JP2015520395A - グルコースセンサー - Google Patents

Abstract

さらにマンニトールなどの干渉物質を含むことがある試料中のグルコース量を定量する方法が、本明細書で提供される。試料中の干渉物質の量に対するそれらの感度が異なる測定法を使用して、少なくとも２つの測定値を得ることで、干渉物質が試料中に存在するかどうかを決定するために結果を比較することが可能になる。本明細書に記載される方法を実施するためのグルコースセンサーも提供される。

Description

本書は、干渉物質種、例えば、マンニトールを含むことがある試料中のグルコースを検出するためのグルコースセンサーに関する。そのような試料中のグルコース量を定量する方法も提供する。

ボロン酸は、１，２−及び１，３−ジオールと可逆的な付加生成物を形成することが知られている。この現象は、グルコースの連続測定用のセンサーを設計する試みで、ボロン酸受容体を発色団又は蛍光体に結合させることにより利用されてきた。１，２−ジオールとの１：１付加生成物を生成するジボロン酸蛍光体の化学的応用も、設計されてきた。さらに、ジボロン酸が、ショートリンカーを介して蛍光体に結合する場合、その化学的性質は、光誘起電子移動（「ＰＥＴ」）機構により発揮させることができる。

生理的グルコースを測定するセンサーの開発において、このような化学的応用を利用する大きな動きがあった。その焦点は、グルコース濃度を算出するための精度及び信頼性を改善することであった。

干渉物質種は、時折血液中に大量に存在することがある。例えば、マンニトールは、臨床状態で存在することがある。マンニトールを含む干渉物質種は、グルコースセンサー中のボロン酸受容体への結合に関してグルコースと競合する能力を持ち得る。

マンニトールなどの干渉物質種は、グルコース検出法において誤差をもたらす可能性がある。糖類（例えば、マンニトール）などのいくつかの潜在的干渉物質は、グルコースに類似の分子量及び化学構造を有する。したがって、保護バリア層をいくつかの潜在的干渉物質を阻止するのに使用することができるものの、マンニトールを含む潜在的干渉物質は、グルコース透過性バリア層を透過することができる。（例えば、血液中にマンニトールなどの干渉物質が存在するため）患者のグルコース濃度のモニタリング時に重大な誤差が生じる場合には、潜在的に危険な誤った診断及び／又は治療様式が起り得る。

したがって、本明細書で提供されるグルコースセンサー及び方法は、グルコースセンサーが化学的性質を示す際に生じる不正確さの問題、特に、このような不正確さが、試料中の干渉物質の存在のため生じる場合の問題に対処する。

本明細書で提供される方法は、試料中の干渉物質の量に対する感度が異なる第１及び第２の測定法を使用して、グルコース量の２つの測定値を得ることを含むことができる。２つの測定値間の比較は、任意の干渉物質が試料中に存在するかどうかを決定するのに使用することができ、存在する場合は、この問題に対処するため、例えば、試料中のグルコース濃度の正確な評価を行うための適切な工程を行う。

したがって、干渉物質をさらに含み得る試料中のグルコース量を定量する方法は、
グルコースに結合するための第１の受容体及び第１の受容体に附随する第１の蛍光体を含む第１の指標系を少なくとも含む感知領域と、
前記感知領域に光を導入するための光導波路と
を含むグルコースセンサーを、試料に挿入し、
前記センサーの感知領域に入射光を提供して、前記第１の蛍光体の発光を検出することを含む第１の測定法により、グルコース量の第１の測定値を得、
第２の測定法によりグルコース量の第２の測定値を得（ここで、第２の測定法は、試料中の前記干渉物質の量に対する感度の点で第１の測定法と異なる）、
前記第１の測定値と前記第２の測定値を比較し、それによって、任意の前記干渉物質が試料中に存在するかどうかを決定すること
を含むことができ、前記干渉物質は、グルコースの前記第１の受容体への結合に干渉することができる物質である。

ある場合には、本明細書で提供される方法は、
グルコースに結合するための第１の受容体及び第１の受容体に附随する第１の蛍光体を含み、前記第１の受容体が、グルコースとの会合定数Ｋ_Ｇ１及び前記干渉物質との会合定数Ｋ_Ｍ１を有する、第１の指標系、及び
グルコースに結合するための第２の受容体及び第２の受容体に附随する第２の蛍光体を含み、前記第２の受容体が、グルコースとの会合定数Ｋ_Ｇ２及び前記干渉物質との会合定数Ｋ_Ｍ２を有し、Ｋ_Ｇ２／Ｋ_Ｍ２はＫ_Ｇ１／Ｋ_Ｍ１と異なる、第２の指標系
を含む感知領域と、
前記感知領域に光を導入するための光導波路と
を含むグルコースセンサーを試料に挿入し、
前記センサーの前記感知領域に入射光を提供し、
前記第１の蛍光体の発光を検出することを含む第１の測定法により、グルコースの量の第１の測定値を得、
前記第２の蛍光体の発光を検出することを含む第２の測定法により、グルコースの量の第２の測定値を得、
前記第１の測定値と前記第２の測定値を比較し、それによって、前記干渉物質が試料中に存在するかどうかを決定し、試料中の前記干渉物質の存在に対して修正すること
を含む。

この好ましい方法、すなわち、センサーの感知領域に入射光を（単一のステップで）提供し、第１及び第２の蛍光体の両方の発光を（単一の発光スペクトル／単一の発光測定で）検出することを含む発光蛍光技法は、単一の実験プロトコールを、第１及び第２の測定値を得るために同時に使用することができるので、特に有利である。本明細書でさらに説明する通り、この２つの蛍光体の蛍光を比較することにより、系の蛍光への任意の干渉物質の寄与を修正（除去）することが可能になる。

したがって、この好ましい方法では、例えば、血液試料を採取し、それを（例えば、電気化学的方法により）実験室分析を行うことによる、試料の干渉物質含有量の個別の実験的検証を行う必要はない。したがって、本書の好ましい方法は、特に便利で、（例えば、特別に訓練された医療従事者でなくとも）迅速且つ簡易に操作することができる。

本書は、グルコースセンサー、特に、干渉物質をさらに含み得る試料中のグルコース量を定量するためのグルコースセンサーであって、
グルコースに結合するための第１の受容体及び第１の受容体に附随する第１の蛍光体を含み、前記第１の受容体が、グルコースとの会合定数Ｋ_Ｇ１及び前記干渉物質との会合定数Ｋ_Ｍ１を有する、第１の指標系、及び
グルコースに結合するための第２の受容体及び第２の受容体に附随する第２の蛍光体を含み、前記第２の受容体が、グルコースとの会合定数Ｋ_Ｇ２及び前記干渉物質との会合定数Ｋ_Ｍ２を有し、Ｋ_Ｇ２／Ｋ_Ｍ２はＫ_Ｇ１／Ｋ_Ｍ１と異なる、第２の指標系
を含む感知領域と、
感知領域に光を導入するための光導波路と
を含むグルコースセンサーも提供する。

このグルコースセンサーは、本書の好ましい方法を実施するのに使用することができる。

さらに好ましい特徴及び実施形態は、附随の明細書及び添付の特許請求の範囲に記載される。

図１は、光ファイバーを組み込んでいるセンサーを示す。 図１ａは、光ファイバーを組み込んでいるセンサー用のモニターを示す。 図２は、センサーの感知領域の実施形態を示す。 図３は、センサーの感知領域の実施形態を示す。 図３ａは、センサーの感知領域の実施形態を示す。 図４は、本明細書で提供する方法を模式的に例示するフローチャートである。 図５は、本明細書で提供する方法の一実施形態を模式的に例示するフローチャートである。 図６は、本明細書で提供する方法の別の実施形態を模式的に例示するフローチャートである。 図７は、例２の結果を示す。Ａ）３５０及び４０５ｎｍの励起波長、２１４ｍＭの［Ｄ−グルコース］_{ｔｉｔｒａｎｔ}でのＰＢＳ中のＤ−グルコースに対するヒドロゲル４の結合試験で記録された蛍光スペクトル（より低い線からより高い線は、より低濃度からより高濃度の順に従っていることに留意されたい）、Ｂ）３５０及び４０５ｎｍの励起波長、１８４ｍＭのＰＢＳ中の［マンニトール］_{ｔｉｔｒａｎｔ}でのＤ−マンニトールに対するヒドロゲル４の結合試験で記録された蛍光スペクトル（より低い線からより高い線は、より低濃度からより高濃度の順に従っていることに留意されたい）、Ｃ）Ｄ−グルコースに対するヒドロゲル４の相対蛍光強度の炭水化物濃度に対するプロフィール、λｅｘ＝３５０ｎｍ、λｅｍ＝３８０ｎｍ及びλｅｘ＝４０５ｎｍ、λｅｍ＝４８７ｎｍ、及びＤ）Ｄ−マンニトールに対するヒドロゲル４の相対蛍光強度の炭水化物濃度に対するプロフィール、λｅｘ＝３５０ｎｍ、λｅｍ＝３８０ｎｍ及びλｅｘ＝４０５ｎｍ、λｅｍ＝４８７ｎｍ。

