JP2015516155A - 乳がん予後判定、プロゲステロン受容体サブタイプの予測および遺伝子発現に基づく抗プロゲスチン処置に対する応答の予測 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2012年4月27日に出願された米国仮出願第61/639,407号に基づく優先権を主張し、その開示は全て参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、米国国立衛生研究所からの米国助成金番号CA1159712-01の下に政府の支援を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
最新のmRNA(例えば遺伝子発現ベースの)予後判定乳がんスクリーニング検査(Oncotype DXなど)は、乳がん進行に関与することがそれぞれ公知である限られた数の無関係な遺伝子の発現についてアッセイする。乳がんは非常に不均質な疾患であるため、これらの検査は、急速に拡大しつつある既存薬および新薬のリストを含む所与の標的療法の恩恵を受ける可能性が最も高い患者を選択し損なう。そこで医療提供者は、利用可能な薬物のランダムな組み合わせを、それらの併用処置が臨床的応答または臨床的利益を与えることを期待して、試さざるを得ない。また、これらの戦略は、遺伝子発現データのいかなる集合体の発現も、それらの発現の原因となる何らかの明確な機序に関連付けることができない(すなわちターゲットは不明である)。
プロゲステロン受容体(PR)は、乳房悪性腫瘍および子宮内膜悪性腫瘍を含む一定のがんの増殖および成長に重要な役割を果たす。乳がん細胞に共通するリン酸化事象は、PRの転写活性に影響を与える。ホスホ-Ser294 PRはリガンド依存性Lys388SUMO化(すなわち抑制的修飾)に対して抵抗性である。プロテインキナーゼによるPR SUMO化のアンタゴニズムは、PR抑制解除(すなわち転写活性化)のための機序になる。野生型またはK388R(SUMO化欠損)PRを発現する乳がん細胞における網羅的遺伝子発現プロファイリングにより、SUMO化欠損PRは、主として、増殖および生存促進シグナリングに必要な遺伝子を調節することが明らかになった。K388R PRは、ステロイド受容体活性化補助因子CBPおよびMLL2(ヌクレオソームリモデリングのメディエーター)と共に、候補「SUMO感受性」遺伝子のエンハンサー領域に優先的に動員される。SUMO欠損(ホスホ-Ser294)PR遺伝子シグネチャは、ERBB2過剰発現乳腺腫瘍と有意に関連し、早期転移および短縮された生存時間を予示する。可逆的なPR SUMO化/脱SUMO化は乳がん細胞におけるターゲット遺伝子選択を大きく変化させると結論される。ホスホPRによって駆動されるER陽性および/またはPR陽性腫瘍を持つ患者は、抗プロゲスチンを含有する内分泌療法の恩恵を受けうる。
別段の定義がある場合を除き、本明細書において使用する技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験では本明細書に記載するものと類似するまたは等価な任意の方法および材料を使用することができるが、本明細書には方法と材料に関していくつかの態様を記載する。本明細書において使用する場合、以下の用語はそれぞれこの項でそれに関連付けられる意味を有する。
本明細書において開示する方法は、PR駆動性の増殖および抗エストロゲンまたはアロマターゼ阻害剤処置に対する内分泌療法抵抗性への進行を起こす可能性が高いがんを持つ患者を同定するために使用することができる。そのような患者は、抗プロゲスチンを含有する内分泌療法の候補であるだろう。本明細書に記載する遺伝子シグネチャは多くのがん、例えば肺がん、脳がん、前立腺がん、子宮内膜がん、髄膜腫、前立腺がん、卵巣がん、および子宮肉腫/がんにおいて使用することができる。本明細書に記載する遺伝子シグネチャは、リンパ管平滑筋腫症および子宮平滑筋腫を含む他の障害においても使用することができる。
乳がんは女性では最もよく診断されるがんであり、がん関連死の原因の第2位である。乳がん(悪性乳房新生物)は、乳房組織から、最も一般的には乳管の内壁または乳管に乳汁を供給する小葉から派生する、がんの一タイプである。乳管から派生するがんは乳管癌と呼ばれており、小葉から派生するものは小葉癌と呼ばれている。乳がんは、ヒトおよび他の哺乳動物の疾患であり、ヒトにおける症例の圧倒的多数は女性であるが、時には男性も乳がんを発生させる。
ミフェプリストン
(10S,11S,14S,15S,17R)-17-[4-(ジメチルアミノ)フェニル]-14-ヒドロキシ-15-メチル-14-(プロパ-1-イン-1-イル)テトラシクロ[8.7.0.0^{2,7}.0^{11,15}]ヘプタデカ-1,6-ジエン-5-オン
リロプリストン
(11-β,17-β,17(z))-ロペニル);エストラ-4,9-ジエン-3-オン,11-(4-(ジメチルアミノ)フェニル)-17-ヒドロキシ-17-(3-ヒドロキシ-1-p;11β-[4-(ジメチルアミノ)フェニル]-17β-ヒドロキシ-17-[(Z)-3-ヒドロキシ-1-プロペニル]エストラ-4,9-ジエン-3-オン
ORG2058
(8R,9S,10R,13S,14S,16R,17S)-16-エチル-17-(2-ヒドロキシアセチル)-13-メチル-2,6,7,8,9,10,11,12,14,15,16,17-ドデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン
ロナプリサン
(8S,11R,13S,14S,17S)-11-(4-アセチルフェニル)-17-ヒドロキシ-13-メチル-17-(1,1,2,2,2-ペンタフルオロエチル)-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン
アソプリスニル
(8S,11R,13S,14S,17S)-11-[4-[(E)-ヒドロキシイミノメチル]フェニル]-17-メトキシ-17-(メトキシメチル)-13-メチル-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン
ウリプリスタール
(8S,11R,13S,14S,17R)-17-アセチル-11-[4-(ジメチルアミノ)フェニル]-17-ヒドロキシ-13-メチル-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-3-オン
PF-2413873
4-[3-シクロプロピル-1-(メシルメチル)-5-メチル-1H-ピラゾール-4-イル]オキシ-2,6-ジメチルベンゾニトリル
テラプリストン
[(8S,11R,13S,14S,17R)-11-[4-(ジメチルアミノ)フェニル]-17-(2-メトキシアセチル)-13-メチル-3-オキソ-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-デカヒドロシクロペンタ[a]フェナントレン-17-イル]アセテート
一定の遺伝子の発現は、抗プロゲスチンによる乳がんの処置を予示することが、ここに実証された。これらの遺伝子には、次に挙げるもの(またはそれらに相同なもの)が含まれる:
I.無極性であるかわずかに極性である小さな脂肪族残基:
Ala、Ser、Thr、Pro、Gly;
II.極性負荷電残基およびそれらのアミド:
Asp、Asn、Glu、Gln;
III.極性正荷電残基:
His、Arg、Lys;
IV.無極性の大きな脂肪族残基:
Met、Leu、Ile、Val、Cys
V.大きな芳香族残基:
Phe、Tyr、Trp。
一態様では、核酸、例えば関心対象の遺伝子のmRNAの発現が決定される。前もって選択されたmRNAの発現レベルは、例えばインサイチューハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、核酸増幅技法(例えばPCR、定量PCR、リガーゼ連鎖反応など)、RNA Seqおよびマイクロアレイ解析などといったさまざまな技法のいずれかによって、同定および/または定量することができる。mRNAのレベルはノーザンブロッティングによって定量的に測定することができる。RNAの試料をアガロースゲル上で分離し、ターゲット配列に相補的な放射標識RNAプローブにハイブリダイズさせる。次に、オートラジオグラフによって放射標識RNAを検出する。
本検出、予後判定および/または診断方法は、プロセッサ/コンピュータシステムを利用することができる。例えば、本明細書に記載する一態様では、本方法を履行するためのコンピュータプログラムコードが格納されたプログラムメモリ、ワーキングメモリ、および従来のコンピュータ画面、キーボード、マウス、およびプリンタなどのインターフェイス、ならびに他のインターフェイス、例えばネットワークインターフェイス、およびデータベースインターフェイスを含むソフトウェアインターフェイスと接続されたプロセッサを含む汎用コンピュータシステムが使用される。
材料と方法
ヒト乳腺腫瘍試料におけるプロゲステロン受容体発現
タンパク質およびmRNA解析のために、匿名化ヒト乳腺腫瘍試料を、University of Minnesota Tissue Procurement FacilityのBiological Materials Procurement Network(BioNet)から入手した。凍結組織試料は管癌、浸潤性管癌、小葉癌、または転移性癌のいずれかと診断された患者に由来した。標本は、University of Minnesotaの臨床病理学部門によって分析され、標準的な臨床組織学的方法を使って、エストロゲン受容体(ER)およびプロゲステロン受容体(PR)発現についてスコア化された。腫瘍試料を、標準的方法(凍結組織粉砕、RIPA緩衝液、tri試薬)を使って、タンパク質用またはmRNA用に個別に収穫し、全PR、ホスホ-Ser294 PR、およびERK1/2のタンパク質発現レベルを、ウェスタンブロッティングによって測定した(後述)。標本は全て、患者の組織試料の研究目的での使用に関してインフォームドコンセントが得られた患者から、University of Minnesota治験審査委員会(Institutional Review Board;IRB)の承認を得て入手した。
T47Dco親細胞株は以前に特徴付けられた(Horwitzら、1982)。WT、K388R、S294A、またはK388R/S294A PRのいずれかをコードするcDNAをpIRES-neo3発現ベクター(Clontech、カタログ番号631621)に分子クローニングした後、FuGENE HD(Roche、カタログ番号04709713001)を使ってベクターをT47D-Y細胞(Sartoriusら、1994)にトランスフェクトすることによって、PRを安定に発現するT47D細胞を作製した。単一細胞クローンを高濃度G418選択下(500μg/ml)で拡大し、低濃度G418選択下(200μg/ml)で維持した(EMD Chemicals、カタログ番号345810)。これらの細胞は、5%ウシ胎児血清(FBS)、1%非必須アミノ酸(NEAA)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、6ng/mlインスリン(CellGro、カタログ番号10-010-CV)を補足した完全最小必須培地(cMEM)で維持した。誘導性PRを発現するT47D細胞は以前に記述されている(Haganら、2011)。誘導性PR発現は、AP21967(10-9M、Ariad Pharmaceuticals、マサチューセッツ州ケンブリッジ)を細胞培養培地に、2日間の最小処置時間にわたって添加することによって達成した。PRを発現するMCF-7細胞株は、WT PRまたはKR PRのどちらかをコードするcDNAインサートを含有するpIRES-neo3ベクターを、細胞に、FuGENE HDを使ってトランスフェクトすることによって作製した。単一細胞クローンを高濃度G418選択下で拡大し、低濃度G418選択下で維持した。MCF-7細胞は、5%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補足したDMEM(ダルベッコ変法イーグル培地、CellGro、カタログ番号10-013-CV)中で維持した。BT-474細胞(ATCC、バージニア州マナッサス)は、10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補足したRPMI1640培地(Gibco、カタログ番号11875)中に維持した。SDS-PAGEは8%ゲルを使って行い、ウェスタンブロッティング分析は先に記述されているように行った(Danielら、2007a)。抗体情報については、図5.1を参照されたい。
pIRES-neo3空ベクター、WT PRまたはKR PRを安定に発現するT47D細胞を、変法IMEM(Gibco、カタログ番号A10488)中で1日間、血清飢餓させ、R5020(10-8M)または媒体対照で6時間処理してから、RNeasyキット(QIAgen、カタログ番号74104)を使ってRNA抽出を行った。6時間のプロゲスチン処理により、以前の研究(Jacobsenら、2005;Richerら、2002)と比較して、実質的なPR依存性遺伝子発現が可能になった。Illumina HT-12v4ビーズプラットフォームを製造者のプロトコールに従って使用する発現解析のために、二重実験から、DNase I処理(QIAgen、カタログ番号79254)RNA試料を調製した。生強度をlog2変換して分位数標準化(quantile normalize)するlumiと呼ばれるBioconductor(Gentlemanら、2004)パッケージを使って、Rソフトウェア内で、データを解析した。経験ベイズ法を使って遺伝子の分散をより良く推定するlimmaパッケージを使用して、差次的発現遺伝子を解析した。提示される遺伝子発現データはlog2標準化強度を含み、提示される生物学的比較(例えばR5020/媒体)はlog2倍率変化をBenjaminiおよびHochberg(BH)調整P値(BenjaminiおよびHochberg、1995)と共に含んでいる。図1Cのヒートマップを作成するために、Rパッケージgplots中のheatmap.2関数を使って、遺伝子の教師なし階層的クラスタリングを行った。クラスタリングはユークリッド距離および完全連結法を使って行った。行を、平均ゼロおよび標準偏差が1になるようにスケーリングした。
2つの独立したマイクロアレイ実験(どちらも上述のIllumina HT-12v4プラットフォームを使って実施したもの)からの生マイクロアレイデータを組み合わせ、生強度をlog2変換して分位数標準化するlumiと呼ばれるBioconductor(Gentlemanら、2004)パッケージを使って、Rソフトウェア内で、一緒に標準化した。
