JP2015513526A - miR−199a−5p、その標的及び/又は阻害剤の、線維増殖障害の診断、予後予測及び治療のための使用 - Google Patents
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Abstract
Description
ature、431:350−355、2004][4]。最近の研究により、癌及び炎症性及び自己免疫障害を含む種々の障害の発症及び進行と関連する特異的miRNA発現プロファイルが同定された。その上、miRNA機能の獲得及び喪失の研究により、インビボにおけるそれらの主要な役割を亢進させる病原性miRNA機能が明らかになった。好ましくは、用語「ミクロRNA」又は「miRNA」は、本発明の関係においては、長さが18から25の間のヌクレオチドからなるRNAオリゴヌクレオチドを意味する。機能的関係では、miRNAは典型的には調節性の内生的RNA分子である。
et al.、Clin.Cancer Res.、14(2):419−427、2008][11]だけでなく気管腫瘍[Mascaux et al.、Eur.Respir.J.、33(2):352−359(Epub 2008)、2009;Puissegur et al.、Cell death Differ.、18(3):465−478、2011][12、13]においても悪性腫瘍と関連づけられた。
et al.、Transl.Res.、157:191−199、2011][19]。
シグネチャー及び細胞に対する効果(線維症機構に関与する主要な因子の1つ)と部分的によく似ていることを示した。
(i)前記対象者からの生物学的試料中におけるmiRNA発現のレベルを定量的に測定するステップ;
(ii)前記対象者からの生物学的試料のmiRNA発現プロファイルを、場合により決定するステップ;
(iii) mir−146b、miR−34a、miR−21、miR−449a、miR−449b、miR−20a、miR−18a、miR−223、miR−449c、miR−147b、miR−152、miR−181ac、miR−451、miR−351、miR−133ac、miR−214、miR−199a−5p、miR−132、miR−222、miR−342−3p、miR−345−5p及びmiR−221からなる、前記対象者からの生物学的試料のmiRNA発現プロファイルを、参照の生物学的試料の同じmiRNA発現プロファイルと比較するステップ;
(iv)発現のレベルが、前記参照試料による同じmiRNAの発現レベルに関して異なる、前記対象者からの前記生物学的試料による少なくとも1種のmiRNAを同定するステップ。
(i)前記対象者からの生物学的試料中におけるmiR−199a−5p発現のレベルを定量的に測定するステップ;
(ii)前記対象者からの前記生物学的試料中におけるmiR−199a−5p発現のレベルを参照生物学的試料中におけるmiR−199a−5p発現のレベルと比較するステップ;
(iii)miR−199a−5p発現のレベルにおける増大を検出するステップ。
Inhibitor、EXIQON)。これらのオリゴマーは、全長が7から少なくとも22個の連続したヌクレオチドの連続したヌクレオチド配列を含むか又はそれらからなることができ、70%までヌクレオチドアナログ(LNA(商標))でよい。最短のオリゴマー(7ヌクレオチド)は、成熟miR−199a−5pの5’末端に位置する最初の
7ヌクレオチドに合致し、miRNA標的特異性に関与する「シード」配列(即ち、miR−199a−5pに対する「ccagugu」、配列番号N°13を参照されたい)と呼ばれる、5’末端から2〜8の位置にある7個のヌクレオチドの配列を含む、相補性の完全配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドに対応するであろうと思われる(Lewis et al.、Cell.2005 Jan 14;120(1):15−20)[38]。「miR−199a−5p Target Site Blocker」は、特異的mRNA上に位置するmiR−199a−5p結合部位に相補性の配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。これらのオリゴマーは、US20090137504の教示に従って設計することができる。これらのオリゴマーは、長さが合計8から23個の連続したヌクレオチドの配列を含むか又はそれらからなることができる。これらの配列は、miR−199a−5pの「シード」配列の逆相補に対応する配列から5’又は3’方向に20ヌクレオチドの範囲を含むことができる。例えば、「CAV1 Target Site Blockers」は、CAV1mRNA(NM_001753.4、NM_001172895.1、NM_001172896.1、NM_001172897.1又はそれらの天然で生ずる変形体及びそれらから誘導されたRNA核酸、好ましくはmRNA)中に存在してmiR−199a−5p部位と定義された特異的ヌクレオチド配列の逆相補に対応する、長さが合計8から23この連続したヌクレオチドの連続した配列を含むか又はそれらからなる(図5A:配列番号N°10)。本発明のオリゴマーのヌクレオチド配列は、CAV1mRNA上のmiR−199a−5p部位に高い親和性を以て結合し、この特定の標的部位におけるCAV1 mRNAの3’UTRに対するmiR−199a−5pの結合を防止するであろう。
