JP2015531757A

JP2015531757A - 標識されたキラルアルファ−ヒドロキシケト酸誘導体、前記誘導体を調製するための方法およびその使用

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Publication number: JP2015531757A
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Abstract

本発明は、標識されたキラルアルファ−ヒドロキシケト酸誘導体、前記誘導体を調製するための方法、ならびにタンパク質および生体分子集合体におけるアミノ酸の同位体標識のための、詳細にはアミノ酸のメチル基の同位体標識のための、より詳細にはバリン、ロイシンおよびイソロイシンメチル基の特異的な同位体標識のためのそれらの使用に関する。本発明はまた、タンパク質および生体分子集合体をＮＭＲ分光法により分析するための方法であって、本発明のキラルアルファ−ヒドロキシケト酸誘導体による、分析されるタンパク質および生体分子集合体におけるアミノ酸、詳細にはバリン、ロイシンおよびイソロイシンの同位体標識のステップを含む方法に関する。本発明はさらに、本発明の１つまたは複数のキラルアルファ−ヒドロキシケト酸誘導体を含む、タンパク質および生体分子集合体におけるバリン、ロイシンおよびイソロイシンアミノ酸の同位体標識のためのキットに関する。【選択図】図１

Description

本発明は、標識されたキラルアルファ−ヒドロキシケト酸誘導体、前記誘導体を調製するための方法、ならびにタンパク質および生体分子集合体におけるアミノ酸の同位体標識のための、詳細にはアミノ酸のメチル基の同位体標識のための、より詳細にはバリン、ロイシンおよびイソロイシンメチル基の特異的な同位体標識のためのその使用に関する。

本発明はまた、タンパク質および生体分子集合体をＮＭＲ分光法により分析するための方法であって、本発明のキラルアルファ−ヒドロキシケト酸誘導体により分析される、タンパク質および生体分子集合体におけるアミノ酸、詳細にはバリン、ロイシンおよびイソロイシンの同位体標識のステップを含む方法に関する。

本発明はさらに、本発明の１つまたは複数のキラルアルファ−ヒドロキシケト酸誘導体を含む、タンパク質および生体分子集合体におけるバリン、ロイシンおよびイソロイシンアミノ酸の同位体標識のためのキットに関する。

巨大タンパク質（>１００ｋＤａ）および超分子系の動態、相互作用ならびに機能の分析に溶液ＮＭＲ分光法を使用することが次第に実現可能になってきている。この進歩の秘訣は、生体分子を標識する新たな強力な手法の開発であり、それらはＮＭＲ方法論における多くの進歩を促すため決定的なものとなってきた。

メチル基は、巨大タンパク質の溶液ＮＭＲ分光法研究のための理想的な分子プローブであることが判明している。

初期のメチル標識手順では、アルファ−ケト酸が、メチルプロトン化イソロイシン（Ｉｌｅ）の産生における前駆体として使用された。より最近の戦略は、大腸菌（E. coli）におけるイソロイシンの生合成前駆体である標識された２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−エチル−３−オキサブタン酸塩を使用することに基づいている（ＡｙａｌａＩ．ｅｔａｌ．、ＣｈｅｍＣｏｍｍ．、２０１１、ｗｗｗ．ｒｓｃ．ｏｒｇ／ｃｈｅｍｃｏｍｍ、ＤＯＩ：１０．１０３９／Ｃ１ＣＣ１２９３２Ｅ）。この方法では、前駆体が化学的に合成されることから、前駆体がラセミ混合物として得られこと、また得られる混合物の半分のみが細菌により変換され得ることを意味している。

バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）およびイソロイシン（Ｉｌｅ）は、それらのメチル基が、タンパク質において利用可能なすべてのメチルプローブの５０％超を占めるため、大変興味が持たれる３つのアミノ酸である。

過重水素化（perdeuterated）タンパク質におけるロイシンおよびバリンメチル基のプロトン化は一般的に、これらのアミノ酸の生合成における中間体であるメチルプロトン化された２−オキソ−３−メチルブタン酸（アルファ−ケトイソ吉草酸としても公知である）を使用して達成され、ここでは両方のメチル基が、^１Ｈ、^１３Ｃ標識される。このタイプのアルファ−ケトイソ吉草酸を使用することにより、非常に多くのＮＭＲ可視メチルプローブに起因して過密した［^１Ｈ，^１３Ｃ］−関連スペクトルがもたらされるため、高分子量タンパク質では効率的ではないことが判明した。

国際公開第２０１１／０８３３５６号は、化学合成により得られるアセト乳酸塩誘導体のラセミ混合物を使用した、タンパク質集合体におけるバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）およびイソロイシン（Ｉｌｅ）の特異的な同位体標識のための方法について記載している。従来法により前記ラセミ混合物をそれらの立体化学的に純粋なアセト乳酸塩誘導体へ分割することは、効率的ではないことが判明した。

ＲｕｓｃｈａｋＡ．Ｍ．ｅｔａｌ．、ＪＢｉｏｍｏｌＮＭＲ、２０１０、４８（３）、ｐ.１２９〜３５およびＡｙａｌａＩ．ｅｔａｌ．、Ｊ．ＣｈｅｍＣｏｍｍｕｎ、２０１２年、４８、ｐ．１４３４〜１４３６は、イソロイシンガンマ−２メチル基の特異的な標識のための２−ヒドロキシ−２−メチル−３−オキソブタン酸および２−ヒドロキシ−２−エチル−３−オキソブタン酸塩のエステル誘導体を調製するための合成経路について記載している。これらの参照文献では、化合物は、アセト酢酸メチル（またはエチル）から化学合成により調製され、したがってラセミ混合物の形態で得られる。その結果として、Ｓ立体化学を有する得られた化合物の半分のみが、細菌により取り込まれ得る。さらに、２−ヒドロキシ−２−メチル−３−オキソブタン酸および２−ヒドロキシ−２−エチル−３−オキソブタン酸塩の誘導体は、エステルの形態で存在し、使用前に塩基性媒質で化合物を脱保護させるのにさらなるステップが必要とされることを意味する。あまり制御されていない反応条件下では、これが、化合物の著しい分解をもたらし得る。

Ｇｏｄｏｙ−ＲｕｉｚＲ．ｅｔａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０１０、１３２（５１）、ｐ.１８３４０〜５０は、アルファ−ケトイソ吉草酸（Ａｌａ、ＬｅｕおよびＶａｌ部位を標識するため）およびアルファ−ケト酪酸（Ｉｌｅ位の標識のため）を使用したアラニン、ロイシン、バリンおよびイソロイシンメチル位の同時選択的同位体標識、ならびに距離制限（distance restraints）や可動性のデータを得るためのそれらの使用について記載している。この参照文献に記載される標識方法は、イソロイシンのガンマ−２位における同位体リーク（isotopic leaks）を導き、構造的な制約を抽出する際に人為的結果をもたらす。この現象は、標識された３−^１３Ｃ−アラニンの幾つかの脱アミノ化に起因し、標識されたピルビン酸塩のｉｎｖｉｖｏ合成を導く。このようにして得られる標識されたピルビン酸塩と内因性２−オキソブタン酸塩とのアセト乳酸シンターゼの存在下での縮合により、２−ヒドロキシ−２−エチル−３−オキソ−４−^１３Ｃ−ブタン酸塩が生じる。

Ｅｎｇｅｌ，Ｓ．ｅｔａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８８、ｐ.８２５〜８３は、芳香族アルファ−ヒドロキシケトンの立体選択的合成における大腸菌（Escherichia Coli）由来のアセトヒドロキシ酸シンターゼＩ（ＡＨＡＳＩ）の使用を報告している。

米国特許第２００６／０１４８０４２号は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）またはタルトロン酸セミアルデヒドシンターゼ（ＴＳＡＳ）を使用したキラル芳香族アルファ−ヒドロキシケトンの調製に関する生体内変換方法に関する。この文書は、キラルアセトヒドロキシ酸の非芳香族合成の合成、特異的にまたは全体的に重水素化され、および／または炭素１３（^１３Ｃ）が富化されたキラルアセトヒドロキシ酸の合成、およびアミノ酸の同位体標識のためのそれらの使用に関しては、全く触れていない。

