JP2015521483A - メラニン細胞性病変における分子悪性度 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2012年6月22日に出願された米国仮特許出願第61/663,428号の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
本開示は、メラニン細胞性病変を良性または悪性として特徴付けるためのバイオマーカーに関する。特に、本開示は、母斑試料および原発性黒色腫試料において有意に差次的に発現するバイオマーカー(mRNAおよび/またはmiRNAを含む)の同定、このようなバイオマーカーの発現に基づく臨床的な予測アルゴリズム、ならびにそれらの使用法およびそれらの使用のための組成物に関する。
HTG Molecular DiagnosticsおよびJohn Wayne Cancer Instituteが、本明細書で開示される発明を統括する共同研究契約の関係機関である。
皮膚がんは、米国では、全てのがんのうちで最も一般的である。メラニン細胞に由来するがんである黒色腫が皮膚がんのうちで占める百分率は比較的小さい。しかし、黒色腫は、最も多くの皮膚がんによる死亡を引き起こすことから、最も危険な種類の皮膚がんのうちの1つとなっている。2012年には、黒色腫は、75,000例を超える皮膚がん症例を占めることになろう。
メラニン細胞含有試料を特徴付ける、例えば、試料が、良性の母斑であるのか、悪性黒色腫であるのかを決定するための方法が開示される。いくつかの例では、これらの方法は、(i)MAGEA2、PRAME、PDIA4、NR4A1、PDLIM7、B4GALT1、SAT1、RUNX1、SOCS3、および表13のバイオマーカーから選択されるバイオマーカーのうちの少なくとも2つ;ならびに(ii)被験体から得られるメラニン細胞含有試料(母斑試料など)中の、少なくとも1つの正規化バイオマーカーに(複数可)ついての発現レベル(核酸レベルまたはタンパク質レベルなど)を決定し、これにより、少なくとも2つのバイオマーカーの各々および少なくとも1つの正規化バイオマーカー(複数可)についての生の発現値をもたらすことにより、メラニン細胞含有試料を特徴付けるステップを含む。少なくとも2つのバイオマーカーの各々についての生の発現値を、少なくとも1つの正規化バイオマーカー(複数可)についての生の発現値に対して正規化して、少なくとも2つのバイオマーカーの各々についての正規化された発現値をもたらす。正規化された発現値を、回帰アルゴリズムまたは機械学習アルゴリズムにおいて使用して、出力値をもたらす。結果として得られる出力値を、良性であるのか悪性であるのかがあらかじめ既知である複数のメラニン細胞含有試料中の、少なくとも2つのバイオマーカーについての正規化された発現値から導出されうるカットオフ値と比較する。次いで、被験体から得られたメラニン細胞含有試料を、例えば、出力値が、複数の既知の良性試料と、カットオフ値の同じ側にあれば、良性として特徴付けるか、または出力値が、複数の既知の悪性試料と、カットオフ値の同じ側にあれば、悪性として特徴付ける。
本明細書で列挙される核酸配列は、37 C.F.R.1.822で規定される、ヌクレオチド塩基のための標準的な文字による略記法を使用して示す。各核酸配列の一方の鎖だけを示すが、相補鎖も、表示される鎖に対する任意の参照により含められるものと理解される。
提示される配列のうち、
別段に言及しない限り、技術用語は、従来の用法に従い使用する。分子生物学における一般用語の定義は、Benjamin Lewin、Genes IX、Jones and Bartlet刊、2008年(ISBN 0763752223);Kendrewら(編)、The Encyclopedia of Molecular Biology、Blackwell Science Ltd.刊、1994年(ISBN 0632021829);およびRobert A. Meyers(編)、Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference、VCH Publishers, Inc.刊、1995年(ISBN 9780471185710)において見出すことができる。
黒色腫を含む大半のがんでは、早期の検出が、生存に対して最大の影響を及ぼし、治癒率の向上に寄与しうる。いくつかの場合には、古典的な方法(例えば、組織病理学的検査)だけに基づいて良性病変と悪性病変とを鑑別することが困難である。したがって、良性の母斑を、黒色腫(例えば、原発性黒色腫)から鑑別することを可能とする方法が必要とされる。検査方法を発展させることは、例えば、このような悪性腫瘍が、顕微鏡レベルまたは生物体レベルにおいて信頼できる形で認識される前に、悪性腫瘍を分子レベルで同定する一助となりうる。分子的検査は、がんの表現型を、良性の母斑を悪性黒色腫(例えば、原発性黒色腫)から鑑別するために本明細書で記載される、臨床的に関与性の遺伝子発現パターンに対して同定することを包含する。このような弁別により、良性の母斑だけを有する者に対する不要な治療を回避することができ、原発性黒色腫を有する者に、初期生検の後で適切な治療を施すことを確実にする一助とすることができる。
遺伝子発現とは、ゲノム(遺伝子)内でコードされた情報が、対応する遺伝子産物(例えば、RNA(mRNAおよびmiRNAなど)およびタンパク質)であって、一群の特徴(表現型としてもまた公知である)をもたらすように相互関連的に機能する遺伝子産物へと変換される(例えば、転写過程および翻訳過程を介して)過程である。本開示の目的では、遺伝子発現は、現在公知であるかまたは将来的に公知となる任意の技法により測定することができる。一般に、遺伝子発現は、目的とする被験体から回収された試料中で発現した遺伝子産物(例えば、mRNA、miRNA、および/またはタンパク質)を検出することにより測定する。
本明細書で開示される方法における使用に適切な試料は、それらの遺伝子発現(例えば、mRNA発現、miRNA発現、またはタンパク質発現;表3、4、11、および/または13のmRNA発現、miRNA発現、またはタンパク質発現など)についての情報が所望される、メラニン細胞を含有する任意の従来の生物学的試料を含む。
参照標準はまた、「対照」とも称する場合がある。対照は、組織内もしくは細胞内またはそれらの集団内(正常非がん性皮膚組織内または細胞内など)に存在する発現(表4、11、または13に示されるバイオマーカーの発現など)の基礎レベルまたは量を示す既知の値または値の範囲でありうる。対照はまた、細胞対照または組織対照でもありうる。
特定の例では、メラニン細胞含有試料(例えば、皮膚生検)など、分析される試料は、固定されるかまたは固定されている。固定技法は、施設間、国の間、研究者間などにより異なる可能性があり(Dissecting the Molecular Anatomy of Tissue、Emmert−Buck、Gillespie、およびChuaqui編、New York、Springer−Verlag、244頁(2010年))、検出される遺伝子産物(複数可)の完全性および/または検出される遺伝子産物(複数可)へのアクセス可能性に影響を及ぼしうる。したがって、固定された試料を伴う、いくつかの開示される方法(例えば、PCRまたは核酸シーケンシングなど、遺伝子発現産物(複数可)を単離するためのステップを伴う方法の実施形態)では、RNAの回収(例えば、可逆性架橋形成剤、エタノールベースの固定剤、および/またはRNAの抽出もしくは精製を使用する(全体的にまたは部分的に))が有利な場合がある。とりわけ、他の代表的な方法(例えば、qNPAを含む)では、RNAの回収は、任意選択であるか、またはRNAの回収は、明確に不要である。同様に、いくつかの方法の実施形態では、組織のコンディショニングを使用して、タンパク質の遺伝子産物を固定された組織から回収し、これにより、このようなタンパク質産物の検出の一助とすることができる。
本明細書で開示される技術革新には、それらの発現(例えば、mRNA発現、miRNA発現、またはタンパク質発現により測定される)が、良性メラニン細胞含有試料(例えば、母斑)と悪性メラニン細胞含有試料(例えば、原発性黒色腫)とを識別するための、開示される方法、アレイ、およびキットにおいて有用な遺伝子(また、バイオマーカーとも称する)および遺伝子のセットがある。また、母斑試料および黒色腫(例えば、原発性黒色腫)試料のための正規子(例えば、試料−試料間の対照)として有用な遺伝子および遺伝子セットも開示される。
(a)表4において記載される遺伝子(すなわち、NR4A1、B4GALT1、SAT1、TP53、TADA3、BRAF、TFRC、RUNX1、SOCS3、PDLIM7、SP100、PIP4K2A、SOX4、PDIA4、MCM6、CTNNB1、RPL37A、GNAS、TGFB1、PPIA、PTEN、MAGED2、1PRAME、GALNTL1、MAGEA2、TEX13A、CREBBP、TPSAB1、CDK2、STAT2、SQSTM1、およびB2M);ならびに/または
(b)表11において記載される遺伝子(すなわち、B4GALT1、BAX、MAGEA2、NR4A1、PDIA4、PRAME、RUNX1、SOCS3、SAT1、PDLIM7、BIRC5、HIF1A、MET、MAGEC2、ERCC1、POLR2J3、LDHA、PICALM、ZFYVE16、およびBEST1);ならびに/または
(c)表13において記載される遺伝子(すなわち、産物hsa.miR.122、hsa.miR.1291、hsa.miR.191、hsa.miR.19b、hsa.miR.200a、hsa.miR.200c、hsa.miR.203、hsa.miR.205、hsa.miR.21、hsa.miR.23b、hsa.miR.29c、hsa.miR.342.3p、hsa.miR.375、hsa.miR.665、hsa.miR.1304、hsa.miR.142.5p、hsa.miR.1254、hsa.let.7a、hsa.miR.140.5p、およびhsa.miR.183)を発現させる遺伝子);ならびに/または
