JP2015517530A - 肺組織像を細分類するためのｓｒｍ／ｍｒｍ分析 - Google Patents
肺組織像を細分類するためのｓｒｍ／ｍｒｍ分析 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2015517530A JP2015517530A JP2015512853A JP2015512853A JP2015517530A JP 2015517530 A JP2015517530 A JP 2015517530A JP 2015512853 A JP2015512853 A JP 2015512853A JP 2015512853 A JP2015512853 A JP 2015512853A JP 2015517530 A JP2015517530 A JP 2015517530A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- krt7
- napsin
- krt5
- ttf1
- muc1
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title description 85
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 title description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 303
- 102100027881 Tumor protein 63 Human genes 0.000 claims abstract description 196
- 102100023974 Keratin, type II cytoskeletal 7 Human genes 0.000 claims abstract description 195
- 101710140697 Tumor protein 63 Proteins 0.000 claims abstract description 195
- 101000975502 Homo sapiens Keratin, type II cytoskeletal 7 Proteins 0.000 claims abstract description 192
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 claims abstract description 191
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 claims abstract description 189
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 163
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 67
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 39
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 23
- 102100025756 Keratin, type II cytoskeletal 5 Human genes 0.000 claims description 196
- 101001056473 Homo sapiens Keratin, type II cytoskeletal 5 Proteins 0.000 claims description 192
- -1 Napsin A Proteins 0.000 claims description 169
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 133
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 132
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 111
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 81
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 79
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 52
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 45
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 42
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 41
- 102100027893 Homeobox protein Nkx-2.1 Human genes 0.000 claims description 23
- 101000632178 Homo sapiens Homeobox protein Nkx-2.1 Proteins 0.000 claims description 23
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 18
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 16
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 15
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 10
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 claims description 7
- QOFFJEBXNKRSPX-ZDUSSCGKSA-N pemetrexed Chemical group C1=N[C]2NC(N)=NC(=O)C2=C1CCC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 QOFFJEBXNKRSPX-ZDUSSCGKSA-N 0.000 claims description 7
- 229960005079 pemetrexed Drugs 0.000 claims description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 6
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 claims description 4
- 238000000534 ion trap mass spectrometry Methods 0.000 claims description 3
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 claims description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 claims description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 claims description 2
- 238000005173 quadrupole mass spectroscopy Methods 0.000 claims description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 2
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 claims description 2
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 claims description 2
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 claims description 2
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 claims description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 2
- 101000845269 Homo sapiens Transcription termination factor 1 Proteins 0.000 claims 22
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 1
- 230000003796 beauty Effects 0.000 claims 1
- 230000013777 protein digestion Effects 0.000 claims 1
- 238000002552 multiple reaction monitoring Methods 0.000 abstract description 87
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 45
- 238000011002 quantification Methods 0.000 abstract description 25
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 4
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000834 fixative Substances 0.000 abstract 1
- 108010020382 Hepatocyte Nuclear Factor 1-alpha Proteins 0.000 description 165
- 102100022057 Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Human genes 0.000 description 165
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 34
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 24
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 24
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 22
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 19
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 19
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 17
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 17
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 13
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 11
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 10
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 10
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 8
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 8
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 7
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 7
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 6
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 6
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 102000002658 Thyroid Nuclear Factor 1 Human genes 0.000 description 5
- 108010057966 Thyroid Nuclear Factor 1 Proteins 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 5
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000005040 ion trap Methods 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 4
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 4
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000581940 Homo sapiens Napsin-A Proteins 0.000 description 3
- 108010070553 Keratin-5 Proteins 0.000 description 3
- 108010070507 Keratin-7 Proteins 0.000 description 3
- 101001018085 Lysobacter enzymogenes Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010008707 Mucin-1 Proteins 0.000 description 3
- 102100027343 Napsin-A Human genes 0.000 description 3
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 3
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 description 3
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- JCLFHZLOKITRCE-UHFFFAOYSA-N 4-pentoxyphenol Chemical compound CCCCCOC1=CC=C(O)C=C1 JCLFHZLOKITRCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 2
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 102000038037 druggable proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091007999 druggable proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 238000011369 optimal treatment Methods 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 2
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003170 Bronchiolo-Alveolar Adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010058354 Bronchioloalveolar carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 1
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102100041019 Coordinator of PRMT5 and differentiation stimulator Human genes 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 101000748895 Homo sapiens Coordinator of PRMT5 and differentiation stimulator Proteins 0.000 description 1
- 101000987003 Homo sapiens Tumor protein 63 Proteins 0.000 description 1
- 101710194928 Keratin, type II cytoskeletal 5 Proteins 0.000 description 1
- CXQHYVUVSFXTMY-UHFFFAOYSA-N N1'-[3-fluoro-4-[[6-methoxy-7-[3-(4-morpholinyl)propoxy]-4-quinolinyl]oxy]phenyl]-N1-(4-fluorophenyl)cyclopropane-1,1-dicarboxamide Chemical compound C1=CN=C2C=C(OCCCN3CCOCC3)C(OC)=CC2=C1OC(C(=C1)F)=CC=C1NC(=O)C1(C(=O)NC=2C=CC(F)=CC=2)CC1 CXQHYVUVSFXTMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000016549 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 229940082789 erbitux Drugs 0.000 description 1
- 229940014144 folate Drugs 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 229950008692 foretinib Drugs 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 208000016992 lung adenocarcinoma in situ Diseases 0.000 description 1
- 201000005243 lung squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000001531 micro-dissection Methods 0.000 description 1
- 208000024191 minimally invasive lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 208000011581 secondary neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 235000020354 squash Nutrition 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004222 uncontrolled growth Effects 0.000 description 1
