JP2015509914A - 選択的ｇｐｃｒリガンド - Google Patents

Abstract

過去１０年間にＡ−ＧＰＣＲ（Ｇタンパク質共役受容体）クラスに関する多量の構造情報が明らかになった。しかし、同じリガンドに対する応答において完全に異なる生物学的機能を示すアンジオテンシン受容体ＡＴ１ａＲおよびＡＴ２Ｒなどの密接に関連する受容体サブタイプのリガンド選択性の構造的および電気的基礎は、ほとんど理解されていない。生物系における複雑な応答をモニターするために、選択性に関して勾配を示すリガンドを有することは有用である。本研究において本発明者らは、アンジオテンシンＩＩにおける芳香族−プロリル相互作用を芳香族電子の変更を通じて調節することによって、２つのアンジオテンシンＩＩ受容体サブタイプ、ＡＴ１ａＲおよびＡＴ２Ｒのリガンド選択性を調整するための効率的な方法を示す。この戦略に基づいて、ＡＴ２Ｒ選択的で高親和性のアゴニストアナログ（Ｋｉ＝３ｎＭ）が得られた。

Description

ＧＰＣＲは、細胞外環境から細胞内空間へのシグナル伝達の重要な決定要素である^１、２。それらは小さな神経伝達物質からホルモンに至る数々の細胞外リガンドによって活性化され得るが、ロドプシン様ＧＰＣＲの重要な構造エレメントにおける配列保存^３は共通の活性化機構を提案している。ＧＰＣＲの近年のＸ−線構造^{１、４〜７}はＧＰＣＲ−ファミリーＡの全体的構造を明確にし、リガンド−結合ポケットの構造を正確に示した。しかしこれらの構造は、密接に関連する受容体サブタイプへのリガンド選択性の機構についての疑問も生じさせた^１、８。例えば、ヒトｂ１およびｂ２アドレナリン受容体のリガンド結合ポケットを直接囲む残基は同一であると考えられるが、リガンドは全く異なる特異性で２つの受容体サブタイプに結合する^１、８。

したがって、ＧＰＣＲ分子認識は、受容体の分子構造だけに依存するありふれたプロセスではなく、リガンド構造に強く関連する。これは、シグナル伝達状態への移行が、その内在性リガンドであるレチナールのｃｉｓからｔｒａｎｓへの異性体構造スイッチによって達成されるロドプシン活性化の機構^９、１０から明らかである。このｃｉｓ／ｔｒａｎｓスイッチの主な結果は、受容体活性化を引き起こす膜貫通らせん間の静電的制限の大部分を破壊する、かつ／または、弱めることである^１０。そのようなｃｉｓからｔｒａｎｓへの異性化スイッチは、プロリンが中心的存在である多数の生物学的プロセスの決定的構成成分として新たに明らかになりつつある^{１１〜１４}。

生理活性ホルモンであるアンジオテンシンＩＩ（ＡＩＩ：ＤＲＶＹＩＨＰＦ）は、異性体状態がＡＴ１ａおよびＡＴ２受容体サブタイプの活性化において重要であり得るプロリン残基を、その一次構造中に有する。水性溶液中では、天然ＡＩＩの一般的な立体構造異性体は、ｔｒａｎｓ（＞９５％）である^１５。興味深いことに、立体構造の可塑性を提供するＡＩＩ中のＰｒｏ７Ｇｌｙ変異は、ＡＴ２Ｒに対するその親和性をほとんど保持していた一方で、ＡＴ１ａＲに対しては１５０分の１の親和性を示した^１６。

生じる重要な疑問は、ｃｉｓ／ｔｒａｎｓ相互変換のエネルギー障壁の低下が、２つのＡＩＩ受容体サブタイプに対する結合親和性および特異性への影響を伴ってＡＩＩが２つの異なる立体構造（ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ）で同時に存在できるようにするかどうかである。受容体サブタイプ選択性におけるプロリン異性化の推定される役割は、ＡＴ２Ｒ活性化の効果（血管拡張、アポトーシスおよび抗増殖性）がＡＴ１ａＲによって調節されるもの（ＡＴ１について細胞増殖および増殖）と対立することから非常に価値がある可能性がある^{１７〜１９}。加えて、ＡＴ２Ｒ活性化が膵がん細胞の増殖を抑制することから、この受容体はこの種類のがんに対する化学療法の標的候補である^{２０、２１}。したがって、制御リガンドの組み合わせ使用によるＡＴ１ａおよびＡＴ２受容体のさまざまな機能的応答の微調整は、強力な治療用ツールである可能性がある^２２。

本明細書において本発明者らは、リガンド芳香族−プロリル相互作用の電子的調節を通じてＡＴ１ａＲおよびＡＴ２Ｒサブタイプのリガンド選択性を微調整するための新規戦略を開示する。ＡＴ２Ｒに対する新規の低ｎＭ親和性で選択的な新規アゴニストは、この戦略に基づいて確立された。

本発明の第一の態様では、アンジオテンシンＩＩ受容体の選択的リガンドを調製するための方法であって、
（ｉ）ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ異性化に感受性である前記受容体のリガンドのモチーフを選択するステップと、
（ｉｉ）前記リガンドを、前記モチーフを含むデータベース中の配列と比較し、前記モチーフの中または近傍における置換のｃｉｓまたはｔｒａｎｓ異性体の形成への影響を判定するステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）における比較に従って前記リガンド中の置換を生じさせ、それによって前記リガンド中においてｃｉｓまたはｔｒａｎｓ異性体を選好するステップと
を含む、方法が提供される。

Ｇタンパク質共役受容体サブタイプに密接に関連する選択的リガンドの開発は、受容体病態生理学的反応を解読するために重要であるが、冗長で時間のかかる方法である。リガンド結合およびサブタイプ選択性の相互作用決定因子の理解がない場合は、試行錯誤およびセレンディピティーは選択的リガンドの順調な開発において重要な役割を演じる。選択的リガンド認識を達成するための原理を規定することは、受容体サブタイプが反対の機能を示す場合に特に重要である。これは２つのＡＩＩ受容体サブタイプについて疑いもなく明らかである。ＡＴ１ａＲは、いくつかの例を挙げると心不全、粥状動脈硬化、網膜症、心肥大、血管平滑筋の増殖および高血圧などの多数の病態に関与している^３７。反対にＡＴ２Ｒは抗増殖性、抗炎症、神経細胞分化、血管リモデリングおよび腫瘍抑制などのＡＴ１Ｒのものとはかなり異なる機能を仲介する^{２０、２１、３８〜４０}。したがってＡＴ２Ｒは重要な医薬品標的になっている。リガンド−受容体認識相互作用の詳細な知識の欠如のため、ＡＴ２Ｒの選択的リガンドの同定は、長く細心の注意を要する努力の後にもたらされた^４１。

本発明者らは、ホルモンＡＩＩによる親和性と同様の親和性で認識されるリガンドを用いて、２つの受容体サブタイプのリガンド−受容体選択性を調整するための戦略を開発した。

ポリペプチドがｃｉｓ−ｔｒａｎｓ異性化を示すためには、Ｎ−置換アミノ酸が必要である。例としては、サルコシンおよびプラリンを含む。好ましくは請求項１に記載の方法では、モチーフはプロリンを含む。配列Ｐｒｏ−Ｘ（式中Ｘは任意のアミノ酸）は、ポリペプチドにｃｉｓおよびｔｒａｎｓ異性体の両方について同様のエネルギーを与え、これは両異性体が理論的に可能であることを意味する。Ｘの性質は、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ異性体の間の平衡に影響を及ぼす。

好ましい実施形態では、モチーフがＸ_１−Ｐｒｏ−Ｘ_２である（式中Ｘ_１およびＸ_２は同じまたは異なっており、任意のアミノ酸であってよい）本発明による方法が提供される。Ｘ_１は、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ異性体の間のバランスにも影響を与える。これらそれぞれの位置に好適なアミノ酸を選択することによって、リガンドが一方または他方の異性体形態を選好するように、または場合によっては両方の異性体形態をとることができるように調整できる。

本発明の一実施形態ではＸ_２はＰｈｅである。したがって、モチーフＸ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅを含むリガンドを、ｃｉｓまたはｔｒａｎｓ異性体形態を選好する能力について分析でき、ｃｉｓまたはｔｒａｎｓ異性体の占有率（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）は、ｐｄｂなどのデータベースにおいて評価でき、そのような異性体形成の可能性はＸ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅモチーフ中のＸの固有性に基づいて検査リガンドに与えられる。

そのような方法によってリガンドは、ＡＴ２ＲまたはＡＴ１Ｒに選択的であるように設計できる。例えばＡＴ２Ｒに選択的であるリガンドは、溶液中でｃｉｓ−異性体化の増加を示すことができる。

本発明の方法における使用のための、すなわちリガンド候補に関する基礎としてのモチーフの供給源は、アンジオテンシンの種々の形態である。例えばリガンドは、アンジオテンシンＩ、ＩＩ、ＩＩＩもしくはＩＶの変異体またはサララシンであってよい。サララシンは、Ｎ末端およびＣ末端アミノ酸がサルコシンおよびアラニンでそれぞれ置換されているアンジオテンシンＩＩの誘導体である。

一実施形態では、モチーフは、アンジオテンシンＩＩ（ＡＩＩ）中のＨｉｓ^６−Ｐｒｏ^７−Ｐｈｅ^８モチーフである。

一実施形態では、Ｈｉｓ^６残基はＴｙｒにより置換され、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−ＰｈｅモチーフおよびＡＩＩのＴｙｒ^６アナログを産生する。したがって第二の態様では、配列Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅを有するアンジオテンシンＩＩ受容体のリガンドが提供される。

代替的な実施形態では、４−置換Ｐｈｅ残基（この位置に電子供与性または電子求引性の基が導入されている）は、ＡＩＩの位置６に用いられる。したがって配列Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（式中Ｐｈｅ^６は４位で置換されている、すなわちフェニルアラニン環のパラ位の水素を置換している）を有するアンジオテンシンＩＩ受容体のリガンドが提供される。

一実施形態では、リガンドは、ＡＴ２受容体に選択的である。代替的な実施形態ではリガンドは、ＡＴ１受容体に選択的である。一般に、位置６における電子供与性の置換はＡＴ２Ｒに対する選択性を選好し、電子求引性の置換はＡＴ１Ｒに対する選択性を選好する。

リガンドのＡＩＩ受容体サブタイプ選択性は、ＡＩＩ（４−ｘ−Ｐｈｅ^６）の位置６に導入されたフェニルアラニンのパラ位にある水素の単純置換の電子的特徴を調整することによって正確に整えることができる。具体的には、電子供与基（−ＯＨ）を含む［Ｙ］^６−ＡＩＩアナログは、ＡＴ２Ｒに対する選択的で高親和性の結合剤を生じる（Ｋｉ＝３．４±０．８ｎＭ）一方で、電子求引基はこの受容体に対する高結合親和性および選択性を完全に消失させる（図５）。最も重要なことに、この受容体認識表現型は、この電子的調節によって誘導される４−ｘ−Ｐｈｅ^６−Ｐｒｏ^７−Ｐｈｅ^８モチーフのｃｉｓ形質（ｃｈａｒａｃｔｅｒ）のアーキテクチャおよび緻密度（ｃｏｍｐａｃｔｎｅｓｓ）に直接関連する。電子不足芳香族残基を位置６に含有するＡＩＩアナログは、ｃｉｓアミド結合に比較的不利であり、電子が豊富な芳香族残基とは対照的にＡＴ２受容体への選択性および親和性の低下を示す。例えば、［４−ＮＯ_２−Ｆ］^６−ＡＩＩは、［Ｙ］^６−ＡＩＩと比較してＡＴ２Ｒに対して３００分の１の親和性を示したが、ＡＴ１ａＲに対しては高い親和性（ｎＭ）を示した（未発表データ）。同じ系において［Ｆ］^６−ＡＩＩはＡＴ１ａＲおよびＡＴ２Ｒの両方に対して同様の親和性だが、［Ｙ］^６−ＡＩＩのＡＴ２Ｒに対する親和性と比較して５０分の１より低く低下した親和性を示した（未発表データ）。このｃｉｓ−ｔｒａｎｓ異性化調節は、Ｐｒｏ^７と４−ｘ−Ｐｈｅ^６の芳香族環電子との間の相互作用の調整に基づいている^２７。したがってｃｉｓ形態は、電子不足プロリルＣ−Ｈ結合と電子が豊富な芳香族環とにおいて発達するＣＨ−π相互作用を通じて安定化される^４２。実際に本発明者らのＮＭＲデータは、ＡＴ２選択的アナログ［Ｙ］^６−ＡＩＩにおいて、プロリン周辺（Ｙ^６−Ｐ^７−Ｆ^８、図２ａ）の２つの芳香族側鎖のｃｉｓ形質および環のパッキングの両方の増強を示した。この残基のパッキングは、アミドプロトン温度係数研究および拡散配列実験（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｏｒｄｅｒｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）によって判定されたとおり（図２ｃ、ｄ）、関連するペプチド結合の保護をもたらし、したがってＡＴ２Ｒリガンド結合ポケットをさらに疎水性の環境へと移行させるコストを低下させる。

芳香族電子の精密な調整を介してリガンド受容体サブタイプ選択性を調節するための戦略が記載されるのは初めてである。この戦略の枠組みに由来する選択的で高親和性のＡＴ２Ｒアナログ、［Ｙ］^６−ＡＩＩは、ＰＣ１２細胞においてＡＴ２Ｒの活性を刺激する（図４）。

さらなる態様では、本発明の前述の態様により選択されたリガンドが腫瘍治療における使用のために提供される。

ＡＴ２Ｒが腫瘍治療のための標的であることは周知である。詳細には、ＡＴ２Ｒノックアウトが膵臓腫瘍の進行を促進し^２０、ＡＴ２Ｒの過剰発現が肺腺がんにおける細胞死を誘導することが示されている^２１。したがってＡＴ２Ｒを選択的に活性化する本発明によるリガンドは、抗腫瘍治療のための候補である。

好ましくは、リガンドは、配列Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅを含むアンジオテンシンＩＩ受容体のリガンドである。

一実施形態では、リガンドは、配列Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅを有する。

さらなる実施形態では、柔軟な（ｌｉｔｈｅ）リガンドは、電子供与性基または電子求引性基がフェニルアラニン環のパラ位の水素を置換するように導入されている４−置換Ｐｈｅ残基を有し得る。

例えばリガンドは、配列Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（式中Ｐｈｅ^６は４位で置換されている）を有し得る。

一実施形態では、リガンドは、ＡＴ２Ｒシグナル伝達を介した膵がん細胞の増殖における負の制御因子としての使用のために提供される^２０。さらなる実施形態ではリガンドは、ＡＴ２Ｒシグナル伝達を通じた肺腺がん細胞の増殖における負の制御因子としての使用のために提供される^２１。

好ましい実施形態ではリガンドは、［Ｙ］^６−ＡＩＩリガンドである。

さらなる態様では、腫瘍治療を必要とする患者において腫瘍を治療するための方法であって、本発明の前述の態様において記載のリガンドの薬学的有効量を前記患者に投与するステップを含む方法が提供される。

さらなる態様では、本発明の前述の態様において記載のリガンドは、腫瘍の治療のためにアンジオテンシンＩアンタゴニストとの組み合わせで提供される。一実施形態では、本発明の前述の態様によるリガンドおよびＡＴ１アンタゴニストは、腫瘍の治療において同時、別々に同時または逐次使用のために提供される。

さらに本発明の前述の態様によるリガンドおよびＡＴ１アンタゴニストを１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤または担体と共に含むキットが提供される。

