JP2015516387A - 成長因子の多相性放出のためのシステムおよび方法 - Google Patents

Abstract

治療部位における、少なくとも１つの成長因子の多相性送達のためのシステムは、初期の放出プロファイルにおいて、少なくとも１つの成長因子を放出するための送達賦形剤、および、持続した放出プロファイルにおいて、少なくとも１つの成長因子を放出するためのキャリアを含む。初期の放出プロファイルは、数時間から数日の期間にわたって、少なくとも１つの成長因子を放出し、ここで、成長因子は、最初に、大量に放出され、残りは、次第に減少する量で、放出される。持続した放出プロファイルは、数日から数週間の期間にわたって、少なくとも１つの成長因子を放出し、ここで、成長因子は、そのような期間にわたって、概ね一定量で、放出される。本発明のシステムは、特に、生体インプラントへの応用に適している。また、本発明は、少なくとも１つの成長因子の多相性送達のための方法およびキットを含む。また、本発明は、治療部位において少なくとも１つの成長因子を送達するための単相性および多相性のシステムの両方において、少なくとも１つの成長因子を放出するためのキャリアとして、硫酸カルシウムを含む。

Description

発明の詳細な説明

〔前出願との相互参照〕
この出願は、２０１１年４月１１日に提出された米国出願番号６１／４７４，０４９から、パリ条約に基づいた優先権を請求する、２０１２年４月１１日に提出されたＰＣＴ／ＣＡ２０１２／０５０２３４の一部継続出願である。各々の出願のすべての内容は、参照により本明細書に含まれている。

〔技術分野〕
本発明は、生体物質の放出のためのシステムおよび方法に関連する。特に、本発明は、生体インプラントに結合した成長因子の放出に関連している。さらに特定すると、本発明は、生体移植の成績を改善する、少なくとも１つの成長因子の多相性放出プロファイルを生成するためのシステムおよび方法を提供する。

〔背景技術〕
成長因子（ＧＦｓ）は、特異的な細胞表面受容体とＧＦｓとの相互作用を介して、細胞の成長および／または分化を刺激するペプチドおよびタンパク質である。成長因子は、組織の修復および再生における総合的な役割を行う。そして、ＧＦｓの外用薬は、骨、軟骨、皮膚および粘膜を含む、種々の組織および種々の器官の修復を刺激するため、そして、修復部位における血管形成の刺激をとおして、組織の修復を向上させるために使用され得る。

哺乳類の、分泌された成長分化因子の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）スーパーファミリーは、３０を超えるメンバーを有する。これらの二量体のタンパク質は、保存された７つのシスチンノットに基づく構造によって、特徴づけられる。これらは、多くの細胞型の分裂、分化および移動を制御し、形態形成、器官形成、組織維持および損傷治癒において重要な役割を有する。成長因子のＴＧＦβスーパーファミリーは、形質転換成長因子ベータサブファミリー、骨形態形成タンパク（ＢＭＰ）および成長分化因子（ＧＤＦ）ファミリー（ＢＭＰサブファミリーとも呼ばれる）、ならびにインヒビンおよびアクチビンサブファミリーを含む、種々のサブファミリーに細分化され得る。

ＴＧＦβスーパーファミリーのＢＭＰサブファミリーは、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３（オステオゲニンとしても知られている）、ＢＭＰ−３ｂ（成長分化因子１０、ＧＤＦ−１０としても知られている）、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７（骨形成タンパク質−１、ＯＰ−１としても知られている）、ＢＭＰ−８（骨形成タンパク質−２、ＯＰ−２としても知られている）、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１（成長分化因子８、ＧＤＦ−８、またはミオスタチンとしても知られている）、ＢＭＰ−１２（成長分化因子７、ＧＤＦ−７としても知られている）、ＢＭＰ−１３（成長分化因子６、ＧＤＦ−６としても知られている）ＢＭＰ−１４（成長分化因子５、ＧＤＦ−５としても知られている）、およびＢＭＰ−１５（調査のために、例えば、Ａｚａｒｉ ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｒｕｇｓ ２００１；１０：１６７７−１６８６を参照すること）を含む、少なくとも２０種のタンパク質を含む。

ＢＭＰは、軟骨芽細胞における基質合成を刺激する、骨芽細胞におけるアルカリフォスファターゼ活性およびコラーゲン合成を刺激する、初期間葉前駆体から骨形成細胞への分化を誘導する（骨誘導）、単核細胞および間葉細胞の走化性を制御する、神経細胞の分化を制御することが示されている（調査のために、例えば、Ａｚａｒｉ ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｒｕｇｓ ２００１；１０：１６７７−１６８６ ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈ ２００１；５７：２９４−３０８を参照すること）。

ＢＭＰタンパク質の多くの機能の１つは、脊椎動物の、軟骨、骨、および結合組織の形成を誘導することである。ＢＭＰサブファミリーのもっとも骨誘導性を有するメンバーは、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８およびＢＭＰ−９（例えば、Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２００１， ５７−２９４−３０８； Ｙｅｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２００５； ９５−１７３−１８８； ａｎｄ Ｂｏｄｅｎ， Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｎｕｒｓｉｎｇ ２００５，２４：４９−５２を参照すること）である。このＢＭＰの骨誘導性の能力は、骨折の修復、脊椎融合、骨格の病気の治療、頭蓋骨、下顎骨、および骨欠損の再生を含む、種々の治療上の応用および臨床応用の見込み、そして、歯周部損傷の再生中における歯質形成およびセメント質形成、抜歯窩移植、歯槽堤増強、および痩孔増強などの口部および歯科の応用においての見込みがとてもあると、長い間、考えられてきた。現在は、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ ＦＤＡよりＩＮＦＵＳＥ（登録商標）として売られている組み換えヒトＢＭＰ−２は、脊椎融合手術における使用、非融合骨折の修復用、および、口部手術における使用が認められる一方、ＳｔｒｙｋｅｒよりＯＰ−１（商標登録）として売られている組み換えヒトＢＭＰ−７は、自己移植および骨髄採取は実行できない、または融合を促進することが期待できない、困難な非融合長骨における自己移植の代替物として、および、修整後外側（横突間）腰椎融合のための自己移植の代替物として、認められている。

骨の修復を外因的に高めるために使用されてきた別の組み換え成長因子は、種々のＴＧＦβ（Ｃｌｏｋｉｅ ＆ Ｂｅｌｌ， Ｊ． Ｃｒａｎｉｏｆａｃｉａｌ Ｓｕｒｇ． ２００３， １４：２６８−７７を参照すること）、繊維芽細胞成長因子のメンバー（ＦＧＦ）（Ｋａｗａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， （２００７） Ｊ． Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｒｅｓ． ２５（４）： ４８０−４８７を参照すること）、成長因子スーパーファミリーに由来する血小板のメンバー（ＰＤＧＦ）（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００８ ＪＢＪＳ ９０（ｓ１）：４８−５４を参照すること）、および血管内被成長因子（ＶＥＧＦ）（Ｓｔｒｅｅｔ ｅｔ ａｌ．， ２００２ ＰＮＡＳ ９９：９６５６−６１）を含む。

これらの成長因子を効果的にするために、これらは、適当な感受性細胞の臨界密度が修復部位に存在しているときに、十分な濃度で、活性があり、かつ有効である必要がある。ＧＦの短い半減期、熱不安定性、プロテアーゼへの感応性および／または可溶性は、この要求を満たすために、キャリアを併用したこれらの投与を要求する。

キャリアの数は、ＧＦの送達のために評価されてきた。これらは、繊維質コラーゲンスポンジ、ゼラチンヒドロゲル、フィブリンゲル、ヘパリン、ポロキサマ−などの逆相ポリマー、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）またはこれらのコポリマー（ＰＬＧＡ）を含むキャリア、ヘパリン結合ＰＬＧＡキャリア、およびリン酸カルシウムなどの無機物質を含む。例えば、歯周部再生のために使用される生体インプラント（ＧＥＭ−２１Ｓ（商標登録））は、ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢ（http://www.osteohealth.com/GEM21S.aspxを参照すること）のためのキャリアとして、ベータリン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）を使用する。

しかし、これらのキャリアは、キャリアと結合した場合の成長因子活性の喪失、移植部位でのＧＦの非効率な放出、および／またはタンパク質分解および劣化からの貧弱な保護のために、有効性が限定されている。例えば、生体インプラントＩｎｆｕｓｅ（商標登録）はｒｈＢＭＰ−２のためのキャリアとして、タイプＩコラーゲンスポンジを使用する。ｒｈＢＭＰ−２は、キャリアからの破裂において、放出され、損傷部位内のＢＭＰの半減期は、１−３日である（Ｗｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．３１：３０３；Ｆｒｉｅｓｓ ｅｔ． ａｌ．，１９９９，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，１８７：９１）。骨を再生する間葉幹細胞が、損傷部位に移動した時までに、導入されたＢＭＰの元の量全体に占める割合のわずかな量しか、骨を形成するこれらの細胞を刺激するために、存在しなかった。これらの後の時点で残存するＢＭＰの有効なレベルを確実にする流動溶液は、初期に投与されるＢＭＰの量を有意に増加させる。これらの増加した投与量は、移植部位を越えた骨形成、自己免疫反応および潜在的な癌を含む合併症のリスクを増加する。さらに、これは、移植のコストを劇的に増加させる。

それゆえ、要求された治療上の効果を達成するために投与される必要がある成長因子の量を最小化するプロファイルを有する成長因子を放出する物質および方法の必要性が、当該技術において存在する。

一つの戦略は、多くの日にちにわたって持続した放出プロファイルを有するＧＦを放出する生体分解性重合体基質にＧＦを包むことである。例えば、ＢＭＰは、持続した放出プロファイルを生み出すために、ポリ乳酸（ＰＬＡ）またはポリ乳酸コグリコール酸（ＰＬＧＡ）と結合させた。しかし、ＰＬＡまたはＰＬＧＡ中へのＢＭＰの取り込みは、ＢＭＰを変性させ、それの活性を低下させ、そして生体移植の有効性を最適化させる放出プロファイルを操作することは難しい。さらに、これらのキャリアの変性速度は、一般的に、多量のＧＦが、治癒が完了したあとの長い間、仕舞い込まれ続けるような速度である。結果として、十分なＧＦが適切な時間に存在することを確実にするために、多量のＧＦが、これらのポリマーに導入される必要がある。

別の戦略は、直接的に、キャリアの表面上にＧＦを化学的に固定化することである。しかし、これは、ＧＦの活性の部分的なまたは完全な喪失に帰着するかもしれないし、そして、キャリアと直接的に接触したこれらの細胞だけがＧＦと相互作用および反応できるように、ＧＦの活性を制限してしまうかもしれない（Ｓｔｅｉｎｍｕｌｌｅｒ−Ｎｅｔｈｌ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００６，２７：４５４７−５６を参照すること）。これは、効果が、損傷部位全体ではなく、キャリアとじかに接した表面に限定されるため、望ましくないだろう。

キャリアの組成は、ＧＦの送達に影響を与え得る。硫酸カルシウムは、骨伝導性、生物分解性、生体適合性があり、および無毒であるため、骨の代用およびＧＦキャリアとして望ましいと考えられている（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｒａｎｉｏｆａｃｉａｌ Ｓｕｒｇ．， ２０１０， ２１：１８８−１９７）。ところがまた、硫酸カルシウムは、切片上の骨に添加した場合、急速な変性速度を有すること、そして、ほとんど骨誘導能力がないことで知られている。これは、骨移植における有用性を制限してきた。

切片上の硫酸カルシウムの分解をうまく扱う一つの戦略は、結晶構造を変換し、硫酸カルシウム移植混合物にポリマー（例えば、キトサン）を添加することによって、分解速度をコントロールすることであった（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ）。ＢＭＰで浸透されたポリマーコーティング硫酸カルシウムペレットは、硫酸カルシウム分解のスピードを遅め得る、そして、圧縮強度および混合物の骨誘導を高め得る（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ）。

骨の主なミネラル成分であるヒドロキシアパタイト（ＨＡｐ）、および硫酸カルシウム半水和物（ＣＳＨ， ｐｌａｓｔｅｒ ｏｆ Ｐａｒｉｓ）を含む複合体は、整形外科移植において使用されてきた。（例えば、Ｄａｍｉｅｎ，Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ．，１９９０，２４：６３９−６５４；Ｄａｍｉｅｎ，Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｓｐｉｎｅ，２００２，１６Ｓ：Ｓ５０−Ｓ５８；Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＣＳＨが無菌生理食塩水または無菌水と混合された場合、これは直ちにゲルになり始める。一方、ゲル状態において、ＨＡｐ、成長因子および／または種々の基質成分は、ＣＳＨと混合され得て、移植複合体を形成し、これは、骨の欠損に挿入され得るまたは注入され得て、これは切片上で定植する。このような方法において、ＣＳＨは、初期に結合剤として働く。しかし、引き続く硫酸カルシウムの分解は、成長中の骨のための空間とともに多孔性基質を残す。この成長中の骨は、硬化した複合体中の成長因子により刺激され得る。同様に、ＣＳＨ、多孔性粒状ポリマー混合物および骨形成タンパクを含む、骨形成タンパク質を送達するための組成物が知られている（米国特許５，３８５，８８７および米国特許出願公報Ｎｏ．２００８／０２３３１６５、これら各々は、全文で示されるように、本明細書に、参照により含まれる）。これら各々の方法において、硫酸カルシウム分解は、成長因子放出のために要求される。それゆえ、骨再生は、硫酸カルシウム分解の速度に依存する。

特定の骨ならびにＣＳＨおよびリン酸カルシウム生成物を含む生体適合性固体成分を含む骨移植は、知られているが、これらは、成長因子キャリアとしてＣＳＨまたはリン酸カルシウムを使用することは含まない（米国出願公報Ｎｏ２０１１／０２０８３０５、全文で示すように、本明細書に、参照により含まれる）。

事実上、損傷の治癒のあいだに、多数のＧＦが、損傷部位および周辺組織内に、種々の濃度で、種々の時間に存在している。例えば、骨折後すぐに、損傷部位における血小板は、初期に、その後の数日にわたって、骨折部位内のタンパクレベルの急な減退とともに、多量のＰＤＧＦを放出するだろう（Ｔｙｎｄａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，４０８：３１９‐３３０を参照すること）。反対に、ＢＭＰ−２は、損傷治癒過程のすべての段階で発現される（Ｒａｓｕｂａｌａ ｅｔ ａｌ．Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒａｌ ａｎｄ Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃｉａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ，２００３，４１：１７３‐１７８を参照すること）、ただし、ＢＭＰ−２の量は、時間とともに変化する（Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂｏｎｅ Ｊｔ． Ｓｕｒｇ ２００３， ８５−Ａ： １２４３−１２５４を参照すること）。これらの成長因子の濃度は、細胞の必要性に合う濃度の調和および多数の成長因子の相乗効果のために、外来性ＧＦの治療上の使用のあいだに使われるＧＦより低い桁だと概算されている。多相性放出プロファイルを有する成長因子の送達、および異なる放出プロファイルを有する多数の成長因子の放出を可能にするシステムを生み出すことは、破裂においてまたは持続した放出にともない一つの成長因子を放出する現在の生体インプラントよりも、自然治癒過程のあいだのＧＦ放出に、より近く似たＧＦ放出プロファイルを有する生体インプラントの使用を可能にする。

この背景技術情報は、既知の情報であると出願人に信じられている情報を、本発明に関連する可能性のあるものとする目的のために提供される。上記情報のいずれも本発明に対して先行技術を構成しているという承認は、必ずしも意図してなく、解釈されるべきではない。

〔発明の概要〕
本発明は、一態様において、例えば治療部位における、少なくとも一つの成長因子の多相性放出のためのシステム、方法およびキットを提供する。この目的のために、本発明のシステムは、生体移植などとして提供されてもよい。一態様において、本発明の方法は、持続した放出プロファイルにおける少なくとも一つの成長因子の送達が後に続く、初期の放出における少なくとも一つの成長因子を送達する。本発明は、初期の放出のための送達システムおよび、持続した放出のためのキャリアを利用する。