本明細書に記載される方法は、
グルコースと結合するための第１の受容体及び第１の受容体に附随する第１の蛍光体を含む第１の指標系を少なくとも含む感知領域と、
前記感知領域に光を導入するための光導波路と
を含むグルコースセンサーの使用を含むことができる。

本明細書で記載される方法では、ファイバー光グルコースセンサー（すなわち、光導波路が光ファイバーであるグルコースセンサー）を使用することができるが、本書に記載の方法は、様々な型の光導波路を有するセンサーを用いて実施することもできる。

本明細書で記載されるグルコース検出方法は、水溶液中で実施することができる。ある場合には、本明細書で記載されるグルコース検出方法は、間質組織や血液などの体液中で実施することができる。例えば、本明細書に記載されるグルコースセンサーは、侵襲的センサーとして使用することができ、血管に挿入することができる。本明細書で提供されるグルコース検出方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ用の非侵襲的センサー、埋め込み型センサー、及び／又は皮下センサーを使用することができる。

光ファイバーを組み込んでいるセンサーの例を、図１及び１ａに示す。センサー１は、その遠位端に感知領域３を含む光ファイバー２を備える。ある場合には、センサー１は、侵襲的センサーとすることができる。センサー１は、ファイバー２を備える。ファイバー２は、患者への挿入、例えば、カニューレを通して血管へ挿入するために適合させることができる。感知領域３（図２、３及び３ａでより詳細に示す）は、指標系が含まれるセル又はチャンバー７を含む。光ファイバーは、ケーブル４を通してコネクター５に延長され、そのコネクター５は、適切なモニター８と連結されるように構成される。モニターは、（ａ）５ａでコネクターにつながり、他の分岐で光センサー９用の適切な入射光源及び（ｂ）帰還信号１０のための検出器に接続する別の光ケーブル４ａを含むことができる。

ある実施形態では、センサーは、使い捨てセンサーである。使い捨てセンサーは、光源９及び検出器１０を含む非使い捨てモニターに接続するよう構成することができる。

図２に示すように、感知領域３は、ファイバー内のチャンバーの形態でセル７を組み込む。１つ又は複数の指標系が、導波路（例えば、ファイバー）により導入される入射光の経路に含まれる限り、セルは任意の形態を取り得る。したがって、セルは、ファイバー若しくは導波路の遠位端に結合していてもよく、任意の望まれる形状を有するファイバー内のチャンバーの形態であってもよい。

場合によっては、活性酸素種（「ＲＯＳ」）消光剤は、本明細書でさらに記載されるように、センサーに、例えば、感知領域内に又は任意選択のバリア層内に存在し得る。活性酸素種の例は、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）である。適切なＲＯＳ−消光剤は、米国特許出願第６１／５２４，５２５号及び国際出願ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５１９２１号に記載され、その内容は参照によって本明細書に組み込む。ＲＯＳ−消光剤をグルコースセンサーに組み込む適切な手段も、米国特許出願第６１／５２４，５２５号及び国際出願ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５１９２１号に記載され、これも参照によって本明細書に組み込む。

グルコースセンサーの感知領域３は、グルコースがセルに入ることを可能にする１つ又は複数の穴６ａ、６ｂを有する。グルコース透過性バリア層「ＢＬ」は、場合によりグルコースがバリア層を通してセルに入るようにこれらの穴を横切って提供され得る。本明細書で提供するグルコースセンサーに使用されるグルコース透過性バリア層は、タンパク質などの高分子量の材料の通過を少なくとも部分的に制限することができる。

図２、３及び３ａでは、任意選択のバリア層ＢＬが、感知領域３の全体にわたって提供されている。しかし、任意選択のバリア層ＢＬはまた、感知領域の一部のみに、例えば、穴６ａ及び６ｂの範囲にのみに提供されてもよい。

簡潔に述べると、図２は、任意選択のバリア層ＢＬが、感知領域３上に、ここでは、光ファイバーの先端上に、ジョイント（例えば、熱成形した接続ポイント）Ｊａ及びＪｂを介して直接適用する実施形態を示す。図３では、感知領域３は、分離したサポート１１内に提供され、バリア層ＢＬは、（この場合もジョイントＪａ及びＪｂを通して）サポート１１上に提供される。図３ａでは、バリア層自体がサポート構造「ＢＬ／１１」を形成する。バリア層が組み込まれる場合の適切なセンサー構造物、及びそのようなバリア層用の適切な材料に関する更なる詳細は、米国特許出願第６１／５２４，５２５号、国際出願ＰＣＴ／ＧＢ２０１２／０５１９２１号及び国際公開第２０１１／１０１６２６号パンフレットに記載され、その内容全体を参照によって本明細書に組み込む。

添付の図に示すものに加え、又は異なる設計特性を有するグルコースセンサーは、もちろん可能である。ただし、これらは、（ｉ）グルコースに結合するための第１の受容体及び第１の受容体に附随する第１の蛍光体を含む第１の指標系を少なくとも含む感知領域と、（ｉｉ）感知領域上に光を導くための光導波路の両方を含むことが求められる。例えば、国際公開第２００８／１４１２４１号パンフレット、国際公開第２００８／０９８０８７号パンフレット及び国際公開第２０１１／１１３０２０号パンフレットに記載及び例示されているようなグルコースセンサーを使用することができる。

「指標系」は、グルコースに結合するための受容体とそれに附随する蛍光体との組み合わせを意味し、その結果、グルコースが受容体に結合すると、蛍光体の発光パターン（例えば、波長、強度、寿命）は変化する（したがって、蛍光体の発光挙動が、グルコースの存在のための「指標」として作用することができる）。

第１の受容体及び第１の蛍光体は、第１の受容体−第１の蛍光体構築体として互いに直接結合していてもよい。適切な第１の蛍光体の例には、アントラセン、ピレン及びそれらの誘導体が含まれる。適切な第１の受容体の例は、少なくとも１つ（例えば１つ若しくは２つ）、又は少なくとも２つ（例えば２つ若しくは３つ）のボロン酸基を有する化合物などのボロン酸受容体である。

適切な受容体には、ヒ素含有受容体、テルル含有受容体及びゲルマニウム含有受容体、例えば、式Ｈ_３ＡｓＯ_３、Ｈ_２ＡｓＯ_３ ⁻、Ｈ_６ＴｅＯ_６、Ｈ_５ＴｅＯ_６ ⁻、Ｇｅ（ＯＨ）_６若しくはＧｅＯ（ＯＨ）_３ ⁻、又はそれらの誘導体の１つ又は複数の基を含む受容体も含まれる。そのような受容体の例には、米国特許出願公開第２００５／０１５８２４５号で開示される受容体が含まれ、その内容全体を参照によって本明細書に組み込む。さらに別の適切な受容体には、例えば、水素結合、ＣＨ−π相互作用及び／又は疎水性相互作用などの非共有相互作用を介してグルコースに結合することができる合成レクチンが含まれる。そのような合成レクチンの例は、Ｎａｔ Ｃｈｅｍ． ２０１２ ４（９） ７１８−２３に記載され、その内容全体を参照によって本明細書に組み込む。

好ましい一実施形態では、第１の受容体は次式（Ｉ）の基である。

式中、ｍ及びｎは、同じであるか又は異なり、通常１又は２であり、好ましくは１であり、Ｓｐは、脂肪族スペーサーであり、通常、アルキレン部分、例えば、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキレン部分、例えば、Ｃ_６アルキレン部分であり、Ｌ_１及びＬ_２は、他の部分、例えば、蛍光体又はヒドロゲルへの可能な結合点を表す。例えば、Ｌ_１及びＬ_２は、官能基に結合している、アルキレン、アルキレン−アリーレン又はアルキレン−アリーレン−アルキレン部分を表すことができる。他の部分への結合が想定されない場所では、官能基は、保護されるか水素原子により置換される。Ｌ_１及びＬ_２における典型的なアルキレン基は、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキレン基、例えば、メチレン及びエチレンである。典型的なアリーレン基は、フェニレン基である。官能基は、通常、例えば、蛍光体又はヒドロゲル（例えば、エステル、アミド、アルデヒド又はアジド）と結合するよう反応し得る任意の基である。スペーサーＳｐの長さを変えると受容体の選択性が変わる。Ｃ_６−アルキレン鎖は、グルコースに対する良好な選択性を有する受容体を提供することができる。そのような受容体の更なる詳細は、米国特許第６，３８７，６７２号に見られ、その内容全体を参照によって本明細書に組み込む。

本記載のセンサーに適切な第１の受容体の別の例には、式（ＩＩ）のものが含まれる。

式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ_２又はＣＨＲ_３を表し、
ｎは、１〜４であり、
ｍは、１〜４であり、ｎ＋ｍは、５であり、
Ｒ_２は、水素又はＣ_１−４アルキルを表し、
各Ｒ_１は、同じであるか又は異なり、水素、Ｃ_１−４アルキル又はＣ_３−７シクロアルキルを表すか、或いは
Ｒ_１は、隣接するＲ_１、Ｒ_２又はＲ_３基及びそれらが結合する炭素又は窒素原子と共に、Ｃ_３−７シクロアルキル又は５−若しくは６−員環ヘテロシクリル基を形成し、
ＸがＣＨＲ_３を表す場合、Ｒ_３は、隣接するＲ_１基及びそれが結合する炭素原子と共に、Ｃ_３−７シクロアルキル基を形成する。この型の受容体の更なる詳細は、米国特許出願公開第６１／４３１，７５６号に開示され、その内容を参照によって本明細書に組み込む。