(d)NR4A1、B4GALT1、SOX4、SQSTM1、B2M、TFRC、TP53、GALNTL1、CREBBP、SOCS3、およびCTNNB1;ならびに/または
(e)NR4A1、B4GALT1、SOX4、SQSTM1、B2M、TFRC、TP53、CREBBP、SOCS3、RPL37A、SAT1、BRAF、およびTPSAB1;ならびに/または
(f)NR4A1、B4GALT1、SOX4、SQSTM1、B2M、TFRC、TP53、CREBBP、およびSOCS3;ならびに/または
(g)NR4A1、B4GALT1、SOX4、SQSTM1、B2M、TFRC、TP53、SOCS3、およびBRAF;ならびに/または
(h)NR4A1、B4GALT1、SOX4、SQSTM1、B2M、TFRC、TP53、CREBBP、SOCS3、およびBFAF;ならびに/または
(i)MAGEA2、PRAME、PDIA4、NR4A1、PDLIM7、B4GALT1、SAT1、RUNX1、およびSOCS3;ならびに/または
(j)表6において記載される任意の遺伝子セット;ならびに/または
(k)表8において記載される任意の遺伝子セット;ならびに/または
(l)表14において記載される任意の遺伝子セット;ならびに/または
(m)下記:
[NR4A1、B4GALT1]、[NR4A1、SOX4]、[NR4A1、SQSTM1]、[NR4A1、B2M]、[NR4A1、TFRC]、[NR4A1、TP53]、[NR4A1、CREBBP]、[NR4A1、SOCS3]、[NR4A1、BRAF]、[B4GALT1、SOX4]、[B4GALT1、SQSTM1]、[B4GALT1、B2M]、[B4GALT1、TFRC]、[B4GALT1、TP53]、[B4GALT1、CREBBP]、[B4GALT1、SOCS3]、[B4GALT1、BRAF]、[SOX4、SQSTM1]、[SOX4、B2M]、[SOX4、TFRC]、[SOX4、TP53]、[SOX4、CREBBP]、[SOX4、SOCS3]、[SOX4、BRAF]、[SQSTM1、B2M]、[SQSTM1、TFRC]、[SQSTM1、TP53]、[SQSTM1、CREBBP]、[SQSTM1、SOCS3]、[SQSTM1、BRAF]、[B2M、TFRC]、[B2M、TP53]、[B2M、CREBBP]、[B2M、SOCS3]、[B2M、BRAF]、[TFRC、TP53]、[TFRC、CREBBP]、[TFRC、SOCS3]、[TFRC、BRAF]、[TP53、CREBBP]、[TP53、SOCS3]、[TP53、BRAF]、[CREBBP、SOCS3]、[CREBBP、BRAF]、および[SOCS3、BRAF]の角カッコ([・・・])内で対をなす特異的組合せのうちのいずれか;ならびに/または
(n)NR4A1、B4GALT1、SOX4、SQSTM1、B2M、TFRC、TP53、CREBBP、SOCS3、およびBRAFのリストに由来する1つ(または2つ)の他の非重複遺伝子と組み合された、(m)内の対のうちのいずれかにより記載される3つ(または4つ)の組合せ;ならびに/または
(o)下記:
[MAGEA2、PRAME]、[MAGEA2、PDIA4]、[MAGEA2、NR4A1]、[MAGEA2、PDLIM7]、[MAGEA2、B4GALT1]、[MAGEA2、SAT1]、[MAGEA2、RUNX1]、[MAGEA2、SOCS3]、[PRAME、PDIA4]、[PRAME、NR4A1]、[PRAME、PDLIM7]、[PRAME、B4GALT1]、[PRAME、SAT1]、[PRAME、RUNX1]、[PRAME、SOCS3]、[PDIA4、NR4A1]、[PDIA4、PDLIM7]、[PDIA4、B4GALT1]、[PDIA4、SAT1]、[PDIA4、RUNX1]、[PDIA4、SOCS3]、[NR4A1、PDLIM7]、[NR4A1、B4GALT1]、[NR4A1、SAT1]、[NR4A1、RUNX1]、[NR4A1、SOCS3]、[PDLIM7、B4GALT1]、[PDLIM7、SAT1]、[PDLIM7、RUNX1]、[PDLIM7、SOCS3]、[B4GALT1、SAT1]、[B4GALT1、RUNX1]、[B4GALT1、SOCS3]、[SAT1、RUNX1]、[SAT1、SOCS3]、または[RUNX1、SOCS3]の角カッコ([・・・])内で対をなす特異的組合せのうちのいずれか;ならびに/または
(p)MAGEA2、PRAME、PDIA4、NR4A1、PDLIM7、B4GALT1、SAT1、RUNX1、およびSOCS3のリストに由来する1つ(または2つ)の他の非重複遺伝子(複数可)と組み合された、(o)内の対のうちのいずれかにより記載される3つ(または4つ)の組合せ;ならびに/または
(q)下記:
[miR.122、miR.1291]、[miR.122、miR.191]、[miR.122、miR.19b]、[miR.122、miR.200a]、[miR.122、miR.200c]、[miR.122、miR.203]、[miR.122、miR.205]、[miR.122、miR.21]、[miR.122、miR.23b]、[miR.122、miR.29c]、[miR.122、miR.342.3p]、[miR.122、miR.375]、[miR.122、miR.665]、[miR.122、miR.1304]、[miR.122、miR.142.5p]、[miR.122、miR.1254]、[miR.122、let.7a]、[miR.122、miR.140.5p]、[miR.122、miR.183]、[miR.1291、miR.191]、[miR.1291、miR.19b]、[miR.1291、miR.200a]、[miR.1291、miR.200c]、[miR.1291、miR.203]、[miR.1291、miR.205]、[miR.1291、miR.21]、[miR.1291、miR.23b]、[miR.1291、miR.29c]、[miR.1291、miR.342.3p]、[miR.1291、miR.375]、[miR.1291、miR.665]、[miR.1291、miR.1304]、[miR.1291、miR.142.5p]、[miR.1291、miR.1254]、[miR.1291、let.7a]、[miR.1291、miR.140.5p]、[miR.1291、miR.183]、[miR.191、miR.19b]、[miR.191、miR.200a]、[miR.191、miR.200c]、[miR.191、miR.203]、[miR.191、miR.205]、[miR.191、miR.21]、[miR.191、miR.23b]、[miR.191、miR.29c]、[miR.191、miR.342.3p]、[miR.191、miR.375]、[miR.191、miR.665]、[miR.191、miR.1304]、[miR.191、miR.142.5p]、[miR.191、miR.1254]、[miR.191、let.7a]、[miR.191、miR.140.5p]、[miR.191、miR.183]、[miR.19b、miR.200a]、[miR.19b、miR.200c]、[miR.19b、miR.203]、[miR.19b、miR.205]、[miR.19b、miR.21]、[miR.19b、miR.23b]、[miR.19b、miR.29c]、[miR.19b、miR.342.3p]、[miR.19b、miR.375]、[miR.19b、miR.665]、[miR.19b、miR.1304]、[miR.19b、miR.142.5p]、[miR.19b、miR.1254]、[miR.19b、let.7a]、[miR.19b、miR.140.5p]、[miR.19b、miR.183]、[miR.200a、miR.200c]、[miR.200a、miR.203]、[miR.200a、miR.205]、[miR.200a、miR.21]、[miR.200a、miR.23b]、[miR.200a、miR.29c]、[miR.200a、miR.342.3p]、[miR.200a、miR.375]、[miR.200a、miR.665]、[miR.200a、miR.1304]、[miR.200a、miR.142.5p]、[miR.200a、miR.1254]、[miR.200a、let.7a]、[miR.200a、miR.140.5p]、[miR.200a、miR.183]、[miR.200c、miR.203]、[miR.200c、miR.205]、[miR.200c、miR.21]、[miR.200c、miR.23b]、[miR.200c、miR.29c]、[miR.200c、miR.342.3p]、[miR.200c、miR.375]、[miR.200c、miR.665]、[miR.200c、miR.1304]、[miR.200c、miR.142.5p]、[miR.200c、miR.1254]、[miR.200c、let.7a]、[miR.200c、miR.140.5p]、[miR.200c、miR.183]、[miR.203、miR.205]、[miR.203、miR.21]、[miR.203、miR.23b]、[miR.203、miR.29c]、[miR.203、miR.342.3p]、[miR.203、miR.375]、[miR.203、miR.665]、[miR.203、miR.1304]、[miR.203、miR.142.5p]、[miR.203、miR.1254]、[miR.203、let.7a]、[miR.203、miR.140.5p]、[miR.203、miR.183]、[miR.205、