細胞系統、試薬及び抗体
MRC−5及びhFLl5CCL−153)正常ヒト肺線維芽細胞及びA549ヒト肺癌の細胞系統は、American Type Culture Collection(ATCC、Manassas、VA、USA)から得て10%胎児仔牛血清を含有するDMEM培地中、37℃で5%CO2v/vを加えて培養した。
マウス肺線維症モデル
9から12週齢の雄C57BL/6及びBALB/c株マウスを、Charles River,Franceから得た。線維症変化を誘発するために、マウスに、気管内経路によりブレオマイシン又は対照としてPBSを点滴注入した。この目的で、マウスをセボラン(Abbott)吸入により麻酔して仰臥位に置いた。24−G供給注射針の経気管挿入を使用して、ブレオマイシン(0.75単位/ml)又は賦形剤(PBS)を、80μlの体積で点滴注入した。マウスを点滴注入の7及び14日後に殺して、肺をその後の分析のために取り出した。
9から12週齢のBALB/c株の雄C57BL/6マウスを、Charles River,Franceから得た。マウスをペントバルビタールの腹腔内注射により(50mg/kg体重)麻酔した。標準的腹壁切開の後、左方近位の尿管を露出させて、4〜0絹糸を用いて2点で結紮した。「模擬実験又は対照」手順は、左の尿管の同様な確認からなるが、尿管は結紮しなかった。
6から8週齢の雄C57BL/6及びBALB/c株マウスをJackson Laboratory(Bar Harbor)から得た。肝臓の線維症を誘発するために、マウスは、上記のように腹腔内経路により0.6ml/kg体重のCCl4(Merck)
をトウモロコシ油(Sigma Life Science)と混合して与えられた[Roderbrug et al.、Hepatol.、53:209−218、2011][24]。総肝管を露出させることにより胆管を結紮して、それらの2箇所の結紮を行い、それに続いてRoderburg et alにより記載されたように[2011、上で挙げた][24]、結紮間で切断した。線維症退縮を誘導するために、マウスを上記のようにCCl4で6週間処理して処理終了後2又は4週間でそれぞれ殺した。
第1期星状細胞を40から55週齢のC57BL/6マウスから単離して、20ng/
mlのTGF−β1(Sigma Aldrich)により、Roderburg et
al.[2011、上で挙げた][24]により以前記載したようにして48時間刺激した。
IPFを有する及び慢性肺疾患を有しない対象者からの凍結した肺組織を「Lung Tissue Research Consortium(LTRC)」から得た。診断は、病歴、病態及び放射線医学に基づくATS/ERS指針[Demedts and Costabel、Eur.Respir.J.、19:794−796、2002;Steele et al.、Am.J.Respir.Crit.Care Med.、172:1146−1152、2005][32、33]に基づいた。全ての試験は、ピッツバーグ大学における施設内倫理委員会により承認された。臨床データは、審査員が審査のために完全に利用できるようにした。
マウス腎臓及び肺を中性の緩衝ホルマリンで終夜固定して、次にパラフィンに封入して、厚さ5μmの組織切片をスライドに固定し、ヘマトキシリン及びエオシン及びマッソン三色染色で染色して線維症の程度を評価した。組織切片は、経験のある病理学者が検査した。
全RNAを、肺細胞及び組織試料からTrizol試薬(Invitrogen)をメーカーの勧告に従って使用して抽出した。最初に全RNA試料の純度及び濃度をNanodrop分光光度計を使用して評価した。260/280及び260/230の比を確認し、2に近い値を有すべきである。次にRNAを、chiナノチップに負荷してそれらの品質(RNAの完全性及び分解レベル)を、Bioanalyzerシステム(Agilent Technologies、France)を使用して分析した。
マウス肺miRNAバイオチップ
miRNA登録中に見出される2054種の成熟miRNAに対応するオリゴヌクレオチド配列は、http://www.microarray.fr:8080/merge/indexで入手できる(「ミクロARN」:GPL4718におけるNCBIGEOデータベース上のプラットホーム参考文献へのリンクを辿られたい)。3通りの生物学的複製を各比較のために作製した。実験データ及びバイオチップ設計をNCBIGEOデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)にGSE34812シリーズとして登録した。実験的設計には、「染料交換」手法を使用して、バイオチップ上に8回刷り込まれた各マウスプローブを、各試料について独立に16回測定した。標的の調製及びバイオチップハイブリッド形成は、以前に記載したようにして[Pottier et al.、PLoS.One、4:e6718、2009;Triboulet et al.、Science、315:1579−1582、2007;Puissegur et al.、2011,前に挙げた][25、26、13]実施した。
miRNAバイオチップ分析は、前に記載したようにして[Pandit et al
.、2010,上で挙げた][18]実施した。簡単に述べると、100ngの全RNAを標識してAgilent microRNA Microarray Release
