JP2015508895A - インピーダンスに基づく細菌検出システム - Google Patents

Abstract

【課題】液体サンプル中の微生物の有無を判定するための方法および装置を提供する。【解決手段】電極が内部に配置された容器が、試験する液体量を受ける。第２の電極も設けられ、両電極が液体サンプルに物理的に接触する。時間変動信号が一方の電極に印加され、他方の電極は位相敏感信号検出器に連結される。位相敏感信号検出器は、位相外れ信号振幅がゼロである周波数を判定する。このゼロ交差周波数をベースラインとして使用し、ゼロ交差周波数の変化は微生物増殖を示す。【選択図】図１０

Description

本発明は、臨床サンプルの微生物検出の分野に関する。本発明は特に、生体サンプル中の細菌の有無をより高速に検出することに関する。

関連出願の相互参照
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる、２０１２年２月１５日出願の米国特許仮出願第６１／５９９，１００号の出願日の利益を主張する。

生体サンプル中の微生物（たとえば細菌）の有無を検出することは、医療において必要な側面である。一般的に、このような検出は、検出されるのに十分な微生物をもたらすように微生物が培養されることを必要とする。試験サンプル中の微生物の量が、微生物が存在する場合に微生物が確実に検出されるのに十分である場合にのみ、サンプル中の微生物の有無を判定することができるため、サンプル中の微生物を増殖させるための広い培地のアレイがある。

たとえば、臨床血液サンプル中の細菌は、一般的に、約１０ｍｌの全血を、約３０ｍｌの増殖培地を含む培養ボトルに接種して細菌の繁殖を支えることにより検出される。サンプルは、自動システム内のボトルにおいて３５℃でインキュベートされる。サンプルは、細胞代謝または細胞増殖の副産物についてモニタリングされて、サンプル中の細菌の有無を判定する。一例では、細菌代謝産物（二酸化炭素等）が、培養ボトル内に配置された化学センサによりモニタリングされる。

総容積８０ｍｌの培養ボトル内の増殖細菌集団の存在は、微生物の数が約５×ｌ０^９ＣＦＵ（コロニー形成単位）まで上昇したときに一般的に検出される。１０ｍｌの血液サンプル中の１または２の生物からこのような大きな数まで細菌集団を増殖させるために、多くの細菌倍増事象が必要とされることが明らかである。より高速な細菌検出を行う１つの解決法は、所要の増殖培地と合わせた１０ｍｌのサンプル液体（一般的に、３０ｍｌ容積の増殖培地を１０ｍｌの血液と組み合わせる）を、閉鎖された小チャンバに含まれる、多数のより小さな部分サンプルに分割することである。これは、参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｅｒｎｄｔの特許文献１および特許文献２に記載されている。参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｎｔｈｏｎｙ他の特許文献３は、互いから閉鎖されず、共同のヘッドスペース容積を有する小チャンバのアレイ（２５０μｌウェルの９６ウェルアレイ）を記載している。Ｍｏｎｔｈｏｎｙ他は、サンプルウェルを分析してサンプルウェル内の細菌の有無を検出するために、比色分析、蛍光分析、放射分析、比濁分析、および赤外線分析の使用を考慮する。Ｍｏｎｔｈｏｎｙ他は、より小さいサンプル量を使用して、検出時間（ＴＴＤ）の短縮が達成されると説明している。

元の１０ｍｌの血液サンプルを３０ｍｌの増殖培地と共に分割することは、より高速な細菌検出の達成を期待させるものであるが、１または複数のチャンバ内の微生物の有無を検出するための実用的な多チャンバサンプルコンテナの設計が課題となる。たとえば、細菌増殖が小チャンバの１つまたは２つのみで検出された場合、ＩＤ（たとえばＭａｌｄｉ飛行時間型）および抗生物質感受性試験（ＡＳＴ）等の下流分析について増殖陽性が検出されたこれらのチャンバからサンプル液体を除去するために、これらのチャンバを識別して、チャンバに接近する必要がある。小チャンバのアレイの別々のチャンバからサンプルを正確に除去することは、さらなる課題を意味する。

微生物増殖を検出するための小容積チャンバのアレイの実施に対する別の課題は、配置される検出器である。個々のチャンバの光学呼掛けは、測定が適切なチャンバに確実に関連するようにするため、正確な測定を必要とする。ウェルからウェルへの信号のクロストークも回避されなければならない。各ウェルについて個々の化学センサを配置することは、費用が掛かり、実施が困難であり得る。

誘電体のインピーダンス測定が、化学センサの使用に代わるものとして評価されている。しかしながら、商業展開に対する障害として、温度変動に対するインピーダンスの感度がある。血液培養ボトルの温度を＋／−０．０５°Ｃよりも良好に維持することは、臨床細菌検出環境については実際的でない。

参照により本明細書に組み込まれる、非特許文献１では、１００μｌ容積のマイクロ流体チャンバが、細菌の存在に対する反応を感知するためのチャンバとして使用された。非特許文献１は、サンプルを含む長くて非常に薄いチャネル状チャンバに、両端部に位置する非常に小さい電極を設けることにより、単純な誘電体の導電性測定（dielectric conductivity measurement）に対して感知反応を向上させることができると説明した。最大１００ＭＨｚの高周波数を使用することにより、液体サンプルの容量寄与が測定されたが、この容量寄与は、Ｓｅｎｇｕｐｔａ他によれば、チャンバ内の細菌の存在および／または増殖によって生じるサンプルの容量の変化に対する感度がより高い。

参照により本明細書に組み込まれる、非特許文献２および非特許文献３にさらに記載されているように、温度変動が、誘電体の導電性測定を用いてサンプル中の細菌の存在を分析するためにマイクロ流体環境を使用する、Ｓｅｎｇｕｐｔａ他の装置および方法の使用に対する最も重要な課題として説明される。

Ｓｅｎｇｕｐｔａ他の装置および方法に対するさらなる制限は、１時間ほどの後に新しいマイクロ流体チャンバを充填し（または、マイクロ流体チャンバ内の液体サンプルを、培養ボトルからの新しい液体サンプルで置き換え）、新しいサンプルを用いて次の測定を行う必要があることである。この手法は、前にサンプリングした各部分が廃棄されるため、１０時間以内で約１ｍｌのサンプル液体を消費する。より良好な信号対雑音比を達成するためにサンプリングをより頻繁に行ってもよいが、増殖の遅い微生物については、経時的なサンプル消費の量が重大な課題となり得る。

したがって、液体サンプル中の微生物の有無を検出するための誘電体測定の使用が商業的に実現可能である場合に、改良の必要がある。

米国特許第５，７７０，４４０号明細書 米国特許第５，８９１，７３９号明細書 米国特許第５，７１６，７９８号明細書

Ｓｅｎｇｕｐｔａ，Ｓ．他，"Ａ ｍａｃｒｏ−ｓｃａｌｅ ｍｕｌｔｉ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｒｅａｃｔａｎｃｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｔ ｌｏｗ ｂｉｏ−ｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，" ＬａｂＣｈｉｐ， Ｖｏｌ．６， ｐｐ．６８２−６９２（２００６） Ｓｅｎｇｕｐｔａ，Ｓ．他，"Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｆｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌ ｉｍｐｅｄａｎｃｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ａｔ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ，" Ｓｃｎｓ．＆Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎ．Ｆｏｏｄ Ｑｕａｌ., Ｖｏｌ．４， ｐｐ．１０８−１１８（２０１０）、 Ｐｕｔｔａｓｗａｍｙ，Ｓ．他，"Ｎｏｖｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｅａｒｌｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉａｂｌｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，" Ｊ．Ｃｌｉｎ．ＭｉｃｒｏＢｉｏ., Ｖｏｌ．４９（６）， ｐｐ．２２８６−２２８９（２０１１）

血液培養分析の好ましい実施形態において、一般的に４０ｍｌ（１０ｍｌの血液、３０ｍｌの増殖培地）のマクロ液体サンプル量を処理可能な微生物（たとえば細菌）検出装置および方法が、本明細書で開示される。前記装置および方法は、容量性インピーダンス成分の測定を容易にし、温度変動を受けず、ベースラインモニタリングおよびサンプル中の微生物の有無を迅速に分析する能力の向上のために、アレイの他のチャンバの誘電体測定と容易に比較できる別個のサンプル部分を誘電体測定するための、比較的簡単かつ低コストの使い捨てチャンバアレイを使用可能にする分析環境を提供する。

本明細書に記載の本発明の一実施形態は、インピーダンスに基づく細菌検出方法である。この方法では、微生物を含む疑いのある液体サンプルを含む容器が設けられる。前記容器は、前記サンプルが電極間に配置されるように位置決めされた電極を有するように構成される。前記液体サンプルは、前記２つの電極の少なくとも１つと物理的に接触する。前記容器自体は、１または複数のチャンバを有することができ、各チャンバが有する前記電極は、前記チャンバ内の任意のサンプルが前記２つの電極間に配置されるように位置決めされる。容器およびマルチチャンバプレート（たとえばマイクロタイタープレート）は当技術分野で周知であるため、本明細書では詳細には説明しない。

時間変動電気信号が、前記液体サンプルに接触する第１の電極に印加される。第２の電極が、位相敏感信号検出器に電気的に接続される。前記時間変動電気信号の周波数は、前記検出器により測定された位相外れ信号振幅が、選択された周波数で約ゼロになるように選択される。その位相外れ信号振幅は、前記位相敏感信号検出器を用いて経時的にモニタリングされる。前記信号振幅の増加が経時的に観察される場合、これが前記液体サンプル内の微生物増殖を示す。

別の実施形態では、前記インピーダンスに基づく細菌検出方法は、前記時間変動電気信号を、前記液体サンプルに接触する前記第１の電極に供給する。前記第２の電極は、前記位相敏感信号検出器に電気的に接続される。前記位相外れ信号振幅は、前記位相敏感信号検出器を用いて経時的にモニタリングされる。この方法では、前記検出器により測定された位相外れ信号振幅が約ゼロになるように、前記電気信号の周波数を調整することにより、前記位相外れ振幅がゼロである周波数が判定される。このステップが、所定の時間間隔で繰り返される。前記位相外れ信号振幅が見られる前記周波数が増加した場合、これが前記液体サンプル内の微生物増殖を示す。

本明細書に記載の前記方法の別の実施形態では、電圧制御発振器により発生された前記時間変動電気信号が、前記第１の電極に印加される。前記第２の電極が、再び位相敏感信号検出器に電気的に接続される。本実施形態では、前記検出器の統合された位相外れ出力信号が、前記電圧制御発振器の周波数制御入力として供給され、前記発振器が、前記検出器により測定された前記位相外れ信号振幅がゼロである周波数に調整される。前記調整された周波数の経時的な増加は、前記液体サンプル内の微生物増殖を示す。

本発明の他の実施形態は、インピーダンスに基づく細菌検出のための装置である。前記装置は、単一の容器または前述したマルチウェルプレートを受ける収容部を有する。前記単一の容器または前記マルチウェルプレートの１もしくは複数のチャンバの液体サンプルは、微生物を含む疑いがある。前記容器または前記マルチウェルプレートの１もしくは複数のチャンバのいずれかが、前記サンプルが前記第１の電極および第２の電極間でこれらに接触して配置されるように位置決めされた、２つの電極を有する。

前記装置は、前記液体サンプルを通して前記第２の電極へ送信される時間変動電気信号を前記第１の電極に供給する信号源を有する。前記装置は、前記容器の前記第２の電極に接続された位相敏感信号検出器を有する。前記信号検出器の出力は、前記液体サンプルのバルク容量の変化が生じた場合に、その変化を示す。

本実施形態では、前記容器がマルチウェルプレートである場合、少なくとも複数の前記ウェルが、微生物を含む疑いのある液体サンプルを受ける。本実施形態では、デマルチプレクサが、発生した前記時間変動電気信号をウェルアレイ内の前記複数のウェルの前記第１の電極に与える。前記装置はまた、前記複数のウェルを通して送信された前記時間変動信号を受信するためのマルチプレクサを有する。前記マルチプレクサは、前記信号を前記位相敏感信号検出器に送信する。

前記装置の別の実施形態では、前記位相敏感信号検出器が、前記液体サンプルを通して送信された前記信号の位相外れ成分を測定する内部信号発生器を有するロックイン増幅器である。前記内部信号発生器は、前記時間変動電気信号を前記第１の電極に供給する信号源である。本実施形態では、前記装置が、前記位相外れ信号の振幅が値ゼロに達するのに必要な、発生した内部信号の周波数の変化（この変化が微生物増殖を示す）を検出するように構成される。

別の実施形態では、前記時間変動電気信号が、電圧制御発振器により前記第１の電極に対して発生される。本実施形態では、前記装置が、前記位相敏感信号検出器の出力に連結された積分器を有する。前記積分器の出力は、前記電圧制御発振器の入力に連結される。前記検出器により測定された位相外れ信号振幅がゼロである周波数に、前記発振器が調整される。前記信号検出器からの出力は、調整された周波数の変化を示す。調整された周波数の変化は、微生物増殖を示す。

一実施形態では、１０ｍｌの全血サンプルが３０ｍｌのＢＤ ＢＡＣＴＥＣ（登録商標）増殖培地と混合され、９６チャンバのアレイに分配される。各チャンバは０．４２ｍｌの総容積を有する。前記１０ｍｌのサンプルサイズが選択される。これは、患者の血流中に微生物が存在する場合に、これらの微生物の一部が前記１０ｍｌサンプル中に存在することを確実にするための、業界で受け入れられる標準サンプルサイズであるからである。本明細書に記載の微生物の有無について前記サンプルを分析するのに十分なサンプル量を確保する以外に、本発明がサンプルサイズまたは培地量に限定されないことを、当業者は理解するだろう。

サンプルを含む前記チャンバに対してＲＦ誘電体のインピーダンス測定を行うことにより、細菌の存在が各チャンバ（またはウェルまたはマイクロウェル、これらの用語は本明細書で交換可能に使用される）でモニタリングされる。前記電極構成は、一般的に、前記チャンバの底部として機能する下部電極と、前記アレイ上に配置され、前記チャンバの上部へいくらか延びる上部電極とである。前記サンプル液体のバルク容量の変化によって、測定された位相外れ信号成分が変化するように、測定の前記周波数、前記電極の直径、および前記電極間の距離が最適化される。前記位相外れ信号成分は、所与の周波数における前記測定信号とは異なる位相を有する信号である。

導電性成分は異なるガス等の代謝細菌産物に関連するが、容量性成分はウェル内の細菌の存在を反映する。存在が検出されるため、すべてのウェルが共同のヘッドスペースを有することができ、これにより、陽性のチャンバに容易に接近できる、非常に簡単かつ低コストの使い捨て品を設計することが可能になる。

本明細書に記載の方法および装置によれば、（ｉ）小容積チャンバの使用によって、（ｉｉ）チャンバのアレイの隣接物を比較することによって、および（ｉｉｉ）容量性検出機構が導電性検出機構よりもはるかに高感度であることによって、より高速の細菌検出を達成することができる。

以下の図１から図１８は、本発明の実施形態を示すために提示される。
本発明の一実施形態による使い捨てチャンバアレイのベースを示す図である。 取り付けた蓋を有する、図１のチャンバアレイのベースを示す図である。 ４０ｍｌのサンプル液体で充填された、本発明の一実施形態によるチャンバアレイの使い捨てベースを示す図である。 充填され組み立てられた使い捨てチャンバアレイを示す図である。 本発明の一実施形態による、アレイのチャンバのためのインピーダンス測定回路の概略図である。 使い捨てアレイの個々のチャンバに呼び掛けるための機構を示す図である。 サンプル容量の２つの値についての、計算された位相外れ信号成分対円測定周波数を表す２つのプロット図である。 線形Ｙスケーリングで示す、円周波数範囲１０^５〜１０^６ｌ／ｓ、すなわち、ゼロ交差が見られる範囲内のみの、図７と同一の２つのプロット図である。 アレイ内の隣接物を比較することにより、かつ容量性インピーダンス成分を測定することにより、向上したセンサ解像度と組み合わせて小容積チャンバを使用することから生じる、検出時間の予想される短縮を示す図である。 液体サンプルの誘電体の容量を測定して、液体サンプル中の微生物の有無を判定するための装置の一実施形態を示す図である。 本明細書に記載の９６ウェルプレートの面積を、標準９６ウェル試験プレートの面積と比較する図である。 位相外れ信号と周波数との関係を示す図である。 周波数と位相外れ信号（信号の仮想部と呼ばれる）との関係をさらに示す実際のデータを示す図である。 周波数と位相外れ信号（信号の仮想部と呼ばれる）との関係をさらに示す実際のデータを示す図である。 図１０に示す実験設定においてＳｔａｎｆｏｒｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ＳＲ８５０ １００ｋＨｚ ＤＳＰロックイン増幅器を使用して測定された、同一の容積および構成の異なるウェルについての一連の記録されたスペクトルを示す図である。 図１０に示す実験設定においてＳｔａｎｆｏｒｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ＳＲ８５０ １００ｋＨｚ ＤＳＰロックイン増幅器を使用して測定された、同一の容積および構成の異なるウェルについての一連の記録されたスペクトルを示す図である。 図１０に示す実験設定においてＳｔａｎｆｏｒｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ＳＲ８５０ １００ｋＨｚ ＤＳＰロックイン増幅器を使用して測定された、同一の容積および構成の異なるウェルについての一連の記録されたスペクトルを示す図である。 同一の液体サンプルで充填された大型ＢＡＣＴＥＣ（登録商標）ボトルを使用して、小ウェルについて記録されたスペクトル、およびＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤのＢＡＣＴＥＣ（登録商標）血液培養機器に平行に記録された成長曲線に基づいて、Ｅ．ｃｏｌｉを添加した培地についての時間／周波数の関係を示す図である。 Ｅ．ｃｏｌｉを添加したＢＡＣＴＥＣ（登録商標）培地のバルク容量の増加により、位相外れ信号成分が正の値になるのにかかる時間を示す図である。右の曲線は、同一の液体サンプルで充填された大型ＢＡＣＴＥＣ（登録商標）ボトルを使用して、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤのＢＡＣＴＥＣ（登録商標）血液培養機器に平行に記録された成長曲線を示す。 測定された位相外れ信号のスケールが拡大された場合に、早期の増殖が検出されることを示す図である。 液体サンプルの誘電体の容量を測定して液体サンプル中の微生物の有無を判定するための装置の代替の実施形態を示し、信号発生器の測定周波数が、ゼロ交差周波数に自動的に調整され維持される図である。

本明細書に記載の本発明の実施例は、血液サンプル中の細菌の有無を検出する状況におけるものである。特に指定のない限り、生体サンプルは、３０ｍｌのＢＤ ＢＡＣＴＥＣ（登録商標）増殖培地と混合された１０ｍｌの全血サンプルである。組み合わされたサンプルおよび培地は、それぞれ０．４２ｍｌ容積の９６チャンバのアレイに分配される。多くの例がこのように説明されるが、当業者は、開示された方法および装置を使用して、種々の異なる増殖培地と組み合わせた種々の異なるサンプル（組織サンプル、喀痰サンプル、尿サンプル等）を試験してもよいことを理解するだろう。記載されたチャンバ容積およびチャンバアレイは、組み合わせた血液／培地サンプルの量に関して有利であるが、当業者は、特定の環境についてチャンバ容積およびアレイサイズを選択することができる。

細菌の有無が、ＲＦ誘電体のインピーダンス測定を使用して判定される。電極構成および周波数は、本明細書で記載されるように構成されて、サンプル液体のバルク容量の変化によって、測定された位相外れ信号成分が確実に変化するようにする。

導電性成分は、サンプル中の異なるガス（たとえばＣ０_２）等の代謝細菌副産物の有無に関連する測定値であるが、容量性成分は、ウェル内の細菌の絶対的な有無をより直接反映する。細菌（細菌の代謝副産物ではない）の存在が検出されるため、アレイ内のすべてのウェルが共通または共同のヘッドスペースを共有することができる。これにより、ウェルアレイの設計制約（すなわち、互いから気密に分離されたウェルまたはチャンバ）が軽減され、細菌について陽性であると判定されたサンプルを含むウェルに容易に接近できる、非常に簡単かつ低コストの使い捨てウェルアレイが可能になる。

図を参照すると、図１はアレイ１００の破断側面図である。ウェル１２０のベース１１０は、接点１４０と電気通信する電極１３０を有する。ウェル１２０の容積は０．５ｍｌ、高さは２６ｍｍ、直径は５ｍｍである。ハウジング１５０はプラスチック製であり、組立てが低コストになる。

図２は、取り付けた蓋１７０を有する図１のウェル１２０のベース１１０を示す。蓋１７０は、各ウェルの上部電極として機能する下層の金属化層１６０を有する。上部電極は、上部電極と下部電極との距離が２１．５ｍｍになるように各ウェル内へ延びる。本実施形態では、以下で説明するように、２１．５ｍｍの距離は、サンプル中の細菌の存在に起因するインピーダンスの変化を検出するのに有利である。

図３は、チャンバがサンプル液体１８０で充填された、図１のウェルアレイを示す。側面図で示されているが、アレイ１００は、９６（０．５ｍｌ）ウェルのうち、４０ｍｌのサンプル液体を受け入れる９６ウェルアレイ（１２×８）である。

図４は、チャンバがサンプル液体１８０で充填された図１のウェルアレイを示す。細菌の存在についてモニタリングされる有効使い捨て容積は、電極間の空間であり、図示した実施形態では０．４１７ｍｌにすぎない。ウェルアレイの有効ヘッドスペース容積は、１５．３ｍｌである。共同のヘッドスペースにより、ガス／液体の比が、最大３６の陽性チャンバについてのＢＡＣＴＥＣ（登録商標）の比以上となる。これは、全血１０ｍｌ当たり最大３６ＣＦＵの細菌負荷について、最適な増殖条件があることを意味する。全血１０ｍｌ当たり３６ＣＦＵより高い細菌負荷については、増殖条件は最適なものよりもやや低いが、このような場合はまれである。サンプル量において少なくとも１個または２個の微生物を患者から得るためには、１０ｍｌの血液サンプルが推奨されることに留意されたい。

図５は、本発明の一実施形態による、アレイ１００のウェル１２０のためのインピーダンス測定回路２００の概略を示す。本実施形態では、信号源２１０が上部電極１２０に印加され、ベクトル電圧計２２０を使用してサンプル１８０のインピーダンスおよび基準電圧２３０に対するインピーダンスの変化を検出する。信号がウェル毎に確実に印加され読み出されるように、デマルチプレクサ２４０およびマルチプレクサ２５０が配置される。

図６は、使い捨てアレイの個々のチャンバに呼び掛けるための機構を示す。８チャネルデマルチプレクサ２４０を使用して上部電極に対処するために、かつ１２チャネルマルチプレクサ２５０を使用して下部電極で信号ピックアップを行うために、９６チャンバのすべてに個々に呼び掛けることができる。

図７は、サンプル容量の２つの値についての、計算された位相外れ信号成分対円測定周波数（ω＝２πｆ）を表す２つのプロットを示す。これらの測定は単一のウェルについてのものである。実線２６０は、細菌負荷により０．６６ｐＦの容量を有するウェルについてのものである。破線２７０は、実線の信号が測定されたウェルの２倍の容量を有するウェルについてのものである。低周波数では、異なる細菌誘発容量にもかかわらず、２つのウェルの位相外れ信号に差がないことに注目されたい。しかしながら、高周波数では、異なる細菌濃度について異なる信号が見られる。

図８は、線形Ｙスケーリングで示す、バルク容量依存ゼロ交差周波数が見られる円周波数範囲１０^５〜１０^６ｌ／ｓ内のみの、図７と同一の２つのプロット図である。バルク懸濁液中の細菌の数の増加により、バルク容量が増加すると予想されるため、細菌増殖は、初期のゼロ交差周波数をより高い値に変化させることが予想される。また、本明細書に記載の実施形態によれば、初期のゼロ交差周波数を判定し、測定周波数をこの値に調整し、経時的な位相外れ信号振幅をモニタリングすることも可能である。懸濁液中の細菌の数が増加すると、位相外れ信号振幅が増加する。言い換えると、細菌の増殖集団の存在を、位相外れ信号振幅を経時的にモニタリングすることにより検出することができる。

図９は、アレイ内の隣接物を比較することにより、かつ容量性インピーダンス成分を測定することにより、向上したセンサ解像度と組み合わせて小容積ウェルを使用することから生じる検出時間の予想される短縮を示す図である。すなわち、図９は、すべての感度のセンサについて、容積の減少が検出時間の減少をもたらすことを示す。標準ＢＡＣＴＥＣ（登録商標）ボトル（８×１０^４μｌ）の容積から、本明細書の実施形態に記載のウェルの容積（５００μｌ）へ容積を小さくすることにより、検出時間が大幅に減少する。

本明細書に記載の方法および装置によれば、（ｉ）小容積チャンバ（たとえば０．５ｍｌ以下）の使用により、（ｉｉ）１つのウェルの測定値を、隣接するウェルからリアルタイムで得られた測定値と比較できることにより、および（ｉｉｉ）周波数依存容量性検出機構が導電性検出機構よりもはるかに高感度であることによって、より高速の細菌検出が達成される。

前述したように、本発明の方法および装置を、サンプルおよび増殖培地の広いアレイと共に使用することができる。試験環境をサンプリング環境に合わせて、サンプル量（培地と組み合わせた）に対して好ましい数のウェルを設けることができる。培地が単に弱導電性であると、バルク容量の変化として測定される、細菌の存在によるインピーダンスの変化を測定しやすくなるため有利である。マクロウェルアレイは、サンプルの容量変化を測定するために先行技術に配置されたマイクロ流体チャンバよりも作業しやすく、１回の充填しか必要とせず、使い捨てで、全１０ｍｌの血液サンプルを受け入れ、モニタリングすることができる。また、細菌は、本明細書に記載のマクロウェルで増殖し、十分なヘッドスペース容積のない、囲まれたマイクロ流体環境では増殖が遅いか、または増殖しない。

さらに、マイクロウェルの開放アレイは、共同のヘッドスペースにより、増殖プロセス全体の間に、好気性微生物種の最適な増殖のための十分な量の酸素を提供する。ガス状の代謝産物はモニタリングされないため、密閉チャンバは必要ない。インピーダンス測定のリアルタイムのウェル毎の比較を可能にするウェルのアレイを使用することによって、より実用的な感知解像度が達成される。本発明は、化学センサの使用を必要としないため有利である。開放アレイは安価で使い捨てであるだけでなく、血液サンプルの分配および抽出、ならびに、同一の機器での下流のＩＤ／ＡＳＴ手順のための、陽性チャンバから他のウェルまたは同様の設計の第２の使い捨て品へのサンプルの移送等の、ロボットによる自動化と共に使用するのにも適している。

図１０は、本発明の一実施形態による装置を示すより詳細な図である。内部信号発生器２１０を含む共通のロックイン増幅器を使用して、誘電体のインピーダンス測定チャンバ２２０の１つの電極へ正弦波ＲＦ信号を供給する。チャンバの第２の電極は、ロックイン増幅器の信号入力２３５に接続される。

当業者に公知であるように、２つの電極に直接接触するチャンバ内のサンプル液体を、図１０の破線のボックス２２５に示す電気ネットワークにより説明することができる。ここで、Ｃｉは金属電極と液体との間のインタフェース容量を示し、Ｒｉは金属電極と液体との間のインタフェース抵抗を示し、Ｒｂは液体のバルク抵抗であり、Ｃｂはバルク容量である。

ロックイン増幅器の内部信号発生器２１０は一般的な内部抵抗５０Ωを有し、ロックイン増幅器入力段２３５は、一般的な容量１５ｐＦおよび一般的な入力抵抗１０ΜΩを有すると想定される。

本発明によれば、図１０に示すソースマッチングレジスタＲｓ（２１５）、および同様に図１０に示す測定負荷レジスタＲｍ（２１６）を選択して、所与の誘電体の測定チャンバおよび液体について、測定信号の位相外れ成分の周波数スペクトルが、（ｉ）Ｃｂの値に依存し、かつ（ｉｉ）１００ｋＨｚ未満の都合のよい低周波数で位置決めされるゼロ交差特徴を示すことにより、標準ロックイン増幅器を使用できるようにする。添付図面に記録されたデータは、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ＳＲ８５０ １００ｋＨｚ ＤＳＰロックイン増幅器により取得されたものである。Ｒｓ＝５００ΩおよびＲｍ＝５００Ωが、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤのＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓのＳｔａｎｄａｒｄ Ａｅｒｏｂｉｃ／Ｆ等の一般的な血液培養増殖培地について、３０〜１００ｋＨｚの範囲内でゼロ交差周波数を発生させることがわかっている。図１０による装置では、ロックイン増幅器２３５を用いて測定された位相外れ信号振幅が、位相外れインピーダンス値に反比例する。言い換えると、位相外れインピーダンス値は、本明細書に記載された方法で測定された位相外れ信号振幅のゼロ交差周波数で最大となる。図１０に示す装置は一例にすぎないことを理解されたい。当業者は、本明細書に記載の方法および装置が、図５の装置に示されるような適切な信号発生器および適切なベクトル電圧計を使用して実施できることを理解するだろう。

インピーダンス測定チャンバの寸法を変化させること、または増殖培地を別の液体サンプルで置き換えることにより、ＲｓおよびＲｍの他の最適値が得られることに注目されたい。

図１１は、本明細書に記載の９６ウェルプレート４１０の面積を、標準９６ウェル試験プレート４００の面積と比較する。本明細書に記載の試験ウェルプレートは、標準９６ウェル試験プレートと比較して略小さい面積を有する。

図１０の文脈で説明したように、本明細書に記載の方法は、バルク容量と、測定信号の位相外れ成分の周波数スペクトルとの関係を利用する。計算され、実際に測定された周波数スペクトル間の比較を良好にするために、図１２は、図７の計算されたスペクトルを線形スケーリングで示す。再び、低い円周波数で、２つの異なる容量を有するサンプルのスペクトルは実質的に同一である。

図１３Ａおよび図１３Ｂのプロットは、細菌のないＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＢＡＣＴＥＣ（登録商標） Ｓｔａｎｄａｒｄ Ａｅｒｏｂｉｃ／Ｆ増殖培地を使用して実際に記録されたデータを示す。図１３Ａからわかるように、記録されたスペクトルは、図１２に示す計算されたスペクトルと非常に類似して見える。この場合、ゼロ交差特徴が６０ｋＨｚ付近で見られる。図１３Ｂに示すプロットは、図８と比較すると最もよく理解される。細菌が実際のサンプルにないため、１つのゼロ交差周波数のみが図１３Ｂに見られる。図１４Ａ〜図１４Ｃに示すスクリーン画像は、ゼロ交差特徴を有する非常に類似した周波数スペクトルが、呼び掛けられたすべてのウェルについて見られることを示す。各ウェルが同量の増殖培地で充填された場合でも、各ウェルが異なるゼロ交差周波数を示すことに注目されたい。しかしながら、これは、自動化された機器が各ウェルについてのゼロ交差周波数を判定し、考えられる細菌増殖の判定がこれらの周波数で行われるため、問題を生じさせることはない。

前述したように、サンプル中で増殖する細菌の濃度が、サンプルのバルク容量に影響する（他の要因はすべて同一である）。

図１５は、所与のサンプルについて、細菌濃度の変化によって、位相外れ信号がゼロである周波数が変化することを示す。したがって、当業者は、位相外れ信号のこのゼロ交差特徴の周波数をモニタリングすることにより、細菌増殖を検出できることを理解するだろう。より高い周波数への周波数の変化は、細菌増殖に起因する細菌濃度の変化である。図１５の左のプロットは、培養後約３．５時間における、このようなより高い周波数への変化を示す。言い換えると、増殖する細菌集団の存在が、３．５時間後に検出された。図１５の右のプロットは、同一のサンプル液体を含むＢＡＣＴＥＣ（登録商標）ボトルについてＢＡＣＴＥＣ（登録商標）機器で測定された成長曲線である。この場合、細菌の存在が９．３３時間で検出された。

図１５のように１０分毎にゼロ交差周波数の考えられる変化を判定する代わりに、初期のゼロ交差周波数を１回のみ判定し、この一定の周波数で設定を操作し、位相外れ信号振幅の時間的経過をモニタリングすることができる。ドリフト効果がなければ、細菌増殖は起こらず、振幅はゼロのままとなる。細菌増殖により、バルク容量の増加の結果として、正の値への信号振幅の変化が生じる。

実用的な実験設定において、経時的な信号振幅のドリフトがあり得る。ＢＡＣＴＥＣ（登録商標） Ｓｔａｎｄａｒｄ Ａｅｒｏｂｉｃ／Ｆ増殖培地について、負の振幅値へのドリフトが見られる。これは図１６に示され、ここでは周波数が初期のゼロ交差値で固定された後、位相外れ信号振幅が経時的に記録された。図示のように、信号振幅はインキュベーション後に負の値へ移動しているが、３時間後に急に正の値になる。これは、増殖する細菌集団の存在が３時間後に検出されたことを意味する。比較のために図１６の右に示すＢＡＣＴＥＣ（登録商標）成長曲線は、９．２５時間後に細菌増殖の存在を明らかにする。

図１６の左の「成長曲線」は、非常に急な増加を示す。図１７は、図１６に示す曲線の完全なデータセットを示す。この曲線は、約９時間後、すなわちＢＡＣＴＥＣ（登録商標）機器の培養ボトルが陽性になったときに、さらなる急な増加を示す。出願人は、特定の理論にとらわれることを望まないが、これが培養ボトルのよりロバストな化学的変化に対する化学センサ応答を示すと考える。バルク容量に関連するインピーダンス手法は、はるかに高感度である。図１７の右の成長曲線は、ｘズーミングではなく、異なる程度の「ｙズーミング」を用いてさえ、１つの曲線のみが２時間以内に増殖を表すことを示す。結果として、細菌増殖は、一般的な化学センサがそれを検出できるよりもかなり前に、確実に生じ得る。

図１８は、液体サンプルの誘電体の容量を測定して、液体サンプル中の微生物の有無を判定するための装置の代替の実施形態を示す。これは図１０で説明したが、図１８の装置は、測定周波数を細菌依存ゼロ交差周波数に自動調整する。位相敏感信号検出器の位相外れ信号出力が、電子の積分器の入力に接続される。積分器の出力が、図１０の２１０で示す装置等において信号発生器として作用する電圧制御発振器の周波数制御入力に接続される。再び、Ｃｉは金属電極と液体との間のインタフェース容量を示し、Ｒｉは金属電極と液体との間のインタフェース抵抗を示し、Ｒｂは液体のバルク抵抗であり、Ｃｂはバルク容量である。

本実施形態では、正弦波電気信号が電圧制御発振器（ＶＯＣ）により発生され、電圧制御発振器（ＶＯＣ）がサンプルに接触する電極４６０に電気的に接続される。同様にサンプルに接触する第２の電極は、位相敏感信号検出器に電気的に接続される。位相敏感信号検出器の位相外れ出力信号は、積分器に連結される。積分器の出力は、ＶＯＣの周波数制御入力に連結される。これにより、位相敏感信号検出器により測定された位相外れ信号振幅がゼロになるまで、ＶＯＣの周波数が調整される。経時的に、調整された周波数の増加は、サンプル内の微生物の増殖を示す。

動作時に、積分器の出力圧力は、電圧制御発振器の周波数に影響する。これは、たとえば図１３Ａおよび図１３Ｂを参照して説明することができる。この例で、始動周波数が６０ｋＨｚ未満である場合、位相外れ信号振幅は正である。これにより、積分器の出力で正の出力電圧が生じるため、電圧制御発振器の周波数が増加する。ゼロ交差周波数に達するまで、周波数の増加が続く。この時点で、位相外れ振幅がゼロになり、さらなる積分は行われず、この例で６０．７２３ｋＨｚである、ゼロ交差周波数での電圧制御発振器の周波数とする。初期の周波数が高すぎると、実際のゼロ交差周波数が、高すぎる周波数から自動的に接近する。ゼロ交差周波数を経時的に記録し、増加を探すことによって、細菌の存在が検出され得る。

図１８による装置の利点は、ゼロ交差周波数を非常に正確に判定できることである。位相敏感信号検出器の出力で「ゼロ信号」が発生することにより、信号発生器の振幅または位相敏感信号検出器の内部利得のドリフトは、システム出力情報を表す自動調整されたゼロ交差周波数に何の影響も与えない。

本明細書において本発明を特定の実施形態を参照して説明したが、これらの実施形態は本発明の原理および適用の例示にすぎないことを理解されたい。したがって、添付の特許請求の範囲により定義された本発明の精神および範囲から逸脱することなく、例示的な実施形態に多くの修正を行ってもよく、他の配置を工夫してもよいことを理解されたい。

Claims (27)

1. 第１の電極および第２の電極間でこれらに接触して配置される、微生物を含む疑いのある液体サンプルを含む容器を設けるステップと、
   前記液体サンプルに接触する前記第１の電極に時間変動電気信号を供給するステップであって、前記第２の電極が位相敏感信号検出器に電気的に接続されるステップと、
   前記検出器により測定された位相外れ信号振幅が、選択された周波数でゼロになるように、前記電気信号の周波数を選択するステップと、
   前記位相外れ信号振幅を、前記位相敏感信号検出器を用いて経時的にモニタリングするステップであって、前記信号振幅の経時的な増加が前記液体サンプル内の微生物増殖を示すステップとを含むことを特徴とするインピーダンスに基づく細菌検出方法。
2. インピーダンスに基づく細菌検出装置の少なくとも１つの容器は、容器のアレイに配置された第１の電極および第２の電極間でこれらに接触して配置される、少なくとも複数が微生物を含む疑いのある液体サンプルを含む容器のアレイであり、
   発生した時間変動電気信号を、容器の前記アレイ内の前記複数の容器の前記第１の電極に供給するステップと、
   前記複数の容器を通して送信される前記時間変動信号を受信するステップと、
   前記信号を前記位相敏感信号検出器に送信するステップとをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のインピーダンスに基づく細菌検出方法。
3. 前記サンプルの量は約４０ｍｌであることを特徴とする請求項１に記載のインピーダンスに基づく細菌検出方法。
4. 前記サンプルは、微生物が前記サンプル中に存在する場合に増殖する増殖培地と組み合わされることを特徴とする請求項１に記載のインピーダンスに基づく細菌検出方法。
5. 前記サンプルは、約３０ｍｌの増殖培地と組み合わされた約１０ｍｌの血液であることを特徴とする請求項４に記載のインピーダンスに基づく細菌検出方法。
6. 容器の前記アレイは共通のヘッドスペースを共有することを特徴とする請求項２に記載のインピーダンスに基づく細菌検出方法。
7. 前記下部電極は前記容器の底部を形成し、前記上部電極は前記容器内へ延びて前記サンプルに接触することを特徴とする請求項１に記載のインピーダンスに基づく細菌検出方法。
8. 第１の電極および第２の電極間でこれらに接触して配置される、微生物を含む疑いのある液体サンプルを含む少なくとも１つの容器を有するサンプルコンテナを設けるステップと、
   前記液体サンプルに接触する前記第１の電極に時間変動電気信号を供給するステップであって、前記第２の電極が位相敏感信号検出器に電気的に接続されるステップと、
   位相外れ信号振幅を、前記位相敏感信号検出器を用いて経時的にモニタリングするステップと、
   前記検出器により測定された位相外れ信号振幅がゼロになるように前記電気信号の周波数を調整することにより、前記位相外れ振幅がゼロである周波数を判定するステップと、
   前記判定するステップを所定の時間間隔で繰り返すステップとを含み、
   前記周波数の経時的な増加が前記液体サンプル内の微生物増殖を示すことを特徴とするインピーダンスに基づく細菌検出方法。
9. インピーダンスに基づく細菌検出装置の前記少なくとも１つの容器は、容器のアレイに配置された第１の電極および第２の電極間でこれらに接触して配置される、少なくとも複数が微生物を含む疑いのある液体サンプルを含む容器のアレイであり、
   発生した時間変動電気信号を、容器の前記アレイ内の前記複数の容器の前記第１の電極に供給するステップと、
   前記複数の容器を通して送信される前記時間変動信号を受信するステップと、
   前記信号を前記位相敏感信号検出器に送信するステップとをさらに含むことを特徴とする請求項８に記載のインピーダンスに基づく細菌検出方法。
10. 前記サンプルの量は約４０ｍｌであることを特徴とする請求項８に記載のインピーダンスに基づく細菌検出方法。
11. 前記サンプルは、微生物が前記サンプル中に存在する場合に増殖する増殖培地と組み合わされることを特徴とする請求項８に記載のインピーダンスに基づく細菌検出方法。
12. 前記サンプルは、約３０ｍｌの増殖培地と組み合わされた約１０ｍｌの血液であることを特徴とする請求項１１に記載のインピーダンスに基づく細菌検出方法。
13. 容器の前記アレイは共通のヘッドスペースを共有することを特徴とする請求項９に記載のインピーダンスに基づく細菌検出方法。
14. 前記下部電極は前記容器の底部を形成し、前記上部電極は前記容器内へ延びて前記サンプルに接触することを特徴とする請求項９に記載のインピーダンスに基づく細菌検出方法。
15. 第１の電極および第２の電極間でこれらに接触して配置される、微生物を含む疑いのある液体サンプルを含む少なくとも１つの容器を有するサンプルコンテナを設けるステップと、
    電圧制御発振器により発生された時間変動電気信号を前記第１の電極に供給するステップであって、前記第２の電極が位相敏感信号検出器に電気的に接続されるステップと、
    前記検出器の統合された位相外れ出力信号を前記電圧制御発振器の周波数制御入力に供給するステップであって、前記発振器が、前記検出器により測定された位相外れ信号振幅がゼロである周波数に調整され、前記調整された周波数の経時的な増加が、前記液体サンプル内の微生物増殖を示すステップとを含むことを特徴とするインピーダンスに基づく細菌検出方法。
16. インピーダンスに基づく細菌検出装置の前記少なくとも１つの容器は、容器のアレイに配置された第１の電極および第２の電極間でこれらに接触して配置される、少なくとも複数が微生物を含む疑いのある液体サンプルを含む容器のアレイであり、
    発生した時間変動電気信号を、容器の前記アレイ内の前記複数の容器の前記第１の電極に供給するステップと、
    前記複数の容器を通して送信される前記時間変動信号を受信するステップと、
    前記信号を前記位相敏感信号検出器に送信するステップとをさらに含むことを特徴とする請求項１５に記載のインピーダンスに基づく細菌検出方法。
17. 前記サンプルの量は約４０ｍｌであることを特徴とする請求項１５に記載のインピーダンスに基づく細菌検出方法。
18. 前記サンプルは、微生物が前記サンプル中に存在する場合に増殖する増殖培地と組み合わされることを特徴とする請求項１５に記載のインピーダンスに基づく細菌検出方法。
19. 前記サンプルは、約３０ｍｌの増殖培地と組み合わされた約１０ｍｌの血液であることを特徴とする請求項１８に記載のインピーダンスに基づく細菌検出方法。
20. 容器の前記アレイは共通のヘッドスペースを共有することを特徴とする請求項１６に記載のインピーダンスに基づく細菌検出方法。
21. 前記下部電極は前記容器の底部を形成し、前記上部電極は前記容器内へ延びて前記サンプルに接触することを特徴とする請求項１５に記載のインピーダンスに基づく細菌検出方法。
22. 少なくとも１つの容器に配置された第１の電極および第２の電極間でこれらに接触して配置される、微生物を含む疑いのある液体サンプルを含むように構成された前記少なくとも１つの容器を備えたサンプルコンテナを受けるように構成された収容部と、
    前記液体サンプルを通して前記第２の電極に送信される時間変動電気信号を、前記第１の電極に供給するための信号源と、
    前記容器の前記第２の電極に接続された位相敏感信号検出器と、
    前記液体サンプルのバルク容量の変化を示す前記信号検出器からの出力とを備えたことを特徴とするインピーダンスに基づく細菌検出装置。
23. 前記少なくとも１つの容器は、容器のアレイに配置された第１の電極および第２の電極間でこれらに接触して配置される、少なくとも複数が微生物を含む疑いのある液体サンプルを含むように構成された容器のアレイであり、前記インピーダンスに基づく細菌検出装置は、
    発生した時間変動電気信号を、容器の前記アレイ内の前記複数の容器の前記第１の電極に供給するためのデマルチプレクサと、
    前記複数の容器を通して送信される前記時間変動信号を受信し、前記信号を前記位相敏感信号検出器に送信するためのマルチプレクサとをさらに備えたことを特徴とする請求項２２に記載のインピーダンスに基づく細菌検出装置。
24. 前記位相敏感信号検出器は、前記液体サンプルを通して送信される前記信号の位相外れ成分を測定するための内部信号発生器を有するロックイン増幅器であり、前記内部信号発生器は、前記時間変動電気信号を前記第１の電極に供給するための前記信号源であり、前記装置は、
    位相外れ信号の振幅が値ゼロに達するのに必要な、発生した内部信号の周波数の変化を検出する検出器をさらに備えることを特徴とする請求項２２に記載のインピーダンスに基づく細菌検出装置。
25. 前記時間変動電気信号は、電圧制御発振器により前記第１の電極に対して発生され、前記装置は、
    前記位相敏感信号検出器の出力に連結された積分器であって、前記積分器の出力が前記電圧制御発振器の入力に連結される積分器をさらに備え、
    前記検出器により測定された位相外れ信号振幅がゼロである周波数に、前記発振器が調整可能であり、
    調整された周波数の変化を示す、前記信号検出器からの出力をさらに備えたことを特徴とする請求項２２に記載のインピーダンスに基づく細菌検出装置。
26. 容器の前記アレイは共通のヘッドスペースを共有することを特徴とする請求項２３に記載のインピーダンスに基づく細菌検出装置。
27. 前記下部電極は前記容器の底部を形成し、前記上部電極は前記容器内へ延びて前記サンプルに接触することを特徴とする請求項２２に記載のインピーダンスに基づく細菌検出装置。

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