例示的なＡＴ１アンタゴニストはロサルタンである。

［Ｙ］^６−ＡＩＩが溶液中でｃｉｓ異性化の増強を示すことを示す図である。ａ）プロリルＴｙｒ^６−Ｐｒｏ^７結合についてのｃｉｓ−ｔｒａｎｓ異性化の模式図。ｂ）［Ｙ］^６−ＡＩＩの３５０ｍｓ ＮＯＥＳＹスペクトル（９０％Ｈ_２Ｏ／１０％Ｄ_２Ｏ）の選択された領域。赤線および緑線はｔｒａｎｓおよびｃｉｓ異性体それぞれについてのＮＯＥ結合性（ＮＯＥ ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）を示している。 操作されたＡＩＩアナログの特徴的なｃｉｓおよびｔｒａｎｓ立体構造異性体の溶液構造を示す図である。ａ、ｂ）２つの立体構造異性体の逆重畳積分は、高品質の化学シフト分散に基づいて達成された。ｃ）［Ｙ］^６−ＡＩＩについてのＮＨΔδ／ΔＴ対ＣＳＤ。点線は、（Δδ／ΔＴ＝−７．８（ＣＳＤ）−４．４）に対応し、タンパク質データベース中で捕捉されたＮＨの最適な区別を提供する。ｄ）［Ｙ］^６−ＡＩＩの^１Ｈ ＤＯＳＹのスペクトルを示す。 アナログ選択性を示すグラフである。：ＡＴ１Ｒ、ＡＴ２Ｒ野生型および変異体へのアナログの結合。［Ｙ］^６−ＡＩＩ（ａ）および［４−ＯＰＯ３Ｈ２−Ｆ］^６−ＡＩＩ（ｂ）アナログのＡＴ１Ｒ（黒）、ＡＴ２Ｒ野生型および変異体への競合結合アッセイ：ＡＴ１Ｒ、白丸；野生型ＡＴ２Ｒ、黒丸；ＡＴ２Ｒ−Ｙ１８９Ａ、青菱形；ＡＴ２Ｒ−Ｙ１８９Ｎ、緑三角；ＡＴ２Ｒ−Ｆ２７２Ａ、赤四角；ＡＴ２Ｒ−Ｆ２７２Ｈ、オレンジ三角。非標識リガンドの非存在下での［^１２５Ｉ］−ＡＴＩＩの結合を１００％と設定した。示したデータは、２回の独立した実験由来であり、各データ点は３連で測定された。Ｋ_ＤおよびＫ_ｉ値は表４に示される。 ［Ｙ］^６−ＡＩＩアナログのＡＴ２受容体に対するアゴニスト効果を示すグラフである。ＡＴ２過発現ＰＣ１２Ｗ細胞における神経突起伸長の増大。ＰＣ１２Ｗ細胞（Ａｄ−ＡＴ２Ｒで形質導入されたまたは形質導入されていない）は２４ウェルプレートに播種され、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中で２４時間培養された。培養培地は５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＤＭＥＭに交換された。３時間後、細胞は１ｎＭのＡＩＩまたは［Ｙ］^６−ＡＩＩのいずれかで刺激された。２４時間後、１ウェルあたり写真１５枚が撮られた。写真５枚が無作為に選択され、神経突起伸長を示している細胞が計数された。神経突起伸長を有する細胞の全細胞に対する割合が算出された。神経突起伸長細胞は、その細胞サイズより長い神経突起の長さを有する細胞として定義された。この実験は、３連で実行された。データは平均±ＳＥ値として表される。 ＡＴ２およびＡＴ１ａ受容体サブタイプについてのリガンド選択性の制御に関する機構的基礎を示す図である。これは、芳香族電子によるｃｉｓ−ｔｒａｎｓ異性化および芳香族−プロリル相互作用の調整によって達成された。プロリル４−置換Ｐｈｅ^６−Ｐｒｏ^７結合についてのｃｉｓ−ｔｒａｎｓ異性化の二次構造が例示される。Ｐｈｅ^６のパラ置換はＸとして示される。 ａ）ＡＴ２Ｒの相同性モデルにおいてＡＴ２ＲとＡＴ１Ｒとの間で保存された残基の位置付けを示す図である。図はＭＯＬＭＯＬおよびＰｒｏｔＳｋｉｎで作成された。ｂ）ＡＴ２Ｒの相同性モデルにおいてＡＴ２Ｒと他のＧＰＣＲとの相同性残基の位置付けを示す図である。図は、ＲａｓｍｏｌおよびＰｒｏｔｓｋｉｎで作成された。ＡＴ１ＲとＡＴ２Ｒとの間で保存された残基はＴＭ領域に存在する。これらの残基の大部分は、他のＧＰＣＲの相同性残基と重複している。 Ｔｙｒ^ｉ−１−Ｐｒｏ^ｉ−Ｐｈｅ^ｉ＋１モチーフにおいてｃｉｓの場合でのクラスターのファミリーに示唆されるメンバーを示す図である。左から右に、Ｔｙｒ^ｉ−１、Ｐｒｏ^ｉおよびＰｈｅ^ｉ＋１内での三環クラスター形成；Ｔｙｒ^ｉ−１とＰｒｏ^ｉとの間での二環クラスター形成；ならびにＴｙｒ^ｉ−１とＰｈｅ^ｉ＋１との間での二環クラスター形成の場合がそれぞれ例示されている。最も多く存在するクラスターは、Ｔｙｒ^ｉ−１、Ｐｒｏ^ｉおよびＰｈｅ^ｉ＋１内での三環クラスター形成である（表３）。 ユビキチン−タンパク質リガーゼＥ３Ａとユビキチンコンジュゲート酵素Ｅ２との間の複合体のＸ−線構造では（ｐｄｂｉｄ：１Ｃ４Ｚ）、Ｅ２（残基６１〜６３）に属するＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅモチーフ（ＹＰＦ）が、相互作用の界面に位置付けられることを示す図である。このモチーフ（赤で示す）では、ｃｉｓプロリンが存在し、その環はＴｙｒおよびＰｈｅの芳香族環とは反対に畳まれている。ＹＰＦモチーフ周辺の環境は６Åの半径カットオフで選択された（炭素を灰色、窒素を青および酸素を赤で示す）。興味深いことにこの環境は、ＡＴ２Ｒのリガンド結合部位付近の環境に酷似している（残基をオレンジで示す）。この重ね合わせのために用いられるＡＴ２Ｒの構造は、リガンド−遊離状態でのロドプシン（ｐｄｂｉｄ：３ＣＡＰ）に基づいて構築された。ＡＴ２ＲとＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅモチーフの周辺環境の残基との間の相同性残基は：Ｗ２６９／Ｗ１０５；Ｋ２１５／Ｒ９６；Ｙ１８９／Ｙ６９４、Ｙ５１（Ａ１９４）／Ｆ６９８、Ｌ９７／Ｌ６９５、Ｌ１２４／Ｌ６９６、Ｌ３０５（Ｉ３０４）／Ｌ６５９、Ｔ２７６／Ｓ６５、Ｉ１９６／Ｉ６９７、Ｌ１２４／Ｌ６９６、Ｐ２７１／Ｐ５８、Ｌ１９０／Ｙ６９４、Ｈ２７３／Ｆ６６、Ｆ２２０／Ｐ６８である。Ｐｈｅ３０８、Ｐｈｅ１２９、Ｐｈｅ２７２およびＩｌｅ３０４は、ＡＴ２での同様のモチーフの集まりを補助できる。 同じ実験条件下（０．０１Ｍ ＫＰｉ緩衝液ｐＨ＝５．７、１０％Ｄ_２Ｏ、２７７Ｋ）で記録された［Ｙ^６］ＡＩＩ（黒で示す）および天然ＡＩＩ（赤で示す）の２Ｄ^１Ｈ−^１Ｈ ＮＯＥＳＹスペクトルの選択された領域のオーバーレイを示す図である。赤線および緑線は、［Ｙ^６］ＡＩＩのｔｒａｎｓおよびｃｉｓ異性体についてのＮＯＥ結合性をそれぞれ示し、青線は天然ＡＩＩについての単一のｔｒａｎｓ異性体を示す。 ｃｉｓプロリン環内での残基内ＮＯＥを示す７５０ＭＨｚのＮＯＥＳＹスペクトルの領域を示す図である。 ｃｉｓ−Ｔｙｒ^６およびｃｉｓ−Ｐｈｅ^８に関する残基内Ｃ^αＨ−Ｃ^βＨクロスピークを示す７５０ＭＨｚのＮＯＥＳＹスペクトルの領域、ならびにペプチドのｃｉｓ形態の保持された立体構造での多数の特徴的ＮＯＥを示す図である。

他に定義されない限り、本明細書で用いるすべての技術的および科学的用語は、ペプチド化学、細胞培養、核酸化学および生化学などの技術分野における当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。標準的技術は、分子生物学、遺伝学および生化学的方法のために用いられる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版．、２００１、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）第４版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照されたい）。本明細書で引用するすべての刊行物は、本発明に関連して用いられる場合があり、刊行物で報告された方法、試薬およびツールを記載するおよび開示する目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

選択的リガンドは、タイプ２よりもタイプ１受容体に優先的に結合できるリガンドである。本発明の内容ではリガンドは、その形態に優先的に結合する場合（例えばリガンドはＡＴ２ＲよりもＡＴ１Ｒに優先的に結合できる）、アンジオテンシンＩＩ受容体の一方または他方の形態に選択的である。優先的結合は排他的結合を意味せず、受容体の一形態の他方を超える占有率は、低い（例えば、所望の受容体の５５％から６０％を占有）から高い（所望の受容体の９５から１００％占有など、の間の範囲で変動してよい。ほとんどの状況下ではリガンドは、受容体の両方の形態に分布しており、分布率は多数の要因に依存する。これらはリガンドの選択性だけでなく、受容体のリガンドの濃度および存在する受容体の相対的濃度も含む。

アンジオテンシンＩＩ受容体は、降圧剤のための十分に特徴付けられた標的である。アンジオテンシン受容体アンタゴニストは、心臓薬においておよび血圧の制御において広く用いられている。少なくとも４種類のアンジオテンシンＩＩ受容体が周知であり、ＡＴ１ＲからＡＴ４Ｒに分類される。すべてがリガンドであるアンジオテンシンＩＩに結合する。本発明は、一方の受容体サブタイプに対して他方よりも選択的であるリガンドを作出する手段を提供する。これは、重要な生理学的影響を有することがあり、例えば上に記載のとおり、多数の状態がＡＴ１ＲおよびＡＴ２Ｒによってさまざまに影響されることが報告されている。

本発明の内容では、ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ異性化はポリペプチド中２つのアミノ酸の間のペプチド結合についてのｃｉｓまたはｔｒａｎｓ異性体の形成である。主としてアミド水素は、後に続くＣ^α原子へよりも先行するＣ^α原子にあまり立体的反発を示さないことから、ほとんどのペプチド結合はｔｒａｎｓ異性体をとっている（典型的には緩い条件下では９９．９％）。対照的にＸ−Ｐｒｏペプチド結合（式中Ｘは任意のアミノ酸を表す）のｃｉｓおよびｔｒａｎｓ異性体の両方は、近接する置換との立体的衝突を経験し、エネルギー的にほとんど等価である。一方、緩い条件下でのｃｉｓ異性体におけるＸ−Ｐｒｏペプチド結合の割合は１０〜４０％の範囲であり、割合は（芳香族残基がｃｉｓ異性体を支持して）先行するアミノ酸に依存する。Ｐｒｏは、サルコシンなどのＮ−置換アミノ酸によって置き換えられ得るが、天然アミノ酸内では唯一である。

ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ異性情報を含む構造情報を含むタンパク質データベースは、広く利用可能である。一例は、多種多様な生体分子の構造情報を含むタンパク質データバンク（ｐｄｂ）データベースである。

アンジオテンシンＩＩ受容体リガンド中のモチーフは、配列Ｘ−Ｐｒｏを含むアミノ酸の任意の配列であってよい。モチーフが由来できる好ましいリガンドは、アンジオテンシンに基づく。しかしアンジオテンシンＩＩ受容体の他のポリペプチドリガンドも調査される場合があり、そこで配列Ｘ−Ｐｒｏを含むモチーフも同定でき、本発明の方法において用いられる場合がある。

アンジオテンシンは、アンジオテンシノーゲン（１０−アミノ酸ポリペプチドアンジオテンシンＩを遊離するレニンの作用によって切断される４５２アミノ酸ポリペプチド）の切断に由来するペプチドホルモンである。これは、２個のＣ−末端残基を切断除去することによってアンジオテンシンＩＩ（生物学的に活性なホルモン）を形成するようにさらに切断される。さらなる切断は、それぞれ１個のＮ−末端残基を切断除去することによってアンジオテンシンＩＩＩおよびＩＶを産生する。

＜ＡＴ２Ｒに選択的であるようにするためのホルモンＡＩＩの操作＞
受容体選択性におけるプロリンの役割を調査するために、本発明者らは、ＡＩＩ受容体の内部深くに結合するための変異導入研究を通じて位置付けられているＡＩＩホルモン（Ｈｉｓ^６−Ｐｒｏ^７−Ｐｈｅ^８）のＣ末端に重点を置いた^{２３〜２６}。タンパク質構造データベース（ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ）は、顕著なｃｉｓ形質を有するアミノ酸モチーフを同定するためにＸ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅモチーフ（式中Ｘは、任意のアミノ酸）についてサーチされた（表１）。そのようなモチーフでは、プロリンに先行するアミノ酸Ｘに応じて大きな構造的可塑性が示される場合があることが明らかであった（データ未記載）。ＡＴ１ａＲおよびＡＴ２Ｒリガンド結合ポケットは、他のＧＰＣＲの周知のＸ−線構造での残基保存に基づいてモデル化され、利用可能な変異導入研究により調整された（図６）。このモデルにより、リガンド結合親和性およびＡＴ２Ｒ／ＡＴ１ａＲそれぞれに対する選択性を決定するために主に関与している可能性がある残基は、次のとおりである：Ｌ１２４／Ｖ１０８、Ｆ３０８／Ｙ２９２、Ｌ３０５／Ｃ２８９、Ｆ１２０／Ａ１０４、Ｔ１２５／Ｓ１０９、Ｆ２７２／Ｈ２５６、Ｇ１２１／Ｓ１０５、Ｆ１９９／Ｙ１８４、Ｆ１２９／Ｙ１１３およびＹ１８９／Ｎ１７４。これらのアミノ酸の大部分は、位置付けられたＡＴ２Ｒのリガンド結合部位の近くに（ＡＴ１ａＲと比較して）、さらに疎水性で大きな残基を導入し、それによってそれをさらに浅くする。同様の観察結果が、ｂ１ＡＲと比較したｂ２ＡＲのリガンド選択性が極性残基の変更によると特定されたベータアドレナリン受容体サブタイプについて示された^１。したがってＡＴ２Ｒに選択的であるアナログに関しては、さらに疎水性で緻密なモチーフが求められるべきであることは理解できる。表１のＸ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅタンパク質データベースから、ｃｉｓ状態が多く存在し、このモチーフを含有する構造の大部分は、プロリン周辺にかさ高い芳香族側鎖の疎水性環のパッキングを表し、緻密さを生じることから、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅミニコアが理想的であると考えられた（図７）。本発明者らは、そのような残基のパッキングがミニコア内のペプチド結合の接触性を低下でき、それによりＡＴ２Ｒリガンド結合ポケットのさらに疎水性の環境中にそれらを分ける高いコストを低下させると推論した。Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅミニコア周辺の環境のＸ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅデータベース中での分析は、相同性モデル化ＡＴ２受容体のリガンド結合ポケット近くに存在する環境に酷似していることを示した（図８）。これは、具体的なミニコアがＡＴ２Ｒに潜在的に組み合わされ、適応できたことを示唆している。したがってＡＩＩアナログは、位置６のヒスチジンの代わりにチロシン残基を導入することによって合成された（［Ｙ］^６−ＡＩＩ：Ａｓｐ^１−Ａｒｇ^２−Ｖａｌ^３−Ｔｙｒ^４−Ｉｌｅ^５−Ｔｙｒ^６−Ｐｒｏ^７−Ｐｈｅ^８）。追加的に、Ｔｙｒ^６置換は、これがＣ−Ｈ−πプロリル−芳香族相互作用をさらに安定化させるさらに高度に電子が豊富な形質を有し、ｃｉｓ状態のさらに緻密な立体構造を支持することから、Ｐｈｅ^６より好ましかった^２７。

＜［Ｙ］^６−ＡＩＩは、溶液において増強されたｃｉｓ異性化を示す＞
ＮＭＲが溶液における［Ｙ］^６−ＡＩＩアナログ構造を探索するために用いられた。アナログの^１Ｈ−^１Ｈ ２Ｄ ＮＯＥＳＹスペクトルの選択された領域が図１に示されている。興味深いことに［Ｙ］^６−ＡＩＩは、水性溶液中でｃｉｓおよびｔｒａｎｓに分離している立体構造集団に対応するプロトン共鳴の２つの別々のセットを示す。これは、単一セットのピークが観察された天然ＡＩＩとは対照的に、単一の立体構造異性体（ｔｒａｎｓ）を表している（図９）。

ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ立体構造異性体の共鳴の優れた分散によって、逆重畳積分および完全な共鳴帰属が達成された（表２および３）。次いでＮＯＥ制限は立体構造の集合体の関連するメンバーだけからの情報を含むように選択された。特徴的なｃｉｓおよびｔｒａｎｓ異性体についての構造計算が実施され、関連する立体構造強度の安定化の構造的原因を位置付けた。［Ｙ］^６−ＡＩＩのｃｉｓ異性体について、セグメントＡｓｐ^１からＩｌｅ^５が伸長されている構造のファミリーが計算によりもたらされた。領域Ｔｙｒ^６からＰｈｅ^８は、Ｐｒｏ環に対して積み重ねられたＴｙｒおよびＰｈｅの芳香族環を含むＶＩ型ターンを示した（図２ａ）。ｃｉｓ状態についてのＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅミニコアの構造的アーキテクチャは、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅタンパク質データベースにおいて記録されている主なファミリーによって使用されている立体構造と非常によく似ている（図７）。したがって、短いペプチド配列での構造的可塑性をタンパク質モチーフからの情報を移行することによって制御できることは明らかである。ｃｉｓ異性体におけるＶＩ型立体構造の存在は、ＮＭＲスペクトルのいくつかの特性によって示されている。例えば、ｃｉｓプロリンのプロトン共鳴の顕著な高磁場シフト（表２および３）；残基６（Ｔｙｒ^６Ｈα）から残基８（Ｐｈｅ^８ＮＨ）への交差ターン（ｃｒｏｓｓ−ｔｕｒｎ）（ｉ〜ｉ＋２）ＮＯＥ；残基内ＮＯＥのパターンによるプロリン環についてのＣ^β−ｅｘｏ／Ｃ^γ−ｅｎｄｏ立体構造；立体構造集合体におけるｃｉｓ形態のモル分率の増加（図１１）。ｃｉｓ立体構造異性体中のこのモチーフの主な安定化因子は、芳香族およびプロリン環の積み重ねである。［Ｙ］^６−ＡＩＩのｔｒａｎｓ立体構造異性体では、このモチーフの構造は、さらに伸長されている（図２ｂ）。

ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ形態でのペプチド結合の接触性を判定するために、本発明者らは両者のアミドプロトン温度係数（Δδ／ΔＴ）（図２ｃ）およびそれらの溶液中での移動拡散をＮＭＲによって測定した。拡散係数はパルスフィールド勾配（ＰＦＧ）技術、拡散最適化分光法（Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｓｅｄ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）ＤＯＳＹ（拡散配列分光法（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ−ｏｒｄｅｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ））^{２８、２９}を用いて決定した。興味深いことに本発明者らは、温度係数および移動拡散の値の両方から判定されるとおり（すなわちＴｙｒ^４に関して本発明者らは、ｃｉｓについて１．９ １０^−１０ｍ^２ｓ^−１、およびｔｒａｎｓについて２．３ １０^−１０ｍ^２ｓ^−１の拡散係数を決定した、図４ｄも参照されたい）、［Ｙ］^６−ＡＩＩのｃｉｓ立体構造異性体がｔｒａｎｓ立体構造異性体のものと比較してペプチド結合の接触性が低下していることを見出した。この低下は、ｔｒａｎｓ形態とは反対にｃｉｓ形態が、ＡＴ２Ｒリガンド結合ポケットの疎水性環境を分けるための高いコストを低くできるようにする。

＜［Ｙ］^６−ＡＩＩアナログはＡＴ２Ｒに選択的である：受容体選択性および親和性のためのｃｉｓ形質の重要性＞
［Ｙ］^６−ＡＩＩアナログはＡＴ２Ｒに選択的であるための判断基準を実験的に満たしていることから、本発明者らはＡＴ１ａＲおよびＡＴ２Ｒへのその結合を測定した。興味深いことにアナログは、ＡＴ２Ｒに高親和性（Ｋｉ＝３．４±０．８ｎＭ）で結合する一方で、本発明者らはアナログのミリモル以下の用いた濃度範囲でＡＴ１ａＲへのいかなる飽和結合も観察できなかった。ＡＴ２Ｒに対する［Ｙ］^６−ＡＩＩ選択性が、リガンドのｃｉｓ形質の増大および生じるＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅモチーフの緻密性に基づくかどうかを解明するために、ＡＩＩアナログのｃｉｓ−ｔｒａｎｓ異性化状態を調節するための電子的戦略^２７が採用された。具体的には芳香族−プロリル相互作用は、疎水性効果によってだけでなく、（芳香族環がピロリジン環の電子不足Ｃ−Ｈ結合に電子密度を供与する（π−電子ドナー）^２７）Ｃ−Ｈ−π相互作用によっても安定化できる。したがって電子が豊富な芳香族残基は、芳香族−プロリル相互作用を安定化でき、ｃｉｓ立体構造を促進する。対照的に電子不足芳香族残基は、ｔｒａｎｓ立体構造を選好するはずであり、相互作用および緻密性をあまり導かない。したがって本発明者らは、電子豊富（−ＯＨ）、電子的に中性（−Ｈおよび−ＯＰＯ_３Ｈ_２）ならびに電子不足（−ＮＯ_２）の基を含む４−置換フェニルアラニンを位置６に導入したＡＩＩアナログを合成した。電子不足芳香族残基（ハメットの置換定数値σｐ＝０．７８）である４−ＮＯ_２−フェニルアラニンＡＩＩアナログは、大部分はｃｉｓ立体構造に不利であるはずである一方で、フェニルアラニンおよびホスホチロシン（σｐ≒０．００）は、中程度のｃｉｓ立体構造を有するはずである。対照的に、チロシン（電子が豊富な芳香族残基（σｐ≒−０．３７））は、ＮＭＲによって実験的に判定されたとおりリガンドｃｉｓアミド結合に有利であった。実際にＮＭＲデータは、次の芳香族置換の序列：−ＯＨ＞−Ｈ≒−ＯＰＯ_３Ｈ_２＞−ＮＯ_２（％ｃｉｓは、それぞれおよそ４０、２０、２５および５であると見出された）を伴って電子が豊富な残基が芳香族−プロリル相互作用およびｃｉｓアミド結合に有利であることを示した。芳香族−プロリル相互作用の電子的調節を介するＡＩＩでのｃｉｓ−ｔｒａｎｓ異性のこの調節に基づいて、本発明者らは次いでアナログのＡＴ１ａＲおよびＡＴ２Ｒへの結合実験を実施した。興味深いことに、すべてのＡＩＩアナログの結合親和性および選択性は、上に記載のとおりアナログのｃｉｓ−ｔｒａｎｓ異性に直接関連した（ＡＴ２Ｒに対する親和性の順番は：［Ｙ］^６−ＡＩＩ＞［４−ＯＰＯ_３Ｈ_２−Ｆ］^６−ＡＩＩ＞［Ｆ］^６−ＡＩＩ＞［４−ＮＯ_２−Ｆ］^６−ＡＩＩである）。

＜ＡＴ２受容体での［Ｙ］^６−ＡＩＩアナログの候補位置＞
いくつかの変異導入研究は、ＡＩＩのＣ末端部分が、ＡＴ１ａＲ^{２３、２６、３０、３１}およびＡＴ２Ｒ^{２６、３２、３３}の奥深くに位置付けられていることを示した。クラスＡ−ＧＰＣＲのＸ線構造は、関連する受容体の現実的な構造モデルを構築するための貴重な鋳型を提供した^３４。本発明者らが上で述べたとおりＡＴ２ＲおよびＡＴ１ａＲの再構築モデルは、ＡＩＩのＣ−末端部分に対して、ＡＴ１ａＲと比較して、ＡＴ２Ｒに関してさらに浅くさらに疎水性のリガンド結合部位を示唆し、ＡＩＩについてさらに小型のＣ末端がＡＴ２Ｒへの高親和性結合のために必要である可能性があることを示している。ＡＴ２Ｒ／ＡＴ１ａＲに対するアナログ［Ｙ］^６−ＡＩＩの親和性および選択性の決定に関与する残基を同定するために本発明者らは、ＡＴ２Ｒ変異体であるＹ１８９Ａ、Ｙ１８９Ｎ、Ｆ２７２ＡおよびＦ２７２Ｈを構築した。これらの変更は、極性残基または小さなサイズの残基をリガンド結合ポケット近くに導入し、ＡＴ１ａＲリガンド結合ポケット中のさらに極性な環境を模倣している。アナログ［Ｙ］^６−ＡＩＩおよび［４−ＯＰＯ_３Ｈ_２−Ｆ］^６−ＡＩＩの両方をＡＴ２Ｒおよびその変異体の結合ポケットを探索するために用い、結果を図３および表４に要約する。［Ｙ］^６−ＡＩＩアナログは、ＡＴ２Ｒにおける最適な環の積み重ねのために位置１８９および２７２の両方に芳香族環を必要とすると考えられる。予測されるとおり、［４−ＯＰＯ_３Ｈ_２−Ｆ］^６−ＡＩＩの極性の増大は、［Ｙ］^６−ＡＩＩリガンドよりも一桁大きいＫｉ値をＡＴ２Ｒについて生じる。野生型ＡＴ２Ｒと比較してＹ１８９Ｎ変異体は、恐らく極性および／または側鎖のサイズの増大のために、［４−ＯＰＯ３Ｈ２−Ｆ］^６−ＡＩＩへの親和性の減少を示した。同じリガンドについて、位置１８９での非極性アミノ酸であるＡｌａによるＴｙｒの置換は、アスパラギンの導入よりも良く許容される。変異体受容体Ｆ２７２Ａは、Ｆ２７２Ｈ変種よりも低い親和性を示し、ファンデルワールス接触を通じた受容体変種のイミダゾール基とアナログのチロシンとの間の環の積み重ね相互作用の安定化を示唆している。全体としてこれらのデータは、ＡＴ２Ｒに対する［Ｙ］^６−ＡＩＩ選択性が、アナログのＴｙｒ^６とＡＴ２Ｒ結合ポケット内のＹ１８９／Ｆ２７２残基との間の芳香族環対合を安定化する（ＡＴ１ａＲへと比較して）さらに疎水性の結合ポケットに基づいているという初期の仮説を支持する。

＜［Ｙ］^６−ＡＩＩアナログはＡＴ２Ｒアゴニストであり、それは、ＡＴ２Ｒを過発現しているＰＣ１２Ｗ細胞において神経突起伸長を誘導する。＞
［Ｙ］^６−ＡＩＩアナログの細胞分化（神経突起伸長）への効果を評価するために、ＰＣ１２Ｗ細胞が用いられた。ＰＣ１２Ｗラット副腎褐色細胞腫細胞は、円形の形状を有し、未分化状態で活発に分裂する。ＰＣ１２Ｗ細胞は、長い無血清培養条件下でＡＴ２Ｒを発現できることが示されており^３５、それらの神経突起伸長はＡＩＩによって刺激される^３６。ＰＣ１２Ｗ細胞は、リアルタイムＰＣＲによって測定されるとおり現在のアッセイ条件ではＡＴ１ａＲを発現しない（データ未記載）。図４に示すとおり、多数の細胞は刺激がないと短い神経突起を発達させる。しかし、ＡＩＩおよび［Ｙ］^６−ＡＩＩアナログの両方がＡＴ２Ｒ形質導入細胞において神経突起伸長を顕著に刺激した（図４）。この表現型は、ＡＩＩおよび［Ｙ］^６−ＡＩＩの両方について１ｐＭ〜１００ｎＭの範囲でリガンド用量依存性であった。

＜［Ｙ］^６−ＡＩＩアナログは腫瘍細胞増殖を阻害するが創傷治癒を促進する。＞
腫瘍細胞増殖へのＡＩＩアナログの効果を評価するために、３種のＡＩＩアナログを細胞増殖アッセイにより検査した。用いられたアナログは、位置６にシステイン残基を有するＡ１（配列：ＤＲＶＹＩＣＰＦ）；位置６にＤ−Ｔｙｒを有するＡ２（配列：ＤＲＶＹＩｄＹＰＦ）およびＡ３（［Ｙ］^６−ＡＩＩアナログ）であった。増殖アッセイは、さまざまながん細胞において実施された。表５を参照されたい。Ａ３は、研究したすべての細胞株において、ｎＭ範囲で優れたＩＣ５０値を表して、最良の結果を示した。

ＡＴＲ１発現が抑制されている細胞株で得られたデータは、ＡＴＲ１発現の低減またはＡＴ１（ＡＩ）拮抗作用が腫瘍細胞増殖の阻害において本発明のＡＩＩアナログを補うように作用することを例示している。データは、ＡＴ１アンタゴニストロサルタンおよび本発明のＡＩＩアナログが非常に有益な組み合わせ効果を有することを示している。

創傷治癒アッセイでの追加的検査も［Ｙ］^６アナログが優れたＩＣ５０値を示すことを示した（表５）。

表４．１２５−Ｉ ＡＩＩ飽和アッセイについての結果ならびに野生型および変異体ＡＩＩ受容体のアナログ競合的アッセイについての結果の要約
アッセイは、材料および方法に記載のとおり実行された。リガンドを含む試料のインキュベーションは氷上、２時間であった。競合結合アッセイにおいて用いられた［^１２５Ｉ］−ＡＩＩの濃度は、２ｎＭであった。Ｋ_ＤデータをソフトウェアＰｒｉｓｍの非線形回帰式を用いてミカエリスメンテン方程式にフィットさせた。Ｋ_ｉ値を第一カラムでのＫ_Ｄ値でチェン−プルソフ（Ｃｈｅｎｇ ａｎｄ Ｐｒｕｓｏｆｆ）方程式に従って算出した。値は２〜３回の独立した実験の代表値である。各データ点は、３重にアッセイされた。

＜医薬組成物＞
好ましい実施形態では、上に記載のリガンドを含む、本発明の前述の態様において定義したアッセイ方法によって同定できる１つまたは複数の化合物を含む医薬組成物が提供される。

本発明による医薬組成物は、活性成分としてＡＴ２Ｒを特異的に活性化できる１つまたは複数の化合物を含む組成物である。典型的には化合物は、任意の薬学的に許容される塩の形態、または例えば必要に応じて、アナログ、遊離塩基形態、互変異性体、鏡像異性体ラセミ体もしくはこれらの組み合わせである。本発明による活性成分を含む医薬組成物の活性成分は、優れた治療活性を（例えば、具体的な場合に応じた量で投与される場合に膵臓がんおよび肺がんなどの腫瘍の治療において）示すことが期待されている。例示的化合物は、配列Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅを含むＡＩＩアナログである。

別の実施形態では、本発明の１つまたは複数の化合物は、任意の前述の状態を治療するために好適であることが周知の、当技術分野において認められた任意の化合物との組み合わせで用いることができる。したがって本発明の１つまたは複数の化合物は、前述の適応症を治療するために好適であることが周知の１つまたは複数の当技術分野で認められた化合物と、簡便で、単一の組成物が対象に投与できるように組み合わせることができる。投与計画は、最適な治療反応を提供するために調整できる。

例えば、いくつかに分割した用量を毎日投与できる、または用量は治療状況の要求によって示されるとおり比例的に減量できる。

活性成分は、経口、静脈内（水溶性である場合）、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内もしくは座薬経路またはインプラント（例えば、持続放出分子を用いる）などの簡便なやり方で投与されてよい。

投与の経路に応じて活性成分は、酵素、酸や、前記成分を不活性化し得る他の天然条件の作用から前記成分を保護するための材料中にコートされる必要がある場合がある。

非経口投与以外によって投与するために、活性成分は不活性化を防ぐ材料によってコートされるか、共に投与される。例えば活性成分は、アジュバント中で投与される場合があり、酵素阻害剤ととともに、またはリポソーム中にて同時投与される場合がある。本明細書において検討されるアジュバントは、レゾルシノール、ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎヘキサデシルポリエチレンエーテルなどの非イオン性界面活性剤を含む。

リポソームは、従来のリポソームと同様に水中油中水ＣＧＦ乳剤を含む。

活性成分は、非経口または腹腔内へも投与できる。

分散剤は、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびこれらの組み合わせならびに油中にも調製できる。保存および使用の通常の条件下でこれらの調製物は、微生物の増殖を抑制するために保存剤を含有する。

注射可能な使用のために好適な医薬用形態は、滅菌水性溶液（水溶性である場合）または分散剤および、滅菌の注射可能な溶液または分散剤の即時調製ための滅菌粉剤を含む。すべての場合において形態は、滅菌されていなければならず、容易なシリンジ操作性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）がある程度に流動性でなければならない。製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の夾雑作用に備えて保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、これらの好適な混合物ならびに植物油を含有する溶媒または分散媒であってよい。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散剤の場合は所要の粒子サイズの維持によっておよびサーファクタントの使用によって維持できる。

微生物の作用の抑制は、種々の抗菌性および抗真菌性薬剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チルメロサールなどによってもたらされる。多くの場合、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含むことは好ましい。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の組成物における使用によってもたらされ得る。

注射可能な滅菌溶液は、上に列挙した種々の他の成分を必要に応じて含む適切な溶媒中に所要量で活性成分を組み込み、続いてろ過滅菌することによって調製される。一般に分散剤は、滅菌活性成分を滅菌ビヒクル（基礎分散媒および上に列挙されたものから所要の他の成分を含有する）に組み込むことによって調製される。注射可能な滅菌溶液の調製のための滅菌粉剤の場合は好ましい調製方法は、活性成分に加えて任意の追加的な所望の成分の粉剤を（あらかじめろ過滅菌したその溶液から）産生する真空乾燥および凍結乾燥技術である。

上に記載のとおり活性成分が好適に保護される場合、それは例えば不活性希釈剤と共にもしくは吸収される食用の担体と共に経口的に投与できる、または硬いもしくは軟らかいシェルのゼラチンカプセル中に封入できる、または錠剤に圧縮できる、または食事の食物に直接組み込むことができる。経口治療用投与のために活性成分は、賦形剤と共に組み入れられてよく、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ、オブラートなどの形態で用いられてよい。そのような治療的に有用な組成物中の活性成分の量は、好適な投与量が得られる程度である。

錠剤、トローチ、丸剤、カプセルなどは、トラガカントゴム、アラビアゴム、トウモロコシデンプンまたはゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；ならびにショ糖、乳糖またはサッカリンなどの甘味剤も含有する場合があり、ペパーミント、冬緑油またはサクランボ香味剤などの香味剤が添加される場合もある。投与単位形態がカプセルである場合、上記の種類の材料に加えて液体担体を含有する場合もある。

種々の他の材料が、コーティング剤として、または、投与単位の物理的形態を変更するために存在する場合がある。例えば、錠剤、丸剤またはカプセルは、セラック、糖または両方でコートされる場合がある。シロップまたはエリキシル剤は、活性成分、甘味剤としてショ糖、保存剤としてメチルおよびプロピルパラベン、色素ならびにサクランボまたはオレンジ香料などの香味料を含有する場合がある。当然のことながら、任意の投与単位形態の調製において用いられる任意の材料は、薬学的に純粋であり、使用される量で実質的に無毒性であるべきである。加えて、活性成分は、徐放性調製物および製剤に組み込まれてよい。

本明細書において使用される「薬学的に許容される担体および／または希釈剤」は、いかなるすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌性ならびに抗真菌性の薬剤、等張剤および吸収を遅らせる薬剤などを含む。医薬用活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において十分周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性成分と不適合性である場合を除いて、治療用組成物におけるそれらの使用は検討される。補助活性成分も組成物に組み込まれてよい。

投与の容易さおよび投与量の均一性のために非経口組成物を投与単位形態に製剤することは特に有利である。本明細書において用いられる投与単位形態は、治療される哺乳動物対象のための単一投与量として適するように物理的に分離された単位を指し、各単位は所望の治療効果を産生するように算出された活性材料のあらかじめ定められた量を所要の薬学的担体と共に含有している。本発明の新規投与単位形態について本明細書は（ａ）活性材料および達成される具体的な治療効果の特有の特徴、および（ｂ）身体の健康が損なわれている疾患状態を有する生体対象における疾患の治療のための活性材料などを組み合わせる技術分野に由来する制限によって指示され、これに直接依存する。

主要な活性成分は、有効量での簡便で有効な投与のために好適な薬学的に許容される担体と投与単位形態で組み合わせられる。補助活性成分を含有する組成物の場合、投与量は前記成分の通常の用量および投与手段を参照して決定される。

さらなる態様では、本明細書前記で定義した本発明の活性成分が、疾患の治療における使用のために、単独または具体的な適応症の治療のために好適であることが周知の当技術分野で認められた化合物との組み合わせのいずれかで提供される。結果的に本発明の活性成分の使用が、がん（特に膵臓または肺がん）の治療のための医薬品の製造および同物に関連する治療の方法のために提供される。

＜材料および方法＞
［材料］ ＡＩＩおよびＡＴ２Ｒ受容体特異的遮断剤ＰＤ１２３３１９は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。ヒトＡＧＴＲ２ ｐｃＤＮＡ３．１＋は、ｔｈｅ ＵＭＲ ｃＤＮＡ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｏｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ−Ｒｏｌｌａ、Ｒｏｌｌａ、ＭＯ）から得た。すべての他の化学物質は分析グレードであった。ＡＴ１ａＲおよびＡＴ２Ｒ構築物は、Ｌａｚｌｏ Ｈｕｎｙａｄｙ（Ｓｅｍｍｅｌｗｅｉｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｂｕｄａｐｅｓｔ、Ｈｕｎｇａｒｙ；^４３）から贈られた物である。

［変異導入］ ＡＴ２Ｒ変異体は他所に記載の通り生成した^４４。

［細胞培養および一過性形質移入］ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、３７℃で維持した。細胞を１０ｃｍディッシュに播種し、２４時間後にＡＴ１ａＲ（ｐｃＤＮＡ３．１）またはＡＴ２Ｒ（ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ）のいずれかでＧｅｎｅＪｕｉｃｅ形質移入試薬を製造者の説明書に従って用いて形質移入した。細胞を形質移入の４８時間後に回収した。形質移入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞（細胞２ｘ１０^６個）の沈殿をプロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）、Ｒｏｃｈｅ）を含有する氷冷結合緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％ＢＳＡおよび０．０２５％バシトラシン）０．５ｍｌに懸濁した。細胞を１．５ｍｌ微量遠心管に移し、２サイクルの凍結融解に供した。融解した細胞を２６ゲージ針に７回通すことによって剪断し、粗製膜を超遠心分離法（６０分間、１２０，０００×ｇ、４℃）によって沈殿させた。次いで粗製膜を、アミドブラックタンパク質アッセイ^４５によって決定したタンパク質濃度３．３μｇ／μｌに対応するプロテアーゼ阻害剤を含有する氷冷結合緩衝液に最終容量０．２ｍｌで再懸濁した。

［ＰＣ１２Ｗ細胞］ ラット副腎クロム親和性細胞腫瘍のクローン単離物由来の亜株を既に記載のとおり^４６１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を補充したＤＭＥＭ中で培養した。細胞は５％ＣＯ_２、加湿したインキュベーター中、３７℃でインキュベートした。ヒトＡＴ２Ｒコード領域を含有している組換え複製欠損アデノウイルスの調製をＶＥＣＴＯＲ ＢＩＯＬＡＢＳ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）によって実行した。

アデノウイルスベクターでの遺伝子形質導入のために、細胞を１ウェルあたり細胞１．２ｘ１０^５個で６−ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞をアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＡＴ２Ｒ ３０感染効率（ＭＯＩ））を含有している無血清ＤＭＥＭで１５分間ごとに軽く震盪して、３７℃、６時間インキュベートした。６時間インキュベーション後、細胞を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで３７℃、５％ＣＯ_２で追加的に２４時間培養した。次いで細胞をトリプシン処理し、１ウェルあたり細胞２ｘ１０^３個の密度で２４−ウェルプレートで継代培養した。神経突起伸長への［Ｙ］^６−ＡＩＩアナログの効果の評価のために継代培養２４時間後に、図４に示すとおり対照細胞およびＡＴ２Ｒ過発現細胞を１ｎＭ ＡＩＩまたは［Ｙ］^６−ＡＩＩで処置した。

［放射性リガンド結合アッセイ］ 飽和曲線を０〜１０ｎＭ（３連でデータ点８個）の範囲の濃度の［^１２５Ｉ］−ＡＩＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて得た。非特異的結合を６μＭコールドＡＩＩの存在下で判定した。競合的アッセイを１ｎＭの濃度の［^１２５Ｉ］−ＡＩＩおよび種々の濃度の未標識リガンドを図３に示すとおり用いて実施した。試料は２時間、４℃でインキュベートした。受容体結合および遊離の放射性リガンドを０．３％ポリエチルアミンにあらかじめ浸漬したＷｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ｂフィルターを通すろ過によって分離した。フィルターを氷冷結合緩衝液５ｍｌで洗浄し、シンチレーション管に移した。放射活性をＢｅｃｋｍａｎ ＬＳ６０００液体シンチレーションカウンターで計測し、データをＰｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いる非線形回帰によって分析した。Ｋｉ値を［^１２５Ｉ］−ＡＩＩについてのＫ_Ｄ、１．８ｎＭ（ＡＴ１ａＲ）および２．３ｎＭ（ＡＴ２Ｒ）でチェン−プルソフ方程式に従って算出した。

［ペプチド合成および試料調製］ 次のペプチド：ＡＩＩ（Ｄ^１−Ｒ^２−Ｖ^３−Ｙ^４−Ｉ^５−Ｈ^６−Ｐ^７−Ｆ^８）、［Ｙ］^６−ＡＩＩ（Ｄ^１−Ｒ^２−Ｖ^３−Ｙ^４−Ｉ^５−Ｙ^６−Ｐ^７−Ｆ^８）、［４−ＯＰＯ_３Ｈ_２−Ｆ］^６−ＡＩＩ、（Ｄ^１−Ｒ^２−Ｖ^３−Ｙ^４−Ｉ^５−（４−ＯＰＯ_３Ｈ_２−Ｆ）^６−Ｐ^７−Ｆ^８）、［Ｆ］^６−ＡＩＩ、（Ｄ^１−Ｒ^２−Ｖ^３−Ｙ^４−Ｉ^５−Ｆ^６−Ｐ^７−Ｆ^８）および［４−ＮＯ_２−Ｆ］^６−ＡＩＩ、（Ｄ^１−Ｒ^２−Ｖ^３−Ｙ^４−Ｉ^５−（４−ＮＯ_２−Ｆ）^６−Ｐ^７−Ｆ^８）の合成は、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ法を用いて達成した。２−クロロトリチルクロリドレジンおよびＮ^α−Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）アミノ酸を合成のために用いた。ペプチド純度は、分析用ＨＰＬＣ（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ−１２０ Ｃ１８、逆相、２５０Ｘ４．０ｍｍ）、質量分析（ＦＡＢＭＳ、ＥＳＩＭＳ）およびアミノ酸分析によって評価した。試料は、０．０２ＭのＫＣｌを含有する０．０１Ｍ ＫＰｉ緩衝液（ｐＨ＝４）にペプチドを溶解することによってＮＭＲ分光法用に調製した。２，２−ジメチル−２−シラ−ペンタンスルホン酸（ＤＳＳ）を内部化学シフト基準として濃度１ｍＭに添加した。ペプチド濃度は、通常９０％^１Ｈ_２Ｏ／１０％^２Ｈ_２Ｏ中に４ｍＭであった。保存剤として痕跡量のＮａＮ_３を添加した。

［ＮＭＲ分光法］
ａ）距離制限の決定。高磁場ＮＭＲスペクトルをｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＩｏａｎｎｉｎａのＮＭＲ ｃｅｎｔｅｒにあるＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ５００分光器を用いて５００ＭＨｚで、およびＵｔｒｅｃｈｔのＢｉｊｖｏｅｔ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＲｅｓｅａｒｃｈにあるＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ７５０分光器を用いて７５０ＭＨｚで取得した。水抑制のために勾配と共に励起スカルプティングを用いた。すべてのプロトン２Ｄスペクトルを直交（ｑｕａｄｒａｔｕｒｅ）検出のためのＳｔａｔｅｓ−ＴＰＰＩ法を用いて、２Ｋｘ５１２複合データ点でインクリメントあたり２Ｄ ＴＯＣＳＹ用には１６スキャンおよび２Ｄ−ＮＯＥＳＹ実験用には６４スキャンでそれぞれ取得した。ＴＯＣＳＹスペクトル用の混合時間は８０ｍｓであった。ＮＯＥＳＹ実験のための混合時間はＮＯＥビルドアップレート（ｂｕｉｌｄ−ｕｐ ｒａｔｅ）を決定するために１００、２００、３５０および４００ｍｓに設定した。３５０ｍｓの混合時間は、２Ｄ−ＮＯＥＳＹにおいてスピン拡散効果を導入することなく十分なクロスピーク強度を提供した。位相敏感２Ｄ−ＮＯＥＳＹを具体的な帰属およびプロトン−プロトン距離拘束の推定のために用いた。データは２Ｋｘ２Ｋ実データ点を示すためにｔ_１でゼロ補填し、９０^ｏ位相シフトしたコサイン２乗−ベル窓関数（９０^°ｐｈａｓｅ ｓｈｉｆｔｅｄ ｓｑｕａｒｅ ｃｏｓｉｎｅ−ｂｅｌｌ ｗｉｎｄｏｗ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を両方の次元に適用した。すべてのスペクトルをＮＭＲＰｉｐｅソフトウェアパッケージを用いることによって処理し、ＮＭＲＶＩＥＷで分析した。

ＡＩＩについてのプロトン間距離をＮＯＥＳＹスペクトルでのクロスピーク強度を測定することから導いた。強度をＮＭＲＶＩＥＷソフトウェアパッケージを用いて一連の距離拘束をもたらすように調整した。ＮＯＥクロスピークをそれらの強度によって３種の距離分類に分けた。強いＮＯＥは、３．０Åの上位（ｕｐｐｅｒ）距離制限、４．０Åの中位（ｍｅｄｉｕｍ）ＮＯＥ値および弱い（ｗｅａｋ）ＮＯＥ、５．５Åをもたらした。下限距離限界を１．８Åに設定した。ｃｉｓ異性体形態（Ｘｃｉｓ）にあるペプチド分子のモル分率を１Ｄスペクトルでｃｉｓおよびｔｒａｎｓ形態にある同じプロトン共鳴に対応する十分に分離されたピークの面積を測定することによって得た。

ｂ）温度係数。アミドプロトンについての溶媒保護値を検討するために、アミドプロトン温度係数（Δδ／ΔＴ）を温度２８３Ｋから３０８Ｋの範囲で測定した。典型的には暴露されたＮＨが−６．０から−８．５ｐ．ｐ．ｂ．／Ｋの範囲で勾配を有する一方で、水素結合されたまたは保護されたＮＨは−２．０から±１．４ｐ．ｐ．ｂ．・Ｋ^−１のΔδ／ΔＴを有すると考えられる^４７。２８３Ｋで測定されたアミドプロトン共鳴のΔδ／ΔＴ対化学シフト偏差（ＣＳＤ）のプロット（図Ｘ）は、適切な無作為コイル化学シフト補正と共に^４８、可動性直鎖ペプチドの部分構造とより良い相関を提供する。破線（Δδ／ΔＴ＝−７．８（ＣＳＤ）−４．４）は、タンパク質の暴露されたＮＨと隔離されたＮＨとの間のΔδ／ΔＴのカットオフを表す。破線より上の勾配は暴露されたＮＨを示し、一方、下は隔離されたＮＨを示す。図２において観察されるとおり、すべての骨格ＮＨ（Ａｒｇ２を例外として）は破線より上であり、これらのペプチドプロトンがいくらか暴露されていることを示している。Ａｒｇ２骨格ＮＨは、恐らく分子内水素結合の形成に関与している（下の考察を参照されたい）。Ａｒｇ２の骨格ＮＨについての低いΔδ／ΔＴ値は、ＡＩＩの環状アナログに見出されており、溶媒からの遮蔽を示唆しているが、この効果の構造的起源について理由付けを有さない。