一態様において、同じ成長因子が、初期の放出プロファイルおよび持続した放出プロファイルにおいて、放出される。別の態様において、初期のプロファイルにおいて放出される第一の成長因子、および持続した放出プロファイルにおいて放出される第二の成長因子による、異なる成長因子が放出される。当業者にはわかるだろうが、このような異なった方法での二つの異なる成長因子の放出は、治療部位における自然な成長因子放出システムに、より近く似ていると信じられる。

本発明の一態様によると、少なくとも一つの成長因子の初期の放出を提供する送達賦形剤と組み合わされた、少なくとも一つの成長因子の持続的な放出を提供するキャリアが提供される。キャリアと送達賦形剤との組み合わせは、成長因子の多相性放出プロファイルを生じる。好ましい実施形態において、キャリアおよび送達賦形剤の量は、少なくとも一つのＧＦの放出をコントロールするために変更される。ここでの送達賦形剤およびキャリアの量は、おおよそ０．５から４.０：１（ｖ：ｖ）の比で、提供される。好ましい実施形態において、使用される送達賦形剤の量は、０．５から１０ｍｌの間にある。特に好ましい実施形態では、０．７５−２．５ｍｌの送達賦形剤は、１ｃｍ^３のキャリアとともに使用される。特に好ましい実施形態では、１．０ｍｌの送達賦形剤および０．５ｃｍ^３のキャリアが使用される。

好ましい実施形態において、成長因子（ＧＦ）は、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）スーパーファミリーのメンバーである。特に好ましい実施形態において、成長因子は、骨形態形成タンパク（ＢＭＰ）である。

本発明の一態様において、キャリア（“ＣＡＲ”）は、ポリマー基質内に分散されてより大きな構造を生じる８０ミクロン未満そして好ましくは４５ミクロン未満のサイズのリン酸カルシウム粒子で、形成されている。一態様において、構造は、さらに、ヒドロキシアパタイト被膜でコートされる。

一実施形態において、少なくとも一つのＧＦは、ポリマー基質と結合する前に、液体としてカルシウム粒子に加えられ、次いで、粒子上に凍結乾燥される。

いくつかの実施形態において、１００％の凍結乾燥されたＧＦが、粒子と結合している。別の実施形態において、１００％未満の凍結乾燥されたＧＦが、粒子に結合し、残りは、粒子に結合していない。ＧＦ結合粒子および粒子に結合していない凍結乾燥ＧＦを含むこのような組成物は、非結合粒子が送達賦形剤中に分散され、引き続いてこれらが放出され得るように、送達賦形剤と結合され得る。

本発明の別の態様において、キャリアは、リン酸カルシウムセメントを生じさせるために、少なくとも一つの成長因子を含む溶液と、一以上のリン酸カルシウムパウダーとを混合することにより形成される。一態様において、次いで、セメントは、粉砕されて、少なくとも１００ミクロンの直径ならびに、好ましくは直径が０．３および３ｍｍの間にある粒子になる。

本発明の別の態様において、キャリアは、すべてが、少なくとも１００ミクロンの直径、ならびに好ましくは０．３および３ｍｍのあいだにある直径の、一以上のカルシウム塩の粒子を含む。次いで、成長因子は、キャリア粒子の表面上に凍結乾燥される。

好ましい実施形態において、送達賦形剤は、逆相ポリマーである。特に好ましい実施形態において、逆相ポリマーは、ポロキサマ−であり、さらに特定すると、少なくとも１２％、ならびに好ましくは２０および４０％の間にある濃度のポロキサマー４０７（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ^ＴＭ Ｆ１２７とも呼ばれる）である。いくつかの特に好ましい実施形態において、Ｐ４０７およびキャリアの量は、キャリアからおよび任意で送達賦形剤から放出されるＧＦの量に影響を与えるために、変更される。

上記のように、一態様において、キャリアおよび送達賦形剤は、同じ成長因子を放出し、一方、別の態様では、キャリアおよび送達賦形剤は、異なる成長因子を放出する。また、本発明の別の態様において、キャリアおよび送達賦形剤は、同じまたは異なる各々によって放出される組み合わせで、２以上の成長因子の合剤を放出することに、各々適している。

それゆえ、一態様において、本発明は、治療部位における成長因子の多相性放出のためのシステムを提供する。上記システムは下記を含む：
−少なくとも一つの第一成長因子を含む送達賦形剤；そして
−少なくとも一つの第二成長因子を含むキャリア；
−ここで：
−送達賦形剤は、初期の放出プロファイルにおいて、少なくとも一つの第一成長因子を第一期間にわたって放出することに適している；
−キャリアは、持続した放出プロファイルにおいて、少なくとも一つの第二成長因子を第二期間にわたって放出することに適している。

別の態様において、本発明は、成長因子の多相性放出の方法を提供する。この方法は下記を含む：
−初期の放出プロファイルで、少なくとも一つの第一成長因子を送達する；
−持続した放出プロファイルにおいて、少なくとも一つの第二成長因子を送達する。

また、さらなる態様において、本発明は、成長因子の多相性送達のためのキットを提供する。キットは下記を含む：
−送達賦形剤成分；
−送達賦形剤に結合した、少なくとも一つの第一成長因子；
−キャリア成分；そして
−キャリアに結合した、少なくとも一つの第二成長因子。

また、さらなる態様において、本発明は、成長因子の多相性送達のためのキットを提供する。キットは下記を含む：
−送達賦形剤成分
−キャリア成分
−送達賦形剤またはキャリアに結合していない、少なくとも一つの第一成長因子；そして
−キャリアに結合した、少なくとも一つの第二成長因子。

一実施形態において、キットは、少なくとも二つの容器を含む。ここで、第一容器は、送達賦形剤を含み、第二容器は、少なくとも一つの第二成長因子および少なくとも一つの第一成長因子に結合したキャリアを含む。好ましい実施形態において、少なくとも一つの第一成長因子は、送達賦形剤がキャリアに添加される場合、送達賦形剤と混合する。

一態様において、また、本発明は、例えば治療部位において、少なくとも一つの成長因子の放出のためのシステム、方法およびキットを提供する。ここで、硫酸カルシウム“キャリア”粒子は、これらの表面上に、少なくとも一つの成長因子を収容する。この目的のために、本発明のシステムは、生体移植などとして、提供されてもよい。

一態様において、本発明の方法は、持続した放出プロファイルにおいて、少なくとも一つの成長因子を送達する。

本発明の一態様において、キャリアは、硫酸カルシウム二水和物およびリン酸カルシウム粒子の混合物を含む。好ましい実施形態において、硫酸カルシウムとリン酸カルシウムとの比は、おおよそ１：１または２：１である。

本発明のいくつかの態様において、少なくとも一つの成長因子は、カルシウムキャリアから、単相中に放出される。この態様において、ＧＦは、送達賦形剤によって放出されない。別の実施形態において、少なくとも一つの成長因子は、カルシウムキャリアおよび送達賦形剤から、多相性放出を受ける。好ましい実施形態において、キャリアおよび送達賦形剤の量は、少なくとも一つのＧＦの放出を制御するために、変更される。ここで、送達賦形剤およびキャリアの量は、おおよそ０．５−４：１（ｖ：ｖ）の比で提供される。好ましい実施形態において、使用される送達賦形剤の量は、０．５および１０．０ｍｌの間にある。特に好ましい実施形態において、キャリア１ｃｍ^３あたり、０．５−２．５ｍｌの送達賦形剤が、使用される。特に好ましい実施形態において、１．０ｍｌの送達賦形剤および０．５ｃｍ^３のキャリアが使用される。

一実施形態において、少なくとも一つのＧＦは、液体として、カルシウム粒子に加えられ、次いで、ポリマー基質と結合する前に、粒子上に凍結乾燥される。

一実施形態において、ＧＦは、いくつかのＧＦがキャリアと結合し、いくつかのＧＦはキャリアから分離するように、凍結乾燥される。送達賦形剤がキャリアに添加される場合、分離したＧＦは、送達賦形剤と結合するようになる。

好ましい実施形態において、カルシウム粒子上における少なくとも一つのＧＦの分布は、粒子上に凍結乾燥されたこのタンパクと比較して、ＧＦを含む溶液量を変えることにより、変更される。カルシウム粒子上に結合したＧＦの量は、ＧＦを送達するのに使われる溶液量を減少させることにより、もっと増加させることができる。好ましい実施形態において、キャリア粒子上へのＧＦの凍結乾燥は、１：１：０．５の比において行われ、ここで、１ユニットＧＦは、１ユニットの溶液と混合され、０．４ユニットのキャリア上に凍結乾燥される。特に好ましい実施形態において、おおよそ１．０ｍｇのＧＦは、おおよそ０．５ｃｍ^３のカルシウム粒子上への凍結乾燥のために、おおよそ１．０ｍｌの溶液に添加される。

さらなる態様において、本発明は、成長因子の送達のためのキットを提供する。キットは下記を含む。

−送達賦形剤成分；
−複数の硫酸カルシウム粒子を含むキャリア成分；
−キャリアと結合した少なくとも一つの第二成長因子、そして必要に応じて、
−送達賦形剤が少なくとも一つの第一成長因子と混合される場合、送達賦形剤と結合することになるであろうキャリアと結合していない、少なくとも一つの第一成長因子。

好ましい実施形態において、キットのキャリア成分は、さらに、リン酸カルシウムを含む。特に好ましい実施形態において、硫酸カルシウム粒子とリン酸カルシウム粒子との比は、おおよそ１：１または２：１である。

さらなる態様において、本発明は、成長因子の多相性送達のためのキットを提供する。キットは下記を含む：
−送達賦形剤成分；
−送達賦形剤と結合した、少なくとも一つの第一成長因子；
−複数の硫酸カルシウム粒子を含むキャリア成分；そして
−キャリアと結合した、少なくとも一つの第二成長因子。

好ましい実施形態において、キットのキャリア成分は、さらに、リン酸カルシウム粒子を含む。特に好ましい実施形態において、硫酸カルシウム粒子とリン酸カルシウム粒子との比は、おおよそ１：１または２：１である。

〔図面の簡単な説明〕
本発明は、添付図を参照して、記述され、これは、以下で簡潔に説明されている。

図１は、本発明のキャリアによって示された持続した放出プロファイルを図示する。

図２は、本発明の送達賦形剤によって示された初期の放出プロファイルを図示する。

図３は、送達賦形剤およびキャリア中の成長因子の量に基づいた、異なった放出プロファイルを図示する。多相性放出プロファイルは、成長因子が送達賦形剤およびキャリアの両方（５０−５０）に取り込まれる場合、観察される。

図４は、生体インプラントのインビボ活性を図示している。ここで、成長因子は、本発明の方法に従って図３に示されたように放出される。

図５は、本発明の方法に従って生産された生体インプラントをマウスに移植した場合における、リン酸カルシウム粒子（ＣａＰ）上への新しい骨（「骨」）の形成を図示している。

図６は、本発明の方法に従って生産された生体インプラントをマウスに移植した場合における、キャリア（「キャリア」）上に形成された新しい骨（「骨」）の組織像外観を図示している。

図７は、本発明の方法に従い生産されたキャリアによって生じた、短期持続成長因子放出プロファイルを図示している。

図８は、持続した放出プロファイルが、本発明の方法に従って生産されたキャリアの特性を変化させることにより、変更され得る方法を図示している。

図９Ａ−Ｄは、凍結乾燥されたキャリアを図示している。ここで、凍結乾燥された溶液量は変更されたが、凍結乾燥された全タンパク量は固定された。治療グループ１（Ａ）、３（Ｂ）および５（Ｃ）が、描写される。

図１０Ａ−Ｂは、本発明の方法に従って生産された生体インプラント中に使用されたリン酸カルシウム（Ａ）および硫酸カルシウム（Ｂ）キャリア成分周辺に形成された、新しい骨の組織像外観。

〔発明の詳細な説明〕
成長因子（ＧＦ）は、組織の修復および再生において、不可欠な役割を担っており、外来性ＧＦは、種々の組織および器官の修復を刺激するために使用され得る。外来性成長因子が修復を刺激することにおいて有効であるためには、これらは、修復を必要としている部位において維持され、不活性化、隔離または分解から保護されなくてはいけない。これを達成するために、キャリアが使用される。しかし、既知のキャリアからの成長因子の放出は、理想的ではなく、容易に調製され得ない。目下の本発明は以下に基づいている：ｉ）生体インプラントからの成長因子の多相性放出は、移植の有効性を高めるという発見；そしてｉｉ）成長因子キャリアとしての、硫酸カルシウムの使用は、生体インプラントを含むＧＦの効能を改善し得るという発見。

本発明者らは、成長因子の活性を維持する一方、移植部位における成長因子の放出キネティクスまたは放出プロファイルを改善することにより、例えば、生体インプラントの有効性を高めるための方法および物質を発展させた。一態様において、本発明は、また少なくとも一つの成長因子を含む送達賦形剤に結合した、少なくとも一つの成長因子を含有するキャリアを含む、成長因子送達システムおよび方法を提供する。キャリアおよび送達賦形剤によって放出される、少なくとも一つの成長因子は、同じであるか、または異なってもよい。

別の形態において、本発明は、必要に応じて少なくとも一つのＧＦを含んでもよい送達賦形剤と結合した、表面上に少なくとも一つのＧＦを含む複数の硫酸カルシウム二水和物粒子を含むキャリアを使用しているため、有効性を高めた、成長因子送達システムおよび方法を提供する。反対に、ＧＦキャリアとして硫酸カルシウムを使用する以前の試みは、ＧＦでカルシウム粒子の表面をコーティングするよりも、成長因子を硫酸カルシウム粒子に組込むまたは浸透させることを含むものであった。本発明において、硫酸カルシウムの分解は、ＧＦ放出のために必要ではない。

好ましい実施形態において、キャリアおよび送達賦形剤の量は、少なくとも一つのＧＦの放出をコントロールするために変更される。ここで、送達賦形剤およびキャリアの量は、おおよそ０．５−４.０：１（ｖ：ｖ）の比で提供される。好ましい実施形態において、使用される送達賦形剤の量は、０．５および１０．０ｍｌの間にある。特に好ましい実施形態において、キャリアのｃｍ^３あたり０．５−２．５ｍｌの送達賦形剤が使用される。特に好ましい実施形態において、１．０ｍｌの送達賦形剤および０．５ｃｍ^３のキャリアが使用される。

一実施形態において、少なくとも一つのＧＦは、キャリア構造を作り出すためにポリマー基質と結合する前に、小さい（＜８０ミクロン）カルシウム粒子に液体として加えられ、次いで、粒子上に凍結乾燥される。

別の実施形態において、ＧＦは、大きい（＞１００ミクロン）粒子に液体として加えられ、次いで、粒子とともに凍結乾燥され、粒子結合ＧＦおよび粒子遊離ＧＦの分布を生じる。

好ましい実施形態において、粒子との結合および粒子からの解離または遊離の間にある、少なくとも一つのＧＦの分布は、凍結乾燥前に共にインキュベーションされる粒子量と比較した、ＧＦを含む溶液量を変えることにより、変更される。粒子に結合したＧＦの量は、ＧＦを送達するのに使用される溶液量を減少させることにより、より多くすることができる。好ましい実施形態において、キャリア粒子上へのＧＦの凍結乾燥は、１：１：０．５の比で行われ、ここで、１ユニットのＧＦは、１ユニットの溶液と混合され、４ユニットのキャリア上に凍結乾燥される。特に好ましい実施形態において、おおよそ１．０ｍｇのＧＦは、おおよそ０．５ｃｍ^３のカルシウム粒子上への凍結乾燥のために、おおよそ１．０ｍｌの溶液に添加される。

本発明のシステムおよび方法は、骨折の修復、骨移植、脊椎融合、ならびに、頭蓋骨、下顎骨、および骨欠損の再生を含む、種々の治療上の応用および臨床応用のために使用され得る。このような応用のために、好ましくは、本発明のシステムは、生体インプラント上に、または生体インプラントの形態で提供される。

〔定義〕
下記で別に定義されたものを除いては、本明細書において使用される、すべての技術的および科学的な用語は、この発明が帰属する当該分野において通常の技術を有する者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

本明細書においては、用語“生体インプラント”は、移植に適した物質を言及しており、外来性の成長因子または生物活性因子を含む。本明細書においてさらに論じられるように、好ましくは、本明細書のシステムは、生体インプラントと同様のものに適用することにより使用される。次いで、生体インプラントは、被験者の体内に与えられ、ここで当該システムは、多相性放出プロファイルにおいて、少なくとも一つの成長因子を放出する。

