CN104040345A - 血管紧张素ii受体的选择性配体 - Google Patents

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Abstract

在过去的十年出现大量A-GPCR(G蛋白偶联受体)种类的结构信息。然而配体对密切相关的受体亚型如血管紧张素受体AT1aR和AT2R的选择性的结构和电子基础知之甚少，所述受体亚型对相同配体的反应呈现完全不同的生物学功能。为了监测生物系统内的复合物反应，在选择性方面呈现梯度的配体是有用的。在本研究中，提出一种有效的方法来调整配体对两种血管紧张素II受体亚型(AT1aR和AT2R)的选择性，该方法通过芳香电子交换，控制血管紧张素II中芳香-脯氨酰基的相互作用。在这个策略的基础上，获得了对AT2R具有选择性和高亲和力的激动剂类似物(Ki＝3nM)。

Description

血管紧张素II受体的选择性配体
背景技术
GPCR是细胞外环境向细胞内空间信号传导的关键因素1,2。尽管他们能够被从小的神经递质到激素的一系列细胞外配体激活，类视紫红质(rhodopsin-like)GPCR3的关键结构元件的序列保守性提出一个共同的激活机制。最近GPCR的X射线结构1,4-7确定了GPCR家族A整体的结构，并准确地指出配体结合口袋的结构。然而，这些结构也引出关于配体对密切相关的受体亚型的选择性机制的问题1,8。例如，尽管直接围在人肾上腺素受体b1和b2配体结合口袋周围的残基似乎相同，但是配体与两个受体亚型结合的特异性完全不同1,8。
因此，在GPCR分子中识别不是一个仅依赖受体分子结构的简单过程，而是与配体结构密切相关。这在视紫红质激活机制中是很显而易见的，其中所述到其信号传导状态的转换是由其固有配体视黄醛的顺式到反式异构结构的转换来完成9,10。这种顺式/反式转换的主要结果是打破和/或减弱跨膜螺旋间的大部分静电约束，从而触发受体激活10。这种顺式向反式异构化转换作为大多数生物过程的关键部分出现，以脯氨酸作为关键元素11-14。
生物活性激素血管紧张素II(AII：DRVYIHPF)在其一级结构中有一个脯氨酸残基，其异构态在激活它的AT1a和AT2受体亚型中可能很重要。在水性溶液中天然的AII普遍的构象是反式的(>95％)15。有趣的是，AII中的Pro7Gly突变提供构象的可塑性，几乎保留其与AT2R的亲和力，但是与ATlaR的亲和力呈现出150倍降低16。
出现的一个关键问题是正式/反式相互转换的能量壁垒的降低是否将允许AII同时占有两种不同的构象(顺式和反式)，从而影响与AII两种受体亚型结合的亲和力与特异性。推定的脯氨酸异构化在受体亚型选择性中的作用可能最有价值，因为AT2R的激活作用(血管舒张、凋亡和抗增殖)与AT1aR介导的作用(对AT1的细胞生长和增殖)相反17-19。另外，因AT2R的激活抑制胰腺癌细胞的生长，这个受体是化学治疗这类癌症潜在的靶点20,21。因此，通过联合使用调节性配体微调AT1a和AT2受体的不同功能反应可作为强大的治疗工具22。
这里，我们描述了通过芳香-脯氨酰基相互作用的电子控制微调配体对AT1aR和AT2R亚型选择性的一种新策略。基于这一策略建立了一个新的低亲和力nM且对AT2R有选择性的激动剂。
发明内容
本发明一方面，提供制备血管紧张素II受体选择性配体的方法，其包含以下步骤：
(i)选择易于顺-反异构化的受体配体的基序；
(ii)比较配体与含有所述基序的数据库中的序列并确定该基序内或附近的取代对顺式或反式异构体的形成的影响；
(iii)根据步骤(ii)中的比较产生配体中的取代，从而利于配体中顺式或反式异构体。
虽然密切相关的G蛋白偶联受体亚型的选择性配体的开发对解码受体病理生理学反应是重要的，但是其是冗长耗时的过程。在缺少对配体结合与亚型选择性间相互作用决定因素的理解时，反复试验和错误和意外发现的运气在选择性配体成功开发中发挥主要的作用。当受体亚型呈现相反的功能时，掌握实现选择性配体识别的原理是尤其重要的。这对两种AII受体亚型是明显的证据：很多病理学已经涉及到AT1aR，如心力衰竭、动脉粥样硬化、视网膜病变、心肌肥厚、血管平滑肌增生、和高血压等疾病37。相反，相较于AT1R，AT2R介导的功能相当不同，如抗增殖、抗炎症、神经分化、血管重构和肿瘤抑制20,21,38-40。因此AT2R已经被认为是重要的药学药物靶点。由于缺少具体的配体-受体识别相互作用的知识，针对AT2R的选择性配体的鉴定出现在长期细致的努力之后41。
使用被激素AII以相似的亲和力识别的配体，我们已经开发出一种调节针对两种受体亚型的配体-受体选择性的策略。
为了多肽能呈现顺-反异构化，需要一个N-取代的氨基酸。实施例包含肌氨酸和脯氨酸。优选，根据权利要求1的方法，基序包含脯氨酸。序列Pro-X,其中X是任何氨基酸，使顺式和反式的两异构体多肽具有相似的能量；这意味着两种异构体是理论上可能的。X的性质影响顺式和反式异构体间平衡。
在一个优选的实施方案中，提供了一种根据本发明的方法，其中基序是X1-Pro-X2，其中X1和X2相同或不同，并可以为任何氨基酸。X1也对顺式和反式异构体间的平衡有影响。通过在这些位置的每个位点选择合适的氨基酸，能够定制偏向于一种或另一种异构体形式的配体，或在有些实例中能够具有两种异构体形式。
在本发明的一个实施例中，X2是Phe。因此，可分析包含基序X-Pro-Phe的配体的偏向于顺式或反式异构体形式的能力；可以在一个数据库中评价顺式或反式异构体的发生率，如pdb，并将形成这种异构体的可能性配制给基于X-Pro-Phe基序中X的同一性的测试配体。
通过这种方法，设计对AT2R或AT1R有选择性的配体。例如一个针对AT2R有选择性的配体在溶液中能够表现出顺式异构化增强。
用于本发明方法中的、以及因此作为潜在配体基础的基序的来源是各种形式的血管紧张素。例如，配体可以是血管紧张素Ⅰ、II、Ⅲ、或Ⅳ的突变体或沙拉新。沙拉新是血管紧张素II的衍生物，其氮端和碳端的氨基酸分别被肌氨酸和丙氨酸取代。
在一个实施方案中，基序是血管紧张素II(AII)中的His6-Pro7-Phe8基序。
在一个实施方案中，His6残基被Tyr所替代，产生Tyr-Pro-Phe基序，和AII的Tyr6类似物。因此，在第二方面，本发明提供了针对血管紧张素II受体的配体，其具序列Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-Tyr-Pro-Phe。