国際公開第２０１１／０８３３５６号米国特許第２００６／０１４８０４２号

ＡｙａｌａＩ．ｅｔａｌ．、Ｊ．ＣｈｅｍＣｏｍｍｕｎ．、２０１１、ｗｗｗ．ｒｓｃ．ｏｒｇ／ｃｈｅｍｃｏｍｍ、ＤＯＩ：１０．１０３９／Ｃ１ＣＣ１２９３２ＥＲｕｓｃｈａｋＡ．Ｍ．ｅｔａｌ．、ＪＢｉｏｍｏｌＮＭＲ、２０１０、４８（３）、ｐ.１２９〜３５ＡｙａｌａＩ．ｅｔａｌ．、Ｊ．ＣｈｅｍＣｏｍｍｕｎ、２０１２、４８、ｐ．１４３４〜１４３６Ｇｏｄｏｙ−ＲｕｉｚＲ．ｅｔａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０１０、１３２（５１）、ｐ.１８３４０〜５０Ｅｎｇｅｌ，Ｓ．ｅｔａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８８、ｐ.８２５〜８３Ｂａｒ−Ｉｌａｎｅｔａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４０（２００１）１１９４６〜５４）Ａｙａｌａｅｔａｌ、２０１２、ＣｈｅｍＣｏｍｍｕｎ、４８（１０）：１４３４〜６Ｈｉｌｌｅｔａｌ．（ＢｉｏｃｈｅｍＪ．１９９７）ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ．２００４８８（７）：８２５〜３１Ｐ．Ｇａｎｓｅｔａｌ．（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、２０１０、４９、１９５８〜１９６２）Ｇｏｄｏｙ−Ｒｕｉｚｅｔａｌ．（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０１０、１３２、１８３４０〜１８３５０頁

したがって、アミノ酸、詳細にはロイシン、バリンおよびイソロイシンから選択されるアミノ酸のメチル基を効率的かつ特異的に標識することが可能である標識された立体特異的なアルファ−ヒドロキシケト酸が依然として必要されている。

詳細には、高収率でかつ穏やかな条件下で位置選択的および立体選択的な方法により製造される上述の標識された立体特異なアルファ−ヒドロキシケト酸が依然として必要とされている。

より詳細には、アミノ酸が標識される部位、即ち、アミノ酸ロイシン、バリンおよびイソロイシンのメチル基で、同位体リークを引き起こさずにアミノ酸を標識することが可能な上述の標識された立体特異的なアルファーヒドロキシケト酸が依然として必要とされている。

さらにより詳細には、検出可能なスクランブリングを伴わずに細菌により標的タンパク質に取り込まれ得る上述の標識された立体特異的なアルファ−ヒドロキシケト酸が依然として必要とされている。

本発明は、（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）：

（式中、
−Ｘ^１およびＸ^２は互いに独立して、^１Ｈ（Ｈ）または^２Ｈ（Ｄ）であり、
−Ｙ^１、Ｙ^２およびＹ^３は互いに独立して、^１２Ｃ（Ｃ）または^１３Ｃであり、
−Ｒ^１は、メチル基（ここで、炭素原子は^１２Ｃ（Ｃ）または^１３Ｃであり、水素原子は互いに独立して、^１Ｈ（Ｈ）または^２Ｈ（Ｄ）である）であり、
−Ｒ^２は、メチル基（ここで、炭素原子は^１２Ｃ（Ｃ）または^１３Ｃであり、水素原子は互いに独立して、^１Ｈ（Ｈ）または^２Ｈ（Ｄ）である）であるか、または
−Ｒ^２は、エチル基（ここで、炭素原子は互いに独立して、^１２Ｃ（Ｃ）または^１３Ｃであり、水素原子は互いに独立して、^１Ｈ（Ｈ）または^２Ｈ（Ｄ）である）である）
の化合物であるが、但し、式（Ｉ）を有する化合物において、同時に、少なくとも１つの水素原子が^２Ｈ（Ｄ）であり、少なくとも１つの炭素原子が^１３Ｃである化合物を提供することにより、当該技術分野におけるこれらの必要性および他の必要性に対処する。

（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の化合物はまた、２−（Ｓ）−アルファ−アセト乳酸誘導体または２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−アルキル−３−オキソブタン酸誘導体としても知られている。

式（Ｉ）の化合物はキラルである。^１２Ｃ（Ｃ）または^１３Ｃのいずれかである本発明の化合物における不斉／キラル中心は、（Ｓ）立体配置を有する。その結果として、タンパク質においてアミノ酸を同位体標識するのに必要とされる式（Ｉ）の化合物の量は、同じ操作に必要な当該技術分野のラセミ混合物の量と比較して半分に低減される。

本発明の化合物の別の利点は、当該技術分野のエステル化合物とは異なり、式（Ｉ）の化合物が酸の形態で存在し、したがって実験的に困難であり得るエステル官能基のさらなる脱保護ステップが回避されることである。

本発明の化合物のさらなる利点は、式（Ｉ）の化合物を用いて、アミノ酸の高レベルの同位体標識が、他の位置に対していかなる漏出も伴わずに得られることである。

本発明の状況では、下記用語は、下記の意味を有する：
−Ｖａｌは、アミノ酸バリンを指す；
−Ｌｅｕは、アミノ酸ロイシンを指す；
−Ｉｌｅは、アミノ酸イソロイシンを指す；
−^１３Ｃは、炭素１３同位体を指す；
−^１２Ｃ（またはＣ）は、炭素−１２同位体を指す；
−^２Ｈ（またはＤ）は、重水素として知られる水素の同位体を指す；
−^１Ｈ（またはＨ）は、水素の一般的な同位体を指す；
−キラル分子は、上に重ねられない鏡像（miror image）、即ち、通過する平面偏光単色光の偏光面を回転させる特性を有する分子である。本発明では、キラル／不斉中心は、４つの異なる置換基を保有する式（Ｉ）の化合物における炭素原子（^１３Ｃまたは^１２Ｃ）、即ち２位にある炭素である；
−立体配置は、キラル分子における不斉／キラル中心に直接結合された原子の空間的配置を指す。この配置は、文字（Ｒ）または（Ｓ）を用いて化学式中に割り当てられる。本件では、式（Ｉ）の化合物は、（Ｓ）立体配置を有する；
−生体分子集合体は、タンパク質、およびＤＮＡループ（二重鎖ＤＮＡ分子の２本鎖が、ＤＮＡの第３の鎖によって一定のストレッチで分離させられ、離れて保持される構造）、脂質、各種リガンド等のような他の群を含有する分子を指す；
−立体特異性は、基質または反応物の幾つかの立体異性体のうちの１つに関する顕著な特異性を指し、通常は酵素または有機反応について言われる；
−位置特異性は、すべての他の考え得る方向よりも優先的に作製または切断する一方向の結合を指す；
−ｐｒｏＲ、ｐｒｏＳ：標識されていないＬｅｕのガンマ炭素上のメチル基（デルタ１およびデルタ２）は異ならず、その結果として標識されていないＬｅｕアミノ酸の前記ガンマ炭素はキラルでない。標識されていないＶａｌのベータ炭素上のメチル基（ガンマ１およびガンマ２）は異ならず、その結果として標識されていないＶａｌアミノ酸の前記ベータ炭素はキラルでない。

しかしながら、基Ｒ^１およびＲ^２は、式（Ｉ）の化合物では同じ様式で標識されず、それぞれＬｅｕおよびＶａｌのガンマおよびベータ炭素原子上の得られたメチル基は、異なって標識される。この差異に起因して、それぞれＬｅｕおよびＶａｌのガンマおよびベータ炭素原子はキラルとなる。これらのメチル基は、標識が（Ｒ）立体配置を生じる場合にはｐｒｏＲと称され、標識が（Ｓ）立体配置を生じる場合にはｐｒｏＳと称される。