本明細書において、用語“成長因子”は、特異的な細胞表面受容体とＧＦの相互作用を通して、細胞の成長および／または分化を刺激するペプチドおよびタンパク質を言及している。成長因子の例は、骨形態形成タンパク（ＢＭＰｓ）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）および血管内被成長因子を含む。好ましい実施形態において、成長因子はＢＭＰである。

“組み換え”によるは、一過性で形質移入された、安定的に形質移入された、もしくは遺伝子組換え宿主細胞、またはこのタンパク質のｃＤＮＡを含む発現コンストラクトによって指示された動物によって生産されたタンパク質を意味する。また、用語“組み換え”は、このようなポリペプチドの医薬的に認められる塩を包含する。

本明細書において、用語“ポリペプチド”または“タンパク質”は、アミド結合を通してともに結合するアルファアミノ酸であるアミノ酸モノマーのポリマーを言及している。それゆえ、ポリペプチドは、長さにおいて、少なくとも二つのアミノ酸残基であり、通常はもっと長い。一般的に、用語“ペプチド”は、長さにおいて、ほんのわずかなアミノ酸残基であるポリペプチドを言及している。ペプチドとは対照的に、ポリペプチドは、任意の数のアミノ酸残基を含んでもよい。このゆえに、用語、ポリペプチドは、アミノ酸のより長い配列と同様に、ペプチドを含んでいた。

本明細書において、用語“骨形態形成タンパク”または“骨形態発生タンパク”または“ＢＭＰ”は、交換可能に使用されており、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３（オステオゲニンとしても知られている）、ＢＭＰ−３ｂ（成長分化因子１０、ＧＤＦ−１０としても知られている）、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７（骨形成タンパク質−１、ＯＰ−１としても知られている）、ＢＭＰ−８（骨形成タンパク質−２、ＯＰ−２としても知られている）、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１（成長分化因子８、ＧＤＦ−８、またはミオスタチンとしても知られている）、ＢＭＰ−１２（成長分化因子７、ＧＤＦ−７としても知られている）、ＢＭＰ−１３（成長分化因子６、ＧＤＦ−６としても知られている）ＢＭＰ−１４（成長分化因子５、ＧＤＦ−５としても知られている）、およびＢＭＰ−１５を含む、成長分化因子の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）スーパーファミリーの骨形態形成タンパク（ＢＭＰ）サブファミリーの任意のメンバーを言及している。

また、用語“骨形態形成タンパク”および“ＢＭＰ”は、ＢＭＰの対立遺伝子変異型、ＢＭＰの機能保存変異型、およびＢＭＰ活性を保持する突然変異ＢＭＰを含む。このような変異型および突然変異型のＢＭＰ活性は、当該技術分野においてよく知られている方法（下記のＢＭＰ活性を測定するアッセイの項を参照すること）または実施例１に記載の方法の何れかにより、確かめられてもよい。

好ましい実施形態において、ＢＭＰは、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８またはＢＭＰ−９である。特に好ましい実施形態において、ＢＭＰは、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４またはＢＭＰ−７である。

好ましい実施形態において、ＢＭＰは、哺乳類ＢＭＰ（例えば、哺乳類ＢＭＰ−２または哺乳類ＢＭＰ−７）である。特に好ましい実施形態において、ＢＭＰは、ヒトＢＭＰ（ｈＢＭＰ）（例えば、ｈＢＭＰ−２またはｈＢＭＰ−７）である。

本明細書において、用語“足場”は、組織修復部位への細胞接着、細胞移動および細胞内殖を助ける構造を提供することが目的である物質を言及している。

本明細書において、用語“キャリア”は、一つのまたは多数の成分を含む物質を言及し、ある期間にわたった持続放出プロファイルにおいて、治療部位で少なくとも一つの成長因子を放出することに適している。一態様において、キャリアによって少なくとも一つの成長因子を放出するのにかかる期間は、数日および数週間のあいだにある。好ましくは、キャリアは、数週間の期間にわたって、少なくとも一つの成長因子を放出することに適している。

好ましい実施形態において、また、キャリアは、足場または基質として働く。上述のように、本発明の一態様において、キャリアはマクロ孔質ポリマー足場またはマクロ孔質ポリマー基質中に分散されたリン酸カルシウム粒子で形成される。一態様において、足場または基質は、さらに、ヒドロキシアパタイト被膜でコートされる。本発明の別の態様において、キャリアは、硫酸カルシウム粒子で形成される。また、本発明の別の実施形態において、キャリアは、硫酸カルシウム粒子およびリン酸カルシウム粒子の混合物である。一実施形態において、少なくとも一つの成長因子は、ポリマー基質とカルシウム粒子を結合する前に、液体として、カルシウム粒子に加えられ、次いで、粒子上に凍結乾燥される。好ましい実施形態において、キャリアは固体である。

本明細書において、用語“送達賦形剤”は、キャリアを運ぶ働きをする物質を言及する。本発明の一態様において、送達賦形剤は、少なくとも一つの成長因子を含むまたは結合し、初期の放出プロファイルにおいて、治療部位で、少なくとも一つの成長因子をある期間にわたって放出することに適している。別の態様において、送達賦形剤は、最初に成長因子を含まない。むしろ、それは、使用前に、キャリアと結合していないＧＦと、あとで結合し、それによって、ＧＦ放出の初期の段階を生じる。一態様において、送達賦形剤が少なくとも一つの成長因子を放出するのにかかる期間は、数時間および数日間の間にある。本発明の好ましい実施形態において、送達賦形剤は、数時間続く、初期の放出または初期の放出プロファイルにおいて、少なくとも一つの成長因子の大部分を放出する。好ましくは、送達賦形剤は、７２時間内に、これの中に含まれる（これに結合している）成長因子の少なくとも８０％を放出することに適している。好ましい実施形態において、送達賦形剤は、液体またはゲルである。

一態様において、本発明の送達賦形剤は、キャリア粒子の扱いを容易にするために使用されてもよく、ここで、キャリアおよび送達賦形剤の配合は、ゲルまたはパテの形態を生じる。

一態様において、送達賦形剤を形成する物質は、ゲルの形状である。好ましい実施形態において、送達賦形剤は、逆相ポリマーである。本明細書において、用語“逆相”は、ポリマーが液体からゲルへの可逆的な温度依存の転移を受ける特性を、言及している。一態様において、転移温度は、１５℃および３７℃の間にある。好ましくは、転移温度は、１５℃および２５℃の間にある。当業者には知られているだろうが、順相物質は、温度の低下とともに、これらの粘度は高くなる。反対に、逆相物質は、温度がこれらの転移温度より下落すると、粘度の低下を示す。

特に好ましい実施形態において、逆相ポリマーは、ポロキサマー、より具体的には、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ^ＴＭＦ１２７（ポロキサマー４０７またはＰ４０７としても知られている）である。

特に好ましい実施形態において、Ｐ４０７ポリマー溶液は、２０％および４０％の間にある。

好ましい実施形態において、生体インプラントにおいて使用されるキャリアの量および送達賦形剤の量は、生体インプラントから放出されるＧＦの量に影響を与えるために、変更される。

本明細書において、用語“持続した放出”または“持続した放出プロファイル”は、移植の数日後または数週間後の同じ期間にわたって放出される量と同じまたは少ない、初期の期間にわたって放出される量の、数日間または数週間の期間にわたる、キャリアによる少なくとも一つの成長因子の放出を言及している。好ましくは、持続した放出プロファイルは、少なくとも一週間続く。当業者にはわかるだろうが、一般的に、初期の３日間にわたる持続した放出プロファイルにおいて放出された成長因子の量は、続く７日間にわたって放出される量より少ないであろう。

本明細書において、用語“初期の放出”または“初期の放出プロファイル”は、数時間または数日間の期間にわたって放出される、次第に少なくなる量が後に続く、送達賦形剤による、少なくとも一つの成長因子の多量な初期の放出を言及している。一態様において、初期の放出プロファイルは、おおよそ７２時間内において、投与された成長因子の少なくとも８０％の送達を生じた。初期の放出プロファイルは、図２において図示されている。

本明細書において、用語“多相性放出”は、第二期間にわたった少なくとも一つの成長因子の持続する放出が後に続く、初期の期間にわたった少なくとも一つの成長因子の初期の放出を言及している。好ましくは、初期の期間は、おおよそ数時間、そして、第二期間は、おおよそ数日から１週間である。また、このような放出プロファイルは、二つの段階において発生するため、二相性放出として言及されてもよい。好ましい実施形態において、初期の放出は、本発明の送達システムによって提供され、持続する放出は、本発明のキャリアによって提供される。

本明細書において、用語“効能”は一定の強さの効果を生じるために要求される量に関して表現された薬剤活性の指標を言及している。

本発明の一態様において、送達賦形剤成分は、本発明のシステムによって送達される成長因子の全体量の少なくとも１０％および５０％より多くない量を含み、キャリア成分は、当該システムによって送達される成長因子の全体量の少なくとも５０％を含む。

（ＢＭＰ活性を測定するアッセイ）
組み換えＢＭＰのインビトロおよびインビボにおける機能を特徴づけるアッセイは、当該技術分野において、よく知られている（例えば、米国特許Ｎｏ．４，７６１，４７１；米国特許Ｎｏ．４，７８９，７３２；米国特許Ｎｏ．４，７９５，８０４；米国特許Ｎｏ．４，８７７，８６４；米国特許Ｎｏ．５，０１３，６４９；米国特許Ｎｏ．５，１６６，０５８；米国特許Ｎｏ．５，６１８，９２４；米国特許Ｎｏ．５，６３１，１４２；米国特許Ｎｏ６，１５０，３２８；米国特許Ｎｏ．６，５９３，１０９；Ｃｌｏｋｉｅ ａｎｄ Ｕｒｉｓｔ，Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．２０００；１０５：６２８−６３７；Ｋｉｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ ２０００；１９：３３１４−３３２４；Ｖａｌｌｅｊｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００２；９４：１８５−１９４；Ｐｅｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｒａｎｉｏｆａｃｉａｌ．Ｓｕｒｇ．２００３；１４：２８４−２９１；ａｎｄ Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，２００４；２２：２９−３３を参照すること）。

このようなアッセイは次のものを含む：齧歯動物（例えば、ラットまたはマウス）に移植後（例えば、後四半部の筋肉または胸部に）の、ＢＭＰの骨誘導活性を定量するインビボアッセイ（例えば、米国特許Ｎｏ．４，７６１，４７１；米国特許Ｎｏ．４，７８９，７３２；米国特許Ｎｏ．４，７９５，８０４；米国特許 Ｎｏ．４，８７７，８６４；米国特許Ｎｏ．５，０１３，６４９；米国特許Ｎｏ．５，１６６，０５８；米国特許Ｎｏ．５，６１８，９２４；米国特許Ｎｏ．５，６３１，１４２；米国特許Ｎｏ６，１５０，３２８；米国特許Ｎｏ．６，５０３，１０９；Ｋａｗａｉ ａｎｄ Ｕｒｉｓｔ．，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｌａｔ．Ｒｅｓ．，１９８８；２２２：２６２−２６７；Ｃｌｏｋｉｅ ａｎｄ Ｕｒｉｓｔ，Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．，２０００；１０５：６２８−６３７；ａｎｄ Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，２００４；２２：２９−３３を参照すること）；哺乳類（例えば、ラット、イヌ、またはサル）の頭蓋トレフィン欠損を再生するＢＭＰの活性を定量するインビボアッセイ（例えば、米国特許Ｎｏ．４，７６１，４７１および米国特許Ｎｏ．４，７８９，７３２）；インビトロの培養軟骨細胞の増殖を誘導するＢＭＰの活性を定量するインビトロアッセイ（例えば、米国特許Ｎｏ．４，７９５，８０４を参照すること）；インビトロの培養筋細胞（例えば、Ｃ２Ｃ１２細胞、ＡＴＣＣ Ｎｕｍｂｅｒ ＣＲＬ−１７７２）または骨髄基質細胞（例えば、マウスＷ−２０細胞、ＡＴＣＣ Ｎｕｍｂｅｒ ＣＲＬ−２６２３）において、アルカリフォスファターゼ活性を誘導するＢＭＰの活性を定量するインビトロアッセイ（例えば、米国特許Ｎｏ．６，５９３，１０９；Ｒｕｐｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ１９９６；２３７：２９５−３０２；Ｋｉｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，２０００；１９：３３１４−３３２４；Ｖａｌｌｅｊｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈ，２００２；９４：１８５−１９４；Ｐｅｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｒａｎｉｏｆａｃｉａｌ Ｓｕｒｇ．，２００３；１４：２８４−２９１；ａｎｄ Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，２００４；２２：２９−３３を参照すること）；培養間葉前駆細胞株（例えば、マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１−２細胞）において、ＦＧＦ−受容体２（ＦＧＦＲ３）発現を誘導するＢＭＰの活性を評価するインビトロアッセイ（例えば、Ｖａｌｌｅｊｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２００２；９４：１８５−１９４を参照すること）；ニワトリ肢芽細胞において、プリテオグリカン合成を誘導するＢＭＰの活性を定量するインビトロアッセイ（例えば、Ｒｕｐｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９６；２３７：２９５−３０２を参照すること）；および、骨髄基質細胞（例えば、マウスＷ−２０細胞；ＡＴＣＣ Ｎｕｍｂｅｒ ＣＲＬ−２６２３）において、オステオカルシン処理を誘導するＢＭＰの活性を定量するインビトロアッセイ（例えば、米国特許Ｎｏ．６，５９３，１０９を参照すること）。

（ＢＭＰ結合および放出を測定するアッセイ）
種々のアッセイが、キャリアからの組み換えＢＭＰの結合および放出を測定することに使用され得る。例えば、組み換えＢＭＰタンパクの量は、ドットブロット、免疫学的検定法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ、ＥＬＩＳＡ）、生体インプラントが、放射能標識ＢＭＰを含む場合、放出緩衝液中に存在する放射能の上昇の測定、およびクロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィー、ＨＰＬＣおよびイオン交換クロマトグラフィー）を含む、当該技術分野においてよく知られた任意の技術によって定量され得る。

このような方法は、当該技術分野において、よく知られている（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．１９９９；Ｇｏｓｌｉｎｇ，ｅｄ．，Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．２０００；Ｏｌｉｖｅｒ，ｅｄ．，ＨＰＬＣ ｏｆ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９８；Ｍｉｌｌｎｅｒ，ｅｄ．，Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９；Ｈｏｃｋｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．１９９３；Ｇｏｒｅ，ｅｄ．，Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００を参照すること）。

例えば、ＢＭＰタンパクの放射性同位元素標識免疫測定分析のためのプロトコルは、記述されている（例えば、米国特許Ｎｏ． ４，８５７，４５６を参照すること）。例えば、ＢＭＰの免疫ブロット分析のためのプロトコルは、記述されている（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９０；８７：２２２０−２２２４を参照すること）。例えば、ヒト、ラット、またはマウスＢＭＰ−２のタンパクレベルの定量のためのＥＬＩＳＡキットは、例を挙げると、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ｃａｔａｌｏｇ♯ＤＢＰ２００，ＰＤＢＰ２００，ｏｒ ＳＢＰ２００）から商業的に入手可能である。例えば、ヒトＢＭＰ−７のタンパクレベルの定量のためのＥＬＩＳＡキットは、例を挙げると、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ｃａｔａｌｏｇ＃ＤＹ３５４ ｏｒ ＤＹ３５４Ｅ）から商業的に入手可能である。

（キット）
一態様において、本発明は、本明細書に記載のシステムを含めるためのキットを提供する。一実施形態において、キットは、必要とされる成長因子と同様に、送達賦形剤およびキャリアを作製するための必須成分を含む。これは、本発明のキットは、送達賦形剤と結合した、または後に結合するであろう、少なくとも一つの成長因子、およびキャリアと結合した少なくとも一つの成長因子と同様に、送達賦形剤およびキャリアを作製するための必須成分を含むだろう。