miR.21]、[miR.205、miR.23b]、[miR.205、miR.29c]、[miR.205、miR.342.3p]、[miR.205、miR.375]、[miR.205、miR.665]、[miR.205、miR.1304]、[miR.205、miR.142.5p]、[miR.205、miR.1254]、[miR.205、let.7a]、[miR.205、miR.140.5p]、[miR.205、miR.183]、[miR.21、miR.23b]、[miR.21、miR.29c]、[miR.21、miR.342.3p]、[miR.21、miR.375]、[miR.21、miR.665]、[miR.21、miR.1304]、[miR.21、miR.142.5p]、[miR.21、miR.1254]、[miR.21、let.7a]、[miR.21、miR.140.5p]、[miR.21、miR.183]、[miR.23b、miR.29c]、[miR.23b、miR.342.3p]、[miR.23b、miR.375]、[miR.23b、miR.665]、[miR.23b、miR.1304]、[miR.23b、miR.142.5p]、[miR.23b、miR.1254]、[miR.23b、let.7a]、[miR.23b、miR.140.5p]、[miR.23b、miR.183]、[miR.29c、miR.342.3p]、[miR.29c、miR.375]、[miR.29c、miR.665]、[miR.29c、miR.1304]、[miR.29c、miR.142.5p]、[miR.29c、miR.1254]、[miR.29c、let.7a]、[miR.29c、miR.140.5p]、[miR.29c、miR.183]、[miR.342.3p、miR.375]、[miR.342.3p、miR.665]、[miR.342.3p、miR.1304]、[miR.342.3p、miR.142.5p]、[miR.342.3p、miR.1254]、[miR.342.3p、let.7a]、[miR.342.3p、miR.140.5p]、[miR.342.3p、miR.183]、[miR.375、miR.665]、[miR.375、miR.1304]、[miR.375、miR.142.5p]、[miR.375、miR.1254]、[miR.375、let.7a]、[miR.375、miR.140.5p]、[miR.375、miR.183]、[miR.665、miR.1304]、[miR.665、miR.142.5p]、[miR.665、miR.1254]、[miR.665、let.7a]、[miR.665、miR.140.5p]、[miR.665、miR.183]、[miR.1304、miR.142.5p]、[miR.1304、miR.1254]、[miR.1304、let.7a]、[miR.1304、miR.140.5p]、[miR.1304、miR.183]、[miR.142.5p、miR.1254]、[miR.142.5p、let.7a]、[miR.142.5p、miR.140.5p]、[miR.142.5p、miR.183]、[miR.1254、let.7a]、[miR.1254、miR.140.5p]、[miR.1254、miR.183]、[let.7a、miR.140.5p]、[let.7a、miR.183]、または[miR.140.5p、miR.183]の角カッコ([・・・])内で対をなす特異的組合せ(各場合において、「hsa」は除外されるが、識別子の一部として意図される)のうちのいずれか;ならびに/または
(r)hsa.miR.122、hsa.miR.1291、hsa.miR.191、hsa.miR.19b、hsa.miR.200a、hsa.miR.200c、hsa.miR.203、hsa.miR.205、hsa.miR.21、hsa.miR.23b、hsa.miR.29c、hsa.miR.342.3p、hsa.miR.375、hsa.miR.665、hsa.miR.1304、hsa.miR.142.5p、hsa.miR.1254、hsa.let.7a、hsa.miR.140.5p、またはhsa.miR.183のリストに由来する1つ(または2つ)の他の非重複miRNA(複数可)と組み合された、(q)内の対のうちのいずれかにより記載される3つ(または4つ)の組合せ。
開示される方法は、本明細書で発見される遺伝子(表4、11、および/または13を参照されたい)であって、良性(例えば、母斑)のメラニン細胞含有試料を、悪性(例えば、原発性黒色腫)のメラニン細胞含有試料から鑑別するか、またはこのような試料型(表3を参照されたい)の発現レベルを正規化するのに適する遺伝子の発現を検出することもさらに包含する。様々な技法が、対象の試料中の遺伝子発現を測定するのに利用可能である(または利用可能になりうる)。しかし、本開示は、遺伝子発現を得るか、測定するか、または検出する特定の方法に限定されない。多くのこのような技法は、このような試料中で発現した遺伝子産物(例えば、核酸(mRNAまたはmiRNAなど)および/またはタンパク質)を検出することを包含する。その結果として得られる遺伝子産物を測定することとは独立に、遺伝子または染色体DNAの活性(例えば、転写速度)を直接検出することもまた可能な(または可能となりうる)場合があり、このような技法もまた、本明細書で開示される方法において有用である。
核酸遺伝子産物とは、名称が示唆する通り、遺伝子発現の産物であって、核酸である産物である。それらの発現を検出しうる例示的な核酸は、cDNA、タンパク質をコードするRNA(例えば、mRNA)またはタンパク質をコードしないRNA(例えば、miRNAまたはlncRNA)などのDNAまたはRNAを含む。特定の例では、方法は、mRNAの発現、miRNAの発現、またはこれらの両方を検出することを含む。RNAまたはDNAの相補鎖の間の塩基対合(すなわち、核酸ハイブリダイゼーション)は、核酸遺伝子産物を検出するための技法の大きな代表的なクラスの基盤の全部または一部を形成する。他の代表的な検出法は、核酸シーケンシングを包含し、これは、ハイブリダイゼーションステップおよび/またはバイオインフォマティクスステップ(例えば、核酸配列情報を、その対応する遺伝子と関連させるための)を伴う場合もあり、これらを伴わない場合もある。本明細書では、代表的な技法について記載するが、当技術分野では、核酸を検出する、これらの方法および他の方法が公知であり、本開示は、核酸検出の特定の方法に限定されることを意図しない。
いくつかの例では、核酸は、試料中のこのような核酸を、相補的な核酸プローブまたはプライマーと接触させ、かつ/または試料中のこのような核酸を他の形で検出する前に、メラニン細胞含有試料から単離または抽出する。核酸(RNA(例えば、mRNAまたはmiRNA)またはDNAなど)は、いくつかの方法のうちのいずれかに従い、試料から単離することができる。核酸を単離および精製する代表的な方法は、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology、3章:Hybridization With Nucleic Acid Probes、I部Theory and Nucleic Acid Preparation、P. Tijssen編、Elsevier、N.Y.(1993年)において詳細に記載されている。当技術分野では、RNA(例えば、mRNAまたはmiRNA)を抽出するための代表的な方法も同様に周知であり、Ausubelら、Current Protocols of Molecular Biology、John Wiley and Sons(1997年)を含む、分子生物学の標準的な教科書において開示されている。
いくつかの例では、開示されるバイオマーカー(表4、11、および/または13のバイオマーカーなど)または正規化バイオマーカー(例えば、表3)の発現レベルを、本明細書で提示される方法において決定するステップは、試料を、複数の核酸プローブ(ヌクレアーゼ保護プローブ(NPP)または隣接ライゲーション可能プローブなど)または対合増幅プライマーと接触させることを包含することが可能であり、ここで、複数の中の各プローブ(またはライゲーション可能プローブのセット)または対合プライマーは、複数の核酸プローブまたは対合プライマーが、表4、11、および/または13のその/それらの相補的なバイオマーカーとハイブリダイズすることを可能とする条件下で、少なくとも2つの表4、11、および/もしくは13のバイオマーカーのうちの1つまたは表3の正規化バイオマーカーに対して特異的、かつ、相補的である。一例では、方法はまた、試料を複数の核酸プローブ(NPPなど)と接触させた後で、試料を、一本鎖核酸分子を消化するヌクレアーゼと接触させることも包含しうる。他の例では、表4、11、および/もしくは13の、少なくとも2つのバイオマーカーの各々、または表3の正規化バイオマーカーを、各々のこのようなバイオマーカーに特異的な複数の(例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つの)プローブからなる「プローブセット」であって、そのデザインが、例えば、このような遺伝子産物から得られるシグナルを増大させるか、または同じ遺伝子産物の複数の変異体を検出するのに有用でありうる「プローブセット」と接触させる。
