JP2015524339A - アスコルビン酸溶出型埋め込み型医療機器、システム、および関連方法 - Google Patents

Abstract

埋め込み型医療機器が、平滑筋細胞の成長を阻害しながら、内皮細胞の成長を促進する薬剤を溶出し得る。場合によっては、埋め込み型医療機器は、Ｌ−アスコルビン酸、またはビタミンＣを溶出し得る。場合によっては、Ｌ−アスコルビン酸を溶出するように構成される埋め込み型医療機器は、ステントであり得るが、様々な他の埋め込み型医療機器が考えられる。【選択図】図３

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年８月６日に出願され、「Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ−Ｅｌｕｔｉｎｇ Ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅｓ」という発明の名称の米国仮特許出願第６１／６７９，９５８号の優先権を主張し、２０１３年６月１２日に出願され、「Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ −Ｅｌｕｔｉｎｇ Ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｙｓｔｅｍｓ，ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ」という発明の名称の米国仮特許出願第６１／８３４，１７９号の優先権をさらに主張するものであり、これらの仮出願は両方とも、全体が参照により本明細書に援用される。

本出願は、一般に、埋め込み型医療機器に関し、より特定的には、アスコルビン酸などの治療剤を溶出する埋め込み型医療機器に関する。

冠動脈疾患（ＣＡＤ）は、米国における男性および女性の両方の主な死因である。この疾患は、アテローム性動脈硬化症によって引き起こされ、アテローム性動脈硬化症は、アテローム性動脈硬化プラークの蓄積により動脈が狭窄したときに起こる病態である。経皮経管冠動脈形成（ＰＴＣＡ）は、ＣＡＤに起因する閉塞冠動脈を開くためによく行われる。しかしながら、ＰＴＣＡ後の再狭窄（動脈の再狭窄）が大きな課題であり、患者の３０〜４０％で２回目の血管再生術が必要とされた。金属ステントの埋め込みは、狭窄動脈を再開通させ、血管のリコイル（ｖｅｓｓｅｌ ｒｅｃｏｉｌ）および陰性リモデリング（血管収縮）をなくす足場を提供した。しかしながら、新生内膜（新しい組織）形成によるステント内再狭窄は、依然として大きな問題である。局所的送達のために抗増殖剤（例えば、パクリタキセルおよび／またはシロリムスなど）を放出する薬剤溶出型ステントが、ステントの進化の主な進展である。抗増殖剤は、平滑筋細胞の成長を阻害し、それによって、ステント内再狭窄を阻害する。しかしながら、場合によっては、薬剤溶出型ステントを有する患者に遅発性ステント血栓症が生じた。遅発性ステント血栓症は、動脈における１つ以上の血栓の形成である。

場合によっては、ステントから放出された抗増殖剤は、再内皮化を遅らせるかまたは害することがあり、この障害が、遅発性ステント血栓症の主な要因であると考えられる。市場にあるほとんどの薬剤溶出型ステントは、新生内膜過形成を治療するための抗増殖剤で被覆されている。これらの抗増殖剤は、細胞特異的でないため；これらの薬剤は、平滑筋細胞の成長を阻害するだけでなく、内皮細胞の成長も阻害する。

ＦＤＡに認可された薬剤溶出型ステントが埋め込まれたヒトの冠動脈の剖検調査により、遅発性ステント血栓症の合併症が、支柱の不完全な内皮被覆と関連していることが示唆されている。調査により、ステント移植の１４日後に、ウサギの腸骨動脈におけるベアメタルステント、シロリムス溶出型ステント、およびパクリタキセル溶出型ステントの内皮化を比較した。不十分な内皮化（支柱が内皮化されなかった）が、抗増殖剤放出ステントの両方で観察され、これが、遅発性ステント血栓症を招く可能性があり得る。内皮細胞の内張り（ｌｉｎｉｎｇ）により、血小板の付着および凝集が防がれ、それによって、遅発性ステント血栓症が阻害されるため、ステント表面の再内皮化は、その長期的な成功のために不可欠である。したがって、平滑筋細胞の成長を阻害しながら、内皮細胞の成長を促進する薬剤を送達する必要性がある。

埋め込み型医療機器が、平滑筋細胞の成長を阻害しながら、内皮細胞の成長を促進する薬剤を溶出し得る。ある実施形態において、埋め込み型医療機器は、Ｌ−アスコルビン酸、またはビタミンＣを溶出し得る。ある実施形態において、Ｌ−アスコルビン酸を溶出するように構成される埋め込み型医療機器は、ステントであり得るが、様々な他の埋め込み型医療機器が考えられる。

複数の実施形態が開示されているが、本発明のさらに他の実施形態が、本発明の例示的な実施形態を示し、説明する以下の詳細な説明から当業者に明らかになるであろう。理解されるように、本発明は、様々な明白な態様において変更が可能であり、これらは全て本発明の趣旨および範囲から逸脱しない。したがって、図面および詳細な説明は、限定ではなく、本質的に例示としてみなされるものである。