１個のボロン酸基を有するボロン酸受容体の例は、以下の式（ＩＩＩ）の化合物である。

式中、
ｎは、１〜３であり、好ましくは１又は２であり、より好ましくは１であり、
Ｌ_１及びＬ_２は、他の部分、例えば、蛍光体又はヒドロゲルへの可能な結合点を表す。例えば、Ｌ_１及びＬ_２は、官能基に結合している、アルキレン、アルキレン−アリーレン又はアルキレン−アリーレン−アルキレン部分を表すことができる。他の部分への結合が想定されない場合には、官能基は、保護されるか水素原子により置換される。Ｌ_１及びＬ_２における典型的なアルキレン基は、Ｃ_１〜Ｃ_４アルキレン基、例えば、メチレン及びエチレンである。典型的なアリーレン基は、フェニレン基である。官能基は、典型的には、例えば、蛍光体又はヒドロゲル（例えば、エステル、アミド、アルデヒド又はアジド）と結合するように反応し得る任意の基である。

上記で説明したように、第１の受容体は、例えば、式（ＩＩＩ）の化合物のように１つのボロン酸基を有する化合物でもよい。しかし、より典型的には、第１の受容体は、２つのボロン酸基を含む。以下でさらに詳細に説明するように、第２の受容体が、さらに存在する場合、この第２の受容体は、式（ＩＩＩ）の化合物のように１つのボロン酸基を有する化合物でもよい。

本明細書では、用語アルキル又はアルキレンは、直鎖又は分岐鎖のアルキル基又はアルキレン部分を意味する。アルキレン部分は、例えば、１〜１５個の炭素原子を含むことができ、例えば、Ｃ_１−１２アルキレン部分、Ｃ_１−６アルキレン部分又はＣ_１−４アルキレン部分、例えば、メチレン、エチレン、ｎ−プロピレン、ｉ−プロピレン、ｎ−ブチレン、ｉ−ブチレン及びｔ−ブチレンなどである。Ｃ_１−４アルキルは、通常、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル又はｔ−ブチルである。疑義を回避するために述べると、２つのアルキル基又はアルキレン部分が存在する場合、アルキル基又はアルキレン部分は、同じであっても、異なっていてもよい。

アルキル基又はアルキレン部分は、置換されていなくても置換されていてもよく、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、アミン、（Ｃ_１−４アルキル）アミン、ジ（Ｃ_１−４アルキル）アミン及びＣ_１−４アルコキシから選択される１つ、２つ又は３つの置換基を含み得る。好ましくはアルキル基又はアルキレン部分は、非置換である。

本明細書では、アリーレン基は、単環式、二環式であり得る不飽和基、又は３個若しくは４個の縮合環を含み得る不飽和基である。アリーレン基は、典型的にはフェニレンである。アリーレン基は、置換されていなくても置換されていてもよい。適切な置換基は、Ｃ_１−４アルキル基、例えば、メチル及びエチルである。好ましくは、アリーレン基は、非置換である。

本明細書では、Ｃ_３−７シクロアルキル基は、典型的には、シクロペンチル又はシクロヘキシル基である。Ｃ_３−７シクロアルキル基は、置換されていなくても置換されていてもよい。適切な置換基は、Ｃ_１−４アルキル基、例えば、メチル及びエチルである。好ましくは、Ｃ_３−７シクロアルキル基は、非置換である。本明細書では５−又は６−員ヘテロシクリル基は、１以上の、通常１つ又は２つの、例えば１つの、Ｎ、Ｏ及びＳから選択されるヘテロ原子を含む５−又は６−員飽和環である。好ましいヘテロシクリル基は、窒素原子を含み、例えば、ピペリジニル及びピロリジニルである。ヘテロシクリル基は、置換されていなくても置換されていてもよい。適切な置換基は、Ｃ_１−４アルキル基、例えば、メチル及びエチルである。好ましくは、ヘテロシクリル基は、非置換である。

第１の受容体及び第１の蛍光体は、典型的には、互いに結合しており、さらにヒドロゲルなどのポリマーマトリックスに、又はデンドリマーに結合し得る。適切なヒドロゲル及びデンドリマーの例は、国際公開第２０１１／１０１６２４号パンフレットに記載されているものであり、その内容を参照によって本明細書に組み込む。

第１の受容体及び第１の蛍光体はまた、互いに直接結合していなくてもよい（例えば、それらは互いに結合していなくてもよく、ヒドロゲルマトリックス内に含まれるポリマー鎖などのポリマー鎖を介してのみ結合していてもよい）。第１の受容体と第１の蛍光体が互いに直接結合していない場合、それらは依然として指標系がグルコースに曝されたときに、第１の蛍光体の蛍光性挙動が変化するように相互作用する能力がなければならないことは明らかであろう。例えば、第１の蛍光体及び第２の蛍光体は、（例えば、電荷対として）静電的に結合する能力を有し得るが、その結合は、グルコースの存在により少なくとも部分的に破壊され得る。適切な第１の蛍光体の例には、ピラニン（ＨＰＴＳ）及びその誘導体、例えば、米国特許出願公開第２００９／０１７７１４３号に開示されているＨＰＴＳそれ自体及びその誘導体、ＨＰＴＳ−ＰＥＧ、ＨＰＴＳ−ＭＡ、ＨＰＴＳ−ＣＯ_２、ＨＰＴＳ−ＴｒｉＣｙｓ−ＭＡ及びＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡが含まれ、その内容全体を参照によって本明細書に組み込む。さらに適切な第１の蛍光体には、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社から市販されているＳＮＡＦ及びＳＮＡＦＬ染料が含まれ得る。適切な第１の受容体の例には、共役窒素含有ヘテロ環芳香族ビス−オニウム構造（例えば、ビオロゲン）に共有結合する芳香族ボロン酸が含まれる。そのような第１の受容体の例は、米国特許出願公開第２００９／０１７７１４３号で提供され、その内容全体を参照によって本明細書に組み込む。１つの特に適切な第１の受容体は、３，３’−ｏＢＢＶであり、米国特許出願公開第２００９／０１７７１４３号に記載されている。

本明細書において、語句「ｉｎ ｖｉｖｏ試料」は、試料が、ヒト又は動物（好ましくはヒト）の体内に存在する試料であることを意味する。例えば、そのような試料は、ヒト又は動物（好ましくはヒト）の体内に存在する血液などの体液である。ｉｎ ｖｉｖｏ試料は、ｅｘ ｖｉｖｏ試料、例えば、ｅｘ ｖｉｖｏ血液試料（この場合、試料は、ヒト又は動物の体内から取り出され（単離され）ている）と対比することができる。したがって、この明細書を通して、「ｉｎ ｖｉｖｏ試料」に実施される方法への言及は、方法が、ヒト又は動物（好ましくはヒト）の体内中のグルコースの量を定量する方法であることを意味する。しかし、例えば、本明細書で記載される侵襲的方法を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏでグルコース濃度を直接測定することにより、又は体内から試料を抽出し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでグルコース濃度を測定することにより、ｉｎ ｖｉｖｏ試料を、グルコース（又は干渉物質、例えば、マンニトール干渉物質）測定に供し得ることは明かである。後者の場合、測定する試料のグルコース（又は干渉物質、例えば、マンニトール干渉物質）濃度は、体内から取り出した時点でのｉｎ ｖｉｖｏ試料の濃度に対応する。

上記から、本明細書で使用されるｉｎ ｖｉｖｏ試料は、例えば、体内の干渉物質（例えば、マンニトール）の代謝によって、グルコース及び干渉物質（例えば、マンニトール）の濃度に関して時間の経過と共に変化することがわかる。したがって、本書で記載の方法が、異なる時点でｉｎ ｖｉｖｏ試料の測定を２回以上行う場合、試料は、必ずしもそれらの異なる時点で同じ組成を有しないであろう。

本書の方法が、ｉｎ ｖｉｖｏ試料に対し実施される範囲において、本明細書で提供される方法に従って実施されるすべての手順（試料にグルコースセンサーを挿入し、試料中のグルコース又は干渉物質の量を電気化学的に測定することを含む）は、ヒト又は動物の患者への実質的な健康リスクを伴わず、さらに高度の医学専門知識なしに実施することができるルーチン手順である。（例えば、本書の例示的グルコースセンサーを挿入する際の）カニューレの挿入や電気化学的測定を行う目的での（例えば、針での抜き取りによる）血液試料の採取などのステップは、当技術分野でルーチンであり、医者の関与を必要とするまでもなく、例えば、看護師により実施され得ることを理解されたい。したがって、本明細書で提供される方法は、ヒト又は動物の体に実施される手術方法を構成しない。

本明細書で提供される方法は、センサーの感知領域に入射光を提供することができ、グルコース量の第１の測定値は、前記第１の蛍光体の発光を検出することを含む第１の測定法により得る。

第１の測定法は、グルコースセンサーが試料と接触した後に、第１の蛍光体の発光の平衡測定をすることを含み得る。

一態様では、前記第１の蛍光体が、励起光に曝された時、第１の指標系は、（例えば、受容体と消光物質との会合により）第１の蛍光体の蛍光発光を少なくとも部分的に消光することができる第１の受容体を含み得る。この態様では、グルコースセンサーが試料と接触した時、試料中のグルコースは、第１の受容体と結合し、それによって少なくとも部分的に第１の受容体の消光効率を低下させ、その結果、第１の蛍光体からの発光の増大を生じる。

第１の測定法は、色素置換技法を使用し得る。

本明細書の議論に照らして、試料中に干渉物質が存在する場合、第１の測定値は、目的とするグルコースではなく、干渉物質（その一例はマンニトールである）の受容体への結合から生じる寄与を含み得ることを理解されたい。換言すると、第１の測定値は、それ自体で（すなわち、干渉物質の存在を考慮する更なる工程を行わずに）、干渉物質を含む試料中のグルコース濃度を正確に定量できないであろう。

したがって、本明細書で提供される方法は、図４のフローチャートで模式的に示すように、第２の測定法によるグルコース量の第２の測定値を得ることをさらに含む。第２の測定法の性質は重要ではない。本明細書で提供される方法は、試料中のグルコースの量を定量的に決定することができる。

第２の測定法は、試料中の干渉物質の量に対するその感度の点で第１の測定法と異なる。「干渉物質の量に対するその感度が異なる」ことによって、干渉物質を含む試料では、グルコースによりなされる寄与との比較において、第２の測定値に対してその干渉物質によりなされる寄与は、第１の測定値での対応する寄与と異なることを意味する。

２つの測定法が、「試料中の干渉物質の量に対する感度が異なる」かどうかは、当業者により容易に確定することができる。例えば、第２の測定法が、電気化学的方法である場合には、通常、その第２の測定法は、検査している分析物（すなわち、干渉物質の場合もあるが、通常、グルコース）にのみ高感度であり、それによって、試料中の干渉物質の量に対する感度が第１の測定法と必然的に異なるようになる。第２の測定法が、第２の指標系中の第２の蛍光体の発光を検出することを含む場合には、通常、第１及び第２の指標系は共に、グルコース及び干渉物質に対するその検出感度を評価するのに予め較正され、グルコース及び干渉物質に対する第１の指標系の検出感度は、グルコース及び干渉物質に対する第２の指標系の検出感度と異なる。

通常、第１及び第２の測定法は共に、試料中のグルコースの量を「直接的に」測定することができる。すなわち、第１及び第２の測定法は共に、試料中のグルコースの量に対して高感度であり、したがって、干渉物質がない場合には、試料中のグルコースの濃度を定量的に決定するのに使用することができる。

しかし、本明細書で提供される方法は、第２の測定法が干渉物質濃度に対して高感度であるが、グルコース濃度に対して、実際に、実質的に又は完全に無感応な場合も、実施することができることを理解されたい。例えば、ある場合に、第２の測定法は、干渉物質の濃度のみを直接的に示すが、明らかにそれでもなお第１の測定値との比較が可能であり、それによって任意の前記干渉物質が存在するかどうかを決定する。換言すると、第２の測定法は、グルコースの量の「直接的」ではなく「間接的」な第２の測定値を提供することができる。疑義を回避するために述べると、本明細書で提供される方法は、直接的なグルコース量の第２の測定値（第２の測定値はグルコースの寄与を含む）、又は間接的なグルコース量の第２の測定値（第２の測定値はグルコースの寄与を含まない）を使用することができることを強調する。

本明細書で提供される方法で使用する第２の測定法は、例えば、（図６フローチャートで模式的に示されるように）試料中のグルコース（又は干渉物質）の量を電気化学的に測定することを含み得る。ある場合には、第２の測定法は、例えば、（図５のフローチャートで図式的に示されるように）グルコースに結合する第２の受容体及び第２の蛍光体を含む第２の指標系に含まれる第２の蛍光体の発光を検出することを含み得る。これらの例示的な第２の測定法を、ここで順に議論する。

電気化学的な第２の測定法
試料中のグルコース量の電気化学的測定は、グルコースの電気化学的検出のための当技術分野で周知の技法を使用して実施することができる。電気化学的原理で動作する市販のグルコースセンサーは、本明細書で提供される方法を実施するために使用することができる。電気化学的なグルコース検出のための例示的装置は、ＹＳＩ（商標）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより提供される分析装置である。ある場合には、これらの装置に少量の（ｅｘ ｖｉｖｏ）試料を投入して、グルコース濃度を正確に決定することが可能である。例えば、本明細書で記載されるグルコースセンサーを使用してグルコース濃度のリアルタイムｉｎ ｖｉｖｏ分析を実施する場合、血液試料は、患者から取り出され、電気化学的分析のために使用することができる。

ある場合には、本明細書で提供される方法は、試料中の干渉物質の量を電気化学的に測定する第２の測定法を使用する。これは、本明細書で記載されるグルコースの「間接的な」第２の測定に対応することを理解されたい。

ある場合には、ｉｎ ｖｉｖｏ試料中のグルコースの量は、試料中のグルコース（又は干渉物質）の量を電気化学的に測定することを含む第２の測定法を使用する本明細書で記載される方法を使用して決定される。本明細書で記載される方法は、試料中に初期に存在する干渉物質が、時間と共にｉｎ ｖｉｖｏで代謝により除去されることに依存することができ、したがって、そのような方法は、当然、代謝により除去され得る（すなわち、代謝される）干渉物質に特に適切である。本明細書で記載される方法は、一旦、干渉物質が少なくとも実質的に代謝されてしまえば、最終的なグルコースの定量化された濃度を得ることができる。

ある場合には、本明細書で提供する方法で使用する第２の測定法は、試料中のグルコース（又は干渉物質）の量を電気化学的に測定することを含み、この方法は、
（ｉ）時点ｔ_ｔｅｓｔで前記第１の測定値を得、
（ｉｉ）前記第２の測定法により前記第２の測定値を得（ここで、前記第２の測定法は、前記時点ｔ_ｔｅｓｔで、前記試料中のグルコース、又は干渉物質の量を電気化学的に測定することを含む）、
（ｉｉｉ）前記第１の測定値と前記第２の測定値を比較し、それによって前記第１の測定値が、試料中の干渉物質からの寄与を含むかどうかを決定すること
を含む。

本明細書で提供される方法は、ヒト又は動物対象に実施することができ、試料は、前記対象のｉｎ ｖｉｖｏ体液である。例えば、ステップ（ｉ）は、時点ｔ_ｔｅｓｔで前記体液にｉｎ ｖｉｖｏ測定を実施することを含み得る（例えば、本明細書で記載されるような侵襲的測定、又は試料を取り出すことなく体に直接的に実施される他の任意の方法）。ステップ（ｉｉ）は、時点ｔ_ｔｅｓｔで前記対象から前記体液の一部を取り出し、それに対しｉｎ ｖｉｔｒｏ 電気化学的測定を実施することを含み得る。

ある場合には、ｔ_ｔｅｓｔで得られる結果は、干渉物質が、（蛍光発光）グルコースセンサーにより測定されるグルコース濃度に大きな悪影響を及ぼしているか（すなわち、大きな干渉による寄与をしているか）を確定するのに使用することができる。

「前記時点ｔ_ｔｅｓｔで、試料中のグルコース、又は干渉物質の量を電気化学的に測定すること」への言及は、時点ｔ_ｔｅｓｔで試料中に存在したグルコース、又は干渉物質の量の電気化学的測定値を得ることを意味する。電気化学的測定は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ試料の場合には針で抜き取ることによりある量の試料を得、次いでその中のグルコース、又は干渉物質の量を電気化学的に測定することにより行うことができる。

比較ステップ（ｉｉｉ）が、第１の測定値への干渉物質の実質的な寄与がないことを示す場合、更なるステップを行う必要はない（第１の測定値が正確であることが確認された）。グルコースセンサーの実際の使用において、長い期間にわたるグルコース濃度の継続（連続）測定が、第１の指標系を使用して実施できることを意味し、試料中の代謝されなかった干渉物質のために読み間違える危険がないことがいまや確証されたことが当然に理解される。

比較ステップ（ｉｉｉ）が、第１の測定値への干渉物質の実質的な寄与があることを示す場合、当業者（例えば、看護師）は、グルコースセンサーからのグルコース濃度測定の正確さが干渉物質により危ういことを確認できる。当業者は、干渉物質が、（少なくとも部分的に）代謝し、ｉｎ ｖｉｖｏ系から除去されたより遅い時に、グルコースセンサーを使用して正確な測定を行うべきであることを決定することができる。ある場合には、ｉｎ ｖｉｖｏ系から干渉物質が除去される概算の時間は、当業者（例えば、看護師）により、及び／又は本明細書で提供するセンサーにより算出することができる。例えば、本明細書で提供するセンサーを、計画時間を表示するモニター又はカウントダウンタイマーに接続していつ正確な測定が行えるかを示すことができる。「前記第１の測定値が、試料中の干渉物質からの寄与を含む」とは、第１の測定値が、（例えば、電気化学的測定により測定される）試料中のグルコースの「真の」（すなわち、実際の）濃度から少なくとも１％、例えば少なくとも２％、少なくとも５％、又は少なくとも１０％異なることを意味し得る。

いつ干渉物質が、（少なくとも部分的に）代謝したかを確定する適切なより遅い時間については、前記第１の測定値と前記第２の測定値を比較する前記ステップ（ｉｉｉ）において、前記第１の測定値が干渉物質からの寄与を実質的に含まない、又は低減された寄与を含むことが決定されるまで、一連のステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）を１回又は複数回それぞれ異なる時点で実施することが必要である。換言すると、干渉物質が、許容できる程度に代謝してしまうまで、１つ又は複数の測定、及び比較を行う。「干渉物質からの寄与が実質的にない又は低減された」とは、第１の測定値が、（例えば、電気化学的測定により測定される）試料中のグルコースの「真の」（すなわち、実際の）濃度より、多くて１０％、好ましくは多くて５％、より好ましくは多くて２％、より好ましくはさらに多くて１％より高い、又はより低いことを意味する。例えば、この方法は、一連のステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）を少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回又は少なくとも５回実施することを含み得る。ある場合には、この方法は、一連のステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）の実施を２０回以下、例えば、１０回以下又は５回以下に制限する。ある場合には、いつ干渉物質が、（少なくとも部分的に）代謝したかの適切なより遅い時間を、前記ステップ（ｉｉｉ）で、第１の測定値及び第２の測定値を比較し、それによって、ｔ_ｔｅｓｔで試料中の干渉物質量の概算値を得る（例えば、算出する）ことにより、確認することができる。多くの干渉物質のｉｎ ｖｉｖｏ代謝速度は、既知の数量であり、したがって、この方法は、
（ｉｖ）ｔ_ｔｅｓｔで試料中に存在する任意の干渉物質にとって十分な時間遅らさせて、試料を実質的に浄化し、
（ｖ）センサーの感知領域に入射光を提供し、前記第１の蛍光体の発光を検出し、それによって、試料中のグルコースの量の第３の測定値を得る（前記第３の測定は、前記干渉物質からの寄与が実質的にない又は低減されている）ことを
を含み得る。

「ｔ_ｔｅｓｔで試料中に存在する干渉物質にとって十分な時間遅らさせて、試料を実質的に浄化し」とは、第３の測定が、（例えば、電気化学的測定により測定される）試料中のグルコースの「真の」（すなわち、実際の）濃度より多くて１０％、好ましくは多くて５％、より好ましくは多くて２％、より好ましくはさらに多くて１％より高いか、又はより低くなるのに十分な時間遅らせることを意味する。

例示として、前記干渉物質がマンニトールである実施形態を考える。マンニトールｉｎ ｖｉｖｏの半減期、ｔ_１／２は、約１００分であり、これから、試料中に最初存在するマンニトールの量が一旦概算されると、どのくらいの時間遅延が、マンニトール干渉物質の濃度を許容レベルまで下げるのに必要であるかを当業者が決定するのは容易なことであろう。例えば、初期の概算後、許容可能な結果を得るためにマンニトール干渉物質の量を約半分にする必要があると確認された場合、約１００分の時間遅延が割り当てられるであろう。ある場合には、センサーは、一定の正確さを満足させる概算時間を算出でき、概算時間をモニター上に（例えば、カウントダウンタイマーとして）表示することができる。

第２の測定法としての発光蛍光
本明細書で提供する方法は、発光蛍光検出を含む第２の測定法を含み得る。ある場合には、第２の測定は、グルコースに結合するための第２の受容体及び第２の蛍光体を含む第２の指標系に含まれる第２の蛍光体の発光を検出することを含み得る。この第２の指標系は、第１の指標系を含むグルコースセンサーの感知領域に含まれ得る。

ある場合には、本明細書で提供するグルコースセンサーは、グルコースと結合するための第１の受容体及び第１の受容体に附随する第１の蛍光体を含む第１の指標系を含み得、前記第１の受容体は、グルコースとの会合定数Ｋ_Ｇ１及び干渉物質との会合定数Ｋ_Ｍ１を有する。このグルコースセンサーは、グルコースと結合するための第２の受容体及び第２の受容体に附随する第２の蛍光体を含む第２の指標系を含み得、前記第２の受容体は、グルコースとの会合定数Ｋ_Ｇ２及び干渉物質との会合定数Ｋ_Ｍ２を有し、Ｋ_Ｇ２／Ｋ_Ｍ２はＫ_Ｇ１／Ｋ_Ｍ１と異なる。

特定の受容体について特定のゲスト物質（例えば、グルコース又は干渉物質、例えば、マンニトール）との会合定数を測定する方法は、当技術分野でよく知られている。そのような手段の１つは、他のゲスト物質を含まない対照試料中のゲスト物質の濃度を変化させた際の、受容体に附随する蛍光体の蛍光挙動（例えば、強度）の変化を較正することを含む。

次いで、このグルコースセンサーを使用する本明細書で提供する方法は、センサーの感知領域に入射光を提供し、（ａ）前記第１の蛍光体の発光を検出することを含む第１の測定によるグルコース量の第１の測定値、及び（ｂ）前記第２の蛍光体の発光を検出することを含む第２の測定によるグルコース量の第２の測定値を得ることにより実施し得る。感知領域に提供される入射光は、第１の蛍光体と第２の蛍光体の両方の蛍光発光を引き起こす適切な波長プロフィールを有し得る。すなわち、蛍光体の蛍光発光を、同時に生じさせ、単一の実験で検出することができる。ある場合には、第１の波長プロフィールの入射光は、第１の蛍光体の蛍光発光を引き起こすために提供され、第２の波長プロフィールの入射光は、第２の蛍光体の蛍光発光を引き起こすために提供され、各波長プロフィール間に時間遅延、例えば、最大で１０秒の遅延、例えば、最大で５秒の遅延がある。

第２の受容体及び第２の蛍光体は、Ｋ_Ｇ２／Ｋ_Ｍ２がＫ_Ｇ１／Ｋ_Ｍ１と異なるように選択される。第２の受容体は、例えば、第１の受容体に対して適切であるとして本明細書で記載される受容体から選択され得る（例えば、本明細書で記載される式（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）のそれらの化合物）。同様に、第２の蛍光体は、例えば、第１の蛍光体に対して適切であるとして本明細書で記載される蛍光体から選択することができる。第２の指標系（すなわち、第２の蛍光体／第２の受容体系）は、第１の指標系（すなわち、第１の蛍光体／第１の受容体系）と異なる。ある場合には、第２の蛍光体は、第１の蛍光体と異なり、第２の受容体は、第１の受容体と異なる。通常、第２の受容体は、第１の受容体と異なる。通常、第１の受容体と第２の受容体は共にゼロ以外のグルコースとの会合定数を有する（すなわち、第１の受容体と第２の受容体は共にグルコースに結合する能力があり、したがって、試料中のグルコース濃度の変化に対して高感度である）。

ある場合には、第１の蛍光体及び第２の蛍光体は、（それぞれの受容体に附随し、前記受容体がグルコース及び／又は干渉物質に結合する場合）それらの夫々のピーク蛍光発光波長は少なくとも５ｎｍ、好ましくは少なくとも１０ｎｍ、より好ましくは少なくとも２０ｎｍだけ異なるように選択される。ピーク蛍光発光波長の分離は、第１の蛍光体と第２の蛍光体の両方の蛍光発光を含む蛍光発光スペクトルの分析を簡素化し得る。

ある場合には、第１の蛍光体及び第２の蛍光体の発光を検出する工程は、それぞれ、第１の蛍光体及び第２の蛍光体の発光寿命を検出することを含む場合、それぞれ第１及び第２の蛍光体は、実質的に異なる蛍光寿命（例えば、少なくとも０．５ｎｓ又は１ｎｓ又は２ｎｓだけ異なる）を有するように選択され得る。

第２の受容体及び第１の受容体は、グルコース及び干渉物質に結合する異なる相対能力を有し得る。ある場合には、グルコース及び干渉物質に結合する相対能力に関するこの差は、重要に成り得る。例えば、商［Ｋ_Ｇ２／Ｋ_Ｍ２］／［Ｋ_Ｇ１／Ｋ_Ｍ１］は、２より大きいか又は０．５未満であることが好ましいだろう（これらの値は、干渉物質に対してより高い相対感度を有するのが第１の受容体であるか、第２の受容体であるかに依存して、同じ有効差を生じることを理解されたい）。商［Ｋ_Ｇ２／Ｋ_Ｍ２］／［Ｋ_Ｇ１／Ｋ_Ｍ１］は、１０より大きいか又は０．１未満であることがより好ましく、商［Ｋ_Ｇ２／Ｋ_Ｍ２］／［Ｋ_Ｇ１／Ｋ_Ｍ１］は、５０より大きいか又は０．０２未満であることが、さらにより好ましいだろう。グルコース及び干渉物質に結合する２つの受容体の相対能力の差が増すと、干渉物質の存在の修正は、干渉物質のより低い濃度に対しても、より正確になり得る。

