JP2015519067A - 遠心動的濾過装置及びそれを用いた細胞分離システム - Google Patents
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Abstract
本発明は、活性細胞を分離するための遠心動的濾過装置を開示し、回転軸（２８）と、回転軸（２８）と垂直に接続され、且つそれに伴って回転する回転アーム（２１１）と、回転アーム（２１１）の遠心端に固定して接続された微細孔膜濾過器（３１）とを含む。微細孔膜濾過器（３１）は、給液口（３１１）と、排液口（３１２）と、給液口（３１１）及び排液口（３１２）にそれぞれ連通された膜前室（３１３）及び膜後室（３１４）と、両室間に設けられた濾過膜（３１５）とを含み、濾過膜（３１５）の濾過孔は、分離すべく細胞の大きさよりも小さい。本発明は細胞分離システムも開示している。
Description
本発明は、生体の細胞分離の分野に関し、特に、遠心動的濾過装置及びその微細孔膜濾過器を備えた細胞分離システムに関し、このシステムを用いて細胞の高速分離方法を確立することができる。
病気を治療に最適な方法の一つとして、活性組織を利用して病気及び老化した組織を再構築及び更新する、「細胞治療」という治療方法がある。細胞治療は、百年の歴史があり、現在、腫瘍、肝臓病気、傷跡消し等の様々な分野に広く用いられ、また拡大な発展が見込まれる。
細胞治療の一つの最も基本的な問題は、目標細胞を分離しておくことである。従来の技術において、細胞の分離はいずれも遠心機を用いて実現したが、このような分離方法は、操作が煩雑ばかりでなく、操作時に液取りや液加入を複数回に繰り返す必要があるため、細胞の機械的な傷つけを招きやすくなり、且つ汚染されやすく、実験室の環境要求も非常に厳しくて、細胞の品質に影響を与え、細胞の分離コストが増加している。
そのため、より優れた細胞分離用の装置、システム及び方法を提供する必要があった。
本発明の一つの目的は、構造が簡単で、操作が便利で、細胞を高速に分離でき、且つ、全密閉システム内で分離を行うことができ、分離過程で生じた細胞の傷つけを軽減し、細胞の汚染を招き難く、分離の全過程をコンピュータで全自動制御可能である遠心動的濾過装置を提供することである。
本発明は、上記目的を達するために、以下のような手段を用いた。
活性細胞を分離するための遠心動的濾過装置において、
回転軸と、前記回転軸と垂直に接続され、且つそれに伴って回転する回転アームと、前記回転アームの遠心端に固定して接続された微細孔膜濾過器とを備え、
前記微細孔膜濾過器は、給液口と、排液口と、前記給液口及び前記排液口にそれぞれ連通された膜前室及び膜後室と、前記膜前室と前記膜後室との間に設けられた濾過膜とを備え、
前記濾過膜の濾過孔の直径は、分離すべく細胞の直径よりも小さく、
前記給液口及び前記膜前室は前記回転アームの遠心端に位置し、前記排液口及び前記膜後室は前記回転アームの近心端に位置し、細胞懸濁液における水分と生体粒子及び生体分子を、液流圧により前記濾過膜に通過させ、細胞は、前記濾過膜により阻止され、遠心力によって前記濾過膜から振り離れて前記膜前室に沈降され、膜孔の細胞に対する詰まりを解除することを特徴とする。
活性細胞を分離するための遠心動的濾過装置において、
回転軸と、前記回転軸と垂直に接続され、且つそれに伴って回転する回転アームと、前記回転アームの遠心端に固定して接続された微細孔膜濾過器とを備え、
前記微細孔膜濾過器は、給液口と、排液口と、前記給液口及び前記排液口にそれぞれ連通された膜前室及び膜後室と、前記膜前室と前記膜後室との間に設けられた濾過膜とを備え、
前記濾過膜の濾過孔の直径は、分離すべく細胞の直径よりも小さく、
前記給液口及び前記膜前室は前記回転アームの遠心端に位置し、前記排液口及び前記膜後室は前記回転アームの近心端に位置し、細胞懸濁液における水分と生体粒子及び生体分子を、液流圧により前記濾過膜に通過させ、細胞は、前記濾過膜により阻止され、遠心力によって前記濾過膜から振り離れて前記膜前室に沈降され、膜孔の細胞に対する詰まりを解除することを特徴とする。
好ましくは、前記回転アームの長さは１０〜３０ｃｍであり、回転数は５００〜１５００ｒｐｍであり、生じた遠心力は１００〜５００ｇである。
好ましくは、前記微細孔膜濾過器の横断面は円形又は方形である。
好ましくは、前記濾過膜の濾過孔の直径はｌ-３０μｍである。
好ましくは、前記微細孔膜濾過器の横断面は円形又は方形である。
好ましくは、前記濾過膜の濾過孔の直径はｌ-３０μｍである。
好ましくは、前記濾過膜は、ポリオレフィン系又はポリアミド系の材料を用いて製造されている。
好ましくは、前記濾過膜は、ポリエチレン、混合セルロース、ＰＥ材料又はナイロン材料で製造されている。
好ましくは、前記濾過膜は、ポリエチレン、混合セルロース、ＰＥ材料又はナイロン材料で製造されている。
好ましくは、前記微細孔膜濾過器の前記給液口には、給液管が接続され、前記給液管は、回転継ぎ手を介してその上流管路に接続され、前記回転継ぎ手は、前記回転アームの軸心の真上の固定ラック上に設けられ、前記回転継ぎ手の非回転端は、前記給液管に連通された上流管路に接続され、前記回転継ぎ手の回転端は、前記微細孔膜濾過器が前記回転軸の回動時に細胞懸濁液を連続的に濾過できるように、前記給液管を介して前記微細孔膜濾過器に接続されている。