16.0、8×60Kにハイブリッドさせた。洗浄後、チップをAgilent Microarrayスキャナーを使用して走査した。走査した像をAgilentのFeature Extractionソフトウェア、バージョン9.5.3で処理した。miRNAバイオチップデータは、Dr Richard Simon及びBRB−ArrayToolsの開発チームにより開発された遺伝子Spring vll.5及びBRB−ArrayTools v.lを使用して分析した。データは、分位当たりで標準化された。miRNAバイオチップデータは、Lung Genomics Research Consortium(LGRC)のウェブサイト(lung−genomics.org)により公に利用可能である。
RNA試料を、Cy3染色によりlow RNA input QuickAmpキット(Agilent)を使用してメーカーの勧告に従って標識した。825ngの標識されたcRNAプローブを、マウス又はヒトのAgilent 8×60K高密度SurePrintG3遺伝子発現バイオチップにハイブリッドさせた。2つの(インビトロヒト試験)又は5つの(インビボ由来の試料)生物学的複製を各々比較のために作製した。実験データを、NCBI GEOデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)に、SuperSeries GSE34818(マウスブレオマイシンモデルにおけるmiRNA及びmRNA応答に対して、それぞれシリーズGSE34812及びGSE34814;hFLlヒト線維芽細胞におけるmiRNA/siRNAトランスフェクション試験に対してシリーズGSE34815)として登録した。ヒト遺伝子発現チップのために、データを、log2に変換して、Rプログラミング
環境で、前に記載したように[Wu et al.、BMC.Bioinformatics、6:309、2005][34]、環状Loessアルゴリズムを使用して標準化した。ヒトバイオチップデータは、LTRC(ltrcpublic.org)及びLTRCプロトコルの一部としてLGRCウェブ部位で公開されて利用可能になっている。
標準化は、Bioconductor(http://www.bioconductor.org)から入手できるLimmaプログラムを使用して実施した。チップ内(2色染料交換試験のみ)及びチップ間標準化は、「PrintTip Loess」法及び分位法をそれぞれ使用して実施した。全ての比較の平均の比を計算してB試験分析を実施した。異なって発現した遺伝子を複数の試験についてBenjamini−Hochbergp値補正を使用して、0.05未満のp値に基づいて選択した。発現バイオチップのデータを、生物学的主題濃縮(カノニカル経路及び遺伝的存在の分子の機能)のために分析して、Ingenuity Pathway Analysisソフトウェア(http://www.ingenuity.com/)及びMediante((http://www.microarray.fr:8080/merge/index)[Le
and Barbry,Bioinformatics,23:1304−1306,2007][27]、プローブ及びデータのセットについての種々の情報を含む情報システムを使用して、生物学的ネットワークを構築した。遺伝子セット濃縮分析(GSEA)ソフトウェアを使用して、原理的に限定された遺伝子セットは、2つの生物学的状態間の差を特徴づけることができるかどうかを決定した[Subramanian et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、102:15545−15550、2005][28]。房状階層は、MultiExperiment Viewer(MeV) version 4.3を用い、マンハッタン距離及び平均リンクを使用して作製した。
MiRonTop[Le et al.、Bioinformatics、26:3131−3132、2010][29]は、特異的生物学的システムにおけるmiRNAの関与の可能性を確認するための、DNAバイオチップデータを統合しているオンラインJavaネットワークのツールである(http://www.microarray.fr:8080/miRonTop/indexで入手できる)。簡単に述べれば、MiRonTopは、発現レベル及び異なった発現閾値に基づいて、転写物を2つのカテゴリー(「上方制御」及び「下方制御」)に分類する。それは、次に、選択された予測ソフトウェア(Targetscan,MiRBase,PicTar、厳密な後代検索: miRNAの2〜7又は1〜8個の最初のヌクレオチド、TarBase vl)に基づいて、各遺伝子セットにおける各miRNAについて予測された標的の数を計算する。各カテゴリーにおけるmiRNA標的の濃縮は、次に、超幾何関数を使用して試験する。非siRNA標的効果の不在は、si−CAVlトランスクリプトーム試験においてSylamerツール[Van et al.、Nat.Methods、5:1023−1025、2008][30]を使用して裏づけられた。
肺線維芽細胞におけるプレmiRNA、LNAに基づくmiRNA阻害剤、標的部位ブロッキング因子及びsiRNAのトランスフェクション
プレmiR−199−5p、プレmiR−21及び対照miRNA(miR−Neg#l)はAmbionから得た。miR−199−5pノックダウン試験のために、抗miR−199−5pLNA及び抗miR−159sLNAの陰性対照(miRCURY LNAノックダウンプローブ)を、Exiqonから取り寄せた。CAV1及び対照siRNA(Silencer Selectにより検証されたsiRNA)を標的とするSiRNAはApplied Biosystemsから得た。