キットは、好ましくは、結合成長因子を入れたまたはコートされたキャリアを含有する容器を含める。

好ましくは、送達賦形剤および任意の結合成長因子は、使用時に結合され得る、個々の容器に保存される。これは、送達賦形剤が液体またはゲルを含んでよい場合に、特に好ましいだろう。送達賦形剤が結合成長因子および液体またはゲルの両方とも含む、このような場合、結合成長因子は、凍結乾燥粉末として個々の容器に保存されてもよい。使用時に、粉末状の成長因子は、液体またはゲルの送達賦形剤と組み合わされてもよい。

好ましい実施形態において、本発明のキットは、次の各々のための少なくとも三つの容器を含むだろう：１）送達賦形剤成分；２）少なくとも一つの第一成長因子（例えば、送達賦形剤と結合した成長因子）；ならびに、３）キャリアおよび少なくとも一つの第二成長因子（例えば、キャリアに結合した成長因子）。使用において、粉末状の、少なくとも一つの第一成長因子は、液体状またはゲル状送達賦形剤と組み合わされ、次いで混合物は、少なくとも一つの第二成長因子が前もって導入されたキャリアに加えられる。

別の好ましい実施形態において、本発明のキットは、次のものを各々含む、少なくとも二つの容器を含むだろう：１）送達賦形剤成分；および２）硫酸カルシウムキャリアおよびキャリアと結合した少なくとも一つの成長因子およびキャリアと結合していない別の成長因子。使用において、液体状またはゲル状の送達賦形剤は、キャリアおよび結合ＧＦ（結合したまたは導入されたＧＦ）に加えられ、キャリアに結合していない成長因子（“遊離”ＧＦ）に加えられる。次いで、遊離ＧＦは、送達賦形剤に取り込まれる。

一つの好ましい実施形態において、キャリアは、硫酸カルシウム粒子およびリン酸カルシウム粒子の混合物に含まれる。本発明の特に好ましい実施形態において、キャリアは、おおよそ１：１または２：１の比の、硫酸カルシウム粒子およびリン酸カルシウム粒子の混合物に含まれる。好ましくは、キャリアは、少なくとも一つの成長因子でコートされる。

さらに別の好ましい実施形態において、本発明のキットは、次の各々のための少なくとも３つの容器を含むだろう：１）送達賦形剤成分；２）少なくとも一つの第一成長因子（例えば、送達賦形剤が結合した成長因子）；そして、３）硫酸カルシウムキャリアおよび少なくとも一つの第二成長因子（例えば、キャリアが結合した成長因子）。使用において、粉末状の、少なくとも一つの第一成長因子は、液体状またはゲル状の送達賦形剤と組み合わされ、次いで混合物は、少なくとも一つの第二成長因子が前もって導入されたキャリアに加えられる。

一つの好ましい実施形態において、キャリアは、硫酸カルシウム粒子およびリン酸カルシウム粒子の混合物が含まれる。本発明の特に好ましい実施形態において、キャリアは、おおよそ１：１または２：１の比の硫酸カルシウムおよびリン酸カルシウムの混合物が含まれる。好ましくは、キャリアは、少なくとも一つの成長因子でコートされる。

一態様において、本発明のキットは、必要とされるであろう、任意の必須試薬および／または器具および／または説明書および／または容器を含んでもよい。

〔実施例〕
それから、本発明は、次の実施例の方法により、記述されるだろう。これらの実施例は、持続した放出とともにＢＭＰを放出するキャリア中のＢＭＰの部分および初期の放出とともにＢＭＰを放出する送達賦形剤中のＢＭＰの部分を導入することによって生じるｒｈＢＭＰ−２などの成長因子の多相性放出プロファイルは、破裂放出または持続する放出を生じるだけのキャリアよりも、さらに効果的であるという、発明者による新しい発見を実証している。また、これらの実施例は、硫酸カルシウム二水和物または硫酸カルシウム二水和物およびリン酸カルシウムの混合物が、生体インプラントの効能を上げるための改善されたシステム、方法、組成物における、ＢＭＰなどの成長因子のキャリアとして使用され得ることを実証している。

当業者には明らかだろうが、キャリア中に一つの成長因子および送達賦形剤中に異なる成長因子を配置し、各々の成長因子の異なる放出プロファイルを生み出すことが可能である。

本明細書において提供される実施例は、ただ、本明細書を説明することを意図するものであり、いかなる手段においても、本明細書の範囲を限定する意図はないと理解されるであろう。同様に、本発明は、本明細書に記載された、いかなる特に好ましい実施形態にも限定されない。実際、本明細書の多くの改変および変型が、本明細書を読んだ当業者には明らかだろう。それゆえ、本明細書は、権利を与えられる特許請求の範囲と均等物の全範囲に加えて、添付した特許請求の範囲によってのみ、限定される。

（実施例１）
ＰＬＧＡ中への封入によるＢＭＰを含む持続放出複合キャリアの生成。

この実施例は、ｒｈＢＭＰ−２を含み、持続する放出プロファイルにおいて成長因子を放出するキャリアを形成する方法を例示する。

材料および方法
１．３３ｄＬ／ｇ（ＭＷ＝２０５，０００−２１０，０００）の固有の粘度を有するＰＬＧＡ７５／２５は、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｃ．（バーミングハム，アラバマ）から購入された。リン酸四石灰（ＴＴＣＰ）は、太平化学産業株式会社（大阪、日本）から入手し、無水リン酸二カルシウム（ＤＣＰＡ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ミズーリ，米国）から入手した。糖粒子は、Ｔａｔｅ＆Ｌｙｌｅ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．（トロント，カナダ）から購入した。

再吸収可能なリン酸カルシウム粒子は、２４時間、１００％の相対湿度で、脱イオン化蒸留水（ｄｄＨ２Ｏ）で、等モルのＴＴＣＰおよびＤＣＰＡを混合することにより、調製された。反応物は、粉砕され、４５μｍのふるいにかけられた。

組み換えヒトＢＭＰ−２（ｒｈＢＭＰ−２、Ｉｎｄｕｃｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｉｎｃ）は、調合緩衝液（１．５ｍｇ／ｍｌ，ｐＨ４．５；５ｍｍグルタミン酸，２．５％グリシン，０．５％スクロースおよび０．０１％Ｔｗｅｅｎ^ＴＭ８０ｄｄＨ_２Ｏ）中で調製された。タンパク質溶液は、ＣａＰ粉末を含む試料びんに添加され、少なくとも１５分間撹拌された。次いで、粉末は、凍結され、凍結乾燥された。

次いで、ＢＭＰ有りの粒子（ＣａＰ−ＢＭＰ）またはＢＭＰ無しの粒子（ＣａＰ）は、次のような転相／粒子溶脱によってＣａＰ粒子−ＰＬＧＡ足場ブロックを作製するために使用された：ＰＬＧＡは、１１．５％（ｗ／ｖ）の濃度で、ＤＭＳＯ中に溶解された。この溶液に、ＣａＰ粒子およびＣａＰ−ＢＭｐ粒子は、２：１（ｗ／ｗ）のＣａＰ／ＰＬＧＡ比になるように、十分に混合された。０．８５−１．１８ｍｍのサイズの範囲の糖結晶は、ＣａＰ／ＰＬＧＡ中に分散され、混合物は、−１８℃で、モールド中において凝固した。ＰＬＧＡは、沈殿し、糖結晶は、ｄｄＨ_２Ｏの３回の交換に浸すことにより、溶脱された。

ヒドロキシアパタイトの膜は、次のようにマクロ孔質複合足場上におよび全体に沈積する：直径２ｍｍおよび長さ２ｍｍの寸法の乾燥ＰＬＧＡ／ＣａＰシリンダーは、７０％エタノール中で、前もって湿らせ、３７℃で９日間、６０ｍｌの３×ＳＢＦに浸された。ＳＢＦは、次のように調製された：１．８ＬのｄｄＨ_２Ｏに、強い撹拌下で、次の塩が、連続で添加された２９．７１１ｇ ＮａＣｌ、２．２０６ｇ ＣａＣｌ_２−２Ｈ_２Ｏ、１０ｍｌ １Ｍ ＨＣｌ、０．８５２ Ｎａ_２ＨＰＯ_４。最終量は、２Ｌになった。ＳＢＦ溶液は、毎日、交換された。コーティングに続いて、３ＰＣＣサンプルは、ｄｄＨ_２Ｏ中ですすがれ、空気乾燥された。

これは、少なくとも７日にわたって持続した放出プロファイルを有するｒｈＢＭＰ−２を放出することができるマクロ孔質複合キャリア（３ＰＳ）の形成を生じる。これらの結果は、図１に図示されている。

（実施例２）
リン酸カルシウムセメント中への封入によるＢＭＰを含む持続した放出キャリアの生成
当該実施例は、持続した放出プロファイルを有するｒｈＢＭＰ−２を含むリン酸カルシウムセメント（ＣＰＣ）キャリアを形成する方法を例示する。

材料および方法
リン酸四石灰（ＴＴＣＰ）は、太平化学産業株式会社（大阪、日本）から入手し、無水リン酸二カルシウム（ＤＣＰＡ）は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から入手した。マクロ孔質二相性リン酸カルシウム顆粒（エクリプス）は、Ｃｉｔａｇｅｎｉｘ（ケベック州ラヴァル、カナダ）から購入された。組み換えヒトＢＭＰ−２（ｒｈＢＭＰ−２、Ｉｎｄｕｃｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｉｎｃ）は、調合緩衝液（１．５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ４．５；５ｍｍグルタミン酸、２．５％グリシン、０．５％スクロースおよび０．０１％Ｔｗｅｅｎ^ＴＭ８０ｄｄＨ２Ｏ）中で調製された。

再吸収可能なリン酸カルシウムセメント粒子は、ｒｈＢＭＰ−２溶液で等モルのＴＴＣＰおよびＤＣＰＡを混合することにより、調製される。反応物は、粉砕され、３００および１００μｍのふるいにかけられ、１００および３００μｍの間の粒子が保持された。

これは、ｒｈＢＭＰ−２が取り込まれたリン酸カルシウムセメントキャリア粒子の形成を生じた。動物に移植すると、ＢＭＰは、少なくとも数週間にわたる持続した方法で、放出された。

マクロ孔質キャリアとしても働く、ＣＰＣに基づく持続放出キャリアを生成するために、ＣＰＣ粒子（０．１から０．３ｍｍ）は、マクロ孔質リン酸カルシウム顆粒（１−２ｍｍ）と１：１の比（ｗ／ｗ）で混合された。

（実施例３）
ＢＭＰに結合するコーティングの使用によるＢＭＰを含む持続放出キャリアの生成
本実施例は、ＢＭＰ結合コーティングを適用することにより、持続した放出プロファイルを有するキャリアを形成する方法を、例示する。一つのこのような方法は、我々の同時係属出願番号米国出願Ｎｏ．１３／００２，４４４（参考文献により本明細書に含まれている全内容）に記載されている、抗体またはＢＭＰ結合タンパクでキャリアをコートすることである。

材料および方法
精製されたポリクローナルウサギ抗ヒトＢＭＰ−２抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（マサチューセッツ州カントン、Ｃａｔ＃ＰＡ００２５）から購入された。マクロ孔質二相性リン酸リン酸カルシウム（ＢＣＰ）顆粒（エクリプス）は、Ｃｉｔａｇｅｎｉｘ（ケベック州ラヴァル、カナダ）から購入された。

無菌ＢＣＰ顆粒は、バイオセイフティーキャビネットにおいて、量り分けられ、無菌ＴＰＰチューブに入れられた。抗体溶液は、１ｍｌ ＰＢＳ中に１５０、３００および６００ｎｇの抗体の最終濃度まで、リン酸緩衝生理食塩水で希釈され、ろ過滅菌され、１：１ｖ／ｖの比でキャリアに加えられた。サンプルは、凍結および凍結乾燥される前に、室温で少なくとも１５分間、撹拌された。次いで、ＢＭＰ溶液は、顆粒に加えられ、室温で１５分間浸しておき、次いで、凍結され、再凍結乾燥された。

これは、持続した方法でｒｈＢＭＰ−２に結合し、ゆっくりと放出した、抗体でコートされたＢＣＰ顆粒の形成を生じる。

結合され得るｒｈＢＭＰ−２の量は、使用された抗体の量を増加することにより、増加され得る。放出の速度は、より低い親和性または結合力を有する抗体を使用することにより、増加され得る。

（実施例４）
Ｆ１２７を使用した送達賦形剤を含むＢＭＰの生成
本実施例は、Ｆ１２７を使用した、ｒｈＢＭＰ−２を含む送達賦形剤を調製する方法を例示している。

材料および方法
ポロキサマーは、次のように調製された：１００ｍｌの蒸留水は、４℃まで冷却され、種々の量のポロキサマー４０７は、すべての固体プリルが溶解し、最終濃度を１２および３３％の間の範囲にするまで、数時間にわたってゆっくりと撹拌しながら、添加された。次いで、ポロキサマー溶液は、オートクレーブ中で滅菌された（１２１℃、２０分、３０ｐｓｉ）。滅菌後、ポロキサマー溶液は、使用まで、４℃に維持された。

凍結乾燥された組み換えヒトＢＭＰ−２粉末（ｒｈＢＭＰ−２、Ｉｎｄｕｃｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｉｎｃ）は、ポロキサマー溶液に添加され、ゆっくりと混合された。

あるいは、ｒｈＢＭＰ−２は、１／１０または１／２０の比（ｖ／ｖ）で溶液（１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ４．５；５ｍｍグルタミン酸、２．５％グリシン、０．５％スクロースおよび０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０）から添加された。

これは、初期の二日にわたって、８０％以上のｒｈＢＭＰ−２を放出した送達賦形剤の形成を生じる（図２に図示されている）。

（実施例５）
多相性放出プロファイルを有する生体インプラントの生成
当該実施例は、多相性放出プロファイルを有するｒｈＢＭＰ−２を放出する、ｒｈＢＭＰ−２を含む３ＰＳ−Ｆ１２７を形成する方法を例示する。

材料および方法
５ｍｇのキャリアあたり０、４．５５、または９．１μｇのｒｈＢＭＰ−２を含む３ＰＳキャリア（実施例１に記載の）は、調製され、エッペンドルフチューブに保存された。４５．５μｌのＦ１２７中に０、４．５５または９．１μｇのｒｈＢＭＰ−２を含む送達賦形剤（実施例４に記載のように調製された）は、エッペンドルフチューブ中に４℃で保存された。使用直前にＦ１２７は、３ＰＳキャリア上にピペットで移され、キャリアは、送達賦形剤に混合された。

次いで、この３ＰＳ−Ｆ１２７生体インプラントは、下記の、インビトロのＢＭＰ放出およびインビボの骨形成作用を測定するために使用された。

キャリアと送達賦形剤との比は、ゲル（１：１の比、ｖ：ｖ）またはパテ（２：１の比、ｖ：ｖ）を生成するために、変更され得る。さらに、ＢＭＰとキャリアまたは粒子サイズのキャリアとの比は、持続した放出プロファイルを変えるために、変更され得る。最後に、キャリアおよび送達賦形剤中のｒｈＢＭＰ−２の量は、続きの数週にわたって放出された量と比較した、最初の２、３時間にわたって初めに放出されたｒｈＢＭＰ−２の量を変えるために、変更され得る。

（実施例６）
生体インプラントからのＢＭＰ放出のためのインビトロアッセイ
本実施例は、実施例１から５に記載の種々の生体インプラントからのｒｈＢＭＰ−２放出を測定する方法を例示している。

材料および方法
実施例１から５で調製された、既知量のｒｈＢＭＰ−２を含む生体インプラントは、エッペンドルフチューブに移された。使用されたｒｈＢＭＰ−２の全量は、５ｍｇのキャリアおよび４５．５μｌのＦ１２７あたり、９．１μｇのｒｈＢＭＰ−２、または１０ｍｇのキャリア、１００μｌのＦ１２７に対し、２０μｇのｒｈＢＭＰ−２である。

次いで、サンプルは、３７℃で、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）＋１％ＢＳＡを含む放出緩衝液の１ｍｌ溶液での撹拌下で、インキュベートされた。緩衝液は、取り除かれ、種々の時間（例えば、１、２、５、７および１０日）後に、新しい放出緩衝液で交換された。回収された溶液は、さらなる分析のために、−２０℃において、１．５ｍｌバイアルで保存された。