本開示の実施形態に係る埋め込み型医療機器の概略図である。 本開示の実施形態に係る水酸化Ｃｏ−Ｃｒ合金表面の概略図である。 本開示の実施形態に係る水酸化Ｃｏ−Ｃｒ合金表面におけるＬ−ＡＡコーティングの概略図である。 実施例１に記載される１日目、３日目、５日目、および７日目におけるＦＤＡで染色された内皮細胞の蛍光顕微鏡画像を提供する。 実施例２に記載されるレザズリン蛍光アッセイのグラフ表示である。 図６Ａは、実施例３に記載される接触角データのグラフ表示である。図６Ｂ−１は、実施例３に記載される、コーティングなしの対照Ｃｏ−Ｃｒ合金表面の接触角画像を提供する。図６Ｂ−２は、実施例３に記載される、ＰＡで被覆されたＣｏ−Ｃｒ合金表面の接触角画像を提供する。図６Ｂ−３は、実施例３に記載される、Ｌ−ＡＡで被覆されたＣｏ−Ｃｒ合金表面の接触角画像を提供する。 図７Ａは、実施例４に記載される水酸化Ｃｏ−Ｃｒ合金表面に被覆されたＬ−ＡＡのＳＥＭ画像（２７倍）を提供する。図７Ｂは、実施例４に記載される水酸化Ｃｏ−Ｃｒ合金表面に被覆されたＬ−ＡＡのＳＥＭ画像（２００倍）を提供する。図７Ｃは、実施例４に記載される水酸化Ｃｏ−Ｃｒ合金表面に被覆されたＬ−ＡＡのＳＥＭ画像（５００倍）を提供する。図７Ｄは、実施例４に記載される水酸化Ｃｏ−Ｃｒ合金表面に被覆されたＬ−ＡＡのＳＥＭ画像（１，０００倍）を提供する。 図８Ａは、実施例４に記載される水酸化Ｃｏ−Ｃｒ合金冠動脈ステント表面に被覆されたＬ−ＡＡのＳＥＭ画像（７００倍）を提供する。図８Ｂは、実施例４に記載される水酸化Ｃｏ−Ｃｒ合金冠動脈ステント表面に被覆されたＬ−ＡＡのＳＥＭ画像（１，０００倍）を提供する。図８Ｃは、実施例４に記載される水酸化Ｃｏ−Ｃｒ合金冠動脈ステント表面に被覆されたＬ−ＡＡのＳＥＭ画像（５，０００倍）を提供する。図８Ｄは、実施例４に記載される水酸化Ｃｏ−Ｃｒ合金冠動脈ステント表面に被覆されたＬ−ＡＡのＳＥＭ画像（１０，０００倍）を提供する。 図９Ａ−１は、実施例４に記載される化学洗浄されたＣｏ−Ｃｒ合金表面（対照）の光学プロフィロメータ（ｏｐｔｉｃａｌ ｐｒｏｆｉｌｏｍｅｔｅｒ）画像を提供する。図９Ａ−２は、実施例４に記載されるリン酸が被覆されたＣｏ−Ｃｒ合金表面の光学プロフィロメータ画像を提供する。図９Ａ−３は、実施例４に記載されるリン酸が被覆され、Ｌ−ＡＡが付着されたＣｏ−Ｃｒ合金表面の光学プロフィロメータ画像を提供する。図９Ｂ−１は、図９Ａ−１に示され、実施例４に記載される試験片のＡＦＭ画像を提供する。図９Ｂ−２は、図９Ａ−２に示され、実施例４に記載される試験片のＡＦＭ画像を提供する。図９Ｂ−３は、図９Ａ−３に示され、実施例４に記載される試験片のＡＦＭ画像を提供する。 実施例４に記載されるＦＴＩＲデータのグラフ表示である。 実施例５に記載される溶出データのグラフ表示である。 図１２Ａは、実施例６に記載される、何も加えられなかった内皮細胞培養物（対照）の７日目の位相差顕微鏡画像を提供する。図１２Ｂは、実施例６に記載される、シロリムスが加えられた内皮細胞培養物の７日目の位相差顕微鏡画像を提供する。図１２Ｃは、実施例６に記載される、パクリタキセルが加えられた内皮細胞培養物の７日目の位相差顕微鏡画像を提供する。図１２Ｄは、実施例６に記載される、アスコルビン酸が加えられた内皮細胞培養物の７日目の位相差顕微鏡画像を提供する。 実施例７に記載されるレザズリン蛍光アッセイのグラフ表示である。 実施例８に記載されるレザズリン蛍光アッセイのグラフ表示である。 実施例９に記載される異なる４日におけるＦＤＡで染色された平滑筋細胞の蛍光顕微鏡画像を提供する。 図１６Ａは、実施例１０に記載される、培養物に何も加えられなかった７日後の平滑筋細胞成長（対照）の位相差顕微鏡画像を提供する。図１６Ｂは、実施例１０に記載される、シロリムスが培養物に加えられてから７日後の平滑筋細胞成長の位相差顕微鏡画像を提供する。図１６Ｃは、実施例１０に記載される、パクリタキセルが培養物に加えられてから７日後の平滑筋細胞成長の位相差顕微鏡画像を提供する。図１６Ｄは、実施例１０に記載される、アスコルビン酸が培養物に加えられてから７日後の平滑筋細胞成長の位相差顕微鏡画像を提供する。 実施例１１に記載されるレザズリン蛍光アッセイのグラフ表示である。 実施例１２に記載される異なる４日におけるＦＤＡで染色された平滑筋細胞の蛍光顕微鏡画像を提供する。 図１９Ａは、実施例１３に記載される、Ｌ−ＡＡの組み込み前のＰＬＧＡコーティングを備えたＣｏ−Ｃｒ合金表面のＳＥＭ画像を提供する。図１９Ｂは、実施例１３に記載される、Ｌ−ＡＡが付着された後のＰＬＧＡコーティングを備えた図１９ＡのＣｏ−Ｃｒ表面のＳＥＭ画像を提供する。

本発明には、様々な変更形態および代替的な形態が可能であるが、特定の実施形態が、図面中の例として示されており、以下に詳細に記載される。しかしながら、本発明を、記載される特定の実施形態に限定することは意図されていない。これに対し、本発明は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内に含まれる全ての変更、均等物、および代替例を包含することが意図される。