分子の構造は、ウミシイタケルシフェラーゼの後ろの、Xhol及びNotl制限部位で、後で記載するCAV1の3’UTRから誘導されたハイブリッドオリゴヌクレオチドをクローニングすることにより、pSI−CHECK(商標)−2ベクター(Promega)中で作製した。HEK293細胞は、10%FCSを含有するDMEM培地中で集密に培養した。次に、細胞を96ウェルプレートに分配して、リポフェクタミン2000(商標)(Invitrogen) を使用して、0.2μgのpsiCHECK(商標)−2プラスミド構造又はプレmiR−199−5p又は対照miRNAにより、10、30及び50nMの最終濃度で共トランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、ウミシイタケ及びホタルルシフェラーゼ活性をDual Glo Luciferase Assay Systemキット(Promega)を用いて評価し、ルミノメーター(Luminoskan Ascent、Thermolabシステム)を使用して測定した。
hsa−CAVl:WT(センス):
TCGAGGACACTTTAATTACCAACCTGTTACCTACTTTGACTTTTTGCATTTAAAACAGACACTGGCATGGATATAGTTTTACTTTTAAACTGTGTACGC(配列番号NO:1)
hsa−CAVl:WT(アンチセンス):
GGCCGCGTACACAGTTTAAAAGTAAAACTATATCCATGCCAGTGTCTGTTTTAAATGCAAAAAGTCAAAGTAGGTAACAGGTTGGTAATTAAAGTGTCC(配列番号NO:2)
hsa−CAVl:MUT(センス):
TCGAGGACACTTTAATTACCAACCTGTTACCTACTTTGACTTTTTGCATTTAAAACAGAGAGTCGCATGGATATAGTTTTACTTTTAAACTGTGTACGC(配列番号NO:3)
hsa−CAVl:MUT(アンチセンス):
GGCCGCGTACACAGTTTAAAAGTAAAACTATATCCATGCGACTCTCTGTTTTAAATGCAAAAAGTCAAAGTAGGTAACAGGTTGGTAATTAAAGTGTCC(配列番号NO:4)
MRC5細胞を、96ウェルのプレートに播種して、24時間後に4%集密度で、RNAi MAXリポフェクタミン試薬を使用して、100ngのSMADをレポーターとするベクター(Cignal Smadレポーター、Qiagen)及び10nMのLNA対照、LNA−199a−5p又はCAV1保護体により共トランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、細胞は血清不足となり、3時間後に10ng/mlのTGFβを加えて、細胞を溶解し、TGFβに24時間曝してからGloルシフェラーゼアッセイ(Promega)を実施した。
成熟miRNAの発現
miR−199a−5pの発現は、TaqManミクロRNAアッセイキット(Applied Biosystems)を、プロトコルで明記されたように使用して評価した。リアルタイムPCRを、GeneAmp Fast PCR Master Mix製品(Applied Biosystems)及びABI7900HTリアルタイムPCR装置を使用して実施した。成熟miRNA発現のレベルを、比較CT法(2−δCT)を使用して評価した。
プリmiR−199a−l及びプリmiR−199a−2の発現を、TaqManプリミクロRNAアッセイシステム(Applied Biosystems)をメーカーの勧告に従って使用して評価した。リアルタイムPCRを、TaqMan(商標)Gene
Expression Master Mix製品(Applied Biosystems)及びABI 7900HTリアルタイムPCR装置を使用して実施した。プリmiRNA発現のレベルは、比較CT法(2−δCT)を使用して評価した。
ヒト及びマウスCAV1の発現レベルは、TaqManミクロRNAアッセイシステム(Applied Biosystems)をメーカーの勧告に従って使用して分析した。リアルタイムPCRは、TaqMan(商標)Gene Expression Master Mix製品(Applied Biosystems)及びABI 7900HTリアルタイムPCR装置を使用して実施した。CAV1のレベル比較のCT方法(2-δCT) を使用して評価した。
細胞又は組織を、溶解緩衝液(細胞のためのM−PERタンパク質抽出緩衝液、組織のためのT−PERタンパク質抽出試薬)及びプロテアーゼ阻害剤の混合物(Pierce)中で溶解した。溶解物はBradfordアッセイ(Biorad)を使用してタンパ