本開示される方法の特定の実施形態では、定量的ヌクレアーゼ保護アッセイおよびアレイ(下記で記載されるアレイなど)を活用して、核酸を試料中で検出する。定量的ヌクレアーゼ保護アッセイは、それらの各々が参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、国際特許公開第WO99/032663号;同第WO00/037683号;同第WO00/037684号;同第WO00/079008号;同第WO03/002750号;および同第WO08/121927号;ならびに米国特許第6,238,869号;同第6,458,533号;および同第7,659,063号において記載されている。また、Martelら、Assay and Drug Development Technologies.、2002年、1巻(1−1号):61〜71頁;Martelら、Progress in Biomedical Optics and Imaging、2002年、3巻:35〜43頁;Martelら、Gene Cloning and Expression Technologies、Q. LuおよびM. Weiner編、Eaton Publishing, Natick(2002年);Seligmann, B.、PharmacoGenomics、2003年、3巻:36〜43頁;Martelら、「Array Formats」、「Microarray Technologies and Applications」、U.R. MullerおよびD. Nicolau編、Springer−Verlag、Heidelberg;Sawadaら、Toxicology in Vitro、20巻:1506〜1513頁;Bakirら、Biorg. & Med. Chem Lett、17巻:3473〜3479頁;Krisら、Plant Physiol.、144巻:1256〜1266頁;Robertsら、Laboratory Investigation、87巻:979〜997頁;Rimszaら、Blood、2008年10月15日、112巻(8号):3425〜3433頁;Pechholdら、Nature Biotechnology、27巻、1038〜1042頁も参照されたい。これらの全ては、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
いくつかの方法の例では、それらの検出の前に、またはそれらの検出のための手段として、核酸分子(核酸遺伝子産物(例えば、mRNA、miRNAまたはlncRNA)またはヌクレアーゼ保護プローブなど)を増幅する。いくつかの例では、増幅中に、例えば、リアルタイムRT−PCRを使用することにより、核酸の発現レベルを決定する。
RNAシーケンシングは、マルチプレックス化された遺伝子発現情報を得るための別の方途を提供し、いくつかの実施形態では、ハイスループットの遺伝子発現情報を得るための別の方途を提供する。当技術分野では、RNAシーケンシングの多数の特定の方法が公知であり、かつ/または開発されている(1つの総論として、ChuおよびCorey、Nuc. Acid Therapeutics、22巻:271頁(2012年)を参照されたい)。全トランスクリプトームシーケンシング技法およびターゲティングRNAシーケンシング技法の各々が利用可能であり、開示される方法においても有用である。シーケンシングベースの遺伝子発現解析ための代表的な方法としては、遺伝子発現の連続解析(SAGE)、大規模並列処理特徴配列決定法(massively parallel signature sequencing)(MPSS)による遺伝子発現解析、全トランスクリプトームショットガンシーケンシング(別名、WTSSまたはRNA−Seq)、またはヌクレアーゼ保護シーケンシング(別名、qNPS、またはNPSeq;PCT公開第WO2012/151111号を参照されたい)が挙げられる。
本開示される方法のいくつかの実施形態では、メラニン細胞含有試料(例えば、皮膚生検)中の遺伝子発現のレベルを決定するステップは、試料中の1または複数のタンパク質を検出する(例えば、このようなタンパク質の相対量または実際量を決定することにより)ことを含む。当技術分野では、タンパク質を検出する日常的な方法が公知であり、本開示は、タンパク質検出の特定の方法に限定されない。
必要に応じて、遺伝子発現産物(例えば、核酸(mRNA、miRNA、lncRNAなど)またはタンパク質)を検出するのに使用されるアッセイは、アッセイの性能を評価するのに使用される陽性および陰性の工程対照要素(process control element)の両方を有する。
遺伝子発現データは、「疾患の防止および治癒、生物学的進化の機構、ならびに薬物の発見に関連する基本的な問題に取組むための鍵を含有する」ことが十分に受容されている(LuおよびHan、Information Systems、28巻:243〜268頁(2003年))。いくつかの例では、このようなデータから情報を抜き出すことは、1または複数の検出される遺伝子産物の存在、非存在、または定性量(例えば、高度、中程度、低度)から、定性的な決定を下すことと同じく単純である。他の例では、生の遺伝子発現データを、前加工する(例えば、バックグラウンドを減算する、対数変換する、かつ/または補正する)場合もあり、正規化する場合もあり、かつ/または分類アルゴリズムにかける場合もある。これらの側面については、下記でより詳細に記載する。
バックグラウンド減算
いくつかの方法の実施形態では、生の遺伝子発現データは、バックグラウンド減算する。この補正は、例えば、データを、マイクロアレイなど、マルチプレックス化された方法を使用して収集した場合に使用することができる。このような変換の1つの目的は、例えば、マイクロアレイ表面の1つの部分が、いかなる生物学的理由もなく、表面の別の部分より「明るく」見える場合に、局所的効果について補正することである。当技術分野では、バックグラウンド減算の方法が周知であり、例えば、(i)局所的バックグラウンド減算(例えば、スポットマスクの外側であるが、スポット中心を中心とするバウンディングボックス内にある全てのピクセルについて考慮する)、(ii)モルフォロジーオープニング(morphological opening)によるバックグラウンドの推定(元の画像から減算するためのバックグラウンド画像を作成するには、オープニングフィルタ、エロージョンフィルタ、ダイレーション フィルタ、およびランクフィルタなど、非線形モルフォロジーフィルタ(Soille、Morphological Image Analysis: Principles and Applications、Berlin、Springer−Verlag(1999年)を参照されたい)に依拠する)、(iii)定常バックグラウンド(全てのスポットについて、定常バックグラウンドを減算する)、Normexpによるバックグラウンド補正(共変量としてのバックグラウンド強度を使用して、正規分布および指数分布のコンボルーションを、フォーグラウンド強度に適合させると、観察されるフォーグラウンドを所与としたときに予測されるシグナルが補正強度となる)を含む。
多くの生物学的変数(例えば、遺伝子発現データ)は、統計学的パラメトリック検定の仮定を満たさず、例えば、このような変数は、正規分布しないか、等分散でないか、またはこれらの両方である(Durbinら、Bioinformatics、18巻:S105頁(2002年))。いくつかの場合には、データを変換することにより、統計学的仮定によりよく適合する。いくつかの方法の実施形態では、有用なデータの変換は、(i)各観察値の対数、例えば、底を10とする対数、底を2とする対数、底をeとする対数(自然対数としてもまた公知である)を取ることからなる対数変換であって、このような対数は定数因子だけ異なるため対数の選択は重要でない対数変換;または例えば、Durbin(上記)により記載されている分散安定化変換を含みうる。具体例では、このような方法において検出される各バイオマーカー(例えば、少なくとも2つの表4、11および/もしくは13のバイオマーカー、ならびに/または少なくとも1つの正規化バイオマーカー)についての生の発現値をlog(例えば、log2またはlog10)変換する。他の実施形態では、正規化するステップは、少なくとも2つの表4、11および/または13のバイオマーカーの各々のlog(例えば、log2またはlog10)変換された生の発現値を、少なくとも1つの正規化バイオマーカーのlog(例えば、log2またはlog10)変換された生の発現値(複数可)で除算することを含みうる。
いくつかの方法の実施形態では、遺伝子発現データにフィルタをかけて、信頼できないと考えられうるデータを除去することができる。当技術分野では、遺伝子発現データの信頼性を評価するための多くの方法が公知であり、以下の非限定的な例は、代表的な例であるに過ぎないことが理解される。
(i)信頼できないプローブセットから生じるデータは、プローブセットの信頼性を、一連の参照データセットに対してランク付けすることにより、解析から除外するように選択しうること。例えば、RefSeqおよびEnsembl(EMBL)は、極めて高品質の参照データセットであると考えられる。いくつかの場合には、RefSeq配列もしくはEnsembl配列にマッチするプローブセットに由来するデータはとりわけ、それらの予測される高い信頼性のために、マイクロアレイ解析実験に含めることができる。同様に、信頼できる参照データセットにそれほどマッチしないプローブセットに由来するデータは、さらなる解析から除外してもよく、ケースバイケースで包含について考慮する場合もあること;または
(ii)分散を呈示しないかまたは呈示する分散が小さなプローブセットは、さらなる解析から除外してよいこと。低分散プローブセットは、カイ二乗検定により解析から除外してよい。プローブセットは、その変換された分散が、自由度N−1のカイ二乗分布の99パーセントの信頼区間の左側にある場合、低分散であると考えられること;または
(iii)所与の遺伝子クラスターもしくは転写物クラスターについてのプローブセットは、例えば、他のデータ前加工ステップの後で、それらが最小数未満のプローブを含有する場合、さらなる解析から除外してよいこと。例えば、いくつかの実施形態では、所与の遺伝子クラスターもしくは転写物クラスターについてのプローブセットは、それらが1つ、2つ、3つ、4つ、または5つ未満のプローブを含有する場合、さらなる解析から除外してよいこと