本発明の第２つ目の目的は、全密閉状態で目的細胞の分離を全自動的に完了できる、上記遠心動的濾過装置の構造、特にその微細孔膜濾過器を含んだ細胞分離システムを提供することである。その構造が簡単で、操作が便利で、且つ全行程が密封されて、汚染されにくい。
本発明は、上記目的を達するために、以下のような手段を用いた。
一度的全密閉管路システムと、計器システムとを備える細胞分離システムであって、
前記一度的全密閉管路システムは、微細孔膜濾過器と、一次濾過器と、回転継ぎ手と、一度的注射器と、平衡液容器と、細胞懸濁液容器と、酵素液容器接続管路とを備え、
前記微細孔膜濾過器は、給液口と、排液口と、前記給液口及び前記排液口にそれぞれ連通された膜前室及び膜後室と、前記膜前室と前記膜後室との間に設けられた濾過膜とを備え、前記濾過膜の濾過孔は、分離して抽出すべく細胞の大きさよりも小さく、前記給液口及び前記膜前室は、前記微細孔膜濾過器の遠心力を受ける遠心端に位置し、前記排液口及び前記膜後室は、前記微細孔膜濾過器の遠心力を受ける近心端に位置し、細胞懸濁液における水分と生体粒子及び生体分子を、液流圧により前記濾過膜に通過させ、細胞は、前記濾過膜により阻止され、遠心力によって前記濾過膜から振り離れて前記膜前室に沈降され、膜孔の細胞に対する詰まりを解除することを特徴とする。
一度的全密閉管路システムと、計器システムとを備える細胞分離システムであって、
前記一度的全密閉管路システムは、微細孔膜濾過器と、一次濾過器と、回転継ぎ手と、一度的注射器と、平衡液容器と、細胞懸濁液容器と、酵素液容器接続管路とを備え、
前記微細孔膜濾過器は、給液口と、排液口と、前記給液口及び前記排液口にそれぞれ連通された膜前室及び膜後室と、前記膜前室と前記膜後室との間に設けられた濾過膜とを備え、前記濾過膜の濾過孔は、分離して抽出すべく細胞の大きさよりも小さく、前記給液口及び前記膜前室は、前記微細孔膜濾過器の遠心力を受ける遠心端に位置し、前記排液口及び前記膜後室は、前記微細孔膜濾過器の遠心力を受ける近心端に位置し、細胞懸濁液における水分と生体粒子及び生体分子を、液流圧により前記濾過膜に通過させ、細胞は、前記濾過膜により阻止され、遠心力によって前記濾過膜から振り離れて前記膜前室に沈降され、膜孔の細胞に対する詰まりを解除することを特徴とする。
前記接続管路は、第一管路と、第二管路と、第三管路と、第四管路と、第五管路と、第六管路とを備え、
前記細胞懸濁液容器は逆様にしたものであり、前記細胞懸濁液容器の瓶口には前記第一管路が接続して連通され、前記第一管路には前記一次濾過器が設けられ、
前記平衡液容器は逆様にしたものであり、前記平衡液容器の瓶口には前記第二管路が接続して連通され、前記第二管路は前記第一管路と連通され、
前記第三管路は、一方端が前記第一及び第二管路の交差部に連通され、他方端が前記一度的注射器に連通され、
前記第四管路は、一方端が前記一度的注射器に連通され、他方端が前記回転継ぎ手の固定端に連通され、
前記第五管路は、一方端が前記回転継ぎ手の回転端に連通され、他方端が前記微細孔膜濾過器の給液口に連通され、
前記第六管路は、一方端が前記微細孔膜濾過器の排液口に連通され、他方端の開口が廃液収集溝に延びられ、
前記第七管路は、一方端が前記第一及び第二管路の交差部に連通され、他方端が前記酵素液容器に連通され、
そのうち、前記計器システムは、電動回転アームと、電動注射ポンプと、平衡液温度上昇制御装置と、細胞懸濁液温度上昇制御装置と、細胞懸濁液発振回転盤と、電磁制御バルブとを備え、
前記電動回転アームのアーム端は前記微細孔膜濾過器に固定され、前記電動回転アームの回転軸は、前記回転継ぎ手の回転軸と同一の直線上にあり、
前記電動注射ポンプは、前記一度的注射器を制御し、前記平衡液温度上昇制御装置は、前記平衡液容器における平衡液温度を上昇制御できるように前記平衡液容器外に設けられ、前記細胞懸濁液温度上昇制御装置は、前記細胞懸濁液容器における細胞懸濁液温度を上昇制御できるように前記細胞懸濁液容器外に設けられ、前記細胞懸濁液容器及び前記細胞懸濁液温度上昇制御装置は、前記細胞懸濁液発振回転盤上に設けられ、前記細胞懸濁液発振回転盤は、コンピュータの配置した周波数によって前記細胞懸濁液容器を自動的に発振させることができ、
前記電磁制御バルブは、第一電磁制御バルブと、第二電磁制御バルブと、第三電磁制御バルブと、第四電磁制御バルブとを備え、
前記第一電磁制御バルブは、前記第一管路に設けられ、且つ、前記第一管路と前記第二管路との交差部の前に位置し、
前記第二電磁制御バルブは、前記第二管路に設けられ、
前記第三電磁制御バルブは、前記第四管路に設けられ、且つ、前記一度的注射器と回転継ぎ手との間に位置し、
前記第四電磁制御バルブは、前記第七管路に設けられている。
前記細胞懸濁液容器は逆様にしたものであり、前記細胞懸濁液容器の瓶口には前記第一管路が接続して連通され、前記第一管路には前記一次濾過器が設けられ、
前記平衡液容器は逆様にしたものであり、前記平衡液容器の瓶口には前記第二管路が接続して連通され、前記第二管路は前記第一管路と連通され、
前記第三管路は、一方端が前記第一及び第二管路の交差部に連通され、他方端が前記一度的注射器に連通され、
前記第四管路は、一方端が前記一度的注射器に連通され、他方端が前記回転継ぎ手の固定端に連通され、
前記第五管路は、一方端が前記回転継ぎ手の回転端に連通され、他方端が前記微細孔膜濾過器の給液口に連通され、
前記第六管路は、一方端が前記微細孔膜濾過器の排液口に連通され、他方端の開口が廃液収集溝に延びられ、
