JP2015519343A - 変性障害の処置のためのledgfペプチドおよびその製剤 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2012年5月21日付で出願された米国仮特許出願第61/649,847号、および2012年11月16日付で出願された国際特許出願第PCT/US2012/065620号の優先権を主張する。上記に特定した優先出願の内容は、参照により本明細書に完全に組み入れられる。
本発明は全体として、変性疾患ならびに酸化ストレスおよびタンパク質凝集ストレスを含むさまざまな細胞ストレスを伴う疾患の処置で用いるための水晶体上皮由来増殖因子(LEDGF)の新規ペプチドおよびその組成物に関する。より具体的には、本発明は、安定性の増強および持続的送達プロファイルを有するLEDGF1〜326の新規製剤、ならびにタンパク質凝集を介する疾患、年齢に関連する疾患および変性疾患の処置でのその使用に関する。
加齢性黄斑変性症(AMD)および網膜色素変性症(RP)を含む後眼部の疾患は、米国における主な失明原因である。(Jager et al., N ENGL J MED, 2008. 358(24): 2606-17(非特許文献1))。現在、約800万人の個人が米国においてAMDに苦しんでおり、2020年までにこの数は1200万に達するものと予想される。(Jager et al.; Friedman et al. Arch Ophthalmol, 2004. 122(4): p. 564-72(非特許文献2))。慢性酸化ストレスおよび炎症に関連する乾燥型のAMD (乾燥AMD)は、AMD症例の90%を占める。(Libby et al. Adv Exp Med Biol, 2010. 664: p. 403-9(非特許文献3); Stuen. Generations, 2003. 27: p. 8-14(非特許文献4))。他方でRPは、50種超の異なる遺伝子変異によって引き起こされる、遺伝的に受け継がれる疾患である。(Ohguro, H., et al., Nihon Ganka Gakkai Zasshi, 2002. 106(8): p. 461-73(非特許文献5); Dryja,, et al., Nature, 1990. 343(6256): p. 364-6(非特許文献6))。世界中で150万前後の人々が現在、RPに苦しんでいる。
本発明は、大量に、高純度で、またはその両方で産生されうる生物学的に活性なLEDGFペプチドを対象にする。例えば、本発明は、SDS-PAGEおよびSEC-HPLCによって定量化した場合に、培養液1リットルあたり20 mgでまたはそれを上回って、かつ90%の純度でまたはそれを上回って産生されうる、LEDGFペプチドを対象にする。1つの例示的な態様において、ペプチドは、80 kDaの二量体として存在しうる、およそ40 kDaの単量体である。別の例示的な態様において、ペプチドは、主にランダムコイル構造を有し、N末端のストレス関連結合ドメイン、および任意でTAT結合ドメインを含む。
定義
本明細書において用いられる場合、「網膜および網膜の」は、網膜および網膜に隣接した全般的な後眼部の両方をいう。
全長LEDGFは、P23H変異体ロドプシン凝集誘導ストレスから網膜色素上皮細胞をレスキューする能力を有する(Baid et al., PLoS One. 6(9): p. e24616)。しかしながら、治療用ペプチドの使用は、タンパク質が、生物学的に活性なままであるために、特定の三次元構造を維持する必要があるため困難である。加えて、産生および生合成は、生合成および精製プロセス全体にわたるタンパク質安定性の欠如のため、失敗することが多い。さらに、タンパク質治療剤を効果的に用いるためには、タンパク質特性を効果的に特徴決定するために数ミリグラムの産生を達成することが必要な場合が多い。例えば、全長LEDGFは、タンパク質を適切に特徴決定するために必要とされる数十ミリグラムには程遠い、500 mlあたり0.9 mgしか得られず、断片化された産物をもたらす。
本発明のLEDGFペプチドは、全長LEDGFのN末端ペプチドを含む。1つの例示的な態様において、LEDGFペプチドは、LEDGFのN末端のストレス関連結合ドメインを含む。以下の理論によって限定されるわけではないが、転写因子として機能し、他のストレス応答遺伝子の転写を開始するLEDGFの能力は、タンパク質凝集を介する疾患を防ぐLEDGFペプチドの能力に寄与しうる。あるいは、LEDGFペプチドは、誤って折り畳まれたタンパク質に直接的にまたは他の中間タンパク質を介して結合し、かつ、通常の折り畳みをまたは誤って折り畳まれたタンパク質のユビキチン化を促進して、タンパク質分解を確実にしうる。ある種の例示的な態様において、LEDGFペプチドはTAT結合ドメインをさらに含みうる。
本明細書において記述されるLEDGFペプチドは、公知の技法を用いて生理学的に許容される製剤として提供することができる。E.W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th Edition (1995)によるRemington's Pharmaceutical Sciencesには、本明細書において開示されるLEDGFペプチドの薬学的送達に適した組成物および製剤が記述されている。
ある種の例示的な態様において、本発明のLEDGFペプチドは、LEDGFペプチドをコロイド金属粒子と結合させるか、または他の方法で会合させることによりナノ粒子アセンブリとして送達されうる。任意のコロイド金属を本発明において用いることができる。コロイド金属は、任意の水不溶性の金属粒子、液体水中に分散された金属化合物、ヒドロゾル、または金属ゾルを含む。コロイド金属粒子は、周期表のIA、IB、IIB、およびIIIB族の金属、ならびに遷移金属、特にVIII族の金属から選択されうる。例示的な金属としては、亜鉛、金、銀、アルミニウム、ルテニウム、鉄、ニッケル、およびカルシウムが挙げられる。他の適当な金属には、それらの種々の酸化状態の全てにおける以下のものが含まれる: リチウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、コバルト、銅、ガリウム、ストロンチウム、ニオビウム、モリブデン、パラジウム、インジウム、錫、タングステン、レニウム、白金、およびガドリニウム。金属は、好ましくは、イオン形態の適切な金属化合物、例えばAl3+、Ru3+、Zn2+、Fe3+、Ni2+、およびCa2+に由来する。
別の例示的な態様において、LEDGFペプチドは粒子中粒子型の持続放出製剤として製剤化される。本発明の持続放出組成物は、多孔性マイクロ粒子中のナノ粒子(NPinPMP)、多孔性大型ナノ粒子中の小型ナノ粒子(SNPinPLNP)、および多孔性大型マイクロ粒子中の小型マイクロ粒子(SMPinPLMP)のような種々の構造物を含む、より大きな多孔性の外側粒子内に含有される内側粒子を含む。内側粒子は、大きい方の粒子と比べて小さく、相対的に非膨張性である。外側粒子は膨張性であり、外側粒子の多孔性構造内への内側粒子の包埋を可能にする処理の間にかなり多孔性の構造を形成する。
本発明のLEDGF製剤は、タンパク質凝集を介する疾患を処置するために用いられうる。本発明のLEDGF組成物で処置されうるタンパク質凝集を介する疾患には、網膜変性疾患および神経変性疾患が含まれる。網膜変性疾患には、加齢性黄斑変性症、網膜色素変性症、および糖尿病性網膜症が含まれる。神経変性疾患には、アルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)、ハンチントン病(HD)、筋萎縮性側索硬化症、およびプリオン病が含まれる。
1. 材料
プラスミドpEGFP-LEDGFは、Toshimichi Shinohara博士(University of Nebraska Medical Center, Omaha, NE)から贈呈された。フォワードおよびリバースプライマーは、Integrated DNA Technologies (Coralville, IA)から得られた。DNAポリメラーゼI、T4 DNAリガーゼ、および制限酵素はNew England Biolab Inc. (Ipswich, MA)から得られた。QIAquickゲル抽出キット、QIAprepスピンミニプレップキット、およびQIAGENプラスミドミニキットは、Qiagen (Valencia, CA)から得られた。XK 16/20カラム、S-200ゲルろ過カラム、SPセファロースビーズは、GE Lifesciences Healthcare (Piscataway, NJ)から得られた。ARPE-19細胞はATCC (Manassas, VA)から得られた。DMEM/F12細胞培養培地、ウシ胎仔血清、Lipofectamine 2000、LB培地、および超高純度アガロースは、Invitrogen (Carsbad, CA)から得られた。他の全ての材料は、特別の定めがなければ、Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)から得られた。
LEDGF1〜326タンパク質をコードする遺伝子を、pET-28a(+)ベクター(Novagen, Madison, WI)にクローニングした。手短に言えば、Ledgf1〜326遺伝子を、HindIII制限エンドヌクレアーゼ部位からなるフォワードプライマー
およびBamHI制限エンドヌクレアーゼ部位からなるリバースプライマー
を用いてpEGFP-LEDGFプラスミドからPCR (ポリメラーゼ連鎖反応)増幅させた。PCR増幅はDNAポリメラーゼIを用いて、5分間94℃での変性、引き続いて36サイクルの、30秒間94℃での変性、45秒間50℃でのアニーリングおよび2分間72℃での伸長、ならびに5分間72℃での伸長の最終段階にて行った。増幅されたLedgf1〜326遺伝子を、製造元のプロトコルにしたがってQIAquickゲル抽出キットを用いて精製した。その後、精製されたLedgf1〜326遺伝子挿入断片およびpET-28a(+)ベクターを、それぞれHindIIIおよびBamHI制限酵素を用いて5'および3'末端の位置で連続的に消化した。それらを次に、製造元のプロトコルにしたがってQIAprepスピンミニプレップキットを用いて精製した。挿入断片およびベクターの付着末端を、T4 DNAリガーゼを用いて4℃で終夜、ライゲーションさせた。製造元のプロトコルにしたがい熱ショック手順を用いて、コンピテントな大腸菌(Escherichia coli) DH5α細胞を、ライゲーション産物で形質転換した。10個のコロニーを選択し、QIAGENプラスミドミニキットを用いてプラスミドを増幅し、抽出し、かつ精製した。pET-28a(+)ベクターにおけるLedgf1〜326の挿入は、3通りの異なる方法により、第1にPCRスクリーニングにより、第2に制限消化により、および最後にDNA配列決定により確認された。組み換えDNAの純度およびサイズは、2%アガロースゲルを用いて分析された。DNA定量化は、NanoDrop 1000 (Thermo scientific, Wilmington, DE)を用いて行った。陽性PCRシグナルおよび正しい配列決定の結果を示すコロニーをさらに培養し、全て将来使うために、その細菌グリセロールストックを作製し、-80℃で貯蔵した。