好ましい実施形態では、（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の化合物では、
−Ｘ^１、Ｘ^２、Ｙ^１、Ｙ^２およびＹ^３は、すでに定義される通りであり、
−Ｒ^１は、ＣＤ_３、^１３ＣＨ_３、^１３ＣＨ_２Ｄおよび^１３ＣＨＤ_２からなる群から選択され、
−Ｒ^２は、^１３ＣＤ_３からなる群から選択されるメチル基であるか、または
−Ｒ^２は、ＣＤ_３−ＣＤ_２、 ^１３ＣＨ_３−ＣＤ_２、ＣＨ_３−^１３ＣＤ_２、^１３ＣＨＤ_２−ＣＤ_２、^１３ＣＨＤ_２−^１３ＣＤ_２、^１３ＣＨ_２Ｄ−ＣＤ_２、^１３ＣＨ_２Ｄ−^１３ＣＤ_２および^１３ＣＨ_３−^１３ＣＤ_２からなる群から選択されるエチル基である。

別の好ましい実施形態では、（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の化合物では、
−Ｘ^１、Ｘ^２、Ｒ^１およびＲ^２は、様々な実施形態ですでに定義される通りであり、
−Ｙ^１＝Ｙ^２＝Ｙ^３＝Ｃである。

さらに別の好ましい実施形態では、（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の化合物では、
−Ｘ^１、Ｘ^２、Ｒ^１およびＲ^２は、様々な実施形態ですでに定義される通りであり、
−Ｙ^１＝Ｙ^２＝Ｙ^３＝^１３Ｃである。

本発明のある実施形態では、（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の化合物は、
・（Ｓ）−２−（１’−^２Ｈ_２，２’−^１３Ｃ）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸｛Ｘ^１＝Ｘ^２＝Ｈ；Ｙ^１＝Ｙ^２＝Ｙ^３＝Ｃ；Ｒ^１＝ＣＤ_３；Ｒ^２＝^１３ＣＨ_３−ＣＤ_２｝、
・（Ｓ）−２−（１’−^２Ｈ_２，２’−^２Ｈ，２’−^１３Ｃ）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸｛Ｘ^１＝Ｘ^２＝Ｈ；Ｙ^１＝Ｙ^２＝Ｙ^３＝Ｃ；Ｒ^１＝ＣＤ_３；Ｒ^２＝^１３ＣＨ_２Ｄ−ＣＤ_２｝、
・（Ｓ）−２−（１’−^２Ｈ_２，２’−^２Ｈ_２，２’−^１３Ｃ）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸｛Ｘ^１＝Ｘ^２＝Ｈ；Ｙ^１＝Ｙ^２＝Ｙ^３＝Ｃ；Ｒ^１＝ＣＤ_３；Ｒ^２＝^１３ＣＨＤ_２−ＣＤ_２｝、
・（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_３，^１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（^１３Ｃ）ブタン酸｛Ｘ^１＝Ｘ^２＝Ｈ；Ｙ^１＝Ｙ^２＝Ｙ^３＝Ｃ；Ｒ^１＝^１３ＣＨ_３；Ｒ^２＝^１３ＣＤ_３｝、
・（Ｓ）−２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^１３Ｃ）メチルブタン酸｛Ｘ^１＝Ｘ^２＝Ｈ；Ｙ^１＝Ｙ^２＝Ｙ^３＝Ｃ；Ｒ^１＝^１３ＣＨ_３；Ｒ^２＝ＣＤ_３−ＣＤ_２｝
からなる群から選択される。

本発明の別の実施形態では、（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の化合物は、
・（Ｓ）−１，２，３−（^１３Ｃ）−２−（１’−^２Ｈ_２，^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸｛Ｘ^１＝Ｘ^２＝Ｈ；Ｙ^１＝Ｙ^２＝Ｙ^３＝^１３Ｃ；Ｒ^１＝ＣＤ_３；Ｒ^２＝^１３ＣＨ_３−^１３ＣＤ_２｝、
・（Ｓ）−１，２，３−（^１３Ｃ）−２−（１’−^２Ｈ_２，２’−^２Ｈ，^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸｛Ｘ^１＝Ｘ^２＝Ｈ；Ｙ^１＝Ｙ^２＝Ｙ^３＝^１３Ｃ；Ｒ^１＝ＣＤ_３；Ｒ^２＝^１３ＣＨ_２Ｄ−^１３ＣＤ_２｝、
・（Ｓ）−１，２，３−（^１３Ｃ）−２−（１’−^２Ｈ_２，２’−^２Ｈ_２，^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸｛Ｘ^１＝Ｘ^２＝Ｈ；Ｙ^１＝Ｙ^２＝Ｙ^３＝^１３Ｃ；Ｒ^１＝ＣＤ_３；Ｒ^２＝^１３ＣＨＤ_２−^１３ＣＤ_２｝
からなる群から選択される。

本発明の別の目的は、（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の化合物を調製するための方法であって、式（ＩＩ）

のアルファ−ケト酸を、アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩ（ＡＨＡＳＩＩ）、補酵素チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）、酸化還元補因子フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、マグネシウム塩および緩衝液の存在下で式（ＩＩＩ）

（式中、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｙ^１、Ｙ^２、Ｙ^３、Ｒ^１およびＲ^２は、様々な実施形態で式（Ｉ）に関して定義される意味を有する）
のアルファ−ケト酸と反応させること
を含む方法を提供することである。

この方法は酵素的であり、それは、
−位置選択的であり（酵素は好ましくは、式（ＩＩ）および／または（ＩＩＩ）のアルファ−ケト酸のある特定の部位と反応する）、また立体特異的であり（２−（Ｓ）−アルファ−ヒドロキシケト酸が単独で入手される）；
−エナンチオマーを分離するステップを必要とせず；
−高収率（少なくとも５０％）で（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の化合物を生じ、
−副生成物の形成を低減し、場合によっては排除し；および／または
−穏やかな反応条件下で高い反応速度を提供する。

式（Ｉ）の化合物を調製するこの酵素的方法の別の利点は、当該技術分野で記載される化学合成により容易に入手可能でない標識された化合物の産生に帰する。

この方法は、植物、細菌、酵母または真菌ＡＨＡＳＩＩを使用してもよく、それらは、野生型であってもよく、組換えでもよく、遺伝子操作および突然変異されてもよい。

本発明のある実施形態では、アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩ（ＡＨＡＳＩＩ）は好適には、Ｂａｒ−Ｉｌａｎｅｔａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４０（２００１）１１９４６〜５４）で調製される大腸菌（ＷＴ）由来の野生型ＡＨＡＳアイソザイムＩＩである。本発明の別の実施形態では、ＡＨＡＳＩＩは好適には、Ｎ末端位内にタグを有する組換えＡＨＡＳアイソザイムＩＩである。

この方法では、反応のｐＨが、５から９、好ましくは６から７．８（端値を含む）であり得る。

式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）アルファ−ケト酸間の反応は、緩衝液の存在下で実施される。緩衝液が好適には、リン酸塩、詳細にはリン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム；マレイン酸水素ナトリウム、イミダゾール；３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）；トリエタノールアミン（ＴＥＡ）；３−［［１，３−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル］アミノ］−２−ヒドロキシプロパン−１−スルホン酸（ＴＡＰＳＯ）；２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）；ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）；およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）からなる群において選択される。

この方法では、反応混合物中の緩衝液の濃度が、０．０１Ｍ〜０．２５Ｍ（端値を含む）であり得る。

反応混合物中のアセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩ（ＡＨＡＳＩＩ）の濃度は、２００から７００μｇ／ｍｌの間、好ましくは３００から５００μｇ／ｍｌの間（端値を含む）であり得る。

この方法では、式（ＩＩ）のアルファ−ケト酸および式（ＩＩＩ）のアルファ−ケト酸のそれぞれの濃度が、２ｍＭから１００ｍＭの間、好ましくは５ｍＭから５０ｍＭの間（端値を含む）である。

好ましい実施形態では、式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）のアルファ−ケト酸が、化学量論量で存在する。