Ｌ−アスコルビン酸は、強力な酸化防止特性を有する水溶性分子である。Ｌ−アスコルビン酸は、以下に示される化学構造を有する。

Ｌ−アスコルビン酸は、低比重リポタンパクの酸化を抑える治療剤として使用可能であり、それによって、冠動脈疾患のリスクを低下させる。その酸化防止特性に加えて、Ｌ−アスコルビン酸は、内皮細胞および平滑筋細胞に大きな影響を与え、内皮細胞および平滑筋細胞は両方とも、遅発性ステント血栓症および新生内膜過形成に関与する。Ｌ−アスコルビン酸は、内皮細胞の成長を促進し、平滑筋細胞の増殖を阻害する。さらに、Ｌ−アスコルビン酸は、マクロファージおよび血小板の成長を阻害する際に他の大きな利点を有する。

ある実施形態において、埋め込み型医療機器が、Ｌ−アスコルビン酸またはその供給源もしくは誘導体のいずれかである治療剤で被覆され得る。例示的であるが非限定的な例は、パルミチン酸アスコルビルであり、これは、アスコルビン酸およびパルミチン酸がエステル結合を介して結合された化合物である。生理的条件下で、エステル結合が壊れ、アスコルビン酸およびパルミチン酸が放出される。別の例示的であるが非限定的な例は、ステアリン酸アスコルビルである。アスコルビン酸誘導体の２つの他の例としては、以下に限定はされないが、Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸セスキマグネシウム塩水和物および２−ホスホ−Ｌ−アスコルビン酸三ナトリウム塩が挙げられる。

ある実施形態において、埋め込み型医療機器が、Ｌ−アスコルビン酸で被覆され得る。場合によっては、埋め込み型医療機器が、２種以上の異なる治療剤で被覆されてもよく、治療剤のうちの１つは、Ｌ−アスコルビン酸またはその供給源もしくは誘導体である。ある実施形態において、２種以上の治療剤が、埋め込み型医療機器に塗布される前に、物理的に混合され、あるいは組み合わされ得る。ある実施形態において、Ｌ−アスコルビン酸などの治療剤が、既に別の治療剤が機器の上に配置されたステントまたは他の埋め込み型医療機器に被覆され得る。

図１は、埋め込み型医療機器１０の概略図である。埋め込み型医療機器１０は、一般に、表面１２およびコーティング１４を含む。機器１０の表面１２は、様々な金属、ポリマーまたはセラミック基板で形成されるかあるいはそれらを含み得る。埋め込み型医療機器１０は、様々な異なる埋め込み型医療機器またはその部分を概略的に表すことが理解されよう。埋め込み型医療機器１０の例示的であるが非限定的な例としては、ステント、心臓弁、人工心臓、ペースメーカー、除細動器、人工血管、血管内ステント移植片、経カテーテル心臓弁、心臓補助機器、補助人工心臓、カウンターパルセーション機器、心肺バイパス機器、およびバルーンカテーテルなどの心血管機器が挙げられる。さらなる機器としては、整形外科的機器、骨折固定機器、人工歯根、眼科的機器、神経機器、縫合糸、および組織工学足場が挙げられる。一般に、Ｌ−アスコルビン酸またはその供給源が固定され得る表面を有する任意の埋め込み型機器が、本明細書において考えられる。

ある実施形態において、埋め込み型医療機器１０は、ステントであり得る。ステントは、金属材料、ポリマー材料、および／またはセラミック材料で形成され得る。ステントなどの機器１０に使用され得る金属材料の例示的であるが非限定的な例としては、ステンレス鋼、タンタルおよびタンタル合金、チタンおよびチタン合金（ニチノールを含む）、白金−イリジウム合金、マグネシウムおよびマグネシウム合金およびコバルト−クロム合金が挙げられる。

図１に示されるように、表面１２は、機器１０の内面または外面であり得る。ある実施形態において、表面１２は、表面１２が体液と接触され得るように埋め込み型医療機器１０中または埋め込み型医療機器１０上に位置決めされ、それによって、体液は水性であるためコーティング１４を溶出するための機構を提供し得る。表面１２は、例えば、血液または髄液などの体液と接触するように位置決めされ得る。

ある実施形態において、コーティング１４は、Ｌ−アスコルビン酸などの治療剤である。あるいは、コーティング１４は、ポリマーベースの材料、ポリマーを含まない材料、または治療剤を保持するのを助け得るいくつかの他の材料などの、治療剤と別の材料との混合物または他の組合せであり得る。ある実施形態によれば、このようなコーティング１４は、まず、治療剤および他の材料を混合あるいは組み合わせて、次に、混合物を表面１２に塗布することによってなされ得る。あるいは、この剤および他の材料は、表面１２に別々に塗布され、表面１２において混合され得る。さらなる実装例において、コーティング１４は、２つ以上の別個のコーティングであってもよく、そのうちの１つが治療剤であり、他の１つ以上が、剤を保持するのを助ける働きを果たす１つ以上の材料である。

特定の実装例において、コーティング１４は、ポリマーベースであってもよく、Ｌ−アスコルビン酸が、ポリマー内に分散されるかまたは共有結合、イオン結合、もしくは水素結合を介してポリマーに結合される。場合によっては、コーティング１４は、Ｌ−アスコルビン酸を中に含む多孔質のセラミック層を表し得る。ある実施形態において、コーティング１４は、ポリマーを含まないコーティングであり得る。場合によっては、Ｌ−アスコルビン酸は、微孔性表面、メソ多孔性金属酸化物、金属有機フレームワーク、鉱物コーティング、自己組織化単分子層、または交互積層（ｌａｙｅｒ ｂｙ ｌａｙｅｒ）コーティングで構成されるコーティング１４上またはコーティング１４内に配置され得る。