LEDGF1〜326アミノ酸配列をExPASy bioinformatics resource portalに供し、LEDGF1〜326の分子量、理論的pI、アミノ酸組成、原子組成、吸光係数、推定半減期をコンピュータで計算した。
タンパク質生合成のため、製造元のプロトコルにしたがってQIAGENプラスミドミニキットを用い大腸菌DH5αコロニーからpLEDGF1〜326プラスミドを増幅かつ精製した。次にこのプラスミドで、製造元のプロトコルにしたがって大腸菌BL21 (DE3)菌株を形質転換した。その後、プラスミドを含有する細菌の単一のコロニーを、50 μg/mlのカナマイシンを含有するLB (Luriaブロス)培地に終夜接種した。終夜増殖された培養物の1%接種材料を、50 μg/mlのカナマイシンを含有するLB培地1リットルに加えた。培養培地について0.6〜0.8の光学密度(O.D.)に達するまで、培養物を37℃で増殖させた。200 μMの終濃度までIPTG (イソプロピル-β-D-チオ-ガラクトシド)を加えることによってタンパク質の発現を誘導した。その後、細胞を37℃で3時間さらにインキュベーションし、4℃で15分間3000 gでの遠心分離によって収集した。収集された細胞を緩衝液A (25 mM Tris-HCl pH 7.0、1 mM EDTA、1 mM PMSF、および5%スクロース)に再懸濁した。細胞を、出力70%(36ワット)の5秒間のパルス超音波処理(Mesonix, Sonicator 3000, Farmingdale, NY)および続く15秒間の冷却に、計30分間供した。溶解された細胞を4℃で20分間13000 gで遠心分離して、溶解物の可溶性画分および不溶性画分を分離した。可溶性(上清)および不溶性(ペレット)画分を、産生されたタンパク質の可溶性/不溶性の判定およびタンパク質含量のためにSDS-PAGEにて分析した。
SDS-PAGEによって判定されたとおり、LEDGF1〜326はもっぱら可溶性画分中に発現していた。LEDGF1〜326は、最初に電荷(陽イオン交換)に基づき、その後サイズ(ゲルろ過)に基づく、2段階の高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)技法を用いて精製された。手短に言えば、陽イオン交換SPセファロースビーズをXK 16/20カラムに充填し、2 ml/分の流速で緩衝液Aを用いて平衡化した。その後、可溶性画分を1 ml/分の流速でカラムに投入した。カラムを次に、2 ml/分の流速で5カラム容量の緩衝液Aにより洗浄した。非特異的にかつ緩く結合した不純物の大部分は、急勾配の塩化ナトリウム(0〜28%の伝導率)を用いて溶出された。カラムに結合した不純物のかなりの割合が除去された後、40分で伝導率28〜40%のNaClの第2の勾配を用いてLEDGF1〜326のさらなる溶出が達成された。内蔵UV検出器を用い280 nmで吸光度を測定することによって、タンパク質溶出プロファイルをモニターした。2.5 mlの画分を、溶出プロセスの間に集め、SDS-PAGEにて分析し、純度を決定した。高いタンパク質量を含有する画分をともにプールした。プールした画分を、透析緩衝液(25 mM Tris pH 7.0、および0.1%スクロース)を用いて透析し、その後、48時間凍結乾燥した。凍結乾燥したタンパク質を蒸留水2 ml中に可溶化した。次段階の精製のため、1 ml/分の流速で平衡化緩衝液B (25 mM Tris-HCl pH 7.0、および100 mM NaCl)を用いて、予め充填されたS-200ゲルろ過カラムを平衡化した。陽イオン交換からのLEDGF1〜326濃縮溶液を次に、S-200カラムに投入した。1 ml/分の流速で緩衝液Bを用いて、LEDGF1〜326を溶出させた。約100分の位置に鋭いピークが得られ、1 mlの画分を回収した。回収した画分を、SDS-PAGEを用いて分析した。純粋なLEDGF1〜326を含有する画分をともにプールした。精製されたLEDGF1〜326を次に、4℃で48時間、3回緩衝液を交換しながら、透析緩衝液(25 mM Tris-HCl pH 7.0、および0.1%スクロース)中で徹底的に透析して、過剰の塩および他の不純物を除去した。透析したLEDGF1〜326を凍結し、-80℃で48時間、凍結乾燥した。凍結乾燥したLEDGF1〜326を全て将来のために分注し、-80℃で貯蔵した。
凍結乾燥したLEDGF1〜326 12 mgを正確に秤量し、その後、蒸留水1 mlに溶解した。Spectramax M5 (Molecular Devices, Downingtown, PA)を用い200 nm〜400 nmでUV吸光度スペクトルを記録した。280 nmで1未満の吸光度が得られるまで、蒸留水を用いてサンプルを連続的に希釈した。この吸光度を用い、モル吸光係数に基づいてサンプル中に存在する精製タンパク質の量を計算した。
LEDGF1〜326タンパク質の分子量および純度を、SDS-PAGE、SEC-HPLC、およびMALDI-TOFによって決定した。
手短に言えば、LEDGF1〜326 5 μgをSDS-PAGEサンプル緩衝液(β-メルカプトエタノールを含有する)中で10分間煮沸した。タンパク質サンプルを4〜15%のSDS-PAGEゲル(Bio-Rad, Hercules, CA)に投入し、30 mAで90分間電気泳動した。ゲルを次に、クマシーブリリアントブルーで染色し、GelDoc(商標) XR (Biorad, Hercules, CA)を用いて白色光の下で可視化した。非還元性SDS-PAGEの場合、LEDGF1〜326を非還元性サンプル緩衝液(β-メルカプトエタノールなし)中で希釈し、煮沸を回避した。
凍結乾燥したタンパク質を500 μg/mlの終濃度まで蒸留水に溶解し、0.22 um (PVDF)のフィルタを通してろ過した。1 ml/分の流速で25℃にて1 mM CaCl2, pH 7.0を含有する25 mM Tris緩衝液を用いてAgilent Bio SEC-3カラムを使い、タンパク質を評価した。カラムを分子量標準(Invitrogen)で較正した。UV吸光度を214 nmで測定した。
4800 Plus MALDI TOF/TOF(商標) (AB Sciex, Framingham, MA)により分子量を決定することによってタンパク質の均質性および同一性を確認した。タンパク質サンプルを標準的なMALDIマトリックスシナピン酸の溶液に溶解し、金属標的プレート上にスポットし、乾燥した。5900強度の1000レーザーショットから全イオン電流(TIC)としてデータを集めた。
zetasizer Nano ZS (Malvern, Westborough, MA)を用いてLEDGF1〜326タンパク質の均質性およびサイズを分析した。手短に言えば、凍結乾燥されたタンパク質サンプルを蒸留水に溶解して、2.5 mg/mlの最終のタンパク質濃度を得た。動的光散乱技法を用いて、173°の後方散乱角度でのデータ収集により、数、強度および容量の平均値という観点でサイズ測定した。測定値は13回のスキャンの平均であった。
生物物理学的特徴決定のため、タンパク質を25 mMリン酸緩衝液pH 7.0中で徹底的に透析して、Tris-HClおよびスクロースを除去し、0.22 μmのPVDFシリンジフィルタを通してろ過した。得られたスペクトルを、Origin(登録商標) 8.5 (OriginLab Corp., Northampton, MA)またはSigmaPlot 11.0 (Systat Software, Inc, Chicago, IL)のどちらかを用いて分析した。下記のようにScholtzらによって定義された方程式1および2を用いデータを適合させて、ΔG、m値、および[尿素]1/2を決定した[62]。
ここでyF°およびyU°は切片であり、ここでy°Fおよびy°Uは切片であり、mFおよびmUはプレ移行期およびポスト移行期ベースラインの傾きであり、ならびにm値は移行期の傾きである。ΔGは任意の特定の尿素濃度での自由エネルギー変化であり、これは尿素濃度に対して直線的に変化し、ΔG(H2O)を推定するために用いられる。ΔG(H2O)は25℃で尿素の非存在下でのタンパク質の立体構造安定性と定義される。Rは一般気体定数であり、Tはサンプルの温度である。[尿素]1/2は、LEDGF1〜326が50%折り畳まれており、かつ50%折り畳まれていない、尿素の濃度である。
LEDGF1〜326の二次構造を決定するためおよびその立体構造安定性パラメータを決定するため、透析したタンパク質の遠紫外CDスペクトルを記録した。手短に言えば、500 μg/mlのタンパク質サンプルを1 mmの石英キュベットに入れ、Chirascan(登録商標) CD機器(Applied Photophysics Ltd, UK)を用いて0.5秒/時点のスキャン速度、1 nmの刻み幅および200から280 nmまで4 nmのバンド幅でスペクトルを記録した。全てのスキャンは三つ組で行った。このようにして得られた天然LEDGF1〜326のスペクトルを、CDNN 2.1 CDスペクトルデコンビュレーションソフトウェア(Gerald Bohm博士, Martin-Luther-University at Halle, Wittenberg, Germany, UK)によりデコンビュレートして、天然LEDGF1〜326タンパク質に存在するさまざまな二次構造の割合を得た。LEDGF1〜326の立体構造安定性のため、さまざまな尿素濃度で化学変性を行った。手短に言えば、300 μg/mlのタンパク質を24時間、25 mMリン酸緩衝液pH 7.0中0〜6 Mの尿素とともにインキュベーションした。CDシグナルを上記のように記録した。LEDGF1〜326の立体構造安定性パラメータを、尿素濃度に応じて230 nmでのCDシグナルをプロットすることにより決定し、この波長での折り畳まれたタンパク質のスペクトルと折り畳まれていないタンパク質のスペクトルとの間の最大CDシグナルの差異を得た。同様に、LEDGF1〜326の熱的安定性を調べるため、500 μg/mlのLEDGF1〜326を1℃/分のランプ速度でスムーズランプモードにて25℃から90℃までの熱変性に供した。222 nmでのCDシグナルを用いて、融点(Tm)を決定した。