緩衝溶液中に放出されたＢＭＰ−２の量は、業務用のＥＬＩＳＡ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎ^ＴＭ ｈＢＭＰ−２ ＥＬＩＳＡ，ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して計測された。ＥＬＩＳＡは、製造業者の説明書に従って、行われた。

結果
ＢＭＰは、ＢＭＰを導入しなかった、何れの生体インプラントから回収された放出緩衝液中にも、検出はされなかった。ｒｈＢＭＰ−２が導入されたキャリアサンプルは、調査の期間にわたって、ｒｈＢＭＰ−２の持続した放出を実証し、一方、送達賦形剤のみにおけるサンプルは、初期の放出プロファイルにおいて放出された。

キャリアおよび送達賦形剤が組み合わされた場合、種々の放出プロファイルは、どちらの成分にＢＭＰが導入されたかに従い、手に入れられた。１００％のｒｈＢＭＰ−２（９．１μｇ）が、３ＰＳ（５ｍｇ）キャリア中に導入され、次いで、これが、３３％Ｆ１２７（４５．５μｌ）と混合された場合、ＢＭＰ放出プロファイルは、初期の２日にわたって放出されたＢＭＰの量が５ｎｇ、３日目および５日目の間のそれは８ｎｇ、５日目および７日目の間のそれは１０ｎｇである、持続したパターンに一致した（図３；１００−０）。

１００％のｒｈＢＭＰ−２（９．１μｇ）が、３３％Ｆ１２７（４５．５μｌ）中に導入され、次いで、次いで、中にＢＭＰを有していなかった３ＰＳキャリア（５ｍｇ）と混合された場合、ＢＭＰは放出され、初期の１日目にわたって放出されたＢＭＰの量が２３６３ｎｇ、二日目にわたっては３８１ｎｇ、次いで３日目においては１２ｎｇであった（図３；０−１００）。

ＢＭＰがキャリアおよび送達賦形剤の間に分散された場合、生体インプラントは、ＢＭＰの持続した放出が後に続く、中間の初期の放出を有する二相性放出プロファイルを示した（図３；５０−５０）。

実施例７
放出されたＢＭＰの活性を検査するインビトロアッセイ
本実施例は、生体インプラントから放出されたｒｈＢＭＰ−２がその活性を維持するかどうかを決定する方法を記述する。放出されたｒｈＢＭＰは生物学的に活性があることを実証するために、感受性細胞は、放出物とともに培養され得て、成長因子へのこれらの反応は、計測された。このようなアッセイは、当該技術分野において、知られている（Ｐｅｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｒａｎｉｏｆａｃ．Ｓｕｒｇ．２００３，１４：２８４−２９１を参照すること）。

材料および方法
実施例１から５に記載の、ｒｈＢＭＰ−２有りまたは無しの材料は、調製された。放出物は、緩衝液が１５％ウシ胎児血清および抗生物質を含むアルファミニマルエッセンシャル培養液（ａＭＥＭ＋１５％ＦＢＳ＋ＡＢ）であったことを除いて、実施例３の記載のように調製された。

Ｃ２Ｃ１２細胞は、ウェルあたり０．５ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、１ｍｌ ａｌｐｈａ ＭＥＭ＋１５％ＦＢＳで、２４ウェル組織培養プレート中にまかれた。２４および７２時間の間の種々の期間後に、培養液は除かれ、種々の放出物は加えられた。ネガティブコントロールは、新しいａＭＥＭ＋１５％ＦＢＳ＋ＡＢで培養されたＣ２Ｃ１２細胞を含んだ。ポジティブコントロールは、２５、５０および１００ｎｇ／ｍｌ ｒｈＢＭＰ−２を含むａＭＥＭ＋１５％ＦＢＳ＋ＡＢでインキュベートされたＣ２Ｃ１２細胞を含んだ。４８時間後、細胞は、１ｍｌ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｅｌｌｙｔｉｃ Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中で溶解され、細胞溶解産物のアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性は、ｐａｒａ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｓｓａｙ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用し、計測された。溶解産物の細胞タンパク成分は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ）を使用し、計測され、それぞれのウェル中の細胞の数へ、ＡＬＰ活性を標準化するために使用された。

一般的に、キャリアまたは送達賦形剤に結合した場合、ＢＭＰの活性におけるロスがあったかどうか決定するために、キャリアまたは送達賦形剤が結合していなかった、ｒｈＢＭＰ−２基準のための、ＡＬＰ／ＰＴＮ結果の標準活性曲線は、決定される。放出物中の活性ｒｈＢＭＰ−２の濃度は、この標準曲線から、決定され得て、これは、ＥＬＩＳＡによって決定される、放出物中に存在するｒｈＢＭＰ−２の全量のパーセンテージとして表現される。

（実施例８）
多相性ＢＭＰインプラントの骨誘導活性の評価
本実施例は、インビボにおいて、生体インプラントを含むＢＭＰの骨誘導活性を決定する方法を記述する。骨形成を誘導する生体インプラントの能力を評価するために、マウス筋肉ポーチアッセイが使用された。このモデルにおいて、生体インプラントは、マウスの後脚に作られた筋肉ポーチに配置され、形成された誘導骨のサイズは、検査されたＢＭＰの量に比例している。このようなアッセイは、当該技術分野において、知られている（例えば、Ｂａｒｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒａｌ Ｓｕｒｇ．Ｏｒａｌ Ｍｅｄ．Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ．Ｏｒａｌ Ｒａｄｉｏｌ．Ｅｎｄｏｄ．，２０１０；１０９：５３１−４０．を参照すること）。

材料および方法
生体インプラントは、実施例１および５に記載されたように調製された。麻酔下において、両側のポーチは、鈍的な切開により、生後３７−４２日のオスのＣＤ−１マウスの後脚の腿筋に作られた。次いで、生体インプラントは、筋肉ポーチに入れられてあった無菌ゼラチンカプセルに入れられた。筋肉は、つなぎ合わせられ、皮膚は、ミッチェルクリップで閉じられた。

動物は、手術後２８日目に、安楽死させられた。後脚は、摘出され、１０％緩衝ホルマリンで固定された。固定化の後、標本は、マイクロＣＴスキャナー（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｅＸｐｌｏｒｅ^ＴＭ Ｌｏｃｕｓ ＳＰ）を使用して、イメージ化された。サンプルは、５９μｍの解像度で、業務用ソフトウエアを使用して、スキャンされ、再構成された。イメージ再構成の後、関心領域（ＲＯＩ）は決定された。この領域は、生体インプラント誘導骨を含むすべての領域を包含する。これらは、位置および密度に基づいて、骨格骨から簡単に区別される。

ＲＯＩ内の骨の量および質を分析するために、ｍＣＴイメージのボクセルは、骨の相および非骨の相に分割され、分割化は、ボクセルが骨としてみなされた、ボクセルグレースケールのための閾値を決定することにより、達成された。ＲＯＩの全量（ＴＶ）、骨量（ＢＶ）、全量のミネラル密度（ＴＶ−ＭＤ）、骨量のミネラル密度（ＢＶ−ＭＤ）、全量のミネラル成分（ＴＶ−ＭＣ）、骨量のミネラル成分（ＢＶ−ＭＣ）および骨量フラクション（ＢＶＦ）は、それぞれのサンプルで決定された。値は、キャリアによるカルシウムの存在のために、キャリアのみが選ばれたより高い閾値を使用することにより、そして、新しい骨に加えてキャリアを含めたより低い閾値を使用して得られた値からそれを引くことにより、調整された（Ｈｕｍｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｏｒａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｏｒａｌ Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｅｎｄｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ．２０１０．１０９：３７２−３８４を参考すること）。

マイクロＣＴ分析の完了後に、標本は、ｓｐｕｒｓ樹脂に包埋されたか、またはギ酸中で脱灰され、蝋に包埋された。樹脂に包埋されたサンプルは、後方散乱ＳＥＭによって評価され、一方、蝋に包埋されたサンプルは、カットされ、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色され、移植部位に存在する組織型を評価するために、光学顕微鏡で検査された。

結果
キャリアおよび送達賦形剤は、実施例５に記載されたように、組み合わされた。

マイクロＣＴ分析は、持続したＢＭＰ放出プロファイルを有した、３ＰＳキャリア中にすべてのＢＭＰを有する生体バイオプラントは、もっとも小さい骨片を生成し（図４、１００−０）、破裂ＢＭＰ放出プロファイルを有した、Ｆ１２７送達賦形剤中にすべてのＢＭＰを有する生体インプラントは、中間のサイズの骨片を生成した（図４、０−１００）、一方、多相性ＢＭＰ放出プロファイルを有した、キャリアに導入された５０％のＢＭＰおよび送達賦形剤に導入された５０％のＢＭＰを有する生体インプラントは、もっとも大きい骨片を生成した（図４、５０−５０）。

後方散乱ＳＥＭは、２８日目の骨が、生体インプラントを通して、ＰＬＧＡ中に含まれていたリン酸カルシウム粒子上に形成したことを示した（図５）。

組織像は、形成された組織が骨であったことを明らかにした（図６）。

（実施例９）
生体インプラントからのＢＭＰ放出のためのインビボアッセイ
本実施例は、動物への移植後の、実施例１、２、３、４または５に記載された、種々の生体インプラントからのｒｈＢＭＰ−２の放出を計測する方法を説明する。これを行う方法は、当該技術分野において、よく知られている。例えば、Ｕｌｕｄａｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ，４６，１９３‐２０２，１９９９を参照すること。

材料および方法
組み換えｈＢＭＰ−２は、Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒのＩｏｄｉｎｅ１２５で放射能標識される。放射能標識されたｒｈＢＭＰ−２（ホット）は、１：１００のホットコールド混合物を生成するために、標識されていないｒｈＢＭＰ−２（コールド）と混合される。

既知量のｒｈＢＭＰ−２を含む生体インプラントは、実施例１から５におけるように、調製される。次いで、これらの生体インプラントは、実施例８に記載の動物に移植される。種々の時点において、動物は、屠殺され、移植部位は、切り出された。次いで、切り出された組織は、重さを量られ、放射能の量は、ガンマカウンターを使用して、決定された。

カウントが、タンパク質に伴われているかどうかを決定するため、組織は、０．５ｍｌ ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ中で均質化される。２ｍｌの氷冷１０％トリクロロ酢酸は、ホモジェネートに加えられ、次いで、少なくとも１時間、４℃で保たれる。次いで、ホモジェネートは、遠心分離され、上清は、取り除かれる。次いで、沈殿物の放射能は、ガンマカウンターを使用して、計測される。

インプラントに結合した放射能は、減衰のために修正され、インプラントに残留しているＢＭＰの全量は見積もられる。

（実施例１０）
短期持続放出プロファイルを有するキャリアの生成
本実施例は、短期持続放出プロファイルを有する成長因子を放出するキャリアの生成方法を説明する。

材料および方法
マクロ孔質二相性リン酸カルシウム（ＢＣＰ）顆粒（エクリプス）は、Ｃｉｔａｇｅｎｉｘ（ケベック州ラヴァル、カナダ）から購入された。組み換えヒトＢＭＰ−２（ｒｈＢＭＰ−２、Ｉｎｄｕｃｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｉｎｃ）は、調合緩衝液（１．５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ４．５；５ｍｍグルタミン酸、２．５％グリシン、０．５％スクロースおよび０．０１％Ｔｗｅｅｎ^ＴＭ８０ｄｄＨ２Ｏ）中で調製された。

無菌ｒｈＢＭＰ−２溶液は、５ｍｇあたり９．１μｇまたは５ｍｇあたり４．５５μｇの比で（ＢＣＰあたりのＢＭＰ）、無菌ＢＣＰ顆粒とともに、振動下において、１５分間、インキュベートされた。次いで、サンプルは、無菌下で、凍結され、凍結乾燥された。

凍結乾燥後、キャリアは、５ｍｇの一定分量に量り分けられ、無菌エッペンドルフチューブに入れられた。いくつかのチューブは、３３％Ｆ１２７を有していた（４５．５μｌが添加された）。次いで、ＢＭＰ放出プロファイルは、実施例６に記載のように決定された。

結果
Ｆ１２７でコートされなかったキャリア（ＢＣＰ）は、最初の日にわたって放出された多量のＢＭＰをともない、次いで、その後の各々の時点において放出された、減少していくＢＭＰ量をともなう破裂放出プロファイルを示した。Ｆ１２７とＢＣＰの混合（ＢＣＰ−Ｐｏｌ）は、同量のＢＭＰが初期の４日にわたる各日において収集された、短期持続放出プロファイルを生じた（図７）。

（実施例１１）
キャリアの持続放出プロファイルの変更
本実施例は、キャリアからの放出プロファイルを変更する方法を説明している。

材料および方法
種々の固有の粘度および分子量を有するＰＬＧＡは、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｃ．（バーミングハム，アラバマ）から購入された。次いで、キャリアは、実施例１に記載のこれらのＰＬＧＡを使用し、作製された。これらのキャリアからのＢＭＰ放出プロファイルは、実施例６の方法に従って、決定された。

結果
すべてのキャリアは、持続した放出プロファイルを生じた。しかし、放出されたＢＭＰ量は、使用されたＰＬＧＡの粘度／分子量によって、異なった。低粘度ＰＬＧＡ（Ｐｏｌ−１）で作製されたキャリアは、調査の１２週間にわたって、高粘度（Ｐｏｌ−２）ＰＬＧＡを使用したキャリアよりも、より多くのｒｈＢＭＰ−２を放出した。

（実施例１２）
冷結乾燥中の結合および非結合タンパクの分布の変更
本実施例は、全タンパク成分および全キャリア成分は固定され続けるが、凍結乾燥される溶液量を変えることによる、キャリア粒子結合および非結合凍結乾燥物の間での、タンパクの分布を変更する方法を説明する。これは、後に、送達賦形剤が凍結乾燥容器に添加される場合、キャリア結合タンパクおよび送達賦形剤結合タンパクの間での、タンパク質の分布を可能にすることを意味する。

材料および方法
実験計画：凍結乾燥前にキャリアに添加されるタンパク質緩衝液の量を変えることが、凍結乾燥された材料の分布に有する効果を検査するために、キャリア量と液状タンパク量との比は、変更され、タンパク質（ウシ血清アルブミン、“ＢＳＡ”）およびキャリアの全量は、各々、１ｍｇおよび４００ｍｇに固定された。

上記基準に基づいて、調査は、表１に明記されたように計画された。ここで、添加されたタンパク質溶液量（例えば、２．０，１．５，１．０，０．７５および０．５ｍｌ／ｖｉａｌ）および添加されたタンパク質の濃度（例えば、０．５，０．６７，１．０，１．３３および２．０ｍｇ／ｍｌ）はさまざまである。

サンプル調製：ＢＳＡは、調合緩衝液（ＦＢ）中に、２ｍｇ／ｍｌ；１．５ｍｇ／ｍｌ；１ｍｇ／ｍｌ；０．７５ｍｇ／ｍｌ０．５ｍｇ／ｍおよび０ｍｇ／ｍｌで、調製された。４００ｍｇのキャリアは、ＢＳＡおよびＦＢを含むそれぞれのバイアルに入れられた。種々の量のタンパク質溶液は、表１に与えられた比で、それぞれのバイアルに入れられ、バイアルは、３０分間、室温で保たれた。次いで、バイアルは、凍結され、凍結乾燥された。凍結乾燥後、それぞれのバイアルは、調べられ、タンパク質凍結乾燥物の外観は、分類され、撮影された（図９Ａ−Ｃ）。

スコアづけ：タンパク質凍結乾燥物の分布は、０および４の間で、スコアづけされた。０は、はっきりと凍結乾燥物粒子が見えないことを意味し、４は、タンパク質乾燥物のシートとともにキャリアおよびタンパク質のはっきりした分離が見えることを意味する。

タンパク質測定：キャリアに結合したタンパク量および顆粒から分離して凍結された量を定量するために、凍結乾燥された材料は、バイアルから、遠心分離チューブに移し替えられ、１ｍｌのＰＢＳは、遠心分離チューブおよびバイアルに添加された。容器は、ボルテックスにかけられ、すすぎ溶液は、回収され、遠心分離された。上清は、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ−Ｐｌｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙを使用して、製造業者の説明書に従って、タンパク質成分を分析した。結合タンパクの量は、導入されたタンパク質の量（１０００μｇ）から、顆粒およびバイアルから放出されたタンパク質の量を引くことにより、計算された。