前記第七管路は、一方端が前記第一及び第二管路の交差部に連通され、他方端が前記酵素液容器に連通され、
そのうち、前記計器システムは、電動回転アームと、電動注射ポンプと、平衡液温度上昇制御装置と、細胞懸濁液温度上昇制御装置と、細胞懸濁液発振回転盤と、電磁制御バルブとを備え、
前記電動回転アームのアーム端は前記微細孔膜濾過器に固定され、前記電動回転アームの回転軸は、前記回転継ぎ手の回転軸と同一の直線上にあり、
前記電動注射ポンプは、前記一度的注射器を制御し、前記平衡液温度上昇制御装置は、前記平衡液容器における平衡液温度を上昇制御できるように前記平衡液容器外に設けられ、前記細胞懸濁液温度上昇制御装置は、前記細胞懸濁液容器における細胞懸濁液温度を上昇制御できるように前記細胞懸濁液容器外に設けられ、前記細胞懸濁液容器及び前記細胞懸濁液温度上昇制御装置は、前記細胞懸濁液発振回転盤上に設けられ、前記細胞懸濁液発振回転盤は、コンピュータの配置した周波数によって前記細胞懸濁液容器を自動的に発振させることができ、
前記電磁制御バルブは、第一電磁制御バルブと、第二電磁制御バルブと、第三電磁制御バルブと、第四電磁制御バルブとを備え、
前記第一電磁制御バルブは、前記第一管路に設けられ、且つ、前記第一管路と前記第二管路との交差部の前に位置し、
前記第二電磁制御バルブは、前記第二管路に設けられ、
前記第三電磁制御バルブは、前記第四管路に設けられ、且つ、前記一度的注射器と回転継ぎ手との間に位置し、
前記第四電磁制御バルブは、前記第七管路に設けられている。
好ましくは、前記一次濾過器の濾過孔の孔径は目的細胞の直径よりも大きく、前記一次濾過器微細孔膜の孔径は、２００〜３００目である。好ましくは、電磁制御バルブは、いずれも電磁ピンチバルブであり、管路の開放及び閉鎖を制御できる。
好ましくは、前記微細孔膜濾過器の前記膜前室及び前記膜後室は、前記濾過膜で仕切られてなり、前記給液口は、前記膜前室の上部又は側壁に設けられ、前記排液口は、前記膜後室の底部又は側壁に設けられている。
好ましくは、前記濾過膜は、親水性膜である。
好ましくは、前記濾過膜の濾過孔の直径はｌ-３０μｍである。
好ましくは、前記濾過膜の濾過孔の直径はｌ-３０μｍである。
好ましくは、前記濾過膜は、ポリオレフィン系又はポリアミド系材料を用いて製造されている。好ましくは、前記濾過膜は、ポリエチレン、又は混合セルロース、又はＰＥ材料又はナイロン材料から製造されている。
本発明は以下のような有益な効果がある。即ち、本発明の遠心動的濾過装置及びその微細孔膜濾過器を用いた細胞分離システムは、構造が簡単で、操作が便利で、細胞を高速に分離でき、且つ、全密閉システム内で分離を行い、細胞の傷つけや汚染を招き難く、分離の全過程のコンピュータ全自動制御動作の実験室に対する要求が低い。本発明の他の好ましい特徴の優位性について、以下の実施の形態で述べることにする。
以下、本発明の好ましい実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。なお、以下の好ましい実施例はただ例示の役割を果たすだけで、本発明の保護範囲を制限するものではない。
(一）遠心動的濾過装置
図１、図２、図３に示すように、本発明による一実施例の遠心動的濾過装置であって、この実施例の細胞分離用の遠心動的濾過装置は、回転軸２８と、回転軸に垂直接続され、且つ回転軸に伴って回転する回転アーム２１１と、回転アームの遠心端に固定接続された微細孔膜濾過器３１とを備えている。
図１、図２、図３に示すように、本発明による一実施例の遠心動的濾過装置であって、この実施例の細胞分離用の遠心動的濾過装置は、回転軸２８と、回転軸に垂直接続され、且つ回転軸に伴って回転する回転アーム２１１と、回転アームの遠心端に固定接続された微細孔膜濾過器３１とを備えている。
そのうち、微細孔膜濾過器３１は、給液口３１１と、排液口３１２と、給液口に連通された膜前室３１３と、排液口に連通された膜後室３１４と、膜前室３１３と膜後室３１４との間に設けられた濾過膜３１５とを備える。好ましくは、給液口３１１は膜前室３１３のトップに設けられ、排液口３１２は膜後室３１４の底に設けられ、図３に示すように、液体は注射による液圧で流動できるようになる。
そのうち、濾過膜３１５は、親水性濾過膜であり、ポリオレフィン系又はポリアミド系材料を用いて製造される。好ましくは、濾過膜は、ポリエチレン、又は混合セルロース、又はＰＥ材料又はナイロン材料から製造される。濾過膜３１５の濾過孔３１５０は、分離して抽出すべく細胞の大きさよりも小さくて、抽出すべく細胞が膜前室３１３に隔離されて残留させ、水分及び他の生体分子は膜後室３１４へ流れ、そして、排液口３１２から流出するようになる。一般に、体細胞の大きさは５〜３０μｍであり、具体的に、濾過膜３１５の濾過孔３１５０の直径は５μｍよりも小さい。好ましくは、濾過膜の濾過孔の直径はｌ-３０μｍであり、より好ましくは、濾過孔３１５０の直径は３μｍ〜５μｍである。
好ましくは、本実施例において、微細孔膜濾過器３１は、具体的に内室を有し、且つ一定の厚さを有する丸餅状であり、濾過膜３１５の給液面は回転アームの遠心端に位置し、出液面は回転アームの近心端に位置している。回転アームの回動によって遠心力が生じ、これによって、濾過膜により阻止された細胞は、その粒子が大きいためより大きな遠心力を受けて、濾過膜から「振り」離れることになり、膜孔１３５０を滞りなく通じるように保持して、水分及び役に立たない又は有害な生体分子を液圧により膜孔を通じて流れていくようにする。
好ましくは、膜前室３１３は回転アーム２１１の遠心端に位置し、膜後室３１４は回転アーム２１１の近心端に位置している。つまり、膜前室３１３の位置と膜後室３１４の位置とを比べると、膜前室３１３は上記回転軸２１１から膜後室３１４よりも遠くなっている。このように、液体は給液口３１１から排液口３１２へ流れ、回転軸２１１から離れたところから回転軸２１１に近づく方向に流動することである。即ち、この微細孔膜濾過器３１の回転軸２１１の回転時に受ける遠心力の方向と逆になっている。これにより、細胞の懸濁液が膜前室３１３に到着した場合、細胞は濾過膜３１５により膜前室３１３に隔離されると共に、遠心力により濾過膜３１５から離れて、濾過孔３１５０を塞ぐことなく、濾過過程をスムーズに連続して行うようにする。
本実施例において、給液管３７５は、回転継ぎ手３３を介してその上流管路に接続される。なお、具体的に、図４に示すように、回転継ぎ手３３は、非回転端３３１及び回転端３３２を備え、非回転端３３１には、回転端３３２と適合する内室が形成され、回転端３３２は、この内室内で回転することができる。非回転端３３１と回転端３３２の接合する箇所にはシールリング３３３が設けられている。非回転端３３１は、上流管路に固定し連通され、その回転端３３２の接続箇所３３２０は給液管３７５に連通されている。このように、給液管３７５は回転継ぎ手の非回転箇所に固定されると共に、回転軸２８に伴って一緒に回動できる。より好ましくは、回転継ぎ手３３は、回転軸２８上又はその延長線上に設けられ、給液管３７５と微細孔膜濾過器３１の部分を同期に回転させる。
(二）細胞分離システム
以下、本発明による細胞分離システムの好ましい実施例を説明する。
以下、本発明による細胞分離システムの好ましい実施例を説明する。
図５に示すように、本実施例の細胞を抽出するシステムは、主に、一度的全密閉管路システム３と、計器システム２との両部分を含んでいる。
そのうち、一度的全密閉管路システム３は、微細孔膜濾過器３１と、一次濾過器３２と、回転継ぎ手３３と、一度的注射器３４と、平衡液容器３５と、細胞懸濁液容器３６と、酵素液容器３８と、接続管路３７とを備えている。以下にそれぞれ説明する。
そのうち、一度的全密閉管路システム３は、微細孔膜濾過器３１と、一次濾過器３２と、回転継ぎ手３３と、一度的注射器３４と、平衡液容器３５と、細胞懸濁液容器３６と、酵素液容器３８と、接続管路３７とを備えている。以下にそれぞれ説明する。
(１)微細孔膜濾過器３１：その構造は上記した遠心動的濾過装置のようで、ここで繰り返して説明しない。
(２)一次濾過器３２：細胞懸濁液で大きい粒子の不純物を濾過することができる。本実施例において、この一次濾過器３２は流体方向の最前端に設けられ、即ち、細胞懸濁液入れ装置３６に一番近くて、組織を洗浄及び濾過する過程において、幾つかの比較的に大きな不純物（例えば、未消化の組織の断片、大分子）が先ず濾過するようにする。好ましくは、本実施例において、好ましくは、複数回の試験を経て、一次濾過器３２は２００目の濾過器であり、このような規格で、濾過効果が比較的に良い。そして、２００〜３００目の濾過器も良いものである。もちろん、本発明の他の実施例において、どんな適切な構造を有する濾過装置でも使用することができる。
(３)回転継ぎ手３３：その構造は上記した遠心動的濾過装置のようで、ここで繰り返して説明しない。
(４)一度的注射器３４：電動注射ポンプ２３(後述するように）の駆動により、液体を抽取し注射するためのものである。
(５)平衡液容器３５：平衡液（緩衝液又は洗浄液とも称される）を入れるものであり、平衡液容器３５は、加熱保温装置２４により３７℃に保持される。３７℃は人間の体温に近づいた温度であり、細胞の保護に有利なものである。細胞の保護ニーズに応じて、加熱保温装置２４よって温度設定を調整してもよい。
ここで、平衡液は、燐酸塩緩衝液（ＰＢＳ)を用いてもよく、乳酸ナトリウムのリンゲル液を用いてもよい。本実施例において、平衡液は乳酸ナトリウムのリンゲル液を選択することが好ましく、その電解質濃度、ＰＨ、浸透圧等が細胞外の液に非常に近いからであり、細胞の生存により有利であり、細胞液に残留したコラゲナーゼの洗浄に適用し、細胞に対する有害な影響を解除する。好ましくは、細胞を抽出する過程において原料を体温に近い温度に保持させる必要があるため、本実施例のシステムでは保温装置２５を設けて、細胞懸濁液入れ容器３６を一定の温度に加熱して保持し、一般的に、３７℃に保持している。温度を均一化するために、好ましくは、細胞懸濁液入れ容器３６の外壁はこの保温装置２５に取り囲まれるようになる。
(６)細胞懸濁液入れ容器３６：本実施例では逆様にした細胞入れ容器を用い、その開口は下向きである。この懸濁液入れ容器３６は、人体から得られる細胞を抽出するための原料を収容するものであり、原料は、様々な組織、例えば、脂肪組織、血液、骨髄、筋肉、皮膚、肝臓、筋鞘、胎盤、臍帯、体液、分泌物、細胞培養液等であってもよいが、これに限定されるものではない。本実施例では、脂肪組織を用いて脂肪幹細胞を分離している。このれの脂肪組織は、従来の技術におけるいかなる適当な方法により得ることができ、例えば、脂肪吸引法（注射器を用いる）や脂肪切除術を用いることができる。脂肪組織の抽取数は、被抽取者の脂肪の提供能力と脂肪幹細胞の必要数を含む様々な要素によって決められる。好ましくは、コラゲナーゼ液と脂肪組織の混合を加速し、脂肪組織に対する酵素の消化を加速するために、本実施例のシステムでは、細胞懸濁液容器３６及びその保温装置２５をいずれも発振装置を有する発振盤２６上に位置させ、細胞懸濁液３６を発振させる。
(７)酵素液容器３８：組織処理過程で必要な薬液を調合及び注入するために用いられ、本実施例ではコラゲナーゼ液である。
(８)接続管路３７は、第一管路３７１と、第二管路３７１と、第三管路３７３と、第四管路３７４と、第五管路３７５と、第六管路３７６と、第七管路３７７とを備える。
そのうち、第一管路３７１は、上記逆様にした細胞懸濁液容器３６の瓶口に接続して連通され、第一管路３７１には上記一次濾過器３２が設けている。
そのうち、第一管路３７１は、上記逆様にした細胞懸濁液容器３６の瓶口に接続して連通され、第一管路３７１には上記一次濾過器３２が設けている。
上記平衡液容器３５も逆様になっており、平衡液容器３５の瓶口には第二管路３７２が接続して連通され、第二管路３７２は第一管路３７１と連通される。
第三管路３７３の一方端は、第一及び第二管路３７１、３７２の交差部に連通され、且つ他方端は一度的注射器３４と連通される。
第四管路３７４の一方端は、一度的注射器３４に連通され、且つ他方端は、回転継ぎ手３３の固定端に連通される。
第四管路３７４の一方端は、一度的注射器３４に連通され、且つ他方端は、回転継ぎ手３３の固定端に連通される。
第五管路３７５の一方端は、回転継ぎ手３３の回転端に連通され、且つ他方端は、微細孔膜濾過器３１の給液口に連通される。
第六管路３７６の一方端は、微細孔膜濾過器３１の排液口に連通され、且つ他方端の開口は廃液収集溝２７まで延びられる。
第六管路３７６の一方端は、微細孔膜濾過器３１の排液口に連通され、且つ他方端の開口は廃液収集溝２７まで延びられる。
第七管路の一方端は、第一及び第二管路の交差部に連通され、且つ他方端は、酵素液容器に連通される。本システムにおいて、細胞分離完了後に、微細孔膜濾過器３１の給液口と排液口に接続された管路、即ち第五管路３７５と第六管路３７６を、熱溶融はさみにより直接にせん断して封口し、この密封した微細孔膜濾過器３１には必要な細胞が残留され、直接に保存して使用することができる。
上記各々管路は硬質的なのもであってもよく、軟性的なのもであってもよいが、具体的な必要に応じて選択することができる。本発明の好ましい実施例において、各々管路は軟性管路であり、例えば、臨床応用で通常使用されるポリエチレン管路、又はシリコン有機樹脂管路、又は従来の技術において既知の他の材料の管路が挙げられる。管路の内径の大きさは、通じるようとする液体又は組織の大きさ、数量、及び必要な流速等により決められる。これらの管路は、上記吸引注射装置により生じる正圧・負圧に耐えなければならない。
上記一度的全密閉管路システム１の各構成部分は、いずれも一度的使用されるものであり、且つ全密閉されて、細胞懸濁液から細胞を分離する全過程が汚染を受けない管路システムで行うように保証している。
以下、細胞分離システムの計器システム２を説明するが、それは再利用できるものである。
図５に示すように、この計器システム２は、電動回転アーム２１と、電磁制御バルブ２２と、電動注射ポンプ２３と、平衡液温度上昇制御装置２４と、細胞懸濁液温度上昇制御装置２５と、細胞懸濁液発振回転盤２６とを備える。
電動回転アーム２１の機能アーム端２１１には上記微細孔膜濾過器３１が固定され、電動回転アーム２１の回転軸は当該システムの回転継ぎ手３３の回転軸と同一の直線上にあり、回転継ぎ手３３をそれにつれて同期に回転させる。機能アーム端の反対端において、この電動回転アーム２１は平衡端２１２として設けられ、即ち平衡ブロックを設けている。電動回転アーム２１はモータ２８で駆動される。
電動注射ポンプ２３は一度的注射器３４を制御する。
平衡液温度上昇制御装置２４は、平衡液容器３５外に設けられ、その中の平衡液温度に対して上昇制御を行うことができる。
平衡液温度上昇制御装置２４は、平衡液容器３５外に設けられ、その中の平衡液温度に対して上昇制御を行うことができる。
細胞懸濁液温度上昇制御装置２５は、細胞懸濁液容器３６外に設けられ、その中の細胞懸濁液温度に対して上昇制御を行うことができる。また、細胞懸濁液容器３６及び細胞懸濁液温度上昇制御装置２５は、細胞懸濁液発振盤２６(図示せず）上に設けられ、細胞懸濁液発振回転盤は、コンピュータにより設定された周波数に従って細胞懸濁液容器３６を自動的に震動させる。
電磁制御バルブ２２は、第一電磁制御バルブ２２１と、第二電磁制御バルブ２２２と、第三電磁制御バルブ２２３と、第四電磁制御バルブ２２４とを備える。
第一電磁制御バルブ２２１は、上記第一管路３７１に設けられ、且つ第一管路３７１と第二管路３７２との交差部の前に位置している。
第二電磁制御バルブ２２２は、第二管路３７２に設けられている。
第二電磁制御バルブ２２２は、第二管路３７２に設けられている。
第三電磁制御バルブ２２３は、第四管路３７４に設けられ、且つ一度的注射器３４とヘッド３３との間に位置している。
第四電磁制御バルブ２２４は、第七管路３７７に設けられている。
第四電磁制御バルブ２２４は、第七管路３７７に設けられている。
上記第一及び第二、第三、第四電磁制御バルブ２２１、２２２、２２３、２２４はいずれも電磁ピンチバルブであり、管路の開放及び閉鎖を制御できる。
微細孔膜濾過器３１、一次濾過器３２、回転継ぎ手３３、一度的注射器３４、細胞懸濁液容器３６、平衡液容器３５、酵素液容器３８及び繋がってる管路３７からなる一度的密封管路システムは、電動遠心回転アーム２１、電動注射ポンプ２３、電磁ピンチバルブ２２、平衡液温度上昇制御装置２４、細胞懸濁液温度上昇制御装置２５、細胞懸濁液発振回転盤２６から構成された計器システムと共に上記細胞分離システムを形成し、組織細胞の洗浄、酵素分解消化、細胞の濾過分離洗浄及び収集等の工作を完成できる。また、構造が簡単で、必要な細胞を高速に得られ、全過程を密封でき、汚染がなく、適応性が強く、細胞の抽出を量産化するに有利である。
(三）細胞分離方法
以下、上記第一の実施例の細胞分離システムに対応して、このシステムを利用した細胞分離方法を説明する。当該方法の解釈により、上記システムの構造や機能もよく理解できる。
以下、上記第一の実施例の細胞分離システムに対応して、このシステムを利用した細胞分離方法を説明する。当該方法の解釈により、上記システムの構造や機能もよく理解できる。
本実施例の細胞分離方法は、人体から抽出した脂肪組織を原料し、それから脂肪幹細胞を抽出する必要がある。この方法は次のようなステップを含んでいる（各工程で言及しなかったバルブは、いずれも閉鎖状態であるとみなす）。
１、平衡液を予熱し、一度的容器と、濾過器と、注射器と、管路システムとを接続する。
平衡液温控加温保温装置２４を３７℃に設定し、袋入りの平衡液体３５を温度制御上昇保温装置２４に置き、平衡液を３７℃に予熱させ、予熱した３７℃の平衡液は、コラゲナーゼ液の調合に予備できるばかりでなく、適合な細胞の洗浄液も提供できる。一度的管路システムを計器に位置させる：第一管路３７１を細胞懸濁液容器３６に繋ぎ、第二管路３７２を平衡液容器３５に繋ぎ、第七管路３７７を酵素液容器３８に繋ぎ、一度的注射器３４を電動注射ポンプ２３に嵌め込み、回転継ぎ手３３を固定ラックに位置させ、遠心濾過器３１を回転アームの機能端２１１に位置させる。
平衡液温控加温保温装置２４を３７℃に設定し、袋入りの平衡液体３５を温度制御上昇保温装置２４に置き、平衡液を３７℃に予熱させ、予熱した３７℃の平衡液は、コラゲナーゼ液の調合に予備できるばかりでなく、適合な細胞の洗浄液も提供できる。一度的管路システムを計器に位置させる：第一管路３７１を細胞懸濁液容器３６に繋ぎ、第二管路３７２を平衡液容器３５に繋ぎ、第七管路３７７を酵素液容器３８に繋ぎ、一度的注射器３４を電動注射ポンプ２３に嵌め込み、回転継ぎ手３３を固定ラックに位置させ、遠心濾過器３１を回転アームの機能端２１１に位置させる。
２、脂肪組織酵素分解
脂肪組織を細胞懸濁液容器３６に装入し、本実施例においてこの容器は非ＰＶＣ輸液袋である。予熱平衡液容器３５から脂肪と相等体積の平衡液を抽出し、酵素液容器３８に注入し、本実施例の酵素希釈液は、乳酸ナトリウムリンゲル液であり、コラゲナーゼ製品の明細書で定めた酵素活性に従って適量なコラゲナーゼを量り、両者を混合して脂肪消化酵素液とし、酵素液容器３８内のコラゲナーゼ液を細胞懸濁液容器３６に注入する。この容器外の温度上昇制御保温装置２５の設定温度は３７℃である。この容器を載置した発振盤２６が動作し、回転数は１００ＲＰＭであり、時間は２０〜４０分であり、酵素活性及び脂肪消化程度に応じて予めに設定した酵素分解時間を調整する。
脂肪組織を細胞懸濁液容器３６に装入し、本実施例においてこの容器は非ＰＶＣ輸液袋である。予熱平衡液容器３５から脂肪と相等体積の平衡液を抽出し、酵素液容器３８に注入し、本実施例の酵素希釈液は、乳酸ナトリウムリンゲル液であり、コラゲナーゼ製品の明細書で定めた酵素活性に従って適量なコラゲナーゼを量り、両者を混合して脂肪消化酵素液とし、酵素液容器３８内のコラゲナーゼ液を細胞懸濁液容器３６に注入する。この容器外の温度上昇制御保温装置２５の設定温度は３７℃である。この容器を載置した発振盤２６が動作し、回転数は１００ＲＰＭであり、時間は２０〜４０分であり、酵素活性及び脂肪消化程度に応じて予めに設定した酵素分解時間を調整する。
脂肪は、酵素により消化された後に、下から水溶液、乳状層、油層の３層に分けられる。脂肪幹細胞は水溶液及び乳状層内に位置している。細胞懸濁液装置３６の最底層が管路３７１と接続されるため、注射ポンプで定量設定することによって、細胞液内の細胞の濾過分離を行うことができる。もちろん、本発明の他の実施例において、原料が他の組織又は組織断片等である場合、このように３層に分層されないこともあるが、細胞液の量は制御可能なもので、当業者が対応に調整すればよく、目的は細胞を含有することにある。
３、濾過装置を用いて不純物及び大分子を濾過し、微細孔膜濾過器を用いて細胞を動的濾過分離して抽出する。
(１)コンピュータの予めに設定したパラメータに従って、濾過、遠心、分離過程が作動し始める。バルブ２２１を開き、電動注射ポンプ２３における注射器３４を用いて、細胞懸濁液容器３６の最下層の水溶性細胞懸濁液を抽出する。この時、細胞懸濁液は一次濾過器３２を通じて、その中の未消化した組織、不純物等を濾過する。
(１)コンピュータの予めに設定したパラメータに従って、濾過、遠心、分離過程が作動し始める。バルブ２２１を開き、電動注射ポンプ２３における注射器３４を用いて、細胞懸濁液容器３６の最下層の水溶性細胞懸濁液を抽出する。この時、細胞懸濁液は一次濾過器３２を通じて、その中の未消化した組織、不純物等を濾過する。