- 208000010576 undifferentiated carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity
- G01N2333/4704—Inhibitors; Supressors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4742—Keratin; Cytokeratin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
- G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
- G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
- G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
- G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
- G01N2333/96472—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
- G01N2458/15—Non-radioactive isotope labels, e.g. for detection by mass spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2560/00—Chemical aspects of mass spectrometric analysis of biological material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本開示は、選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）質量分析の方法または多重反応モニタリング（ＭＲＭ）質量分析ともよばれ得るものにより、ホルマリンで固定された生体試料におけるＫＲＴＳ、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦI、ＴＰ６３および／またはＭＵＣ１タンパクを直接定量化するために特に有利な、ＫＲＴＳ、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦI、ＴＰ６３および／またはＭＵＣ１タンパク由来の特定のペプチド、およびそのペプチドの派生したイオン化特性を提供する。このような生体試料は、化学的に保存されて固定され、当該生体試料は、ホルマリン固定組織／細胞、ホルマリン固定／パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織／細胞、ＦＦＰＥ組織ブロックおよびこれらのブロック由来の細胞、並びにホルマリン固定およびまたはパラフィン包埋された組織培養細胞を含む、薬剤／固定剤を含むホルムアルデヒドで処理された組織および細胞から選択される。
Description
本出願は、２０１２年５月１６日出願の、「肺組織像を細分類するためのＳＲＭ／ＭＲＭ分析」という表題の、米国仮特許出願第６１／６４７，６０２号の利益を主張し、その内容が、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。
肺癌は、最も蔓延している癌（２００，０００より多い新たな米国の症例／一年）であり、低い５年生存率（約１５％）を有する。肺癌の治療は、放射線、葉酸代謝、プラチナベースの薬物および／またはタキソールベースの薬物からなる治療の限定的な選択肢の使用から、腫瘍および／または重要なバイオマーカーもしくは治療標的タンパク質の存在もしくは欠損の組織学的特徴づけを必要とする、より標的を定める処置へと移行している。全ての肺癌の８０％もが非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）タイプであり、この一般的なタイプは、組織学的分析に基づいて、４つの異なるサブタイプに分類され得、これらのタイプは、腺癌、扁平上皮癌、細気管支肺胞上皮癌、および大細胞未分化癌である。大部分のＮＳＣＬＣ患者は、腺癌（ＡＤＣ）または扁平上皮癌（ＳＣＣ）のサブタイプを示す。２つの近年利用される、標的を定める癌の治療、ペメトレキセドおよびベバシズマブは、ＮＳＣＬＣ肺癌を治療することにおいて高い成功率を示しているが、両方の薬物が、扁平上皮癌（ＳＣＣ）患者におけるより高いリスクの出血を引き起こす。よって、それらの使用は、非扁平、非小細胞肺癌患者に制限されて、そのほとんどは腺癌（ＡＤＣ）患者であり、ＳＣＣからＡＤＣを区別し得る分析は非常に価値があり、これらの薬物による処置に害されず利益をうけるだけである患者のみが、これらの薬物により実際に治療される。本実施形態は、肺癌治療の向上された処置の決定のための肺の扁平上皮癌（ＳＣＣ）から腺癌（ＡＤＣ）を区別するために有用である、ＳＲＭ／ＭＲＭ分析における使用のためのペプチドおよびペプチド配列を提供する。
以下のタンパク質のサブシーケンス由来の特定のペプチド、ケラチン５（ＫＲＴ５またはＫＲ５）、ケラチン７（ＫＲＴ７またはＫＲ７）、ナプシンＡ、甲状腺転写因子１（ＴＴＦ１）、腫瘍タンパク質６３（ＴＰ６３）、およびムチン１（ＭＵＣ１）が提供される。ケラチン５は、サイトケラチン５およびタイプＩＩケラチンＫｂ５としても知られ、ＫＲＴ５として言及されるであろう。ケラチン７は、サイトケラチン７としても知られ、ＫＲＴ７として言及されるであろう。ナプシンＡは、ナプシン１、アスパルチルプロテアーゼ４、およびＡＳＰ４としても知られ、ナプシンＡとして言及されるであろう。甲状腺転写因子１は、ＴＩＴＦ１、ＴＴＦ１、ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ２．１、ホメオボックスタンパク質ＮＫ‐２相同体Ａ、および甲状腺核因子１（ｔｈｙｒｏｉｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ １）としても知られ、ＴＴＦ１として言及されるであろう。腫瘍タンパク質６３は、ケラチノサイト転写因子ＫＥＴ、形質転換関連タンパク質６３、および慢性的な潰瘍性口内炎のタンパク質としても知られ、ＴＰ６３として言及されるであろう。ムチン１は、カルシノーマ関連ムチン、エピシアリン、ＣＤ２２７、および腫瘍関連上皮膜抗原としても知られ、ＭＵＣ１として言及されるであろう。
タンパク質由来の各ペプチドについてのペプチド配列および断片化／移行イオンは、ＳＲＭ／ＭＲＭ分析（複数を含む）として以下に言及される、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）分析（複数を含む）としても言及され得る、質量分析に基づく選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）分析（複数を含む）において潜在的に有用である。ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質およびこれらのタンパク質のアイソフォームのＳＲＭ／ＭＲＭ分析についてのペプチドの使用が記載される。
１もしくはそれ以上の、２もしくはそれ以上の、３もしくはそれ以上の、４もしくはそれ以上の、または５もしくは６のＳＲＭ／ＭＲＭ分析（複数を含む）が、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来の１またはそれ以上の特定のペプチドの存在を検出し、相対的または絶対的な定量レベルを測定するために使用され得、よって、質量分析により生体試料から得られた所与のタンパク質調製物におけるこれらのタンパク質のそれぞれの総量を測定する手段を提供する。また、これらのタンパク質由来の使用可能なペプチドの全てのまたは全ての一部分が、単一のＳＲＭ／ＭＲＭ分析で同時に分析され得、または個々のＳＲＭ／ＭＲＭ分析のあらゆる組み合わせにおいて分析され得る。ペプチドのそれぞれが、質量分析により生体試料から得られた所与のタンパク質調製物における、対応するタンパク質のそれぞれの総量を測定することの可能性のある手段を提供する。
本明細書に記載されるＳＲＭ／ＭＲＭ分析（複数を含む）は、ホルマリン固定癌患者組織（例えば、生検）のような、患者の組織サンプルから得た、細胞から調製された複合タンパク質溶解物サンプルにおいて、直接これらのペプチドを測定し得る。ホルマリン固定組織からタンパク質サンプルを調製する方法は、その内容がそれらの全体において参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，４７３，５３２号に記載されている。当該特許に記載されている方法は、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）から入手可能なＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ試薬およびプロトコールを用いて便利に行われ得る。
癌患者から外科的に取り除かれた組織のホルムアルデヒド／ホルマリン固定は、病理学の現場においては受け入れられている慣例である。その結果、ホルムアルデヒド／ホルマリン固定パラフィン包埋組織は、これらの患者から最も広範囲で使用可能な形態の組織である。ホルムアルデヒド／ホルマリン固定は、概して、ホルマリンとして言及される、ホルムアルデヒドの水溶液を用いる。「１００％」ホルマリンは、酸化および重合の程度を制限するために少量の安定剤、通常はメタノールを含む、水におけるホルムアルデヒド（体積で約４０％または重量で約３７％のホルムアルデヒド）の飽和溶液からなる。組織が保存される最も一般的な方法は、通常、１０％中性緩衝ホルマリンとよばれる、水溶性のホルムアルデヒドにおいて、長時間（８時間から４８時間）、組織全体を浸すことであり、その後、室温での長期間の保存のために、固定された組織全体をパラフィンワックスで包埋する。よって、ホルマリン固定癌組織を分析するための分子分析方法は、癌患者組織の分析のために最も受け入れられ、大いに利用される方法であろう。
ＳＲＭ／ＭＲＭ分析（複数を含む）からの結果は、組織（生体試料）が採取されて保存された患者または対象の特定の組織サンプル（例えば、癌組織サンプル）内の、これらのタンパク質の可能性のあるアイソフォームの正確で精密な定量レベルに加えて、これらのタンパク質のいずれかまたは全ての正確で精密な定量レベルを関連付けるために用いられ得る。このことは、癌についての診断情報を提供するだけでなく、医師または他の医療専門家が患者または対象の適切な治療を決定することを可能にする。患部組織または別の患者／対象サンプルにおけるタンパク質発現のレベルについての診断上および治療上の重要な情報を提供するこのような分析は、コンパニオン診断分析とよばれる。例えば、このような分析は、癌のステージ、程度、またはヒストロジーを診断し、患者または対象が最も反応しそうな治療薬を決定するために設計され得る。
より具体的には、患者からの癌細胞における、１もしくはそれ以上の、２もしくはそれ以上の、３もしくはそれ以上の、４もしくはそれ以上の、または５もしくはそれ以上の、ＫＲＴ７、ＭＵＣ１、ＴＴＦ１、および／またはナプシンＡのタンパク質であって、ＫＲＴ５および／またはＴＰ６３ではないタンパク質の検出および／または定量は、ＡＤＣとして細分類されるＮＳＣＬＣを示す。検出されるこれらのタンパク質が多くなるほど、癌がＮＳＣＬＣである可能性が高くなる。同様に、患者からの癌細胞における、ＫＲＴ５および／またはＴＰ６３のタンパク質であって、ＫＲＴ７、ＭＵＣ１、ＴＴＦ１、および／またはナプシンＡでないタンパク質の検出および定量は、ＳＣＣとして細分類されるＮＳＣＬＣを示す。多くのＮＳＣＬＣ患者がＫＲＴ５およびＫＲＴ７タンパク質のみを単独で用いて細分類され得る（ＡＤＣ＝ＫＲＴ７＞ＫＲＴ５；ＳＣＣ＝ＫＲＴ５＞ＫＲＴ７）ことがわかっているが、ＫＲＴ５および／またはＫＲＴ７タンパク質が検出および／または定量化されず、よって、ＡＤＣおよびＳＣＣを区別するために有用でない場合に、他のタンパク質がＡＤＣとＳＣＣを区別するために使用され得る。
患者のＮＳＣＬＣが、１、２、３、またはそれ以上のＫＲＴ７、ＭＵＣ１、ＴＴＦ１および／またはナプシンＡのタンパク質の発現による検出および／または定量により、ＡＤＣであることが決定される場合、そのときは、患者において過度のおよび有害な出血を誘発しない、ペメトレキセドおよび／またはベバシズマブのいずれかにより、患者の癌が治療されるかもしれない。患者のＮＳＣＬＣが、ＫＲＴ５およびＴＰ６３のタンパク質のうちの１つまたは両方の検出および／または定量により、ＳＣＣであることが決定される場合、そのときは、患者の過度のおよび有害な出血を避けるために、ペメトレキセドおよび／またはベバシズマブのいずれかにより、患者の癌は治療されるべきではない。
本明細書に記載される分析は、相対的または絶対的なレベルの特定の改変されていない、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１を含む、タンパク質由来のペプチドを定量化しまたは測定し、また、相対的または絶対的なレベルの、これらのタンパク質由来の特定の改変されたペプチドを測定することもできる。改変の例は、ペプチドに存在するリン酸化アミノ酸残基およびグリコシル化アミノ酸残基を含む。
タンパク質および可能性のあるアイソフォームの相対的な定量のレベルは、ＳＲＭ／ＭＲＭ方法論により、例えば、ＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積（例えば、シグネチャのピーク面積または集積されたフラグメントイオン強度）を比較することにより測定され得る。個々のＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のペプチドの相対的なレベルが、異なるサンプルで測定され得る（例えば、対照サンプルおよび患者のまたは対象の組織から調製されたサンプル）。代替的には、各ペプチドは、それ自身の特定のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピークを有する場合、１またはそれ以上のＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１シグネチャペプチドについての、複数のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積を比較することができる。ピーク面積を比較することにより、１つの生体試料における、または、１もしくはそれ以上の追加のもしくは異なる生体試料における、相対的なＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質および可能性のあるタンパク質アイソフォーム含有量を測定することができる。このようにすることで、これらのタンパク質由来の、特定の１つのペプチドまたは複数のペプチドの相対量、それゆえにＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の相対量、およびそれらの可能性のあるアイソフォームが測定され得、複数の（例えば、２、３、４、５、またはそれ以上）生体試料にわたって、同じ実験条件下で測定され得る。さらに、単一のサンプル内のＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来の所与の１つのペプチドまたは複数のペプチドについて、相対的な定量が、ＳＲＭ／ＭＲＭ方法論によるそのペプチドについてのシグネチャのピーク面積を、生体試料由来の同じタンパク質調製物内で、異なる１つのタンパク質または複数のタンパク質由来の、別のまたは異なる１つのペプチドまたは複数のペプチドについてのシグネチャのピーク面積に対して比較することにより、測定され得る。このような方法論を用いて、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来の特定のペプチドの量、それゆえに対応するタンパク質およびこれらの可能性のあるアイソフォームのそれぞれの量が、同じサンプル内または異なるサンプルにおいて、相対的に相互に測定され得る。個々の１つのペプチドまたは複数のペプチドの相対的な定量は、サンプル内またはサンプル間で別の１つのペプチドまたは複数のペプチドの量に対して相対的に行われるかもしれないので、生体試料におけるタンパク質の、絶対的な体積に対する重量または重量に対する重量の量によらず、（例えば、相互に相対的であるピーク面積を測定することにより）存在するペプチドの相対量を測定することができる。よって、生体試料由来のタンパク質調製物におけるＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のペプチドの量は、種々のサンプルにおけるおよび種々のサンプル間のこれらのタンパク質の量を測定するために使用されるかもしれない。異なるサンプル間の個々のシグネチャのピーク面積についての相対的な定量データは、サンプルごとに分析されるタンパク質の量に対して一般的に正規化される（例えば、サンプルの総タンパク質濃度および分析された体積が、サンプルを正規化するために使用される。）。相対的な定量は、相対的なタンパク質量、他のペプチド／タンパク質に対する１のペプチド／タンパク質のさらなる見識を得るために、単一のサンプルにおいておよび／または多くのサンプルにわたり、複数のタンパク質およびＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質（複数を含む）由来の多くのペプチドにわたって、同時に行われ得る。
ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の絶対的な定量レベルは、例えば、ＳＲＭ／ＭＲＭ方法論により測定され、これにより、１つの生体試料における、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来の個々のペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積が、既知量でサンプルに「添加」される、１またはそれ以上の内部標準（例えば、同位体標識化標準物質）の既知量のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積と比較される。一実施形態では、内部標準は、１またはそれ以上の重同位体で標識された１またはそれ以上のアミノ酸残基を含む、正確に同じＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のペプチドの合成したものである。質量分光分析が、天然のＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のペプチドシグネチャのピークとは異なりかつ別個である、予測できるおよび一貫したＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピークを生成し、比較部のピークとして使用され得るように、このような同位体標識化内部標準が合成される。よって、内部標準が、既知量で、生体試料由来のタンパク質またはペプチド調製物内に既知量で添加されて、質量分析により分析される場合、天然のペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積は、当該内部標準ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積と比較され得る。数値の比較は、対応するタンパク質の濃度または重量が測定される、生体試料由来のもとのタンパク質調製物に存在する天然ペプチドの絶対的なモル濃度および／または絶対的な重量のいずれかの算出を可能にする。フラグメントペプチドについての絶対的な定量データは、典型的に、サンプルごとに分析されるタンパク質の量に従って表示される。個々の生体試料および／または個々のサンプルのコホート全体における、絶対的なタンパク質量の見識を得るために、単一のサンプルにおいておよび／または複数のサンプルにわたって、同時に複数のタンパク質（例えば、２、３、４、５等）の定量測定を可能にする、多くのペプチドにわたって、絶対的な定量が行われ得る。一実施形態では、タンパク質の定量は、米国特許第７，５０１，２８６号においてＧｙｇｉらにより記載される、ペプチド標準物質を用いて行われることとしてもよい。