結果
もっとも低いタンパク質濃度を有したグループ１（例えば、０．５ｍｇ／ｍｌ）およびグループ３（１．０ｍｇ／ｍｌ）、４（１．３３ｍｇ／ｍｌ）および５（２．０ｍｇ／ｍｌ）の間には、凍結乾燥物の分布における有意差があった（表２）。グループ１におけるサンプルは、バイアルの壁に見えるいくつかのタンパク質凍結乾燥物を有していた（図９Ａ）。凍結乾燥物は、グループ１のサンプル中のキャリア粒子の間においては見えなかった。グループ３のサンプル中では、いくつかのタンパク質凍結乾燥物が、バイアルのガラスの壁に認識できた。しかしまた、白いまたは半透明の雪片に似ているタンパク凍結乾燥物の大きなかたまりは、グループ３サンプル中のキャリア粒子の間に認識できた（図９Ｂ）。グループ５サンプルにおいて、タンパク質の明瞭な縁が、ガラスのバイアルの表面上に形成した（図９Ｃ）。また、かたまりは、グループ５サンプル中のキャリア粒子間に横たわっているところが観察された。

グループ１対グループ５、グループ１対グループ４およびグループ１対グループ３は、すべて、有意に異なった。

結合タンパク質の測定は、凍結乾燥前に添加された溶液量に従って、結合タンパク質の量のあいだで、有意差があったことを、示した。具体的には、１ｍｇのタンパク質を送るために使用された溶液量が、４００ｍｇのキャリアあたり、０．５ｍｌから２ｍｌに変更された場合、結合タンパク質の量は、６８％から３９パーセントに変化した（表３、グループ１および５における結合タンパク質を、各々参照すること）。

結合タンパク質グループのポストホック分析は、グループ１およびグループ３、グループ１およびグループ４、グループ１およびグループ５；グループ２およびグループ４、グループ２およびグループ５；ならびにグループ３およびグループ５のあいだで、有意差があったことを、示した（表４）。

（実施例１３）
ＢＭＰ放出に対する、キャリア量およびＰ４０７量を変更することの効果。

本実施例は、使用された送達賦形剤量およびキャリア量を変更することによる、キャリアからのＢＭＰ放出プロファイルを変えるための方法を説明する。

材料および方法
実験計画：送達賦形剤量およびキャリア量を変更することがＢＭＰ放出プロファイルに有する効果を検査するため、キャリア（二相性リン酸カルシウム、ＢＣＰ）量および送達賦形剤（３３％Ｐ４０７ゲル）量は、生体インプラント中で変更された。ここで、キャリア粒子に添加されたＢＭＰ量は、４０μｇ／サンプルに固定され、ＢＭＰは、キャリア顆粒上に凍結乾燥された。調査計画は、表５に、さらに記述されている。

材料の調製：８０％β−リン酸三カルシウム、２０％ヒドロキシアパタイトを含む無菌マクロ孔質ＢＣＰ顆粒（直径０．５−１ｍｍ）は、Ｃｉｔａｇｅｎｉｘ Ｉｎｃ．（ケベック州ラヴァル）から購入された。ＢＭＰ−２（１ｍｇ／ｍｌ）は、Ｉｎｄｕｃｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｉｎｃによって調製された。３３％ポロキサマー４０７（Ｐ４０７）ゲルは、３３ｇのポロキサマー４０７（ＢＡＳＦ）を冷水に添加することにより、調製された。次いで、溶液は、加圧滅菌することにより、無菌化された。ポロキサマーゲルは、無菌化のあと、２−８℃に維持された。

ＢＭＰは、次のように、キャリア上に凍結乾燥された。キャリアの必要量は、重さを量られ、無菌エッペンドルフチューブに入れられた。所望のＢＭＰ−２量は、キャリアに添加され、凍結前に、３０分間室温で保たれた。凍結後すぐに、エッペンドルフチューブは、卓上凍結乾燥機に入れられ、一晩、凍結乾燥された。すべての手順は、無菌状態を維持するため、無菌下で行われた。

ＢＭＰ放出：凍結乾燥サンプルは重さが量られ、エッペンドルフチューブに入れられ、これに、Ｐ４０７ゲルは、添加され、２０分間、浸漬された。そのあと、１ｍｌ ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡは、各々のチューブに入れられ、次いで、これは、３７℃インキュベータ内のシェーカ上に置かれ、穏やかに振盪された。各々の収集時点（１、２、３、４、７日目）において、チューブは取り除かれ、遠心分離され、ＰＢＳ＋ＢＳＡは取り除かれ、新しいＰＢＳ＋ＢＳＡは添加された。次いで、収集されたＰＢＳ＋ＢＳＡは、分析されるまで、凍結保存された。

分析方法：溶液に放出されたＢＭＰ量は、製造業者の説明書に従って、ＢＭＰ−２ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）を使用して、決定された。

統計分析：データは、正規分散および等分散を検査された。等分散の正規分布データは、２Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ（キャリアおよびＰ４０７が、因子として使用された）を使用して、有意差を検査された。すべての別のデータは、ＡＮＯＶＡ ｏｎ ＲＡＮＫｓを使用して、検査された。ポストホックテストは、スチューデント−ニューマン−クルーズの方法を使用して、すべてペアワイズで、実行された。すべての統計的検定は、Ｓｉｇｍａ Ｓｔａｔ ｖ３．５を使用して、実行された。

結果
Ｐ４０７の添加は、７日までのあいだ、ＢＭＰの放出を遅くさせた。Ｐ４０７ゲルは、以前に、わずか数時間だけのあいだ薬剤放出を遅くすること（その後、薬剤は緩衝溶液中に分散してしまった）に効果的であることが、報告されたため、これは、驚きの結果であった。Ｐ４０７の量は、初期の７日にわたって、ＢＭＰ放出に影響した。４日目から、最初に使用されたＰ４０７の量は、Ｐ４０７無しのグループおよびＰ４０７を足したグループのあいだの差異の有無を決定する（表６）。存在するキャリア量は、放出されるＢＭＰ量を減少させるキャリア量を増加させることで、Ｐ４０７の存在下または非存在下におけるＢＭＰ放出に影響を与えた（表６）。

１日目のデータは、Ｐ４０７が存在する場合より、Ｐ４０７の非存在下においてキャリアから放出されたＢＭＰは、有意に、より多かったことを示した（表８）。

キャリアのみの量は、１日目においてＢＭＰ放出に強い影響を与えると考えられなかったので、キャリア量およびＰ４０７量のあいだに相互作用があった。具体的に２０ｍｇキャリアにおいて、使用したＰ４０７ゲル量は、ＢＭＰ放出に、有意に影響を与えた（３０ｖ１２０および３０ｖ６０）。一方、４０ｍｇまたは８０ｍｇのキャリアを有するサンプル中では、これは観察されなかった（表８）。

２日目のデータは、キャリア量およびＰ４０７量の両方が、相互作用が発生することで、有意に、ＢＭＰ放出に強い影響を与えたことを、示した（表９）。効果に必要とされたＰ４０７の量は、キャリアの量に依存した。

３日目の結果は、キャリア量がＢＭＰ放出に影響をあたえた主要な因子であったことを、示した。ところが、Ｐ４０７ゲル量は、いくつかのグループにおいて、有意性に近づいた（表１０）。

４日目の結果は、２つのあいだで相互作用はないと思われたが、キャリア量およびＰ４０７ゲル量が、ＢＭＰ放出に影響を与えたことを示した。（表１１）。３０μｌのゲルが使用された限りは、Ｐ４０７ゲルの量において、差異はなかった。ＢＭＰ放出は、使用された、３つすべてのキャリア量のあいだで、異なった（表１１）。

７日目の結果は、キャリア量およびＰ４０７ゲル量の両方がＢＭＰ放出に影響を与えることが、４日目の結果に類似していた（表１２）。ところが、この時に、インプラントあたり、最小量の６０μｌ Ｐ４０７ゲルが使用されなければならない。

考察
まとめると、これらの結果は、使用されるＰ４０７の量およびキャリアの量を変更することにより、ＢＭＰの放出プロファイルを変えることが可能であることを、示す。また、これらの結果は、２、３時間の期間にわたった薬剤送達のためにＰ４０７を使用することの従前報告と反対に、キャリアとのコンビネーションにおけるＰ４０７ゲルの使用は、７日目までのあいだに、タンパク質放出の阻害を生じることを、示す。Ｐ４０７の大部分が初期の数時間において溶解したあと、Ｐ４０７ゲルの薄膜が、キャリアの表面上に残留し、タンパク質放出の速度を遅めていると、本明細書においては考えられている。

（実施例１４）
異なるキャリア粒子からのインビトロタンパク質放出の評価
本実施例は、ｒｈＢＭＰ−２が凍結乾燥された無水硫酸カルシウム（ＣＳＤ）粒子を含む生体インプラントを説明する。これらの生体インプラントは、キャリアとして２タイプのリン酸カルシウム粒子を含む生体インプラントと比較して、１４日間にわたって、より大きくより一定のＢＭＰ放出を生み出す。

材料および方法
実験計画：３つのキャリアが検査された：生体インプラント中の硫酸カルシウム二水和物（ＣＳＤ）、ヒドロキシアパタイト（ＨＡｐ）および二相性リン酸カルシウム（ＢＣＰ）、ここで、ＢＭＰとキャリアとの比は４０μｇ：２０ｍｇであり、キャリアと送達賦形剤（例えば、Ｐ４０７）は、２００μｌ：２０ｍｇ、であり、ここで、ＢＭＰは、キャリア顆粒上に凍結乾燥された。実験計画は、表１３において、さらに示されている。

材料の調製：８０％β−リン酸三カルシウム、２０％ヒドロキシアパタイトを含む無菌マクロ孔質ＢＣＰ顆粒（直径０．５−１ｍｍ）は、Ｃｉｔａｇｅｎｉｘ Ｉｎｃ．（ケベック州ラヴァル）から購入された。無菌ＣＳＤ顆粒（０．５−１．２ｍｍ）は、Ｏｓｔｅｏｓｅｔ ｐｅｌｌｅｔｓ（Ｗｒｉｇｈｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｎａｄａ Ｌｔｄ．，ミシソーガ，オンタリオ州）を粉砕し、１．１８ｍｍのふるいおよび０．５ｍｍのふるいのあいだで分けられることにより、調製された。無菌ヒドロキシアパタイト顆粒は、Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（トロント、オンタリオ州）から入手された。ＢＭＰ−２（１ｍｇ／ｍｌ）は、Ｉｎｄｕｃｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｉｎｃによって調製された。３３％ポロキサマー４０７（Ｐ４０７）ゲルは、冷水に３３ｇのポロキサマー４０７（ＢＡＳＦ）を添加することにより、調製された。次いで、溶液は、加圧滅菌することにより、無菌化された。ポロキサマーゲルは、加圧滅菌後、２−８℃で保存された。

キャリア粒子上へのＢＭＰ凍結乾燥：キャリアの必要量は、重さが量られ、無菌エッペンドルフチューブに入れられた。ＢＭＰ−２の所望の量は、キャリアに添加され、凍結前に、３０分間室温で保たれた。凍結後すぐに、エッペンドルフチューブは、卓上凍結乾燥機に入れられ、一晩、凍結乾燥された。すべての手順は、無菌状態を維持するため、無菌下で行われた。

インビトロＢＭＰ放出：８０μｌのＰ４０７ゲルは、キャリアおよび結合ｒｈＢＭＰ−２に添加され、２０分間浸漬させた。その後、１ｍｌ ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡは、各々のチューブに添加され、次いで、３７℃のインキュベータ内のシェーカ上に置かれ、穏やかに振盪された。それぞれの収集時点（１、２、３、４、７、１０および１４日目）において、チューブは、取り除かれ、遠心分離され、ＰＢＳ＋ＢＳＡは取り除かれ、新しいＰＢＳ＋ＢＳＡが添加された。次いで、収集されたＰＢＳ＋ＢＳＡは、分析されるまで、凍結保存された。

分析方法：溶液中に放出されたＢＭＰの量は、製造業者の説明書に従って、ＢＭＰ−２ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）を使用して決定された。

統計分析：データは、正規分散および等分散を検査された。等分散の正規分布データは、ＡＮＯＶＡを使用して、有意差を検査された。すべての別のデータは、ＡＮＯＶＡ ｏｎ ＲＡＮＫｓを使用して、検査された。ポストホックテストは、スチューデント−ニューマン−クルーズの方法を使用して、すべてペアワイズで、実行された。すべての統計的検定は、Ｓｉｇｍａ Ｓｔａｔ ｖ３．５を使用して、実行された。

結果
ポストホックテストは、硫酸カルシウムキャリア粒子が、検査されたすべての時点において、ＢＣＰキャリア粒子より、より多くのＢＭＰを放出したことを、示していた（表１４）。また、ＣＳＤキャリア粒子は、１日目、２日目、７日目において、Ｈａｐキャリア粒子より、より多くのＢＭＰを放出した。ＨＡｐキャリア粒子からのＢＭＰ放出は、７日目および１０日目において、ＢＣＰからとは異なった。

考察
これらの結果は、ＣＳＤキャリア粒子は、検査された別のキャリア粒子より、１４日間にわたった合計および３日目を除いたすべての時点において、より多くのＢＭＰ−２を放出した。

（実施例１５）
多相性ＢＭＰ生体インプラント中に使用される、既知のキャリアに比較して、インビボにおける、改善された有効性を有するＢＭＰキャリアの生成。

本実施例は、多相性生体インプラントの一部として使用された場合において、どれがもっとも多くの骨を生成するかを決定する、種々のキャリア成分の評価を、説明する。この実施例において、“改善された骨成長”または“骨片形成のための改善された能力”は、同じＢＭＰを含む既知のキャリアのそれに比較した、骨片サイズおよび／または骨片密度の増加を言及する。この調査の結果は、ｒｈＢＭＰ−２が乾燥凍結されたＣＳＤ粒子を使用した生体インプラントが、移植された場合、ヒドロキシアパタイトキャリアまたは二相性リン酸カルシウムキャリアを含む生体インプラントより、より大きな骨片を生じたことを、示す。

材料および方法
実験計画：比較的、高い骨生成能力を有するキャリアを特定するため、硫酸カルシウム二水和物（ＣＳＤ）、ヒドロキシアパタイト（ＨＡｐ）および二相性リン酸カルシウム（ＢＣＰ）は、生体インプラント中で、検査された。ここで、ＢＭＰ量とインプラント量との比は、４０μｇ：２０ｍｇに固定され、キャリアと送達賦形剤（例えば、Ｐ４０７）との比は、２００μｌ：２０ｍｇに固定され、ＢＭＰは、キャリア顆粒上に凍結乾燥された。実験計画は、表１５にさらに示されている。

材料の調製：８０％β−リン酸三カルシウム、２０％ヒドロキシアパタイトを含む無菌マクロ孔質ＢＣＰ顆粒（直径０．５−１ｍｍ）は、Ｃｉｔａｇｅｎｉｘ Ｉｎｃ．（ラヴァル、ケベック州）から購入された。無菌ＣＳＤ顆粒（０．５−１．２ｍｍ）は、Ｏｓｔｅｏｓｅｔ ｐｅｌｌｅｔｓ（Ｗｒｉｇｈｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｎａｄａ Ｌｔｄ．、ミシソーガ，オンタリオ州）を粉砕し、１．１８ｍｍのふるいおよび０．５ｍｍのふるいのあいだで分けられることにより、調製された。無菌ヒドロキシアパタイト顆粒は、Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（トロント、オンタリオ州）から入手された。ＢＭＰ−２（１ｍｇ／ｍｌ）は、Ｉｎｄｕｃｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｉｎｃによって、調製された。３３％ポロキサマー４０７（Ｐ４０７）ゲルは、冷水に３３ｇのポロキサマー４０７（ＢＡＳＦ）を添加することにより、調製された。次いで、溶液は、加圧滅菌することにより、無菌化された。ポロキサマーゲルは、加圧滅菌後、２−８℃で保存された。ＢＭＰは、次のように、キャリア上に凍結乾燥された：キャリアの必要量は、重さが量られ、無菌エッペンドルフチューブに入れられた。ＢＭＰ−２の所望の量は、キャリアに添加され、凍結前に、３０分間室温で保たれた。凍結後すぐに、エッペンドルフチューブは、卓上凍結乾燥機に入れられ、一晩、凍結乾燥された。すべての手順は、無菌状態を維持するため、無菌下で行われた。