特定の実施形態において、ポリマーベースのコーティング中の１つ以上のポリマーとしては、以下に限定はされないが、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、デキストラン、硫酸デキストラン、ポリカプロラクトン、およびポリカプロラクトンコポリマーが挙げられる。

ある実施形態において、Ｌ−アスコルビン酸は、後に上塗りで覆われる粗面または平滑面で構成されるコーティング上またはコーティング内に配置され得る。上塗りとしては、ジチオスレイトール、グルタチオン、アスコルビン酸６−パルミテート、デヒドロアスコルビン酸、アセチルサリチル酸、エチレンジアミン四酢酸、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、酢酸アンモニウム、オクタデシルホスホン酸、１６−ホスホノヘキサデカン酸、１１−ホスホノウンデカン酸、１−ドデシルホスホン酸、リン酸、ホスホノ酢酸、ならびに他のアルキルホスホン酸およびアルキルカルボン酸などの有機または鉱物コーティングを含む、非ポリマー材料のうちの１つ以上が挙げられる。あるいは、上塗りは、１つ以上のポリマーで作製され得る。さらなる代替例において、治療剤は、機器１０の粗面または平滑面１２におけるコーティング１４であり得、上塗りは、薬剤コーティング１４を覆うことができる。

ある実施形態において、コーティング１４は、ポリマーを含まなくてもよい。場合によっては、コーティング１４は、表面１２に結合された官能基を含み得る。好適な官能基の例としては、以下に限定はされないが、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、カルボン酸基（−ＣＯＯＨ）およびアミン基（−ＮＨ２）が挙げられる。Ｌ−アスコルビン酸は、これらの官能基とともに、水素結合または共有結合を形成し得る。表面１２の化学的組成または構造に応じて、これらの官能基を表面１２に加えるための様々な方法があることが理解されよう。

ある実施形態において、表面１２は、リン酸を用いて水酸化されてもよく、以下に示される化学構造を有する。

ある実施形態において、水酸化表面は、公知のプロセスにしたがって、リン酸を含有する水溶液に金属基板を浸漬させることによってＣｏ−Ｃｒ基板などの金属基板上に形成され得る。場合によっては、浸漬後の金属基板の加熱は、コーティングを安定させるのを助け得る。ある実施形態において、リン酸は、金属基板上に分子コーティングを形成し得る。これは、例えば、図２に例示されている。

図２は、リン酸で処理を行った後の水酸化Ｃｏ−Ｃｒ合金表面１６の概略図である。図示されるように、リン酸分子１８は、リン酸分子１８およびＣｏ−Ｃｒ合金表面１６自体における酸素原子とヒドロキシル部分との間の共有結合を介してＣｏ−Ｃｒ合金表面１６に結合されている。

図３は、図２に示されるものなどの水酸化Ｃｏ−Ｃｒ合金基板２０におけるＬ−アスコルビン酸コーティング２４の概略図である。図３において、結合されたリン酸２２の層上に分子コーティングを形成するＬ−アスコルビン酸２４Ａの第１の層があることが分かる。Ｌ−アスコルビン酸２４Ａの第１の層は、リン酸２２に水素結合する。図示されるように、Ｌ−アスコルビン酸２４Ｂの第２の層が、Ｌ−アスコルビン酸２４Ａの第１の層の上に形成され、Ｌ−アスコルビン酸２４Ａの第１の層に水素結合する。Ｌ−アスコルビン酸の複数の層が、Ｃｏ−Ｃｒ合金基板２０に固定され得ることが理解されよう。

内皮細胞の成長ならびに接着および埋め込み型医療機器からのその後の溶出を促進するＬ−ＡＡの性能を実証するために様々な実験を行った。

実施例１
実施例１において、１００μｇのＬ−アスコルビン酸、１００μｇのシロリムス、および１００μｇのパクリタキセルを、別個の内皮細胞培養物（１５，０００個の細胞／ウェル）に加えた。薬剤を加えていない対照の細胞培養物も提供した。生細胞をフルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）で染色することによって、培養ウェルにおける内皮細胞の接着を調べた。次に、培養の１日目、３日目、５日目、および７日目に、ＦＤＡで染色された生細胞を、蛍光顕微鏡検査法を用いて撮像した。５日後、内皮細胞の拡散の測定を行った。７日後、内皮細胞の成長（生存度および増殖）の測定を行った。

図４は、結果を示す。１日目（第１のカラム）に、内皮細胞の接着は、アスコルビン酸では優れており、シロリムスおよびパクリタキセルでは弱かった一方、対照は、細胞接着を同様に示した。アスコルビン酸を含有する培養ウェル中の生存内皮細胞の数は、シロリムスおよびパクリタキセルを含有する培養ウェルより大幅に多かった。これらの結果は、アスコルビン酸が、シロリムスおよびパクリタキセルと比較した際に、内皮細胞の接着を強く促進することを示す。

内皮細胞の拡散は、ステントの内皮化に直接関連するため、分析するべき重量なパラメータである。５日目に、アスコルビン酸で処理された培養ウェル中の細胞の拡散は優れていた一方、シロリムスおよびパクリタキセルで処理された培養ウェル中では、拡散は不十分であった。シロリムスおよびパクリタキセルで処理された培養ウェル中では、細胞の大部分が、円形を維持する。対照は、いくらかの拡散を示した。これらの結果は、アスコルビン酸が、シロリムスおよびパクリタキセルなどの他の抗増殖剤と比較した際に、内皮細胞の拡散を強く促進することを示す。