パラメトリック遺伝子変数(正規性条件と等分散性条件の両方を満たした)には独立t検定を使用し、正規性条件は満たすが等分散性条件を満たさない遺伝子変数にはAspin-Welch不等分散検定(AW)を使用し、ノンパラメトリック遺伝子変数、すなわちi)正規性条件を満たさないか、ii)正規性条件と等分散性条件とを満たさない変数にはMann-Whitney U検定(MW)を使用した。Illumina HT-12v4チップには47,231のプローブセットが存在することを考慮し、ボンフェローニ補正を使用して、研究全体の有意水準をα=1.06×10-6に設定した。したがって、任意の変数がP値法に従って有意であるとみなされるには、次の条件が満たされなければならない:P<α。Mann-Whitney U検定(MW)については、ノンパラメトリック変数が関係しない(一方の群からの対象が他方の群からの対象と同じ発現値を有する)場合は、正確確率を使用し、そうでない場合は、補正を伴う近似確率を使用した。
全ての遺伝子変数について、KR群の平均発現値の方がWT群の平均発現値より大きい場合(過剰発現)は、倍率変化(FC)を KR群の平均発現値/WT群の平均発現値 と定義し、統計的有意性を、log2スケールで≧10%の変化を表すFC≧1.10に設定した。KR群の平均発現値がWT群の平均発現値より低い場合(過小発現)は、FCを、負の WT群の平均発現値/KR群の平均発現値 の比と定義し、統計的有意性を、やはりlog2スケールにおいて≧10%の変化を表すFC≦-1.10に設定した。したがってこの方法によれば、統計的に有意であるとみなされるには、遺伝子変数が|FC|≧1.10でなければならない。
全ての遺伝子変数に対して、2つの群の関するその識別力を評価するために、ROC曲線解析を行った。小さいサンプルサイズの効果を可能な限り相殺するために、統計的有意性をROC AUC=1.00に設定した。ROC AUC=1.00である変数は完璧な識別力を有する。言い換えると、2つの群はその変数に関して完全に離れていて、2つの群間にオーバーラップはない。(AUC:曲線下面積)。この解析には実験的ROC曲線を使用した。
逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)アッセイのために、5×105細胞/ウェルを6ウェルディッシュにプレーティングし、変法IMEM中で1日間、血清飢餓させてから、処理した(個々の図を参照されたい)。TriPure試薬(Roche、カタログ番号11667157001)を使ってRNAを抽出し、Transcriptor cDNA第一鎖cDNA合成キット(Roche、カタログ番号04897030001)を使ってcDNAを作製した。Roche LightCycler IIで、SYBRグリーンマスターミックス(Roche、カタログ番号04887352001)を使って行われるqPCRアッセイによって、相対的発現レベルを決定した。ターゲット遺伝子定量レベルを、標準的なハウスキーパー遺伝子、すなわちTBP、ACTB、および/またはGAPDHの発現に対して標準化した。誘導性PRを発現する細胞の場合、リガンド処理に先だって細胞をAP21967(10-9M)で2日間誘導したことを除けば、プロトコールは上記と同じとした。
Ingenuityパスウェイ解析(IPA)を使って2つの異なる遺伝子リストを比較した:WT PRを発現するT47D細胞においてプロゲスチンによってアップレギュレートされるものと、SUMO欠損PRを発現する細胞においてプロゲスチンによってアップレギュレートされる遺伝子との比較(+R5020/−R5020 log2倍率変化>1.0、BH調整P<0.01)。これらの遺伝子リストをIPAソフトウェアにアップロードし、そこでコア解析を完了することで、各遺伝子のさまざまな生物学的機能またはネットワークパスウェイとの関連を決定した。IPA比較解析を使って、WT PRまたはKR PRを発現する細胞が機能的に異なるパスウェイをアップレギュレートするかどうかを明らかにした。解析を有意性(BH調整P値、複数の仮説検定について補正)に基づいてスコア化し、ある遺伝子リストが特定の生物学的機能に有意に関与するための閾をP<0.05(または-log10(BH調整P値)>1.30)とした。
媒体またはR5020のどちらかで処理した、空ベクター、WT PR、またはK388R PRを構成的に発現する細胞株からの遺伝子発現マイクロアレイデータを使って、メタ遺伝子解析を行った(図5C〜D)。非負値行列因子分解(GaujouxおよびSeoighe、2010)を使って各試料内でのメタ遺伝子を同定する戦略を使用した。この戦略により、メタ遺伝子の同定と、他のデータセットへの適用が容易になった。変動が大きい遺伝子に研究を限定し、メタ遺伝子フィットの計算に使用されるプローブの数を限定するために、プローブの四分位数間範囲(IQR)が上側第80パーセンタイル内にあることに基づいて、メタ遺伝子解析のためのプローブを考慮した。データの最適ランクは8と計算されたので、8つのメタ遺伝子がデータ中に存在する。これらのメタ遺伝子のうちの3つは、全ての試料中に多量に発現しているか、またはどの試料にも発現していなかったことから、それらはおそらくハウスキーピング遺伝子または連続的に発現される遺伝子に関するメタ遺伝子であるだろう。残り5つのメタ遺伝子は、空ベクターPRヌル試料(-R5020処理と+R5020処理の間で差異なし)、およびR5020ありまたはR5020なしでのWT PRまたはKR PRのペアワイズの組み合わせに対応した。したがって、これらの解析により、生物学的に関連する細胞のサブタイプからメタ遺伝子が同定された。
先に公表された2つの研究(Jacobsenら、2005;Richerら、2002)からのリガンド依存性およびリガンド非依存性PRターゲット遺伝子リストを合わせた(重複は除去した)。ここで同定された遺伝子は、どちらかのプラットフォーム(IlluminaとAffymetrixを合わせた)を使って測定した場合にアップレギュレートされ(>1.5倍、BH調整P<0.01)、バイオインフォマティクスツールVENNY(Oliveros、2007)を使った既知のアップレギュレートされた遺伝子とのベン図比較の前に、重複を除去した。
ChIPアッセイはChIP-IT Express使用説明書(Active Motif、カタログ番号53008)に従って行った。細胞をcMEM中、15cm培養皿あたり15×106細胞の密度で2日間プレーティングした後、変法IMEM中で2日間、血清飢餓させた。細胞をR5020(10-8M)または媒体で1時間または4時間処理した。誘導性PRを発現するT47D細胞の場合は、飢餓工程中にAP21967(10-9M)を加えた。クロマチンをBioruptorソニケータ(Diagenode、モデルUCB-200)を使って30分間(30秒オン/オフ)せん断した。免疫沈降は60μlのせん断クロマチン、2μgの抗体で調製し、一晩、免疫沈降させた。精製ChIPおよびインプットDNAを使って、相対的動員をqPCRによって三重に決定した。アッセイはRoche LightCycler IIでSYBRグリーンマスターミックスを使って行った。ターゲット座位定量をインプットDNA定量のパーセンテージとして標準化した。
細胞増殖はMTTアッセイ(3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド、Sigmaカタログ番号M2128)を使って測定した。24ウェルプレートで、cMEM中、1×104細胞/ウェルをプレーティングし(誘導性PR発現はAP21967(10-9M)で2日間誘導した)、細胞を洗浄し、5%デキストラン被覆活性炭処理(DCC)FBSを補足した変法IMEM中で1日間、ステロイド飢餓させてから、R5020(10-8M)を添加した。0、2、4、6日目に、各0.5ml細胞培養ウェルに60μlのMTT(5mg/ml)を3時間添加することによって細胞増殖を決定し、培地を注意深く取り除いて可溶化溶液(90% v/v DMSO/PBS)を加えることで細胞を溶解した。プレートリーダーを使って溶解物の吸光度(650および570nm)を測定した。650nm測定値を570nm測定値から差し引き、試料平均を0日目に対して標準化した。
Oncomineデータベース(バージョン4.4、2011年10月データ公開)を検索することによって、ヒト乳腺腫瘍試料における個々のPRターゲット遺伝子の相対的発現を決定した。個々のPRターゲット遺伝子(例えばRGS2)をThe Cancer Genome Atlas(TCGA)Breast 2データセットでクエリした。Oncomine出力データをソートして「がん対正常」連関を取り出し、血液、正常乳房および乳癌試料についてのコピー数単位発現値として、箱ひげ図(ドット:最大/最小、ひげ:90/10パーセンタイル、箱:75/25パーセンタイル、線:全試料の中央値)を使って報告した(図2A)。各解析で、各遺伝子について指定された具体的乳癌は、浸潤性小葉乳癌(MSX2)、浸潤性管および小葉癌(RGS2)、管内篩状乳腺癌(MAP1A)、および粘液性乳癌(PDK4)である。
PR SUMO化はT47D乳がん細胞におけるプロモーター選択を変化させる
理由は不明だが、腫瘍性胸部組織との比較で正常胸部組織におけるPR調節遺伝子にはオーバーラップがほとんどない(Grahamら、2009)。PR機能の明白な相違の一つの機序は、改変されたシグナル伝達など、乳がん発生における早期事象に関係しうる。一部は本発明者らの以前の研究(Danielら、2007a;DanielおよびLange、2009;Danielら、2007b)にも基づいて、SUMO化PRとリン酸化(すなわち脱SUMO化)PRの間のバランスは乳がんではしばしば変化していて、それがPRプロモーター選択性の変化と改変された遺伝子発現パターンをもたらすと予測される。PR陽性と臨床的に定義された10の乳腺腫瘍のスクリーンでは、幅広い全PR mRNA発現(掲載していない)およびタンパク質発現(図1A)が検出された。RT-qPCRでもウェスタンブロッティングでもPR陽性であることが確認された(10中)7つの乳腺腫瘍のうち、少なくとも5つの試料(レーン1、3、6、8、および9)は、明らかに何らかのレベルのホスホ-Ser294 PR-Bも含有していた(図1A)。注目すべきことに、10中2つの腫瘍(レーン1および3)が、豊富なホスホ-Ser294 PR-Bを含有していた。とりわけ、PR-BのSer294は、主としてMAPKおよびCDKファミリー内のプロリン指向性プロテインキナーゼに入力(input)するプロゲスチンまたはペプチド成長因子のどちらかに応答して、迅速にリン酸化されるが、PR-Aはそうではない(Clemmら、2000)。この知見と合致して、EGFは、プロゲスチンが誘導するPR-BのSUMO化を遮断したが、PR-AのSUMO化は遮断しなかった(Danielら、2007a)。
「SUMO感受性」PRターゲット遺伝子の調節機序を調べるために、本発明者らは、マイクロアレイ解析から、さらなる研究用に4つの遺伝子(MSX2、RGS2、MAP1AおよびPDK4)を選択した。これらの具体的遺伝子はKR受容体を発現する細胞ではアップレギュレートされたが、WT受容体を発現する細胞ではアップレギュレートされなかった(図1D、197遺伝子カテゴリー)。Oncomineデータベースのクエリにより、4つの遺伝子は全て、正常胸部組織および血液との比較で、乳がんでは増幅されることが実証された(図2A)。PRターゲット遺伝子発現のSUMO依存性変化をさらなる乳がんモデルで検証するために、本発明者らは、低レベルの内在性PRを(エストロゲンの非存在下で)発現するMCF-7細胞にベクター対照、WT受容体またはKR受容体を安定に導入した。これらの細胞を、PRアンタゴニストRU486(10-7M)の非存在下または存在下、媒体対照(エタノール)またはR5020(10-8M)で、6時間処理した(図2B)。MCF-7細胞におけるプロゲスチン誘発性遺伝子発現プロファイルは、本発明者らのT47D細胞モデルで得られたものとほぼ同一であった(MSX2、RGS2、MAP1A、およびPDK4)。さらに、それらのR5020誘導性mRNA発現は、RU486の添加によって完全に消滅したことから、これらの遺伝子の調節は完全にPR依存性であることが示された。
遺伝子アレイ解析は、PRのSUMO修飾が選択されたプロモーターに対する転写応答の大きさを変化させると同時に、他のPRターゲット遺伝子の調節はPR SUMO化に対して全く非感受性であることを示した(図1)。PRプロモーター選択の機序を調べるために、差次的に調節されるPRターゲット遺伝子のクロマチンへのPRおよび選択された共調節因子の動員を検討した。まず、実験の焦点をMSX2に置いた。PR-Bと同様に、このホメオボックス転写因子は乳腺発生にとって必須であり、MSX2のトランスジェニック発現はマウスにおいて腺管過形成を引き起こす(Satohら、2007;Satokataら、2000)。機能研究は、MSX2が、サイクリンD1およびE1発現を誘導し(Satohら、2004)、RAS媒介性細胞トランスフォーメーションに関与し(Takahashiら、1997)、上皮マーカーのダウンレギュレーションを介して上皮間葉転換を駆動する(di Bariら、2009)ことを示している。Laniganら(Laniganら、2010)は、MSX2発現が、良好な予後との関連(すなわちERおよびPRと同様)にもかかわらず、ルミナール(luminal)B分子サブタイプの乳がんでもHER2エンリッチ(HER2-enriched)分子サブタイプの乳がんでも、有意に上昇していることを示した。MSX2転写開始部位の上流および下流にある複数のコンセンサスプロゲステロン応答エレメント(PRE)配列が、MatInspectorソフトウェアを使って同定された(Carthariusら、2005)。特に、一つのPREは、PRシストローム(cistrome)(すなわち、Myles Brown(Harvard University、マサチューセッツ州ボストン)によって提供された未公表のChIP-chip実験から導かれるもの)によれば、公知のPR動員の領域と整合していた。MSX2は、SUMO欠損PRを安定にまたは誘導性に(T47D)発現するT47DまたはMCF-7細胞のプロゲスチン処理に応答して転写的にアップレギュレートされるが、WT受容体の場合はそうならない(図2B〜C、1.1C)。MSX2のPREエンハンサー領域へのPRの直接的動員を調べるために(図3A)、WT PRまたはKR PRのどちらかを構成的(または誘導性)に発現する細胞を、R5020(10-8M)で処理し、クロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイを行った。WT PRを発現するプロゲスチン処理細胞における転写活性(RT-qPCRによって測定されるmRNAレベル)(図2B〜C、1.1C)は検出されなかったものの、プロゲスチン処理後に、WT PRおよびKR PRはどちらもPREエンハンサー領域に容易に検出された(図3B左)。とりわけ、MSX2エンハンサー座位に動員されるSUMO欠損KR PRは、WT PRとの比較で、有意に多かった。この知見は、誘導性PR(図3B右)を発現する細胞でも、SUMO欠損PRによってアップレギュレートされる他の複数の遺伝子のPRE含有エンハンサーにおけるもの(図3.1)と共に再現された。次に、MSX2エンハンサー座位への、一般的PR転写活性化補助因子であるcAMP応答エレメント結合タンパク質(CREB)結合タンパク質(CBP)の動員を調べた。CBPは複数の核内受容体と相互作用し、転写の足場として機能し、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)活性を有する(LambertおよびNordeen、2003;Liら、2003;Ogryzkoら、1996)。ChIPアッセイを使って、プロゲスチン処理後に、MSX2座位へのCBP動員が、SUMO欠損KR PRを発現する細胞では有意に上昇するが、WT PRを発現する細胞ではそうでないことが決定された(図3C)。KR PRと関連するこの活性化補助因子の増加した存在と合致して、iWT PRを発現する細胞との比較で、iKR PRを発現するプロゲスチン処理細胞におけるMSX2近位プロモーター領域への全RNAポリメラーゼIIおよび機能的に活性なホスホ-Ser5 RNAポリメラーゼIIの増加した動員が観察された(図3.2)。これらのデータは、プロゲスチンの存在下でWT PRはこの領域に明らかに動員されるのに(図3B)、有意なmRNA発現が起こらない(図2B〜C、1.1C)理由の説明になりうる。内在性遺伝子座位における脱SUMO化PRおよびSRC1の構成的会合は、以前に報告された(DanielおよびLange、2009)。
ヒト乳がんはしばしば高レベルのMAPK、AKT、および/またはCDKタンパク質、および/またはキナーゼ活性を含有するので、PR抑制解除に有利である(Danielら、2007a;DanielおよびLange、2009)。ホスホPR駆動性(SUMO欠損)病変を示唆する遺伝子パターンの証拠について、公表されたヒト乳がんデータベースを探るために、KR受容体を発現する細胞において、WT受容体を発現する細胞との比較で、発現量が高い遺伝子(KR対WTで発現>1.5倍、BH調整P<0.01)から構成されるユニークなPR遺伝子シグネチャを定義した。これらの遺伝子は、KR受容体を発現する細胞では圧倒的にアップレギュレートされ、かつ/またはWT受容体を発現する細胞だけでダウンレギュレートされた。この解析をリガンド依存性PRターゲット遺伝子とリガンド非依存性PRターゲット遺伝子の両方について行った。これらの基準を使って、ユニークな151遺伝子および92遺伝子のシグネチャが作製され、それぞれリガンド依存性(LD)およびリガンド非依存性(LI)KR受容体によって(WTと比べて)差次的にアップレギュレートされるPRターゲット遺伝子と定義された(図4.1)。
リガンド依存性PRプロモーター選択性は受容体のリン酸化およびSUMO化ステータスに依存する。加えて、PRリガンド構造もPR活性に影響を与え、ターゲット遺伝子調節に対するアゴニスト特性またはアンタゴニスト特性を引き起こす。PRリガンド(プロゲステロンおよびR5020)は強いアゴニストであり、一方、PRアンタゴニスト(RU486、アグレプリストン、およびオナプリストン)は一般にPR転写作用を遮断するが、これらのリガンドはユニークな作用機序を有し、異なる細胞状況下で可変的なレベルのアゴニズム/アンタゴニズムの引き金を引きうる(Cadepond、1997)。そこで本発明者らは、遺伝子発現プロファイリングを使って、野生型PR(WT)、SUMO欠損PR(KR)、または空ベクター(PR-ヌル)を発現するT47D乳がん細胞におけるこれらのアンタゴニストの転写効果を調べた。
本明細書では、高転写活性PR(すなわちリン酸化され、脱SUMO化されたもの)が乳がん細胞成長のドライバーであり(図4)、上昇したHER2シグナリングと関連し(図5)、低減した無転移生存期間の予測因子である(図5)ことの少なからぬ証拠を挙げた。そこで、高い感度と特異性を保証するために3つの独立した統計的方法を使って、WT PRを発現する細胞と活性化PR(KR)を発現する細胞とを識別することができるPR依存性遺伝子マーカー(遺伝子)を同定しようと努力した。
上記の統計的解析により、プロゲスチンの存在下でWT PRを発現する細胞とSUMO欠損PRを発現する細胞とを識別することができる15の遺伝子を確信を持って同定するための、感受性および特異性の強い尺度が得られた。しかし、プロゲスチン処理に応答して(すなわちP4/エタノールの比)特異的にアップレギュレートされるPRターゲット遺伝子は他にも数多く存在する。プロゲスチンにより、WTと比べて、活性化PR(KR)を発現する細胞において特異的に誘導されるPRターゲット遺伝子を調べた。これらの遺伝子産物は、おそらく、活性化PR転写プログラムのドライバーであるだろう。実際、151遺伝子のリガンド依存性「KR>WT」遺伝子シグネチャ(図2B、4.1)として、これらのタイプのPR遺伝子を記載した。
この研究では、PR SUMO修飾がどのように転写活性およびプロモーター選択に影響を与えるかをより良く理解するために、遺伝子発現プロファイリングを行った。新たに工学的に作製した乳がん細胞株モデルを使って、ヒト腫瘍中に存在し、減少した患者生存率と関連する、(脱SUMO化)PR駆動性遺伝子シグネチャを同定した。Ser294におけるPRリン酸化はLys388におけるPR SUMO化をアンタゴナイズすることは、以前に示された(Danielら、2007a)。本明細書では、新規データにより、乳がん細胞はこの機序を利用して、細胞増殖および生存促進パスウェイを駆動するターゲット遺伝子へと、PR転写作用をシフトさせうることが示唆される(図4、5)。バイオインフォマティクスを使って網羅的遺伝子発現レベルを解析することにより(図1)、WT PRと脱SUMO化PRとの間に転写応答の劇的な相違が同定され、それらをプロモーター/エンハンサー選択性の変化としてChIP解析によってさらに特徴付けた(図3、3.1)。加えて、無修飾乳がん細胞(またはWT PR-Bだけを発現する細胞)をEGFで処理することにより、PR Ser294リン酸化(PR脱SUMO化)が、選択されたPRターゲット遺伝子の転写抑制解除に関連付けられた(図2)。とりわけ、SUMO欠損PRによって特異的にアップレギュレートされる(すなわちホスホPR駆動性の)遺伝子は、ERBB2陽性のヒト乳腺腫瘍および細胞株において多量に発現する遺伝子と有意に関連し、これらの研究は、リン酸化(脱SUMO化)PR-B特異的転写作用とERBB2関連遺伝子のサブセットの発現との間の機序的つながりを裏付ける(図5)。全体として、これらのデータは、転写のホスホPR依存性調節の機序および内分泌療法抵抗性への早期のまたは迅速な乳がん進行に対するこの活性の潜在的寄与に関するさらなる研究に、強い論理的根拠を与える。
PR SUMO化が、HBEGF、IRS1、およびSTC1を含む限られた数の内在性遺伝子座位において転写抑制的であることは、以前に報告されており(Danielら、2007a;DanielおよびLange、2009)、3つの遺伝子産物はいずれも、乳がん細胞増殖の一因であることが知られている(BeerliおよびHynes、1996;Byronら、2006;Changら、2003)。ここでは、合成プロゲスチンR5020ありまたはR5020なしの処理を行った、WT PRまたはSUMO欠損変異型K388R PR(ホスホミミック)のどちらかを発現するT47D細胞における全ゲノム発現プロファイリングのために最新のマイクロアレイ技法を使って、内在性PRターゲット遺伝子の調節を測定するための包括的な一組の実験を行った。このマイクロアレイデータセットは、可逆的PR SUMO化の役割の調査の他に、プロゲスチン処理に応答して起こるWT PR-B転写作用の、適切な対照が置かれた最新の解析(新たに作製された同ベクター細胞株)を提供する。構成的(安定)なまたは誘導性のWT PRまたは変異型PRを発現する追加の細胞株および新規細胞株クローンを使って、厳密な独立した実験を行い、異なるマイクロアレイプラットフォーム(IlluminaおよびAffymetrix)を使って遺伝子発現レベルを測定した。実際、分析により、以前に同定されたPRターゲット遺伝子(Jacobsenら、2005;Richerら、2002)のうちの70%が確認されたが、何百という新規PRターゲット遺伝子も明らかになった。それらの多くはリガンド非依存性の例である。このデータセットは、リガンド依存性およびリガンド非依存性PR媒介性転写調節の機序を調べるさらなる研究の強力なリソースになる。
PR SUMO修飾は広範なPRターゲット遺伝子の発現を変化させるが、他の遺伝子には影響を持たないことを、マイクロアレイ研究は明確に実証している。プロモーター選択性の機序についてはほとんどわかっていない。しかしこの問題は、他のSRファミリーメンバーに関して取り組まれている(Tangら、2011)。SRとクロマチンとの相互作用は極めてダイナミックであり、迅速かつ継続的な交換として起こる(Hagerら、2009)。したがって(ChIPによって測定される)転写因子「結合」の集中領域は、実際には、その領域における転写因子占有率が増加する方向への平衡状態のシフトを反映している。この平衡状態には、コンセンサスDNA配列へのSR結合、多タンパク質複合体への共調節因子の参加および/または特異的細胞位置へのSRの隔離、ならびにクロマチンの接近可能性を調節するヒストン修飾など、複数の要因が影響する。加えて、制限酵素の研究により、コンセンサス配列への酵素結合を、拡散だけで可能な速さの最大1000倍まで容易にする機序が明らかになっており、結合を容易にする補助因子の存在が示唆される(HalfordおよびMarko、2004)。また、「パイオニア因子」と呼ばれる特別なタンパク質が、発生組織またはがん特異的状況下で、クロマチンリモデリングと、ゲノム結合部位(エンハンサー)近くへのSRの局在化を助けることが、最近の研究によって決定されている(Carrollら、2005;Hurtadoら、2011;Lupienら、2008)。
選択的ER修飾因子(SERM[例えばタモキシフェン]、抗エストロゲン[例えばフルベストラント])および/またはアロマターゼ阻害剤(例えばアナストロゾール、レトロゾール、またはエクセメスタン)によるルミナール乳がんにおけるER機能のターゲティングは、大半の女性にとって非常に効果的である(Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group、2005;Gossら、2011)。実際、成長因子シグナリングパスウェイとのSRクロストークは広範囲にわたり、腫瘍は、高まった成長因子シグナリングの影響下で内分泌療法抵抗性へと進行する傾向を示すので、ER受容体とERBB受容体の両方を標的とする併用治療が無増悪生存を強化する(Johnstonら、2009;Kaufmanら、2009)。本明細書では、脱SUMO化(ホスホミミック)PR種によって、リガンド依存性条件下(151遺伝子)およびリガンド非依存性条件下(92遺伝子)の両方で、アップレギュレートまたは抑制解除されるユニークな一組の遺伝子を開示する(図4.1)。これらの遺伝子の上昇した発現は、主として高活性ホスホPR(脱SUMO化)種によって駆動される腫瘍を、特に活性化された成長因子シグナリングカスケードを特徴とするがんにおいて、知らしめることができる。例えば、MAPKおよびCDK2またはCDK4/6は、一部の乳腺腫瘍においておそらく永続的なPR Ser294リン酸化を誘導する乳がん進行の公知のドライバーである(図1A)。この「ホスホ-PR」遺伝子シグネチャを発現するルミナール型(ER陽性/PR陽性)乳腺腫瘍を持つ患者が存在すること(図1Aおよび図4.1参照)、そしてこのサブセットは、もし早期に同定されるのであれば、高選択的抗プロゲスチンの使用を、場合によっては現在使用されている抗エストロゲンもしくはアロマターゼ阻害剤および/または成長因子パスウェイ阻害と組み合わせて含む、内分泌療法の恩恵を受けるであろうことが、予測される。
本明細書では、PRがマイトジェン刺激のセンサーであって、それにより、リン酸化事象が受容体を脱SUMO化状態へと駆動して、細胞の増殖および生存を促進する劇的に変化した転写プログラムをもたらす限りにおいて、PR転写作用は当初考えられていたものより複雑であることが示された。乳がん細胞モデルにおいて高活性PRシグナリングのマーカーである公知のPRターゲット遺伝子と新規PRターゲット遺伝子の両方の脱SUMO化ホスホPR遺伝子シグネチャが同定された。このシグネチャは、再発乳がんを持つ患者のサブセットにも実際に存在する(図1Aおよび5D)。このユニークなシグネチャは、進行しかつ/または内分泌療法抵抗性(すなわちエストロゲン標的療法に対して抵抗性)になる可能性が高い腫瘍を持つ患者を同定するための貴重な予後判定尺度を与えることができる。
Claims (47)
- がんが活性プロゲステロン受容体(KR)を発現する細胞を含み、かつ抗プロゲスチンによる治療的処置に応答する可能性が高いかどうかを決定するための方法であって、(a)がんと診断された患者から生物学的試料を取得する工程、(b)KBTBD11、RBPMS2、PLA2G48、FL112684、SH2D4B、RASCD2、CLDN8およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の、該生物学的試料の細胞における少なくとも一つの発現試料レベルを決定する工程、および(c)工程(b)における該少なくとも一つの発現試料レベルを、野生型(WT)対照試料の細胞における該少なくとも一つの遺伝子の少なくとも一つの発現レベルと比較する工程を含み、発現試料レベルが該対照試料と比較して減少しているのであれば、前記がんは抗プロゲスチンによる処置に対するレスポンダーである、方法。
- (d)VCX、CHN2、AFAP1L2、PXMP4、THY1、ZNF26、CDH10、ZNF812およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の、生物学的試料の細胞における発現レベルを決定する工程、および(e)工程(d)における発現レベルを、野生型(WT)対照試料における該少なくとも一つの遺伝子の発現レベルと比較する工程をさらに含み、生物学的試料における該少なくとも一つの遺伝子の発現レベルが該WT対照試料と比較して増加しているのであれば、がんは抗プロゲスチンによる処置に対するレスポンダーである、請求項1記載の方法。
- がんが、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、脳がん、肺がん、前立腺がん、子宮内膜がん、髄膜腫または子宮がんからなる群より選択される、請求項1または2記載の方法。
- がん患者が抗プロゲスチン処置に応答すると考えられるかどうかを決定するための方法であって、
a.患者からの生物学的試料のがん細胞における、KR78D11、RBPMS2、PLA2G48、FL112684、SH2D4B、RASCD2、CLDN8およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを測定する工程を含み、
b.対照WT試料におけるレベルと比べて、生物学的試料における前記少なくとも一つの遺伝子の減少した発現のレベルは、患者が抗プロゲスチン処置に応答すると考えられることのしるしである、方法。 - (c)VCX、CHN2、AFAP1L2、PXMP4、THY1、ZNF26、CDH10、ZNF812およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の、生物学的試料の細胞における発現レベルを決定する工程、および(d)工程(c)における発現レベルを、野生型(WT)対照試料における該少なくとも一つの遺伝子の発現レベルと比較する工程をさらに含み、生物学的試料における該少なくとも一つの遺伝子の発現レベルが該WT対照試料と比較して増加しているのであれば、患者は抗プロゲスチンによる処置に対するレスポンダーである、請求項4記載の方法。
- 遺伝子のmRNAレベルが遺伝子発現レベルの指標として測定される、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- 遺伝子KB7BD11の発現がSEQ ID NO:1のプローブへのハイブリダイゼーションによって検出される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- プローブがデバイスに貼付される、請求項7記載の方法。
- デバイスがマイクロアレイである、請求項8記載の方法。
- プローブが、少なくとも2つの前記遺伝子にハイブリダイズする多数の貼付されたプローブの一つである、請求項7記載の方法。
- 少なくとも一つの前記遺伝子の発現レベルを測定することが、インサイチューハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、核酸増幅、マイクロアレイ解析またはそれらの組み合わせを含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
- KR78D11、RBPMS2、PLA2G48、FL112684、SH2D4B、RASCD2、CLDN8、VCX、CHN2、AFAP1L2、PXMP4、THY1、ZNF26、CDH10、ZNF812およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも2つの遺伝子の発現が測定される、請求項2〜6のいずれか一項記載の方法。
- KR78D11、RBPMS2、PLA2G48、FL112684、SH2D4B、RASCD2、CLDN8、VCX、CHN2、AFAP1L2、PXMP4、THY1、ZNF26、CDH10、ZNF812およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも3つの遺伝子の発現が測定される、請求項12記載の方法。
- KR78D11、RBPMS2、PLA2G48、FL112684、SH2D4B、RASCD2、CLDN8、VCX、CHN2、AFAP1L2、PXMP4、THY1、ZNF26、CDH10、ZNF812およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも4つの遺伝子の発現が測定される、請求項13記載の方法。
- KR78D11、RBPMS2、PLA2G48、FL112684、SH2D4B、RASCD2、CLDN8、VCX、CHN2、AFAP1L2、PXMP4、THY1、ZNF26、CDH10、ZNF812およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも6つの遺伝子の発現が測定される、請求項14記載の方法。
- KR78D11、RBPMS2、PLA2G48、FL112684、SH2D4B、RASCD2、CLDN8、VCX、CHN2、AFAP1L2、PXMP4、THY1、ZNF26、CDH10、ZNF812およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも7、8、9、10、11、12、13、14または15個の遺伝子の発現が測定される、請求項15記載の方法。
- 生物学的試料が、組織生検、乳管洗浄液または細針吸引物試料である、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
- 対照試料が非がん性組織の試料である、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
- 対照が患者に由来する、請求項18記載の方法。
- 抗プロゲスチン療法を開始または中止するように医療提供者に助言する工程をさらに含む、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
- 患者にがんの処置をすることをさらに含む、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
- 処置が有効量の少なくとも一つの抗プロゲスチンを投与する工程を含む、請求項21記載の方法。
- 処置が少なくとも一つの追加治療剤を投与する工程をさらに含む、請求項21または22のいずれか一項記載の方法。
- がん患者を処置するための方法であって、対照と比較して、KR78D11、RBPMS2、PLA2G48、FL112684、SH2D4B、RASCD2、CLDN8およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子のレベルが減少している、かつ/または、VCX、CHN2、AFAP1L2、PXMP4、THY1、ZNF26、CDH10、ZNF812およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子のレベルが増加している患者に、がん患者が処置されるように、抗プロゲスチンを単独でまたは他の処置と組み合わせて投与する工程を含む、方法。