式（ＩＩ）のアルファ−ケト酸と式（ＩＩＩ）のアルファ−ケト酸との間の反応が、１５から４０℃の間、好ましくは２０から３０℃の間（端値を含む）の温度で実施され得る。

本発明による方法では、式（ＩＩ）のアルファ−ケト酸と式（ＩＩＩ）のアルファ−ケト酸との間の反応は、０から５０％ｖ／ｖの濃度の２−プロパノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびアセトアミドから選択される水混和性有機溶媒の存在下で実施され得る。

式（ＩＩ）のアルファ−ケト酸と式（ＩＩＩ）のアルファ−ケト酸との間の反応は、総濃度０から１５０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）のような酵素安定性を改善するための還元剤、１つまたは複数の緩衝塩の存在下で任意に実施され得る。

マグネシウムイオンは、カルシウム、バリウム、マンガン、亜鉛、コバルトおよびニッケルのような酵素を活性化することが可能である他の二価金属陽イオンで置き換えられてもよい。

続いて、過重水素化された発現培養液に添加されると、式（Ｉ）の化合物は、検出可能なスクランブリングを伴わずに細菌により標的タンパク質へ取り込まれる。

本発明はまた、本発明による（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の化合物を使用した、タンパク質および生体分子集合体におけるバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）およびイソロイシン（Ｉｌｅ）からなる群から選択されるアミノ酸の同位体標識のための、より詳細にはバリン、ロイシンおよびイソロイシンメチル基の特異的な標識のための方法に関する。

この方法は、検出可能なスクランブリングを伴わずに、タンパク質または所望のタンパク質を過剰発現する細菌を含有する培養培地における本発明による（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の化合物の添加による、タンパク質および生体分子集合体におけるイソロイシン、ロイシンおよびバリンアミノ酸におけるメチル基の効率的かつ立体特異的な標識を可能にする。細菌は、大腸菌であり得るが、これに限定されない。使用されるプロトコルは、例えば国際公開第２００１／０８３３５６号に記載されるものであってもよい。

本発明はまた、タンパク質および生体分子集合体をＮＭＲ分光法により分析するための方法であって、本発明による（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の化合物による、分析されるタンパク質および生体分子集合体におけるバリン、ロイシンおよびアミノ酸の同位体標識のステップを含む方法に関する。

したがって、式（Ｉ）の化合物は、バリン、ロイシンおよびイソロイシンアミノ酸を含有するタンパク質の構造的研究を実施することを可能にする。式（Ｉ）の化合物による標識は、３０ｋＤａ未満のタンパク質において０．０５Ｈｚ程度と低い弱い双極子およびスカラー相互作用を検出することを可能にする。

本発明はさらに、本発明による（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の１つまたは複数の化合物を含む、タンパク質および生体分子集合体におけるバリン、ロイシンおよびイソロイシンアミノ酸の同位体標識のための、詳細にはバリン、ロイシンおよびイソロイシンメチル基の同位体標識のためのキットに関する。

本発明の他の利点および特徴は、説明目的で付与される下記実施例および添付の図面と関連してより良好に理解され得る。

大腸菌のアセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩ（ＡＳＡＨＩＩ）による２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−エチル，３−オキソブタン酸イオンおよび２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−メチル，３−オキソブタン酸イオン（前駆体とも称される）の酵素合成を表す。ピルビン酸イオン分子の１つに由来する最終化合物の炭素原子を太字で示す。２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−エチル，３−オキソブタン酸塩（前駆体とも称される）の酵素合成を表す。左：時間の関数としてのＡＳＡＨＩＩの存在下でのオキソブタン酸塩／ピルビン酸塩の１：１混合物の一次元ＮＭＲスペクトルが表される。右：オキソブタン酸塩のメチル基および前駆体のデルタ−１位におけるメチル基の共鳴強度の時間の関数としての漸進的変化が表される。２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（２’−^１３Ｃ−１’−Ｄ_２）−エチル，３−オキソ−４−Ｄ_３−ブタン酸イオン（Ｉ）の合成を表す。上部パネル：（Ｕ−Ｄ）ピルビン酸イオンおよび４−^１３Ｃ−３−Ｄ_２−２−オキソブタン酸イオンの等モル混合物（左）およびＡＨＡＳＩＩの添加後の２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（２’−^１３Ｃ−１’−Ｄ_２）−エチル，３−オキソ−４−Ｄ_３−ブタン酸イオン（前駆体デルタ−１とも称される）（右）のＮＭＲスペクトルが表される。幾らかのアセト乳酸塩（１０％未満）が反応中に形成されるが、それらは重水素化されると観察不可能である。下部パネル：２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（２’−^１３Ｃ−１’−Ｄ_２）−エチル，３−オキソ−４−Ｄ_３−ブタン酸イオンの合成スキームが表される。^１３Ｃ標識された炭素原子を太字で表す。２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（Ｄ_５）エチル，３−オキソ，４−^１３Ｃ−オキソブタン酸イオンの合成を表す。上部パネル：（Ｕ−Ｄ）−２−オキソブタン酸イオンおよび３−^１３Ｃ−ピルビン酸イオンの等モル混合物（左）およびＡＨＡＳＩＩの添加後の最終生成物（２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（Ｄ_５）エチル，３−オキソ，４−^１３Ｃ−ブタン酸イオン）（右）のＮＭＲスペクトルが表される。１．３５および１．５７ｐｐｍのピークは、ピルビン酸イオンの水和形態に相当し（左）、１．３２および１．５５ｐｐｍのピークは、反応中に形成されるアセト乳酸塩に相当する（右）。下部パネル：２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（Ｄ_５）エチル，３−オキソ，４−^１３Ｃ−ブタン酸イオン（前駆体ガンマ−２とも称される）の合成スキームが表される。^１３Ｃ標識された炭素位置を太字で表す。２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（^１３Ｃ）メチル，３−オキソ，４−^１３Ｃ−ブタン酸イオンの合成を表す。上部パネル：３−^１３Ｃ−ピルビン酸イオン（左）およびＡＨＡＳＩＩの添加後の最終生成物（２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（^１３Ｃ）メチル，３−オキソ，４−^１３Ｃ−ブタン酸イオン）（右）のＮＭＲスペクトルが表される。１．３５および１．５７ｐｐｍのピークは、ピルビン酸イオンの水和形態に相当に相当する。下部パネル：２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（^１３Ｃ）メチル，３−オキソ，４−^１３Ｃ−ブタン酸イオン（アセト乳酸イオンとも称される）の合成スキームが表される。^１３Ｃ標識された炭素位置を太字で表す。２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（^１３Ｃ_２−１’−Ｄ_２）−エチル−３−オキソ−１，２，３−^１３Ｃ−４−Ｄ_３−ブタン酸イオンの合成を表す。上部パネル：（Ｕ−^１３Ｃ）−３−Ｄ_２−２−オキソブタン酸イオンおよび（Ｕ−Ｄ）−２−^１３Ｃ−ピルビン酸イオンの等モル混合物（左）およびＡＨＡＳＩＩの添加後の最終生成物（右）のＮＭＲスペクトルが表される。１．３５および１．５７ｐｐｍのピークは、ピルビン酸イオンの水和形態に相当し（左）、１．３２および１．５５ｐｐｍのピークは、反応中に形成されるアセト乳酸イオンに相当する（右）。下部パネル：２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（^１３Ｃ_２−１’−Ｄ_２）−エチル−３−オキソ−１，２，３−^１３Ｃ−４−Ｄ_３−ブタン酸イオンの合成の合成スキームが表される。^１３Ｃ標識された炭素位置を太字で表す。添加される外因性前駆体の量の関数としての過剰発現されるタンパク質における（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−エチル−３−オキソブタン酸塩の取込みのレベルを表す。ユビキチンは、２ｇ／ＬのＵ−［^２Ｈ］−グルコースを有するＭ９／Ｄ_２Ｏ培養培地中の大腸菌で発現された。（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−エチル−３−オキソブタン酸塩の取込みのレベル（四角）を、化学合成（Ａｙａｌａｅｔａｌ、２０１２、ＣｈｅｍＣｏｍｍｕｎ、４８（１０）：１４３４〜６）により得られるラセミ２−ヒドロキシ−２−［^２Ｈ５］エチル−［１，２，３，４−^１３Ｃ４］−３−オキソブタン酸塩の取込みのレベル（黒丸）と比較する。定量化は、イソロイシンガンマ−２メチル基に相当するシグナルの強度を、メチオニンのイプシロンメチル基のシグナルに関して比較することにより実施した。９５％のＩｌｅ側鎖における取込みのレベルは、化学合成した前駆体に関して１リットル当たり１００ｍｇ以上と比較して、Ｍ９／Ｄ_２Ｏ培養培地１リットル当たり（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−エチル−３−オキソブタン酸塩約５０ｍｇを添加することにより得られる。標識されたアラニンおよび２−オキソブタン酸塩の存在下（上部パネル）、または標識されたアラニンおよび上述のプロトコルを使用して合成される前駆体の存在下（下部パネル）のいずれかで大腸菌で産生されるユビキチンの^１３Ｃ−ＨＳＱＣスペクトルを表す。スペクトルは、点線領域内（ここでは、スペクトルは１％でプロットされる）を除いてイソロイシンアミノ酸の共鳴の最大強度の１０％でプロットされる。Ｇｏｄｏｙ−Ｒｕｉｚｅｔａｌ．（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０１０、１３２（５１）、ｐ．１８３４０〜５０）のプロトコルを使用することにより、１．５〜２％のイソロイシンのガンマ−２メチル基の人為的な標識が導かれ（上部パネル）、その標識は、培養液に関して本発明者らの前駆体を使用する場合には、総合的に抑制される（下部パネル）。実施例で記載するような本発明者の標識プロトコルに習って産生されたユビキチンの^１３Ｃ−ＨＳＱＣスペクトル（メチル領域）を表す。ロイシンおよびバリンのｐｒｏＳメチル基ならびにイソロイシンアミノ酸のデルタ−１メチル基のみが標識されていることが観察され得る。他のメチル位への漏出は観察されない。