ク質濃度をアッセイした。タンパク質(試料当たり10μg)をSDS−ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動にかけて、液体培地中でニトロセルロース膜(Hybond(商標)C Extra、Amersham Bioscience)上に移し、移動緩衝液(50mMトリス、40mMグリシン、1.3mM SDS及び10%エタノール)中で1時間30分移動させた。移動後、膜を5%ミルク0.1%TBS−TweenTween溶液でブロッキングし、室温で1時間攪拌した。次にそれを、1:400に希釈された抗CAVl一次抗体(Santa Cruz)及び1:1000の抗βアクチン抗体(Cell Signaling Technology)と終夜4℃で回転プレート上でインキュベートした。0.1%TBS−TweenTween中で30分間室温で3回洗浄後、膜を、HRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ、Cell Signaling)と結合したマウス抗IgG二次抗体(5%ミルクTBS−0.1%TweenTweenで1:5000に希釈)の存在下で、攪拌しながら1時間インキュベートした。0.1%TBS−TweenTween中で30分間数回洗浄した後、関心のあるタンパク質を化学発光(ECL基質、Amersham)により検出した。
パラフィンに包埋した厚さ5μmのマウス肺切片を、キシレンで脱パラフィンして(2×5分)、100%エタノール中で2×5分、95%エタノール中で2×5分、及び分80%エタノール中で2×5分インキュベートすることにより再水和した。水で洗浄後、抗原をクエン酸塩緩衝液(pH=6.0、DAKO)を使用して20分間の熱変性により脱マスクした。切片を室温に冷却して、次に0.1%TBS−TweenTweenで洗浄し、内在するペルオキシダーゼを、TBS中の3%過酸化水素で10分間インキュベートした。切片は、アビジン/ビオチン活性についてもブロッキングし、血清を含まないブロッキング試薬でブロッキングして、抗CAVl又は抗α−SMA一次抗体と室温で1時間、4℃で終夜、それぞれインキュベートした。次に関心のあるタンパク質を二次抗体とインキュベートした後、ジアミノベンジジン(DAB、DAKO)を用いて検出した。
組織中のmiR−199a−5pの所在を、二重にDIG−標識されたLNAプローブシステム(Exiqon、Woburn、MA)を使用して検出した。パラフィン中に包埋されたマウス組織をキシレンで脱パラフィンして(2×5分)、100%エタノール中で2×5分、95%エタノール中で2×5分、及び80%エタノール中で2×5分インキュベートすることにより再水和した。次にスライドをPBS(pH7.5)で洗浄し、プロテイナーゼK(Ambion)中37℃で15分間インキュベートすることにより透過性にした。スライドを再びPBSで洗浄して、湿潤チェンバー中においてハイブリッド形成緩衝液(50%ホルムアミド、5×SSC、0.1%Tween20、9.2mMクエン酸、50μg/mlヘパリン、及び500μg/ml酵母RNA、pH6)中でプレハイブリッドさせた。次に、二重DIG標識LNAプローブを80nMの濃度で加えて、湿潤チェンバー中50℃で2時間インキュベートした。スライドを、5×SSC、l×SSC及び0.2×SSC溶液中同じハイブリッド形成温度ですすいだ。これに続いて2%ヒツジ血清、PBS+0.1%Tween20(PBST)中2mg/mlのBSAでブロッキングし、抗DIG−APのFabフラグメント(1:800)(Roche Applied Sciences)と室温で2時間インキュベートした。PBSTで洗浄後、染色反応を、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホスフェート(BCIP)/ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)溶液(Roche Applied Sciences)中で1mMレバミゾールと終夜室温でインキュベートすることにより生じさせた。PBSTで洗浄することにより十分な青色沈殿が発生したことを観察した後、染色反応を停止させた。次にスライドを対比染色し、台に載せてスライドカバーで覆った。
MRC5細胞を12マルチウェルプレートの内側に置かれたRound Glass Coverslips O 16mm(Thermo Scientific)上で成長させた。Coverslipsスライドをリン酸緩衝食塩水で洗浄して4%パラホルムアルデヒド中で15分間固定し、次に、細胞を、0.1%トリトンX−102(Agilent Technologies)を使用して10分間透過性にし、BSA(3%)を含有するPBS溶液で30分間ブロッキングした。一次抗体とのインキュベーションをブロッキング溶液BSA(1%)中37℃で1時間、以下の希釈で実施した:α−SMA(1:1000)、CAV1(1:50)。PBSで3回洗浄した後、細胞を、二次Alexa Fluor 488ヤギ抗マウスIgG(Invitrogen)(1:500)、Alexa Fluor 647ヤギ抗ウサギIgG(Invitrogen)(1:500)及びAlexa Fluor(登録商標)647ファロイジン(A22287、Life Technologies)(1単位/スライド)と共にインキュベートした。45分後、Coverslipsのスライドを、顕微鏡スライド上でPro10ng(登録商標)Gold Antifade試薬DAPI(Invitrogen)を使用して固定した。蛍光をオリンパスの共焦点走査顕微鏡FV10iで検査した。
ヒト肺線維芽細胞(MRC−5又はhFL−1)を、6ウェルプレート中の10%FCSで補完されたDMEM培地中に分配した(1ウェル当たり150,000細胞)。翌日、培養培地を血清を含まない培地と入れ替えて、細胞をプレmiR−199a−5pでトランスフェクトした。次に、トランスフェクションの48時間後に、細胞増殖を、click−iT(商標)EdU細胞増殖アッセイキット(Invitrogen)を使用してメーカーの勧告に従ってフローサイトメトリーにより評価した。