を含むデータフィルタが有用でありうる。
正規化の目的は、生物学的効果に起因する変動を、観察および定量化しうるように、実験誤差に起因する(例えば、ピペティング、プレートにおける位置、画像のアーチファクト、全RNA量の差違などに起因する)変動を除去することである。この工程は、異なる試料型の間で観察される差違が、試料の生物学的特質の差違に真に起因するものであり、何らかの技術アーチファクトに起因するものではないことを確認する一助となる。実験中には、誤差が導入されうるいくつかの点が存在するが、これは、正規化により除外することができる。当技術分野では、遺伝子発現データを正規化するための方法が十分に確立されている(例えば、Methods in Microarray Normalization、Phillip Stafford編、Baton Rouge、FL: CRC Press、Taylor & Francis Groupにより刊行中、2008年)。
分類アルゴリズムの性能は典型的に、数千の特徴(遺伝子/タンパク質)について最適未満である。したがって、特徴選択法(feature selection method)を使用して、表現型を最もよく予測する特徴を同定する。選択された遺伝子/タンパク質は、分類子または予測モデルへと提示する。特徴空間の次元の縮減からは、以下の利益:(i)分類精確さを改善する利益、(ii)データを生成した基底的概念のよりよい理解をもたらす利益、および(iii)特徴の数が多く、トレーニングパターンの数が比較的少ない場合に生じるデータの過剰適合の危険性を克服する利益、が得られる。特徴選択を使用して、開示される遺伝子セットを決定した(したがって、対応する分類子には、上記の利点が組み込まれている)。
いくつかの方法では、遺伝子発現情報(例えば、表3、4、11、および/または13において記載されているバイオマーカーについての)を、アルゴリズムへと適用して、発現プロファイルを分類(例えば、メラニン細胞含有試料(皮膚生検など)が、良性の母斑であるのか、原発性黒色腫であるのか、これらのいずれでもない(判定保留(indeterminant)など)のか)する。本明細書で開示される方法は、遺伝子発現ベースの分類子であって、メラニン細胞含有試料を、母斑または黒色腫として特徴付けるための分類子を含みうる。特定の分類子実施形態を、提供される遺伝子セットおよび分類法に基づき記載するが、他の分類子実施形態も今や可能である。
決定木アルゴリズムとは、各々の内部のノードは、属性についての検定を示し、ブランチは、検定のアウトカムを表す、フローチャート様のツリー構造である。リーフノードは、クラスラベルまたはクラス分布を表す。決定木を作成するには、全てのトレーニング例をルートにおいて使用し、ツリーのルートにおける論理検定を適用し、次いで、トレーニングデータを、論理検定の値に基づき、サブグループへと分割する。この工程を帰納的に適用し(すなわち、属性を選択し、分岐させ)、1本のブランチ内の全てのデータ要素が同じクラスとなったら終了する。未知の標本を分類するには、その属性値を決定木に対して検定する。
1.トレーニング例数を、「N」とし、分類子内の変数の数を「M」とする。
2.「m」とは、ツリーのノードにおいて決定を下すのに使用される入力変数の数であり、mは、M未満とする。
3.置きかえを伴ってn回にわたり選択することにより、このツリーのトレーニングセットを、N例の利用可能なトレーニング例全てから選択する(すなわち、ブートストラップ標本を選ぶ)。残りのトレーニング例を使用して、それらのクラスを予測することにより、ツリーの誤差を推定する。
4.ツリーの各ノードについて、そのノードにおける決定が基づくm個の変数をランダムに選択する。トレーニングセット内のこれらのm個の変数に基づき、最良の分岐を計算する。
5.各ツリーを十分に成長させ、剪定(正規ツリー分類子を構築するときになされる場合がある)はしない。
表4、11、および/または13の遺伝子を使用して、統計学的予測モデルを開発するための1つの代表的な方法は、二極分布(binary distribution)およびロジットリンク関数によるロジスティック回帰である。このようなモデルのための推定は、フィッシャースコアリングを使用して実施することができる。しかし、正確ロジスティック回帰、経験的サンドイッチ推定量、または他の、バイアスを補正するか、分散を安定化させるか、もしくは他の形の補正推定技法により推定されるモデルもまた、多くの状況下で、類似のモデルであって、やや異なるパラメーターの推定値をもたらす一方で、定性的に一貫したパターンの結果をもたらすモデルを提供する。同様に、累積ロジット関数、相補的log−log関数、プロビット関数、または累積プロビット関数を含むがこれらに限定されない他のリンク関数も、同じ定性的パターンの結果を与える予測モデルをもたらすことが期待されうる。
予測モデル(アルゴリズム)の1つの代表的な形態は、
Logit(Yi)=β0+β1X1+β2X2+β3X3・・・βnXn
[式中、β0は、切片項であり、βnは、係数の推定値であり、Xnは、所与の遺伝子についての発現値の対数(例えば、底を2とする対数、または底を10とする対数などの、任意の対数)である。典型的に、全てのβの値は、−1,000を超え、かつ、1,000未満となろう。切片項であるβ0は、−200を超え、かつ、200未満となることが多く、−100を超え、かつ、100未満である例を伴う。さらなるβnは、n>0のとき、−100を超え、かつ、100未満でありうる]
である。
二値分類子を含む、開示される方法により、メラニン細胞含有試料など、生物学的試料を分類する場合、4つの可能なアウトカムが得られることが典型的である。予測からのアウトカムがpであり、実際の値もまたpである場合、アウトカムは、真陽性(TP)と呼ばれるが、実際の値がnである場合、アウトカムは、偽陽性(FP)と呼ばれる。逆に、予測アウトカムおよび実際の値の両方がnである場合は、真陰性が生じ、予測アウトカムはnであるが、実際の値がpである場合は偽陰性が生じる。試料が黒色腫(例えば、原発性黒色腫)であるのかどうかを決定しようとする実施形態について考察する。この場合における偽陽性は、試料が、検査では陽性とされているが、実際には黒色腫(例えば、原発性黒色腫)でない場合に生じる。他方、偽陰性は、試料が、実際には黒色腫(例えば、原発性黒色腫)であるが、検査では陰性(すなわち、黒色腫ではない)とされている場合に生じる。いくつかの実施形態では、関連する比率で利用可能な試料に対してなされる誤差をリサンプリングすることにより、現実世界における亜型の有病率を仮定するROC曲線を作成することができる。
偽陽性率(α)=FP/(FP+TN)−特異度
偽陰性率(β)=FN/(TP+FN)−感度
検出力=感度=1−β
陽性尤度比=感度/(1−特異度)
陰性尤度比=(1−感度)/特異度
[式中、TNは、真陰性であり、FNは、偽陰性であり、TPおよびFPは、上記で定義した通りである]である。
本明細書で記載される、分類子を伴う方法などの方法は、多数の様式で実装することができる。いくつかの代表的な非限定的な実施形態を下記に記載する。
本開示はまた、コンピュータで読取り可能な保存媒体(例えば、CD−ROM、メモリキー、フラッシュメモリカード、ディスケットなど)であって、コンピュータ環境内で実行されると、本明細書で記載される応答尤度評価の結果の全部または一部を実行するアルゴリズムの実装を提供するプログラムをその上に保存した保存媒体も想定する。コンピュータで読取り可能な媒体が、本明細書で記載される方法を実行するための完全なプログラムを含有する場合、プログラムは、収集、解析、および出力の生成のためのプログラムの命令を含み、一般に、コンピュータで読取り可能なコードデバイスであって、本明細書で記載されるとおり、ユーザーと対話する、そのデータを解析情報と共に加工する、および、そのユーザーのために固有の印字媒体または電子媒体を作成するためのコードデバイスを含む。
いくつかの実施形態では、特定の試料(患者)についてのスコアを決定したら、そのスコアを、医師または他の介護者へと表示し、かつ/または伝えることができる。例えば、検査の結果は、認知可能な出力であって、検査の結果についての情報を提供する出力により、ユーザー(医師または他の保健従事者、検査室関係者、または患者など)へと提供する。いくつかの例では、出力は、紙への出力(例えば、書面化された出力または印字された出力)、スクリーン上の表示、グラフ式の出力(例えば、グラフ、図表、または他の図)、または聴覚的出力である。したがって、出力は、作成された報告を含みうる。
開示される方法の結果として、メラニン細胞含有試料(例えば、皮膚生検)を、良性(例えば、母斑)試料もしくは悪性(例えば、原発性黒色腫などの黒色腫)試料、または判定保留の試料もしくは疑わしい試料(例えば、がん、疾患、または状態を示唆する試料)、あるいは非診断(non−diagnostic)試料(例えば、がん、疾患、または状態の存在または非存在に関してもたらす情報が不十分である試料)として特徴付けることができる。これらの(および他の可能な)結果の各々は、訓練された臨床従事者に有用である。いくつかの方法の実施形態は、下記でより詳細に記載されるとおりの臨床的に関与するステップを含む。
診断は、被験体(例えば、患者)に、いかなる疾患または状態を有するまたは有しうるのかの情報を与える。本開示を通してより具体的に記載される通り、メラニン細胞含有試料を特徴付ける、任意の開示される方法の任意の結果は、例えば、被験体または保健従事者に、診断として提供することができる。したがって、いくつかの方法の実施形態では、診断(良性(例えば、母斑)もしくは悪性(例えば、原発性黒色腫などの黒色腫)、または判定保留の、もしくは疑わしい(例えば、がん、疾患、または状態を示唆する)、あるいは非診断(例えば、がん、疾患、または状態の存在または非存在に関してもたらす情報が不十分である)など)を、被験体または保健従事者に提供することが想定される。
予後診断とは、その試料が特定の検査結果(例えば、黒色腫と対比した母斑)を受けた被験体についての、起こり得る健康転帰である。予後診断の不良とは、被験体についての長期にわたる見通しが良好でないこと、例えば、1、2、3、または5年間の生存率が、50%以下(例えば、40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、2%、または1%以下)であることを意味する。他方、予後診断の良好とは、被験体についての長期にわたる見通しが、かなり良好であること、例えば、1、2、3、または5年間の生存率が、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、または90%を超えることを意味する。
開示される方法は、試料が黒色腫(例えば、原発性黒色腫)として診断された場合に、黒色腫(例えば、原発性黒色腫)のための処置について被験体を選択するステップもさらに含みうる。代替的に、開示される方法は、試料が良性の母斑として診断された場合に、処置をしないことについて被験体を選択することもさらに含みうる。
本明細書では、発現(表4、11、および/または13の試料型特異的バイオマーカーのうちの2つ以上の発現など)を検出するのに使用されうるアレイ、例えば、上記で論じたとおり良性の母斑または原発性黒色腫としてのメラニン細胞含有試料の特徴付けにおける使用のためのアレイが開示される。いくつかの実施形態では、開示されるアレイはまた、1または複数の正規化バイオマーカー(例えば、表3の正規化バイオマーカー)の発現を検出するのにも使用することができる。他の実施形態では、開示されるアレイはまた、表6、8、または14の遺伝子セットなど、本開示を通して記載される遺伝子セットの発現を検出するのにも使用することができる。特定の例では、アレイ表面は、プレート、ビーズ(または複数のビーズ)、またはフローセル(例えば、複数のチャネルを有するフローセル)を含む。
アレイの固体支持体は、有機ポリマーから形成することができる。固体支持体に適する材料としては、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリイソブチレン、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリビニルピロリジン、ポリテトラフルオロエチレン(polytetrafluroethylene)、ポリビニリデンジフルオリド(polyvinylidene difluroide)、ポリフルオロエチレン−プロピレン、ポリエチレンビニルアルコール、ポリメチルペンテン、ポリクロロトリフルオロエチレン(polycholorotrifluoroethylene)、ポリスルホン(polysulforne)、ヒドロキシル化二軸延伸ポリプロピレン、アミノ化二軸延伸ポリプロピレン、チオール化二軸延伸ポリプロピレン、エチレンアクリル酸、エチレンメタクリル酸(thylene methacrylic acid)、およびこれらのコポリマーのブレンド(米国特許第5,985,567号を参照されたい)が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書で開示されるアレイに適する基材の他の例としては、ガラス(官能化ガラスなど)、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SiN4、変性シリコン、ニトロセルロース、ポリスチレン、ポリカーボネート、ナイロン、繊維、またはこれらの組合せが挙げられる。アレイ基材は、硬く比較的非可撓性(例えば、ガラスまたは支持膜)の場合もあり、可撓性(ポリマー膜など)の場合もある。
アレイ内で、各々の配置された試料は、その位置を、アレイの次元(例えば、少なくとも二次元)内において、信頼できる形で、かつ、一貫した形で決定しうる点でアドレス可能である。アレイ上の特徴の適用位置は、異なる形状を呈する場合がある。例えば、アレイは、規則的(均一の行内および列内に配置されるか、または複数の個別に同定可能なビーズにより提示されるなど)な場合もあり、不規則的な場合もある。したがって、秩序化アレイ内では、試料をアレイへと適用するときに、各試料の位置を試料へと割り当て、各位置を適切な標的または特徴の位置と相関させるためのキーを与えることができる。秩序化されたアレイは、対称性の格子パターンで配置することが多いが、試料は、他のパターン(放射状に分布させた直線で、渦巻き線で、または秩序化クラスターで、など)で配置することもできる。アドレス可能なアレイは通常、コンピュータは、アレイ上の特定のアドレスを、その位置における試料についての情報(例えば、シグナル強度などを含む、ハイブリダイゼーションデータまたは結合データ)と相関させるようにプログラムしうるという点において、コンピュータで読取り可能である。コンピュータで読取り可能なフォーマットのいくつかの例では、アレイ内の個々の特徴を、例えば、コンピュータによりアドレス情報と相関させうるデカルト格子パターンで規則的に配置する。
本明細書ではまた、発現(表4、11、および/または13のバイオマーカーのうちの2つ以上の発現など)を検出するのに使用されうる、例えば、上記で論じたとおりの良性の母斑または原発性黒色腫としての試料の特徴付けにおける使用のためのキットも開示される。いくつかの実施形態では、開示されるキットはまた、1または複数の正規化バイオマーカー(例えば、表3の正規化バイオマーカー)の発現を検出するのにも使用することができる。特定の例では、キットは、本明細書で提示されるアレイのうちの1または複数を含む。
いくつかの例では、キットは、核酸プログラミングリンカーを含む。プログラミングリンカーは、アレイ上の捕捉プローブ(複数可)と相補的な第1の部分およびヌクレアーゼ保護プローブ(NPP)と相補的な第2の部分を有するヘテロ二官能性リンカーであり、NPPは、表4、11、および/または13で列挙される少なくとも2つのバイオマーカーのうちの1つ、または少なくとも1つの、表3の正規化バイオマーカーと相補的である。一例では、表面が、アドレス可能な固定化された捕捉プローブおよび核酸プログラミングリンカーを含むように、プログラミングリンカーを、捕捉プローブとあらかじめハイブリダイズさせ、それらを共有結合的に結合させないようにする。このような例では、キットは、プログラミングリンカーを伴う個別の容器を有さない。
臨床的に特徴付けられた皮膚試料の発見セットを使用した遺伝子の選択
母斑および黒色腫細胞は、全ての細胞と同様に大量の遺伝子を発現するが、それらの多くは、これらグループ間の識別には無関係である。したがって、有用な遺伝子情報を抽出して次元数を小さくするために、この実施例は、2600種より多くのmRNA標的発現の最初のスクリーニングにより、ヒト被験体から生検によって得られたホルマリン固定パラフィン包埋(「FFPE」)皮膚試料中で有意に差次的に発現されたmRNAが同定されることを記載する。さらに実施例全体で使用された方法論的な詳細も記載する。
簡単に言えば、各FFPE組織切片を測定して、そのおよその面積(cm2)を決定した。次いでかみそり刃を使用してスライド上の過量のパラフィンが入らないように組織切片を掻き取り、それを、ラベルを付けたエッペンドルフチューブに入れた。適用可能な組織切片0.3cm2当たり25μlの予熱した(50℃)ホルムアミドおよびSDSを含むSSC緩衝液に試料を懸濁した。次いで組織懸濁液上に、界面活性剤(例えば、Brij−97)を含有する500μlの鉱油(「非水層」)を載せ、この溶解反応物を95℃で10〜15分インキュベートした。この反応混合物を短時間で冷却した後、プロテイナーゼKを1mg/mlの最終濃度まで添加し、インキュベートを50℃で30〜60分続けた。溶解反応物の一部を即座にヌクレアーゼ保護アッセイ(nuclease protection assay)に使用するか(以下を参照)、または溶解反応物(またはそれらの残りの部分)を−80℃で凍結して保存した。その後の使用の前に、凍結した溶解反応物を50℃で10〜15分で融解させた。
25μlの溶解させた各溶解反応混合物を96ウェルプレートのウェル中に入れ、70μlの非水層を上に載せた。各ウェルに、5μlのヌクレアーゼ保護プローブ(NPP)ミックスを添加した。NPPミックス中に、検出しようとする複数のmRNA標的のそれぞれに相補的な1nMの(過量の)NPPが存在した。ArrayPlate検出用のNPPは、(i)長さが50塩基対であり、NPPのそれぞれの半分が40℃〜75℃の範囲のTm(および全長は60℃〜85℃の範囲のTm)を有し、さらに(ii)それぞれのmRNA標的への特異性に関して、インシリコで(NCBI BLASTを使用して)、インビトロで転写物を用いてテストされた(NPA反応において、他のNPP、他の標的、または他の分析物との交差反応性は実質的になかった)。ArraySlide検出用のNPPは、NPPの3’末端に向けて偏りのある内部のビオチン化塩基(T)を含有するという点のみにおいて異なっている。NPPはさらに、他の実施例で特異的に同定された遺伝子に関連して記載される。