(２)バルブ２２１を閉鎖し、バルブ２２３を開く、電動注射ポンプにおける注射器３４を用いてそのうちの溶液を管路四３７４、回転継ぎ手３３、管路五３７５を通じて、回動中の遠心動的濾過装置３１に注入させ、膜前室に達し、水分及び小さい生体分子、特にコラゲナーゼは膜孔を経て膜後室に流れ込み、管路六３７６を経て、廃液溝２７に排出され、細胞は膜前室に差し止められ、且つ遠心力の差によって、細胞は膜孔から振り離れ、膜孔を詰めることがない。本実施例の回転アームの半径は２０であり、回転数は１５００ｒｐｍである。
(３)吸引過程を繰り返し、量に対するコンピュータの予め設定に従って、油と水の分離面以下になるまで、溶液を吸い終わる。細胞の分離効率を向上するために、平衡液を繰り返して注入し、再びに濾過でき、具体的に以下のステップを含む。
Ａ、バルブ２２２を開き、平衡液収容装置３５における３７℃平衡液を適量に、本実施例では１００ｍｌを吸い取る。バルブ２２２を閉鎖し、バルブ２２１を開いて、平衡液を細胞懸濁液容器３６に注入し、過程（２)を繰り返して行う。乳状層内に残留した細胞が得られる。
Ａ、バルブ２２２を開き、平衡液収容装置３５における３７℃平衡液を適量に、本実施例では１００ｍｌを吸い取る。バルブ２２２を閉鎖し、バルブ２２１を開いて、平衡液を細胞懸濁液容器３６に注入し、過程（２)を繰り返して行う。乳状層内に残留した細胞が得られる。
４、遠心動的濾過装置における抽出した細胞を平衡液で洗浄する。
まず、バルブ２２２を開き、注射器３４により処理液収容装置３５から平衡液を抽出する。その後、バルブ２２２を閉鎖し、バルブ２２３開いて、平衡液は管路四３７４を経て動的遠心装置３１の膜前室に流れ込み、膜前室に差し止められた細胞液を連続に希釈し洗浄して、有害な小分子の物質を徹底的に除去する。本実施例の洗浄液は１５０ｍｌである。
洗浄ステップは、主に細胞又は細胞液に残存した酵素を除去するためにある。
まず、バルブ２２２を開き、注射器３４により処理液収容装置３５から平衡液を抽出する。その後、バルブ２２２を閉鎖し、バルブ２２３開いて、平衡液は管路四３７４を経て動的遠心装置３１の膜前室に流れ込み、膜前室に差し止められた細胞液を連続に希釈し洗浄して、有害な小分子の物質を徹底的に除去する。本実施例の洗浄液は１５０ｍｌである。
洗浄ステップは、主に細胞又は細胞液に残存した酵素を除去するためにある。
５、微細孔膜濾過器３１を取り外し、管路を密封して用意する。
微細孔膜濾過器３１を取り外し、その内の溶液は直接に使用することができる。本実施例において、熱溶融はさみを用いて給液管路と出液管路を直接に熱溶融してせん断して封口し、保存して用意する。直接に使用する前に、微細孔膜濾過器３１を発振器に置いて発振させ、均一に混合すれば吸い出すことができる。
この実施例の細胞分離方法は、組織の消化、初歩的な濾過、動的濾過による細胞の獲得、細胞の収集等の工程を全自動化を実現できる。そして、全過程が一度的密封管路で自動的に完成され、外部環境に露出することなく、汚染を回避し、操作中の細胞の機械的傷つけを軽減して、分離細胞の生存率を高めている。
微細孔膜濾過器３１を取り外し、その内の溶液は直接に使用することができる。本実施例において、熱溶融はさみを用いて給液管路と出液管路を直接に熱溶融してせん断して封口し、保存して用意する。直接に使用する前に、微細孔膜濾過器３１を発振器に置いて発振させ、均一に混合すれば吸い出すことができる。
この実施例の細胞分離方法は、組織の消化、初歩的な濾過、動的濾過による細胞の獲得、細胞の収集等の工程を全自動化を実現できる。そして、全過程が一度的密封管路で自動的に完成され、外部環境に露出することなく、汚染を回避し、操作中の細胞の機械的傷つけを軽減して、分離細胞の生存率を高めている。
もちろん、本発明の他の実施例において、管路システムの設計は上記実施例と異なってもよく、対応する機能を実現できればよい。
以上の記述は本発明の好ましい実施例に過ぎず、これにより本発明の保護範囲を限定されるわけにはいかない。本発明の技術案と同等な変換及び取替は、いずれも本発明の保護範囲に含まれるはずである。
Claims (15)
- 活性細胞を分離するための遠心動的濾過装置において、
回転軸と、前記回転軸と垂直に接続され、且つそれに伴って回転する回転アームと、前記回転アームの遠心端に固定して接続された微細孔膜濾過器と、を含み、
前記微細孔膜濾過器は、給液口と、排液口と、前記給液口、及び前記排液口にそれぞれ連通された膜前室及び膜後室と、前記膜前室と前記膜後室との間に設けられた濾過膜とを含み、
前記濾過膜の濾過孔の直径は、分離すべく細胞の直径よりも小さく、
前記給液口及び前記膜前室は前記回転アームの遠心端に位置し、前記排液口及び前記膜後室は前記回転アームの近心端に位置し、細胞懸濁液における水分と生体粒子及び生体分子を、液流圧により前記濾過膜に通過させ、細胞は、前記濾過膜により阻止され、遠心力によって前記濾過膜から振り離れて前記膜前室に沈降され、膜孔の細胞に対する詰まりを解除する、
ことを特徴とする遠心動的濾過装置。 - 前記回転アームの長さは１０〜３０ｃｍであり、回転数は５００〜１５００ｒｐｍであり、生じた遠心力は１００〜５００ｇである、ことを特徴とする請求項１に記載の遠心動的濾過装置。
- 前記微細孔膜濾過器の横断面は円形又は方形である、ことを特徴とする請求項１に記載の遠心動的濾過装置。
- 前記濾過膜の濾過孔の直径はｌ-３０μｍである、ことを特徴とする請求項１に記載の遠心動的濾過装置。
- 前記濾過膜は、ポリオレフィン系又はポリアミド系の材料を用いて製造される、ことを特徴とする請求項１に記載の遠心動的濾過装置。