ヒト肺線維芽細胞(MRC−5又はhFL−1)を12ウェルプレートに入れた(1ウェル当たり500,000細胞)。集密になったら、培養培地を血清を含まない培地と入れ替えて、細胞を、プレmiR−199a−5p又は抗miR−199−5p阻害剤(LNA抗miR−199−5p、Exiqon)でトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、細胞をピペットの先端で擦過して、TGFβ(20ng/ml)で処理し、又はしなかった。次に「インビトロ」の治癒過程を、擦過の24時間後に、調節インサート(PeconGmbH)を備えたAxiovert 200Mi倒立顕微鏡(Carl Zeiss)を使用してビデオ顕微鏡により5%CO2及び37℃でフィル
ムに撮影した。背景光のある像を、Metamorphソフトウェア(Roper Scientific)を使用して処理するCoolSNAPHQ CCDカメラに付いた倍率10の位相差レンズを通して30分毎に撮影した。細胞運動性を、ImageJ image分析ソフトウェアを使用して回復した面積のパーセンテージを評価することにより計算した。
mR−199a−5pを過発現しているMRC5線維芽細胞の侵襲を、市販の24ウェルBioCoat Matrigel Invasionチェンバー(BD Biosciences)を使用してアセスした。簡単にいうと、肺の繊維芽細胞を上記のプレmiR−199a−5p又は陰性対照のいずれかでトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、細胞をトリプシン−EDTAを用いて収集し、遠心分離してDMEM培地中に再懸濁させた。細胞懸濁液(1×105細胞/ウェル)を上側のチェンバーに
加えた。チェンバーの下側のウェルを、化学誘引物質として10%FBSを含有するDMEM培地で満たし、それに対して上側のチェンバーはDMEMのみで満たした。37℃における48時間のインキュベーションの後、膜の上の非侵襲細胞を綿スワブで取った。侵襲細胞を含む膜をメタノールで固定して、PBSで3回洗浄し、DAPIのハードセット
(Vector Laboratories)を用いて蛍光性顕微鏡観察のためにガラススライド上に載せた。
結果は、平均±平均の標準誤差として示した。統計分析は、Microsoft Excel(商標)により提供されるスチューデント検定を使用して実施した。
肺線維症抵抗性マウスと感受性マウスとは、ブレオマイシンに対する応答において明確に異なったmiRNA発現プロファイルを示す
ブレオマイシンは、マウスを含む種々の動物モデルに肺線維症を誘発するために選択された実験ツールである。このようにして、C57BL/6タイプのマウスは、ブレオマイシンに誘発される肺線維症に感受性であるとみなされるが、それに対してBALB/cタイプのマウスは抵抗性である。肺線維症プロセスに関与している可能性のあるmiRNAを同定するために、ブレオマイシンに誘発された肺線維症感受性マウス及び抵抗性マウス(1群当たりのマウスn=3)におけるブレオマイシンに対する応答の肺のmiRNA発現プロファイルを、バイオチップに基づく、他のどこかで記載された[25、26、13]プラットホーム(データセット1、アクセッション番号GSE34812)を使用して検討した。特に、発現プロファイルの検討は、線維症プロセス、即ち、ブレオマイシン投与の7日及び14日後の線維症相に焦点を当てた。同定された発現プロファイルは、少なくとも1つのタイプにおいて、対照の肺とブレオマイシン治療した動物の肺の間で有意に異なって発現した22種のmiRNAからなり、大多数はブレオマイシンを点滴注入された肺における上方制御であった(図1A)。興味あることに、肺線維症の進行中のブレオマイシンに対する応答において、miR−199a−5pは、C57BL/6タイプマウスにおいてのみ増大した発現を示した(図IB)。ブレオマイシン投与の14日後のmiR−199a−5p発現のレベルにおける増大は、より大きい数の動物で(1群当たりのマウスn=5)リアルタイムPCRにより独立に確認された(図2A)。その結果として、これらの結果は、基本的に、miR−199a−5pが、肺線維症プロセス中に重要な役割を演ずることを示した。
miRNAの生物学における主な関心の1つは、調節される標的mRNAを実験的に同定し且つ特徴づけることができることである。この関係で、コンピューターシミュレーションによる手法(標的予測バイオインフォマティクスソフトウェア)及び実験的手法(トランスクリプトームチップ)、正規の場所外のmiRNA発現及びルシフェラーゼと融合された関心のある遺伝子の3’−UTR部を含有するレポーターベクターを、前に記載されたように[25、13]、組み合わせた。多数の標的予測アルゴリズムが提案されている。それらは、一般的に、i) miRNAの5’区域(「シード」と称する)における、miRNAと標的mRNAの3’−UTRとの間の相補性、及びii)標的のmRNAの3’−UTR中のこの配列の系統発生的保存をもとに判断する。
a−5pの最も重要な標的を表すように思われる。