７日目に、アスコルビン酸で処理された内皮細胞の成長（生存および増殖）は優れていた一方、シロリムスおよびパクリタキセルで処理された細胞では、成長が不十分であった。Ｌ−ＡＡで処理された細胞は、対照と比較してより多い成長を示した。アスコルビン酸における生存内皮細胞の数は、７日間の培養の後、シロリムスおよびパクリタキセルのそれより大幅に多かった。これらの結果は、アスコルビン酸が、シロリムスおよびパクリタキセルと比較した際に、内皮細胞の成長を強く促進することを示す。

実施例２
実施例１の結果の定量的特性評価を提供するために、レザズリン蛍光アッセイ（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ）を使用した。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅの溶液を、アスコルビン酸、シロリムス、またはパクリタキセルで既に処理された内皮細胞培養物に加えた。治療剤を含まない対照が含まれていた。それぞれの時点（１日、３日、５日、および７日）後、溶液の蛍光を、マイクロプレートリーダーを用いて測定した。収集されたデータを、試料の全ての３つの群（アスコルビン酸、シロリムス、およびパクリタキセル）について、時間に対する相対蛍光単位（ＲＦＵ）として示した。

結果が図５に示される。アスコルビン酸で処理された内皮細胞の成長は、シロリムス、パクリタキセル、および対照（薬剤なし）でそれぞれ処理された細胞の成長より１９倍、１０倍、および１．６倍多かった。この結果は、ステントに現在使用されている他の抗増殖剤を上回る、内皮化を促進するためのＬ−アスコルビン酸の優位性を示す。

実施例３
金属基板へのリン酸の結合を、コバルト−クロム（「Ｃｏ−Ｃｒ」）合金を用いて試験した。対照および試験片の両方を、化学洗浄手順によって処理して、Ｃｏ−Ｃｒ合金表面から一切の汚染物質を除去した。Ｃｏ−Ｃｒ合金試験片を、１０分間ずつ２回、エタノール、アセトン、およびメタノール中で超音波処理することによって、化学洗浄手順を行った。次に、試験片を窒素ガス下で乾燥させた。次に、試験用のＣｏ−Ｃｒ合金試験片を、２４時間にわたって脱イオン水（ジ−Ｈ_２Ｏ）中のリン酸の１００ｍＭの溶液中に浸漬させた。試験片を１９時間にわたって空気中１２０℃で加熱した後、１分間にわたってジ−Ｈ_２Ｏ中で洗浄した。

対照および試験片の両方を、接触角の角度測定法を用いて特性評価し、結果を、図６Ａにグラフ形式で示した。化学洗浄された対照のＣｏ−Ｃｒ合金では、５０．６±４．４°の接触角値が得られた。しかしながら、リン酸処理の後、接触角値は、１６．２±８．７°へと大幅に減少した。これは、リン酸がＣｏ−Ｃｒ合金表面に結合され、ヒドロキシル（−ＯＨ）基富化表面を提供することを示唆している。

図６Ｂ−１、６Ｂ−２、および６Ｂ−３は、対照（化学洗浄されたＣｏ−Ｃｒ合金）（図６Ｂ−１）、リン酸で被覆された試験片（図６Ｂ−２）、および別のリン酸で被覆された試験片の上にアスコルビン酸が付着されたもの（図６Ｂ−３）の接触角画像を示す。リン酸およびアスコルビン酸が付着された試験片は、それぞれ１６．２±８．７°および１４±３．５°の接触角値を示した。これは、リン酸がＣｏ−Ｃｒ合金表面に結合され、アスコルビン酸がその上に首尾よく付着されたことを示唆している。

実施例４
水酸化Ｃｏ−Ｃｒ基板へのＬ−アスコルビン酸の結合を試験した。Ｌ−アスコルビン酸の溶液を、４ｍｇ／ｍＬの濃度で、エタノール中で調製した。調製されたＬ−アスコルビン酸溶液の７５μＬのアリコートを、マイクロピペットを用いて水酸化Ｃｏ−Ｃｒ合金表面（１ｃｍ×１ｃｍ）上に注意深く載せた。溶液を、２４時間にわたって３７℃で、空気中で蒸発させたところ、合金表面にＬ−アスコルビン酸薄膜が残った。Ｌ−アスコルビン酸が付着された合金試験片を、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）、光学プロフィロメータ、およびフーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）を用いて特性評価した。

図７Ａ〜７Ｄは、２７倍（図７Ａ）、２００倍（図７Ｂ）、５００倍（図７Ｃ）および１，０００倍（図７Ｄ）で取得されたＳＥＭ画像を含む。これらの画像は、Ｃｏ−Ｃｒ合金表面に均一に付着された羽根の形状のアスコルビン酸結晶の存在を示す。この結果は、Ｃｏ−Ｃｒ合金におけるアスコルビン酸の良好なコーティングを強く示す。

図８Ａ〜８Ｄは、７００倍（図８Ａ）、１，０００倍（図８Ｂ）、５，０００倍（図８Ｃ）、および１０，０００倍（図８Ｄ）で取得されたＳＥＭ画像を含む。これらの画像は、ステントの支柱における羽根の形状のＬ−アスコルビン酸結晶の均一な付着を示す。これらの結果は、３Ｄ心血管ステントにおけるアスコルビン酸の良好な付着を示す。