本明細書で使用されるように、用語の、定量化する、定量化、測る、または計測は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、標準物質（例えば、内部標準）のような分析物の相対的または絶対的なレベルを測定することを意味する。
ＡＤＣとＳＳＣを区別するために有用であることに加えて、本明細書に記載されるＳＲＭ／ＭＲＭ分析方法は、例えば、ホルマリン固定組織のような、患者由来または対象由来の組織を使用する場合、癌のステージを測定するための補助として使用され得る。本明細書に記載されるＳＲＭ／ＭＲＭ分析は、また、どの治療薬が、患者または対象を治療するときの使用に最も有利であるかを決定する際の補助として用いられることとしてもよい。
本明細書に記載される肺癌に関連するタンパク質のレベルを試験するために、癌組織、または、疑いのある疾病の存在もしくは不存在を判定するために行われる、部分的もしくは全部の腫瘍の切除により、または生検手順により、患者または対象から取り除かれた癌の疑いがある組織で分析が行われ得る。組織のサンプルは、１またはそれ以上のＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質（複数を含む）、およびこれらのタンパク質を形成するものが、患者または対象の組織に存在するかどうかを判定するために分析される。さらに、１またはそれ以上のこれらのタンパク質の発現レベルが測定され、健康な組織でみられる「正常」または参照レベルと比較され得る。健康な組織でみられる正常または参照レベルのタンパク質は、例えば、癌を有しない１またはそれ以上の個体の関連する組織由来であることとしてもよい。代替的に、正常または参照レベルは、癌による影響を受けない関連する組織（例えば、同じ器官の一部）の分析により、癌を有する個体について得られることとしてもよい。
タンパク質またはペプチドの量またはレベルは、ＳＲＭ／ＭＲＭ分析により測定されるタンパク質またはペプチドのモル、質量、または重量で表される量として定義され得る。レベルまたは量は、分析される（例えば、タンパク質の１マイクログラムあたりのマイクロモル、またはタンパク質の１マイクログラムあたりのマイクログラムで表される）溶解物におけるタンパク質または別の成分の合計のレベルまたは量に対して正規化されることとしてもよく、または重量あたりに基づくＤＮＡの量（例えば、ＤＮＡマイクログラムあたりのマイクロモルまたはマイクログラム）に対して正規化もされ得る。また、タンパク質またはペプチドのレベルまたは量が、体積ベースで測定され、例えば、１マイクロリットルあたりマイクロモルまたはナノグラムとして表されることとしてもよい。また、ＳＲＭ／ＭＲＭ分析により測定されるタンパク質またはペプチドの量またはレベルは、分析される細胞の数に対して正規化され得る。
ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質、並びにこれらのタンパク質のアイソフォームに関する情報が、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質、およびそれらのアイソフォーム、またはフラグメントペプチドのレベルを正常な組織で観察されるレベルと関連付けまたは比較することにより、癌の組織学的ステージまたは悪性度を判定する際に補助するために使用され得る。いったん、癌の組織学的ステージおよび／もしくは悪性度、並びに／またはＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／もしくはＭＵＣ１のタンパク質発現特性が測定されると、その情報が、例えば、分析された１つのタンパク質または複数のタンパク質（例えば、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１の）異常な発現により特徴づけられる、癌組織を特異的に治療するために開発された治療薬（化学的および生物学的）のリストとつき合わされ得る。特定の個体由来の、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質分析からの、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質（複数を含む）を発現する細胞／組織を特異的に標識する治療薬のリストに対するマッチングの情報は、肺癌の疾病を治療するための個別化医療アプローチを示す。本明細書に記載される分析方法は、患者のまたは対象自身の組織由来のタンパク質の分析を用いることにより、診断および治療の決定のソースとして、個別化医療アプローチの基礎を形成する。
ペプチドの生成
原則として、既知の特異性のあらゆるタンパク質分解プロセスにより調製されたＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来のあらゆる予測されるペプチドが、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の発生量を測定するための代用のレポーターとして使用されることとしてもよい。一実施形態では、サンプルは、既知の特異性の１のプロテアーゼまたは複数のプロテアーゼ（例えば、１またはそれ以上のトリプシン、エンドプロテアーゼ、および／またはＬｙｓ‐Ｃ）により消化される。タンパク分解処理から得られる１またはそれ以上のペプチドは、質量分析に基づくＳＲＭ／ＭＲＭ分析のような適切な分析において、１またはそれ以上のＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の発生量を測定するために、代用のレポーターとして使用され得る。同様に、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質において改変されていることが知られる部位でアミノ酸残基を含む、あらゆる予想されるペプチド配列は、サンプルにおけるＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の改変の程度を分析するためにも使用されることとしてもよい。
原則として、既知の特異性のあらゆるタンパク質分解プロセスにより調製されたＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来のあらゆる予測されるペプチドが、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の発生量を測定するための代用のレポーターとして使用されることとしてもよい。一実施形態では、サンプルは、既知の特異性の１のプロテアーゼまたは複数のプロテアーゼ（例えば、１またはそれ以上のトリプシン、エンドプロテアーゼ、および／またはＬｙｓ‐Ｃ）により消化される。タンパク分解処理から得られる１またはそれ以上のペプチドは、質量分析に基づくＳＲＭ／ＭＲＭ分析のような適切な分析において、１またはそれ以上のＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の発生量を測定するために、代用のレポーターとして使用され得る。同様に、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質において改変されていることが知られる部位でアミノ酸残基を含む、あらゆる予想されるペプチド配列は、サンプルにおけるＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の改変の程度を分析するためにも使用されることとしてもよい。
ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のフラグメントペプチドが、米国特許第７，４７３，５３２号で提供されるＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）プロトコールの使用によるものを含む種々の手段によって生成されることとしてもよい。Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）プロトコールおよび試薬が、組織／生体試料におけるタンパク質のタンパク分解消化による、ホルマリン固定されたパラフィン包埋組織から、質量分光分析に適切なペプチドサンプルの産生を可能にする。Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）プロトコールにおいて、タンパク質架橋結合を戻すまたは解除するために、組織／バイオロジカルが、長時間、緩衝液中で上昇した温度で維持される（例えば、約１０分から約４時間の間、約８０℃から約１００℃）。使用される緩衝液は、中性の緩衝液であり（例えば、トリスベースの緩衝液、または界面活性剤を含む緩衝液）、有利には、質量分光分析を妨げない緩衝液である。次に、組織／生体試料が、当該生体試料の組織および細胞構造を崩壊させるのに、および当該サンプルを液化させるのに、十分な時間の間（例えば、約３７℃から約６５℃の温度で、約３０分から約２４時間の期間）、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、エンドプロテアーゼ、およびＬｙｓ‐Ｃを含むがこれらに限定されない、１またはそれ以上のプロテアーゼで処理される。加熱およびタンパク質分解の結果、液体の、可溶性の、希釈可能な生体分子溶解物となる。一連の実施形態では、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、エンドプロテアーゼ、およびＬｙｓ‐Ｃから選択される、２またはそれ以上のプロテアーゼが生体試料のタンパク分解の処理に使用される。
ペプチドの分離および分析
いったん溶解物が調製されると、サンプル中のペプチドは、それらの分析および測定（定量化）を促進する、種々技術に供されることとしてもよい。質量分析により分析が行われる場合、１またはそれ以上のクロマトグラフ法が分析を容易にするために使用されることとしてもよい。
いったん溶解物が調製されると、サンプル中のペプチドは、それらの分析および測定（定量化）を促進する、種々技術に供されることとしてもよい。質量分析により分析が行われる場合、１またはそれ以上のクロマトグラフ法が分析を容易にするために使用されることとしてもよい。
一実施形態では、ペプチドが、質量分析器具により分析される前に、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）により分離される。例えば、ペプチドは、Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｏ ９０Å Ｃ１２，４μｍ樹脂（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）で１２ｃｍのベッド長さに自己充填したＰｉｃｏＦｒｉｔ（１００μｍ ＩＤ／１０μｍ 先端のＩＤ，Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）カラムを用いて、ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）またはＥＡＳＹ−ｎＬＣ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上で分離され得る。ペプチドは、８００ｎＬ／分の流量で、０．１％ギ酸を含む１％から５０％のアセトニトリルの１２分のクロマトグラフィー勾配にわたって溶出され得る。いったん液体クロマトグラフィーにより分離されると、溶出されたペプチドは、分析用の質量分析計内に導かれる。一実施形態では、質量分析計は、ナノスプレー源を備える。
別の実施形態では、例えば、免疫学ベースの精製（例えば、イムノアフィニティークロマトグラフィー）のようなアフィニティ技術、イオン選択性媒体上でのクロマトグラフィーにより、またはペプチドが改変されている場合には、含水炭素が改変されたペプチドの分離のためのレクチンのような適切な媒体を用いる分離により、ペプチドが分離されることとしてもよい。さらに別の実施形態では、質量分光分析の前に、ペプチドの免疫学的分離を利用するＳＩＳＣＡＰＡ方法が使用される。ＳＩＳＣＡＰＡの技術は、例えば、米国特許第７，６３２，６８６号に記載されている。さらに他の実施形態では、レクチンアフィニティ方法（例えば、アフィニティ精製および／またはクロマトグラフィー）が質量分析による分析の前に、溶解物からペプチドを分離するために使用されることとしてもよい。レクチンに基づく方法を含む、ペプチドの群を分離するための方法は、例えば、Geng et al.,J.Chromatography B,752:293-306(2001)に記載される。イムノアフィニティークロマトグラフィー技術、レクチンアフィニティ技術、および別の形態のアフィニティ分離および／またはクロマトグラフィー（例えば、逆相、サイズに基づく分離、イオン交換）が、質量分析によるペプチドの分析を促進するためにあらゆる適切な組み合わせで使用されることとしてもよい。
驚くべきことに、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来の多くの可能性のあるペプチド配列は、明らかではない理由のために、質量分析に基づくＳＲＭ／ＭＲＭ分析の使用について適切ではないまたは効果がないことが発見された。特に、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来の多くのトリプシンペプチドが、ホルマリン固定のパラフィン包埋組織からのＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物中で、効率よくまたは全く検出できなかったことが発見された。ＭＲＭ／ＳＲＭ分析についての最も適切なペプチドを予測することができないため、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質についての確実で正確なＳＲＭ／ＭＲＭ分析を開発するために、実際のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物で、改変されたおよび改変されていないペプチドを実験的に識別する必要があった。理論に拘束されることを望まないが、いくつかのペプチドは、例えば、十分にイオン化または他のタンパク質とは別個のフラグメントを産生しないために、質量分析により検出することが難しいかもしれず、また、ペプチドは、分離（例えば、液体クロマトグラフィー）において十分に分解されておらず、またはガラスもしくはプラスチック資材に付着していないかもしれないことが考えられる。よって、ホルマリン固定組織サンプルから調製される、Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物（例えば、表１および表２のペプチド）で検出され得るＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来のこれらのペプチドは、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のＳＲＭ／ＭＲＭ分析において、ＳＲＭ／ＭＲＭ分析が使用され得るペプチドである。一実施形態では、単一のサンプルにおいて、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントの同時調製で使用されるプロテアーゼは、トリプシンであろう。
本明細書に記載される（例えば、表１および／または表２）種々の実施形態でみられるＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のペプチドは、ホルマリン固定された癌組織から得られた細胞から調製された、複合的なＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物内の全てのタンパク質のトリプシン消化によるＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来であった。別途記載しない限り、各例において、プロテアーゼはトリプシンである。Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物は、質量分析により検出されて分析される、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来のこれらのペプチドを測定するために質量分析により分析される。質量分光分析のための特定の好ましいサブセットのペプチドの識別は、１）Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物の質量分光分析においてタンパク質由来のどの１つのペプチドまたは複数のペプチドがイオン化するかの実験的判定、２）Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物を調製する際に使用されるプロトコールおよび実験の条件で残存するペプチドの性能に基づく。後者の性能は、ペプチドのアミノ酸配列だけでなく、ペプチド内の改変されたアミノ酸残基がサンプル調製中に改変された形態で残存する性能についても及ぶ。
ホルマリン（ホルムアルデヒド）固定組織から直接得られた細胞由来のタンパク質溶解物は、組織のマイクロダイセクションにより、サンプルチューブ内に細胞を収集し、その後、長時間、Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）緩衝液中で細胞を加熱することを必要とする、Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）試薬およびプロトコールを用いて調製される。いったんホルマリン誘導架橋結合が否定的な影響を受けると、組織／細胞は、例えば、プロテアーゼトリプシンを含むがこれに限定されない、プロテアーゼを用いて、予測できる態様で完全に（ｔｏ ｃｏｍｐｌｅｔｉｏｎ）その後消化される。各タンパク質溶解物は、プロテアーゼによる未変化のポリペプチドの消化によりペプチドの集合に変化する。各Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物が、各タンパク質溶解物に存在する全ての細胞のタンパク質から、質量分析により識別され得るような、できるだけ多くのペプチドの同定としてデータが示される、ペプチドの複数の包括的なプロテオミクス調査を行うために（例えば、イオントラップ質量分析により）分析された。単一の複合タンパク質／ペプチド溶解物由来のできるだけ多くのペプチドの同定のための、イオントラップ質量分析計または包括的プロファイリングを行うことができる他の形態の質量分析計が、概して分析のために使用される。ＳＲＭ／ＭＲＭ分析が、ＭＡＬＤＩ、イオントラップ、または三連四重極を含む、あらゆるタイプの質量分析計で開発されて行われ得るが、ＳＲＭ／ＭＲＭ分析のための最も有利な器具のプラットフォームは、三連四重極器具のプラットフォームであると考えられることが多い。
できるだけ多くのペプチドが、使用される条件下で、単一の溶解物のシングルＭＳ分析でいったん同定されると、その後、そのペプチドのリストが照合されて、その溶解物で検出されたタンパク質を判定するために使用された。そのプロセスは、複数のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物で繰り返され、ペプチドの非常に大きなリストが照合されて単一のデータセットにされた。そのタイプのデータセットは、（プロテアーゼ消化後に）分析された生体試料のタイプにおいて、具体的には、生体試料のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物において検出し得るペプチドを示すとみなされ得、よって、例えば、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のような特定のタンパク質についてのペプチドを含む。