外科モデル：種々の生体インプラントの骨誘導性は、マウス筋肉ポーチアッセイ（Ｂａｒｒ ｅｔ ａｌ．Ｏｒａｌ Ｓｕｒｇ．Ｏｒａｌ Ｍｅｄ．Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ Ｏｒａｌ Ｒａｄｉｏｌ．Ｅｎｄｏｄ．２０１０；１０９（４）：５３１−４０）において、評価された。

ポロキサマーがキャリアと混合されることになっていたサンプルは、無菌ステンレススチールトレイ上に、キャリア顆粒を注ぐことにより、調製された。ポロキサマーは、氷上に保存され、適量のポロキサマーゲルは、ピペットにより、キャリア顆粒に加えられた。キャリアおよびゲルは、混合され、次いで、ゼラチンカプセルに注意深く入れられ、次いで、これは、筋肉ポーチに入れられた。

オスのＩＧＳマウス（おおよそ２２ｇｍ）は、鈍的切開によって、これらの大腿二頭筋に形成された筋肉内のポーチを有する。次いで、生体インプラントは、ポーチに入れられた。次いで、皮膚は、引き合わせられ、ミッチェルクリップを使用して閉じられた。

マウスは、毎日モニターされた。あらかじめ、マウスは、２８日後に安楽死させられることになっていた。ところが、インプラントは、ブリッジングが脊椎骨および大腿骨のあいだで発生し、それがマウスの動きを制限するほど、多量の骨を形成するため、すべてのマウスは、１８日後に屠殺された。動物の屠殺後、後ろ脚は、切除され、中性の緩衝ホルマリンを使用して、固定された。

分析方法：生体インプラントによって形成された骨量は、マイクロＣＴによって決定された。適正値は、以前に記載された、残留キャリアからのカルシウムの存在のために、調整された（Ｈｕｍｂｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｏｒａｌ Ｓｕｒｇ． Ｏｒａｌ Ｍｅｄ Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ．Ｏｒａｌ Ｒａｄｉｏｌ．Ｅｎｄｏｄ．２０１０ Ｍａｒ；１０９（３）：３７２−８４）。簡単に説明すると、インプラントが配置された領域は、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｅＸｐｌｏｒｅ^ＴＭ Ｌｏｃｕｓ ＳＰマイクロＣＴスキャナーを使用して、イメージ化された。残留キャリア、および筋肉内のインプラントのまわりに形成されたどんな新しいかたまり（集団的に呼ばれると、骨片）でも、関心領域（ＲＯＩ）を明確にするために、１０スライスごとにアウトライン化された。

キャリア物質は、新しい骨よりも、より密度が高かった。それゆえ、各々のグループから多数のサンプルをイメージ化して、グレースケール値の平均をとることにより、新しい骨およびキャリアの閾値を別々に決定することが可能だった。標準化の目的のために、ある物質（例えば、ＣＳＤ）のために得られた、もっとも低いキャリア閾値が、すべてのキャリアに使用された（例えば、１８３５）。同様に、新しい骨のための共通の値が、使用された（例えば、５５５）。

分析は、２つの閾値を使用して、実行された（例えば、１８３５および５５５）。上限閾値は、骨および軟組織からキャリアを区別し、一方、下限は、軟組織から骨＋キャリアを区別した。下限閾値から上限閾値を引くことにより、骨のみのための値が決定された。７つの異なるパラメーターは、マイクロＣＴを使用して、測定された。表１６は、マイクロＣＴから直接得られたパラメーター、および、結果に大きな影響を与えた任意の閾値化を説明する。表１７は、派生パラメーターおよびこれらの計算方法を説明する。

骨誘導活性を決定するために使用された、２つの基準は、全量（ＴＶ）および調整骨量（ａＢＶ）であった。

組織像：マイクロＣＴ分析の後、サンプルは、脱灰され、光学顕微鏡のために加工された。

統計分析：マイクロＣＴパラメーターは、正規分散および等分散を検査された。等分散の正規分布データは、ＡＮＯＶＡを使用して、有意差を検査された。すべての別のデータは、ＡＮＯＶＡ ｏｎ ＲＡＮＫｓを使用して、検査された。ポストホックテストは、スチューデント−ニューマン−クルーズの方法を使用して、すべてペアワイズで、実行された。すべての統計的検定は、Ｓｉｇｍａ Ｓｔａｔ ｖ３．５を使用して、実行された。

結果
キャリアの比較：マイクロＣＴの結果は、ＣＳＤキャリアは、全量において、リン酸カルシウムを基にしたキャリアのどちらよりも、より大きな骨片を生成したことを、示していた（表１８）。また、ＣＳＤ骨片は、リン酸カルシウム含有キャリアのどちらよりも、さらに新しい骨を含む傾向があった（表１９）。

ポストホックテスト：全対多重比較法（スチューデント−ニューマン−クルーズの方法）。ＣＳＤ ｖｓ ＨＡｐ（Ｐ＜０．０５）；ＣＳＤ ｖｓ ＢＣＰ （Ｐ＜０．０５）； ＨＡｐ ｖｓ ＢＣＰ（有意差なし）

組織像：組織像評価は、すべての生体インプラントで、骨片が、主に、骨、軟骨および軟組織を囲う骨の外殻を含んでいたことを、示していた。どのインプラントにおいても、炎症の兆候はなかった。

残留リン酸カルシウム顆粒は、ＢＣＰまたはＨＡｐを含む生体インプラント中で、認識できた一方、ＣＳＤは、ＣＡＳ顆粒が少し見えるだけで、急速に再吸収されるように思われる。

これらの結果は、ＢＭＰ−２がＣＳＤキャリア上に凍結乾燥された場合、ＣＳＤ−Ｐ４０７生体インプラントが、ＢＭＰ−２が凍結乾燥された別のキャリアよりも、より多くの骨を含む、より大きな骨片を生成したことを、示している。

（実施例１６）
ＢＭＰがキャリア上にのみある生体インプラントに比較して、キャリア上および送達賦形剤中の両方にＢＭＰを分散することによって、向上した効能を有する生体インプラントの生成。

本実施例は、マウス筋肉ポーチアッセイにおける、ＡＣＳに比較して骨生成を改善するであろう、個々における、そして、混合物として、ＢＭＰのキャリアとしての硫酸カルシウムおよびリン酸カルシウムの評価を説明する。このアッセイにおいて、送達賦形剤（例えば、Ｐ４０７）に比較した、ＢＭＰとキャリアとの好ましい比、および硫酸カルシウムと二相性リン酸カルシウムとの好ましい比が、決定される。

材料および方法
実験計画：比較的高い骨生成能力を有するキャリアを特定するために、１：０、３：１、１：１および０：１の比の脱水硫酸カルシウム（ＣＳＤ）および二相性リン酸カルシウム（ＢＣＰ）の混合物が、検査された。さらに、キャリア上のＢＭＰとＦ１２７送達賦形剤中のＢＭＰとの比が、１００：０、９０：１０および７０：３０の比のように変更され、ＣＳＤ：ＢＣＰは検査された。各々の変数は、生体インプラント中で検査され、ここで、キャリアとＦ１２７との比は３０：４５であり、＜１ｍｇ／ｃｃの目標に従って、ＢＭＰ量とインプラント量との比は４０μｇ：〜５０μｌであった。実験計画は、さらに、表２０において示されている。

材料の調製：８０％β−リン酸三カルシウム、２０％ヒドロキシアパタイトを含む無菌マクロ孔質ＢＣＰ顆粒（直径０．５−１ｍｍ）は、Ｃｉｔａｇｅｎｉｘ Ｉｎｃ．（ラヴァル、ケベック州）から購入された。無菌ＣＳＤ顆粒（０．５−１．２ｍｍ）は、Ｏｓｔｅｏｓｅｔ ｐｅｌｌｅｔｓ（Ｗｒｉｇｈｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃａｎａｄａ Ｌｔｄ．、ミシソーガ，オンタリオ州）を粉砕し、１．１８ｍｍのふるいおよび０．５ｍｍのふるいのあいだで分けられることにより、調製された。Ｉｎｆｕｓｅ（登録商標）キットは、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ ｏｆ Ｃａｎａｄａ Ｌｔｄから購入された。注入ＢＭＰ−２は、Ｉｎｆｕｓｅ(登録商標)キット中の凍結ｒｈＢＭＰ−２パウダーへの注入のための水を添加することにより、調製された。ＡＣＳスポンジは、おおよそ５×５ｍｍのピースにカットされ、エッペンドルフカプセルに入れられた。

誘導ＢＭＰ−２（１ｍｇ／ｍｌ）は、Ｉｎｄｕｃｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｉｎｃによって、調製された。３３％ポロキサマー４０７（Ｐ４０７）ゲルは、冷水に３３ｇのポロキサマー４０７（ＢＡＳＦ）を添加することにより、調製された。次いで、溶液は、加圧滅菌することにより、無菌化された。ポロキサマーゲルは、無菌化のあと、２−８℃に維持された。

ＢＭＰは、次のように、キャリア上に凍結乾燥された。キャリアの必要量は、重さが量られ、無菌エッペンドルフチューブに入れられた。ＢＭＰ−２の所望の量は、キャリアに添加され、凍結前に、３０分間室温で保たれた。凍結後すぐに、エッペンドルフチューブは、卓上凍結乾燥機に入れられ、一晩、凍結乾燥された。すべての手順は、無菌状態を維持するため、無菌下で行われた。ＢＭＰ−Ｐ４０７サンプルは、所望の濃度でＢＭＰにＢＭＰ−２を添加することにより、無菌エッペンドルフチューブ内で、大量に調製された。手術時において、Ｐ４０７の適当量は、チューブからピペットで吸い出した。

手術方法：実施例１５に示されているとおり。

分析方法：マイクロＣＴおよび組織像分析は、実施例１５に示されているとおり。

統計分析：ＡＣＳのみでは、測定され得た骨片を形成しなかったため、これらは、統計分析に含めなかった。

マイクロＣＴパラメーターは、正規分散および等分散を検査された。等分散の正規分布データは、ＡＮＯＶＡを使用して、有意差を検査された。すべての別のデータは、ＡＮＯＶＡ ｏｎ ＲＡＮＫｓを使用して、検査された。ポストホックテストは、スチューデント−ニューマン−クルーズの方法を使用して、すべてペアワイズで、実行された。すべての統計的検定は、Ｓｉｇｍａ Ｓｔａｔ ｖ３．５を使用して、実行された。

結果
キャリア顆粒およびＰ４０７ゲルのあいだでＢＭＰを分散させることの効果：ＢＭＰは、Ｐ４０７ゲルおよびＣＳＤ顆粒のあいだで、分散された場合、これは、すべてのＢＭＰがＣＳＤ上に凍結乾燥された場合よりも、より大きな骨片を生成した（全骨量）。（グループ３ａ＞グループ２ａ）（表２２）。

２：１のＣＳＤ−ＢＣＰ顆粒を使用した場合において、７０％が顆粒上に凍結乾燥され、３０％がＰ４０７中にあった場合、次いで、９０％が凍結乾燥され、１０％がゲル中にあった場合、より多くの骨が形成された（全骨量）。（グループ５ａ＞グループ７ａ）（表２２）。

ＢＣＰ顆粒ではなくＣＳＤを使用することの効果：顆粒およびＰ４０７のあいだで、ＢＭＰの同様な分布を有するグループにおいて、私達は、ＣＳＤ顆粒の使用が、ＢＣＰよりも、より大きな骨片を生成することを発見した（全骨量）（Ｇｐ３ａ＞Ｇｐ４ａ）（表２０）。ＣＳＤが、比において５０％より多く、ＢＣＰグループと混合された場合、この比のＣＳＤは、より大きな骨片を形成した（グループ３ａ（１００ＣＳＤ）＞５ａ（６７％ＣＳＤ）＞グループ７ａ（５０％ＣＳＤ）＝４ａ（０％ＣＳＤ）（全骨量）（表２２）。

顆粒およびＰ４０７ゲルのあいだでＢＭＰを分散させることの効果：ＢＭＰが、Ｐ４０７ゲルおよびＣＳＤ顆粒のあいだに分散された場合、これは、すべてのＢＭＰがＣＳＤ上に凍結乾燥された場合よりも、より多くの骨を生成した（調整骨量）（Ｇｐ３ａ＞Ｇｐ２ａ）（表２４）。

ＢＣＰ顆粒ではなくＣＳＤを使用することの効果：顆粒およびＰ４０７のあいだで、ＢＭＰの同様な分布を有するグループにおいて、私達は、ＣＳＤ顆粒を使用することが、ＢＣＰよりも、より大きな骨片を生成したことを発見した（調整骨量）（Ｇｐ３ａ＞Ｇｐ４ａ）（表２４）。ＣＳＤが、５０％より多く、ＢＣＰグループと混合された場合、この比のＣＳＤは、より大きな骨片を形成した（調整骨量）（Ｇｐ３ａ（１００ＣＳＤ）＞５ａ（６７％ＣＳＤ）＞４ａ（０％ＣＳＤ）（表２４）。

組織像評価は、すべての生体インプラントで、骨片が、主に、骨、軟骨および軟組織を囲う骨の外殻を含んでいたことを、示していた。どのインプラントにおいても、炎症の兆候はなかった。

残留リン酸カルシウム顆粒は、ＢＣＰを含む誘導生体インプラント中で、認識できた一方、硫酸カルシウムは、ＣＡＳ顆粒が少し見えるだけで、急速な再吸収をうけていると思われる。ＣＡＳ顆粒およびＢＣＰ顆粒の上および中に直接、骨が形成していることが見られた（図１０Ａ−Ｂ）。

考察
この調査からの結果は、ＢＭＰが、キャリア顆粒上に乾燥凍結されること、およびＰ４０７ゲル中に混合されることの中間で、分散された場合、（多相性ＢＭＰ放出を生じる分布）すべてのＢＭＰが、顆粒上に凍結乾燥され、後の手術時にＰ４０７ゲルと混合された場合より、より多い骨を有する、より大きい骨片が生成したことを示している。

顆粒およびＰ４０７ゲルのあいだの７０／３０分布は、顆粒およびＰ４０７ゲルのあいだの９０／１０分布よりも、より多くの骨を有する、より大きな骨片を生成した。

顆粒およびＰ４０７のあいだでＢＭＰの等しい分布を有するグループにおいて、ＣＳＤ顆粒は、ＣＳＤ生成骨片が、多孔性であるために、より大きな表面面積を有するにもかかわらず、類似したサイズのＢＣＰ顆粒より、より多くの骨を有する、より大きな骨片を生成した（ＢＣＰ顆粒は固体であった。）。ＣＳＤが、少なくとも６７％で、ＢＣＰ生体インプラントと混合され得る場合、ＣＳＤ顆粒は、５０％またはより少ないＣＳＤ顆粒を有するそれらより、より大きい骨片を生成した。

図１は、本発明のキャリアによって示された持続した放出プロファイルを図示する。 図２は、本発明の送達賦形剤によって示された初期の放出プロファイルを図示する。 図３は、送達賦形剤およびキャリア中の成長因子の量に基づいた、異なった放出プロファイルを図示する。多相性放出プロファイルは、成長因子が送達賦形剤およびキャリアの両方（５０−５０）に取り込まれる場合、観察される。 図４は、生体インプラントのインビボ活性を図示している。ここで、成長因子は、本発明の方法に従って図３に示されたように放出される。 図５は、本発明の方法に従って生産された生体インプラントをマウスに移植した場合における、リン酸カルシウム粒子（ＣａＰ）上への新しい骨（「骨」）の形成を図示している。 図６は、本発明の方法に従って生産された生体インプラントをマウスに移植した場合における、キャリア（「キャリア」）上に形成された新しい骨（「骨」）の組織像外観を図示している。 図７は、本発明の方法に従い生産されたキャリアによって生じた、短期持続成長因子放出プロファイルを図示している。 図８は、持続した放出プロファイルが、本発明の方法に従って生産されたキャリアの特性を変化させることにより、変更され得る方法を図示している。 図９Ａ−Ｄは、凍結乾燥されたキャリアを図示している。ここで、凍結乾燥された溶液量は変更されたが、凍結乾燥された全タンパク量は固定された。治療グループ１（Ａ）、３（Ｂ）および５（Ｃ）が、描写される。 図１０Ａ−Ｂは、本発明の方法に従って生産された生体インプラント中に使用されたリン酸カルシウム（Ａ）および硫酸カルシウム（Ｂ）キャリア成分周辺に形成された、新しい骨の組織像外観。