定常状態蛍光分光法を行って、三次構造の擾乱を判定した。タンパク質サンプル(終濃度300 μg/ml)を24時間、25 mMリン酸緩衝液pH 7.0中さまざまな濃度の尿素溶液(0〜6 M)とともにインキュベーションした。内因性トリプトファンの蛍光スペクトルを、Spectramax M5 (Molecular Devices, Downingtown, PA)を用いて増分1 nmで、励起波長280 nmで、300から400 nmまで記録した。尿素濃度に応じて340/356 nmでの蛍光強度比をプロットすることにより、LEDGF1〜326の立体構造安定性パラメータを決定した。緩衝液の影響および内側フィルタの影響について全ての強度値を補正した。
ARPE-19細胞を用いて、凝集を介するストレスの存在下でLEDGF1〜326の細胞生存機能を決定した。手短に言えば、ARPE-19細胞を先に記述(Baid et al.,. PLoS One. 6(9): p. e24616)のように維持した。細胞生存性アッセイ法のため、細胞10,000個を96ウェルプレートにプレーティングし、24時間インキュベーションした。24時間後、血清を含有する培地を吸引除去した。試験群(pP23H-Rho+ LEDGF1〜326)に、製造元のプロトコルにしたがって無血清培地中1:3の比率のリポフェクタミン2000を用いてpP23H-Rhoプラスミド(1 μg/ml)を一過性にトランスフェクションした。トランスフェクションの6時間後に、培地を吸引除去し、細胞を48時間、0.001 μg/ml〜50 μg/mlの濃度範囲で漸増量のLEDGF1〜326により処理した。細胞なし(培地だけ)、リポフェクタミン2000を有しない細胞およびリポフェクタミン2000を有する細胞も対照として維持した。48時間後、培地を吸引除去し、新鮮な無血清培地200 μlを加えた。MTT試薬(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニル四ナトリウムブロミド、PBS pH 7.4中で5 mg/ml) 20 μlを各ウェルに加え、さらなるインキュベーションを37℃で3時間行った。MTTを含有する培地を吸引除去し、形成されたホルマザン結晶をDMSO 200 μlに溶解した。発色の吸光度を、Spectramax M5を用いて570 nmで測定した。群の生存性の割合を、リポフェクタミン2000を有しない細胞を含有する対照群に対して計算した。全ての群をn=4として繰り返した。
RCSラットコロニーは、コロラド大学アンシュッツ医学部キャンパスの動物施設内でおよびIUCACの承認を得て維持した。実験は、視覚および眼科研究における動物の使用についてのARVO宣言にしたがって行われた。
4週齢の時点で、ラットを30分間暗順応させた。その後、動物を暗赤色灯の下でERGのために準備した。手短に言えば、ラットを80 mg/kgのケタミンおよび12 mg/kgのキシラジンの混合物の腹腔内注射で麻酔した。瞳孔をその後、一滴の0.5%トロピカミド(Akorn, Lake Forest, IL)で開き、一滴の2.5%ヒプロメロース(Akorn, Lake Forest, IL)を用いて潤わせ続けた。その後、37℃で安定化された温水ジャケット上に動物を置いた。動物の尾および頬の中に参照電極(LKC Technologies Inc., Gaithersburg, MD)を挿入した。DTL plus電極(LKC Technologies Inc., Gaithersburg, MD)を、各眼の角膜を横切るようにして置いた。各動物を、各フラッシュ間の間隔を10秒とした0.4 log cd-s/m2の短時間のフラッシュに曝露し、暗順応ERGを記録した。その後、動物を30 cd/m2の背景光で3分間明順応させた。明順応ERGを同じ強度のフラッシュで、ただし背景光をつけて記録した。少なくとも3回のERGを平均化して、ラットごとに単一のERGを得た。その後、滅菌ろ過した、0.25、0.5、または2.5 mg/mlのLEDGF1〜326 2 μlを片側の眼の硝子体内に与え、媒体を反対側の眼に与えた。ERGを硝子体内注射後8週間、すなわちラットの12週齢まで2週間ごとに記録した。
データは、平均±SDとして表されている。2つのまたは複数の実験群間の比較のため、独立したサンプルのスチューデントのt-検定または一元配置ANOVAに続いてチューキー(Tukey)のポストホック分析(SPSS, ver.11.5; SPSS, Chicago, IL)をそれぞれ行った。差異はp ≦ 0.05で統計的に有意とみなした。
pET28a(+)にクローニングされたLEDGF1〜326
pEGFP-LEDGFプラスミドからのLedgf1〜326遺伝子(図3、レーン1)のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅より、約1000塩基対のDNA断片を得た。未消化のpET-28a(+)ベクター(レーン2)は、約4.5 kbの位置に陽性バンドを示し、これはBamHIを用いて消化された場合に、直線化され、5〜6 kbのDNAマーカーの間に上方移行した(レーン3)。Ledgf1〜326遺伝子をpET-28a(+)ベクターにライゲーションした場合(このようにして得られたプラスミドは、このことからpLEDGF1〜326と表せる)、およそ1000 bpに相当する上向きのバンドシフトが認められ、pET28a(+)ベクターにおけるLedgf1〜326遺伝子の挿入の成功(レーン4)が示唆された。ライゲーションを確認するため、pLEDGF1〜326をBamHI (レーン5)またはHindIII (レーン6)のいずれかで個々に消化した。pLEDGF1〜326は両制限酵素での消化反応により直線化され、DNAバンドが約6.4 kbの位置に見られ、これはpET28a(+)ベクターよりも1000 bp多かった。BamHIおよびHindIIIを用いたpLEDGF1〜326の二重消化により、およそ5.4 kbの大きい方の断片(上方のバンド、レーン8)およびおよそ1000 bpの小さい方の断片(下方のバンド、レーン7)の2つの断片が生じた。pLEDGF1〜326からのLedgf1〜326遺伝子のPCR増幅によって、約1000塩基の陽性のDNAバンドが生じ(レーン8)、LEDGF1〜326がpET-28a(+)ベクターに成功裏に挿入されたことが示唆された。
SIB ExPASy (Gasteiger et al., Nucleic Acids Res, 2003. 31(13): p. 3784-8)を用いたLEDGF1〜326配列のバイオインフォマティク分析から、その理論的分子量36.9 kDaが示された。LEDGF1〜326の等電点計算値(pI)は9.23であり、正電荷を持つ(アルギニンおよびリジン)アミノ酸残基が73個、負電荷を持つ(アスパラギン酸およびグルタミン酸)アミノ酸残基が63個であった。理論的なモル吸光係数は、水中280 nmで15470 M-1 cm-1であった。そのN末端アミノ酸メチオニンに基づき、哺乳類細胞におけるその半減期は、30時間であると予測された。
BL21(D3B)細胞において特定条件の下でLEDGF1〜326を発現させた場合に、約40 kDaの位置に、新しい強力な陽性バンドが現れ、LEDGF1〜326タンパク質の発現が示唆された(図4A、レーン3)。このバンドは細菌細胞の溶解後には上清画分中に現れ、これにより、細菌培養においてLEDGF1〜326が可溶性タンパク質として発現されたことが示唆された(レーン4)。高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)システムを用いて未精製の細胞溶解物からLEDGF1〜326が精製された。精製の第1段階において、陽イオン交換カラムを用いた(図4B)。未結合のタンパク質および脂質を含む他の細胞不純物は、カラム洗浄期の間に溶出された(100〜280 ml)。その後、塩化ナトリウム(NaCl)急勾配を用いて移動相の伝導率を0から28%まで増加させた場合に、カラムに緩く結合された他の細胞タンパク質が溶出された(280〜400 ml)。NaClの勾配を40%の伝導率に達するように40分にわたってゆっくりとさらに増大させると、LEDGF1〜326が溶出された(400〜450 ml)。SDS-PAGEを用いて回収された画分を分析した場合に、他のさらに低分子量のバンドとともにおよそ40 kDaの位置にLEDGF1〜326の強いバンドが認められた(図4A、レーン5)。ゲルろ過カラムを用いたさらなる精製により、LEDGF1〜326は最初のピーク(回収された画分)として溶出され、その後にさらに低分子量の他のタンパク質のピークが続いた(図4C)。ゲルろ過カラムからプールされた画分により、SDS-PAGEにおいて非常にかすかな低分子量のバンドとともにおよそ40 kDaの強力な陽性バンドが示され、LEDGF1〜326のほぼ完全な精製が示唆された(図4A、レーン6)。タンパク質評価から、振盪フラスコ培養1リットルあたりタンパク質約20 mgが得られたことが示唆された。
サイズ排除クロマトグラフィー(SEC-HPLC)によってLEDGF1〜326タンパク質の純度を決定した(図5A)。2本のピークが認められ、第1のピークは10.5分の保持時間を有し、第2のピークは約11.5分の保持時間を有していた。曲線下面積を積分した場合、第1のピークはわずか5%であって、第2のピークは95%であり、LEDGF1〜326タンパク質が約95%の純度であることが示唆された。マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI-TOF)によりLEDGF1〜326の分子量が確認された。MALDI-TOFスペクトルにおいて得られた主なピークは、40314.32および80663.19 m/z (質量対電荷)比の位置にあった(図5B)。MALDI-TOFから、LEDGF1〜326が40 kDaの分子量を有することが示唆され、これは理論的分子量に等しかった。80663 m/zの位置に第2のピークも認められ、これより、LEDGF1〜326が二量体として存在しうることが示唆された。二量体の存在について調べるため、LEDGF1〜326のSDS-PAGEを還元条件および非還元条件の下で行った(図5D)。非還元条件の下で、95〜105 kDaのサイズへのLEDGF1〜326のバンドの上方シフトが認められ、LEDGF1〜326が二量体型として存在しうることが示唆された。還元/変性条件の下で、二量体は単量体に解離した。
LEDGF1〜326の二次構造について調べるため、天然LEDGF1〜326の遠紫外円偏光二色性(CD)スペクトルを分析した(図6A)。CDシグナルは280から200 nmまで負のままであった。220 nmの後、CDシグナルの急減が認められた。222 nmおよび208 nmに特徴的な負のバンドは認められず、200 nmの近傍に特徴的ないずれの正のバンドも認められず、LEDGF1〜326が主にα-ヘリックスまたはβ-シートを保有しないことが示唆された。実際に、210 nm超での非常に低い楕円率および200 nm未満での負のバンドから、LEDGF1〜326が主にランダムコイルから構成されうることが示唆された。