SDSを含有するSSC緩衝液(「SSC−S」)中5nMの50塩基対プログラミングリンカー(「PL」)40μlを用いて、ArrayPlate番号1および2をプログラム化した。PLは、一部分がアレイ表面に取り付けられたユニバーサルアンカー配列に相補的であり、他の部分が特定のアレイ位置に割り当てられた特定のNPPに相補的な、人工的な25塩基対の二官能性合成オリゴヌクレオチドコンストラクト(アダプター)であった。プログラミング工程後、ストッププレートからの各反応物の全水相(60〜65μl)をプログラム化されたArrayPlateの対応するウェルに添加し、50℃で16〜24時間インキュベートし、未消化のNPP(これは、ヌクレアーゼ工程中に標的に結合するため、試料中に存在する標的の定量可能な代理物である)を捕捉した。その後、各反応物に1%乾燥脱脂乳を含むSSC−S中の5nMの二官能性検出リンカー(「DL」)を添加し、続いて60℃で1時間インキュベートした。DLは、一部分がそのそれぞれのNPPに相補的であり、他の部分がビオチン標識検出プローブ(「DP」)の1つまたは複数の(例えば、2または3つの)コピー(ここで、これらのDPは全てのDLに設計されている検出領域に特異的に結合できる)に相補的な人工的な25塩基対の二官能性合成オリゴヌクレオチドコンストラクトであった。検出のための「サンドイッチ」を完成させるために、反応物に40μlの3nMのDPを添加し、続いて50℃で45〜60分インキュベートした。次に、1%乾燥脱脂乳を含むSSC−S中の40μlのアビジンペルオキシダーゼ(1:600)を添加し、続いて37℃で30〜45分インキュベートした。最後に、ペルオキシダーゼ酵素の存在下で光を発し、HTG OMIX(商標)イメージャーを使用してその光が捕捉される化学発光基質ミックスを添加した。遺伝子発現は、ArrayPlateのアドレス可能な各位置における放出された光の強度と直接関連する。
次いで、NPP捕捉のために、各ヌクレアーゼ保護アッセイ反応物(60〜65μl)の全水相を、ArraySlide番号1または番号2に50℃で16〜24時間ハイブリダイズさせた。ビオチン化NPP捕捉後、それぞれのArraySlideを、1%Tweenを含有する1×SSC(「洗浄緩衝液」)で徹底的に洗浄した。検出酵素緩衝液(1×SSC−S、0.05%Tweenおよび乾燥脱脂乳)中のアビジン−ペルオキシダーゼ(1:600)50μlを37℃で45分かけて添加した。ArraySlideを洗浄し、続いて検出のために増幅用希釈剤(Perkin Elmer)中のTSA−Plus Cy3試薬を添加した。室温で3分インキュベートした後、ArraySlideを洗浄緩衝液中で洗浄することによってTSA−Plus Cy3反応を止めた。最後に、ArraySlideを回転させて乾燥させ、GenePix 4200ALマイクロアレイスライドスキャナー(Molecular Devices、Sunnyvale、CA)を使用して5μmの解像度でスキャンした。以下に記載した通りに、分析のためにNimbleScan2.5ソフトウェア(Roche NimbleGen、Madison、WI)を使用してTIFF画像からプローブ強度を抽出した。
この実施例における各アレイからの生データを、BRBアレイツール(インターネットで、2012年6月4日現在、linus.nci.nih.gov/〜brb/download_full_v4_2_1_stable.htmlで調査用途のために自由に利用可能)を使用して加工した。簡単に言えば、データを最小強度で閾値化し、分位数により正規化して、ある特定のデータフィルタを適用して非差次的データポイントを更なる分析から除去した。データをlog2変換し分析することにより、p値および対数の倍率変化値に基づいて、グループアレイ間で統計学的有意な差次的遺伝子を見出した。
臨床的に特徴付けられた皮膚試料の第二のセットで有意に差次的に発現された遺伝子−4種への正規化
この実施例は、JWCI組織バンクによって母斑または原発性黒色腫のいずれかとして特徴付けられたヒト皮膚生検間でそのmRNA発現が有意に異なる32種の遺伝子のセットを同定することを記載する。
特に他の定めがない限り、実施例2および3の全ての分析はSASバージョン9.3で行われた。
HTG OMIX(商標)イメージングデバイスを使用してデータを加工し、16ビットの画像を抽出した。ゲノム調査での標準的な実施と同様に、データのスケールをより線形にするために、生の強度値を、2を底とする対数で変換した。各遺伝子に3回の独立した観察を行い、(算術平均も同様に等しく役立つが)幾何平均を用いて3つ全ての観察を平均して、遺伝子ごとに2を底とする対数で示した発現値の複合平均値を作製した。植物遺伝子ANT(AP2様エチレン応答性転写因子;GenBankにおけるmRNAのRefSeq NM_119937;配列番号122)を、各アレイでの陰性対照として使用した。バックグラウンドを上回るANTが検出可能であった試料を使用して、アッセイの失敗をスクリーニングして除去した。また記述的な統計分析も行い、データファイル中の誤差に関してスクリーニングを行った。
あらゆる遺伝子は、全ての試料タイプまたは被験体にわたりその発現において一定を保つ(すなわち、ユニバーサル「ハウスキーパー」遺伝子)という科学界の定説は、支持を失いつつある(例えば、Avison、Measuring Gene Expression、Psychology Press、2007年、128頁)。したがって、特にマイクロアレイデータの正規化に好適な遺伝子を選択する他の選択肢が開発されている。いくつかの好適な方法が本明細書に記載されており、他の方法は当業者公知である。
上記の正規子を用いてデータを正規化するために、各遺伝子の全ての繰り返しに関する平均のlog2発現値を、BMP−1、MF12、NCOR2、およびRAP2b正規子(これはまた、「数種への正規化」としても当業者に公知であり、本明細書では「4種への正規化」と称される場合もある)の幾何平均で除算した。これまでに述べたように、算術平均も、上記の目的には十分である。得られた値に10の定数を乗算した。
表4の遺伝子を使用して統計予測モデルを開発するのに使用される原理は、二極分布およびロジットリンク関数を用いたロジスティック回帰であった。モデルの推定を、フィッシャーのスコア付けを使用して行った。しかしながら、正確なロジスティック回帰、実験的なサンドイッチ推定量もしくは他の補正されたバイアス、安定化された分散、または別の方式による補正推定技法を用いて推定されたモデルも、多くの環境下では、わずかに異なるパラメーター推定を生じつつも定性的には一貫した結果のパターンを生じる類似のモデルをもたらす。同様に、これらに限定されないが、累積ロジット、相補的な両対数、プロビットまたは累積プロビットなどの他のリンク関数も、同じ定性的な結果パターンをもたらす予測モデルを生じると期待され得る。
この実施例におけるモデル(アルゴリズム)の一次形態は:
Logit(Yi)=β0+β1X1+β2X2+β3X3・・・βnXn
であり、式中βoは、切片項であり、βnは、係数推定値(coefficient estimate)であり、Xnは、所定の遺伝子に関する2を底とする対数の発現値である。典型的には、全てのβの値は、−1,000より大きく1,000より小さい。多くの場合、β0切片項は、−200より大きく200より小さく、いくつかの場合においては−100より大きく100より小さい。追加のβnは、n>0の場合、−100より大きく100より小さい可能性がある。
2つの代替の正規子を用いた分析により、母斑か原発性黒色腫かを予測することに関するモデルの頑健性を実証する
さらに実施例2に記載された予測(例えば、診断)遺伝子の組合せの頑健性を、データを正規化するために正規化遺伝子の代替のセットを使用することにより示した。この実施例で示される中でも特に、このような分析は、[N4RA1、B4GALT1]予測モデルに対して有意義な効果を有さず、この結果は、実施例2に記載された全ての予測モデルの代表例であると考えられる。
機械学習法を使用した黒色腫および母斑の分類
この実施例では、ArrayPlate番号3および4(実施例2および3を参照)を含む4つのArrayPlateのセットを使用して、ヒト被験体から生検によって得られたFFPE皮膚試料の第三のセットにおけるmRNAおよびmiRNA発現を決定した。このようなデータを使用して、黒色腫および母斑試料で有意に差次的に発現されたmRNAおよびmiRNAのセットをうまく同定し、機械学習(例えば、ランダムフォレスト(Breiman、Machine Learning、45(1):5〜32頁(2001年))黒色腫−母斑分類器をトレーニングした。
利用できる試料に限界があり、各アレイで全ての試料を処理できたわけではないため、全ての生データは以下のような厳重な品質管理(すなわち予備的な加工)を受けた:生データからバックグラウンドを減算し、log2変換した。陰性対照遺伝子ANTに関して200より大きいRLUが測定されたあらゆる試料を失敗とみなし、それらの特定のウェルからの全てのデータをさらなる考察から除外した。各遺伝子での繰り返しの発現値に関して変動係数(CV)を決定した。試料の繰り返しのCVが8%を超える場合、平均から最も遠い繰り返しを外れ値として除外した。繰り返しの再現性をペアワイズ相関およびペアワイズ線形単回帰によって測定した。相関がr≧0.90を示し、線形回帰の切片がゼロとは統計学的に有意差がない場合、このような繰り返しは認められ、その他の場合は失敗とみなされた。2つより多くの失敗した繰り返しを示した全ての試料を、失敗試料と定義した。品質標準を満たさなかったデータを分析から除外した。表10に要約を示す。
加工データのいくつかの単変量解析(例えば、対数倍率変化、2試料のt検定(偽発見率(FDR)調整p値)、およびAUCロジスティック回帰分析)を行って、各データセットにおいて試料タイプ間で特定の遺伝子が有意に差次的に発現されたのかどうかを評価した。
次いで多変量解析を行って、検出された標的のどの部分集合が(統計的な(stastical)見地から)最も強く黒色腫試料タイプと母斑試料タイプとを識別したかを決定した。複数の特徴選択法(RF、LIMMA、t検定、AUC)を使用して、各データセットにおいて試料タイプ間で特定の遺伝子が有意に差次的に発現されたかどうかを評価した。機械学習アルゴリズム(例えば、ロジスティック回帰(LR)、ランダムフォレスト(RF)、サポートベクターマシン(SVM)、K−近傍法(KNN))を使用して、最初の分類器を開発した。特徴選択および分類性能の両方を一つ抜き(leave one out)交差検証法で評価した。遺伝子数の関数としての誤り率と受診者動作特性(ROC)曲線を使用して、分類器の性能を評価した。