Claims (90)

1. ａ）少なくとも１つの成長因子を含むキャリアであって、上記キャリアは、持続した放出プロファイルにおいて、上記少なくとも１つの成長因子を放出することに適しており、上記キャリアは、これらの表面上に、上記少なくとも１つの成長因子を含む複数の粒子を含み、そして、上記複数の粒子は、硫酸カルシウム二水和物を含む、キャリア；および
   ｂ）送達賦形剤
   を含む、治療部位における、少なくとも１つの成長因子の放出のためのシステム。
2. 上記キャリアは、さらに、リン酸カルシウム粒子を含む、請求項１に記載のシステム。
3. 硫酸カルシウム二水和物とリン酸カルシウム粒子との比は、おおよそ１：１または２：１である、請求項２に記載のシステム。
4. 上記送達賦形剤は、ポリマーを含む、請求項１に記載のシステム。
5. 上記ポリマーは、逆相ポリマーまたはブロックコポリマーである、請求項４に記載のシステム。
6. 上記ポリマーは、ポロキサマーである、請求項５に記載のシステム。
7. 上記ポリマーは、ポロキサマー４０７である、請求項６に記載のシステム。
8. 上記少なくとも１つの成長因子は、骨形態形成タンパク（ＢＭＰ）、形質転換成長因子ベータ、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）または血管内被成長因子（ＶＥＧＦ）である、請求項１〜７の何れか一項に記載のシステム。
9. 上記少なくとも１つの成長因子は、ＢＭＰである、請求項８に記載のシステム。
10. 上記少なくとも１つの成長因子は、ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−７である、請求項９に記載のシステム。
11. ｉ）上記送達賦形剤が、第一期間にわたった、持続した放出プロファイルにおいて、少なくとも１つの第一成長因子を放出することに適しており；かつ
    ｉｉ）上記キャリアは、第二期間にわたった、初期の放出プロファイルにおいて、少なくとも１つの第二成長因子を放出することに適している、請求項１〜１０の何れか一項に記載のシステム。
12. 上記第一期間は、数時間または数日間を含む、請求項１１に記載のシステム。
13. 上記第二期間は、数日間または数週間を含む、請求項１１または１２に記載のシステム。
14. 上記少なくとも１つの第一成長因子および上記少なくとも１つの第二成長因子は、同一である、請求項１１〜１３の何れか一項に記載のシステム。
15. 上記少なくとも１つの第一成長因子および上記少なくとも１つの第二成長因子は、異なる、請求項１１〜１３の何れか一項に記載のシステム。
16. 上記第一および第二成長因子は：血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内被成長因子（ＶＥＧＦ）、骨形態形成タンパク（ＢＭＰ）、形質転換成長因子ベータ、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）または繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）である、請求項１１〜１５の何れか一項に記載のシステム。
17. 上記少なくとも１つの第一および第二成長因子の少なくとも１つは、ＢＭＰである、請求項１６に記載のシステム。
18. 上記少なくとも１つの第一および第二成長因子の少なくとも１つは、ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−７である、請求項１７に記載のシステム。
19. 上記キャリアは、上記少なくとも１つの成長因子の全量の１００％を送達する、請求項１〜１８の何れか一項に記載のシステム。
20. 上記キャリアは、上記少なくとも１つの成長因子の全量の少なくとも７０％を送達し、上記送達賦形剤は、上記少なくとも１つの成長因子の全量の少なくともおおよそ１０％を送達する、請求項１〜１８の何れか一項に記載のシステム。
21. 上記キャリアは、上記少なくとも１つの成長因子の全量のおおよそ７０％を送達し、上記送達賦形剤は、上記少なくとも１つの成長因子の全量のおおよそ３０％を送達する、請求項１〜１８または２０の何れか一項に記載のシステム。
22. 上記送達賦形剤とキャリアとの比は、おおよそ０．５−４：１である、請求項１〜２１の何れか一項に記載のシステム。
23. 上記送達賦形剤量は、おおよそ０．５および１０．０ｍｌの間にある、請求項２２に記載のシステム。
24. 上記送達賦形剤量は、１．０ｍｌであり、上記キャリア量は、おおよそ０．５ｃｍ^３である、請求項２３に記載のシステム。
25. 上記キャリアと結合した上記少なくとも１つの成長因子は、液体として上記キャリアに添加され、次いで、当該キャリア上に凍結乾燥される、請求項１〜２４の何れか一項に記載のシステム。
26. 上記キャリアと結合した上記少なくとも１つの成長因子、液体、およびキャリアは、おおよそ１：１：０．５の比である、請求項２５に記載のシステム。
27. 上記キャリアと結合した１．０ｍｇの上記少なくとも１つの成長因子は、おおよそ０．５ｃｃの上記キャリア上に共に凍結乾燥される１．０ｍｌの上記液体に、添加される、請求項２６に記載のシステム。
28. 請求項１から２７の何れか一項に記載の上記成長因子放出システムを含む、生体インプラント。
29. キャリアによって少なくとも１つの成長因子を送達することであって、上記キャリアは、持続した放出プロファイルにおいて、上記少なくとも１つの成長因子を放出することに適しており、上記キャリアは、複数の粒子を含み、上記複数の粒子は、硫酸カルシウム二水和物を含む、送達すること；および
    送達賦形剤と共に、キャリア
    を送達すること、を含む、少なくとも１つの成長因子を放出する方法。
30. 上記キャリアは、さらに、リン酸カルシウム粒子を含む、請求項２９に記載の方法。
31. 硫酸カルシウム二水和物とリン酸カルシウム粒子との比は、おおよそ１：１または２：１である、請求項３０に記載の方法。
32. 上記少なくとも１つの成長因子は：血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内被成長因子（ＶＥＧＦ）、骨形態形成タンパク（ＢＭＰ）、形質転換成長因子ベータ、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）または繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）である、請求項２９〜３１の何れか一項に記載の方法。
33. 上記少なくとも１つの成長因子は、ＢＭＰである、請求項３２に記載の方法。
34. 上記少なくとも１つの成長因子は、ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−７である、請求項３３に記載の方法。
35. 上記送達賦形剤とキャリアとの比は、おおよそ０．５−４：１である、請求項２９〜３４の何れか一項に記載のシステム。
36. 上記送達賦形剤量は、おおよそ０．５および１０.０ｍｌの間にある、請求項３５に記載のシステム。
37. 上記送達賦形剤量は、１．０ｍｌであり、上記キャリア量は、おおよそ０．５ｃｍ^３である、請求項３６に記載のシステム。
38. 上記少なくとも１つの成長因子は、液体として上記キャリアに添加され、次いで、当該キャリア上に凍結乾燥される、請求項２９〜３７の何れか一項に記載のシステム。
39. 上記少なくとも１つの成長因子、液体およびキャリアは、おおよそ１：１：０．５の比である、請求項３８に記載のシステム。
40. １．０ｍｇの上記少なくとも１つの成長因子は、０．５ｃｍ^３の上記キャリア上に共に凍結乾燥される１．０ｍｌの上記液体に添加される、請求項３９に記載のシステム。
41. 初期の放出プロファイルにおいて、送達賦形剤により、少なくとも１つの第一成長因子を送達すること；
    持続した放出プロファイルにおいて、キャリアにより、少なくとも１つの第二成長因子を送達することであって、上記キャリアは、持続した放出プロファイルにおいて、上記少なくとも１つの成長因子を放出することに適合され、上記キャリアは、複数の粒子を含み、上記複数の粒子は、硫酸カルシウム二水和物を含む、送達すること、
    を含む、成長因子の多相性放出の方法。
42. 上記キャリアは、さらに、リン酸カルシウム粒子を含む、請求項４１に記載の方法。
43. 硫酸カルシウム二水和物とリン酸カルシウム粒子との比は、おおよそ１：１または２：１である、請求項４２に記載の方法。
44. 上記少なくとも１つの第一成長因子および上記少なくとも１つの第二成長因子は、同一である、請求項４１〜４３の何れか一項に記載の方法。
45. 上記少なくとも１つの第一成長因子および上記少なくとも１つの第二成長因子は、異なる、請求項４１〜４３の何れか一項に記載の方法。
46. 上記少なくとも１つの第一および第二成長因子は：血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内被成長因子（ＶＥＧＦ）、骨形態形成タンパク（ＢＭＰ）、形質転換成長因子ベータ、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）または繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）である、請求項４１〜４５の何れか一項に記載の方法。
47. 上記少なくとも１つの第一および第二成長因子の少なくとも１つは、ＢＭＰである、請求項４６に記載の方法。
48. 上記少なくとも１つの第一および第二成長因子の少なくとも１つは、ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−７である、請求項４７に記載の方法。
49. 上記キャリアは、上記成長因子の全量の１００％を送達する、請求項４１〜４８の何れか一項に記載の方法。
50. 上記送達賦形剤は、上記成長因子の全量の少なくとも１０％を送達し、上記キャリアは、上記成長因子の全量の少なくとも５０％を送達する、請求項４１〜４８の何れか一項に記載の方法。
51. 上記送達賦形剤とキャリアとの比が、おおよそ０．５−４：１である、請求項４１〜５０の何れか一項に記載の方法。
52. 上記送達賦形剤量は、おおよそ０．５および１０．０ｍｌの間にある、請求項５１に記載の方法。
53. 上記送達賦形剤量は、１．０ｍｌであり、上記キャリア量は、おおよそ０．５ｃｍ^３である、請求項５２に記載の方法。
54. 上記キャリアと結合した上記少なくとも１つの成長因子は、液体として上記キャリアに添加され、次いで、上記キャリア上に凍結乾燥される、請求項４１〜５３の何れか一項に記載の方法。
55. 上記キャリアと結合した上記少なくとも１つの成長因子、液体、およびキャリアは、おおよそ１：１：０．５ｃｍ^３の比である、請求項５４に記載の方法。
56. 上記キャリアと結合した１．０ｍｇの上記少なくとも１つの成長因子は、０．５ｃｍ^３の上記キャリア上に共に凍結乾燥される１．０ｍｌの上記液体に、添加される、請求項５５に記載の方法。
57. 送達賦形剤成分；
    複数の硫酸カルシウム二水和物粒子を含むキャリア成分；および
    上記キャリアと結合した少なくとも１つの成長因子、
    を含む、成長因子の送達のためのキット。
58. 上記キャリア成分は、さらに、リン酸カルシウム粒子を含む、請求項５７に記載のキット。
59. 硫酸カルシウム二水和物とリン酸カルシウム粒子との比は、おおよそ１：１または２：１である、請求項５８に記載のキット。
60. 上記送達賦形剤成分および上記キャリア成分は、別々の容器中にある、請求項５７〜５９の何れか一項に記載のキット。
61. 上記キャリアおよび上記少なくとも１つの成長因子は、１つの容器中で結合され、上記少なくとも１つの成長因子は、上記キャリア成分上に導入される、またはコートされる、請求項５７〜５９の何れか一項に記載のキット。
62. 上記送達賦形剤は、ポリマーを含む、請求項５７〜６１の何れか一項に記載のキット。
63. 上記ポリマーは、逆相ポリマーまたはブロックコポリマーである、請求項６２に記載のキット。
64. 上記ポリマーは、ポロキサマーである、請求項６３に記載のキット。
65. 上記ポリマーは、ポロキサマー４０７である、請求項６４に記載のキット。
66. 送達賦形剤成分；
    上記送達賦形剤と結合した、少なくとも１つの第一成長因子；
    複数の硫酸カルシウム二水和物粒子を含むキャリア成分；および
    上記キャリアと結合した少なくとも１つの第二成長因子、
    を含む、成長因子の多相性送達のためのキット。
67. 上記キャリア成分は、さらに、リン酸カルシウム粒子を含む、請求項６６に記載のキット。
68. 硫酸カルシウム二水和物とリン酸カルシウム粒子との比は、おおよそ１：１または２：１である、請求項６７に記載のキット。
69. 上記送達賦形剤成分および上記キャリア成分は、別々の容器中にある、請求項６６〜６８の何れか一項に記載のキット。
70. 上記送達賦形剤および上記少なくとも１つの第一成長因子は、別々の容器中にある、請求項６９に記載のキット。
71. 上記キャリアおよび上記少なくとも１つの第二成長因子は、１つの容器中で結合され、そして、上記少なくとも１つの第二成長因子は、上記キャリア成分上に導入される、またはコートされる、請求項６６〜７０の何れか一項に記載のキット。
72. 上記少なくとも１つの第一成長因子は、上記キャリア成分と共に提供される、請求項７１に記載のキット。
73. 上記送達賦形剤は、ポリマーを含む、請求項６６〜７２の何れか一項に記載のキット。
74. 上記ポリマーは、逆相ポリマーまたはブロックコポリマーである、請求項７３に記載のキット。
75. 上記ポリマーは、ポロキサマーである、請求項７４に記載のキット。
76. 上記ポリマーは、ポロキサマー４０７である、請求項７５に記載のキット。
77. 上記少なくとも１つの第一成長因子および上記少なくとも１つの第二成長因子は、同一である、請求項６６〜７６の何れか一項に記載のキット。
78. 上記少なくとも１つの第一成長因子および上記少なくとも１つの第二成長因子は、異なる、請求項６６〜７６の何れか一項に記載のキット。
79. 上記第一および第二成長因子は：血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内被成長因子（ＶＥＧＦ）、骨形態形成タンパク（ＢＭＰ）、形質転換成長因子ベータ、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）または繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）である、請求項６６〜７８の何れか一項に記載のキット。
80. 上記第一および第二成長因子の少なくとも１つは、ＢＭＰである、請求項７９に記載のキット。
81. 上記第一および第二成長因子の少なくとも１つは、ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−７である、請求項８０に記載のキット。
82. 上記少なくとも１つの第一成長因子は、上記キットにおいて提供された成長因子の全量の少なくとも１０％を含み、上記少なくとも１つの第二成長因子は、上記キットにおいて提供された成長因子の全量の少なくとも５０％を含む、請求項６６〜８１の何れか一項に記載のキット。
83. 少なくとも１つの第一成長因子を含む送達賦形剤；および
    少なくとも１つの第二成長因子を含むキャリア；を含み、
    上記送達賦形剤は、初期の放出プロファイルにおいて、上記少なくとも１つの第一成長因子を第一期間にわたって放出することに適しており；
    上記キャリアは、持続的な放出プロファイルにおいて、上記少なくとも１つの第二成長因子を第二期間にわたって放出することに適している、
    治療部位における、成長因子の多相性放出のためのシステム。
84. 上記送達賦形剤とキャリアとの比は、おおよそ０．５−４：１である、請求項８３に記載のシステム。
85. 上記送達賦形剤量は、おおよそ０．５および１０．０ｍｌの間にある、請求項８４に記載のシステム。
86. 上記送達賦形剤量は、１．０ｍｌであり、上記キャリア量は、おおよそ０．５ｃｍ^３である、請求項８５に記載のシステム。
87. 上記少なくとも１つの第二成長因子は、液体として上記キャリアに添加され、次いで、上記キャリア上に凍結乾燥される、請求項８３〜８６の何れか一項に記載のシステム。
88. 上記少なくとも１つの第二成長因子、液体およびキャリアは、おおよそ１：１：０．５の比である、請求項８７に記載のシステム。
89. １．０ｍｇの上記少なくとも１つの第二成長因子は、おおよそ０．５ｃｍ^３の上記キャリア上に共に凍結乾燥される１．０ｍｌの上記液体に、添加される、請求項８８に記載のシステム。
90. 上記少なくとも１つの第一成長因子は、上記キャリアの存在下において、上記送達賦形剤に添加される、請求項８３〜８９の何れか一項に記載のシステム。

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