水中でのLEDGF1〜326の立体構造安定性を理解するために、LEDGF1〜326に存在するトリプトファン分子の内因性蛍光を測定することによって、化学変性による三次構造の擾乱を判定した(図7Aおよび7B)。尿素の非存在下での、天然LEDGF1〜326タンパク質の発光スペクトルは、340 nmでλ最大を有し、Δλ1/2 (Δλの半値幅) は56 nmであった(図7A)。尿素の濃度が0から5 Mまで増すにつれて、蛍光シグナルの消光および赤方シフト(右方向への蛍光最大値のシフト)が認められた。0.9 Mの尿素濃度に達するまでシグナルはゆっくり低下した。その後、2.3 Mの尿素濃度に達するまで蛍光シグナルの激減が認められた。この濃度を超えると、蛍光シグナルの低下は最小限であった。5 M尿素でLEDGF1〜326のλ最大は356 nmまでシフトし、Δλ1/2は71 nmであった。340対356 nmでのLEDGF1〜326蛍光シグナルの比率を尿素濃度に応じてプロットした場合、S字形曲線が得られた(図7B)。0〜1 M尿素までに蛍光シグナルの緩やかな衰退(プレ移行期)、次いで1〜3 M尿素までに急な減衰(移行期)、引き続いて3〜5 Mまでに緩やかな衰退期(ポスト移行期)が認められた。(方法に記述されている)方程式1および2を用いて、LEDGF1〜326のΔG(H2O)は3.24±0.48 kcal mol-1であるものと推定され、m値は1.70±0.22 kcal mol-1M-1であるものと推定され、[尿素]1/2は1.81±0.02 Mであるものと推定され、LEDGF1〜326が安定なタンパク質であることが示唆された。
遠紫外CD分光法を用いてLEDGF1〜326の熱的安定性を判定した(図7Eおよび7F)。変性剤としての熱の存在下でCDシグナルを215〜250 nmまで測定した(図7E)。LEDGF1〜326溶液の温度が増すにつれて、約235 nmで得られる負の傾斜は増すように思われた。CDシグナルは化学変性と同じパターン、つまりおよそ30〜35℃のプレ移行期、その後におよそ35〜55℃の移行期、その後におよそ55〜70℃のポスト移行期をたどった(図7F)。全体的適合分析を用いてこのデータを適合させた場合、得られたLEDGF1〜326のTm (融解温度)は44.82±0.17℃であり、LEDGF1〜326が25℃ (室温)で安定である可能性のあることが示唆された。
タンパク質凝集を介するストレスからARPE-19細胞をレスキューするLEDGF1〜326の活性を細胞生存性アッセイ法によって測定した(図8)。最初に、ストレスが全く無いARPE-19細胞の生存性を増加させるLEDGF1〜326の能力について調べた(図8A)。処理から48時間後に未処理細胞および0.001〜50 μg/mlのLEDGF1〜326処理細胞での細胞生存性の有意差は認められなかった。より高用量のLEDGF1〜326 (50 μg/ml)で、細胞生存性は未処理細胞の100±13.19% (最も左側の棒線)と比べて108.14±5.63% (最も右側の棒線)であって、これは有意ではなかった。pP23H-RhoトランスフェクションARPE-19細胞において、LEDGF1〜326は異なる挙動をとった(図8B)。P23H変異体ロドプシンを発現する細胞は、48.25±5.62%への細胞生存性の低下を示した(棒線2)。細胞生存性のこの喪失は、細胞内での、凝集しやすいP23H変異体ロドプシンタンパク質の発現および蓄積の毒性作用に起因しうる。P23H変異体ロドプシンを発現する細胞(棒線3〜9)を、漸増量のLEDGF1〜326で処理した場合、細胞生存性の増大が認められた。LEDGF1〜326は0.001 μg/mlほどの低い濃度でARPE-19細胞の細胞生存性を48.25±5.62から77.02±10.20%まで増大させた。この点を超えると、細胞生存性は未処理pP23H-Rhoトランスフェクション群よりも有意に高いままであった(棒線2)。
光受容体の視覚機能の喪失を遅延させるLEDGF1〜326の効力を、網膜電図(ERG)をモニタリングすることによりRCSラットにおいて調べた。暗所順応(暗順応) ERGにおいて、未処置および処置ラットのB波振幅は、硝子体内注射を施す前に、4週齢の時点(基準ERG)で180.17±27.42から216.60±35.30 μVに及んだ(図9A)。硝子体内注射後2週の時点で、全群においてB波振幅の急減が認められ、その値は65.80±15.44から91.13±13.94 μVに及んだ。未処置群およびLEDGF1〜326処置群の有意差は認められなかった。しかしながら、2週を超えると、全群においてB波振幅の持続的な減少が認められ、減少はLEDGF1〜326処置群においていっそう緩やかであった。硝子体内注射後8週の時点で、未処置群、LEDGF1〜326 0.5、1.0、および5 μg処置群のB波振幅は、それぞれ、9.40±4.57、32.43±10.34、37.93±0.60、および57.63±8.81 μVであった。LEDGF1〜326処置群のB波振幅は、未処置群よりも有意に(p<0.05)高かった。LEDGF1〜326処置群の場合にB波振幅減少の用量依存的な遅延が認められた。漸増用量のLEDGF1〜326により、B波振幅の喪失が低減された。
1. 材料および方法
材料- イソプロピル-β-D-チオ-ガラクトシド(IPTG)クエン酸、リン酸水素ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、Tween 20、スクロース、アジ化ナトリウムはSigma-Aldrich()から購入した。AKTA FLPCをタンパク質精製に用いた。全てのクロマトグラムはUNICORNソフトウェアを用いて分析した。全ての化学物質は、特別の定めがなければ、Sigma Aldrichから入手し、試薬等級またはそれよりも高い等級のものであった。
プライマーを用いてpLEDGF1〜326から増幅させた。LEDGF1〜326遺伝子をその後、NcoIおよびHindIII酵素で消化した後にpET-28a(+)にライゲーションした。使用者マニュアルにしたがって、ライゲーション産物で、コンピテントな大腸菌DH5α細胞を形質転換した。遺伝子の挿入はPCR法、制限消化法および配列決定法によって確認された。
LEDGF1〜326(Hisタグなし)を既述(Ref-JBC)のように生合成し、精製した。手短に言えば、LEDGF1〜326を、1 mM IPTGを用い大腸菌BL21 (DE3)において発現させた。LEDGF1〜326は、最初に電荷(陽イオン交換)に基づき、その後にサイズ(ゲルろ過)に基づく2段階の高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)技法を用いて、細胞溶解物から精製された。精製されたLEDGF1〜326をクエン酸-リン酸緩衝液pH 7.0中で徹底的に透析し、濃縮し、さらに使用するまで-80℃で貯蔵した。
クエン酸-リン酸緩衝液中のLEDGF1〜326 (1または0.5 mg/ml)製剤を、6から7.5に及ぶpHで作製した。添加物のTween 20、EDTA、およびスクロースを、それぞれ、0.1% (w/v)、1 mM、10% (w/v)の終濃度まで加えた。0.02%アジ化ナトリウムを含有する製剤を、微生物増殖によって起こりうる任意の分解について試験した。調製したら全ての製剤を温度制御インキュベータ中25℃で貯蔵し、いかなる蒸発も回避するために十分な対策を取った。
定常状態蛍光分光法を行って、三次構造の変化を判定した。製剤の内因性トリプトファン(Trp)の蛍光スペクトルを、Spectramax M5 (Molecular Devices, Downingtown, PA)を用いて増分1 nmごとで、励起280 nmで、300から400 nmまで記録した。蛍光の変化を測定するために、342 nmでの蛍光強度を各pHおよび各時点についてプロットした。全ての蛍光値について緩衝液および内側フィルタの影響を補正した。
LEDGF1〜326の二次構造変化を遠紫外CDスペクトルによって判定した。手短に言えば、製剤を1 mmの石英キュベットに入れ、Chirascan(登録商標) CD機器(Applied Photophysics Ltd, UK)を用いて0.5秒/時点のスキャン速度、1 nmの刻み幅および200から280 nmまで4 nmのバンド幅で、スペクトルを記録した。
Nano ZS (Malvern, Westborough, MA)を用いてLEDGF1〜326タンパク質のサイズをモニターした。手短に言えば、製剤100 μlを低容量ガラスキュベットの中に入れた。動的光散乱を用いて、LEDGF1〜326粒子散乱データを173°の後方散乱角度で集めた。各測定ごとに平均13回のスキャンを記録した。
LEDGF1〜326製剤サンプル(10 μg)を2×ローディング緩衝液10 μlとともに75℃で10分間煮沸した。サンプルを4〜15%のミニPROTEAN TGXゲルに投入し、タンパク質をサイズ分離した。使用者プロトコルにしたがいCoomassie Blue染色を用いてタンパク質を可視化した。
タンパク質評価のため、LEDGF1〜326製剤を5分間10000 gでスピンダウンし、上清を集めた。使用者マニュアルにしたがいBCAアッセイ法のキットを用いて、上清のタンパク質評価を行った。不溶性凝集体の評価のため、各時点で測定された可溶性タンパク質を、対応する製剤の0日目のタンパク質レベルから差し引いた。
製剤中の免疫反応性LEDGF1〜326の割合を決定するために、間接的ELISA法を開発した。手短に言えば、96ウェルプレート中に、標準的なLEDGF1〜326 (新たに精製された)または製剤サンプルのいずれか100 μlを三つ組で4℃にて終夜コーティングした。各段階の後に洗浄用緩衝液(PBS pH 7.0中0.1% w/vのTween 20)で3回ウェルを洗浄した。非特異的な結合部位を4時間、ブロッキング溶液(PBS pH 7.0中0.5%のウシ血清アルブミン、および0.1%のTween 20)でブロッキングした。LEDGF1〜326をマウス抗LEDGF抗体(BD Biosciences, San Diego, CA)によって検出し、マウス抗LEDGF抗体はHRP結合抗マウス二次抗体(source)で交差検出した。プレートの洗浄後、最後に3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)を加えた。青色の発色による650 nmでの比色吸光度により免疫反応性LEDGF1〜326を定量化した。
全てのデータは、平均±SDとして表されている。複数の群間の比較の場合、データを全てのpHについて組み合わせ、平均化し、対応する添加物を含んだ製剤と比較した。統計は、一元配置ANOVAに続くチューキー(Tukey)ポストホック分析によって、行った(SPSS, ver.11.5; SPSS, Chicago, IL)。p ≦ 0.05を統計的に有意であるとみなした。
HisタグのないLEDGF1〜326のクローニングおよび精製