カベオリン−1(CAV1)は、カベオラと称される小さい原形質膜の陥入の形成に必須の22kDaの膜タンパク質である。カベオラは、組織により量は異なるが、大部分のタイプの細胞に見出される。それらは、脂肪細胞、内皮細胞、タイプI肺胞細胞、線維芽細胞及び平滑筋細胞及び横紋筋細胞などの分化した細胞に特に多い。カベオラは、それらの陥入した円形の形状に基づいて形態学的に同定され得る浮遊脂質のサブカテゴリーを表し、カベオリン−1、カベオリン−2及びカベオリン−3と名づけられた構造タンパク質の存在により特徴づけられる。カベオリン−1及び−2は、大部分の分化した細胞に比較的遍在する分布を有するが、骨格筋繊維及び心筋細胞は例外である[Scherer et al.、J.Cell Biol.,127:1233−1243,1994][20]。カベオリン−3の発現は、骨格筋、横隔膜及び心臓に限定される[Tang et
al.、J.Biol.Chem.,271;2255−2261,1996][21]。興味あることに、研究により、カベオリン−1遺伝子が欠失したトランスジェニックマウスは、特に肺で種々の異常を呈することが、最近示された[Park et al.、Biochemistry,42:15124−15131,2003][22]。これらのマウスは、特に、肺線維症及び内皮細胞増殖を発症する。インビトロ研究により、肺線維芽細胞において減少するカベオリン−1発現は、TGFβのこの型の細胞に対するプロ線維症効果、特に線維芽細胞の活性化、増殖及び筋線維芽細胞への分化を促進することも示された[Wang et al.、2006、上で挙げた][23]。
TGFβによる刺激後のCAV1発現における減少が、miR−199a−5p発現の増大と関連するかどうかを検討した。この仮説を試験するために、MRC5細胞系統をTGFβに曝して、CAV1及びmiR−199a−5p発現のレベルを分析した。Taqman RT−PCRにより検出されたように、ヒト線維芽細胞をTGFβで24から48時間処理すると、CAV1 mRNAにおける著しい減少が生じたが、それに対してmiR−199a−5pの発現は有意に上方制御された(図7A及び7B)。最終的に、時間依存性のCAV1タンパク質レベルの減少も、TGFβ処理後に観察された(図7C)。全てのこれらの結果は、基本的に、miR−199a−5pがヒト線維芽細胞におけるCAV1発現のTGFβ依存性の下方制御の原因になり得ることを示す。
するLNAに基づくTarget Site Blockerを使用して、追加の実験を実施し、CAV1の3’UTRに対するmiR−199a−5pの結合に特異的に干渉した。図7Dに描いたように、LNAに媒介されるmiR−199a−5pのサイレンシング及びCAV1 3’UTRに対するmiR−199a−5p結合のブロッキングの両方共、TGFβに誘発されたCAV1の下方制御を阻害する。要するに、これらの結果は、肺線維芽細胞において、TGFβに対する応答におけるmiR−199a−5pの誘発は、CAV1の3’UTRに所在の特有の部位に対する結合によりCAV1の下方制御を媒介することを示す。
CAVl発現を線維症マウス肺で検討した。以前の研究と一致して、データは、ブレオマイシン投与の14日後のC57BL/6JマウスにおけるCAVlタンパク質のレベル及びmRNA発現の有意の減少を示す(図8A、8B及び8C)。それに加えて、ブレオマイシン処理の14日後のC57BL/6Jマウスから得た肺組織切片に対するCAVlの免疫細胞化学染色は、肺の線維症領域におけるCAVlの顕著な減少を示した(図8D)。まとめて、これらの結果は、肺線維芽細胞において、線維症マウス肺におけるmiR−199a−5pの発現の上方制御は、CAVlの下方制御と相関することを示した。
10個のIPF試料及び10個の対照試料からなる最近公開されたデータセット(アクセッション番号GEO GSE13316)を使用して、miR−199a−5p発現がIPFを患う患者の肺においても調節解除されているかどうかを検討した。興味あることに、対照と比較して、IPF試料におけるmiR−199a−5pの発現は、非常に有意に増加した(p=0.005、p=0.006、表1)。
ratio)は0.54であり(FDR<0.05)、同じ対象者に対するmiR−199a−5pの線形比は1.35(p<0.05)であった。結論として、IPFになりやすい肺区域の検査は、減少したCAV1発現に伴った肺線維芽細胞におけるmiR−199a−5p発現を示した(図11C及び11D)。
CAV1発現のレベルが肺線維芽細胞の線維形成活性化に関与する決定的に重要な因子であるとして、肺線維芽細胞中におけるmiR−199a−5pの過剰発現がCAV1発現の減少と関連する知られているプロ線維症効果(即ち線維芽細胞増殖、移動及び筋線維芽細胞への分化)を反復するのに十分であるかどうかを検討した。図12に表したように、miR−199a−5p前駆体をトランスフェクトすることにより増大するmiR−199a−5pレベルは、肺線維芽細胞の移動(図12A及び12B)、侵襲(図12C)及び増殖における有意の増大を生じさせる(図12D)。それに加えて、miR−199a−5pの過剰発現は、ACTA2発現(筋線維芽細胞の分化を示す)(図12E)、並びにTGFβに対して応答するCOLlAl誘発の有意の相乗作用の増大も生じさせる(図12F)。
最終的に、miR−199a−5pはTGFβシグナル伝達に関与することが示された。このために、TGFβシグナル伝達のシグネチャーは、肺線維芽細胞で実験的に特徴づけられ、GSEAの方法を使用してmiR−199a−5pのシグネチャーと比較された。この分析により、これら2つのシグネチャー間で、1を超える標準化された強化スコア(上方及び下方制御遺伝子のそれぞれについて、名目p値及びFDRq値<0.05で1.4及び2.17)と見積もられた有意の重なりが示され、miR−199a−5pは、基本的に、肺線維芽細胞におけるTGFβ応答メディエーターであることが示された(図14B)。