一実施形態では、ＫＲＴ５（例えば、ＮＣＢＩ受託番号Ｐ１３６４７、配列番号１２）、ＫＲＴ７（例えば、ＮＣＢＩ受託番号Ｐ０８７２９、配列番号１３）、ナプシンＡ（例えば、ＮＣＢＩ受託番号Ｏ９６００９、配列番号１４）、ＭＵＣ１（例えば、ＮＣＢＩ受託番号Ｐ１５９４１、配列番号１５）、ＴＴＦ１（例えば、ＮＣＢＩ受託番号Ｐ４３６９９、配列番号１６）、および／またはＴＰ６３（例えば、ＮＣＢＩ受託番号Ｑ９Ｈ３Ｄ４、配列番号１７）の絶対的または相対的な量の測定において有用であるとして同定されるＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のトリプシンペプチドが、１もしくはそれ以上の、２もしくはそれ以上の、３もしくはそれ以上の、４もしくはそれ以上の、５もしくはそれ以上の、６もしくはそれ以上の、７もしくはそれ以上の、８もしくはそれ以上の、９もしくはそれ以上の、または１０もしくはそれ以上の、または全部の、それぞれが表１に挙げられている、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１のペプチドを含む。これらのペプチドのそれぞれが、ホルマリン固定されたパラフィン包埋組織から調製されるＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物における質量分析により検出された。よって、表１のペプチドのそれぞれ、またはこれらのペプチドのあらゆる組み合わせ（例えば、表１に挙げられる、１もしくはそれ以上の、２もしくはそれ以上の、３もしくはそれ以上の、４もしくはそれ以上の、５もしくはそれ以上の、６もしくはそれ以上の、７もしくはそれ以上の、８もしくはそれ以上の、９もしくはそれ以上の、または１０もしくはそれ以上のこれらのペプチド）は、ホルマリン固定された患者組織または対象組織において直接を含む、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質についての定量的ＳＲＭ／ＭＲＭ分析における使用のための候補である。
表１に挙げられるＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、およびＭＵＣ１のペプチドは、前立腺、結腸、乳房を含む異なるヒト器官の複数の異なるホルマリン固定された組織の複数のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物から検出されたものを含む。これらのペプチドのそれぞれは、ホルマリン固定された組織におけるＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の定量的ＳＲＭ／ＭＲＭ分析のために有用であると考えられる。これらの実験のさらなるデータ分析は、いずれの特定の器官部位から任意の特定のペプチドについての優先性が観察されないことを示した。よって、これらのペプチドのそれぞれは、身体におけるあらゆる生体試料またはあらゆる器官部位からもたらされるあらゆるホルマリン固定組織由来のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物のＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のＳＲＭ／ＭＲＭ分析を行うために適切であることが考えられる。
別の実施形態では、ＳＲＭ／ＭＲＭ分析は、ＫＲＴ５およびＴＰ６３のそれぞれについて１または２のペプチド（例えば、表１に挙げられるペプチド由来）を使用する。別の実施形態では、ＳＲＭ／ＭＲＭ分析は、ＫＲＴ７、ＭＵＣ１、ＴＴＦ１、およびナプシンＡのそれぞれについて１または２のペプチド（例えば、表１に挙げられるペプチド由来）を使用する。
別の実施形態において、ＳＲＭ／ＭＲＭ分析（複数を含む）を用いて、ＫＲＴ５およびＴＰ６３のタンパク質の１つまたは両方が分析され、ＫＲＴ７、ＭＵＣ１、ＴＴＦ１、およびナプシンＡのタンパク質の１つ、２つ、３つ、または４つが分析される。このような実施形態の一例において、１つまたは両方のＫＲＴ５およびＴＰ６３のタンパク質についての少なくとも１つまたは少なくとも２つのペプチドは、ＳＲＭ／ＭＲＭ分析により分析され（例えば、表１に挙げられるＫＲＴ５およびＴＰ６３のペプチド）、いずれか１つ、２つ、３つ、または４つのＫＲＴ７、ＭＵＣ１、ＴＴＦ１、およびナプシンＡについての少なくとも１つまたは少なくとも２つのペプチドが分析される（例えば、表１に挙げられるペプチド）。このような実施形態の別の例においては、１つまたは両方のＫＲＴ５およびＴＰ６３のタンパク質についての少なくとも１つまたは少なくとも２つのペプチドがＳＲＭ／ＭＲＭ分析により分析され（例えば、表１に挙げられるペプチド）、いずれかＫＲＴ７、ＭＵＣ１、ＴＴＦ１、およびナプシンＡについての少なくとも１つまたは少なくとも２つのペプチドが分析される（例えば、表１に挙げられるペプチド）。同位体的に標識されるがそれ以外はこれらの実施形態のいずれかで示されるペプチドの１またはそれ以上のペプチドと同一である組成物が本明細書のために提供され、それらの調製物の使用、特に質量分析スタンダードとしての使用について、以下に記載される。
一実施形態では、表１における１またはそれ以上のペプチドまたはこれらのペプチドのあらゆる組み合わせ（例えば、１もしくはそれ以上の、２もしくはそれ以上の、３もしくはそれ以上の、４もしくはそれ以上の、５もしくはそれ以上の、６もしくはそれ以上の、７もしくはそれ以上の、８もしくはそれ以上の、９もしくはそれ以上の、または１１の全て）が、免疫学的方法（例えば、ウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡ）を含むがこれに限定されない、質量分析によらない方法により分析される。一実施形態では、分析は、ホルマリン固定された組織を用いて行われる。ペプチド（複数を含む）の量（絶対的または相対的）に関する情報がどのように得られるかに関わらず、情報は、患者もしくは対象における癌の存在を示すこと（診断すること）、癌のステージ／悪性度／状態を判定すること、予後を提供すること、または患者もしくは対象の治療または処置レジメンを決定することを含み、本明細書に記載されるあらゆる方法において使用されることとしてもよい。
他の実施形態においては、免疫学的方法（例えば、ウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡ）を含むがこれに限定されない、質量分析によらない方法により、１つまたは両方のＫＲＴ５およびＴＰ６３のタンパク質が分析され、１つ、２つ、３つ、または４つのＫＲＴ７、ＭＵＣ１、ＴＴＦ１、およびナプシンＡのタンパク質が分析される。このような実施形態の一例においては、１つまたは両方のＫＲＴ５およびＴＰ６３のタンパク質についての少なくとも１つまたは少なくとも２つのペプチドが分析され（例えば、表１に挙げられるＫＲＴ５およびＴＰ６３のペプチド）、いずれか１つ、２つ、３つ、または４つのＫＲＴ７、ＭＵＣ１、ＴＴＦ１、およびナプシンＡについての少なくとも１つまたは少なくとも２つのペプチドが分析される（例えば、表１に挙げられるペプチド）。このような実施形態の別の例においては、１つまたは両方のＫＲＴ５およびＴＰ６３のタンパク質についての少なくとも１つまたは少なくとも２つのペプチドが（例えば、表１に挙げられるＫＲＴ５およびＴＰ６３のペプチド）、いずれかＫＲＴ７、ＭＵＣ１、ＴＴＦ１、およびナプシンＡについての少なくとも１つまたは少なくとも２つのペプチドが分析される（例えば、表１に挙げられるペプチド）。
ＳＲＭ／ＭＲＭ分析を行うときに重要な考慮すべき事は、ペプチドの分析において使用される機器のタイプである。ＳＲＭ／ＭＲＭ分析は、ＭＡＬＤＩ、イオントラップ、または三連四重極を含むあらゆるタイプの質量分析計で開発されて行われ得るが、現在最も有利なＳＲＭ／ＭＲＭ分析のための器械のプラットフォームは、三連四重極器械のプラットフォームであると考えられることが多い。その質量分析計のタイプは、細胞内に含まれる全てのタンパク質からの数十万から数百万の個々のペプチドからなり得る非常に複雑なタンパク質溶解物内で、単一に分離された標的ペプチドを分析するために最も適切な機器であると思われるであろう。
ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来の各ペプチドについてのＳＲＭ／ＭＲＭ分析を最も効率よく実行するために、分析におけるペプチド配列に加えて情報を利用することが望ましい。その追加の情報は、分析が効率的に行われるように、特定の標的ペプチド（複数を含む）の正確でフォーカスされた分析を行うために質量分析計（例えば、三連四重極質量分析計）を誘導して指示するときに使用されることとしてもよい。
標的ペプチドについての、一般的な、および特定のＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、およびＭＵＣ１のペプチドについての追加の情報は、１、２、３、４、またはそれ以上の各ペプチドの単同位体質量、その前駆物質の荷電状態、前駆物質のｍ／ｚ値、ｍ／ｚ遷移イオン、および各遷移イオンのイオンタイプを含むこととしてもよい。ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質についてのＳＲＭ／ＭＲＭ分析を開発するために使用され得る追加のペプチドの情報が、表１のリストからのＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、およびＭＵＣ１のペプチド、全ての１１（１１）について表２に示される。表２に示されるペプチドについて記載されるこの追加の情報が、他のプロテアーゼまたはプロテアーゼの組み合わせ（例えば、トリプシンおよび／またはＬｙｓ Ｃ）の作用により産生されたものを含む、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来のあらゆる他のペプチドの分析に対して準備され、得られ、および適用されることとしてもよい。
いくつかの実施形態において、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の分析に適するペプチド（例えば、配列番号１から１１に示されるペプチド）は、切断された場合にサブペプチドを生じるであろうペプチド配列内部に追加のタンパク分解部位を含み得る。このようなサブペプチドは、所望のプロテアーゼのタンパク分解切断部位について同定されたペプチドの配列を評価することにより認識できる。一実施形態では、トリプシンペプチドは、トリプシンによるさらなる切断でサブペプチドをもたらし得る追加の内部トリプシン切断部位を含むこととしてもよい。別の実施形態では、トリプシンペプチドは、いずれか１つ、２つ、またはそれ以上のトリプシン、ＧｌｕＣ、ＡｓｐＮ、キモトリプシン、および／またはＬｙｓ Ｃによる切断でサブペプチドの形成をもたらし得る、トリプシン、ＧｌｕＣ、ＡｓｐＮ、キモトリプシン、および／またはＬｙｓ Ｃを含むがこれらに限定されない、プロテアーゼについての内部部位を含むこととしてもよい。別の実施形態では、Ｌｙｓ Ｃペプチドは、いずれか１つ、２つ、またはそれ以上のＧｌｕＣ、ＡｓｐＮ、キモトリプシン、および／またはトリプシンによる切断でサブペプチドの形成をもたらし得る、ＧｌｕＣ、ＡｓｐＮ、キモトリプシン、および／またはトリプシンのような他のプロテアーゼについての内部部位を含むこととしてもよい。このようなサブペプチド、および具体的には、配列番号１から１１に示されるいずれか１またはそれ以上のペプチドのトリプシン、ＧｌｕＣ、ＡｓｐＮ、キモトリプシン、および／またはＬｙｓ Ｃの切断フラグメントが示され、本開示の範囲内であることが理解される。
本明細書に示される実施形態は、表１および２における、１またはそれ以上のペプチドを含む組成物を含み、同位体標識されているが、それ以外は表１および２にみられる１またはそれ以上のペプチドと同じであるペプチドを任意に含むこととしてもよい。いくつかの実施形態において、組成物は、表１および２における、１もしくはそれ以上の、２もしくはそれ以上の、３もしくはそれ以上の、４もしくはそれ以上の、５もしくはそれ以上の、６もしくはそれ以上の、７もしくはそれ以上の、８もしくはそれ以上の、９もしくはそれ以上の、または１１の全てのペプチドを含む。このような組成物は、アミノ酸配列が同位体標識されているが、それ以外は表１および２にみられる１またはそれ以上のペプチドと同じであるペプチドを含む、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を任意に含むこととしてもよい。表１および２に示される、１、２、３、４、５、６、またはそれ以上のペプチドを含む、同位体標識された合成または天然ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が使用される場合、プロテアーゼ処置が、同位体標識されているが、それ以外は表１および２におけるペプチドと同じであるペプチドを放出する。このように同位体標識されている生体または生合成のペプチドは、例えば、プログラムされた細胞溶解物においてまたは同位体標識されているアミノ酸を用いる組織培養において調製されることとしてもよい。それぞれの同位体標識されたペプチドは、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈ、またはこれらの組み合わせからなる群から独立して選択される、１またはそれ以上のアイソトープで標識されることとしてもよい。ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来のペプチドを含む組成物は、同位体標識されているかどうかに関わらず、そのタンパク質由来の全てのペプチドを含む必要はない（例えば、完全なセットのトリプシンペプチド）。いくつかの実施形態において、組成物は、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来の組み合わせにおける全てのペプチド、および、特に、表１および２に表わされる全てのペプチドを含まない。ペプチドを含む組成物は、乾燥もしくは凍結乾燥した材料、液体（例えば、水溶性の）溶液もしくは懸濁液、アレイ、またはブロットの形態であることとしてもよい。
一実施形態では、特定のＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、およびＭＵＣ１のペプチドについての追加の情報は、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のＬｙｓ Ｃタンパク質分解がもたらすペプチドについての、１もしくはそれ以上の、２もしくはそれ以上の、または３もしくはそれ以上の、各ペプチドの単同位体質量、その前駆物質の荷電状態、前駆物質のｍ／ｚ値、ｍ／ｚ遷移イオン、および各遷移イオンのイオンタイプを含む。
別の実施形態では、特定のＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、およびＭＵＣ１のペプチドについての追加の情報は、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のトリプシンタンパク質分解がもたらすペプチドについての、１もしくはそれ以上の、２もしくはそれ以上の、または３もしくはそれ以上の、各ペプチドの単同位体質量、その前駆物質の荷電状態、前駆物質のｍ／ｚ値、ｍ／ｚ遷移イオン、および各遷移イオンのイオンタイプを含む。
さらに別の実施形態では、特定のＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、およびＭＵＣ１のペプチドについての追加の情報は、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のトリプシンおよび／またはＬｙｓ Ｃのタンパク質分解がもたらすペプチドについての、１もしくはそれ以上の、２もしくはそれ以上の、または３もしくはそれ以上の、各ペプチドの単同位体質量、その前駆物質の荷電状態、前駆物質のｍ／ｚ値、ｍ／ｚ遷移イオン、および各遷移イオンのイオンタイプを含む。一実施形態では、関連する追加の情報に沿って、それぞれのＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１由来の単一のトリプシンのおよび／またはＬｙｓ Ｃのタンパク分解ペプチドが、診断測定において使用される。よって、例えば、配列番号２、３、５、６、８、および／または１１のペプチド、並びにこれらのペプチドについての追加の情報（表３を参照）が診断分析において使用される。
ある実施形態
本発明のある実施形態は、以下に記載される。
１． 質量分析を用いて、生体試料から調製される、タンパク質消化物における１またはそれ以上の改変されたおよび／または改変されていないＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドの量を検出しおよび／または定量化し、当該サンプルにおける、改変されたまたは改変されていないＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のレベルを算出することを含む、当該生体試料におけるＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のレベルを測定する方法であって、当該量は相対量または絶対量である。
本発明のある実施形態は、以下に記載される。
１． 質量分析を用いて、生体試料から調製される、タンパク質消化物における１またはそれ以上の改変されたおよび／または改変されていないＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドの量を検出しおよび／または定量化し、当該サンプルにおける、改変されたまたは改変されていないＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のレベルを算出することを含む、当該生体試料におけるＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のレベルを測定する方法であって、当該量は相対量または絶対量である。
２． １またはそれ以上の改変されたまたは改変されていないＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチの量を検出および／または定量化する前に、当該タンパク質消化物を分画する工程をさらに含む、実施形態１の方法。
３． 当該分画する工程は、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィーからなる群から選択される、実施形態２の方法。
４． 当該生体試料の当該タンパク質消化物は、Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）プロトコールにより調製される、実施形態１から３のいずれかの方法。
５． 当該タンパク質消化物はプロテアーゼ消化物を含む、実施形態１から３のいずれかの方法。
６． 当該タンパク質消化物は、トリプシンおよび／またはｌｙｓ Ｃ消化物を含む、実施形態５の方法。
７． 当該質量分析は、タンデム質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極型質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、ＭＡＬＤＩ質量分析、および／または飛行時間型質量分析を含む、実施形態１から６のいずれかの方法。
８． 使用される質量分析のモードは、選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、および／もしくは複数の選択的反応モニタリング（ｍＳＲＭ）、またはこれらのあらゆる組み合わせである、実施形態７の方法。
９． ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および／または配列番号１１として示されるアミノ酸配列を含む、実施形態１から８のいずれかの方法。