- (c)VCX、CHN2、AFAP1L2、PXMP4、THY1、ZNF26、CDH10、ZNF812およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の、生物学的試料の細胞における発現レベルを決定する工程、および(d)工程(a)における発現レベルを、対照における該少なくとも一つの遺伝子の発現レベルと比較する工程をさらに含み、生物学的試料における該少なくとも一つの遺伝子の発現レベルが該対照と比較して増加しているのであれば、患者は抗プロゲスチンによる処置に対するレスポンダーである、請求項24記載の方法。
- がんと診断された患者が、活性プロゲステロン受容体(KR)を発現する細胞を含み、かつ抗プロゲスチンによる治療的処置に応答する可能性が高いかどうかを決定するための方法であって、(a)患者から生物学的試料を取得する工程、(b)生物学的試料の細胞における、THY1、KLF9、SPINK5L.3、PHLDA1、MAP1A、SPRYD5、ATG12、PDK4、MSX2、TUBA3E、TSC22D1、TUBA3D、KHDRBS3、UTS2D、SLC35C1、KIAA0513およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを決定する工程、および(c)工程(b)における発現レベルを、野生型(WT)対照試料における該少なくとも一つの遺伝子の発現レベルと比較する工程を含み、生物学的試料における該少なくとも一つの遺伝子の発現レベルが該WT対照試料と比較して増加しているのであれば、患者は抗プロゲスチンによる処置に対するレスポンダーである、方法。
- がんが、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、脳がん、肺がん、前立腺がん、子宮内膜がん、髄膜腫または子宮がんである、請求項26記載の方法。
- がん患者が抗プロゲスチン処置に応答すると考えられるかどうかを決定するための方法であって、
a.患者からの生物学的試料における、THY1、KLF9、SPINK5L.3、PHLDA1、MAP1A、SPRYD5、ATG12、PDK4、MSX2、TUBA3E、TSC22D1、TUBA3D、KHDRBS3、UTS2D、SLC35C1、KIAA0513およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現のレベルを測定する工程
を含み、
b.WT対照試料におけるその発現レベルと比較して、生物学的試料における前記少なくとも一つの遺伝子の増加した発現のレベルが、対象は抗プロゲスチン処置に応答すると考えられることのしるしである、
方法。 - mRNAレベルが遺伝子発現レベルの指標として測定される、請求項26〜28のいずれか一項記載の方法。
- 遺伝子THY1の発現がSEQ ID NO:16のプローブへのハイブリダイゼーションによって検出される、請求項26記載の方法。
- プローブがデバイスに貼付される、請求項30記載の方法。
- デバイスがマイクロアレイである、請求項31記載の方法。
- 少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを測定することが、インサイチューハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、核酸増幅、マイクロアレイ解析またはそれらの組み合わせを含む、請求項26〜32のいずれか一項記載の方法。
- THY1、KLF9、SPINK5L.3、PHLDA1、MAP1A、SPRYD5、ATG12、PDK4、MSX2、TUBA3E、TSC22D1、TUBA3D、KHDRBS3、UTS2D、SLC35C1、KIAA0513およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも2つの遺伝子の発現が測定される、請求項26〜29のいずれか一項記載の方法。
- THY1、KLF9、SPINK5L.3、PHLDA1、MAP1A、SPRYD5、ATG12、PDK4、MSX2、TUBA3E、TSC22D1、TUBA3D、KHDRBS3、UTS2D、SLC35C1、KIAA0513およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも3つの遺伝子の発現が測定される、請求項34記載の方法。
- THY1、KLF9、SPINK5L.3、PHLDA1、MAP1A、SPRYD5、ATG12、PDK4、MSX2、TUBA3E、TSC22D1、TUBA3D、KHDRBS3、UTS2D、SLC35C1、KIAA0513およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも4つの遺伝子の発現が測定される、請求項35記載の方法。
- THY1、KLF9、SPINK5L.3、PHLDA1、MAP1A、SPRYD5、ATG12、PDK4、MSX2、TUBA3E、TSC22D1、TUBA3D、KHDRBS3、UTS2D、SLC35C1、KIAA0513およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも6つの遺伝子の発現が測定される、請求項36記載の方法。
- THY1、KLF9、SPINK5L.3、PHLDA1、MAP1A、SPRYD5、ATG12、PDK4、MSX2、TUBA3E、TSC22D1、TUBA3D、KHDRBS3、UTS2D、SLC35C1、KIAA0513およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも7つの遺伝子の発現が測定される、請求項37記載の方法。
- THY1、KLF9、SPINK5L.3、PHLDA1、MAP1A、SPRYD5、ATG12、PDK4、MSX2、TUBA3E、TSC22D1、TUBA3D、KHDRBS3、UTS2D、SLC35C1、KIAA0513およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15または16個の遺伝子の発現が測定される、請求項38記載の方法。
- 生物学的試料が、組織生検、乳管洗浄液または細針吸引物試料である、請求項26〜39のいずれか一項記載の方法。
- 対照試料が非がん性組織の試料である、請求項26〜40のいずれか一項記載の方法。
- 対照が患者に由来する、請求項41記載の方法。
- 抗プロゲスチン療法を開始または中止するために医療提供者に情報を与える工程をさらに含む、請求項26〜42のいずれか一項記載の方法。
- 患者にがんの処置をすることをさらに含む、請求項26〜43のいずれか一項記載の方法。
- 処置が有効量の少なくとも一つの抗プロゲスチンを投与する工程を含む、請求項44記載の方法。
- 処置が少なくとも一つの追加治療剤を投与する工程をさらに含む、請求項45記載の方法。
- がん患者を処置するための方法であって、対照と比較して、THY1、KLF9、SPINK5L.3、PHLDA1、MAP1A、SPRYD5、ATG12、PDK4、MSX2、TUBA3E、TSC22D1、TUBA3D、KHDRBS3、UTS2D、SLC35C1、KIAA0513およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現レベルが増加している患者に、がん患者が処置されるように、抗プロゲスチンを単独でまたは他の処置と組み合わせて投与する工程を含む、方法。
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