- 前記濾過膜は、ポリエチレン、混合セルロース、ＰＥ材料又はナイロン材料で製造される、ことを特徴とする請求項５に記載の遠心動的濾過装置。
- 前記微細孔膜濾過器の前記給液口には、給液管が接続され、前記給液管は、回転継ぎ手を介してその上流管路に接続され、前記回転継ぎ手は、前記回転アームの軸心の真上の固定ラック上に設けられ、
前記回転継ぎ手の非回転端は、前記給液管に連通された上流管路に接続され、前記回転継ぎ手の回転端は、前記微細孔膜濾過器が前記回転軸の回動時に細胞懸濁液を連続的に濾過できるように、前記給液管を介して前記微細孔膜濾過器に接続される、
ことを特徴とする請求項１に記載の遠心動的濾過装置。 - 細胞分離システムにおいて、
一度的全密閉管路システムと、計器システムとを含み、
前記一度的全密閉管路システムは、微細孔膜濾過器と、一次濾過器と、回転継ぎ手と、一度的注射器と、平衡液容器と、細胞懸濁液容器と、酵素液容器接続管路とを含み、
前記微細孔膜濾過器は、給液口と、排液口と、前記給液口及び前記排液口にそれぞれ連通された膜前室及び膜後室と、前記膜前室と前記膜後室との間に設けられた濾過膜とを含み、前記濾過膜の濾過孔は、分離して抽出すべく細胞の大きさよりも小さく、前記給液口及び前記膜前室は、前記微細孔膜濾過器の遠心力を受ける遠心端に位置し、前記排液口及び前記膜後室は、前記微細孔膜濾過器の遠心力を受ける近心端に位置し、細胞懸濁液における水分と生体粒子及び生体分子を、液流圧により前記濾過膜に通過させ、細胞は、前記濾過膜により阻止され、遠心力によって前記濾過膜から振り離れて前記膜前室に沈降され、
前記接続管路は、第一管路と、第二管路と、第三管路と、第四管路と、第五管路と、第六管路と、第七管路とを含み、
前記細胞懸濁液容器は逆様にしたものであり、前記細胞懸濁液容器の瓶口には前記第一管路が接続して連通され、前記第一管路には前記一次濾過器が設けられ、
前記平衡液容器は逆様にしたものであり、前記平衡液容器の瓶口には前記第二管路が連通され、前記第二管路は前記第一管路と連通され、
前記第三管路は、一方端が前記第一及び第二管路の交差部に連通され、他方端が前記一度的注射器に連通され、
前記第四管路は、一方端が前記一度的注射器に連通され、他方端が前記回転継ぎ手の固定端に連通され、
前記第五管路は、一方端が前記回転継ぎ手の回転端に連通され、他方端が前記微細孔膜濾過器の給液口に連通され、
前記第六管路は、一方端が前記微細孔膜濾過器の排液口に連通され、他方端の開口が廃液収集溝に延びられ、
前記第七管路は、一方端が前記第一及び第二管路の交差部に連通され、他方端が前記酵素液容器に連通され、
ここで、前記計器システムは、電動回転アームと、電動注射ポンプと、平衡液温度上昇制御装置と、細胞懸濁液温度上昇制御装置と、細胞懸濁液発振回転盤と、電磁制御バルブとを含み、
前記電動回転アームのアーム端は前記微細孔膜濾過器に固定され、前記電動回転アームの回転軸は、前記回転継ぎ手の回転軸と同一の直線上にあり、
前記電動注射ポンプは、前記一度的注射器を制御し、前記平衡液温度上昇制御装置は、前記平衡液容器における平衡液温度を上昇制御できるように前記平衡液容器外に設けられ、前記細胞懸濁液温度上昇制御装置は、前記細胞懸濁液容器における細胞懸濁液温度を上昇制御できるように前記細胞懸濁液容器外に設けられ、前記細胞懸濁液容器及び前記細胞懸濁液温度上昇制御装置は、前記細胞懸濁液発振回転盤上に設けられ、前記細胞懸濁液発振回転盤は、コンピュータの配置した周波数によって前記細胞懸濁液容器を自動的に発振させるようになり、
前記電磁制御バルブは、第一電磁制御バルブと、第二電磁制御バルブと、第三電磁制御バルブと、第四電磁制御バルブとを含み、
前記第一電磁制御バルブは、前記第一管路に設けられ、且つ、前記第一管路と前記第二管路との交差部の前に位置し、
前記第二電磁制御バルブは、前記第二管路に設けられ、
前記第三電磁制御バルブは、前記第四管路に設けられ、且つ、前記一度的注射器と回転継ぎ手との間に位置し、
前記第四電磁制御バルブは、前記第七管路に設けられていることを特徴とする細胞分離システム。 - 前記一次濾過器の濾過孔の孔径は目的細胞の直径よりも大きく、前記一次濾過器微細孔膜の孔径は、２００〜３００目である、ことを特徴とする請求項８に記載の細胞分離システム。
- 電磁制御バルブは、いずれも電磁ピンチバルブであり、管路の開放及び閉鎖を制御する、ことを特徴とする請求項８に記載の細胞分離システム。
- 前記微細孔膜濾過器の前記膜前室及び前記膜後室は、前記濾過膜で仕切られてなり、前記給液口は、前記膜前室の上部又は側壁に設けられ、前記排液口は、前記膜後室の底部又は側壁に設けられている、ことを特徴とする請求項８に記載の細胞分離システム。
- 前記濾過膜は、親水性膜である、ことを特徴とする請求項８に記載の細胞分離システム。
- 前記濾過膜の濾過孔の直径はｌ-３０μｍである、ことを特徴とする請求項８に記載の細胞分離システム。
- 前記濾過膜は、ポリオレフィン系又はポリアミド系材料を用いて製造される、ことを特徴とする請求項１０に記載の細胞分離システム。
- 前記濾過膜は、ポリエチレン、又は混合セルロース、又はＰＥ材料又はナイロン材料から製造される、ことを特徴とする請求項１４に記載の細胞分離システム。
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