PCR増幅によってLEDGF1〜326の1000 bpのバンドが得られた。LEDGF1〜326遺伝子挿入プラスミドからの制限消化、ライゲーションおよびその後のPCR増幅によって、LEDGF1〜326の陽性のバンドが示された。LEDGF1〜326タンパク質の精製により、非常にかすかな低分子量のバンドとともに40 kDaの単量体バンドが示され、精製プロセスの間にLEDGF1〜326が何らかの分解を受けた可能性があることが示唆された。
LEDGF1〜326の安定性に及ぼす添加物Tween 20、EDTA、およびスクロースの効果を、pH 6.0〜7.5のクエン酸-リン酸緩衝液中でモニターした。LEDGF1〜326におけるトリプトファン(Trp)の蛍光挙動を測定することによって、LEDGF1〜326における三次構造の擾乱をモニターした(図11A)。LEDGF1〜326製剤(0.5 mg/ml)は、緩衝液のpHに関して、342 nmでの蛍光強度に何の有意差も示さなかった(図11A(i))。0日目に、LEDGF1〜326の添加物不含(plain)緩衝液製剤では、6.0〜7.5のpH範囲において342 nmで5163±302 R.F.U.の初期蛍光強度が示された。1日目に6198±102まで蛍光強度が増加し、これが3日目までに3518±305 R.F.U.に大幅に低下したことから、1日目と比べておよそ43%のシグナル強度の喪失が示唆された。14日目までに、シグナル強度の87%の喪失が認められた。蛍光スペクトルは、3日目、7日目、およびスペクトルはほとんどが平らになって以降に、最大蛍光強度の赤方シフトを示した
LEDGF1〜326の、添加物不含緩衝液の製剤pH 6.0〜7.5に対する0日目の可溶性タンパク質含量は、417.8±21.3 μg/mlであった(図13A)。7日目までに、142.5±60.7 μg/mlまでの可溶性タンパク質含量の有意な減少が認められた。その後、異なるpHでの、添加物不含緩衝液の製剤におけるタンパク質含量の高いバラツキが認められたが、しかし明らかな傾向は認められなかった。60日間までの平均で、全可溶性タンパク質含量は316.2±140.0 μg/mlであった。添加物を含有する製剤は、0日目に470.5±17.3 μg/mlのタンパク質含量を示し、60日目まででさえ469.0±33.4 μg/mlであり続けた。
LEDGF1〜326の免疫反応性を間接的ELISAを用いて定量化した(図14)。ELISAにより、添加物不含緩衝液の製剤pH 6.0〜7.5において0日目に76.9±4.8%の免疫反応性LEDGF1〜326が示された。14日目に免疫反応性を試験した場合、LEDGF1〜326がその免疫反応性のほぼ全てを喪失し、3.1±2.4%しか残存していないことが分かった。60日目までには、免疫反応性LEDGF1〜326は検出不能であった。他方では、添加物を含有する製剤は、0日目、14日目、および60日目に、それぞれ、74.8±7.7、66.2±2.8、および70.4±24.5%の免疫反応性LEDGF1〜326を示した。免疫反応性はpH依存性を有するように見られたが、60日目にpH 6、および7.5では30±4および58±1%の免疫反応性LEDGF1〜326を示し、pH 6.5、6.75、7.0、および7.25では78±15、78±45、76±9、および102±13%の免疫反応性LEDGF1〜326を示した。
LEDGF1〜326安定性に及ぼす個々の添加物の効果を理解するため、一度に1種だけの添加物をpH 7.0にてLEDGF1〜326 (1 mg/ml)の製剤中で試験した(図15、および16)。添加物不含クエン酸-リン酸緩衝液の製剤に関して、342 nmでのLEDGF1〜326の蛍光強度は、30日目までに8410±116から2178±22 R.F.Uまで低下した(図15A)。その一方で0.01% Tween 20、1 mM EDTA、および10%スクロースを含有する製剤の場合、蛍光強度は30日目にそれぞれ、4925±1249、4056±979、および6370±592 R.F.U.であった。微生物汚染をモニターするために対照として用いられたアジ化ナトリウムは、9136±241 R.F.Uの蛍光強度を示した。添加物の非存在下で、LEDGF1〜326蛍光シグナルの喪失は0日目のシグナルの75%であり、Tween 20、EDTA、およびスクロースはそれぞれ、およそ59、48、および76%まで蛍光シグナルを保持した。蛍光と同様に、CDシグナルも、LEDGF1〜326の不安定性を示した(図15B)。
1. 材料および方法
ARPE-19細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection) (ATCC; Manassas, VA)から入手した。細胞培養材料、試薬およびリポフェクタミン2000は、Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA)から入手した。クロム酸、HCl、NaOHおよび円偏光二色性のための他の購入品は、Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)から入手した。Tris塩基、ZnCl2、EDTA (エチレンジアミン四酢酸)は、Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)から入手した。
凍結乾燥されたLEDGF1〜326を4℃にて25 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 7.4中で終夜、徹底的に透析した。ZnCl2ストック溶液(100 mM)を同じ緩衝液中で調製した。ナノアセンブリの調製のため、亜鉛ストック溶液を、25 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 7.4を用いて0.1 mM、1 mM、および10 mMの終濃度に希釈し、これにLEDGF1〜326 (終濃度1 mg/ml)を加え、24時間37℃でインキュベーションした。同様の条件下で亜鉛を有しないLEDGF1〜326を対照として保持した。製剤の調製の前に全ての溶液を0.2 μmのフィルタでろ過した。ナノ(xx)アセンブリとは、xx mMのZn(II)で調製されたLEDGF1〜326ナノアセンブリを示す。
ナノアセンブリの均質性およびサイズ分布を、動的光散乱(DLS)に基づきzeta sizer Nano ZS (Malvern, Westborough, MA)を用いて測定した。手短に言えば、サンプルを150 μlの石英キュベットに入れ、最終のサイズ分布プロットのために平均して11回のスキャンにより173°の後方散乱角度でデータを集めた。これらのナノアセンブリのサイズの時間依存性のバラツキおよびその安定性を、さまざまな時点で個数サイズ分布プロファイルを測定することによってモニターした。
トリプトファンの定常状態の内因性蛍光を測定することによって、LEDGF1〜326の三次構造の変化を判定した。サンプルを150 μlの石英キュベットに入れ、発光スペクトルを、Spectramax M5 (Molecular Devices, Downingtown, PA)を用いて増分1 nmで、励起波長280 nmで、300から400 nmまで記録した。データ点あたりのスキャン数は、6であった。
LEDGF1〜326における二次構造の変化を判定するため、製剤の遠紫外CDスペクトルを記録した。手短に言えば、サンプルを1 mmの石英キュベットに入れ、Chirascan(登録商標) CD機器(Applied Photophysics Ltd, UK)を用いて0.5秒/時点のスキャン速度、1 nmの刻み幅および200から280 nmまで4 nmのバンド幅で、スペクトルを記録した。全てのスキャンは三つ組で行った。スキャンを緩衝液の成分について差し引いた。
ARPE-19細胞を用いて、凝集を介するストレスの存在下でLEDGF1〜326の細胞生存機能を決定した。手短に言えば、ARPE-19細胞を先に記述(Baid et al. PLoS One. 6(9):e24616)のように維持した。細胞生存性アッセイ法のため、細胞10000個を、血清を含有するDMEM-F12培地中で96ウェルプレートに播種した。24時間後、培地を吸引除去し、細胞を無血清培地100 μlで洗浄した。その後、細胞を48時間、LEDGF1〜326のみまたはLEDGF1〜326 +10 mM亜鉛ナノアセンブリのいずれか200 μlで処理した。細胞なし(単なる培地)、LEDGF1〜326のみの対照として25 mM Tris緩衝液を有する細胞、25 mM Tris +10 mM亜鉛(最大量の亜鉛を含有する群に相当する)を有する細胞を、対照として維持した。細胞を24時間、および48時間インキュベーションした。その後、培地を吸引除去し、新鮮な無血清培地200 μlを加えた。MTT試薬(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニル四ナトリウムブロミド、PBS pH 7.4中で5 mg/ml) 20 μlを各ウェルに加え、さらなるインキュベーションを37℃で3時間行った。MTTを含有する培地を吸引除去し、形成されたホルマザン結晶をDMSO 200 μlに溶解した。発色の吸光度を、Spectramax M5を用いて570 nmで測定した。群の生存性の割合を、リポフェクタミン2000を有しない細胞を含有する対照群に対して計算した。全ての群をn=3として繰り返した。
ARPE-19 (50,000個)細胞を、血清を含有するDMEM-F12培地中で24ウェルプレートに播種した。24時間後、培地を吸引除去し、細胞を無血清培地100 μlで洗浄した。その後、細胞を1時間および6時間、LEDGF1〜326またはナノ(10)アセンブリのいずれか200 μlで処理した。LEDGF1〜326のみの対照として25 mM Tris緩衝液を有する細胞、25 mM Tris +10 mM亜鉛(最大量の亜鉛を含有する群に相当する)を有する細胞を、対照として維持した。2時間または6時間後、細胞を冷PBS pH 7.4 500 μlで2回洗浄し、引き続いて酸性PBS pH 5 500 μlでの2回の洗浄を行った。その後、細胞を室温で20分間1% triton-xで溶解させ、こすり取って回収した。励起488 nmおよび発光519 nmで蛍光を測定した。
ナノアセンブリの形成がキレート剤の存在下で反転されうるかどうか調べるため、上記のように37℃で24時間ナノアセンブリを形成させた。25 mM Tris-HClおよび100 mM NaCl, pH 7.4を用いて、EDTA 500 mMストック溶液を作製した。EDTAをLEDGF1〜326またはナノアセンブリのいずれかに、50 mMの終濃度まで加えた。それを室温で4時間インキュベーションし、その後、UV、蛍光、およびCDを上記のように計測した。
LEDGF1〜326はZnCl2の存在下で構造変化および立体構造変化を受ける