在一个替代的实施方案中，在AII的位置6中使用了4-取代的Phe残基，其中引入了供电子或吸电子基团。因此，本发明提供了针对血管紧张素II受体的配体，其具有序列Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-Phe-Pro-Phe，其中Phe6在位置4上取代，即取代苯丙氨酸环对位的氢。
一个实施方案中，配体对AT2受体是有选择性的。在一个替代实施方案中，配体对AT1受体具有选择性。一般而言，位置6的供电子取代偏向于对AT2R的选择性，吸电子取代偏向于对AT1R的选择性。
AII受体亚型的配体选择性可以通过调节AII(4-x-Phe6)位置6上引入的苯丙氨酸对位氢的简单取代的电子特征来准确描述。尤其是，具有供电子基团(-OH)的[Y]6-AII类似物产生一个对AT2R有选择性和高亲和力的结合物(Ki＝3.4±0.8nM)，然而，吸电子基团完全取消了对这个受体的高结合亲和力和选择性(图5)。最重要的是，这个受体识别表型直接与顺式特征的结构和由该电子控制诱导的4-X-Phe6-Pro7-Phe8基序的紧密度相关。在位置6包含缺电子芳香残基的AII类似物相对不偏向于顺式酰胺键，并相对于富含电子的芳香残基呈现对AT2受体的选择性和亲和力下降。例如，相较于[Y]6-AII，[4-NO2-F]6-AII呈现对AT2R亲和力300倍的降低，但是对AT1aR具有高亲和力(nM)(未发表数据)。同时，[F]6-AII对AT1aR和AT2R呈现相同的亲和力，但是相较于[Y]6-AII对AT2R的亲和力降低了50倍以上(数据未发表)。这个顺式-反式异构化控制以调节Pro7和4-X-Phe6 27芳香环电子间的相互作用为基础。因此，通过缺电子的脯氨酰基C-H键和富电子芳香环间形成的一个CH-π相互作用稳定顺式形式42。事实上，我们的NMR数据提示在[Y]6-AIIAT2可选择的类似物中增强了顺式特征和脯氨酸周围两芳香侧链环的堆积(Y6-P7-F8图2a)。这个残基的堆积导致对涉及肽键的保护，这通过酰胺质子温度系数研究和扩散序实验确定(图2c，d)，因此降低了将其转移进入AT2R配体结合口袋的更加疏水环境的成本。
通过微调节芳香电子控制配体对受体亚型的选择性的策略是第一次描述。从这个策略衍生的选择性和高亲和力的AT2R类似物，[Y]6-AII，在PC12细胞中刺激AT2R的活性(图4)。
另一方面，提供一个根据本发明上述方面选择的用于肿瘤治疗的配体。
众所周知AT2R是肿瘤治疗的靶。尤其是，敲除AT2R能提升胰腺肿瘤的发展已经被证实20，且在肺腺癌细胞中过表达AT2R诱导细胞死亡21。因此，根据本发明，选择性激活AT2R的配体是抗肿瘤治疗的候选。
优选，配体是包含序列Tyr-Pro-Phe的血管紧张素II受体的一个配体。
在一个实施方案中，配体具有序列Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-Tyr-Pro-Phe。
在另一个实施方案中，易弯曲的(lithe)配体可有4-位取代的Phe残基，其中引入一个供电子或一个吸电子基团替代苯丙氨酸环对位的氢。
例如，配体可具有序列Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-Phe-Pro-Phe，其中Phe6在位置4被取代。
在一个实施方案中，提供了通过AT2R信号传导用作胰腺癌细胞生长的负调节物的配体20。在另一个实施方案中，提供了通过AT2R信号传导用作肺腺癌细胞生长的负调节物的配体21。
在一个优选的实施方案中，配体是[Y]6-AII配体。
在另一方面，本发明提供了用于治疗有肿瘤治疗需要的患者中的肿瘤的方法，其包括给所述患者施用药学有效剂量的配体，所述配体如本发明上述方面所示。
在又一个方面，提供了本发明上述方面所示的配体与血管紧张素Ⅰ拮抗剂联合用于治疗肿瘤。在一个实施方案中，提供了根据本发明以上所述的配体和AT1拮抗剂同时、同时分开或相继用于治疗肿瘤，
另外，本发明提供了试剂盒，其包含根据本发明之前所述的配体和AT1拮抗剂，以及一种或更多药学可接受的稀释剂或载体。
一个示范性的ATI拮抗剂是氯沙坦。
附图说明
图1、[Y]6-AII在溶液中呈现顺式异构化增强。a)脯氨酰基Tyr6-Pro7键的顺式-反式异构化图解视图。b)[Y]6-AII(90％H2O/10％D2O)350ms的NOESY谱的选择区域。红线与绿线分别表示反式和顺式异构体的NOE连通性。
图2、工程化的AII类似物的独特的顺式和反式构象异构体的溶液结构。a,b)以化学位移射散的高质量为基础得到两种构象异构体的去卷积。c)[Y]6-AII的NH△δ/△T相对于CSD。虚线对应于△δ/△T＝-7.8(CSD)-4.4，其在蛋白质数据库提供隔离型(sequestered)NH的最佳区分。d)[Y]6-AII的1HDOSY谱。
图3、类似物选择性：类似物与AT1R、AT2R野生型和突变体的结合。[Y]6-AII(a)和[4-OPO3H2-F]6-AII类似物(b)与AT1R(黑色)、AT2R野生型和突变体的竞争结合实验：AT1R，开环；野生型AT2R，黑圆；AT2R-Y189A，蓝色钻形；AT2R-Y189N，绿三角；AT2R-F272A，红色正方形；AT2R-F272H，橘色三角。缺失未标记配体时的[125I]-ATII的结合设为100％。显示的数据来自两个独立的实验，其每个数据点重复测试3次。KD和Ki值显示在表4中。
图4、[Y]6-AII类似物对AT2受体的激动效果：在AT2过表达的PC12W细胞中神经突增生的增加。Ad-AT2R转导或无转导的PC12W细胞接种于24孔板中，在含有10％FBS的DMEM培养基中培养24小时。培养基改为含有5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的DMEM培养基。三小时后，细胞用1nMAII或[Y]6-AII刺激。二十四小时后，每个孔拍摄15幅照片。随机选择五幅照片，计数显示神经突增生的细胞。计算具有神经突增生的细胞相对于全部细胞的比率。神经突增生细胞定义为细胞神经突长度大于细胞大小。试验重复三次。数据表示为平均±SE值。
图5、调节配体对AT2和AT1a受体亚型选择性的机械基础。其通过调节顺式-反式异构化和芳香电子学的芳香-脯氨酰基相互作用来实现。显示脯氨酰基4-取代的Phe6-Pro7键的顺式-反式异构化的二级结构。Phe6的对位取代表示为X。
图6、a)在AT2R的同源模型中绘制AT2R和AT1R间的保守残基。图通过MOLMOL和ProtSkin制作。b)在AT2R的同源模型中绘制AT2R和其他GPCR的同源残基。图通过Rasmol和Protskin制备。AT1R和AT2R之间的保守残基存在于TM区域。这些残基的大多数与其他GPCR的同源残基重叠。
图7、Tyri-1-Proi-Phei+1基序中的顺式情况簇家族中参考性成员。从左至右分别表示：Tyri-1、Proi和Phei+1中三环聚集的情况；Tyri-1和Proi之间两环聚集；和Tyri-1和Phei+1之间两环聚集。数量最多簇的是Tyri-1、Proi和Phei+1中的三环聚集(表3)。
图8、泛素蛋白连接酶E3A和泛素结合酶E2(pdbid：1C4Z)之间复合物的X射线结构，Tyr-Pro-Phe基序(YPF)属于E2(残基61-63)，位于相互作用的界面。在这个基序中(红色)有一个顺式脯氨酸，脯氨酸环相对于Tyr和Phe的芳香环形密封。以半径截点选择YFP基序周围的环境(碳为灰色，氮为蓝色和氧为红色)。有趣的是，该环境与AT2R的配体结合位点(橘色的残基)附近的环境高度类似。用于此叠加位点的AT2R结构以无配体状态的视紫红质(pdbid：3CAP)为基础构建。AT2R与围绕在Tyr-Pro-Phe基序环境周围的残基的同源残基是：W269/W105；K215/R96；Y189/Y694,Y51(A194)/F698,L97/L695,L124/L696,L305(I304)/L659,T276/S65,I196/I697,L124/L696,P271/P58,L190/Y694,H273/F66,F220/P68。Phe308,Phel29,Phe272和Ile304能够帮助AT2中相似基序的组装。
图9、在相同实验条件(0.01M KPi缓冲液pH＝5.7,10％D2O,277K)下记录的[Y]6-AII(黑色)与天然AII(红色)的2D-1H-1HNOESY谱所选区域重叠。红线和绿线分别表示[Y6]-AII反式和顺式异构体的NOE连通性，蓝色的线表示天然AII单一反式异构体。
图10、750MHzNOESY谱的区域，其显示顺式脯氨酸环中残基内NOE。
图11、750MHzNOESY谱的区域，其显示顺式Tyr6和顺式Phe8残基内的CαH-CβH交叉峰，以及肽顺式形式折叠构象的若干特征性NOE。
具体实施方式
除非另有定义，此处用到所有技术和科学术语与本领域那些普通技术人员通常理解的意思相同，如肽化学、细胞培养、核酸化学和生物化学领域。标准的技术用于分子生物学、基因和生化方法。(见Sambrook等,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3rd ed.,2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY；Ausubel等,Short Protocols in Molecular Biology(1999)4th ed.,JohnWiley & Sons,Inc.)。此处索引的所有出版物全部并入此处作为参考，目的是描述和公开方法学、试剂和可能用于本发明的在出版物上报道的工具。
选择性配体是相对于第二个能够优先与第一个受体结合的配体。在本发明的上下文中，如果配体优先结合到一种形式，则其对一种或另外一种形式的血管紧张素II受体具有选择性；例如相对于AT2R，配体优先结合AT1R。优先结合并不意味着专一结合，相比于另外一种形式，占有受体一种形式的比率可任意变化，可以从低(例如，所需受体的占有55％到60％)到高(如所需受体的占有95％-100％)。多数情况下，配体在两种形式的受体之间分配，其分配比率依赖若干因素。这些不仅包括配体的选择性，还包括配体相对于受体的浓度，以及存在的受体的相对浓度。
血管紧张素II受体是抗高血压剂特征良好的靶。血管紧张素受体拮抗剂广泛用于在心脏医学和血压调节。已知血管紧张素II受体的至少有四种类型，标记为AT1R到AT4R。所述所有血管紧张素受体结合血管紧张素II配体。本发明提供一种对一种受体亚型的选择性超过另外一种的配体生成方法。这可具有重要的生理学结果；例如，如上面所见，已经报道了很多病况不同地受AT1R和AT2R影响。
在本发明的上下文中，顺式-反式异构化是在一个多肽的两个氨基酸间的肽键形成顺式或反式异构体。大多数肽键采用反式异构体(典型地，在非限制条件下99.9％)，主要是因为相对于之后的Cα原子，酰胺氢对之前的Cα原子提供较少的位阻排斥。相反，X-Pro肽键的顺式和反式异构体(其中X代表任何氨基酸)都与相邻取代具有位阻冲突，且能量几乎相等。因此，在非限制条件下顺式异构体中X-Pro肽键的分数范围是10-40％；所述分数依赖于之前的氨基酸，芳香残基偏向于顺式异构体。Pro可被N-取代的氨基酸替代，如肌氨酸，但是在天然氨基酸中是独特的。
包含结构信息(包括顺式-反式异构信息)的蛋白数据库被广泛使用。一个例子是蛋白数据库(pdb)数据库，其含有大量生物分子的结构信息。
血管紧张素II受体的配体中的基序可以是含有序列X-Pro的任何氨基酸序列。可以衍生基序的优选配体以血管紧张素为基础。然而，可以考虑血管紧张素II受体的其他多肽配体，其中可鉴定包含序列X-Pro的基序并用在本发明的方法中。
血管紧张素是一个通过剪切血管紧张素原得到的肽激素，血管紧张素原是452个氨基酸的多肽，其被肾素作用剪切并释放10个氨基酸的血管紧张素Ⅰ多肽。通过切除两个C端残基，其被进一步剪切形成血管紧张素II，一种生物活性的激素。通过每次切除一个N端残基，进一步剪切产生血管紧张素Ⅲ和Ⅳ。
工程化AII激素使其对AT2R具有选择性。为研究脯氨酸在受体选择性中的作用，我们主要集中在AII激素的C端部分(His6-Pro7-Phe8)，其已经通过致突变研究被描绘深深锚定在AII受体内部23-26。在蛋白结构数据库(www.pdb.org)搜索X-Pro-Phe基序(其中X是任何氨基酸)来鉴定标记有顺式特征的氨基酸基序(表1)。很明显，这些基序中有很大的结构可塑性，取决于脯氨酸之前的X氨基酸(数据未显示)。AT1aR和AT2R配体结合口袋以与其他GPCR的已知X射线结构的保守型残基为基础建模，并根据可利用的致突变研究进行改善(图6)。根据这一模型，主要负责决定配体对AT2R/AT1aR的结合亲和力和选择性的残基分别如下：L124/V108,F308/Y292,L305/C289,F120/A104,T125/S109,F272/H256,G121/S105,F199/Y184,F129/Y113和Y189/N174。相对于AT1aR，这些氨基酸多数在绘制的AT2R配体结合位点附近引入更疏水和更大的残基，这导致结合位点变浅。类似的观察在beta-肾上腺素受体亚型被注意到，其中相对于b1AR，b2AR的配体选择性被认为是由于极性残基的改变1。因此可以认为对AT2R选择性的类似物应该寻找更疏水和紧密的基序。从表1的X-Pro-Phe蛋白数据库看出，Tyr-Pro-Phe微核心似乎是理想的，因为顺式状态数量很高，且含有此基序的多数结构呈现脯氨酸附近大体积芳香侧链疏水环形密封(ring packing)，其导致紧密度(图7)。我们推测这样的残基密封能够降低微核心内的肽键的可接近性，因此降低将其划分至AT2R配体结合口袋的更疏水环境的高成本。X-Pro-Phe数库中Tyr-Pro-Phe微核心周围的环境分析提示与存在于同源建模AT2受体的配体结合口袋附近的环境高度相似性(图8)。这提示特异的微核心可潜在地被组装并安置在AT2R内。因此，合成AII类似物，其在位置6引入酪氨酸残基而不是组氨酸([Y]6-AII:Asp1-Arg2-Val3-Tyr4-Ile5-Tyr6-Pro7-Phe8)。另外，Tyr6取代优于Phe6，因为前者有更高的富电子特征，其将更好的稳定C-H-π脯氨酰-芳香的相互作用，因此偏向于顺式状态的更紧密的构象27。
在溶液中，[Y]6-AII显示增强的顺式异构化。NMR用于探索[Y]6-AII类似物在溶液中的结构。类似物的1H-1H-2D NOESY谱的选择区域显示在图1。有趣的是，[Y]6-AII显示两套不同的质子共振，其相应于水性溶液中离散的顺式和反式构象群。这与天然AII相反，其只观察到单独一组峰，代表单独的构象(反式)(图、9)。
由于顺式和反式构象异构体的共振分散得非常好，可以实现去卷积和完整的共振分配(表2和3)。然后选择NOE限制，使其只包含来自构象全体的相关成员信息。对不同的顺式和反式异构体进行了结构计算，并且绘制了稳定相关构象效能的结构成因。对于[Y]6-AII的顺式异构体，计算给出了一个结构家族，其伸展的Asp1到Ile5片段。Tyr6到Phe8区域显示VI型变动，其Tyr和Phe的芳香环堆积在Pro的环上(图2a)。顺式状态的Tyr-Pro-Phe微核心的结构构造高度模拟记录在X-Pro-Phe蛋白数据库中的多数家族采用的构象(图7)。因此，很显然短肽序列中的结构可塑性能够被蛋白基序传递的信息所调节。NMR谱的多个特征表明在顺式异构体中存在VI型构象。例如，顺式脯氨酸质子共振的显著高磁场位移(表2和3)；来自残基6(Tyr6Hα)到残基8(Phe8NH)的交叉转弯(cross-turn)(i-i+2)NOE；基于残基内NOE形式的脯氨酸环的Cβ-exo/Cγ-endo构象；在构象全体中顺式形式摩尔分数增加(图11)。在顺式构象异构体中此基序主要的稳定因素是芳香的和脯氨酸环的堆积。在[Y]6-AII的反式构象异构体中此基序的结构更加伸展(图2b)。
为了确定顺式和反式形式肽键的可接近性，我们用NMR测量了酰胺质子温度系数(Δδ/ΔΤ)(图2c)和它们在溶液中的平移扩散。扩散系数用脉冲场梯度(PFG)技术测定，扩散优化谱DOSY(扩散序谱)28,29。有趣的是，通过测量温度系数和平移扩散的值我们发现[Y]6-AII顺式构象异构体肽键的可接近性相比于反式构象异构体降低更多(即对顺式和反式的Tyr4我们测定的扩散系数分别是1.910-10m2s-1和2.310-10m2s-1，见图4d)。与反式形式相反，这种降低能够允许顺式形式采取较低的高成本划分在AT2R配体结合口袋的疏水环境中。
[Y]6-AII类似物对AT2R具有选择性：顺式特征对受体的选择性和亲和力的重要性。因[Y]6-AII类似物满足对AT2R选择性的实验标准，我们测量了它与AT1aR和AT2R的结合。有趣的是，类似物以高亲和力与AT2R结合(Ki＝3.4±0.8nM)，然而在所用类似物浓度的亚毫摩范围内我们未能观察到与AT1aR的饱和结合。为了说明[Y]6-AII对AT2R的选择性是否以配体顺式特征的增加和产生的Tyr-Pro-Phe基序的紧密性为基础，采用一个电子策略27用于控制AII类似物的顺式-反式异构化状态。特别是，当芳香环提供电子密度(π电子供体)给缺电子的吡咯烷环的C-H键时，芳香-脯氨酰基的相互作用能够不仅因为疏水作用被稳定，而且还因为C-H-π相互作用被稳定27。因此，富电子芳香残基能够稳定芳香-脯氨酰基相互作用，增加顺式构象。相反，缺电子芳香残基应该偏向于反式构象，并导致不太有利于的相互作用和紧密性。因此，我们合成了在位置6引入4-取代的苯丙氨酸的AII类似物，其带有富电子(-OH)、中性电子(-H和-OPO3H2)和缺电子(NO2)基团。所述4-NO2-苯丙氨酸AII类似物，是一个缺电子芳香残基(Hammet取代基常数的值σρ＝0.78)，应该最不偏向于顺式构象，然而苯丙氨酸和磷酸化酪氨酸(σρ～0.00)应该有适度的顺式构象。相反，如NMR实验确定的，酪氨酸，一个富电子的芳香残基(σρ≈-0.37)，偏向于顺式酰胺键的配体。确实，NMR数据表明富电子残基偏向于芳香-脯氨酰基相互作用和顺式酰胺键，按以下芳香取代排序：-OH>-H≈-OPO3H2>-N02(发现cis％大概分别是40、20、25和5)。通过芳香-脯氨酰基相互作用的电子转变在控制AII中的顺式-反式异构的基础上，我们实施了类似物与AT1aR和AT2R的结合实验。有趣的是，所有AII类似物的结合亲和力和选择性与以上描述的类似物顺式-反式异构直接相关(对AT2R亲和力的排序是：[Y]6-AII>[4-OPO3H2-F]6-AII>[F]6-AII>[4-NO2-F]6-AII)。
[Y]6-AII类似物在AT2受体的潜在定位。几个致突变研究表明AII C端部分定位于AT1aR23,26,30,31和AT2R26,32,33的内部深处。A-GPCR种类的X射线结构为建立相关受体真实的结构模型提供有价值的模板34。如我们以上所述，AT2R和AT1aR的重建模型提示，相较于AT1aR，AT2R对AII C端部分有更浅和更疏水的结合位点，表明对AT2R高亲和力的结合需要更紧密的AII C端。为了鉴定负责决定[Y]6AII与AT2R/AT1aR亲和力和选择性的残基，我们构建了如下AT2R突变体：Y189A、Y189N、F272A、F272H。这些改变在配体结合口袋附近引入极性残基或较小的残基，仿效AT1aR配体结合口袋中更极性的环境。[Y]6-AII和[4-OPO3H2-F]6-AII两类似物用于探索AT2R和其突变体的结合口袋：结果总结在图3和表4。在AT2R中为了最佳环堆积，[Y]6-AII类似物似乎在位置189和272都需要一个芳香环。如所预料，[4-OPO3H2-F]6-AII的增强极性导致对AT2R的Ki值比[Y]6-AII配体大一个数量级。相较于野生型AT2R，Y189N突变体显示降低的对[4-OPO3H2-F]6-AII的亲和力，可能归因于极性的增强和/或侧链的大小。对相同的配体，189位酪氨酸替换为丙氨酸，一个非极性氨基酸，比引入天冬氨酸更好接纳。突变受体F272A相比于F272H突变体呈现较低亲和力，提示受体变体的咪唑基团与类似物的酪氨酸之间通过范德华力接触的稳定的环堆积相互作用力。总之，这些数据支持最初的假设，即[Y]6-AI1对AT2R的选择性基于更加疏水的结合口袋(相较于AT1aR)，其稳定类似物Tyr6和AT2R结合口袋中Y189/F272残基之间的芳香环配对。
[Y]6-AII类似物是AT2R激动剂：其在过表达AT2R的PC12W细胞中诱导神经突增生。用PC12W细胞来评价[Y]6-AII类似物对细胞分化(神经突增生)的作用。PC12W大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞在未分化状态下，是圆形且分裂活跃。PC12W细胞已经显示能够在长时间的无血清培养条件下35表达AT2R，且他们的神经突增殖被AII所促进36。如通过实时定量PCR所测定的，PC12W细胞在本试验条件下不表达AT1aR(数据未显示)。如图4所示，很多细胞未刺激时已经生长出短的神经突。然而，在AT2R转导的细胞中，AII和[Y]6-AII类似物都显著刺激神经突增生(图4)。这种表型在1pM到100nM范围内的AII和[Y]6-AII均是配体剂量依赖。
[Y]6-AII类似物抑制肿瘤细胞增殖，而且促进伤口愈合。
为评价AII类似物在肿瘤增殖中的作用，三个AII类似物在细胞增殖测试中进行了测试。所用类似物是A1(序列：DRVYICPF)，在位置6具有半胱氨酸残基；A2(序列：DRVYIdYPF)，在位置6有D-Tyr，和A3([Y]6-AII类似物)。增殖测试在不同癌细胞中进行。见表5。A3在所有研究的细胞系中呈现最好的结果，在nM的范围呈现良好的IC50值。
AT1R表达被沉默的细胞系获得的数据说明AT1R表达降低，或AT1(AI)拮抗，在抑制肿瘤细胞增殖中与本发明的AII类似物发挥互补作用。数据表明AT1拮抗剂氯沙坦和本发明的AII类似物具有非常有益的组合效应。
另外的伤口愈合的测试再次显示[Y]6类似物呈现优异的IC50值(表5)。
表1、在PDB中X-Pro-Phe肽基序中顺式形式的相对发生率的结构统计。
表2、AII类似物反式异构体完整的共振分配。
表3.AII类似物顺式异构体完整的共振分配。
表4、125-I AII饱和试验和野生型与突变AII受体的类似物竞争试验的结果总结。
试验按材料与方法所述实施。样品与配体在冰上孵育2小时。竞争结合试验中使用的[125I]-AII的浓度为2nM。KD数据用Prism软件的非线性回归公式拟合到米曼氏公式。Ki值根据Cheng和Prusoff公式计算，使用第一栏中KD值。数值是2-3次独立试验的代表。每个数据点重复测试三次。
a所用配体浓度范围内(6.4x10-12-2.5x10-6M)无可检测到的竞争结合。
表5、肿瘤细胞增殖和伤口愈合测试的IC50数据总结。
增殖测试
伤口愈合
药物组合物
在一个优选的实施方案中，提供药物组合物，其包含化合物或通过本发明上述方面定义的检测方法可鉴定的化合物，包括以上描述的配体。
根据本发明药物组合物是一种物质组合物，其包含一种或多种作为活性成分能够特异激活AT2R的化合物。通常地，所述化合物是任何药学可接受的盐的形式，或例如，当合适时，是类似物、游离碱形式、互变异构体、对映异构体消旋物、或其组合。包含根据本发明的活性成分的药物组合物的活性成分设计成呈现优异的治疗活性，例如，以取决于特定病例的量施用时，在治疗肿瘤如胰腺癌和肺癌中的治疗活性。示例化合物是AII类似物，其包含序列Tyr-Pro-Phe。
在另一个实施方案中，一种或以上本发明化合物可以与本领域公认的已知适合用于治疗任何上述病况的化合物联合使用。因此，一种或以上本发明的化合物可以与一种或以上已知适合用于治疗上述病况的化合物联合使用，从而能够施用于受试者方便的单一组合物。为提供最佳的治疗反应，剂量方案可以进行调整。
例如，可以每日施用几个分开的剂量或剂量可以依照治疗情况紧急程度按比例降低。
活性成分可以以方便的方式施用，如口服的、静脉的(可溶于水时)、肌肉的、皮下的、鼻内的、皮内的或栓剂途径或植入(如使用缓释分子)。
根据给药途径，活性成分可能需要被包被在材料中以保护所述成分免受酶、酸、和其他可以使所述活性成分失活的天然条件伤害。
除了肠胃外施用外，为了施用活性成分，其将被包被、或与可阻止其失活的物质联合施用。例如，活性成分可以在佐剂中施用、与酶抑制剂共同施用或置于脂质体内施用。这里考虑的佐剂包括间苯二酚、非离子表面活性剂、如聚氧乙烯油基醚和十六烷基聚乙烯醚。
脂质体包含水包油包水CGF乳浊液和传统脂质体。
活性成分也可以肠胃外或腹腔内施用。
分散剂也可以制备于甘油、液态聚乙二醇、和其混合物和油中。常规的储存和使用条件下，这些制剂含有防止微生物生长的防腐剂。
适合注射用的药物形式包含无菌水性溶液(可溶于水时)或分散液和用于临时配置无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。所有情况下，剂型必须无菌且必须是容易使用注射器程度的流体。其在生产和储存的条件下必须稳定，并且必须防止微生物的污染，如细菌和真菌。载体可以是一种溶剂或分散介质包含，如，水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。可以保持适当的流动性，例如，通过使用包衣如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所要求的粒径大小和通过使用superfactants(无对照中文翻译)。
可以通过各种抗菌和抗真菌剂来实现阻止微生物的活性，如，苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、thirmerosal(无对应中文)等。很多情况下，将优选含有等渗剂，如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收剂来实现，例如，单硬脂酸铝和明胶来实现。
无菌注射液是通过将所需量的活性成分与其他以上列举的各种成分掺入到合适的溶剂中来制备，如需要，随后过滤灭菌。一般来说，分散液通过将无菌的活性成分掺入到含有基础分散介质和所需的以上列举的其他成分的无菌载体中制备。对于用于无菌注射液配制的无菌粉末，制备的优选的方法是真空干燥和冻干技术，这些技术从之前的其无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何其他所需成分的粉末。
当活性成分如上所述进行适当的保护时，它可以口服施用，如，与一种惰性稀释剂或与一种可吸收的食用载体、或它可以包裹在硬或软壳明胶胶囊内，或它可以被压缩到片剂中，或它可以直接掺入到饮食的食物中。为了口服治疗施用，活性成分可以掺入赋形剂，以可吸收的片剂、颊含片、锭剂、胶囊剂、酏剂、分散剂、糖浆、薄片剂(wafer)等。在这样的治疗有用组合物中将获得适当量的活性成分的剂量。
片剂、锭剂、丸剂、胶囊剂等也可以包含如下：粘合剂如西黄蓍胶，阿拉伯胶，玉米淀粉或明胶；赋形剂如磷酸二钙；崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂如硬脂酸镁；且可以添加甜味剂如蔗糖、乳糖或糖精，或调味剂如薄荷、冬青油、或樱桃调味剂。当单位剂型是胶囊时，除了上述类型的材料，其可以含有液态载体。
各种其他材料可以作为包衣或其他修饰单位计量的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用虫胶、糖或两者包衣。糖浆或酏剂可以包含活性成分、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的甲基和对羟基苯甲酸丙酯、染料和调味剂如樱桃或橙味。当然，用于制备任何单位剂型中任何材料应该是药学纯的和所用量基本上无毒的。另外，活性成分可以掺入缓释制剂和配方。
如此处所用，“药学可接受的载体和或稀释剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。这些介质和试剂在药物活性物质中的使用在本领域是众所周知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，可以考虑其在治疗组合物中使用。补充的活性成分也能掺入组合物中。
特别有利的是，以单位剂型配制胃肠外组合物，由于其易于施用和剂量均匀。此处所用单位剂型是指适合用于待治疗哺乳动物受试者的单一剂量的物理上离散单位；每个单位包含预定量的活性物质(经过计算产生期望的治疗效果)以及所需的药物载体。本发明新单位剂型的说明书表示为且直接取决于(a)活性物质的独特特征和要达到的特殊的治疗效果，(b)混合如活性物质领域固有的局限性，所述活性物质用于治疗具有身体健康受损的疾病状态的活受试者的活性物质。
单位剂型内将主要活性成分按有效量与合适的药学可接受的载体混合，以方便和有效的施用。在包含补充活性成分的组合物的情况下，剂量通过参考所述成分施用的常用剂量和方式来确定。
另一方面，提供了如以上所定义的本发明的活性成分，其用于单独治疗疾病或与已知适合治疗特定疾病的领域公认的化合物联合用于治疗疾病。于是，本发明提供了本发明的活性成分用于生产治疗癌症的药物的用途，尤其是治疗胰腺癌和肺癌，以及相关的治疗方法。
材料和方法
材料。AII和AT2R受体-特异阻断剂PD123319购买自Sigma-Aldrich ChemicalCo.(St.Louis,MO)。人AGTR2pcDNA3.1+从UMR cDNA Resource Centor获得(密苏里大学罗拉分校，罗拉，MO)。所有其它化学物质都是分析级。AT1aR和AT2R构建体是由Lazlo Hunyady赠送(赛梅维什医科大学，布达佩斯，匈牙利；43)。
致突变。AT2R突变体按别处描述生成44。
细胞培养和瞬时转染。HEK293T细胞培养在37℃在补充10(v/v)胎牛血清(FBS)，2mM谷氨酰胺，100U/ml青霉素，和100μg/ml链霉素的Dulbecco'smodified Eagle's medium(DMEM)培养基中。细胞接种于10cm的皿，24小时后用GeneJuice转染试剂根据生产商的说明书转染ATlaR(pcDNA3.1)或AT2R(pcDNAI/Amp)。转染48小时后收获细胞。用0.5ml冰冷的含有蛋白酶抑制剂(CompleteTM,Roche)的结合缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.4,100mM NaCl,10mMMgCl2,1mM EDTA,0.2％BSA和0.025％杆菌肽)重悬转染的HEK293T细胞(2x106个细胞)沉淀。细胞转移到1.5ml微离心管中，然后经受两轮冻融。裂解的细胞通过7次穿过26号针来剪切，粗制的细胞膜通过超速离心沉淀(60min,120,000xg,4℃)。粗制的细胞膜继而被重悬在终体积为0.2ml含有蛋白酶抑制的冰冷的结合缓冲液中，相应的蛋白浓度为3.3μg/μl，其通过安吉黑蛋白测定法测定45。
PC12W细胞是从大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤克隆分离的亚株，培养在补充有10％FBS，100U/ml青霉素和100μg/ml的链霉素的DMEM中(Invitrogen,Carlsbad,CA)如先前所述46。细胞孵育在5％CO2湿化培养箱,37℃。使用VECTOR BIOLABS(Philadelphia,PA)实施制备包含人AT2R编码区的重组复制缺陷腺病毒。
为了用腺病毒载体转导基因，细胞接种于6孔板，每孔1.2x105个细胞。24小时后，细胞在含有腺病毒载体(Ad-AT2R30多重感染(MOI))的无血清DMEM中孵育6小时，37℃，并每十五分钟轻轻摇动。孵育6hr后，细胞在含有10％FBS的DMEM培养基中，在37℃,5％CO2再培养24小时。然后细胞被胰蛋白酶化并以每孔2x103个细胞在24孔板中次培养。为了评价[Y]6-AII类似物对细胞突增生的作用，次培养24小时后，对照细胞和AT2R过表达细胞用1nM AII或[Y]6-AII处理，如图4所示。
放射配体结合试验。饱和曲线用浓度范围为0-10nM的[125I]-AII(Amersham)获得(8个数据点重复三次)。非特异性结合在6μΜ冷的AII存在下测定。竞争试验用1nM[125I]-AII和不同浓度的非标记的配体进行，如图3所示。样品在4℃孵育两小时。结合受体的和游离的放射性配体通过Whatman GF/B滤纸过滤分离，滤纸在0.3％聚乙撑胺中预浸。滤纸用5ml冰冷的结合缓冲液冲洗，转移到闪烁管。放射活性用Beckman LS6000液态闪烁计算器计算，且数据分析使用Prism软件(GraphPad)进行非线性回归。Ki值根据Cheng和Prusoff公式计算，其中对[125I]-AII的KD值是1.8nM(ATlaR)和2.3nM(AT2R)。
肽合成与样品制备。合成以下肽段：
AII(D1-R2-V3-Y4-I5-H6-P7-F8)；[Y]6-AII(D1-R2-V3-Y4-I5-Y6-P7-F8)；[4-OPO3H2-F]6-AII,(D1-R2-V3-Y4-I5-(4-OPO3H2-F)6-P7-F8),[F]6-AII,(D1-R2-V3-Y4-I5-F6-P7-F8)和[4-NO2-F]6-AII,(D1-R2-V3-Y4-I5-(4-NO2-F)6-P7-F8)用Fmoc/tBu方法学实现。2-氯三苯甲基氯树脂和Nα-Fmoc(9-芴甲氧羰基)氨基酸用于合成。肽纯度通过HPLC分析(Nucleosil-120C18,反相,250X4.0mm)、质谱(FABMS,ESIMS)和氨基酸分析来评价。如下制备NMR光谱用的样品：将肽溶解于0.01M KPi缓冲液(pH＝4)中，其含有0.02M KCl，加入2,2-二甲基-2-硅烷-5-磺酸钠(DSS)至浓度1mM，作为化学位移内参。肽在90％1H2O/10％2H2O中浓度通常为4mM。加入微量NaN3作为防腐剂。
NMR光谱
a)约束距离的测定。高场NMR谱在500MHz和750MHz获得，500MHz使用约阿尼纳大学NMR中心的Bruker Avance500分光仪，750MHz使用乌德勒支分子生物学研究的Bijvoet中心Bruker Avance750分光仪。对于水峰抑制使用具有梯度的激发塑型。所有质子二维光谱用State-TPPI方法获得用于正交检测，具有2K×512复合数据点，分别为对于2D TOCSY，每个增量16次扫描和对于2DNOESY实验，每个增量64次扫描。TOCSY光谱的混合时间为80ms。NOESY实验的混合时间设置为100,200,350和400ms来测定NOE建立速度。350ms的混合时间提供足够的交叉峰强度而在2D-NOESY中不引入自旋扩散效应。相位-敏感(Phase-sensitive)的2D NOESY用于特定指认和估算质子-质子距离约束。在t1填充的数据是零，得到2K×2K实际数据点，在两个维度中均应用90°相位移动余弦平方-贝尔窗口函数。所有光谱用NMRPipe软件包处理，用NMRVIEW分析。
AII质子间距离通过测量NOESY谱上交叉峰强度获得。使用NMRVIEW软件包进行强度校准得到一组距离约束。NOE交叉峰根据他们的强度被分为三种距离类别。强的NOE产生较高的距离限制，中等NOE是值而弱NOE是较低距离限制设为顺式异构形式(Xcis)中肽分子的摩尔分数通过测量1D光谱中顺式和反式形式相同质子的共振对应的分辨良好的峰面积来得到。
b)温度系数。为研究对酰胺质子的溶剂保护值，酰胺质子温度系数(Δδ/ΔT)在283K到308K的温度范围内测量。暴露的NH通常地具有-6.0至-8.5p.p.b./K范围内的梯度，而氢键或受保护的NH显然具有-2.0至±1.4p.p.b.K-1的Δδ/ΔT值47。对在283K测量的酰胺质子共振的Δδ/ΔT和化学位移偏差(CSD)作图(图X)，适当校正随机的卷曲化学位移48，提供了与柔性线性肽的局部结构更好的相关性。虚线(Δδ/ΔT'＝-7.8(CSD)-4.4)代表蛋白暴露的和隔离型NHs之间的截断。虚线之上的梯度表示暴露的NH，而之下的表示隔离型NH。如图2中所看到的，除了Arg2，所有的NH骨架都在虚线之上，表示这些肽质子是有些暴露的。Arg2骨架NH最可能提示分子内氢键形成(见如下讨论)。Arg2的骨架NH的低Δδ/ΔT值已经在AII的环类似物中被发现，提示被溶剂屏蔽，但是这种效果的结构成因没有合理化。
c)扩散序NMR光谱。应用布鲁克微程序stebpgplsl9，在298K获得扩散序光谱(DOSY)。使用脉冲程序刺激回波，扩散采用双极性梯度脉冲，水抑制采用有梯度的3-9-19脉冲。对于每个FID，为二项水抑制以3s弛豫延迟和20s收集512瞬时。对于所有实验，在F2维度收集4096个数据点(20ppm)，在F1维度收集16-32个数据点(梯度强度)。最终数据大小为4096x1024。指数运算用在1Hz线宽(line broadening)的F2中。扩散时间(Δ)和梯度长度(δ)分别设为100ms和1ms，而梯度脉冲后的恢复延迟为200μs。两种类型的数据分析应用于原始实验数据。对自动的2D-处理，标准的2D DOSY处理草案在应用于XWTNNMR软件，F1(扩散系数)维度用对数尺度。对手工的曲线拟合，用不同梯度强度下测量的1D质子谱中所选的峰强度拟合，使用式Ι＝Ι0exp(-Dγ2g2δ2(Δ-δ/3))[→sqrt(-In(I/Io))＝sqrt(D*)g](AR Waldeck,PW Kuchel,AJ Lennon,和BE Chapman,NMR DiffusionMeasurements to Characterise Membrane Transport and Solute Binding。Prog.NMRSpectrosc.)，以得到表观扩散系数D*。在这个理论公式中，以下物理量代表：I，实际(测量的)峰强度；I0，梯度强度零点的峰强度；D，扩散系数；γ磁旋比(质子)；g,梯度强度；δ梯度长度；Δ,扩散时间。理论上，梯度长度和扩散时间也可以在扩散实验中增加，然而多数脉冲-方案修改梯度强度(g)。因D、γ、Δ和δ是常数，在Dγ2g2δ2(Δ-δ/3)中他们可以转化为新的常数，D*(D*＝cD,其中c＝γ2δ2(Δ-δ/3)，是一个常数)。对原始公式的数学重置和替换新的常数(D*)，推导出一个线性公式[sqrt(-ln(I/Io))＝sqrt(D*)g](见上)，其可应用于测定扩散系数。在这些图中，梯度强度表示为介于5％和95％之间的总梯度强度的线性变化增量(应用16或32的增量)。如公式显示，拟合线的斜率等于D*的平方根，因此D*可从斜率的值计算出来。相对于参照的实际分子量可以通过以下公式决定，log(D1/D2)＝1/3*log(MW2/MW1)，其中D1/D2＝D1*/D2*(AR Waldeck,PW Kuchel,AJLennon,和BE Chapman,NMR Diffusion Measurements to Characterise MembraneTransport和Solute Binding.Prog.NMR Spectrosc)。这个公式假定被比较的分子具有相同的整体形状和弛豫性质。
结构计算。结构计算使用ARIA设置和方案用CNS进行，如Bonvin等人中描述在。
构建和分析具有X-Pro-Phe(X＝任何氨基酸)序列基序的结构蛋白数据组。
来自蛋白数据库[ref](PDB)的序列一致性阈值<90％、分辨率和R-因数<0.3的蛋白结构数据组获得于PISCES服务器49。12376个蛋白结构的脯氨酰残基被检查(见材料与方法)。对每个脯氨酰残基，计算扭转角欧米伽(ω)。角度在-50·和+50·之间的键认为是顺式脯氨酰基键。对数据库进行进一步处理，以避免冗余(即只有他们的扭转角差别大于50°时，才保留出现在相同pdb的不同链中、但含有相同序列的残基)和缺失感兴趣脯氨酸的相邻残基。用C++写的自制脚本(Tsoulos I.,Tzakos A.G.,等人，准备中)用于：(i)为脯氨酸残基计算扭转角ω；(ii)构建具有X-Pro-Phe基序的残基的数据组(X代表任何氨基酸)；(iii)计算X-Pro-Phe基序(表1)中每个氨基酸顺式脯氨酸酰胺键发生率的统计；(iv)X-Pro-Phe序列基序(表2)的顺式情况结构可塑性的绘制。家族集簇按照方均方根偏差进行拟合。
肿瘤细胞的增殖试验。
增殖使用MTT试验评价。早期对数期细胞接种到微滴定板，并允许过夜生长。然后AII类似物加入到一系列稀释液中。新鲜的药物每24小时加入。根据生产商的方案，增殖在24小时间隔使用MTT测定法。IC50值计算为相对于未处理的对照和/或仅用药物载体处理的对照，引起增殖降低50％所需的制剂浓度。每个研究做至少两次和重复6次。
伤口愈合试验
AII类似物对细胞迁移的作用在伤口愈合试验中评价，其使用划伤方案进行。使用近汇合的细胞(试验在35mm的皿中进行)。细胞在低血清的培养基中生长过夜，然后按标准的实验方案用无菌的移液器尖划伤伤口。划伤后细胞立刻暴露在AII类似物的系列稀释液中。显微监测划伤细胞前沿之间的间隙。
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除非另有声明，与此处所述那些类似或相同的任何方法和材料可用于本发明的实施和测试。适合于这些用途的方法、仪器和材料描述在上面。此处索引的所有出版物全部并入此处作为参考为了描述和公开方法学、试剂和在出版物上报告的可能与本发明有关的工具。

Claims (24)

1.一种制备血管紧张素II受体选择性配体的方法，其包括步骤：
(i)选择受体的配体基序，其对顺式-反式异构化敏感；
(ii)比较配体与含有所述基序的数据库的序列，并确定该基序中或附近的取代对顺式或反式异构体形成的影响；
(iii)根据步骤(ii)中的比较产生配体的取代，从而在配体中偏向于顺式或反式异构体。
2.根据权利要求1的方法，其中基序包含脯氨酸。
3.根据权利要求2的方法，其中基序是X1-Pro-X2，其中X1和X2是相同或不同并可以是任何氨基酸。
4.根据权利要求3的方法，其中X2是Phe。
5.根据上述任意权利要求的方法，其中配体对AT2R是选择性的。
6.根据上述任意权利要求的方法，其中配体对AT1R是选择性的。
7.根据权利要求5的方法，其中配体对AT2R是选择性的，并在溶液中呈现增加的顺式异构化。
8.根据上述任意权利要求的方法，其中配体是血管紧张素I、II、III或IV的突变体或沙拉新。
9.根据权利要求5所述的方法，其中基序是His6-Pro7-Phe8。
10.根据权利要求9所述的方法，其中His6残基被Tyr替换，产生Tyr-Pro-Phe基序和AII的Tyr6类似物。
11.根据权利要求9所述的方法，其中4-取代的Phe残基中引入供电子或吸电子基团取代苯丙氨酸环对位的氢。
12.一种血管紧张素II受体的配体，其包含序列Tyr-Pro-Phe。
13.根据权利要求12所述的配体，其具有序列Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-Tyr-Pro-Phe。
14.一种血管紧张素II受体的配体，其具有4-取代的Phe残基，其中引入供电子或吸电子基团取代苯丙氨酸环对位的氢。
15.一种血管紧张素II受体的配体，其具有序列Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-Phe-Pro-Phe，其中Phe6是4位取代的。
16.一种血管紧张素II的突变体，与野生型的血管紧张素II相比，所述突变体中偏向于一种或以上顺式或反式异构体的形成。
17.根据权利要求1-11任一项所选择的配体，其用于肿瘤治疗。
18.根据权利要求12-16任一项的配体，其用于肿瘤治疗。
19.根据权利要求17或18所述的配体，其用作通过AT2R信号传导的胰腺癌细胞生长的负调节物，或用作通过AT2R信号传导的肺腺癌细胞生长的负调节物。
20.根据权利要求12-19任一项所述的配体，和AT1拮抗剂，同时或同时分开、或相继用于肿瘤治疗。
21.根据权利要求1-11任一项所述的配体，或根据权利要求12-16任一项所述的配体，用于脊髓损伤治疗。
22.根据权利要求17-21任一项所述的配体，其为[Y]6-AII配体。
23.一种用于治疗有肿瘤治疗需要的患者中的肿瘤的方法，包含给所述患者施用药学有效量的根据权利要求17-19、21或22任一项所述的配体。
24.一种用于治疗有脊髓治疗需要的患者中的肿瘤的方法，包含给所述患者施用药学有效量的根据权利要求20所述的配体。
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