１０． 当該生体試料は、血液サンプル、尿サンプル、血清サンプル、腹水サンプル、喀痰サンプル、リンパ液、唾液サンプル、細胞、または，固形組織である、実施形態１から９のいずれかの方法。
１１． 当該生体試料はホルマリン固定された組織である、実施形態１から１０のいずれかの方法。
１２． 当該生体試料はパラフィン包埋組織である、実施形態１から１１のいずれかの方法。
１３． 当該生体試料は腫瘍から得られた組織である、実施形態１から１２のいずれかの方法。
１４． 当該腫瘍は原発腫瘍である、実施形態１３の方法。
１５． 当該腫瘍は続発性腫瘍である、実施形態１３の方法。
１６． 改変されたおよび／または改変されていないＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドを定量化することをさらに含む、実施形態１から１５のいずれかの方法。
１７（ａ）． ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドを定量化することは、１つの生体試料における、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の約８から約４５のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む、１またはそれ以上のＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、およびＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドの量を、異なるおよび別個のサンプルまたは生体試料における、同じＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドの量と比較することを含む、実施形態１から１６のいずれかの方法。
１７（ｂ）． ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドを定量化することは、１つの生体試料における、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１に示される、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の約８から約４５のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む１またはそれ以上のＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、およびＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドの量を、異なるおよび別個の生体試料における、同じＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドの量と比較することを含む、実施形態１から１６のいずれかの方法。
１８． １またはそれ以上のＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドを定量化することは、既知量の添加された内部標準ペプチドとの比較により、生体試料におけるそれぞれのＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドの量を測定することを含み、生体試料におけるそれぞれのＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドが、同じアミノ酸配列を有する添加された内部標準ペプチドと比較される、実施形態１７（ａ）または１７（ｂ）の方法。
１９． 当該内部標準ペプチドは同位体標識されたペプチドである、実施形態１８の方法。
２０． 同位体標識されている内部標準ペプチドは、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈ、またはこれらの組み合わせから選択される１つまたはそれ以上の重安定同位体を含む、実施形態１９の方法。
２１． タンパク質消化物における、１またはそれ以上の改変されたまたは改変されていないＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドの量を検出しおよび／または定量化することは、改変されたおよび／または改変されていないＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の存在、および患者または対象における癌（例えば、ＡＤＣおよび／またはＳＳＣ）との関連性を示す、実施形態１から２０のいずれかの方法。
２２． １またはそれ以上の改変されたおよび／または改変されていないＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドの量、または当該ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の量を当該検出しおよび／または定量化することの結果を、癌の診断ステージ／悪性度／状態と関連付けることをさらに含む、実施形態２１の方法。
２３． １またはそれ以上の改変されたまたは改変されていないＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドの量、または当該ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の量を当該検出しおよび／または定量化することの結果を、癌の診断ステージ／悪性度／状態と関連付けることは、癌の診断ステージ／悪性度／状態についての追加の情報を提供するために、複合的なフォーマットで他のタンパク質または他のタンパク質由来のペプチドの量を検出しおよび／または定量化することと組み合わせられる、実施形態２２の方法。
２４． １またはそれ以上のＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／もしくはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドの存在、不存在、もしくは量、または、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／もしくはＭＵＣ１のタンパク質の量に基づいて、当該生体試料が得られた患者または対象のために、処置を選択することをさらに含む、実施形態１から２３のいずれか１つの方法。
２５． 当該生体試料が得られた患者または対象に、治療上効果のある量の治療薬を投与することをさらに含み、治療薬および／または投与される治療薬の量は、１またはそれ以上の改変されたまたは改変されていないＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドの量、またはＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の量に基づく、実施形態１から２４のいずれかの方法。
２６． 処置または治療薬は、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質を発現している癌細胞に向けられている、実施形態２４または２５の方法。
２７． 当該治療薬は、ペメトレキセドおよびベバシズマブから選択される、実施形態２６の方法。
２８． 生体試料は、Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）プロトコールおよび試薬を使用する、１またはそれ以上の改変されたまたは改変されていないＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドの量を定量化するために処理されたホルマリン固定された腫瘍組織である、実施形態１から２７のいずれかの方法。
２９． 当該１またはそれ以上の改変されたまたは改変されていないＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドは、表１における１またはそれ以上のペプチドである、実施形態１から２８のいずれかの方法。
３０． １もしくはそれ以上の、２もしくはそれ以上の、３もしくはそれ以上の、４もしくはそれ以上の、５もしくはそれ以上の、６もしくはそれ以上の、７もしくはそれ以上の、８もしくはそれ以上の、９もしくはそれ以上の、または１０もしくはそれ以上の、表１におけるペプチドおよび／またはこれらに対する抗体を含む、組成物。
３１． １もしくはそれ以上の、２もしくはそれ以上の、３もしくはそれ以上の、４もしくはそれ以上の、５もしくはそれ以上の、６もしくはそれ以上の、７もしくはそれ以上の、８もしくはそれ以上の、９もしくはそれ以上の、または１０もしくはそれ以上の、表２におけるペプチド、またはこれらに対する抗体を含む、実施形態３０の組成物。
例示的なＳＲＭ／ＭＲＭ分析方法
１． １）ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質について、質量分析に基づくＳＲＭ／ＭＲＭ分析のために使用され得る、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来の候補ペプチドを識別するために、２）ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来の標的ペプチドについての、個々のＳＲＭ／ＭＲＭ分析または複数のＳＲＭ／ＭＲＭ分析を開発するために、３）癌の診断および／または最適な治療を選択するために定量分析を適用するために、以下に記載される方法が使用された。ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質についてのＳＲＭ／ＭＲＭ候補フラグメントペプチドの同定。
ａ．タンパク質を消化するために、１つのプロテアーゼまたは複数のプロテアーゼを用いて、（トリプシンを含むこととしてもよく、または含まないこととしてもよい）、ホルマリン固定された生体試料由来のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）タンパク質溶解物を調製。
ｂ．イオントラップタンデム質量分析計でＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物における全てのタンパク質フラグメントを分析し、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来の全てのフラグメントペプチドを同定し、個々のフラグメントペプチドは、リン酸化またはグリコシル化のようなあらゆるペプチド改変を含まない。
ｃ．イオントラップタンデム質量分析計でＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物における全てのタンパク質フラグメントを分析し、例えば、リン酸化またはグリコシル化残基のようなペプチド改変を保有する、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来の全てのフラグメントペプチドを同定する。
ｄ．全ての、全長ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質から特定の消化方法により生成される全てのぺプチドが、潜在的に測定され得るが、ＳＲＭ／ＭＲＭ分析の開発のために使用される好ましいペプチドは、ホルマリン固定された生体試料から調製される、複合的なＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）タンパク質溶解物において、直接、質量分析により同定されるものである。
ｅ．ホルマリン固定された生体試料由来のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物を分析するときに、質量分析計でイオン化し、よって検出され得る患者または対象組織における、特異的に改変された（リン酸化、グリコシル化等）ペプチドが、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のペプチド改変を分析するための候補ペプチドとして同定される。
１． １）ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質について、質量分析に基づくＳＲＭ／ＭＲＭ分析のために使用され得る、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来の候補ペプチドを識別するために、２）ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来の標的ペプチドについての、個々のＳＲＭ／ＭＲＭ分析または複数のＳＲＭ／ＭＲＭ分析を開発するために、３）癌の診断および／または最適な治療を選択するために定量分析を適用するために、以下に記載される方法が使用された。ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質についてのＳＲＭ／ＭＲＭ候補フラグメントペプチドの同定。
ａ．タンパク質を消化するために、１つのプロテアーゼまたは複数のプロテアーゼを用いて、（トリプシンを含むこととしてもよく、または含まないこととしてもよい）、ホルマリン固定された生体試料由来のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）タンパク質溶解物を調製。
ｂ．イオントラップタンデム質量分析計でＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物における全てのタンパク質フラグメントを分析し、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来の全てのフラグメントペプチドを同定し、個々のフラグメントペプチドは、リン酸化またはグリコシル化のようなあらゆるペプチド改変を含まない。
ｃ．イオントラップタンデム質量分析計でＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物における全てのタンパク質フラグメントを分析し、例えば、リン酸化またはグリコシル化残基のようなペプチド改変を保有する、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来の全てのフラグメントペプチドを同定する。
ｄ．全ての、全長ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質から特定の消化方法により生成される全てのぺプチドが、潜在的に測定され得るが、ＳＲＭ／ＭＲＭ分析の開発のために使用される好ましいペプチドは、ホルマリン固定された生体試料から調製される、複合的なＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）タンパク質溶解物において、直接、質量分析により同定されるものである。
ｅ．ホルマリン固定された生体試料由来のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物を分析するときに、質量分析計でイオン化し、よって検出され得る患者または対象組織における、特異的に改変された（リン酸化、グリコシル化等）ペプチドが、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のペプチド改変を分析するための候補ペプチドとして同定される。
２． ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来のフラグメントペプチドの質量分光分析
ａ．Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物で識別される個々のフラグメントペプチドについての三連四重極質量分析計でのＳＲＭ／ＭＲＭ分析が、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来のペプチドに適用される。
ｉ． ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない、最適なクロマトグラフィー条件のためのフラグメントペプチドについての最適な保持時間を測定する。
ｉｉ． 各ペプチドについてのＳＲＭ／ＭＲＭ分析を開発するために、ペプチドの単同位体質量、各ペプチドの前駆物質の荷電状態、各ペプチドについての前駆物質ｍ／ｚ値、各ペプチドについてのｍ／ｚ遷移イオン、および各フラグメントペプチドについての各遷移イオンのイオンタイプを測定する。
ｉｉｉ． ＳＲＭ／ＭＲＭ分析は、三連四重極質量分析計で（ｉ）および（ｉｉ）からの情報を用いて、その後行われ得、各ペプチドは、固有のＳＲＭ／ＭＲＭ分析が三連四重極質量分析計で行われたと精密に定義する、固有のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピークおよび特性を有する。
ｂ．ＳＲＭ／ＭＲＭ質量分光分析からの固有のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積の関数として検出される、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドの量が、特定のタンパク質溶解物におけるＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の相対的および絶対的な量の両方を示すことができるようにＳＲＭ／ＭＲＭ分析を行う。
ｉ． 相対的な定量が以下により達成されることとしてもよい。
１． １つのホルマリン固定された生体試料由来のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物で検出された所与のＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のペプチドからのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積を、少なくとも第２の、第３の、第４の、またはそれ以上のホルマリン固定された生体試料由来の少なくとも第２の、第３の、第４の、またはそれ以上のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物における同じＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のフラグメントペプチドの同じＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積と比較することにより、増加したまたは減少したＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の存在を測定すること。
２． １つのホルマリン固定された生体試料由来のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物において検出された所与のＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、およびＭＵＣ１のペプチドからのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積を、異なるおよび別個の生物源由来の他のサンプルにおける他のタンパク質由来のフラグメントペプチドから発生されたＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積と比較することにより、増加したまたは減少したＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の存在を測定し、ペプチドフラグメントについての２つのサンプル間のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積の比較は、各サンプルで分析されたタンパク質の量に対して正規化される。