ある場合には、グルコース及び干渉物質に結合する２つの受容体は、実質的に異なる化学的特性及び／又は立体化学的特性を有し得る。例えば、第１の受容体と第２の受容体は何れもボロン酸受容体でもよいが、第１の受容体は、２つのボロン酸基を有し得（例えば、それは、本明細書で定義される式（Ｉ）又は式（ＩＩ）の受容体である）、他方、第２の受容体は、１つのボロン酸基の受容体（例えば、それは、本明細書で定義される式（ＩＩＩ）である）のみを有し得る。ジボロン酸、例えば、上記の式（Ｉ）又は（ＩＩ）のものは、グルコースとマンニトール干渉物質の両方に結合し得、他方モノボロン酸、例えば、式（ＩＩＩ）のものは、グルコースよりもマンニトール干渉物質により強く結合し得る。

第２の受容体及び第２の蛍光体は、互いに結合することができ、ヒドロゲルなどのポリマーマトリックス、又はデンドリマーにさらに結合することができる。適切なヒドロゲル及びデンドリマーの例は、国際公開第２０１１／１０１６２４号パンフレットに記載されるものであり、その内容を参照によって本明細書に組み込む。ポリマーマトリックスを使用する場合、ポリマーマトリックスの粒子は、第２の受容体及び第２の蛍光体と共に第１の受容体及び第１の蛍光体を同時に担持し得る。ある場合には、第２の受容体及び第２の蛍光体は、異なるポリマーマトリックスに結合することができる。

第２の受容体及び第２の蛍光体はまた、例えば、第１の受容体及び第１の蛍光体に関して上記で記載されるように、互いに直接結合していなくてもよい。

測定値を比較し、それによって試料中に干渉物質が存在するかどうかを決定する
本明細書で提供される方法は、第１の測定値（例えば、第１の蛍光体の発光）と第２の測定値（例えば、第２の蛍光体の発光）とを比較し、それによって任意の干渉物質が試料中に存在するかどうかを決定することを含み得る。干渉物質が試料中に存在することが決定される場合には、この方法は、好ましくは、さらに（ａ）試料中の干渉物質の存在について修正し、又は（ｂ）（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏで代謝されてしまって）干渉物質が試料中に（実質的に）もはや存在しないより遅い時点で、グルコース濃度の補完測定を行うことのどちらかを含む。したがって、試料中の干渉物質の存在に対して修正する、又はグルコース濃度の補完測定を行うステップは、「試料中のグルコース量の測定値であって、干渉物質からの寄与が実質的にない又は低減された測定値を得ること」、すなわち、「試料中のグルコース量を定量すること」を意味することを理解されたい。

「第１の測定値と第２の測定値を比較する」ステップが、試料中に干渉物質が（実質的に）ないという結論に至る場合、これら測定値の一方又は両方は、さらなる修正や補完測定の工程を行わずに、グルコース濃度を決定するのに使用することができる。

表現「試料中の干渉物質の存在について修正すること」は、広い意味を持ち、干渉物質によりなされる第１（又は第２）の測定への寄与を数学的に除去するなどの手順を含む。

２つの蛍光体を必要とする本明細書で提供する方法においては、当業者は、これら２つの蛍光体は、干渉物質に対して異なる感度を有するので、単一試料（特定のグルコース及び干渉物質の濃度を含む）中のそれらの発光挙動の比較は、いずれか一方の測定値から干渉物質の寄与を（数学的分析により）除去し、それによって試料中のグルコース濃度の正しい値を得るために使用することができることを容易に理解するであろう。干渉物質の寄与を除去するこの能力には、試料中のグルコースと干渉物質の両方の濃度を算出する能力が内在することを理解されたい。

１つ又は２つの受容体の存在下のグルコースと干渉物質の混合溶液の会合挙動をパラメーターで表わす、いくつかの例示的な（但し非限定的である）数学的等式は、以下の実施例セクションに示される。これらの等式は、一般に、本明細書で提供される方法に適用可能であり、実施例で使用される詳細に記載される方法及び系（例えば、特定のヒドロゲル又は干渉物質種）に決して限定されないことを強調しておく。

第２の測定法が、試料中のグルコースの量を電気化学的に測定することを含む特定の場合には、「第１の測定値と第２の測定値を比較し、それによって、干渉物質が、試料中に存在するかどうかを決定する」といった工程は、第１（蛍光発光−マンニトールからの干渉を受けやすい）及び第２の測定値（電気化学的−干渉物質からの干渉を受けにくい）は、実質的に同じグルコース濃度を示すかどうかを最初に評価することを含み得る。大きな違いがない場合、干渉を特に考慮するための更なる工程は必要ない（試料中に干渉物質はない）ことを理解されたい。しかし、実質的な違いがある場合、試料中の干渉物質の存在は、より遅い時点（単数又は複数）で、すなわち、本明細書の別の箇所に記載するように、干渉物質が十分にｉｎ ｖｉｖｏで代謝した後に、更なる測定（単数又は複数）を実施することにより考慮することができる。

同様に、第２の測定法が、試料中の干渉物質の量を電気化学的に測定することを含む特定の場合には、「第１の測定値と第２の測定値を比較し、それによって、干渉物質が、試料中に存在するかどうかを決定する」といった工程は、第２の（電気化学的）測定値が、試料中に存在する干渉物質を示すかどうかを最初に評価することを含み得る。存在しない場合、干渉を特に考慮するための更なるステップは必要ない（試料中に干渉物質はない）ことを理解されたい。しかし、第２の測定値が、干渉物質の存在を示す場合、この試料中の干渉物質の存在は、より遅い時点（単数又は複数）で、すなわち、本明細書の別の箇所に記載するように、干渉物質が十分にｉｎ ｖｉｖｏで代謝した後に、更なる測定（単数又は複数）を実施することにより考慮することができる。

本明細書で提供する方法及び系は、グルコースと干渉物質の両方に対する検出感度について予め較正された第１の指標系を含み得る。第２の指標系も、ある場合は、予め較正され得る。

グルコースセンサー
本文献は、グルコースセンサーも提供する。グルコースセンサーは、本明細書で提供される方法を実施するように構成することができる。ある場合には、本明細書で提供するグルコースセンサーは、本明細書で記載されるように、第２の測定法が、第２の蛍光体からの蛍光発光を検出することを含む方法を実施するように構成することができる。

本明細書で提供するグルコースセンサーの構成要素は、本明細書の上記で提供された方法に関する議論で記載したものに対応し得る。例えば、感知領域、第１の指標系、第１の受容体、第１の蛍光体、第２の指標系、第２の受容体、第２の蛍光体及び光導波路、並びにそれらの好ましい態様は総て、上記で議論した本明細書で提供される方法に関する本明細書の記載の通りである。第１の指標系と第２の指標系は共に、感知領域内に含まれるので、それらは、試料をグルコースセンサーと接触させる時、第１の指標系と第２の指標系の両方が試料と接触するように構成される。したがって、通常、感知領域は、第１及び第２の指標系が共に含まれるセル又はチャンバーを備える。

グルコースセンサーは、平衡グルコースセンサーでもよい。

疑いを避けるため、本明細書を通して、受容体（例えば、第１又は第２の受容体）が、「グルコースに結合するため」であるとの言及は、受容体が、グルコースに結合する能力がある（すなわち、ゼロでないグルコースとの会合定数を有する）ことを意味することを強調しておく。したがって、そのような受容体を含む指標系は、対応する蛍光体と共に、試料中のグルコースの濃度に高感度である。

干渉物質
本明細書では、「干渉物質」は、グルコースセンサーの感知領域に含まれる第１の受容体へのグルコースの結合に干渉することができる物質である。通常、物質は、それ自体が第１の受容体に結合可能であることにより、グルコース結合に干渉することができる（すなわち、グルコースセンサー中の受容体部位についてグルコースと競合する）。しかし、干渉する他の手段は、本明細書で記載される方法及びセンサーにより対処することが可能であり、例えば、物質は、第１の受容体に結合するグルコースの能力を変更するようにグルコースと相互作用（例えば、結合して）することができる。

通常、「第１の受容体へのグルコースの結合に干渉することができる」干渉物質は、ゼロでない第１の受容体との会合定数を有する干渉物質である（したがって、受容体に対しグルコースと競合し得る）。例えば、第１の受容体との干渉物質の会合定数は、第１の受容体とのグルコースの会合定数の少なくとも１％、又は少なくとも１０％、又は少なくとも２５％と成り得る。

通常、干渉物質は、プロトン又はヒドロキシルイオン以外の物質である。通常、干渉物質は、試料のｐＨを単に変更する以外の手段により、グルコースセンサーの感知領域に含まれる第１の受容体へのグルコースの結合に干渉することができる物質である。

試料は、１つの干渉物質又は複数の異なる（すなわち、化学的に異なる）干渉物質を含み得る。複数の異なる干渉物質が存在する場合でも、本明細書で提供される方法では、試料中のグルコース量を定量することが依然可能である。