図９Ａ−１、９Ａ−２、および９Ａ−３は、化学洗浄されたＣｏ−Ｃｒ合金（対照）（図９Ａ−１）、リン酸で被覆されたＣｏ−Ｃｒ合金（図９Ａ−２）、およびリン酸で被覆されたＣｏ−Ｃｒ合金の上にＬ−アスコルビン酸が付着されたもの（図９Ａ−３）の光学プロフィロメータ画像を示す。光学プロファイラー画像は、対照の表面（図９Ａ−１）およびリン酸で被覆された表面（図９Ａ−２）について平坦な表面を示した。しかしながら、アスコルビン酸の付着後、羽根の形状のアスコルビン酸結晶が、Ｃｏ−Ｃｒ合金表面に均一に存在していた（図９Ａ−３）。これは、ＳＥＭ特性評価と一致して、Ｃｏ−Ｃｒ合金表面におけるアスコルビン酸コーティングの良好な付着を示す。

図９Ｂ−１、９Ｂ−２、および９Ｂ−３は、上述した、対照（図９Ｂ−１）、リン酸で被覆されたＣｏ−Ｃｒ合金（図９Ｂ−２）、およびリン酸で被覆され、Ｌ−アスコルビン酸が付着されたＣｏ−Ｃｒ合金試験片（図９Ｂ−３）のＡＦＭ画像（走査サイズ＝１０×１０μｍ）を示す。これらの画像は、上記のＳＥＭ特性評価および光学プロフィロメータ画像と一致して、Ｃｏ−Ｃｒ合金表面におけるアスコルビン酸コーティングの良好な付着を示す。

図１０は、４つのＯＨ基：３２３２ｃｍ^−１におけるＣ（２）−ＯＨ基；３３３０ｃｍ^−１におけるＣ（５）−ＯＨ基；３４２５ｃｍ^−１におけるＣ（３）−ＯＨ基；および３５４０ｃｍ^−１におけるＣ（６）−ＯＨ基についての強いピークを示すＦＴＩＲスペクトルを示す。Ｃ＝Ｏ（１７５０Ｃｍ^−１）およびＣ＝Ｃ（１６８０ｃｍ^−１）結合についてのピークも存在していた。これらの結果は、Ｃｏ−Ｃｒ合金表面におけるアスコルビン酸のコーティングを首尾よく実証した。

実施例５
薬剤放出試験を行った。Ｌ−アスコルビン酸で被覆されたＣｏ−Ｃｒ合金試験片を、最大で４日間にわたって３７℃でトリス−緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中に浸漬させた。ＴＢＳ溶液を、所定の時点で収集し、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、放出されたＬ−アスコルビン酸の量を分析した。結果が図１１に示され、この図は、アスコルビン酸がＣｏ−Ｃｒ合金表面から首尾よく送達されたことを示す。

実施例６
実施例６において、１００μｇのＬ−アスコルビン酸、１００μｇのシロリムス、および１００μｇのパクリタキセルを、別個の内皮細胞培養物に加えた。薬剤を加えていない対照の細胞培養物も提供した。明視野像モードでＡｘｉｏｖｅｒｔ ２００ Ｍ倒立顕微鏡法（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を用いて７日後の細胞の位相差画像を撮影し、細胞形態を調べることによって、内皮細胞の成長に対するＬ−ＡＡ、ＳＩＲ、およびＰＡＴの影響を調べた。

図１２Ａ〜１２Ｄは、７日目の結果を示す。内皮細胞は、対照（図１２Ａ）およびＬ−ＡＡ（図１２Ｄ）で特徴的な多角形形状を有する拡散した形態を示した一方、ＳＩＲ（図１２Ｂ）およびＰＡＴ（図１２Ｃ）では、拡散した形態を有さない特徴的でない楕円形または円形を示す。したがって、結果は、内皮細胞の特徴的な形態学的特徴が、Ｌ−ＡＡおよび対照で十分に維持された一方、ＳＩＲまたはＰＡＴで処理された細胞中ではこのような特徴が存在しなかったことを示した。これらの結果は、アスコルビン酸が、シロリムスおよびパクリタキセルと比較した際に、内皮細胞の成長を強く促進することを示す。

実施例７
実施例７において、定量的なレザズリン蛍光アッセイを使用した。Ｂｉｏｔｉｕｍ Ｉｎｃ．（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）から購入したキットからのａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）の溶液を、様々な用量のアスコルビン酸で既に処理された内皮細胞培養物に加えた。より詳細には、様々な用量のアスコルビン酸には、１μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、および１０００μｇ／ｍＬが含まれていた。アスコルビン酸を含まない対照も含まれる。それぞれの時点（１日、３日、５日、および７日）後、溶液の蛍光を、マイクロプレートリーダーを用いて測定した。収集されたデータを、試料の全ての６つの群（対照、１μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、および１０００μｇ／ｍＬ）について、時間に対する相対蛍光単位（ＲＦＵ）として示す。

結果が図１３に示される。１日目に、細胞数の有意差は観察されなかった。３日目に、１００μｇの用量のアスコルビン酸で観察される細胞数は、対照または３００μｇの用量を除く他のアスコルビン酸用量で観察される細胞数より大幅に多かった。５日目に、１００、３００、および５００μｇのアスコルビン酸用量は、対照および他の用量（１および１０００μｇ）の細胞数と比較した際に、大幅に多い細胞数を示した。７日目に、用量１００および３００μｇは、異なる群の中で最大細胞数を示し、対照および他の用量の細胞数より大幅に多かった。これらの結果に基づいて、様々な用量のアスコルビン酸についての内皮細胞の生存および増殖は、次の順序で増加した：１０００μｇ＜１μｇ＝対照＝５００μｇ＜＜３００μｇ＝１００μｇ。