ｃ）拡散配列ＮＭＲ分光法。２９８Ｋでの拡散配列分光法（ＤＯＳＹ）スペクトルを得るためにＢｒｕｋｅｒマイクロプログラムｓｔｅｂｐｇｐ１ｓ１９を適用した。パルスプログラムは、拡散については双極性勾配パルス傾斜を、水抑制については勾配を有する３−９−１９パルスを用いる刺激エコーを適用する。各ＦＩＤについて、緩和遅延３ｓおよび二項水抑制について２０μｓ遅延で過渡応答５１２個を収集した。Ｆ２次元（２０ｐｐｍ）においてデータ点４０９６個およびＦ１次元においてデータ点１６〜３２個（勾配強度）をすべての実験について収集した。最終データサイズは４０９６×１０２４であった。指数乗算（Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を１Ｈｚ線幅拡大でＦ２に適用した。拡散時間（Δ）および勾配長（δ）をそれぞれ１００ｍｓおよび１ｍｓに設定し、勾配パルス後の回復遅延は２００μｓであった。２種類のデータ分析法を未加工実験データに適用した。自動化２Ｄ処理のために、標準的２Ｄ−ＤＯＳＹ処理プロトコールをＦ１（拡散係数）次元において指数スケーリングでＸＷＩＮＮＭＲソフトウェアに適用した。手作業での曲線適合のために、さまざまな勾配強度で測定した１Ｄプロトンスペクトルにおいて選択したピークの強度を見かけの拡散係数Ｄ^＊を得るために方程式Ｉ＝Ｉ_０ｅｘｐ（−Ｄγ^２ｇ^２δ^２（Δ−δ／３））［→ｓｑｒｔ（−ｌｎ（Ｉ／Ｉｏ））＝ｓｑｒｔ（Ｄ^＊）ｇ］（ＡＲ Ｗａｌｄｅｃｋ、ＰＷ Ｋｕｃｈｅｌ、ＡＪ Ｌｅｎｎｏｎ、ａｎｄ ＢＥ Ｃｈａｐｍａｎ、ＮＭＲ Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｔｏ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｎｄ Ｓｏｌｕｔｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｐｒｏｇ．ＮＭＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．）を用いてフィットさせた。この理論的方程式では、次の物理量が表される：Ｉ、実際の（測定された）ピーク強度；Ｉ_０、ゼロ勾配強度でのピーク強度；Ｄ、拡散係数；γ、（プロトンの）磁気回転比；ｇ、勾配強度；δ、勾配長；およびΔ、拡散時間。理論的には勾配長および拡散時間も拡散実験において増加させることができるが、しかし大部分のパルススキームは、勾配強度（ｇ）を変更する。Ｄ、γ、Δおよびδが一定であることから、Ｄγ^２ｇ^２δ^２（Δ−δ／３）では、それらは新たな定数の元に変換できる、Ｄ^＊（Ｄ^＊＝ｃＤ、式中ｃ＝γ^２δ^２（Δ−δ／３）は一定）。元の方程式の数学的再構成および新たな定数（Ｄ^＊）の置換によって、一次方程式［ｓｑｒｔ（−ｌｎ（Ｉ／Ｉｏ））＝ｓｑｒｔ（Ｄ^＊）ｇ］が推測され（上記を参照されたい）、拡散係数の決定に適用できる。これらのプロットでは、勾配強度は５％から９５％の間の総勾配強度の線形的に変化するインクリメントとして表される（１６または３２インクリメントが適用された）。方程式で示すとおり、フィットした線の傾きは、Ｄ^＊の平方根に等しく、それによりＤ^＊は傾きの値から算出できる。したがって基準と比較した実際の分子量は、次の方程式、ｌｏｇ（Ｄ_１／Ｄ_２）＝１／３^＊ｌｏｇ（ＭＷ_２／ＭＷ_１）（式中Ｄ１／Ｄ２＝Ｄ１^＊／Ｄ２^＊（ＡＲ Ｗａｌｄｅｃｋ、ＰＷ Ｋｕｃｈｅｌ、ＡＪ Ｌｅｎｎｏｎ、ａｎｄ ＢＥ Ｃｈａｐｍａｎ、ＮＭＲ Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｔｏ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｎｄ Ｓｏｌｕｔｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｐｒｏｇ．ＮＭＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．））によって決定できる。この方程式は、比較される分子が同様の全体的形状および緩和特性を有することを推測する。

［構造計算］ 構造計算は、Ｂｏｎｖｉｎ ｅｔ ａｌ．に記載のとおりＡＲＩＡセットアップおよびプロトコールを用いるＣＮＳで実施された。

［Ｘ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ配列モチーフ（Ｘ＝任意のアミノ酸）を有する構造タンパク質データセットの構築および分析］ ＜９０％配列同一性閾値、解像度≦３．０Å、およびＲ因子≦０．３を有するタンパク質データバンク［ｒｅｆ］（ＰＤＢ）由来のタンパク質構造のデータセットをＰＩＳＣＥＳサーバーから得た^４９。１２７３６個のタンパク質構造のプロリル残基を検討した（材料および方法を参照されたい）各プロリル残基について、回旋角オメガ（ω）を算出した。−５０°から＋５０°の間の角度を有する結合をｃｉｓプロリル結合とした。データベースを重複性（すなわち、同じｐｄｂ中の異なる鎖に存在するが同じ配列を有する残基は、それらの回旋角における差異が５０°より大きい場合だけ保持された）、および目的のプロリンの近隣残基の欠損を回避するためにさらに処理した。Ｃ^＋＋で記述された自家製スクリプト（Ｔｓｏｕｌｏｓ Ｉ．、Ｔｚａｋｏｓ Ａ．Ｇ．、ｅｔ ａｌ．準備中）を、（ｉ）プロリン残基に対する回旋角ωを算出する；（ｉｉ）Ｘ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅモチーフ（式中Ｘは任意のアミノ酸）を有する残基のデータセットを構築する；（ｉｉｉ）Ｘ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅモチーフ中のすべてのアミノ酸中でのｃｉｓプロリンアミド結合の発生率に関する統計を算出する（表１）；（ｉｖ）Ｘ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ配列モチーフのｃｉｓの場合での構造的可塑性を位置付ける（表２）ために用いた。ファミリーへのクラスター形成を平均２乗偏差フィッテイングによって実施した。

［腫瘍細胞増殖アッセイ］
増殖をＭＴＴアッセイを用いて評価した。初期対数期細胞をマイクロタイタープレートに播種し、一晩増殖させた。次いでＡＩＩアナログを系列希釈で添加した。新鮮な薬物を２４時間ごとに添加した。ＭＴＴアッセイを製造者のプロトコールに従って用いて増殖を２４時間間隔で評価した。ＩＣ５０値を、未処置対照および／または薬物ビヒクルだけで処置した対照と比較して増殖における５０％低下を生じるために必要な薬剤の濃度として算出した。各研究は、少なくとも２回、６について２重に（in duplicates of 6）行った。

［創傷治癒アッセイ］
細胞移動へのＡＩＩアナログの効果を、スクラッチプロトコールを用いて実施した創傷治癒アッセイで評価した。サブコンフルエントな細胞を用いた（アッセイは３５ｍｍディッシュで行った）。細胞を低血清培地で一晩増殖させ、次いで標準的プロトコールを用いて滅菌ピペットチップでスクラッチすることによって傷をつけた。傷をつけた直後に細胞をＡＩＩアナログの系列希釈物に暴露した。傷をつけた細胞の先端でのギャップを顕微鏡でモニターした。

（参考文献）

他に述べない限り、本明細書に記載のものに類似のまたは等価な任意の方法および材料は、本発明の実施または検査において用いることができる。そのような使用のために好適な方法、デバイスおよび材料は、上に記載されている。本明細書で引用するすべての刊行物は、本発明と関連して用いられる場合があり、刊行物において報告された方法、試薬およびツールを記載するおよび開示する目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (24)

1. アンジオテンシンＩＩ受容体の選択的リガンドを調製するための方法であって、
   （ｉ）ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ異性化に感受性である、前記受容体のリガンドのモチーフを選択するステップと、
   （ｉｉ）前記リガンドを、前記モチーフを含むデータベース中の配列と比較し、前記モチーフの中または近傍における置換の、ｃｉｓまたはｔｒａｎｓ異性体の形成への影響を判定するステップと、
   （ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）における比較に従って前記リガンド中の置換を生じさせ、それによって前記リガンド中でｃｉｓまたはｔｒａｎｓ異性体を選好するステップと
   を含む、方法。
2. 前記モチーフがプロリンを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記モチーフがＸ_１−Ｐｒｏ−Ｘ_２であり、式中Ｘ_１およびＸ_２が同じまたは異なっており、かつ、いかなるアミノ酸であってよい、請求項２に記載の方法。
4. Ｘ_２がＰｈｅである、請求項３に記載の方法。
5. 前記リガンドがＡＴ２Ｒに選択的である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記リガンドがＡＴ１Ｒに選択的である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記リガンドがＡＴ２Ｒに選択的であり、溶液中においてｃｉｓ−異性体化の増大を示す、請求項５に記載の方法。
8. 前記リガンドがアンジオテンシンＩ、ＩＩ、ＩＩＩもしくはＩＶまたはサララシンの変異体である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記モチーフがＨｉｓ^６−Ｐｒｏ^７−Ｐｈｅ^８である、請求項５に記載の方法。
10. 前記Ｈｉｓ^６残基がＴｙｒにより置換されて、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−ＰｈｅモチーフおよびＡＩＩのＴｙｒ^６アナログを産生する、請求項９に記載の方法。
11. 電子供与性基または電子求引性基がフェニルアラニン環のパラ位の水素を置換するように導入されている４−置換Ｐｈｅ残基、請求項９に記載の方法。
12. 配列Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅを含む、アンジオテンシンＩＩ受容体のリガンド。
13. 配列Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅを有する、請求項１２に記載のリガンド。
14. 電子供与性基または電子求引性基が、フェニルアラニン環のパラ位の水素を置換するように導入されている４−置換Ｐｈｅ残基を有する、アンジオテンシンＩＩ受容体のリガンド。
15. 配列Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅを有するアンジオテンシンＩＩ受容体のリガンドであって、Ｐｈｅ^６が４位で置換されているリガンド。
16. 野生型アンジオテンシンＩＩと比較して、１つまたは複数のｃｉｓまたはｔｒａｎｓ異性体の形成が選好される、アンジオテンシンＩＩの変異体。
17. 腫瘍治療における使用のための、請求項１〜１１のいずれか１項により選択されるリガンド。
18. 腫瘍治療における使用のための、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載のリガンド。
19. ＡＴ２Ｒシグナル伝達を介した膵がん細胞の増殖における負の制御因子としての使用のための、または、ＡＴ２Ｒシグナル伝達を通じた肺腺がん細胞の増殖における負の制御因子としての使用のための、請求項１７または請求項１８に記載のリガンド。
20. 腫瘍治療における、ＡＴ１アンタゴニストとの同時、別々に同時または逐次の使用のための、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載のリガンド。
21. 脊髄損傷の治療における使用のための、請求項１〜１１のいずれか１項により選択されるリガンド、または請求項１２〜１６のいずれか１項に記載のリガンド。
22. ［Ｙ］^６−ＡＩＩリガンドである、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載のリガンド。
23. 腫瘍治療の必要がある患者において腫瘍を治療するための方法であって、請求項１７〜１９、２１または２２のいずれか１項に記載のリガンドの薬学的有効量を前記患者に投与するステップを含む、方法。
24. 脊髄治療の必要がある患者において腫瘍を治療するための方法であって、請求項２０に記載のリガンドの薬学的有効量を前記患者に投与するステップを含む、方法。

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