干渉物質は、糖アルコール又はグルコース以外の糖類でもよい。特に目的とする糖アルコール及び糖類は、血液中に大量に存在し得るものを含む。

干渉物質は、ｃｉｓ−ジオール基を含み得る。例えば、干渉物質は、ｃｉｓ−ジオール基を含むポリオール（例えば、糖アルコール又は糖類）でもよい。ｃｉｓ−ジオール基を含む物質は、特に、例えば、本明細書で記載されるグルコースセンサーに含まれる第１の受容体などのボロン酸受容体に結合する能力があると思われる。疑義を避けるために述べると、用語「ｃｉｓ−ジオール基を含む」は、ヒドロキシル基が、ｃｉｓ−ジオール基に含まれる以外には、干渉物質中に何も存在しないことを意味しない。したがって、例えば、干渉物質は、少なくともｃｉｓ−ジオール基を含むポリオール（例えば、糖アルコール又は糖類）でもよく、合計で２個、３個、４個、５個、６個、又は６個超のヒドロキシル基も含み得る。

干渉物質は、マンニトール、ソルビトール、ガラクチトール、イノシトール、フルクトース、ガラクトース及びアラビノースからなる群から選択される糖アルコール又は糖類でもよい。干渉物質は、マンニトールでもよい。

干渉物質は、アミン、すなわち、アミン官能基を含む化合物であってもよい。アミン官能基は、第一級、第二級又は第三級アミン基でもよい。特に目的とするアミンは、血液中に大量に存在し得るものを含む。アミンは、例えば、グルタミン及びカテコールアミン（例えば、エピネフリン、ノルエピネフリン及びドーパミン）から選択され得る。

干渉物質は、１０００ダルトン未満、例えば５００ダルトン未満、又は３００ダルトン未満、又は２００ダルトン未満の分子量を有し得る。そのような干渉物質を本明細書の別の箇所に記載されるタイプのバリア層の使用を通してグルコースセンサーの感知領域から除外することが困難又は不可能なことがあるので、本システム及び方法は、これらの低分子量干渉物質において特に有用であろう。

本明細書で提供する方法及びセンサーを、特定の実施例を参照して以下に記載する。本発明は、これらの特定の実施例に限定されることを意図しない。

以下のヒドロゲルを実際の実施例で使用した。

（例１）

この実施例は、マンニトール干渉物質の濃度を決定する第２の測定値（例えば電気化学的測定値）が得られる場合に、第１の測定値を、この既知のマンニトール濃度に基づき修正して、グルコース濃度の修正値を得ることができることを示す。

１つの受容体を使用する場合の２つの分析物の競合結合についての一般等式
ホスト「Ｈ」が、分析物Ｄ−グルコース「Ｇ」、及びＤ−マンニトール「Ｍ」に結合できる場合、以下の平衡が存在する。

３つの平衡が存在し：

３つの会合定数が導かれる。

質量収支から、次式も解る。

（式中、［Ｘ］＝平衡濃度であり、［Ｘ］_ｉ＝初期濃度である）
（７）及び（９）を（４）に代入すると、次式が得られる。

（１０）を並べ替えると次式が導かれる。

Ｋ_Ｇ［Ｈ］_ｉ＜＜１と仮定すると、二乗項は無視でき、したがって、

となる。
［ＨＭ］及び［Ｈ］_ｉ＜＜［Ｇ］_ｉ、及び１／Ｋ_ｇも仮定することもできる。したがって、（１２）は、次式のように単純化でき、

これは以下のように書き直すことができる。

（８）及び（９）を（５）に代入し、同じ操作を行うと、次式が得られる。

（１４）及び（１５）は、それらを行列形式で書くことにより、［ＨＧ］及び［ＨＭ］に対して解くことができ、

この行列の逆数を求めると、

となる。ここで、この行列式は、
Δ＝１＋Ｋ_Ｇ［Ｇ］_ｉ＋Ｋ_Ｍ［Ｍ］_Ｉ （１８）
である。したがって、

となる。
強度測定値については以下の通りになる。

（１９）及び（２０）を（２３）に代入すると次式が得られる。

（２１）及び（２２）を（２４）に代入し、並べ替えると次式が導かれる。

Ｉ_∞Ｇ＝Ｉ_∞Ｍと仮定すると（２５）〜（２６）がさらに単純化され、２つの分析物が存在する場合（この場合グルコース及びマンニトール）、蛍光体発光の強度の算出が可能になる。（２６）を並べ替えた結果、（２７）及び（２８）が導かれ、これらは、第２の分析物の濃度及びセンサーの蛍光応答が分っている場合、第１の分析物の濃度を決定することを可能にする。

ヒドロゲル３を含むセンサーのＤ−マンニトール及びＤ−グルコースに対する較正
センサーが、Ｄ−マンニトールとＤ−グルコースの両方に対して較正され得ることを示すために、ヒドロゲル３を使用した。これらの較正の結果を以下の表１に示す。

ヒドロゲル３のジボロン酸受容体は、Ｄ−マンニトールよりＤ−グルコースに対してより選択的であることが、Ｋ_Ｇ及びＫ_Ｍから認められる。両方の分析物に対するＩ_０は同じであり、Ｉ_∞の測定で認められた違いは、おそらく較正による誤差のためである。
（例２）

この実施例は、グルコース及びマンニトールに対して異なる相対会合定数を有する２つの受容体を組み込むグルコースセンサーが、グルコースとマンニトールを共に含む試料中で、マンニトール干渉物質の存在について修正して、正確なグルコース濃度を測定するために使用できることを示す。

２つ受容体を使用する場合の２つの分析物の競合結合についての一般等式
２つのホスト「Ｈ_１」及び「Ｈ_２」が、分析物Ｄ−グルコース「Ｇ」、及びＤ−マンニトール「Ｍ」に結合できる場合、以下の平衡が存在する。

存在する平衡は：

であり、６つの会合定数が導かれる。


質量収支から、次式も分る。

（式中、［Ｘ］＝平衡濃度であり、［Ｘ］_ｉ＝初期濃度である）
（４１）及び（４３）を（３５）に代入すると次式が得られる。

（４５）を並べ替えると次式が導かれる。

Ｋ_Ｇ［Ｈ］_ｉ＜＜１と仮定すると、二乗項が無視できることを意味し、したがって、次式が得られる。

ホスト濃度は、非常に小さいと想定されるので、［Ｇ］_ｉ及び１／Ｋ_ｇ１と比較される［Ｈ_２Ｇ］及び［Ｈ_１Ｍ］の項をさらに落とすことにより近似値を求めることもできる。

これは、以下のように書き直すことができる。

（４２）及び（４３）を（３６）に代入し、いくつかの操作を行うと次式が得られる。

（４９）及び（５０）は、それらを行列形式で書くことにより、［Ｈ_１Ｇ］及び［Ｈ_１Ｍ］に対し解くことができ、

行列の逆数を求めると

となる。ここで、この行列式は、
Δ＝１＋Ｋ_Ｇ１［Ｇ］_ｉ＋Ｋ_Ｍ１［Ｍ］_Ｉ （５３）
である。したがって、

となる。
第２のホストに対し、同じ方法及び近似を使用して、次式を得る。

２つの蛍光体に対する光強度は、次式により与えられる。

次いで、（５４）及び（５５）を（５８）に代入し、次式を得ることができる。

展開し、並べ替えると次式が得られる。

同様に、（５６）及び（５７）を（５９）に代入する。

行列形式で（６１）及び（６２）を書き、逆数を求めると、

が得られる。ここで、この行列式は、
Δ＝（ΔＩ_Ｇ１−ｉ_１）Ｋ_Ｇ１（ΔＩ_Ｍ２−ｉ_２）Ｋ_Ｍ２−（ΔＩ_Ｇ２−ｉ_２）Ｋ_Ｇ２（ΔＩ_Ｍ１−ｉ_１）Ｋ_Ｍ１ （６４）
である。したがって、

となる。
（２１）及び（２２）を（６５）に代入すると次式が得られる。

同様に

が得られる。

ヒドロゲル４を含むセンサーに関しＤ−マンニトール及びＤ−グルコースに対して得られた結果
２つの別々のボロン酸センサーを、ヒドロゲル４内に固定した。これらの１つは、Ｄ−グルコースとＤ−マンニトールの両方に対し類似の会合定数を有するジボロン酸であった。２つ目は、Ｄ−マンニトールに対しより選択的であるモノボロン酸であった。図７は、Ｄ−グルコース又はＤ−マンニトール濃度の増加に伴い、選択波長で励起した場合のヒドロゲル４の蛍光スペクトルを示す。これらのセンサーのそれぞれに対して独立に会合定数を算出することが可能であり、これらの結果を以下の表２に示す。

Ｄ−グルコース及びＤ−マンニトールに対する２つのボロン酸受容体の選択性は、それぞれ異なっている。したがって、アルゴリズム（６６）及び（６７）は、グルコース及びマンニトールを含む溶液中の両方の分析物濃度を決定して、グルコース濃度の正確な測定を行うことを試みる場合、マンニトール干渉物質の存在について修正するために使用することができる。

Claims (30)

1. さらに干渉物質を含むことがある試料中のグルコース量を定量するためのグルコースセンサーであって、
   グルコースに結合するための第１の受容体及び該第１の受容体に附随する第１の蛍光体を含み、該第１の受容体は、グルコースとの会合定数Ｋ_Ｇ１及び該干渉物質との会合定数Ｋ_Ｍ１を有する、第１の指標系、及び
   グルコースに結合するための第２の受容体及び該第２の受容体に附随する第２の蛍光体を含み、該第２の受容体は、グルコースとの会合定数Ｋ_Ｇ２及び該干渉物質との会合定数Ｋ_Ｍ２を有し、Ｋ_Ｇ２／Ｋ_Ｍ２はＫ_Ｇ１／Ｋ_Ｍ１と異なる、第２の指標系
   を含む感知領域と、
   該感知領域に光を導入するための光導波路と
   を備える、グルコースセンサー。
2. 前記第１の蛍光体及び前記第２の蛍光体は、少なくとも５ｎｍ異なるピーク発光波長を有する、請求項１に記載のグルコースセンサー。
3. ［Ｋ_Ｇ２／Ｋ_Ｍ２］／［Ｋ_Ｇ１／Ｋ_Ｍ１］は、２より大きいか又は０．５未満である、請求項１又は２に記載のグルコースセンサー。
4. 前記第１の受容体及び前記第２の受容体は、ボロン酸受容体である、請求項１から３のいずれか一項に記載のグルコースセンサー。
5. 前記第１の受容体は、２つのボロン酸基を含み、前記第２の受容体は、１つのボロン酸基を含む、請求項４に記載のグルコースセンサー。
6. 前記干渉物質は、（ａ）ｃｉｓ−ジオール基を含む干渉物質、及び（ｂ）アミンから選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載のグルコースセンサー。
7. ｃｉｓ−ジオール基を含む前記干渉物質は、糖アルコール及び糖類から選択される、請求項６に記載のグルコースセンサー。
8. 前記干渉物質は、マンニトール、ソルビトール、ガラクチトール、イノシトール、フルクトース、ガラクトース、アラビノース、グルタミン及びカテコールアミンからなる群から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載のグルコースセンサー。
9. 前記干渉物質は、マンニトールである、請求項８に記載のグルコースセンサー。
10. さらに干渉物質を含むことがある試料中のグルコース量を定量する方法であって、
    グルコースに結合するための第１の受容体及び該第１の受容体に附随する第１の蛍光体を含む第１の指標系を少なくとも含む感知領域と、該感知領域に光を導入するための光導波路とを備えるグルコースセンサーを、該試料に挿入し、
    該センサーの該感知領域に入射光を提供して、該第１の蛍光体の発光を検出することを含む第１の測定法により、グルコース量の第１の測定値を得、
    該試料中の該干渉物質の量に対する感度の点で該第１の測定法と異なる、第２の測定法によりグルコース量の第２の測定値を得、
    該第１の測定値と該第２の測定値を比較し、それによって、該干渉物質が該試料中に存在するかどうかを決定すること
    を含み、該干渉物質は、グルコースの該第１の受容体への結合に干渉することができる物質である、方法。
11. グルコースに結合するための第１の受容体及び該第１の受容体に附随する第１の蛍光体を含み、該第１の受容体は、グルコースとの会合定数Ｋ_Ｇ１及び前記干渉物質との会合定数Ｋ_Ｍ１を有する第１の指標系、及びグルコースに結合するための第２の受容体及び該第２の受容体に附随する第２の蛍光体を含み、該第２の受容体は、グルコースとの会合定数Ｋ_Ｇ２及び前記干渉物質との会合定数Ｋ_Ｍ２を有し、Ｋ_Ｇ２／Ｋ_Ｍ２はＫ_Ｇ１／Ｋ_Ｍ１と異なる第２の指標系を含む感知領域と、
    該感知領域に光を導入するための光導波路と
    を備えるグルコースセンサーを前記試料に挿入し、
    該センサーの該感知領域に入射光を提供し、
    該第１の蛍光体の発光を検出することを含む第１の測定法により、グルコース量の第１の測定値を得、
    該第２の蛍光体の発光を検出することを含む第２の測定法により、グルコース量の第２の測定値を得、
    該第１の測定値と該第２の測定値を比較し、それによって、前記干渉物質が前記試料中に存在するかどうかを決定し、前記試料中の前記干渉物質の存在に対して修正すること
    を含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記第１の測定値及び前記第２の測定値は、単一の発光検出工程で得られる、請求項１１に記載の方法。
13. 前記第１の蛍光体及び前記第２の蛍光体は、少なくとも５ｎｍ異なるピーク発光波長を有する、請求項１１又は１２に記載の方法。
14. ［Ｋ_Ｇ２／Ｋ_Ｍ２］／［Ｋ_Ｇ１／Ｋ_Ｍ１］は、２より大きいか又は０．５未満である、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記第１の受容体及び前記第２の受容体は、ボロン酸受容体である、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記第１の受容体は、２つのボロン酸基を含み、前記第２の受容体は、１つのボロン酸基を含む、請求項１５に記載の方法。
17. さらに干渉物質を含むことがある前記試料は、ｉｎ ｖｉｖｏ試料である、請求項１０から１６のいずれか一項に記載の方法。
18. さらに干渉物質を含むことがある前記試料は、ｉｎ ｖｉｖｏ試料であり、前記方法は、
    （ｉ）時点ｔ_ｔｅｓｔで前記第１の測定値を得、
    （ｉｉ）前記第２の測定法により前記第２の測定値を得、ここで、前記第２の測定法は、該時点ｔ_ｔｅｓｔで、前記試料中のグルコース、又は該干渉物質の量を電気化学的に測定することを含み、
    （ｉｉｉ）前記第１の測定値と前記第２の測定値を比較し、それによって前記第１の測定値が、前記試料中の該干渉物質からの寄与を含むかどうかを決定すること
    を含む、請求項１０に記載の方法。
19. 前記方法は、ヒト又は動物対象に実施され、前記試料は、該対象のｉｎ ｖｉｖｏ体液であり、ステップ（ｉ）は、時間ｔ_ｔｅｓｔで該体液にｉｎ ｖｉｖｏ測定を実施することを含み、ステップ（ｉｉ）は、時間ｔ_ｔｅｓｔで該対象から該体液の一部を取り出し、それに対してｉｎ ｖｉｔｒｏ電気化学的測定を実施することを含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記第１の測定値と前記第２の測定値を比較する前記ステップ（ｉｉｉ）において、前記第１の測定値が前記干渉物質からの寄与を実質的に含まない、又は低減された寄与を含むことが決定されるまで、一連のステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）を１回又は複数回それぞれ異なる時点で実施することを含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
21. 前記第１の測定値と前記第２の測定値を比較する前記ステップ（ｉｉｉ）において、ｔ_ｔｅｓｔで前記試料中の前記干渉物質の量の概算値が得られ、
    （ｉｖ）ｔ_ｔｅｓｔで前記試料中に存在する前記干渉物質にとって十分な時間を遅らせることで、前記試料を実質的に浄化し、
    （ｖ）前記センサーの前記感知領域に入射光を提供し、前記第１の蛍光体の発光を検出することで、前記試料中のグルコース量の第３の測定値を得ること（該第３の測定値は、前記干渉物質からの寄与が実質的にない又は低減されている）
    をさらに含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
22. 前記干渉物質は、（ａ）ｃｉｓ−ジオール基を含む干渉物質、及び（ｂ）アミンから選択される、請求項１０から２１のいずれか一項に記載の方法。
23. ｃｉｓ−ジオール基を含む前記干渉物質は、糖アルコール及び糖類から選択される、請求項２２に記載の方法。
24. 前記干渉物質は、マンニトール、ソルビトール、ガラクチトール、イノシトール、フルクトース、ガラクトース、アラビノース、グルタミン及びカテコールアミンからなる群から選択される、請求項１０から２３までのいずれか一項に記載の方法。
25. 前記干渉物質は、マンニトールである、請求項２４に記載の方法。
26. さらに干渉物質を含むことがある試料中のグルコース量を定量するためのグルコースセンサーであって、
    グルコースに結合するための２つのボロン酸基を含む第１の受容体、及び該第１の受容体に附随する第１の蛍光体を含む第１の指標系、及び
    グルコースに結合するための１つのボロン酸基を含む第２の受容体、及び該第２の受容体に附随する第２の蛍光体を含む第２の指標系を含む、感知領域と、
    該感知領域に光を導入するための光導波路と
    を備えるグルコースセンサー。
27. 前記糖類は、ｃｉｓ−ジオール基を含む、請求項２６に記載のグルコースセンサー。
28. 前記糖類は、マンニトール、ソルビトール、ガラクチトール、イノシトール、フルクトース、ガラクトース及びアラビノースからなる群から選択される、請求項２６に記載のグルコースセンサー。
29. 前記糖類はマンニトールである、請求項２６に記載のグルコースセンサー。
30. 前記第１の受容体は、グルコースとの会合定数Ｋ_Ｇ１及び前記干渉物質との会合定数Ｋ_Ｍ１を有し、前記第２の受容体は、グルコースとの会合定数Ｋ_Ｇ２及び前記干渉物質との会合定数Ｋ_Ｍ２を有し、Ｋ_Ｇ２／Ｋ_Ｍ２がＫ_Ｇ１／Ｋ_Ｍ１と異なる、請求項２６に記載のグルコースセンサー。