＡテイルで終わるかＭＡＬＡＴ１三重らせんで終わるかに関わらず、これらの効果は、転写物レベル上に反映され（図７Ｃ）、これは、タンパク質産生に対する効果が、少なくとも部分的には、減少したＲＮＡレベルに起因する可能性が高いことを示している。ＨｅＬａ細胞中のｍｉｃｒｏＲＮＡのレベルを増加させるために合成ｌｅｔ−７をトランスフェクトすると、観察されたｍｉｃｒｏＲＮＡ媒介性抑制のレベルは、存在する３’末端配列に関わらず、一貫して増加した（図７Ｂ、Ｃ）。これらの結果は、ポリＡテイルがｍｉｃｒｏＲＮＡによるｉｎｖｉｖｏでの最大抑制には必要ではないこと、および従って、ｍｉｃｒｏＲＮＡが細胞中の非ポリアデニル化転写物もまた効率的に標的化し得ることを示唆している。非ポリアデニル化転写物がｍｉｃｒｏＲＮＡに応答して分解される機構は不明であるが、これらの結果は、脱アデニル化が、効率的なｍｉｃｒｏＲＮＡ媒介性のサイレンシングに常に必要とされるわけではない可能性があることを示唆している。

（実施例６）
半減期測定：
ＨｅＬａ細胞に、ＣＭＶ−ｃＧＦＰ−ｍＭＡＬＡＴ１＿３’レポータープラスミドを２４時間にわたり一過的にトランスフェクトした。次いで、ＭＡＬＡＴ１三重らせんで終わるｃＧＦＰレポーターｍＲＮＡの半減期を概算するために、１μＭのアクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ）（転写阻害剤）を培地に添加し、細胞を、転写阻害後０、１、２、４、６、８および１０時間の時点で回収した。ノザンブロットは、三重らせんで終わるｃＧＦＰ転写物のＨｅＬａ細胞中での半減期を約５時間と示した。結果を図１８に示す。以前の研究は、ポリ（Ａ）テイルで終わるＧＦＰ転写物の半減期を約４．８時間と概算しており（Ｋｕｄｌａ，Ｇ．ら（２００６年）．ＨｉｇｈｇｕａｎｉｎｅａｎｄｃｙｔｏｓｉｎｅｃｏｎｔｅｎｔｉｎｃｒｅａｓｅｓｍＲＮＡｌｅｖｅｌｓｉｎｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳＢｉｏｌ．４巻：ｅ１８０頁）、これは、試験したＲＮＡ分子上の三重らせんおよびポリ（Ａ）テイルが、同様の程度まで転写物の３’末端を安定化できたことを示している。

（実施例７）
ｉｎｖｉｔｒｏで転写された三重らせんで終わるｍＲＮＡは、細胞抽出物中で翻訳され得る。

大量のｍＲＮＡが、ファージ（例えば、ＳＰ６、Ｔ３またはＴ７）から単離されたＲＮＡポリメラーゼを使用して、ＤＮＡ鋳型からｉｎｖｉｔｒｏで合成され得る。細胞中にトランスフェクトした場合または細胞抽出物中でインキュベートした場合、ｉｎｖｉｔｒｏで合成されたポリ（Ａ）テイルで終わるｍＲＮＡは、内因性細胞翻訳機械を使用して効率的に翻訳され得る。ｉｎｖｉｔｒｏで転写された三重らせんで終わるｍＲＮＡが、細胞翻訳機械とのインキュベーションの際に同様に翻訳され得るかどうかを決定するために、十分特徴付けられたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｉｎｖｉｔｒｏ翻訳アッセイを使用した（Ｇｉｌｂｅｒｔら、２００７年；Ｒｏｊａｓ−ＤｕｒａｎおよびＧｉｌｂｅｒｔ２０１２年）。以前に記載されたように（Ｒｏｊａｓ−ＤｕｒａｎおよびＧｉｌｂｅｒｔ２０１２年）、Ｔ７プロモーターの制御下にホタルルシフェラーゼオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するレポーター構築物を生成した。ＤＮＡ鋳型中のルシフェラーゼＯＲＦの下流に挿入したものは以下のいずれかであった：（ｉ）６２ヌクレオチドのポリ（Ａ）テイル、（ｉｉ）野生型ＭＡＬＡＴ１三重らせん、または（ｉｉｉ）三重らせん構造を顕著に不安定化する変異を含有し、従って迅速な分解のためにｍＲＮＡを標的化する、Ｃｏｍｐ．２７バージョンのＭＡＬＡＴ１三重らせん（図５Ｅ）。