Claims (20)
- メラニン細胞含有試料を特徴付ける方法であって、
被験体から得られるメラニン細胞含有試料中の、
(i)MAGEA2、PRAME、PDIA4、NR4A1、PDLIM7、B4GALT1、SAT1、RUNX1、SOCS3、および表13のバイオマーカーから選択されるバイオマーカーのうちの少なくとも2つ、ならびに
(ii)少なくとも1つの正規化バイオマーカー
についての発現レベルを決定し、これにより、該少なくとも2つのバイオマーカーの各々および該少なくとも1つの正規化バイオマーカーについての生の発現値をもたらすステップと、
該少なくとも2つのバイオマーカーの各々についての該生の発現値を、該少なくとも1つの正規化バイオマーカーについての該生の発現値に対して正規化して、該少なくとも2つのバイオマーカーの各々についての正規化された発現値をもたらすステップと、
該正規化された発現値を、回帰アルゴリズムまたは機械学習アルゴリズムにおいて使用して、出力値をもたらすステップと、
該出力値を、良性であるのか悪性であるのかがあらかじめ既知である複数のメラニン細胞含有試料中の、該少なくとも2つのバイオマーカーについての正規化された発現値から導出されたカットオフ値と比較するステップと、
該出力値が、該複数の既知の良性試料と、該カットオフ値の同じ側にあれば、該試料を良性として特徴付けるか、または該出力値が、該複数の既知の悪性試料と、該カットオフ値の同じ側にあれば、該試料を悪性として特徴付けるステップと
を含む方法。 - 前記少なくとも1つの正規化バイオマーカーが、母斑試料と原発性黒色腫試料との間で発現の統計学的有意差を有さない、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの正規化バイオマーカーが、表3のバイオマーカーのうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つまたは9つ全てを含む、請求項1から2のいずれかに記載の方法。
- 前記メラニン細胞含有試料中の複数のバイオマーカーについての遺伝子発現値を測定するステップであって、該複数のバイオマーカーについての発現の範囲が、該試料のトランスクリプトームにおけるバイオマーカー発現の全範囲を表すステップと、
このような複数のバイオマーカーについての中心傾向発現値を計算するステップと、
必要に応じて、外れ値を棄却し、該外れ値発現値を伴わずに再計算された複数の中心傾向発現値を計算するステップと
該中心傾向発現値、または、必要に応じて、該再計算された複数の中心傾向発現値を使用して、該少なくとも2つのバイオマーカーの各々についての前記生の発現値を正規化するステップと
をさらに含む、請求項1または2に記載の方法。 - 試料中の遺伝子発現を決定する方法であって、
被験体からメラニン細胞含有試料を得るステップと、
該試料中の、MAGEA2、PRAME、PDIA4、NR4A1、PDLIM7、B4GALT1、SAT1、RUNX1、SOCS3、および表13のバイオマーカーから選択されるバイオマーカーのうちの少なくとも2つを含む複数の遺伝子の発現レベルを決定するステップと、
該試料中の該複数の遺伝子の発現レベルの報告、または該試料の、該複数の遺伝子の該発現レベルに基づく、母斑または黒色腫としての特徴付けを提供するステップと
を含む方法。 - 前記少なくとも2つのバイオマーカーが、
N4RA1およびB4GALT1、または
NR4A1およびSOCS3、または
NR4A1、SOCS3、およびB4GALT1、または
MAGEA2、PRAME、PDIA4、NR4A1、PDLIM7、B4GALT1、SAT1、RUNX1、およびSOCS3
を含む、請求項1から5のいずれかに記載の方法。 - 前記少なくとも2つのバイオマーカーが、表4のバイオマーカーのうちの少なくとも2つを含み、前記出力値が、ロジスティック回帰アルゴリズムによりもたらされた、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
- 前記アルゴリズムが、
出力値=β0+β1X1+β2X2+・・・βnXn
[式中、Xnは、前記少なくとも2つの(最大でnの)表4のバイオマーカーについての発現値の対数であり、β0は、−200を超え、かつ、200未満であり、n>0に対する全てのβは、−1,000を超え、かつ、1,000未満である]
である、請求項1から7のいずれかに記載の方法。 - 前記少なくとも2つのバイオマーカーが、表11および13のバイオマーカーのうちの少なくとも2つを含み、前記出力値が、機械学習アルゴリズムによりもたらされた、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
- 前記少なくとも2つのバイオマーカーが、表11のバイオマーカーのうちの少なくとも2つまたは表13のバイオマーカーのうちの少なくとも2つを含む、請求項9に記載の方法。
- 前記少なくとも2つのバイオマーカーが、
B4GALT1、BAX、MAGEA2、NR4A1、PDIA4、PRAME、RUNX1、SOCS3、SAT1、PDLIM7、BIRC5、MET、MAGEC2、POLR2J3、ZFYVE16、およびBEST1のうちの少なくとも2つ、または
NR4A1、SOCS3、PRAME、POLR2J3、BEST1、RUNX1、BIRC5、MET、PDLIM7、ZFYVE16、HIF1A、およびPICALMのうちの少なくとも2つ
を含み、
前記出力値が、機械学習アルゴリズムによりもたらされた、
請求項1から10のいずれかに記載の方法。 - 前記少なくとも2つのバイオマーカーが、表4、表11、表13、または表4および表11の両方の遺伝子のうちの少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%である、請求項16または17に記載の方法。
- メラニン細胞含有試料における悪性度を決定する方法であって、
被験体から得られるメラニン細胞含有試料中の、B4GALT1、BAX、MAGEA2、NR4A1、PDIA4、PRAME、RUNX1、SOCS3、SAT1、PDLIM7、BIRC5、MET、MAGEC2、POLR2J3、ZFYVE16、およびBEST1から選択される少なくとも2つのバイオマーカーの発現レベルを決定するステップと、
該少なくとも2つのバイオマーカーの該発現レベルを入力として使用するアルゴリズムからの出力を計算するステップと、
該アルゴリズムの出力から、該出力を既知の悪性メラニン細胞含有試料に由来する参照標準と比較することにより、該試料が悪性であるのか悪性でないのかを決定するステップと
を含む方法。 - 前記少なくとも2つの選択されたバイオマーカーの前記発現レベルを、
(a)MFI2、RAP2B、BMP1、および/もしくはNCOR2のうちの少なくとも1つ、
(b)MFI2、NCOR2、RAP2b、およびBMP−1、
(c)RPS6KB2および/もしくはSDHA、または
(d)前記メラニン細胞含有試料中で発現した少なくとも1つの遺伝子であって、該少なくとも2つのバイオマーカーではなく、その発現が、代表的な複数のメラニン細胞含有試料において有意に異ならない遺伝子
からなる群から選択される少なくとも1つの正規化バイオマーカーの該発現レベルに対して正規化するステップをさらに含む、請求項13に記載の方法。 - 発現レベルを決定するステップが、核酸の発現を決定することを含む、請求項1から14のいずれかに記載の方法。
- 核酸の発現を決定することが、前記試料を、複数の核酸プローブまたは対合増幅プライマー対と接触させることを含み、各プローブまたは対合プライマーは、該複数の核酸プローブまたは対合プライマーがその/それらの相補的な少なくとも2つのバイオマーカーとハイブリダイズすることを可能とする条件下で、前記少なくとも2つのバイオマーカーのうちの1つに対して特異的、かつ、相補的である、請求項15に記載の方法。
- 前記試料を前記複数の核酸プローブと接触させた後で、該試料を、一本鎖核酸分子を消化するヌクレアーゼと接触させることをさらに含む、請求項16に記載の方法。
- 少なくとも3つのアドレス可能な位置であって、各位置が、同じ特異性を有する固定化された捕捉プローブを含み、各位置が、各他の位置における捕捉プローブとは異なる特異性を有する捕捉プローブを含む位置
を含むアレイであって、
該少なくとも3つの位置のうちの2つにおける該捕捉プローブが、MAGEA2、PRAME、PDIA4、NR4A1、PDLIM7、B4GALT1、SAT1、RUNX1、SOCS3、および表13のバイオマーカーのうちの2つ以上を含むバイオマーカーに、直接的または間接的に、特異的にハイブリダイズすることが可能であり、該少なくとも3つの位置のうちの1つにおける該捕捉プローブが、表3に列挙される正規化バイオマーカーに、直接的または間接的に、特異的にハイブリダイズすることが可能であり、
各捕捉プローブの該特異性が、該アレイの該アドレス可能な位置により同定可能である
アレイ。 - 前記少なくとも3つのアドレス可能な位置の各々が、個別に同定可能なビーズまたはフローセル内のチャネルである、請求項18に記載のアレイ。
- 請求項18または19に記載のアレイ、ならびに
溶解緩衝液を含有する容器;
一本鎖核酸に特異的なヌクレアーゼを含有する容器;
複数の核酸プログラミングリンカーを含有する容器;
複数のNPPを含有する容器;
複数の二官能性検出リンカーを含有する容器;
該二官能性検出リンカーに特異的に結合する検出プローブを含有する容器;および
検出試薬を含有する容器
のうちの1または複数
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