３． 種々の細胞条件下で、それらの発現のレベルが変化しない他のタンパク質のレベルに対して、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のレベルの変化を正規化するために、所与のＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、およびＭＵＣ１のペプチドについてのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積を、ホルマリン固定された生体試料からの同じＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物内の異なるタンパク質由来の他のフラグメントペプチドからのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積と比較することにより、増加したまたは減少したＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の存在を測定すること。
４． これらの分析は、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の改変されていないフラグメントペプチドおよび改変されたフラグメントペプチドの両方に適用され得、改変は、リン酸化および／またはグリコシル化を含むがこれらに限定されず、改変されたペプチドの相対的なレベルは、改変されていないペプチドの相対量を測定することと同じ態様で測定される。
ｉｉ． 所与のペプチドの絶対的な定量が、個々の生体試料におけるＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来の所与のフラグメントペプチドについてのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積を、生体試料由来のタンパク質溶解物内に添加されたフラグメントペプチド内部標準のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積と比較することにより達成されることとしてもよい。
１． 内部標準は、調べられるＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来のフラグメントペプチドの標識された合成バージョンである。この標準物質は、既知量でサンプルに添加され、ＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積が、生体試料におけるフラグメントペプチド内部標準と天然フラグメントペプチドの両方について別個に測定され得、続いて両方のピーク面積を比較する。
２． これは、改変されていないフラグメントペプチドおよび改変されたフラグメントペプチドに適用され得、改変は、リン酸化および／またはグリコシル化を含むがこれらに限定されず、改変されたペプチドの絶対的なレベルは、改変されていないペプチドの絶対量を測定することと同じ態様で測定され得る。
ａ．Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物で識別される個々のフラグメントペプチドについての三連四重極質量分析計でのＳＲＭ／ＭＲＭ分析が、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来のペプチドに適用される。
ｉ． ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない、最適なクロマトグラフィー条件のためのフラグメントペプチドについての最適な保持時間を測定する。
ｉｉ． 各ペプチドについてのＳＲＭ／ＭＲＭ分析を開発するために、ペプチドの単同位体質量、各ペプチドの前駆物質の荷電状態、各ペプチドについての前駆物質ｍ／ｚ値、各ペプチドについてのｍ／ｚ遷移イオン、および各フラグメントペプチドについての各遷移イオンのイオンタイプを測定する。
ｉｉｉ． ＳＲＭ／ＭＲＭ分析は、三連四重極質量分析計で（ｉ）および（ｉｉ）からの情報を用いて、その後行われ得、各ペプチドは、固有のＳＲＭ／ＭＲＭ分析が三連四重極質量分析計で行われたと精密に定義する、固有のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピークおよび特性を有する。
ｂ．ＳＲＭ／ＭＲＭ質量分光分析からの固有のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積の関数として検出される、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドの量が、特定のタンパク質溶解物におけるＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の相対的および絶対的な量の両方を示すことができるようにＳＲＭ／ＭＲＭ分析を行う。
ｉ． 相対的な定量が以下により達成されることとしてもよい。
１． １つのホルマリン固定された生体試料由来のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物で検出された所与のＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のペプチドからのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積を、少なくとも第２の、第３の、第４の、またはそれ以上のホルマリン固定された生体試料由来の少なくとも第２の、第３の、第４の、またはそれ以上のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物における同じＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のフラグメントペプチドの同じＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積と比較することにより、増加したまたは減少したＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の存在を測定すること。
２． １つのホルマリン固定された生体試料由来のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物において検出された所与のＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、およびＭＵＣ１のペプチドからのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積を、異なるおよび別個の生物源由来の他のサンプルにおける他のタンパク質由来のフラグメントペプチドから発生されたＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積と比較することにより、増加したまたは減少したＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の存在を測定し、ペプチドフラグメントについての２つのサンプル間のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積の比較は、各サンプルで分析されたタンパク質の量に対して正規化される。
３． 種々の細胞条件下で、それらの発現のレベルが変化しない他のタンパク質のレベルに対して、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のレベルの変化を正規化するために、所与のＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、およびＭＵＣ１のペプチドについてのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積を、ホルマリン固定された生体試料からの同じＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物内の異なるタンパク質由来の他のフラグメントペプチドからのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積と比較することにより、増加したまたは減少したＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の存在を測定すること。
４． これらの分析は、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の改変されていないフラグメントペプチドおよび改変されたフラグメントペプチドの両方に適用され得、改変は、リン酸化および／またはグリコシル化を含むがこれらに限定されず、改変されたペプチドの相対的なレベルは、改変されていないペプチドの相対量を測定することと同じ態様で測定される。
ｉｉ． 所与のペプチドの絶対的な定量が、個々の生体試料におけるＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来の所与のフラグメントペプチドについてのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積を、生体試料由来のタンパク質溶解物内に添加されたフラグメントペプチド内部標準のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積と比較することにより達成されることとしてもよい。
１． 内部標準は、調べられるＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来のフラグメントペプチドの標識された合成バージョンである。この標準物質は、既知量でサンプルに添加され、ＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積が、生体試料におけるフラグメントペプチド内部標準と天然フラグメントペプチドの両方について別個に測定され得、続いて両方のピーク面積を比較する。
２． これは、改変されていないフラグメントペプチドおよび改変されたフラグメントペプチドに適用され得、改変は、リン酸化および／またはグリコシル化を含むがこれらに限定されず、改変されたペプチドの絶対的なレベルは、改変されていないペプチドの絶対量を測定することと同じ態様で測定され得る。
３． 癌の診断および処置に対してフラグメントペプチド定量を適用する。
ａ．ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドレベルの相対的および／または絶対的な定量を行い、患者または対象の腫瘍組織における癌のステージ／悪性度／状態に対する、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、およびＭＵＣ１のタンパク質発現の、癌の分野で十分に理解される、あらかじめ測定された関連性が確認されることを示す。
ｂ．ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドレベルの相対的および／または絶対的な定量を行い、異なる処置ストラテジーからの臨床成績との関連付けを示し、この関連付けはすでに当該分野で示されており、または患者もしくは対象のコホートにわたる関連付けの研究およびこれらの患者もしくは対象からの組織により将来的に示され得る。いったん、あらかじめ確立された関連付け、または将来得られる関連付けのいずれかがこの分析により確認され、その後、当該分析は、最適な処置ストラテジーを決定するために使用され得る。
ａ．ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドレベルの相対的および／または絶対的な定量を行い、患者または対象の腫瘍組織における癌のステージ／悪性度／状態に対する、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、およびＭＵＣ１のタンパク質発現の、癌の分野で十分に理解される、あらかじめ測定された関連性が確認されることを示す。
ｂ．ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドレベルの相対的および／または絶対的な定量を行い、異なる処置ストラテジーからの臨床成績との関連付けを示し、この関連付けはすでに当該分野で示されており、または患者もしくは対象のコホートにわたる関連付けの研究およびこれらの患者もしくは対象からの組織により将来的に示され得る。いったん、あらかじめ確立された関連付け、または将来得られる関連付けのいずれかがこの分析により確認され、その後、当該分析は、最適な処置ストラテジーを決定するために使用され得る。
ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来のフラグメントペプチドについての質量分光分析。
ａ．タンパク質溶解物における、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の相対的および／または絶対的な量を測定するために検出されるＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドの量を測定するためのＳＲＭ／ＭＲＭ分析。
ｉ． 相対的な定量が以下により達成されることとしてもよい。
１． １つのホルマリン固定された生体試料からのＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物で検出された所与のＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質ペプチドからのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積を、少なくとも第２の、第３の、第４の、またはそれ以上のホルマリン固定された生体試料由来の少なくとも第２の、第３の、第４の、またはそれ以上のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物における同じＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドの同じＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積と比較することにより、増加したまたは減少したＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の存在を測定すること。
２． １つのホルマリン固定された生体試料由来のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物において検出された所与のＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、およびＭＵＣ１のペプチドからのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積を、異なるおよび別個の生物源由来の他のサンプルにおける他のタンパク質由来のフラグメントペプチドから発生されたＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積と比較することにより、増加したまたは減少したＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の存在を測定し、ペプチドフラグメントについての２つのサンプル間のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積の比較は、各サンプルで分析されたタンパク質の量に対して正規化される。
３． 種々の細胞条件下で、それらの発現のレベルが変化しない他のタンパク質のレベルに対して、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のレベルの変化を正規化するために、所与のＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、およびＭＵＣ１のタンパク質ペプチドについてのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積を、ホルマリン固定された生体試料からの同じＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物内の異なるタンパク質由来の他のフラグメントペプチドからのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積と比較することによる、増加したまたは減少したＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の存在を測定すること。
４． これらの分析は、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の改変されていないフラグメントペプチドおよび改変されたフラグメントペプチドの両方に適用され得、改変は、リン酸化および／またはグリコシル化を含むがこれらに限定されず、改変されたペプチドの相対的なレベルは、改変されていないペプチドの相対量を測定することと同じ態様で測定される。
ｉｉ． 所与のペプチドまたはそれが由来するタンパク質の絶対的な定量が、個々の生体試料におけるＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来の所与のフラグメントペプチドについてのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積を、生体試料由来のタンパク質溶解物内に添加されたフラグメントペプチド内部標準のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積と比較することにより達成されることとしてもよい。
ａ．タンパク質溶解物における、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の相対的および／または絶対的な量を測定するために検出されるＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドの量を測定するためのＳＲＭ／ＭＲＭ分析。
ｉ． 相対的な定量が以下により達成されることとしてもよい。
１． １つのホルマリン固定された生体試料からのＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物で検出された所与のＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質ペプチドからのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積を、少なくとも第２の、第３の、第４の、またはそれ以上のホルマリン固定された生体試料由来の少なくとも第２の、第３の、第４の、またはそれ以上のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物における同じＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドの同じＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積と比較することにより、増加したまたは減少したＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の存在を測定すること。