キャップ付ルシフェラーゼｍＲＮＡを、Ｔ７ポリメラーゼを用いたランオフ転写によってｉｎｖｉｔｒｏで合成し、その後、ワクシニアキャッピング酵素でキャップした。精製されたｍ^７Ｇキャップ付ｍＲＮＡを、アガロースゲルのデンシトメトリーによって定量した。次いで、等量の各ｍＲＮＡを、野生型酵母抽出物に添加し、翻訳アッセイを（Ｒｏｊａｓ−ＤｕｒａｎおよびＧｉｌｂｅｒｔ２０１２年）に従って実施した。ｍＲＮＡ当たりの翻訳活性を決定するためにルシフェラーゼ活性を使用して、両方のポリ（Ａ）テイルおよび野生型ＭＡＬＡＴ１三重らせんが、背景レベルを超えて有意な翻訳を促進することが見出された（Ｃｏｍｐ．２７変異体によって決定されるように）（図２１）。従って、これらの結果は、ｉｎｖｉｔｒｏで転写された三重らせんで終わるｍＲＮＡが、顕著なレベルのタンパク質産生を得るために、細胞抽出物に添加され得ることを示す。

考察
ポリＡテイルを欠いているにもかかわらず、長い非コードＲＮＡＭＡＬＡＴ１は、ｉｎｖｉｖｏで多くのタンパク質コード遺伝子と匹敵するまたはそれよりも高いレベルで発現される安定な転写物である（Ｗｉｌｕｓｚら、２００８年；Ｚｈａｎｇら、２０１２年）。本研究で、本発明者らは、ＭＡＬＡＴ１の３’末端が、進化的に保存された三重らせんによって分解から保護されることを実証した。本発明者らは、ＭＥＮβの長い非コードＲＮＡの３’末端を安定化する高度に類似した三重らせん構造をさらに同定した。驚くべきことに、これらの三重らせん領域は、強い翻訳エンハンサーエレメントとしても機能し、非ポリアデニル化ｍＲＮＡが、正準のポリＡテイルを有するｍＲＮＡと同様に効率的に翻訳されることを可能にする。これらの結果は、複数の細胞株で観察されている。三重らせんで終わる転写物は、ｍｉｃｒｏＲＮＡによって効率的に抑制され、これは、ポリＡテイルがｉｎｖｉｖｏでの効率的なｍｉｃｒｏＲＮＡ媒介性のサイレンシングには必要とされないことを示す。本発明者らのデータは、ＭＡＬＡＴ１、ＭＥＮβおよびおそらくはポリＡテイルを欠く他の転写物が、ｉｎｖｉｖｏで如何にして安定化および調節されるかについての新たな洞察を提供する。

ＲＮＡ分解におけるウリジル化についての高まる役割
ＭＡＬＡＴ１三重らせんの完全性を破壊することで、転写物は効率的に分解される。本発明者らは、驚くべきことに、転写物が分解を受けている場合に、崩壊プロセスにおけるウリジル化を示す、転写後に付加された短いＵリッチテイルで終わる多数のｃＧＦＰ−ＭＡＬＡＴ１＿３’転写物を見出した（図２Ｆおよび図１１Ｃ）。オリゴウリジル化は、ｔＲＮＡ（図８）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ前駆体（Ｈｅｏら、２００９年）、成熟ｍｉｃｏＲＮＡ（Ｌｉら、２００５年）および転写開始部位会合ＲＮＡ（Ｃｈｏｉら、２０１２年）を含む多数のクラスのｓｍａｌｌＲＮＡの分解と関連付けられてきた。ｉｎｖｉｖｏの長い転写物上のＵテイルについての証拠は現在あまり存在しないが、ウリジル化は、ｍＲＮＡのキャップ除去を促進し得（ＳｏｎｇおよびＫｉｌｅｄｊｉａｎ２００７年；ＲｉｓｓｌａｎｄおよびＮｏｒｂｕｒｙ２００９年）、Ｕテイルは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ指向性の切断の産物上で観察されている（ＳｈｅｎおよびＧｏｏｄｍａｎ２００４年）。興味深いことに、ヒストンｍＲＮＡは、ＤＮＡ合成の完了の後にウリジル化および分解に供される（ＭｕｌｌｅｎおよびＭａｒｚｌｕｆｆ２００８年）。ＭＡＬＡＴ１の高度に構造化された３’末端において本発明者らが観察したこと（図２Ｆおよび図１１Ｃ）と同様に、ＭｕｌｌｅｎおよびＭａｒｚｌｕｆｆは、３’−５’エキソヌクレアーゼによって事前に短縮されたように見えるヒストンｍＲＮＡ上の短いＵテイルを観察した。本発明者らは、分解のために標的化される変異体ｍａｓｃＲＮＡ転写物の３’末端における同様の現象をさらに観察した（図８）。これらの結果は、オリゴウリジル化が、大規模なＲＮＡ二次構造の領域の分解において、本発明者らが現在理解しているよりもかなり顕著な役割を果たし得ることを示唆している。特に、本発明者らは、３’−５’エキソヌクレアーゼが大規模な二次構造の領域において立ち往生する場合に、引き続いて崩壊因子によって認識され、分解プロセスを再開するために使用される一本鎖テイルを提供するために、オリゴ（Ｕ）テイルが付加され得ることを示唆している。

ＭＡＬＡＴ１およびＭＥＮβの機能についての三重らせんの関与
迅速に分解され、従ってほぼ検出不能なレベルで発現される多くの長い非コードＲＮＡ（Ｗｙｅｒｓら、２００５年；Ｐｒｅｋｅｒら、２００８年）とは異なり、ＭＡＬＡＴ１およびＭＥＮβは、１２時間よりも長い半減期を有する安定な転写物である（Ｗｉｌｕｓｚら、２００８年；Ｓｕｎｗｏｏら、２００９年）。これらの非コードＲＮＡの３’末端からの分解を防止することによって、三重らせんは、ＲＮＡ安定性を確実にすることだけでなく、これらの転写物に重要な細胞機能を果たさせることにおいても、重要な役割を果たす。例えば、ＭＥＮβの非コードＲＮＡは、核中のパラスペックルの本質的な構造的構成要素である（Ｓｕｎｗｏｏら、２００９年）。ＭＥＮβが細胞から枯渇すると、この核内ドメインはもはや観察されず、パラスペックル関連タンパク質およびＲＮＡがその代りに分散される。矛盾する結果が公開されているので（Ｔｒｉｐａｔｈｉら、２０１０年；Ｙａｎｇら、２０１１年ｂ；Ｅｉｓｓｍａｎｎら、２０１２年；Ｚｈａｎｇら、２０１２年）、ＭＡＬＡＴ１の正確な細胞機能は、現在論争中である。それにもかかわらず、ＭＡＬＡＴ１は、多くのがんにおいて共通して過剰発現され、これは、悪性表現型における可能な役割を示唆している。

ＭＡＬＡＴ１およびＭＥＮβの三重らせんが強い翻訳エンハンサーエレメントとして機能するという本発明者らの知見は、これらの核保持された転写物が如何にして機能し得るかについて、さらなる予期しない展開を加える。Ｘｉｓｔの長い非コードＲＮＡがタンパク質コード遺伝子から進化したことを考慮すると（Ｄｕｒｅｔら、２００６年）、ＭＡＬＡＴ１およびＭＥＮβについても同じことが当てはまり得、従ってそれらの関連する翻訳制御エレメントは、単にその進化上の過去の遺物である。代替的に、これらの非コードＲＮＡは、リボソームと相互作用し得、かつて非コードとみなされた他の転写物について示されたように、短いペプチドをおそらくは産生する（Ｇａｌｉｎｄｏら、２００７年；Ｉｎｇｏｌｉａら、２０１１年）。再現可能な非ランダムなリボソームフットプリントが、マウス胚性幹細胞においてＭＡＬＡＴ１上で見出されたが（図６）、よく保存されている明らかなオープンリーディングフレームは同定されなかった。ＭＡＬＡＴ１およびＭＥＮβは、翻訳機械の構成要素と単に相互作用し得、それによってｍＲＮＡに対するこれらの因子の結合を防止する「スポンジ」として機能することもまた可能である。

最後に、ポリＡテイルなしの安定な細胞質ｍＲＮＡを産生する発現ベクターの入手可能性は、この非鋳型コード構造を含む翻訳制御のための機構のｉｎｖｉｖｏ試験を可能にする。例えば、本発明者らは、ｍｉｃｒｏＲＮＡが、ポリＡテイルを有する標的ｍＲＮＡの発現を、ＭＡＬＡＴ１三重らせんで終わるｍＲＮＡと同様に効率的に調節することを見出している。

まとめると、本発明者らは、非ポリアデニル化ＭＡＬＡＴ１およびＭＥＮβの長い非コードＲＮＡの３’末端において、ＲＮＡ崩壊を防止するように機能する高度に保存された三重らせん構造を同定した。オープンリーディングフレームの下流に置いた場合、この三重らせんは、効率的な翻訳を促進するようにさらに機能する。本発明者らは、ｉｎｖｉｔｒｏで転写された三重らせんで終わるｍＲＮＡが、ｉｎｖｉｔｒｏで翻訳もされ得ることを実証している。従って、本発明者らの知見は、正準のポリＡテイルを欠く転写物が、如何にして安定化、調節および翻訳され得るかについての新規パラダイムを明らかにする。ヒトトランスクリプトームの複雑性およびポリＡテイルを欠き得る多くの他の長い転写物の存在を考慮すると、三重らせんおよび他のＲＮＡ構造エレメントは、転写物安定性を確実にし遺伝子発現を調節することにおいて、さらなる正しく評価されていない役割を有し得る可能性が高い。

参考文献

Claims

異種ＲＮＡ安定化末端配列に連結された、ポリＡテイルを欠くＲＮＡ分子
を含むハイブリッド核酸。
前記異種ＲＮＡ安定化末端配列が三重らせんコンフォメーションを有する、請求項１に記載のハイブリッド核酸。
前記ＲＮＡ分子が細胞質ＲＮＡまたは核ＲＮＡである、請求項１〜２のいずれか一項に記載のハイブリッド核酸。
前記ＲＮＡ分子がｍＲＮＡである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のハイブリッド核酸。
前記ＲＮＡ分子が非コードＲＮＡである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のハイブリッド核酸。
前記ＲＮＡ分子が真核生物ＲＮＡである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のハイブリッド核酸。
前記ＲＮＡ分子が哺乳動物ＲＮＡである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のハイブリッド核酸。
前記ＲＮＡ分子が植物ＲＮＡである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のハイブリッド核酸。
前記ＲＮＡ分子がヒトＲＮＡである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のハイブリッド核酸。
前記異種ＲＮＡ安定化末端配列がＭＡＬＡＴ１末端配列である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のハイブリッド核酸。
前記異種ＲＮＡ安定化末端配列がＭＥＮβ末端配列である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のハイブリッド核酸。
前記異種ＲＮＡ安定化末端配列がＵリッチ配列である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のハイブリッド核酸。
前記異種ＲＮＡ安定化末端配列がＡリッチ配列である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のハイブリッド核酸。
前記異種ＲＮＡ安定化末端配列がＵリッチおよびＡリッチ配列である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のハイブリッド核酸。
前記異種ＲＮＡ安定化末端配列がＣリッチおよびＧリッチ配列である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のハイブリッド核酸。
前記異種ＲＮＡ安定化末端配列が、三重らせん構造を有するＲＮＡである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のハイブリッド核酸。
前記ＲＮＡ分子がレポーター分子に対応する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のハイブリッド核酸。
ＲＮＡ分子に対応する核酸、前記ＲＮＡ分子に対応する前記核酸の上流のプロモーター、および前記ＲＮＡ分子に対応する前記核酸の下流の末端配列に対応する核酸を含む、ベクター。
プラスミドである、請求項１８に記載のベクター。
前記ＲＮＡ分子に対応する前記核酸が、レポータータンパク質をコードする核酸である、請求項１８〜１９のいずれか一項に記載のベクター。
前記レポータータンパク質が緑色蛍光タンパク質である、請求項２０に記載のベクター。
前記ＲＮＡ分子がｍＲＮＡである、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のベクター。
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のハイブリッド核酸を生成する核酸配列を含む、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載のベクター。
前記プロモーターが異種プロモーターである、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載のベクター。
前記プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載のベクター。
前記ＲＮＡ分子が、真核生物ＲＮＡ、哺乳動物ＲＮＡ、植物ＲＮＡまたはヒトＲＮＡである、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載のベクター。
前記末端配列がＭＡＬＡＴ１末端配列である、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載のベクター。
前記末端配列がＭＥＮβ末端配列である、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載のベクター。
前記末端配列がＵリッチ配列である、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載のベクター。
前記末端配列がＡリッチ配列である、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載のベクター。
前記末端配列がＵリッチおよびＡリッチ配列である、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載のベクター。
前記末端配列がＣリッチおよびＧリッチ配列である、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載のベクター。
前記末端配列が、三重らせん構造を有するＲＮＡである、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載のベクター。
前記末端配列が、リガンド結合ドメインを有する、請求項１８〜３３のいずれか一項に記載のベクター。
前記リガンド結合ドメインが、組織特異的エレメントを有する、請求項３４に記載のベクター。
前記組織ががん性組織であり、前記組織特異的エレメントが、前記がん性組織における翻訳の調節に関与する、請求項３５に記載のベクター。
核酸が、少なくとも１つの化学的改変または天然の改変を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のハイブリッド核酸または請求項１８〜３６のいずれか一項に記載のベクター。
ＲＮＡの翻訳を増強するための方法であって、前記方法は：
ポリＡテイルを欠く単離された細胞質ＲＮＡを、細胞において発現させるステップを含み、ここで前記細胞質ＲＮＡは、前記細胞における前記ＲＮＡの翻訳を増強するのに有効な３’末端配列を有する、方法。
３’末端配列を有しポリＡテイルを欠く前記単離された細胞質ＲＮＡが、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のハイブリッド核酸である、請求項３８に記載の方法。
請求項１８〜３６のいずれか一項に記載のベクターが、ポリＡテイルを欠く前記単離された細胞質ＲＮＡを発現させるために前記細胞に投与される、請求項３８に記載の方法。
ポリＡテイルを欠くＲＮＡを発現させるための方法であって、前記方法は：
３’異種末端配列を有しポリＡテイルを欠くＲＮＡを含む単離された核酸を細胞において発現させるステップを含む、方法。
前記単離された核酸が、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のハイブリッド核酸である、請求項４１に記載の方法。
請求項１８〜３６のいずれか一項に記載のベクターが、前記単離された核酸を発現させるために前記細胞に投与される、請求項４１に記載の方法。
ナノ粒子中に製剤化された、異種ＲＮＡ安定化末端配列に連結された、ポリＡテイルを欠くＲＮＡ分子を含む、組成物。
ＲＮＡが、少なくとも１つの化学的改変または天然の改変を含む、請求項４４に記載の組成物。
請求項１８〜３６のいずれか一項に記載の核酸ベクターを含むナノ粒子またはマイクロ粒子を含む、組成物。
核酸が、少なくとも１つの化学的改変または天然の改変を含む、請求項４６に記載の組成物。
請求項４６に記載の組成物を被験体に投与するステップを含む、ＲＮＡをｉｎｖｉｖｏで細胞に送達する方法。
ＲＮＡを精製するための方法であって、前記方法は：
３’異種末端配列を有しポリＡテイルを欠くＲＮＡを含む単離された核酸の混合物を、アフィニティー精製ステップまたはサイズ排除精製ステップに供して、ポリＡテイルを欠く精製されたＲＮＡを得るステップを含む、方法。
前記単離された核酸が、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のハイブリッド核酸である、請求項４９に記載の方法。
精製されたＲＮＡが、ｉｎｖｉｔｒｏ、ｅｘｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｖｏの方法において使用される、請求項４９に記載の方法。
被験体において疾患を処置するための方法であって、前記方法は：
３’異種末端配列を有しポリＡテイルを欠くＲＮＡを含む単離された核酸を、前記被験体においてタンパク質を発現させるのに有効な量で前記被験体に投与するステップを含み、前記タンパク質は、前記被験体における疾患の処置において有用である、方法。
前記疾患が、機能喪失に関連する疾患である、請求項５２に記載の方法。
前記疾患が、筋ジストロフィーまたは嚢胞性線維症である、請求項５３に記載の方法。
前記疾患が、がん、心血管疾患、自己免疫、神経変性疾患および皮膚疾患からなる群より選択される疾患である、請求項５２に記載の方法。
前記単離された核酸が、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のハイブリッド核酸である、請求項５２に記載の方法。
請求項１８〜３６のいずれか一項に記載のベクターが、前記単離された核酸を発現させるために前記細胞に投与される、請求項５２に記載の方法。
組織生成のための方法であって、前記方法は：
３’異種末端配列を有しポリＡテイルを欠くＲＮＡを含む単離された核酸を細胞において発現させるステップ、前記細胞を増殖条件下で足場において増殖させて、組織を形成させるステップを含む、方法。
前記組織が身体中に移植される、請求項５８に記載の方法。
請求項５８に記載の方法に従って生成された組織。
幹細胞を生成するための方法であって、前記方法は：
３’異種末端配列を有しポリＡテイルを欠くＲＮＡを含む単離された核酸を、分化した細胞の集団において発現させるステップであって、前記ＲＮＡは、再プログラミングタンパク質をコードする、ステップ、再プログラミングを促進する条件下で前記分化した細胞を増殖させて、多能性幹細胞を形成させるステップを含む、方法。
請求項６１に記載の方法に従って生成された多能性幹細胞。
分化した細胞を生成するための方法であって、前記方法は：
３’異種末端配列を有しポリＡテイルを欠くＲＮＡを含む単離された核酸を、幹細胞の集団において発現させるステップであって、前記ＲＮＡは、分化タンパク質をコードする、ステップ、分化を促進する条件下で前記幹細胞を増殖させて、分化した細胞を形成させるステップを含む、方法。
遺伝的欠陥の訂正を必要とする被験体において遺伝的欠陥を訂正する方法であって、前記方法は：
３’異種末端配列を有しポリＡテイルを欠くＲＮＡを含む単離された核酸を含む単離された細胞の治療有効量を前記被験体に投与するステップを含み、前記ＲＮＡは、前記遺伝的欠陥を訂正するためのタンパク質をコードする、方法。
前記遺伝的欠陥が、免疫系障害を引き起こす遺伝的欠陥；神経学的障害を引き起こす遺伝的欠陥；心障害を引き起こす遺伝的欠陥；循環障害を引き起こす遺伝的欠陥および呼吸障害を引き起こす遺伝的欠陥からなる群より選択される、請求項６４に記載の方法。
遺伝障害の処置を必要とする被験体において遺伝障害を処置する方法であって、前記方法は：
３’異種末端配列を有しポリＡテイルを欠くＲＮＡを含む単離された核酸を含む単離された細胞の治療有効量を前記被験体に投与するステップを含み、前記ＲＮＡは置き換えタンパク質をコードし、前記置き換えタンパク質の欠如は、前記遺伝障害に関連する、方法。
異種ＲＮＡ安定化末端配列に連結された、ポリＡテイルを欠くＲＮＡ分子を含む、ハイブリッド核酸であって、前記ＲＮＡ分子は、免疫原性タンパク質をコードする、ハイブリッド核酸。
被験体をワクチン接種するための方法であって、前記方法は：
被験体に請求項６７に記載のハイブリッド核酸を、前記免疫原性タンパク質に対する獲得免疫応答を惹起するための有効量で投与するステップを含む、方法。
非ヒト動物であって、前記動物の１つまたは複数の細胞中に、異種ＲＮＡに連結された、ポリＡテイルを欠く外因性ＲＮＡ分子、および安定化させる末端配列を含む、非ヒト動物。
前記ＲＮＡ分子が治療タンパク質をコードする、請求項６９に記載の動物。
前記ＲＮＡ分子が免疫原性タンパク質をコードする、請求項６９に記載の動物。