材料および手順
使用する化合物は市販されている：（Ｄ_５）−２−オキソブタン酸塩に関しては、ＣＤＮＩｓｏｔｏｐｅｓＩｎｃ．、４−（^１３Ｃ）−２−オキソブタン酸塩、３−^１３Ｃ−ピルビン酸塩、２−^１３Ｃ−ピルビン酸塩、ピルビン酸塩に関しては、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、およびＵ−（^１３Ｃ）−２−オキソブタン酸塩に関しては、ＣａｍｂｒｉｄｇｅＩｓｏｔｏｐｅｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。ＡＨＡＳＩＩの２つのサブユニットをコードする配列を保有するプラスミドは、ＤａｖｉｄＣｈｉｐｍａｎ博士（ネゲブのベングリオン大学）によりご厚意により提供された。

^１Ｈおよび^１３Ｃ一次元ＮＭＲスペクトルはすべて、極低温三重共鳴パルス磁場勾配プローブヘッドを装備したプロトン周波数６００ＭＨｚで作動するＶａｒｉａｎＤｉｒｅｃｔＤｒｉｖｅ分光計で記録した。

標識されたタンパク質の二次元^１Ｈ−^１３ＣＨＭＱＣは、直接的な次元における１２８８個（／７８０）の複素数データ点（最大値ｔ_２＝９９ｍｓ）（／６０ｍｓ））および炭素次元における５１２個（／３８０）の点（最大値ｔ_１＝１２８ｍｓ）（／４７ｍｓ））で記録された。

１’アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩ（ＡＨＡＳＩＩ）の調製
ＡＨＡＳＩＩの過剰発現および精製は、Ｈｉｌｌｅｔａｌ．（ＢｉｏｃｈｅｍＪ．１９９７）の方法に従って行われた。過剰発現されたＡＨＡＳＩＩのプラスミドを保有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地中で３７℃で成長させた。

６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）または吸光度が０．５〜０．７に達した際に、最終濃度０．４ｍＭになるようにイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することより、ＡＨＡＳＩＩ発現を誘発させた。発現は、２０℃で１２時間実施した。４℃で１５分間、５０００ｇでの遠心分離により、細菌を収集して、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ０．１ＭｐＨ７．５１０ｍｌ中に再懸濁させて、４℃で１５分間、４０００ｇで遠心分離した。細菌を緩衝液（緩衝液Ａ：ＴＲＩＳ５０ｍＭｐＨ８、ＫＣｌ０．５Ｍ、イミダゾール１０ｍＭおよびＦＡＤ２０μＭ）１０ｍｌ中に再懸濁させた。２分間の超音波処理により、細胞を崩壊させて、４℃で４５分間、４５，０００ｇで超遠心分離により、不溶性物質を除去した。

次に、緩衝液Ａで平衡化したＮｉＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎから入手）上に上清を置いた（deposed）。５倍容量の緩衝液Ａでカラムを洗浄した後、緩衝液Ｂ（緩衝液Ｂ：ＴＲＩＳ５０ｍＭｐＨ８、ＫＣｌ０．５Ｍ、イミダゾール４００ｍＭおよびＦＡＤ２０μＭ）を使用して、ＡＨＡＳＩＩを溶出させた。ＡＨＡＳＩＩを含有する分画をプールして、濃縮して、脱イオン水に対して透析して、凍結乾燥させた。ＡＨＡＳＩＩの活性は、３３３ｎｍでピルビン酸塩の吸光度の減少を測定することにより決定した。

^１３Ｃおよび^２Ｈ（Ｄ）標識された２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−エチル，３−オキソ，４−ブタン酸塩および２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−メチル，３−オキソ，４−ブタン酸塩の合成
本発明による２つの化合物であるＤおよび^１３Ｃで標識された２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−エチル，３−オキソ，４−ブタン酸塩および２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−メチル，３−オキソ，４−ブタン酸塩の合成は、芳香族アルファ−ヒドロキシケトンのキラル合成に関するＤ．Ｃｈｉｐｍａｎ氏により記載されるプロトコル（ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌＢｉｏｅｎｇ．２００４８８（７）：８２５〜３１および米国特許第２００６／０１４８０４２号）に従って実施した。

^１３Ｃおよび^２Ｈ標識された化合物の合成は、^１３Ｃおよび^２Ｈ（Ｄ）標識されたピルビン酸塩および２−オキソブタン酸塩の等モル混合物中で、上述のように精製したＡＨＡＳＩＩの分割量を添加することにより行った。反応は、^１ＨＮＭＲスペクトル（一次元）によりモニタリングして、ピルビン酸塩と２−オキソブタン酸塩との縮合は、図２で示されるように２時間で完了した。^１３Ｃおよび^２Ｈにより異なって標識された試薬を使用して、多数の式（Ｉ）の化合物を酵素的に合成できた。

Ａ．２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（２’−^１３Ｃ−１’−Ｄ_２）−エチル，３−オキソ−４−Ｄ_３−ブタン酸塩（前駆体デルタ−１）の合成。

３３ｍＭの（Ｕ−Ｄ）ピルビン酸塩（ｐＨ１０．７で７２時間、Ｄ_２Ｏ中での標識されていないピルビン酸塩の処理により過重水素化した）を、Ｄ_２Ｏ緩衝液（リン酸カリウム５０ｍＭｐＨ７．８、ＭｇＣｌ_２１０ｍＭ、チアミン二リン酸１ｍＭ、ＦＡＤ２０ｍＭ）３ｍｌ中で３３ｍＭの４−^１３Ｃ，３−Ｄ_２−２−オキソブタン酸塩と混合させた。

反応は、６ｍＭ（４２０ｍｇ／ｍｌ）のＡＨＡＳＩＩの添加により開始して、続いて^１ＨＮＭＲ（一次元）を行った。初期および最終化合物の^１ＨＮＭＲスペクトルを図３に表す。

Ｂ．２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（Ｄ_５）エチル，３−オキソ，４−^１３Ｃ−ブタン酸塩（前駆体ガンマ−２）の合成
３３ｍＭの３−^１３Ｃ−ピルビン酸塩を、Ｄ_２Ｏ緩衝液（リン酸カリウム５０ｍＭｐＨ７．８、ＭｇＣｌ_２１０ｍＭ、チアミン二リン酸１ｍＭ、ＦＡＤ２０ｍＭ）３ｍｌ中で同濃度のＤ_５−２−オキソブタン酸塩と混合させた。

反応は、６ｍＭ（４２０ｍｇ／ｍｌ）のＡＨＡＳＩＩの添加により開始して、続いて^１ＨＮＭＲ（一次元）を行った。初期および最終化合物の^１ＨＮＭＲスペクトルを図４に表す。

Ｃ．２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（^１３Ｃ）メチル，３−オキソ，４−（^１３ＣＤ_３）−ブタン酸塩（アセト乳酸塩）の合成
６６ｍＭの３−^１３Ｃ−ピルビン酸塩を、Ｄ_２Ｏ緩衝液（リン酸カリウム５０ｍＭｐＨ７．８、ＭｇＣｌ_２１０ｍＭ、チアミン二リン酸１ｍＭ、ＦＡＤ２０ｍＭ）３ｍｌ中に溶解させた。

反応は、６ｍＭ（４２０ｍｇ／ｍｌ）のＡＨＡＳＩＩの添加により開始して、続いて^１ＨＮＭＲ（一次元）を行った。ピルビン酸イオンおよび最終化合物（２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（^１３Ｃ）メチル，３−オキソ，４−（^１３ＣＤ_３）−ブタン酸イオン）の^１ＨＮＭＲスペクトルを図５に示す。４位での重水素化は、Ｐ．Ｇａｎｓｅｔａｌ．（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、２０１０、４９、１９５８〜１９６２）により記載されるように、^１Ｈ／^２Ｈ（Ｄ）交換により遂行される。

Ｄ．２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（^１３Ｃ_２−１’−Ｄ_２）−エチル−３−オキソ−１，２，３−^１３Ｃ−４−Ｄ_３−ブタン酸塩の合成
３３ｍＭのＵ−Ｄ，２−^１３Ｃ−ピルビン酸塩を、Ｄ_２Ｏ緩衝液（リン酸カリウム５０ｍＭｐＨ７．８、ＭｇＣｌ_２１０ｍＭ、チアミン二リン酸１ｍＭ、ＦＡＤ２０ｍＭ）３ｍｌ中で同濃度でのＵ−^１３Ｃ，３−Ｄ_２−２−オキソブタン酸塩と混合させた。

反応は、６ｍＭ（４２０ｍｇ／ｍｌ）のＡＨＡＳＩＩの添加により開始して、続いて^１ＨＮＭＲ（一次元）を行った。初期および最終化合物の^１ＨＮＭＲスペクトルを図５ａに示す。

過剰発現されたタンパク質における（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−エチル−３−オキソブタン酸塩の取込みの最適化。

過剰発現されたタンパク質への（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−エチル−３−オキソブタン酸塩取込みのレベルを決定するための初期実験は、モデル系としてユビキチンを使用して実施した。

大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、Ｈｉｓでタグ付したヒトのユビキチン遺伝子を保有するｐＥＴ４１ｃプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎから入手）（ｐＥＴ４１ｃ−Ｈｉｓ−Ｕｂｉ）で形質転換して、形質転換体を、１ｇ／Ｌの^１５ＮＤ_４Ｃｌおよび２ｇ／ＬのＵ−［^２Ｈ］−グルコースを含有するＭ９／Ｄ_２Ｏ培地中で成長させた。

６００ｎｍでの光学密度または吸光度が０．８に達した際に、標識された２−ヒドロキシ−２−エチル−３−オキソブタン酸塩を含有する溶液を添加した。さらに１時間後、最終濃度１ｍＭになるようにβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより、ユビキチン発現を誘発させた。誘発は、３７℃で３時間実施した。ユビキチンを、単一ステップでＮｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎから入手）クロマトグラフィーカラムにより精製した。

過剰発現されたタンパク質におけるほぼ完全な取込みを達成するのに必要とされる２−ヒドロキシ−２−エチル−３−オキソブタン酸塩の最適な量は、２００ｍｇ／ｍＬのＵ−［^１３Ｃ］−メチオニンと一緒に１５、３０、６０、８０および１００ｍｇ／Ｌの最終濃度になるように、種々の量の標識された前駆体が誘発の１時間前に添加された一連の培養物（それぞれ１００ｍＬ）中で評価した。精製タンパク質への取込みのレベルは、^１３Ｃ−ＨＳＱＣＮＭＲによりモニタリングした。定量化は、Ｍｅｔのイプシロンメチル基のシグナルに関して、Ｉｌｅメチル基に相当するシグナルの積算を比較することにより実施した。

Ｍ９／Ｄ_２Ｏ培養培地１リットル当たり約５０ｍｇの純粋な（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−エチル−３−オキソブタン酸塩の添加により、Ｉｌｅ側鎖における９５％の取込みレベルが達成される（図６）。

Ｕ−［^２Ｈ］，Ｕ−［^１５Ｎ］，Ｉｌｅ−ｄ１−［^１３Ｃ^１Ｈ_３］タンパク質の産生。

Ｈｉｓでタグ付したヒトのユビキチン遺伝子を保有するｐＥＴ４１ｃプラスミド（ｐＥＴ４１ｃ−Ｈｉｓ−Ｕｂｉ）で形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、１ｇ／Ｌの^１５ＮＤ_４Ｃｌおよび２ｇ／ＬのＤ−グルコース−ｄ_７（Ｉｓｏｔｅｃから入手）を含有するＭ９／Ｄ_２Ｏ培地に、三段階で２４時間かけて徐々に適合させた。最終的な培養では、細菌を、９９．８５％のＤ_２Ｏ（Ｅｕｒｉｓｏｔｏｐから入手）を用いて調製したＭ９培地中で３７℃で成長させた。

６００ｎｍでの光学密度または吸光度が０．８に達した際に、（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−［２’−^１３Ｃ，１’−Ｄ_２］エチル，［４−Ｄ_３］−３−オキソ−ブタン酸塩（実施例２−Ａに記載するプロトコルに従って調製）および２−オキソイソ吉草酸−ｄ_７を含有する溶液を、それぞれ６５ｍｇ／Ｌおよび２００ｍｇ／Ｌの最終濃度になるように培養培地に添加した。１時間後、最終濃度１ｍＭになるようにイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより、ユビキチン発現を誘発させた。発現を３７℃で３時間実施した後、収集した。ユビキチンを、単一ステップでＮｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎから入手）カラムクロマトグラフィーにより精製した。

^１３Ｃスペクトルを、プロトン周波数６００ＭＨｚで作動するＮＭＲ分光計でＤ_２Ｏ中で３７℃で記録した。デルタ−１イソロイシンメチル炭素に関する唯一のシグナルが、^１３Ｃスペクトルで観察され、（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−［２−^１３Ｃ，１−Ｄ_２］エチル，［４−Ｄ_３］−３−オキソ−ブタン酸塩の^１３Ｃ^１Ｈ_３基が、他のアミノ酸の代謝経路に取り込まれないことを示した。イソロイシンアミノ酸のデルタ−１位における^１３ＣＨ_３基の取込みレベルは、標識されたタンパク質の二次元^１Ｈ−^１３ＣＨＭＱＣで観察されるＮＭＲシグナルの積算に基づいて９５％よりも高いと推定された。