Zn(II)の存在下でのナノアセンブリの形成を、動的光散乱(DLS)、内因性trp蛍光、遠紫外線CD、およびUV-visスペクトルによってモニターした(図17)。LEDGF1〜326は9±1 nmの流体力学直径を示し、これは、DLSによってモニターしたように、24時間以内に大きく変化することはなかった(図17A)。異なる濃度のZn(II)とともにインキュベーションされたLEDGF1〜326は、サイズの変化を起こし、ナノアセンブリの形成を示唆していた。0.1 mM ZnCl2では、24時間までにサイズの変化は認められなかった。1 mMおよび10 mM Zn(II)の存在下で、LEDGF1〜326は、37℃で30分のインキュベーションの間にサイズ増大を示した。24時間のインキュベーションで、LEDGF1〜326は、それぞれ対照、ナノ(0.1)、ナノ(1)、およびナノ(10)のアセンブリについて7±1、22±5、26±5、および28±5 nmのサイズを示した。
図18に示されるように、LEDGF1〜326ナノ(10)アセンブリ(最も右側のパネル)は、透過電子顕微鏡法(TEM)の下で可視化された場合、濃密な陰性染色によって分かるように、緩く形成されたナノ構造の存在を示した。ナノアセンブリのなかには互いと密着していたものもあったが、個々の粒子として存在していたものもあった。Zn(II)の非存在下で、LEDGF1〜326 (真ん中のパネル)はそのようないずれの構造の存在も示さなかった。
DLSを用いて希釈に対するナノアセンブリの安定性を研究した(図10)。いったん形成されたナノ(10)アセンブリは、2倍および4倍希釈された場合、いかなるサイズ変化も示さなかった。さらに、これらの希釈されたナノ(10)アセンブリを24時間4℃で貯蔵し、その後、サイズを測った場合、サイズ変化は認められなかった。
LEDGF1〜326と亜鉛との間の相互作用の種類を調べるため、本発明者らは、ナノ(10)に及ぼすEDTAの効果をモニターした(図19)。対照LEDGF1〜326へのEDTAの添加は、いかなる有意なサイズ変化も示さず、LEDGF1〜326のサイズは依然として、およそ7〜8 nmであった(図19A)。EDTAの添加前に、ナノ(10)アセンブリは25±4のサイズを示し、これはEDTAの添加によって9±2まで低下した。ナノアセンブリの形成によって消光されたナノアセンブリの蛍光スペクトルは、元に戻った(図19B)。EDTAの添加後、対照およびナノ(10)アセンブリは、類似の蛍光スペクトルを示した。CDスペクトルによって示された二次構造の全ての変化も同様に戻った(図19C)。UV-visスペクトルも、アセンブリの形成によって起きた変化の反転を示した(図19D)。
25℃でのナノアセンブリにおけるLEDGF1〜326の安定性を、DLS、SDS-PAGE、CD、および蛍光を用いて30日間モニターした(図20)。対照LEDGF1〜326のサイズは、3日目に8±1から5±1 nmまで低下した(図20A)。ナノ(1)アセンブリは0日目に27±1 nmのサイズを示し、これは7日目に4±3 nmまで低下した。他方で、ナノ(10)アセンブリは、30日までサイズの変化のないことを示した。30日目に、ナノ(10)アセンブリについて27±1から8±2 nmまでのサイズ変化が認められた。
Alexa結合LEDGF1〜326を用いARPE-19細胞においてLEDGF1〜326の細胞取込みを調べた(図21)。ARPE-19によるAlexa-LEDGF1〜326の取込みは、用量依存的であった。2時間以内に、2、10、および25 μg/mlのAlexa-LEDGF1〜326とともにインキュベーションされた場合、それぞれ、0.5±0.1、1.0±0.3、および1.4±0.2 μgのAlexa-LEDGF1〜326 (対照)がARPE-19細胞によって取り込まれた。インキュベーション時間を6時間まで増やした場合、Alexa-LEDGF1〜326の取込みの増大が認められた。LEDGF1〜326の取込みは、2、10、および25 μg/mlのAlexa-LEDGF1〜326処理に関して、6時間でそれぞれ1.2±0.2、1.2±0.2、および1.9±0.2 μgまで増大した。
血清飢餓の下でARPE-19細胞を生存させるナノアセンブリの効力をMTTアッセイ法によってモニターした(図22)。未処理群(100%の生存性)と比べて、LEDGF1〜326処理群は用量依存的に生存性の増大を示した。ARPE-19細胞の生存性は0.01、0.1、および1.0 μg/mlのLEDGF1〜326処理により、それぞれ、124±11、148±12、および160±44%まで増大した。ナノ(10)アセンブリ処理群は、対応する対照LEDGF1〜326処理群と比べていっそう高い細胞生存性を示した。ARPE-19細胞の生存性は0.01、0.1、および1.0 μg/mlのLEDGF1〜326処理により、それぞれ、150±3、180±22、および200±8%まで増大した。
網膜の機能喪失を防ぐナノアセンブリの効力を、網膜電図検査(ERG)を用いRCSラットにおいて試験した(図23A)。4週目に、ラットに硝子体内注射する前、B波振幅は313±32 μVであり、全ての群で有意差はなかった。その後の10週の期間にわたって、すなわち14週の時点で、緩衝液およびZn(II)処置群は、それぞれ、307±44から17±10 μVまで、および302±37から11±7 μVまでのB波振幅の減少を示した。LEDGF1〜326処置(対照)はB波振幅の喪失を示し、14週目に、B波振幅は337±30から42±15 μVまで減少したが、14週目において緩衝液群、Zn(II)群および、対照群のB波振幅には有意差が認められなかった。ナノ(10)は14週まで、B波振幅の喪失からの有意な防御を示していた。B波振幅は14週目に305±36から65±15 μVまで減少し、これは、対応する緩衝液群またはZn(II)群と比べて有意に高いB波を示した。
Alexa-LEDGF1〜326の蛍光シグナルを用いて正常SDラットにおけるLEDGF1〜326の残留性を測定した(図24)。図24Aは、SDラット眼の硝子体内注射前のブランクスキャンの平均(n=7)を示す。ブランクスキャンから、それぞれ約24、50、および88個のデータ点での、脈絡膜、水晶体、および角膜の自家蛍光が示された。このブランクスキャンに基づき、データ点を眼のさまざまな組織に割り当てた。割り当てたデータ点は、脈絡膜-RPE 24、硝子体液およそ40、水晶体 50、房水およそ70、および角膜88であった。図24Bおよび32Cは、対照およびナノ(10)アセンブリの標準曲線である。これを用いて、Flurotronスキャンからナトリウムフルオレセイン(NaF)濃度(ng/ml)に換算して得られた蛍光シグナルを実際のAlexa-LEDGF1〜326濃度(μg/ml)に変換した。図24Dおよび24Eは、硝子体内注射後2分から14日までの対照およびナノ(10)アセンブリ群のFlurotronスキャン(N=4)である。硝子体液、脈絡膜-RPE、および房水における蛍光シグナルをFlurotronスキャンから得て(図24D、および24E)、これをそれぞれ、図24F、24G、および24Hにおいて実際のAlexa-LEDGF1〜326濃度に変換した。図24C、および24Dにおける注射2分後での硝子体液における高いピークから、硝子体内注射が適切に行われたことが示唆された。
間接的ELISAにより単回の硝子体内注射の14日後にさまざまな眼組織においておよび血液においてAlexa-LEDGF1〜326の免疫反応性を調べた(図25)。注射されていないブランクの眼組織については角膜、房水、水晶体、硝子体液、網膜、脈絡膜-RPE、強膜および血液において検出可能なレベルのAlexa-LEDGF1〜326は認められず、検出可能な量の内因性LEDGF1〜326が全く存在しないことが示唆された。興味深いことに、Alexa-LEDGF1〜326は対照群およびナノ(10)アセンブリ群の両方について網膜で検出可能であり、それぞれ0.2±0.2および1.3±0.4 μg/g組織重量であった。対照群およびブランク群には有意差がなかったが、ナノ(10)アセンブリは対照群またはブランク群と比べて有意に多い量のAlexa-LEDGF1〜326を有していた。
生/死細胞カウントアッセイ法-
細胞カウントアッセイ法のため、10000個のARPE-19細胞を96ウェルプレートにプレーティングし、24時間インキュベーションした(図26)。24時間後、血清を含有する培地を吸引除去した。試験群(pP23H-Rho+ LEDGF1〜326)に、製造元のプロトコルにしたがって無血清培地中1:3の比率のリポフェクタミン2000 (LP-2000)を用いてpP23H-Rhoプラスミド(1 μg/ml)を一過性にトランスフェクションした。トランスフェクションの6時間後に、培地を吸引除去し、細胞を漸増量のLEDGF1〜326により処理した。細胞なし(単なる培地)、LP-2000を有しない細胞およびLP-2000を有する細胞も対照として維持した。LEDGF1〜326処理時間の終わりに、細胞をPBSで洗浄した。細胞を原形質膜浸透物(Hoechst 33342)、原形質膜不浸透性分子(BOBO(商標)3)、および核色素(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩; DAPI)の組み合わせで標識した。Hoechst 33342は細胞核を標識し、その一方でBOBO(商標)3は死んでいる細胞または死細胞を標識した。Operetta(登録商標)高含量画像化システムを用いて細胞を可視化した。Operetta(登録商標)機器内の自動ソフトウェアツールを用いて細胞カウントを得た。「全細胞」カウントから死細胞カウントを差し引くことによって、生細胞の数および割合を計算した。図26に示されるように、LEDGF1〜326はARPE-19細胞生存性を増大させる。
免疫ブロッティングのため、トランスフェクション用のP23H-Rhoの代わりにCFPタグ付きP23H-Rho (pP23H-CFP-Rho)を用いた。ARPE-19細胞を60 mmのプレートにプレーティングした; トランスフェクションおよび薬物処理を96ウェルプレート試験に対し比例してスケールアップした。LEDGF1〜326処理が終わった後に、細胞を冷PBSで1回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤を含有するRIPA緩衝液中での超音波処理によって溶解させた。等量の上清をSDS-PAGEゲルに投入し、Hsp70、Hsp40、Hsp27、CFP (P23H-CFP-Rhoの場合)、およびLEDGF1〜326、ならびにβ-アクチンについて免疫ブロットした。高感度化学発光ECL(商標)検出キット(GE Healthcare, Piscataway, NJ)を用いてタンパク質のバンドを可視化した。観察データから、LEDGF1〜326が内部移行されることが示唆される。