実施例８
実施例８において、定量的なレザズリン蛍光アッセイを使用した。Ｂｉｏｔｉｕｍ Ｉｎｃ．（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）から購入したキットからのａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）の溶液を、アスコルビン酸、シロリムス、またはパクリタキセルで既に処理された平滑筋細胞培養物に加えた。治療剤を含まない対照も含まれていた。それぞれの時点（１日、３日、５日、および７日）後、溶液の蛍光を、マイクロプレートリーダーを用いて測定した。収集されたデータを、試料の全ての３つの群（アスコルビン酸、シロリムス、およびパクリタキセル）について、時間に対する相対蛍光単位（ＲＦＵ）として示す。

結果が図１４に示される。１日目に、全ての３つの処理剤は、対照と比較して、大幅に少ない細胞数を示した。３日目に、３つの処理剤は、細胞成長をかなり阻害し、対照の細胞数と比較した際により少ない細胞数を示し、アスコルビン酸、パクリタキセル、およびシロリムスの間で細胞数の有意差は観察されなかった。同様の傾向が、５日目に観察されたが、シロリムスおよびパクリタキセル処理剤は、アスコルビン酸処理剤の細胞数より少ない細胞数を示した。同様の結果が、７日目に観察された。これらの結果に基づいて、ＳＭＣ生存および増殖は、次の順序で減少した：対照＞＞アスコルビン酸＞シロリムス＝パクリタキセル。したがって、これらの結果は、アスコルビン酸が、ＳＭＣの成長をかなり阻害したが、この阻害作用は、シロリムスおよびパクリタキセルの阻害作用より劣っていることを示した。

実施例９
実施例９は、蛍光顕微鏡法を用いて、実施例８の結果の定性的特性評価を提供する。より詳細には、３つの異なる処理剤（アスコルビン酸、パクリタキセル、およびシロリムス）の存在下における平滑筋細胞の成長を、フルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）で生細胞を染色することによって調べた。次に、ＦＤＡで染色された生細胞を、培養の１日目、３日目、５日目、および７日目に、蛍光顕微鏡法を用いて撮像した。それぞれの日に、平滑筋細胞の成長（生存および増殖）の測定を行った。

結果が図１５に示される。これらの画像は、平滑筋細胞が、ある時点と他の時点との間で、対照についてかなり増殖した一方、細胞成長は、アスコルビン酸、パクリタキセル、およびシロリムスについてかなり阻害されたことを示す。７日後、対照の試料は、９０％を超えるコンフルエンスを示した一方、アスコルビン酸で処理された細胞は、約５０〜６０％のコンフルエンスを示した。パクリタキセルおよびシロリムスは、約２０％のコンフルエンスで生存細胞をほとんど示さなかった。これらの定性的な結果は、実施例８において提供される定量的評価と一致している。

実施例１０
実施例１０は、位相差顕微鏡法を用いて、実施例８の結果のさらなる定性的特性評価を提供する。すなわち、明視野像モードでＡｘｉｏｖｅｒｔ ２００ Ｍ倒立顕微鏡法（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を用いて７日後の細胞の位相差画像を撮影し、細胞形態を調べることによって、平滑筋細胞の成長に対するＬ−ＡＡ、ＳＩＲ、およびＰＡＴの影響を調べた。

図１６Ａ〜１６Ｄは、７日目の結果を提供する。平滑筋細胞は、対照（図１６Ａ）の特徴的な紡錘形を有する拡散した形態を示した。アスコルビン酸（図１６Ｄ）では、細胞は、紡錘形であったが、対照と比較した際に拡散が少なかった。パクリタキセル（図１６Ｃ）およびシロリムス（図１６Ｂ）では、細胞は拡散しておらず、ごくわずかな細胞が紡錘形であり、残りの細胞は、三角形または不規則な形状のいずれかであった。これらの結果は、平滑筋細胞の拡散が、アスコルビン酸、シロリムス、およびパクリタキセルでの処理によって影響された一方、細胞の形態学的特徴も、シロリムスおよびパクリタキセルでの処理によって影響されたことを示唆している。

実施例１１
実施例１１において、定量的なレザズリン蛍光アッセイを使用した。Ｂｉｏｔｉｕｍ Ｉｎｃ．（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）から購入したキットからのａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）の溶液を、様々な用量のアスコルビン酸で既に処理された平滑筋細胞培養物に加えた。より詳細には、様々な用量のアスコルビン酸には、１μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、および１０００μｇ／ｍＬが含まれていた。アスコルビン酸を含まない対照も含まれていた。それぞれの時点（１日、３日、５日、および７日）後、溶液の蛍光を、マイクロプレートリーダーを用いて測定した。収集されたデータを、試料の全ての６つの群（対照、１μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、および１０００μｇ／ｍＬ）について、時間に対する相対蛍光単位（ＲＦＵ）として示す。

結果が図１７に示される。１日目に、１００〜１０００μｇの範囲のアスコルビン酸用量は、対照および１μｇのアスコルビン酸用量の両方と比較して大幅に少ない細胞を示した。５００および１０００μｇのアスコルビン酸用量が、１００および３００μｇの用量と比較してより少ない細胞を示すことに加えて、同様の傾向が、３日目に観察された。同様の結果が、５日目および７日目に同様に観察された。これらの結果に基づいて、様々な用量のアスコルビン酸についての平滑筋細胞の生存および増殖は、次の順序で減少した：対照＝１μｇ＞＞１００μｇ＝３００μｇ＞５００μｇ＝１０００μｇ。

実施例１２
実施例１２は、蛍光顕微鏡検査法を用いて、実施例１１の結果の定性的特性評価を提供する。より詳細には、５つの様々な用量のアスコルビン酸の存在下における平滑筋細胞の成長を、生細胞をフルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）で染色することによって調べた。次に、ＦＤＡで染色された生細胞を、培養の１日目、３日目、５日目、および７日目に、蛍光顕微鏡検査法を用いて撮像した。それぞれの日に、平滑筋細胞の成長（生存および増殖）の測定を行った。