Ｕ−［^２Ｈ］，Ｕ−［^１５Ｎ］，Ｉｌｅ−ｇ２−［^１３Ｃ^１Ｈ_３］タンパク質の産生。

６００ｎｍでの光学密度または吸光度が０．８に達した際に、２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（Ｄ_５）エチル，３−オキソ，４−^１３Ｃ−ブタン酸塩（実施例２−Ｂに記載するプロトコルに従って調製）および２−オキソイソ吉草酸−ｄ_７を含有する溶液を、それぞれ６５ｍｇ／Ｌおよび２００ｍｇ／Ｌの最終濃度になるように培養培地に添加した。１時間後、最終濃度１ｍＭになるようにイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより、ユビキチン発現を誘発させた。発現を３７℃で３時間実施した後、収集した。ユビキチンを、単一ステップでＮｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎから入手）カラムクロマトグラフィーにより精製した。

^１３Ｃスペクトルを、プロトン周波数６００ＭＨｚで作動するＮＭＲ分光計でＤ_２Ｏ中で３７℃で記録した。イソロイシンのガンマ−２メチル炭素に関する唯一のシグナルが、^１３Ｃスペクトルで観察され、２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（Ｄ_５）エチル，３−オキソ，４−^１３Ｃ−ブタン酸塩の^１３Ｃ^１Ｈ_３基が、他のアミノ酸の代謝経路に取り込まれないことを示した。イソロイシンのガンマ−２位における^１３ＣＨ_３基の取込みレベルは、標識されたタンパク質の二次元^１Ｈ−^１３ＣＨＭＱＣで観察されるＮＭＲシグナルの積算に基づいて９５％よりも高いと推定された。

Ｇｏｄｏｙ−Ｒｕｉｚｅｔａｌ．（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０１０、１３２、１８３４０〜１８３５０頁）のプロトコルを使用したＵ−［^２Ｈ］，Ｕ−［^１５Ｎ］，Ａｌａ−ベータ［^１３Ｃ^１Ｈ_３］，Ｉｌｅ−デルタ−１−［^１３Ｃ^１Ｈ_３］タンパク質の産生
Ｈｉｓでタグ付したヒトのユビキチン遺伝子を保有するｐＥＴ４１ｃプラスミド（ｐＥＴ４１ｃ−Ｈｉｓ−Ｕｂｉ）で形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、１ｇ／Ｌの^１５ＮＤ_４Ｃｌおよび２ｇ／ＬのＤ−グルコース−ｄ_７（Ｉｓｏｔｅｃから入手）を含有するＭ９／Ｄ_２Ｏ培地に、三段階で２４時間かけて徐々に適合させた。最終的な培養では、細菌を、９９．８５％のＤ_２Ｏ（Ｅｕｒｉｓｏｔｏｐから入手）、２．５ｇ／Ｌのコハク酸塩−ｄ_５（Ｉｓｏｔｅｃから入手）を用いて調製したＭ９培地中で３７℃で成長させた。

６００ｎｍでの光学密度または吸光度が０．８に達した際に、^１３ＣＨ_３−アラニン，４−^１３Ｃ−２−ケト酪酸および２−ケトイソ吉草酸−ｄ_７を含有する溶液を、それぞれ８００、７５および２００ｍｇ／Ｌの最終濃度になるように培養培地に添加した。スペクトルを簡素化して、重複を回避するために、元のプロトコルからの４−^１３Ｃ，３−メチル（^２Ｈ_３）−２−ケトイソ吉草酸を、前駆体の過重水素化形態で置換したことに留意されたい。１時間後、最終濃度１ｍＭになるようにイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより、ユビキチン発現を誘発させた。発現を３７℃で３時間実施した後、収集した。ユビキチンを、単一ステップでＮｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎから入手）カラムクロマトグラフィーにより精製した。

^１３Ｃスペクトルを、プロトン周波数６００ＭＨｚで作動するＮＭＲ分光計でＤ_２Ｏ中で３７℃で記録した。アラニン、およびイソロイシンのデルタ−１メチル炭素に関するシグナルが、^１３Ｃスペクトルで観察されたが、イソロイシンの共鳴ガンマ−２メチル炭素に相当する疑似ピークも観察された。イソロイシンのガンマ−２メチル炭素における同位体スクランブリングのレベルは、図７に示されるように１．５〜２％であると推定された。イソロイシンのデルタ−１位およびアラニンのベータ位における^１３ＣＨ_３基の取込みレベルは、標識されたタンパク質の二次元^１Ｈ−^１３ＣＨＭＱＣで観察されるＮＭＲシグナルの積算に基づいて９５％よりも高いと推定された。

Ｕ−［^２Ｈ］，Ｕ−［^１５Ｎ］，Ａｌａ−ベータ［^１３Ｃ^１Ｈ_３］，Ｉｌｅ−デルタ−１−［^１３Ｃ^１Ｈ_３］，Ｌｅｕ／Ｖａｌ−［^１３Ｃ^１Ｈ_３］ｐｒｏＳタンパク質の産生
Ｈｉｓでタグ付したヒトのユビキチン遺伝子を保有するｐＥＴ４１ｃプラスミド（ｐＥＴ４１ｃ−Ｈｉｓ−Ｕｂｉ）で形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、１ｇ／Ｌの^１５ＮＤ_４Ｃｌおよび２ｇ／ＬのＤ−グルコース−ｄ_７（Ｉｓｏｔｅｃから入手）を含有するＭ９／Ｄ_２Ｏ培地に、三段階で２４時間かけて徐々に適合させた。最終的な培養では、細菌を、９９．８５％のＤ_２Ｏ（Ｅｕｒｉｓｏｔｏｐから入手）を用いて調製したＭ９培地中で３７℃で成長させた。

６００ｎｍでの光学密度または吸光度が０．８に達した際に、^１３ＣＨ_３−アラニン，２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（２’−^１３Ｃ−１’−Ｄ_２）−エチル，３−オキソ−４−Ｄ_３−ブタン酸塩および２−ヒドロキシ，２−（^１３Ｃ）メチル，３−オキソ，４−（^１３ＣＤ_３）−ブタン酸塩前駆体を含有する溶液を、それぞれ８００ｍｇ／Ｌ、６５ｍｇ／Ｌ、４００ｍｇ／Ｌの最終濃度になるように培養培地に添加した。

２−（Ｓ）−２−ヒドロキシ，２−（^１３Ｃ）メチル，３−オキソ，４−（^１３ＣＤ_３）−ブタン酸塩前駆体（実施例２−Ｃに記載するように酵素的に調製）を使用する場合、最終化合物の量は、４００ｍｇ／Ｌに代わって２００ｍｇ／Ｌに低減させることができる。１時間後、最終濃度１ｍＭになるようにイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより、ユビキチン発現を誘発させた。発現を３７℃で３時間実施した後、収集した。ユビキチンを、単一ステップでＮｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎから入手）カラムクロマトグラフィーにより精製した。

^１３Ｃスペクトルを、プロトン周波数６００ＭＨｚで作動するＮＭＲ分光計でＤ_２Ｏ中で３７℃で記録した。イソロイシンメチル炭素のガンマ−２の共鳴に相当する検出可能な疑似ピークを伴わずに、Ａｌａ、Ｉｌｅ−デルタ−１、Ｌｅｕ／Ｖａｌ−ｐｒｏＳメチル炭素に関するシグナルが、^１３Ｃスペクトルで観察された。イソロイシンのガンマ−２位、Ｌｅｕ／Ｖａｌ−ｐｒｏＳおよびＡｌａのベータ位における^１３ＣＨ_３基の取込みレベルは、標識されたタンパク質の二次元^１Ｈ−^１３ＣＨＭＱＣで観察されるＮＭＲシグナルの積算に基づいて９５％よりも高いと推定された。

したがって、図７に示すように、上述のプロトコルを使用することにより、標識の人為的結果、即ち構造決定（ＮＯＥ）に関して必要とされるデータを収集することを妨げるイソロイシンのガンマ−２メチル基の残留標識が抑制されることは明らかである。

Claims

（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）：

（式中、
−Ｘ^１およびＸ^２は互いに独立して、^１Ｈ（Ｈ）または^２Ｈ（Ｄ）であり、
−Ｙ^１、Ｙ^２およびＹ^３は互いに独立して、^１２Ｃ（Ｃ）または^１３Ｃであり、
−Ｒ^１は、メチル基（ここで、炭素原子は^１２Ｃ（Ｃ）または^１３Ｃであり、水素原子は互いに独立して、^１Ｈ（Ｈ）または^２Ｈ（Ｄ）である）であり、
−Ｒ^２は、メチル基（ここで、炭素原子は^１２Ｃ（Ｃ）または^１３Ｃであり、水素原子は互いに独立して、^１Ｈ（Ｈ）または^２Ｈ（Ｄ）である）であるか、または
−Ｒ^２は、エチル基（ここで、炭素原子は互いに独立して、^１２Ｃ（Ｃ）または^１３Ｃであり、水素原子は互いに独立して、^１Ｈ（Ｈ）または^２Ｈ（Ｄ）である）である）
の化合物であるが、但し、式（Ｉ）の化合物において、同時に、少なくとも１つの水素原子が^２Ｈ（Ｄ）であり、少なくとも１つの炭素原子が^１３Ｃである化合物。
−Ｒ^１が、ＣＤ_３、^１３ＣＨ_３、^１３ＣＨ_２Ｄおよび^１３ＣＨＤ_２からなる群から選択され、
−Ｒ^２が、^１３ＣＤ_３からなる群から選択されるメチル基であるか、または
−Ｒ^２が、ＣＤ_３−ＣＤ_２、 ^１３ＣＨ_３−ＣＤ_２、ＣＨ_３−^１３ＣＤ_２、^１３ＣＨＤ_２−ＣＤ_２、^１３ＣＨＤ_２−^１３ＣＤ_２、^１３ＣＨ_２Ｄ−ＣＤ_２、^１３ＣＨ_２Ｄ−^１３ＣＤ_２および^１３ＣＨ_３−^１３ＣＤ_２からなる群から選択されるエチル基である、請求項１に記載の化合物。
Ｙ^１＝Ｙ^２＝Ｙ^３＝Ｃである、請求項１または２に記載の化合物。
Ｙ^１＝Ｙ^２＝Ｙ^３＝^１３Ｃである、請求項１または２に記載の化合物。
・（Ｓ）−２−（１’−^２Ｈ_２，２’−^１３Ｃ）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸｛Ｘ^１＝Ｘ^２＝Ｈ；Ｙ^１＝Ｙ^２＝Ｙ^３＝Ｃ；Ｒ^１＝ＣＤ_３；Ｒ^２＝^１３ＣＨ_３−ＣＤ_２｝、
・（Ｓ）−２−（１’−^２Ｈ_２，２’−^２Ｈ，２’−^１３Ｃ）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸｛Ｘ^１＝Ｘ^２＝Ｈ；Ｙ^１＝Ｙ^２＝Ｙ^３＝Ｃ；Ｒ^１＝ＣＤ_３；Ｒ^２＝^１３ＣＨ_２Ｄ−ＣＤ_２｝、
・（Ｓ）−２−（１’−^２Ｈ_２，２’−^２Ｈ_２，２’−^１３Ｃ，）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸｛Ｘ^１＝Ｘ^２＝Ｈ；Ｙ^１＝Ｙ^２＝Ｙ^３＝Ｃ；Ｒ^１＝ＣＤ_３；Ｒ^２＝^１３ＣＨＤ_２−ＣＤ_２｝、
・（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−（^２Ｈ_３，^１３Ｃ）メチル−３−オキソ−４−（^１３Ｃ）ブタン酸｛Ｘ^１＝Ｘ^２＝Ｈ；Ｙ^１＝Ｙ^２＝Ｙ^３＝Ｃ；Ｒ^１＝^１３ＣＨ_３；Ｒ^２＝^１３ＣＤ_３｝、
・（Ｓ）−２−（^２Ｈ_５）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^１３Ｃ）メチルブタン酸｛Ｘ^１＝Ｘ^２＝Ｈ；Ｙ^１＝Ｙ^２＝Ｙ^３＝Ｃ；Ｒ^１＝^１３ＣＨ_３；Ｒ^２＝ＣＤ_３−ＣＤ_２｝
からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
・（Ｓ）−１，２，３−（^１３Ｃ）−２−（１’−^２Ｈ_２，^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸｛Ｘ^１＝Ｘ^２＝Ｈ；Ｙ^１＝Ｙ^２＝Ｙ^３＝^１３Ｃ；Ｒ^１＝ＣＤ_３；Ｒ^２＝^１３ＣＨ_３−^１３ＣＤ_２｝、
・（Ｓ）−１，２，３−（^１３Ｃ）−２−（１’−^２Ｈ_２，２’−^２Ｈ，^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸｛Ｘ^１＝Ｘ^２＝Ｈ；Ｙ^１＝Ｙ^２＝Ｙ^３＝^１３Ｃ；Ｒ^１＝ＣＤ_３；Ｒ^２＝^１３ＣＨ_２Ｄ−^１３ＣＤ_２｝、
・（Ｓ）−１，２，３−（^１３Ｃ）−２−（１’−^２Ｈ_２，２’−^２Ｈ_２，^１３Ｃ_２）エチル−２−ヒドロキシ−３−オキソ−４−（^２Ｈ_３）ブタン酸｛Ｘ^１＝Ｘ^２＝Ｈ；Ｙ^１＝Ｙ^２＝Ｙ^３＝^１３Ｃ；Ｒ^１＝ＣＤ_３；Ｒ^２＝^１３ＣＨＤ_２−^１３ＣＤ_２｝
からなる群から選択される、請求項１、２または４のいずれか一項に記載の化合物。
請求項１〜６のいずれか一項に記載の（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の化合物を調製するための方法であって、式（ＩＩ）

のアルファ−ケト酸を、アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩ（ＡＨＡＳＩＩ）、補酵素チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）、酸化還元補因子フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、マグネシウム塩および緩衝液の存在下で式（ＩＩＩ）

（式中、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｙ^１、Ｙ^２、Ｙ^３、Ｒ^１およびＲ^２は、請求項１〜６のいずれか一項において式（Ｉ）に関して定義される意味を有する）
のアルファ−ケト酸と反応させること
を含む方法。
反応のｐＨが、５から９、好ましくは６から７．８（端値を含む）である、請求項７に記載の方法。
緩衝液が、リン酸塩、詳細にはリン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム；マレイン酸水素ナトリウム、イミダゾール；３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）；トリエタノールアミン（ＴＥＡ）；３−［［１，３−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル］アミノ］−２−ヒドロキシプロパン−１−スルホン酸（ＴＡＰＳＯ）；２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）；ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）；およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）からなる群において選択される、請求項７または８に記載の方法。
反応混合物中の緩衝液の濃度が、０．０１Ｍから０．２５Ｍ（端値を含む）の間である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
反応混合物中のアセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩ（ＡＨＡＳＩＩ）の濃度が、２００から７００μｇ／ｍｌの間、好ましくは３００から５００μｇ／ｍｌの間（端値を含む）である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
反応混合物中の式（ＩＩ）のアルファ−ケト酸および式（ＩＩＩ）のアルファ−ケト酸のそれぞれの濃度が、２ｍＭから１００ｍＭの間、好ましくは５ｍＭから５０ｍＭの間（端値を含む）である、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の方法。
反応が、１５〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃の温度で実施される、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
請求項１〜６のいずれか一項に記載の（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の化合物を使用した、タンパク質および生体分子集合体におけるバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）およびイソロイシン（Ｉｌｅ）からなる群から選択されるアミノ酸の同位体標識のための、より詳細にはバリン、ロイシンおよびイソロイシンメチル基の特異的な標識のための方法。
タンパク質および生体分子集合体をＮＭＲ分光法により分析するための方法であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載の（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の化合物による、分析されるタンパク質および生体分子集合体におけるバリン、ロイシンおよびイソロイシンアミノ酸の同位体標識のステップを含む方法。
請求項１〜６のいずれか一項に記載の（Ｓ）立体配置を有する式（Ｉ）の１つまたは複数の化合物を含む、タンパク質および生体分子集合体におけるバリン、ロイシンおよびイソロイシンアミノ酸の同位体標識のためのキット。