ARPE-19細胞を24ウェルプレートに播種し、siRNAトランスフェクション用薬剤(Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX)を用いて6時間、20 pM/mlのMERTK siRNA (Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX)でトランスフェクションした。トランスフェクション用培地を除去し、24時間、無血清培地中で細胞をさらにインキュベーションした。MERTK siRNAなしでトランスフェクション用培地のみでトランスフェクションした細胞を、対照として維持した。細胞を1回洗浄し、24時間0.05、0.5、または5 μg/mlのLEDGF1〜326で処理し、その後、2 μmの粒子の貪食をモニターした。手短に言えば、100 μg/mlの2 μmの青色FluoSpheres (Life Technologies, Grand Island, NY)を3時間細胞とともにインキュベーションした。その後、細胞を冷PBS pH 7.4で2回洗浄し、引き続き冷PBS pH 5.0での2回の洗浄を行って、付着したFluoSpheresを除去した。1% Triton-xを用いて細胞を溶解させ、励起350 nmおよび発光430 nmを用いて細胞溶解物中の粒子の蛍光を測定した。siRNAなしでトランスフェクション用薬剤のみでトランスフェクションした細胞を、粒子取込みの対照として得た。粒子処理なしの細胞をバックグラウンドの蛍光測定に用いた。図27に示されるように、LEDGF1〜326は貪食活性を増大させる。網膜色素上皮細胞の貪食の減少は、変性疾患を含むいくつかの網膜疾患の顕著な特徴である。LEDGF1〜326は、貪食の障害を伴う疾患の処置において有用であろう。
試験の終わりに、すなわち12週目に、眼をERG測定後に摘出し、室温で24時間Davidsonの固定剤(2%の37〜40%ホルムアルデヒド、35%エタノール、10%氷酢酸、および53%蒸留水)中で固定した。眼を次に、その後の連続脱水およびパラフィン中での包埋のために70%エタノール中で貯蔵した。厚さ6 μmの垂直切片3枚を標準的なミクロトームにて視神経の位置で鼻側から側頭側へ(500 μm離して)切り取った。全体の網膜形態を、組織切片のヘマトキシリン/エオシン染色の後に光学顕微鏡によって評価した。Aperio ImageScopeソフトウェアv11.1.2.760を用いて外核層(ONL)および内核層(INL)の厚さを系統的に測定した。光受容体細胞保護は網膜全体で一様でない可能性があるため、各切片において上縁から下縁まで500 μmごとに分析を行い、点ごとに切片3枚の平均を行った。データは眼3つの平均を表す。図28に示されるように、LEDGF1〜326は両網膜核の光受容体喪失を遅延させる。
免疫蛍光のため、パラフィンの除去後、他に指定のない限り、以下の逐次段階を通じて室温で眼切片を処理した。15分間80℃で切片を煮沸することによって抗原を回復させた。非特異的な結合をブロッキングした後に、切片を終夜4℃でマウス抗ロドプシン(1D4)一次抗体とともにインキュベーションし、引き続いてAlexa Fluor(登録商標) 594結合ロバ抗マウスIgGおよびDAPIとの30分のインキュベーションを行った。最後に、眼切片を洗浄し、Supermount H (Biogenex, San Ramon, CA)封入剤により封入して、急速な蛍光消失を防いだ。共焦点顕微鏡(Nikon Eclipse CI)を20倍光学ズームで用いて蛍光を可視化した。DAPIおよび、Alexa Fluorに用いた励起-発光波長は、それぞれ、408-450/35、および637-605/75 nmであった。Nikon EZ-C1ソフトウェア・バージョン3.40を用いて画像を捕捉した。図29に示されるように、LEDGF1〜326は桿体外節の喪失を遅延させた。
His-LEDGF1〜326のインビトロでの累積放出
His-LEDGF1〜326が被包されたNPinPMPを、PBS pH 7.4中でのインビトロ放出について評価した。粒子(2〜3 mg)を秤量し、PBS pH 7.4 1 ml中に分散させ、200 rpm (Max Q振盪機インキュベータ)での振盪下、37℃でインキュベーションした。所定の時点で、懸濁された粒子を15分間13,000 gで遠心分離し、上清を回収した。粒子を含むペレットを新鮮PBS pH 7.4 1 mlに再懸濁し、インキュベーションした。サンプル中のHis-LEDGF1〜326含量を、製造元の指示にしたがってマイクロBCAアッセイ法を用い推定した(Pierce Biotechnology, IL, USA)。インビトロの累積データにより、NPinPMPからのHis-LEDGF1〜326の持続放出が示された。図30に示されるように、累積60%のHis-LEDGF1〜326の放出が3ヶ月の終わりまでに観察された。
His-LEDGF1〜326のインビボ送達を、ラットモデルにおけるNPinPMP中のAlexa Fluor 488結合His-LEDGF1〜326の硝子体内投与後に評価した。NPinPMP中で未標識LEDGF1〜326は使われなかった。ラット眼に、Alexa-His-LEDGF1〜326が被包されたNPinPMP (His-LEDGF1〜326 6.0 μg/5 μl)を注射し、対照としてAlexa-His-LEDGF1〜326 = 当量濃度で(標識タンパク質1.5 μgおよび非標識タンパク質4.5 μg/5 μl)を注射した。この比率によって、本発明者らは、両群が初めに類似の蛍光強度を有する状態で始めることが可能になった。Alexa-His-LEDGF1〜326の放出による眼の蛍光を、蛍光が検出下限またはベースラインに達するまで、Fluorotron Master(商標) (Ocumetrics, CA, USA)を用いて周期的にモニターした。製剤を注射する前に眼のベースライン蛍光値をモニターした。各時点で、3回の蛍光スキャンを得て、平均値を用いた。異なる濃度でのAlexa-His-LEDGF1〜326の標準曲線を、キュベットおよびラット水晶体アダプタによる眼蛍光測定を用いて得た。標準曲線を用いて、蛍光光度計により得られたフルオレセイン当量濃度を、実際のAlexa-His-LEDGF1〜326濃度に変換した。
Claims (33)
- 水晶体上皮由来増殖因子(LEDGF)のN末端のストレス関連結合ドメインを含む、 LEDGFのアミノ酸配列を含むペプチド。
- TAT結合ドメインをさらに含む、請求項1記載のペプチド。
- およそ40 kDaの分子量を有する、請求項1記載のペプチド。
- SEQ ID NO:2のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:2に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、もしくは少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項1記載のペプチド。
- 請求項4記載のペプチドをコードする核酸配列。
- 請求項5記載の核酸配列を含むベクター。
- 請求項1〜4のいずれか一項記載のペプチドを含む組成物。
- 薬学的な担体、希釈剤、賦形剤またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項7記載の組成物。
- ペプチドがコロイド金属ナノ粒子に結合しているかまたは会合している、請求項7記載の組成物。
- コロイド金属ナノ粒子が金、銀、アルミニウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ニッケル、カルシウム、リチウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、コバルト、銅、ガリウム、ストロンチウム、ニオビウム、モリブデン、パラジウム、インジウム、錫、タングステン、レニウム、白金、またはガドリニウムのコロイド金属ナノ粒子である、請求項9記載の組成物。
- ナノ粒子が亜鉛ナノ粒子である、請求項10記載の組成物。
- 薬学的な担体、希釈剤、賦形剤またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項9〜11のいずれか一項記載の組成物。
- ペプチドが内側粒子に結合しているかまたは内側粒子内に被包されており、かつ該内側粒子が多孔性の外側粒子内に負荷されている、請求項7記載の組成物。
- 内側粒子が、超臨界二酸化炭素中で膨張しない粒子材料から作製されている、請求項13記載の組成物。
- 内側粒子の材料が重合体材料である、請求項13記載の組成物。
- 内側粒子の重合体材料が、ポリ乳酸(PLA)、ポリ(グリコール酸) (PGA)、乳酸およびグリコール酸の共重合体(PLGA)、セルロース誘導体、ならびにキトサンからなる群より選択される、請求項15記載の組成物。
- 内側粒子の重合体材料がポリ乳酸(PLA)である、請求項16記載の組成物。
- 外側粒子が、超臨界二酸化炭素中で膨張する粒子材料から作製されている、請求項13記載の組成物。
- 外側粒子が重合体材料である、請求項18記載の組成物。
- 重合体材料が、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、およびそれらの共重合体、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、アクリル酸エステルおよびメタクリル酸エステルの重合体、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシルエチルセルロース、セルロースポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(エチルメタクリレート)、ポリ(ブチルメタクリレート)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルアセテート)、ならびにポリビニルピロリドンより選択される材料である、請求項19記載の組成物。
- 外側粒子の材料がラクチド-コ-グリコリドである、請求項20記載の組成物。
- それを必要としている患者に請求項7〜21のいずれか一項記載の組成物を投与する段階を含む、タンパク質凝集を介する疾患を処置する方法。
- 凝集を介する疾患が眼疾患である、請求項22記載の方法。
- 眼疾患が網膜変性疾患である、請求項23記載の方法。
- 網膜変性疾患が加齢性黄斑変性症(AMD)、または網膜色素変性症(RP)である、請求項24記載の方法。
- 凝集を介する疾患が神経変性疾患である、請求項22記載の方法。
- 神経変性疾患がアルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)、ハンチントン病(HD)、筋萎縮性側索硬化症、またはプリオン病である、請求項26記載の方法。
- それを必要としている患者に請求項7〜21のいずれか一項記載の組成物を投与する段階を含む、タンパク質凝集を介する疾患におけるタンパク質凝集を低減する方法。