２． １つのホルマリン固定された生体試料由来のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物において検出された所与のＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、およびＭＵＣ１のペプチドからのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積を、異なるおよび別個の生物源由来の他のサンプルにおける他のタンパク質由来のフラグメントペプチドから発生されたＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積と比較することにより、増加したまたは減少したＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の存在を測定し、ペプチドフラグメントについての２つのサンプル間のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積の比較は、各サンプルで分析されたタンパク質の量に対して正規化される。
３． 種々の細胞条件下で、それらの発現のレベルが変化しない他のタンパク質のレベルに対して、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のレベルの変化を正規化するために、所与のＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、およびＭＵＣ１のタンパク質ペプチドについてのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積を、ホルマリン固定された生体試料からの同じＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）溶解物内の異なるタンパク質由来の他のフラグメントペプチドからのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積と比較することによる、増加したまたは減少したＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の存在を測定すること。
４． これらの分析は、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の改変されていないフラグメントペプチドおよび改変されたフラグメントペプチドの両方に適用され得、改変は、リン酸化および／またはグリコシル化を含むがこれらに限定されず、改変されたペプチドの相対的なレベルは、改変されていないペプチドの相対量を測定することと同じ態様で測定される。
ｉｉ． 所与のペプチドまたはそれが由来するタンパク質の絶対的な定量が、個々の生体試料におけるＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質由来の所与のフラグメントペプチドについてのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積を、生体試料由来のタンパク質溶解物内に添加されたフラグメントペプチド内部標準のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積と比較することにより達成されることとしてもよい。
内部標準は、調べられるＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質（または、タンパク質分解で放出されるフラグメントペプチドの標識された合成バージョンを含むタンパク質、もしくはポリペプチド）由来のフラグメントペプチドの標識された合成バージョンであり得る。この標準物質は、既知量でサンプルに添加され、ＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャのピーク面積が、生体試料におけるフラグメントペプチド内部標準と天然フラグメントペプチドの両方について別個に測定され得、続いて両方のピーク面積を比較する。
これは、改変されていないフラグメントペプチドおよび改変されたフラグメントペプチドに適用され得、改変は、リン酸化および／またはグリコシル化を含むがこれらに限定されず、改変されたペプチドの絶対的なレベルは、改変されていないペプチドの絶対的なレベルを測定することと同じ態様で測定され得る。
ホルマリン固定された患者由来または対象由来の組織の分析に基づく、組織におけるＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、およびＭＵＣ１のタンパク質レベルの評価は、特定の各患者または対象についての、診断、予後、および治療に関する情報を提供し得る。本明細書に記載されるのは、質量分析を用いて、生体試料から調製されたタンパク質消化物における、１またはそれ以上の改変されたまたは改変されていないＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、およびＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドの量を検出しおよび／または定量化すること、当該サンプルにおいて、改変されたまたは改変されていないＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のレベルを算出することを含む、生体試料における、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のレベルを測定するための方法であって、当該レベルは相対的レベルまたは絶対的レベルである。関連する実施形態において、１またはそれ以上のＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、およびＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドを定量化することは、既知量の添加された内部標準ペプチドに対する比較により、生体試料におけるＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、およびＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドのそれぞれの量を測定することを含み、生体試料におけるそれぞれのＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、およびＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドは、同じアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較される。いくつかの実施形態において、内部標準は、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈ、またはこれらの組み合わせから選択される１またはそれ以上の重安定同位体を含む、同位体標識されている内部標準ペプチドである。
本明細書に記載される、生体試料においてＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質（または、その代用となるフラグメントペプチド）のレベルを測定する方法は、患者または対象における癌の診断の指標として使用されることとしてもよい。一実施形態では、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のレベルの測定からの結果は、組織でみられるＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のレベルを、正常なおよび／または癌のもしくは前癌組織でみられるＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のレベルと関連付ける（例えば、比較する）ことにより、癌の診断ステージ／悪性度／状態を測定するために使用されることとしてもよい。
ホルマリン固定された患者組織における特定のタンパク質のレベルを検出するための使用における唯一の現在の方法は、免疫組織化学（ＩＨＣ）である。この方法は、患者の腫瘍組織サンプルからの単一の組織切片で一度に１つのタンパク質のみを分析する。そのため、複数のタンパク質を分析するために、複数の組織切片が、多くの時間と労力をかけて調べられなければならない。ＩＨＣは、標的タンパク質の存在を検出するために抗体を用い、タンパク質に対する抗体の非特異的な結合の可能性があるために、あらゆるＩＨＣ実験においてシグナルのバックグラウンドの大きく内在する可能性がある。また、ＩＨＣは、せいぜい半定量のみである。これらの問題により、ＩＨＣは、複数のタンパク質の同時の客観的な定量分析を提供していない。本実施形態は、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の発現についての非常により有用なデータを提供する一方、患者組織サンプルの単一の切片を利用する、１００％の分析特異性で、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の同時の客観的な定量を提供することができ、多大な時間とお金を節約する。
この複合的なＳＲＭ／ＭＲＭ分析は、また、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、およびｃＭｅｔのような、薬物標的のタンパク質を含む、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質以外の、他の追加のタンパク質の同時の分析を含み得る。このことは、追加のタンパク質の分析が、ＮＳＣＬＣタイプ（ＡＤＣまたはＳＣＣ）の測定を可能にし、よって、対象がペメトレキセドまたはベバシズマブのいずれを受けるべきかの指標を提供するだけでなく、ペメトレキセドおよびベバシズマブと組み合わせて使用されるどの追加の薬物が、ＮＳＣＬＣを治療するために有用であり得るのかをも示すので有用である。これらの追加の薬物標的タンパク質の分析に基づく追加の薬物の例は、ＥＧＦＲレセプターを標的とするアービタックス、ＩＧＦ‐１Ｒを標的とするフィギツムマブ、およびｃ‐Ｍｅｔおよび血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ‐２）を標的とするフォレチニブを含む。
核酸およびタンパク質の両方が、同じＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）の生体分子の調製物から分析され得るので、タンパク質が分析される同じサンプルにおける核酸から、疾病の診断および薬物治療の決定についての追加の情報を生成することが可能となる。例えば、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質が、増加したレベルで、ある細胞により発現される場合、ＳＲＭにより分析される際、データは、細胞の状態についての情報を提供し得、およびそれらの未制御な増殖、潜在的薬物耐性、および癌の発達の可能性が得られ得る。同時に、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、およびＭＵＣ１の遺伝子、並びに／または核酸およびそれらがコードするタンパク質の状態についての情報（例えば、ｍＲＮＡ分子およびそれらの発現レベルまたはスプライスのバリエーション）が、同じ生体分子の調製物内に存在する核酸から得られ得る。一実施形態では、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／もしくはＭＵＣ１のタンパク質、並びに／または１、２、３、４、もしくはそれ以上の追加のタンパク質についての情報が、これらのタンパク質をコードする核酸を試験することにより評価されることとしてもよい。これらの核酸は、例えば、１もしくはそれ以上の、２もしくはそれ以上の、または３もしくはそれ以上のシーケンス法、ポリメラーゼ連鎖反応方法、制限断片多型分析、欠失の識別、挿入、並びに／または、単一塩基対の多型、移行、塩基転換、もしくはこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、突然変異の存在の測定により試験され得る。
実施例１ 腺癌および扁平上皮癌で観察されるＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＭＵＣ１、ＫＲＴ５およびＴＰ６３のレベル
腺癌と診断された４人の患者および扁平上皮癌と診断された４人の患者のホルマリン固定された肺組織標本が得られた。各サンプルは、米国特許第７，４７３，５３２号で提供されるＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅプロトコールを用いて、トリプシンによりタンパク分解的に消化された。得られた溶解物は、同位体標識されているが、それ以外はその強度が質量分析計において測定されたペプチドと化学的に同じである、内部標準を用いて、質量分光分析に供された。ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＭＵＣ１、ＫＲＴ５およびＴＰ６３についての溶解物の分析から得られたデータは、図１におけるヒストグラムに示される。ヒストグラムの１から４（１〜４）は、腺癌を有する患者の組織サンプルから得られたデータを示し、ヒストグラムの５から８（５〜８）は、扁平上皮癌を有する患者から得られたデータを示す。各セットのヒストグラムは、左から右にかけて、タンパク質のアトモル／マイクログラム（ａｍｏｌ／μｇ）で示されるＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＭＵＣ１、ＫＲＴ５およびＴＰ６３の量を示す。また、データは、表４に数値的に表される。
腺癌と診断された４人の患者および扁平上皮癌と診断された４人の患者のホルマリン固定された肺組織標本が得られた。各サンプルは、米国特許第７，４７３，５３２号で提供されるＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅプロトコールを用いて、トリプシンによりタンパク分解的に消化された。得られた溶解物は、同位体標識されているが、それ以外はその強度が質量分析計において測定されたペプチドと化学的に同じである、内部標準を用いて、質量分光分析に供された。ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＭＵＣ１、ＫＲＴ５およびＴＰ６３についての溶解物の分析から得られたデータは、図１におけるヒストグラムに示される。ヒストグラムの１から４（１〜４）は、腺癌を有する患者の組織サンプルから得られたデータを示し、ヒストグラムの５から８（５〜８）は、扁平上皮癌を有する患者から得られたデータを示す。各セットのヒストグラムは、左から右にかけて、タンパク質のアトモル／マイクログラム（ａｍｏｌ／μｇ）で示されるＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＭＵＣ１、ＫＲＴ５およびＴＰ６３の量を示す。また、データは、表４に数値的に表される。
上記記載ならびに方法および組成物の例示的な実施形態は、本開示の範囲の説明である。当業者にとって明らかである変形のため、しかしながら、本開示は、上述される具体的な実施形態に限定されることを意図しない。
Claims (18)
- 生体試料におけるＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のレベルを測定する方法であって、
質量分析を用いて前記生体試料から調製された、タンパク質消化物における、１またはそれ以上の改変されたおよび／または改変されていないＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドの量を検出しおよび／または定量化し、
前記試料における改変されたまたは改変されていないＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３および／またはＭＵＣ１のタンパク質の前記レベルを算出することを含み、
前記量は、相対量または絶対量である、方法。 - １またはそれ以上の改変されたまたは改変されていないＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドの前記量を検出しおよび／または定量化する前に、前記タンパク質消化物を分画する工程をさらに含む、請求項１の方法。
- 前記生体試料の前記タンパク質消化物は、Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）のプロトコールにより調製される、請求項１の方法。
- 前記タンパク質消化物は、プロテアーゼ消化物を含む、請求項１の方法。
- 前記質量分析は、タンデム質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極型質量分析、ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量分析、ＭＡＬＤＩ質量分析、および／または飛行時間型質量分析を含む、請求項１の方法。
- 前記ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および／または配列番号１１として示すアミノ酸配列を含む、請求項１から５のいずれかの方法。
- 前記生体試料は、血液サンプル、尿サンプル、血清サンプル、腹水サンプル、喀痰サンプル、リンパ液、唾液サンプル、細胞、または固形組織である、請求項１から５のいずれかの方法。
- 改変されたおよび／または改変されていないＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドを定量化することをさらに含む、請求項１から５のいずれかの方法。
- 前記ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドを定量化することは、１つの生体試料における、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１に示される、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の約８から約４５のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む、１またはそれ以上のＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、およびＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドの量を、異なるおよび別個の生体試料における、同じＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドの前記量と比較することを含む、請求項８の方法。
- １またはそれ以上のＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドを定量化することは、既知量の添加された内部標準ペプチドとの比較により、生体試料における各前記ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドの前記量を測定することを含み、
前記生体試料における、各前記ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドは、同じアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較される、請求項９の方法。 - 前記内部標準ペプチドは、同位体標識されたペプチドである、請求項１０の方法。
- 前記タンパク質消化物において、１またはそれ以上の改変されたまたは改変されていないＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドの前記量を検出しおよび／または定量化することは、改変されたまたは改変されていないＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質の存在、および患者または対象における癌との関連性を示す、請求項１から５のいずれかの方法。