結果が図１８に示される。これらの画像は、平滑筋細胞が、ある時点と他の時点との間で、対照および１μｇの用量についてかなり増殖している一方、細胞成長は、１００〜１０００μｇの範囲のアスコルビン酸用量についてかなり阻害されたことを示す。７日後、対照の試料および１μｇの用量は、９０％を超えるコンフルエンスを示した一方、１００および３００μｇの用量は、約５０〜６０％のコンフルエンスを示し、５００および１０００μｇの用量は、約３０〜４０％のコンフルエンスを示した。これらの結果は、アスコルビン酸が、用量依存的な阻害作用を示したことを示し、１μｇの用量が阻害作用を示さず、１０００μｇの用量が、最大阻害作用を示した。

実施例１３
実施例１３において、Ｃｏ−Ｃｒ合金表面におけるポリ（乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）で作製されたポリマーベースのコーティングの使用およびコーティングへのＬ−ＡＡの付着を調べた。ＰＬＧＡコーティングを表面に塗布し、次に、Ｌ−ＡＡを付着させた。

図１９Ａ〜１９Ｂは、ＰＬＧＡコーティングを備えたＣｏ−Ｃｒ合金表面（Ｌ−ＡＡの組み込み前）（図１９Ａ）およびＬ−ＡＡが付着された後のＰＬＧＡコーティングを備えた同じＣｏ−Ｃｒ表面（図１９Ｂ）のＳＥＭ画像を含む。図１９Ｂは、Ｃｏ−Ｃｒ合金表面におけるＰＬＧＡコーティングに均一に付着されたアスコルビン酸結晶の存在を示す。この結果は、Ｃｏ−Ｃｒ合金におけるＰＬＧＡコーティングへのアスコルビン酸の良好な付着を示す。

本発明の範囲を逸脱せずに、記載される例示的実施形態に様々な変更および追加を行うことができる。例えば、上述される実施形態は特定の特徴を示すが、本発明の範囲は、記載される特徴の全てを含むわけではない特徴および実施形態の様々な組合せを有する実施形態も含む。したがって、本発明の範囲は、請求項の全ての均等物とともに、特許請求の範囲内に含まれる全てのこのような代替形態、変更形態、および変形形態を包含することが意図される。

本発明が、好ましい実施形態を参照して説明されてきたが、当業者は、本発明の趣旨および範囲を逸脱せずに、形態および詳細に変更を行い得ることを認識するであろう。

Claims (16)

1. 表面と；
   前記表面に対して固定されるアスコルビン酸の供給源と
   を含む埋め込み型医療機器。
2. 心血管機器、整形外科的機器、骨折固定機器、人工歯根、眼科的機器、神経機器、縫合糸および組織工学足場からなる群から選択される機器を含む、請求項１に記載の埋め込み型医療機器。
3. 前記表面が、前記アスコルビン酸供給源が結合する官能化表面を含む、請求項１に記載の埋め込み型医療機器。
4. 前記官能化表面が、ヒドロキシル部分、カルボキシル部分またはアミン部分を含み、前記アスコルビン酸が、共有結合または水素結合を介して前記官能化表面に結合する、請求項３に記載の埋め込み型医療機器。
5. 前記アスコルビン酸が、前記表面に被覆されたポリマーまたはセラミック材料内に配置される、請求項１に記載の埋め込み型医療機器。
6. 表面を有するステント本体と；
   前記表面に対して固定されるアスコルビン酸の供給源と
   を含む埋め込み型ステント。
7. 金属ステント本体、ポリマーステント本体またはセラミックステント本体を含む、請求項６に記載の埋め込み型ステント。
8. 前記表面が、前記アスコルビン酸供給源が結合する官能化表面を含む、請求項６に記載の埋め込み型ステント。
9. 前記官能化表面が、ヒドロキシル部分、カルボキシル部分またはアミン部分を含み、前記アスコルビン酸供給源が、共有結合または水素結合を介して前記官能化表面に結合する、請求項８に記載の埋め込み型ステント。
10. 前記表面に結合されたリン酸の層をさらに含む、請求項６に記載の埋め込み型ステント。
11. 前記アスコルビン酸が、リン酸の前記層に結合される、請求項１０に記載の埋め込み型ステント。
12. 前記ステント本体が、コバルトクロム合金を含む、請求項６に記載の埋め込み型ステント。
13. アスコルビン酸溶出型ステントを形成する方法であって、
    表面を有するステントを提供する工程と；
    前記ステントの前記表面を、リン酸と接触させて、結合されたリン酸の層を形成する工程と；
    結合されたリン酸の前記層を、アスコルビン酸の溶液と接触させる工程と
    を含み；
    前記アスコルビン酸が、結合されたリン酸の前記層とともに結合を形成する方法。
14. ステントを提供する工程が、金属ステント、ポリマーステントまたはセラミックステントを提供する工程を含む、請求項１３に記載の方法。
15. ステントを提供する工程が、コバルトクロム合金ステントを提供する工程を含む、請求項１３に記載の方法。
16. アスコルビン酸を溶出するインフレータブルバルーンカテーテルを形成する方法であって、
    表面を有するインフレータブルバルーンを提供する工程と；
    アスコルビン酸供給源を受け入れるように前記インフレータブルバルーンの前記表面を処理する工程と；
    前記表面を、アスコルビン酸の溶液と接触させて、前記インフレータブルバルーンの前記表面にアスコルビン酸の層を形成する工程と
    を含む方法。