- タンパク質凝集が小胞体ストレス、酸化ストレス、またはそれらの両方によって引き起こされる、請求項28記載の方法。
- 患者が網膜変性疾患を有する、請求項28記載の方法。
- 網膜変性疾患がAMDまたはRPである、請求項30記載の方法。
- 患者が神経変性疾患を有する、請求項28記載の方法。
- 神経変性疾患がAD、PH、HD、筋萎縮性側索硬化症、またはプリオン病である、請求項32記載の方法。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020514410A (ja) * | 2017-01-25 | 2020-05-21 | 2シー テック コーポレイション | 眼薬持続送達用のナノ粒子および使用法 |
JP2021528498A (ja) * | 2018-06-22 | 2021-10-21 | ビオラリクス ベー.フェー. | 経口投与用生物学的ポリマーの製剤 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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KR101748120B1 (ko) * | 2015-07-13 | 2017-06-16 | 서울대학교산학협력단 | 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체를 유효성분으로 포함하는 혈관신생억제용 조성물 및 이의 용도 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011527328A (ja) * | 2008-07-11 | 2011-10-27 | クリティカル ファーマシューティカルズ リミテッド | 微粒子を調製する方法 |
US20120028889A1 (en) * | 2002-09-26 | 2012-02-02 | K.U. Leuven Research & Development | Integrase cofactor |
Family Cites Families (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4221787A (en) | 1978-03-28 | 1980-09-09 | Interx Research Corporation | Esteramide prodrugs of anti-inflammatory corticosteroids |
US4469689A (en) | 1983-03-30 | 1984-09-04 | The Upjohn Company | Sulfonate containing ester prodrugs of corticosteroids |
US6750052B1 (en) | 1997-07-23 | 2004-06-15 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Lens epithelial cell derived growth factor |
US7708915B2 (en) * | 2004-05-06 | 2010-05-04 | Castor Trevor P | Polymer microspheres/nanospheres and encapsulating therapeutic proteins therein |
US20040142325A1 (en) * | 2001-09-14 | 2004-07-22 | Liat Mintz | Methods and systems for annotating biomolecular sequences |
WO2004017904A2 (en) | 2002-08-23 | 2004-03-04 | The Mclean Hospital Corporation | Corticosteroid conjugates and uses thereof |
US20040253606A1 (en) * | 2002-11-26 | 2004-12-16 | Protein Design Labs, Inc. | Methods of detecting soft tissue sarcoma, compositions and methods of screening for soft tissue sarcoma modulators |
US20060166879A1 (en) | 2002-12-20 | 2006-07-27 | Chakshu Research Inc | Treatment of conditions associated with the presence of macromolecular aggregates, particularly ophthalmic disorders |
WO2004063355A2 (en) * | 2003-01-10 | 2004-07-29 | Protein Design Labs, Inc. | Novel methods of diagnosis of metastatic cancer, compositions and methods of screening for modulators of matastatic cancer |
EP1774043A4 (en) * | 2004-05-28 | 2009-09-02 | Dana Farber Cancer Inst Inc | COMPOSITIONS, KITS AND METHODS OF IDENTIFICATION, ASSESSMENT, PREVENTION AND THERAPY OF CANCER |
US9265814B2 (en) | 2005-12-30 | 2016-02-23 | Neurotech Usa, Inc. | Micronized device for the delivery of biologically active molecules and methods of use thereof |
EP2520935A3 (en) * | 2006-08-09 | 2013-02-13 | Homestead Clinical Corporation | Organ-specific proteins and methods of their use |
WO2008053478A2 (en) | 2006-10-30 | 2008-05-08 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Compositions and methods for inhibiting hiv-1 replication and integrase activity |
WO2008103265A2 (en) * | 2007-02-16 | 2008-08-28 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods of using ledgf/p75 |
CA3004867C (en) * | 2008-06-26 | 2020-09-15 | Orphazyme Aps | Use of hsp70 as a regulator of enzymatic activity |
US10234453B2 (en) * | 2011-07-01 | 2019-03-19 | Inova Diagnostics, Inc. | Method for increasing specificity of diagnostic tests for autoimmune diseases |
EP2852399B1 (en) * | 2012-05-21 | 2020-02-19 | The Regents of The University of Colorado, A Body Corporate | Ledgf peptides and formulations thereof for treatment of degenerative disorders |
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20120028889A1 (en) * | 2002-09-26 | 2012-02-02 | K.U. Leuven Research & Development | Integrase cofactor |
JP2011527328A (ja) * | 2008-07-11 | 2011-10-27 | クリティカル ファーマシューティカルズ リミテッド | 微粒子を調製する方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
BAID, RINKU ET AL.: "LEDGF1-326 Decreases P23H and Wild Type Rhodopsin Aggregates and P23H Rhodopsin Mediated Cell Damage", PLOS ONE, vol. 6, no. 9, JPN6017012831, September 2011 (2011-09-01), pages e24616, XP055175476, DOI: doi:10.1371/journal.pone.0024616 * |
YANDRAPU, SARATH K. ET AL.: "Nanoparticles in Porous Microspheres(NPinPMP) Sustain Delivery of Stable Bevacizumab for 4 Months", INVESTIGATIVE OPHTHALMOLOGY & VISUAL SCIENCE, vol. Vol.53, JPN6017012832, March 2012 (2012-03-01), pages 4636 * |
改訂第4版 タンパク質実験ノート 上タンパク質をとり出そう(抽出・精製・発現編), vol. 第139-141頁, JPN7017001247, 1 October 2011 (2011-10-01) * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020514410A (ja) * | 2017-01-25 | 2020-05-21 | 2シー テック コーポレイション | 眼薬持続送達用のナノ粒子および使用法 |
JP2021528498A (ja) * | 2018-06-22 | 2021-10-21 | ビオラリクス ベー.フェー. | 経口投与用生物学的ポリマーの製剤 |
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