数を増す証拠により、miRNAは、心臓、腎臓、肝臓又は肺などの種々の器官における線維症プロセスにおいて役割を演ずることが示唆される。例えば、以前の研究により、miR−21は、肺及び心臓の線維症において重要な役割を有することが示されている。このように、miR−199a−5pが、組織線維症、即ち腎臓及び肝臓の線維症の1形態においても調節解除されているかどうかを、十分特徴づけられた実験用マウスモデルを使用して検討した。この目的で、これらの線維症モデルで得られたmiRNAの発現プロファイルを、それらのmiRNAに基づく同じプラットホームを使用して比較した。きまって調節解除されている5種のmiRNAが、p値<0.01で同定された(図17)。これらのmiRNAのなかで、3種が下方制御され(miR−193、miR−30b及びmiR−29c)、2種が上方制御された(miR−199a−3p及びmiR−199a−5p)(下の表4を参照されたい)。
BL/6マウスよりも著しい肝臓の線維症を有するとして肝臓線維症の重症度により補正した(図19A及び19B)。それに加えて、miR−199a−5p発現は、CCl4
により誘発された実験的肝臓線維症の退縮中に、有意に減少した(図19D)。さらに、星状細胞のTGFβへの露出は、miR−199a−5p発現の増大及びCAV1発現のレベルの減少と関連することが示された(図19E及び19F)。興味あることに、miR−199a−5pの増強された発現は、肝臓線維症を有する患者からの臨床試料においても観察された(図18)。
手順の28日後(即ち、線維症が確立したとき)に実施したIn situハイブリッド形成は、正常腎臓においてはmiR−199a−5pについていかなる検出可能なシグナルも示さなかったが、それに対して、ハイブリッド形成シグナルは、筋線維芽細胞と適合性の領域にある損傷された腎臓の全体にわたって有意に増大した。さらに、手順の28日後の線維症マウスの腎臓について実施したCAV1免疫化学検査は、腎臓の線維症領域におけるCAV1発現において顕著な減少を示した(図20C)。
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Claims (11)
- 線維増殖障害を予防及び/又は治療するためのmiR−199a−5p阻害剤の使用。
- 線維増殖障害が突発性肺線維症である、請求項1に記載のmiR−199a−5p阻害剤の使用。
- 医薬製品としてのmiR−199a−5p阻害剤の使用。
- 以下のステップを含むことを特徴とする、対象者における線維増殖障害のためのインビトロの診断方法:
(i)前記対象者からの生物学的試料におけるmiRNAの発現レベルを定量的に測定するステップ、
(ii)前記対象者からの生物学的試料のmiRNA発現プロファイルを参照生物学的試料の同じmiRNAの発現プロファイルと比較するステップにおいて、前記発現プロファイルは、mir−146b、miR−34a、miR−21、miR−449a、miR−449b、miR−20a、miR−18a、miR−223、miR−449c、miR−147b、miR−152、miR−181ac、miR−451、miR−351、miR−133ac、miR−214、miR−199a−5p、miR−132、miR−222、miR−342−3p、miR−345−5p及びmiR−221からなるステップ;
(iii)前記対象者からの前記生物学的試料による発現のレベルが、前記参照試料による少なくとも1種の同じmiRNAの発現のレベルに対して異なる前記発現プロファイル内の少なくとも1種のmiRNAを同定するステップ。 - 以下のステップをさらに含む、請求項4に記載のインビトロの診断方法:
(iv)発現のレベルが、ステップ(iii)で同定された前記の少なくとも1種のmiRNAのレベルにより調節される少なくとも1種の標的遺伝子を同定するステップ。 - ステップ(iii)において同定される前記の少なくとも1種のmiRNAがmiR−199a−5pである、請求項4又は5のいずれか1項に記載のインビトロの診断方法。
- ステップ(iv)において同定される前記の少なくとも1種の標的遺伝子が、カベオリン−1をコードする、請求項5又は6に記載のインビトロの診断方法。
- 以下のステップを含むことを特徴とする、線維増殖障害を発症しやすい対象者を同定する方法:
(i)前記対象者からの生物学的試料中におけるmiR−199a−5p発現のレベルを定量的に測定するステップ;
(ii)前記前記対象者からの生物学的試料におけるmiR−199a−5p発現のレベルを参照生物学的試料中におけるmiR−199a−5pの発現のレベルと比較するステップ;
(iii)miR−199a−5pの発現レベルの増大を検出するステップ。 - 以下のステップをさらに含む、請求項8に記載の方法:
(iv)発現レベルが、ステップ(iii)で同定されたmiR−199a−5pの発現レベルにより調節される少なくとも1種の標的遺伝子を同定するステップ。 - ステップ(iv)で同定される前記少なくとも1種の標的遺伝子がカベオリン−1をコードする、請求項9に記載の方法。
- 創傷修復を刺激するためのmiR−199a−5p阻害剤の使用。
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