- １またはそれ以上の改変されたまたは改変されていないＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／もしくはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドの前記量、または前記ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／もしくはＭＵＣ１のタンパク質の前記量を前記検出しおよび／または定量化した結果を、前記癌の診断ステージ／悪性度／状態と関連付けることをさらに含む、請求項１２の方法。
- １またはそれ以上の改変されたまたは改変されていないＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／もしくはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドの前記量、または前記ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／もしくはＭＵＣ１のタンパク質の前記量を前記検出しおよび／または定量化した前記結果を、前記癌の前記診断ステージ／悪性度／状態と関連付けることは、前記癌の前記診断ステージ／悪性度／状態についての追加の情報を提供するために、複合的なフォーマットで、他のタンパク質または他のタンパク質由来のペプチドの前記量を検出しおよび／または定量化することと組み合わされる、請求項１３の方法。
- 前記生体試料が得られた患者または対象に、治療上効果のある量の治療薬を投与することをさらに含み、
前記治療薬および／または投与された前記治療薬の量は、１またはそれ以上の改変されたまたは改変されていないＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／もしくはＭＵＣ１のタンパク質のフラグメントペプチドの量、またはＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／もしくはＭＵＣ１のタンパク質の前記量に基づく、請求項１３の方法。 - 前記治療または前記治療薬は、ＫＲＴ５、ＫＲＴ７、ナプシンＡ、ＴＴＦ１、ＴＰ６３、および／またはＭＵＣ１のタンパク質を発現する癌細胞に向けられている、請求項１５の方法。
- 前記治療薬は、ペメトレキセドおよびベバシズマブから選択される、請求項１６の方法。
- 表１（配列番号１から配列番号１１）における１もしくはそれ以上の、２もしくはそれ以上の、３もしくはそれ以上の、４もしくはそれ以上の、５もしくはそれ以上の、６もしくはそれ以上の、７もしくはそれ以上の、８もしくはそれ以上の、９もしくはそれ以上の、または１０もしくはそれ以上のペプチドおよび／またはこれらに対する抗体を含む組成物。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201261647602P | 2012-05-16 | 2012-05-16 | |
| US61/647,602 | 2012-05-16 | ||
| PCT/US2013/041424 WO2013173627A1 (en) | 2012-05-16 | 2013-05-16 | Srm/mrm assay for subtyping lung histology |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2015517530A true JP2015517530A (ja) | 2015-06-22 |
| JP6441215B2 JP6441215B2 (ja) | 2018-12-19 |
Family
ID=49584299
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2015512853A Active JP6441215B2 (ja) | 2012-05-16 | 2013-05-16 | 肺組織像を細分類するためのｓｒｍ／ｍｒｍ分析 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US9261506B2 (ja) |
| EP (1) | EP2850229A4 (ja) |
| JP (1) | JP6441215B2 (ja) |
| AU (2) | AU2013262727B2 (ja) |
| CA (1) | CA2873632A1 (ja) |
| IL (1) | IL235688A0 (ja) |
| WO (1) | WO2013173627A1 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6441215B2 (ja) | 2012-05-16 | 2018-12-19 | エクスプレッション、パソロジー、インコーポレイテッドＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ． | 肺組織像を細分類するためのｓｒｍ／ｍｒｍ分析 |
| EP3092495B1 (en) * | 2014-01-06 | 2020-11-25 | Expression Pathology, Inc. | Srm assay for pd-l1 |
| WO2016191368A1 (en) | 2015-05-22 | 2016-12-01 | Expression Pathology, Inc. | Srm/mrm assay for the cyclin-dependent kinase inhibitor 2a (p16) protein |
| EP3334508A4 (en) | 2015-08-13 | 2019-04-10 | Waters Technologies Corporation | NICKEL-COBALT ALLOY MATERIAL DEVICES AND COMPONENTS |
| JP2018531234A (ja) * | 2015-09-24 | 2018-10-25 | エクスプレッション、パソロジー、インコーポレイテッドＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ． | 癌処置のためのＭｅｔタンパク質の定量 |
| US20180172690A1 (en) * | 2016-04-20 | 2018-06-21 | Expression Pathology, Inc. | Method for improved hepatocellular cancer diagnosis |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005510200A (ja) * | 2000-12-22 | 2005-04-21 | ダナ−ファーバー キャンサー インスティテュート，インコーポレイテッド | Ｍｕｃ１による細胞増殖調節方法 |
| US20090215636A1 (en) * | 2005-05-25 | 2009-08-27 | Krizman David B | Diagnosis of diseases and conditions by analysis of histopathologically processed biological samples using liquid tissue preparations |
| US20090263842A1 (en) * | 2006-03-24 | 2009-10-22 | Expression Pathology | Method of assessing the metastatic status of a primary tumor |
| JP2010530980A (ja) * | 2007-06-22 | 2010-09-16 | エクスプレッション、パソロジー、インコーポレイテッド | 固体組織から疾患の分泌バイオマーカーを発見および解析する方法 |
| JP2010249776A (ja) * | 2009-04-20 | 2010-11-04 | Pathology Institute | 癌の組織型を判別するカクテル抗体、判別キット及び判別方法 |
| CA2751835A1 (en) * | 2010-09-05 | 2012-03-05 | University Health Network | Methods and compositions for the classification of non-small cell lung carcinoma |
| JP2012197258A (ja) * | 2011-03-23 | 2012-10-18 | Tohoku Univ | 個別化治療診断のためのマーカータンパク質絶対量の定量方法 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7501286B2 (en) | 2002-08-14 | 2009-03-10 | President And Fellows Of Harvard College | Absolute quantification of proteins and modified forms thereof by multistage mass spectrometry |
| US7632686B2 (en) | 2002-10-03 | 2009-12-15 | Anderson Forschung Group | High sensitivity quantitation of peptides by mass spectrometry |
| DK1601450T3 (da) | 2003-03-10 | 2013-09-08 | Expression Pathology Inc | Flydende vævspræparat ud fra histopatologisk bearbejdede biologiske prøver, væv og celler |
| EP2306198A1 (en) * | 2004-07-02 | 2011-04-06 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Method of analyzing protein structural affinity relationship |
| US8586006B2 (en) * | 2006-08-09 | 2013-11-19 | Institute For Systems Biology | Organ-specific proteins and methods of their use |
| WO2008021115A2 (en) * | 2006-08-14 | 2008-02-21 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Diagnostic tests using gene expression ratios |
| WO2010030598A2 (en) | 2008-09-11 | 2010-03-18 | Dr. Reddy's Laboratories Limited | Pharmaceutical formulations comprising pemetrexed |
| WO2011127219A1 (en) | 2010-04-06 | 2011-10-13 | Caris Life Sciences Luxembourg Holdings | Circulating biomarkers for disease |
| WO2011149943A1 (en) | 2010-05-24 | 2011-12-01 | Ventana Midical Systems, Inc. | Method for differentiation of non-small cellung carcinoma |
| EP3761034A3 (en) * | 2011-01-26 | 2021-02-17 | University of Pittsburgh - Of the Commonwealth System of Higher Education | Urine biomarkers for prediction of recovery after acute kidney injury: proteomics |
| WO2013096862A2 (en) * | 2011-12-21 | 2013-06-27 | Integrated Diagnostics, Inc. | Selected reaction monitoring assays |
| JP6441215B2 (ja) | 2012-05-16 | 2018-12-19 | エクスプレッション、パソロジー、インコーポレイテッドＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ． | 肺組織像を細分類するためのｓｒｍ／ｍｒｍ分析 |
-
2013
- 2013-05-16 JP JP2015512853A patent/JP6441215B2/ja active Active
- 2013-05-16 WO PCT/US2013/041424 patent/WO2013173627A1/en active Application Filing
- 2013-05-16 EP EP13790060.1A patent/EP2850229A4/en not_active Withdrawn
- 2013-05-16 AU AU2013262727A patent/AU2013262727B2/en active Active
- 2013-05-16 CA CA2873632A patent/CA2873632A1/en not_active Abandoned
-
2014
- 2014-11-13 IL IL235688A patent/IL235688A0/en unknown
- 2014-11-17 US US14/543,610 patent/US9261506B2/en active Active
-
2015
- 2015-11-09 US US14/935,586 patent/US9470687B2/en active Active
-
2016
- 2016-07-22 US US15/216,789 patent/US9766246B2/en active Active
-
2017
- 2017-10-27 AU AU2017251859A patent/AU2017251859B2/en active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005510200A (ja) * | 2000-12-22 | 2005-04-21 | ダナ−ファーバー キャンサー インスティテュート，インコーポレイテッド | Ｍｕｃ１による細胞増殖調節方法 |
| US20090215636A1 (en) * | 2005-05-25 | 2009-08-27 | Krizman David B | Diagnosis of diseases and conditions by analysis of histopathologically processed biological samples using liquid tissue preparations |
| US20090263842A1 (en) * | 2006-03-24 | 2009-10-22 | Expression Pathology | Method of assessing the metastatic status of a primary tumor |
| JP2010530980A (ja) * | 2007-06-22 | 2010-09-16 | エクスプレッション、パソロジー、インコーポレイテッド | 固体組織から疾患の分泌バイオマーカーを発見および解析する方法 |
| JP2010249776A (ja) * | 2009-04-20 | 2010-11-04 | Pathology Institute | 癌の組織型を判別するカクテル抗体、判別キット及び判別方法 |
| CA2751835A1 (en) * | 2010-09-05 | 2012-03-05 | University Health Network | Methods and compositions for the classification of non-small cell lung carcinoma |
| JP2012197258A (ja) * | 2011-03-23 | 2012-10-18 | Tohoku Univ | 個別化治療診断のためのマーカータンパク質絶対量の定量方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2873632A1 (en) | 2013-11-21 |
| JP6441215B2 (ja) | 2018-12-19 |
| AU2017251859B2 (en) | 2020-01-30 |
| US20160320398A1 (en) | 2016-11-03 |
| US20160054323A1 (en) | 2016-02-25 |
| EP2850229A4 (en) | 2016-02-17 |
| US20150072895A1 (en) | 2015-03-12 |
| US9261506B2 (en) | 2016-02-16 |
| WO2013173627A1 (en) | 2013-11-21 |
| US9766246B2 (en) | 2017-09-19 |
| US9470687B2 (en) | 2016-10-18 |
| EP2850229A1 (en) | 2015-03-25 |
| IL235688A0 (en) | 2015-01-29 |
| AU2017251859A1 (en) | 2017-11-16 |
| AU2013262727A1 (en) | 2014-11-20 |
| AU2013262727B2 (en) | 2017-07-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6668432B2 (ja) | 癌療法を示すためのｓｒｍアッセイ | |
| JP6670288B2 (ja) | 化学療法標的に対するｓｒｍアッセイ | |
| JP6612414B2 (ja) | Ｐｄ−ｌ１に対するｓｒｍアッセイ | |
| US9766246B2 (en) | SRM/MRM assay for subtyping lung histology |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160308 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170310 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170612 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20171117 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20180219 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20180417 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180517 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20181023 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20181121 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6441215 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |