JP2015505240A - 多能性細胞を選別するための方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ＭＤＲ１トランスポーターを介して多能性細胞から排除される化合物を用いて多能性細胞を選別するための方法を提供する。
Description
本発明は、多能性細胞と分化した細胞とを含む試料等の細胞試料から、多能性細胞を選別する方法に関する。本発明はまた、多能性細胞を選択する方法および分化した細胞を選択する方法に関する。
ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞（Thomson, J. A. et al. Science 1998, 282, 1145-1147）および人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞（Takahashi, K. et al. Cell 2007, 131, 861-872）は、無限に増殖し、種々の細胞型へと分化する細胞であり、基礎生物学研究のための有用なツールとして、また再生医療のための有望な資源として用いられてきた。そのような進展にも関わらず、幹細胞の臨床的な応用には多くの問題が残っている。少量の未分化幹細胞を含む細胞試料を移植した動物モデルにおいて奇形腫が発生したことにより、安全性に対する懸念が提起されている。より安全な幹細胞治療のためには、未分化幹細胞の検出および除去のための戦略が必要である。
ヒト多能性幹細胞の検出のため、ＳＳＥＡ−４（ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ４）に対する抗体が広く使用されてきた（Shevinsky,
L. H. et al. Cell 1982, 30, 697-705）。ＳＳＥＡ−４は初期胚の細胞表面に発現する糖脂質であり、ヒトＥＳおよびＥＣ（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞の表面に選択的に提示されるが、その理由は分かっていない（Henderson, J. K. et al. Stem Cells 2002, 20, 329-337）。ヒト幹細胞の他のマーカーの例としては、Ｏｃｔ３／４およびＮａｎｏｇが挙げられ、これらは幹細胞の未分化状態を維持するために必要な転写因子であり、分化の際に下方制御される（Rosner, M. H. et al. Nature 1990, 345, 686-692, and Mitsui, K. et al. Cell 2003, 113, 631-642）。これらに対する抗体は多能性細胞の検出において極めて有用であるが、不安定なタンパク質ツールであるため、高額であり、また細胞の固定や透過処理といった注意を要する処理が必要である。ヒト幹細胞の他のルーチンマーカーとしては、アルカリフォスファターゼが挙げられる（Thomson, J. A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92, 7844-7848）。その酵素活性を利用したアッセイは幹細胞を検出するための簡便かつ極めて有用な方法であるが、多能性幹細胞に対する特異性に関しては大きな懸念がある。なぜなら、この酵素はハウスキーピング酵素であり、他の多くの種類の細胞に広く発現しているためである。
L. H. et al. Cell 1982, 30, 697-705）。ＳＳＥＡ−４は初期胚の細胞表面に発現する糖脂質であり、ヒトＥＳおよびＥＣ（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞の表面に選択的に提示されるが、その理由は分かっていない（Henderson, J. K. et al. Stem Cells 2002, 20, 329-337）。ヒト幹細胞の他のマーカーの例としては、Ｏｃｔ３／４およびＮａｎｏｇが挙げられ、これらは幹細胞の未分化状態を維持するために必要な転写因子であり、分化の際に下方制御される（Rosner, M. H. et al. Nature 1990, 345, 686-692, and Mitsui, K. et al. Cell 2003, 113, 631-642）。これらに対する抗体は多能性細胞の検出において極めて有用であるが、不安定なタンパク質ツールであるため、高額であり、また細胞の固定や透過処理といった注意を要する処理が必要である。ヒト幹細胞の他のルーチンマーカーとしては、アルカリフォスファターゼが挙げられる（Thomson, J. A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92, 7844-7848）。その酵素活性を利用したアッセイは幹細胞を検出するための簡便かつ極めて有用な方法であるが、多能性幹細胞に対する特異性に関しては大きな懸念がある。なぜなら、この酵素はハウスキーピング酵素であり、他の多くの種類の細胞に広く発現しているためである。
多能性幹細胞を高度に特異的に選別するため、本願発明者らは鋭意研究を行い、その結果、多能性細胞を、ＭＤＲ１トランスポーターを介して多能性細胞から排除される化合物を用いて選別することが可能であることを発見し、本発明を完成させるに至った。
本発明は以下の特徴を有する。
［１］以下の工程を含む、多能性細胞を選別する方法：
（ｉ）細胞試料を、ＭＤＲ１トランスポーターを介して多能性細胞から排除される化合物と接触させる工程；および
（ｉｉ）前記化合物を蓄積した細胞を、多能性細胞として検出する工程。
［２］前記化合物が式（Ｉ）
［式中、
Ｒ１は式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）：
（ここで、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９はそれぞれ水素、ハロゲン、炭素数１〜６のアルキル、フェニル、−ＯＲ１０および−ＳＲ１０からなる群より選択され、Ｒ１０は炭素数１〜６のアルキルまたはアリールである）
からなる群より選択され；
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ水素、炭素数１〜６のアルキルおよび−（ＣＨ２）ｍＮＲ１１Ｒ１２からなる群より選択され、ここでｍは１〜１２の整数であり、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ水素、炭素数１〜６のアルキルおよびクロロアセチルからなる群より選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、Ｒ２およびＲ３が結合する窒素原子と共に式（Ｖ）：
（Ｖ）（ｌは１〜６の整数である）
の環状構造を形成し；
ＸはＯ、Ｓ、ＮＨおよびＮＲ１３（Ｒ１３は炭素数１〜６のアルキル）からなる群より選択される］
の構造を有する、［１］記載の方法。
［３］Ｒ２およびＲ３がそれぞれ水素、メチル、エチル、ジメチルアミノエチルおよび１０−クロロアセチルアミノデシルからなる群より選択されるか、またはＲ２およびＲ３が１−ピペリジニルの環状構造を形成し；
Ｒ４がメチルであり；
Ｒ５が水素、フッ素、メトキシ、フェノキシ、メチルチオ、メチル、プロピルおよびフェニルからなる群より選択され；
Ｒ６およびＲ７がそれぞれ水素、フッ素、塩素、メトキシおよびメチルからなる群より選択され；
Ｒ８がフッ素であり；
Ｒ９がメトキシであり；そして
ＸがＯ、Ｓおよびメチルアミノからなる群より選択される；
［２］記載の方法。
［４］前記化合物が以下の表１に示す式からなる群より選択される、［３］記載の方法。
［５］前記化合物が次の式：
である、［４］記載の方法。
［６］前記細胞試料が初期化因子を導入した体細胞である、［１］記載の方法。
［７］前記初期化因子がＯｃｔファミリー遺伝子またはその遺伝子産物、Ｓｏｘファミリー遺伝子またはその遺伝子産物、Ｋｌｆ４ファミリー遺伝子またはその遺伝子産物、およびＭｙｃファミリー遺伝子またはその遺伝子産物、からなる群より選択される少なくとも１つの因子である、［６］記載の方法。
［８］前記細胞試料が、体細胞への分化を誘導された多能性細胞からなる、［１］記載の方法。
［９］［１］記載の方法により多能性細胞を選別し、選別された前記細胞を選択する工程を含む、多能性細胞を選択する方法。
［１０］請求項１記載の方法により多能性細胞を選別し、選別された前記細胞を細胞試料から排除する工程を含む、分化した細胞を選択する方法。
［１１］ＭＤＲ１トランスポーターを介して多能性細胞から排除される化合物を含む、多能性細胞を選別するためのキット。
［１２］前記化合物が式（Ｉ）：
［式中、
Ｒ１は式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）：
（ここで、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９はそれぞれ水素、ハロゲン、炭素数１〜６のアルキル、フェニル、−ＯＲ１０および−ＳＲ１０からなる群より選択され、Ｒ１０は炭素数１〜６のアルキルまたはアリールである）
からなる群より選択され；
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ水素、炭素数１〜６のアルキルおよび−（ＣＨ２）ｍＮＲ１１Ｒ１２からなる群より選択され、ここでｍは１〜１２の整数であり、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ水素、炭素数１〜６のアルキルおよびクロロアセチルからなる群より選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、Ｒ２およびＲ３が結合する窒素原子と共に式（Ｖ）：
（Ｖ）（ｌは１〜６の整数である）
の環状構造を形成し；
ＸはＯ、Ｓ、ＮＨおよびＮＲ１３（Ｒ１３は炭素数１〜６のアルキル）からなる群より選択される］
の構造を有する、［１１］記載のキット。
［１３］Ｒ２およびＲ３がそれぞれ水素、メチル、エチル、ジメチルアミノエチルおよび１０−クロロアセチルアミノデシルからなる群より選択されるか、またはＲ２およびＲ３が１−ピペリジニルの環状構造を形成し；
Ｒ４がメチルであり；
Ｒ５が水素、フッ素、メトキシ、フェノキシ、メチルチオ、メチル、プロピルおよびフェニルからなる群より選択され；
Ｒ６およびＲ７がそれぞれ水素、フッ素、塩素、メトキシおよびメチルからなる群より選択され；
Ｒ８がフッ素であり；
Ｒ９がメトキシであり；そして
ＸがＯ、Ｓおよびメチルアミノからなる群より選択される；
［１２］記載のキット。
［１４］前記化合物が表１に示す式からなる群より選択される、［１３］記載のキット。［１５］前記化合物が次の式：
である、［１４］記載のキット。
［１］以下の工程を含む、多能性細胞を選別する方法：
（ｉ）細胞試料を、ＭＤＲ１トランスポーターを介して多能性細胞から排除される化合物と接触させる工程；および
（ｉｉ）前記化合物を蓄積した細胞を、多能性細胞として検出する工程。
［２］前記化合物が式（Ｉ）
［式中、
Ｒ１は式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）：
からなる群より選択され；
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ水素、炭素数１〜６のアルキルおよび−（ＣＨ２）ｍＮＲ１１Ｒ１２からなる群より選択され、ここでｍは１〜１２の整数であり、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ水素、炭素数１〜６のアルキルおよびクロロアセチルからなる群より選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、Ｒ２およびＲ３が結合する窒素原子と共に式（Ｖ）：
の環状構造を形成し；
ＸはＯ、Ｓ、ＮＨおよびＮＲ１３（Ｒ１３は炭素数１〜６のアルキル）からなる群より選択される］
の構造を有する、［１］記載の方法。
［３］Ｒ２およびＲ３がそれぞれ水素、メチル、エチル、ジメチルアミノエチルおよび１０−クロロアセチルアミノデシルからなる群より選択されるか、またはＲ２およびＲ３が１−ピペリジニルの環状構造を形成し；
Ｒ４がメチルであり；
Ｒ５が水素、フッ素、メトキシ、フェノキシ、メチルチオ、メチル、プロピルおよびフェニルからなる群より選択され；
Ｒ６およびＲ７がそれぞれ水素、フッ素、塩素、メトキシおよびメチルからなる群より選択され；
Ｒ８がフッ素であり；
Ｒ９がメトキシであり；そして
ＸがＯ、Ｓおよびメチルアミノからなる群より選択される；
［２］記載の方法。
［４］前記化合物が以下の表１に示す式からなる群より選択される、［３］記載の方法。
である、［４］記載の方法。
［６］前記細胞試料が初期化因子を導入した体細胞である、［１］記載の方法。
［７］前記初期化因子がＯｃｔファミリー遺伝子またはその遺伝子産物、Ｓｏｘファミリー遺伝子またはその遺伝子産物、Ｋｌｆ４ファミリー遺伝子またはその遺伝子産物、およびＭｙｃファミリー遺伝子またはその遺伝子産物、からなる群より選択される少なくとも１つの因子である、［６］記載の方法。
［８］前記細胞試料が、体細胞への分化を誘導された多能性細胞からなる、［１］記載の方法。
［９］［１］記載の方法により多能性細胞を選別し、選別された前記細胞を選択する工程を含む、多能性細胞を選択する方法。
［１０］請求項１記載の方法により多能性細胞を選別し、選別された前記細胞を細胞試料から排除する工程を含む、分化した細胞を選択する方法。
［１１］ＭＤＲ１トランスポーターを介して多能性細胞から排除される化合物を含む、多能性細胞を選別するためのキット。
［１２］前記化合物が式（Ｉ）：
Ｒ１は式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）：
からなる群より選択され；
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ水素、炭素数１〜６のアルキルおよび−（ＣＨ２）ｍＮＲ１１Ｒ１２からなる群より選択され、ここでｍは１〜１２の整数であり、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ水素、炭素数１〜６のアルキルおよびクロロアセチルからなる群より選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、Ｒ２およびＲ３が結合する窒素原子と共に式（Ｖ）：
の環状構造を形成し；
ＸはＯ、Ｓ、ＮＨおよびＮＲ１３（Ｒ１３は炭素数１〜６のアルキル）からなる群より選択される］
の構造を有する、［１１］記載のキット。
［１３］Ｒ２およびＲ３がそれぞれ水素、メチル、エチル、ジメチルアミノエチルおよび１０−クロロアセチルアミノデシルからなる群より選択されるか、またはＲ２およびＲ３が１−ピペリジニルの環状構造を形成し；
Ｒ４がメチルであり；
Ｒ５が水素、フッ素、メトキシ、フェノキシ、メチルチオ、メチル、プロピルおよびフェニルからなる群より選択され；
Ｒ６およびＲ７がそれぞれ水素、フッ素、塩素、メトキシおよびメチルからなる群より選択され；
Ｒ８がフッ素であり；
Ｒ９がメトキシであり；そして
ＸがＯ、Ｓおよびメチルアミノからなる群より選択される；
［１２］記載のキット。
［１４］前記化合物が表１に示す式からなる群より選択される、［１３］記載のキット。［１５］前記化合物が次の式：
である、［１４］記載のキット。
本発明は、次の工程を含む、多能性細胞を選別する方法を提供する：
（ｉ）細胞試料を、ＭＤＲ１トランスポーターを介して多能性細胞から排除される化合物と接触させる工程；および
（ｉｉ）前記化合物を蓄積した細胞を、多能性細胞として検出する工程。
（ｉ）細胞試料を、ＭＤＲ１トランスポーターを介して多能性細胞から排除される化合物と接触させる工程；および
（ｉｉ）前記化合物を蓄積した細胞を、多能性細胞として検出する工程。
ＭＤＲ１トランスポーターのヌクレオチド配列情報、およびＭＤＲ１ ｃＤＮＡにコードされるタンパク質のアミノ酸配列情報は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０００９２７を参照して得ることができる。
多能性細胞からＭＤＲ１トランスポーターを介して排除される前記化合物は、実施例５に記載されるように、ＭＤＲ１を有する、または有しない細胞を用いて認識することができる。
本発明の一態様において、多能性細胞からＭＤＲ１トランスポーターを介して除去される前記化合物は、式（Ｉ）：
［式中、
Ｒ１は式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）：
（Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９はそれぞれ水素、ハロゲン、炭素数１〜６のアルキル、フェニル、−ＯＲ１０および−ＳＲ１０からなる群より選択され、ここでＲ１０は炭素数１〜６のアルキルまたはアリールであり、好ましくは、Ｒ５は水素、フッ素、メトキシ、フェノキシ、メチルチオ、メチル、プロピルおよびフェニルからなる群より選択され、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ水素、フッ素、塩素、メトキシおよびメチルからなる群より選択され、Ｒ８はフッ素であり、Ｒ９はメトキシである）
からなる群より選択され；
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ水素、炭素数１〜６のアルキルおよび−（ＣＨ２）ｍＮＲ１１Ｒ１２からなる群より選択され、ここでｍは１〜１２の整数であり、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ水素、炭素数１〜６のアルキルおよびクロロアセチルからなる群より選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、Ｒ２およびＲ３が結合する窒素原子と共に式（ＩＩＩ）：
（ＩＩＩ）（ｌは１〜６の整数である）
の環状構造を形成し、好ましくは、Ｒ２およびＲ３がそれぞれ水素、メチル、エチル、ジメチルアミノエチルおよび１０−クロロアセチルアミノデシルからなる群より選択されるか、またはＲ２およびＲ３が１−ピペリジニルの環状構造を形成し、Ｒ４がメチルであり；
ＸはＯ、Ｓ、ＮＨおよびＮＲ１３（Ｒ１３は炭素数１〜６のアルキル）からなる群より選択され、好ましくはＸはＯ、Ｓおよびメチルアミノからなる群より選択される］
を有する。
Ｒ１は式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）：
からなる群より選択され；
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ水素、炭素数１〜６のアルキルおよび−（ＣＨ２）ｍＮＲ１１Ｒ１２からなる群より選択され、ここでｍは１〜１２の整数であり、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ水素、炭素数１〜６のアルキルおよびクロロアセチルからなる群より選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、Ｒ２およびＲ３が結合する窒素原子と共に式（ＩＩＩ）：
の環状構造を形成し、好ましくは、Ｒ２およびＲ３がそれぞれ水素、メチル、エチル、ジメチルアミノエチルおよび１０−クロロアセチルアミノデシルからなる群より選択されるか、またはＲ２およびＲ３が１−ピペリジニルの環状構造を形成し、Ｒ４がメチルであり；
ＸはＯ、Ｓ、ＮＨおよびＮＲ１３（Ｒ１３は炭素数１〜６のアルキル）からなる群より選択され、好ましくはＸはＯ、Ｓおよびメチルアミノからなる群より選択される］
を有する。
本発明において、炭素数１〜６のアルキルとは、炭素数１〜６の直鎖または分岐鎖飽和炭化水素基、すなわち、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ヘプチルまたはヘキシルを意味する。
本発明の一態様において、より好ましい化合物は、以下の表２中に記載されるものである。
本発明の方法で使用される前記化合物はこれら化合物の塩であってもよい。それらの塩は当業者に周知であり、好ましい例として、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸およびリン酸等の無機酸との塩；ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒
石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸およびｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸との塩；ナトリウム塩およびカリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩およびバリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アンモニウム塩；トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン、シクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノネン−５（ＤＢＮ）、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（ＤＢＵ）等の有機塩基との塩；アルギニン、リジンおよびオルニチン等の塩基性アミノ酸との塩；アスパラギン酸およびグルタミン酸等の酸性アミノ酸との塩；等が挙げられる。
石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸およびｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸との塩；ナトリウム塩およびカリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩およびバリウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩；アンモニウム塩；トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミン、シクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノネン−５（ＤＢＮ）、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（ＤＢＵ）等の有機塩基との塩；アルギニン、リジンおよびオルニチン等の塩基性アミノ酸との塩；アスパラギン酸およびグルタミン酸等の酸性アミノ酸との塩；等が挙げられる。
一態様において、本発明の方法で用いられる前記化合物は米国特許出願公開第２００８／０１２４７５１号に記載の反応により調製することができる。
他の態様においては、次の合成スキームが提供される。
前記化合物が官能基（水酸基等）を有する場合、該官能基を必要に応じてあらかじめ保護し、上記反応後に常法によって脱保護してもよい。
前記化合物が官能基（水酸基等）を有する場合、該官能基を必要に応じてあらかじめ保護し、上記反応後に常法によって脱保護してもよい。
本発明において、前記の多能性細胞を選別する方法は、前記化合物を蓄積した細胞を多能性細胞として検出するさらなる工程を含む。例えば、前記化合物を蓄積した細胞は該化合物の蛍光を測定することにより、または該化合物に対する抗体を使用することにより、検出することができる。
前記多能性細胞は、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ。該多能性幹細胞の例としては、胚性幹（ＥＳ）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹細胞（「ｎｔＥＳ細胞」）、生殖幹細胞（「ＧＳ細胞」）、胚性生殖細胞（「ＥＧ細胞」）、および人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい前記多能性幹細胞の例として、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞、およびｉＰＳ細胞が挙げられる。
（Ａ）胚性幹細胞
ＥＳ細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能とを有する幹細胞である。
ＥＳ細胞は、受精卵の８細胞期、桑実胚期後の胚である、胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚由来幹細胞であり、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。ＥＳ細胞は、マウスで１９８１年に発見され（M. J. Evans and M. H. Kaufman (1981), Nature 292:154-156）、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもＥＳ細胞株が樹立された（J. A. Thomson et al. (1998), Science 282:1145-1147；J. A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848；J. A. Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55:254-259；および J. A. Thomso
n and V. S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165）。
ＥＳ細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊をフィーダー細胞である線維芽細胞の上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）などの物質を添加した培地を用いて行うことができる。ヒトおよびサルのＥＳ細胞の樹立と維持の方法については、例えば、H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932；M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9554-9559；H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222:273-279；およびH. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585などに記載されている。
ヒトＥＳ細胞は、例えば０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸、２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸、２０％ ＫＳＲ及び４ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦを補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を使用し、３７℃、５％ ＣＯ２湿潤雰囲気下で維持することができる。また、ＥＳ細胞は、３〜４日おきに継代する必要があり、このとき、継代は、例えば１ｍＭ ＣａＣｌ２及び２０％ ＫＳＲを含有するＰＢＳ中の０．２５％ トリプシン及び０．１ｍｇ／ｍｌ コラゲナーゼＩＶを用いて行うことができる。
ＥＳ細胞の選択は、一般に、アルカリホスファターゼ、Ｏｃｔ−３／４、Ｎａｎｏｇなどの遺伝子マーカーの発現を指標にして行うことができる。特に、ヒトＥＳ細胞の選択では、ＯＣＴ−３／４、ＮＡＮＯＧ、などの遺伝子マーカーの発現をＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法で検出したり、細胞表面抗原であるＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１を免疫染色法にて検出することで行うことができる（Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444:481-485）。
ヒトＥＳ細胞株である例えばＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２及びＫｈＥＳ−３は、京都大学再生医科学研究所（京都、日本）から入手可能である。
ＥＳ細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能とを有する幹細胞である。
ＥＳ細胞は、受精卵の８細胞期、桑実胚期後の胚である、胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚由来幹細胞であり、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。ＥＳ細胞は、マウスで１９８１年に発見され（M. J. Evans and M. H. Kaufman (1981), Nature 292:154-156）、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもＥＳ細胞株が樹立された（J. A. Thomson et al. (1998), Science 282:1145-1147；J. A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848；J. A. Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55:254-259；および J. A. Thomso
n and V. S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165）。
ＥＳ細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊をフィーダー細胞である線維芽細胞の上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）などの物質を添加した培地を用いて行うことができる。ヒトおよびサルのＥＳ細胞の樹立と維持の方法については、例えば、H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932；M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9554-9559；H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222:273-279；およびH. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585などに記載されている。
ヒトＥＳ細胞は、例えば０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸、２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸、２０％ ＫＳＲ及び４ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦを補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を使用し、３７℃、５％ ＣＯ２湿潤雰囲気下で維持することができる。また、ＥＳ細胞は、３〜４日おきに継代する必要があり、このとき、継代は、例えば１ｍＭ ＣａＣｌ２及び２０％ ＫＳＲを含有するＰＢＳ中の０．２５％ トリプシン及び０．１ｍｇ／ｍｌ コラゲナーゼＩＶを用いて行うことができる。
ＥＳ細胞の選択は、一般に、アルカリホスファターゼ、Ｏｃｔ−３／４、Ｎａｎｏｇなどの遺伝子マーカーの発現を指標にして行うことができる。特に、ヒトＥＳ細胞の選択では、ＯＣＴ−３／４、ＮＡＮＯＧ、などの遺伝子マーカーの発現をＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法で検出したり、細胞表面抗原であるＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１を免疫染色法にて検出することで行うことができる（Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444:481-485）。
ヒトＥＳ細胞株である例えばＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２及びＫｈＥＳ−３は、京都大学再生医科学研究所（京都、日本）から入手可能である。
（Ｂ）生殖幹細胞
生殖幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ＥＳ細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できる性質をもつ（M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616；K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012）。生殖幹細胞は、神経膠細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を含む培地で自己複製可能であるし、またＥＳ細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、生殖幹細胞を得ることができる（竹林正則ら（２００８），実験医学，２６巻，５号（増刊），４１〜４６頁，羊土社（東京、日本））。
生殖幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ＥＳ細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できる性質をもつ（M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616；K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012）。生殖幹細胞は、神経膠細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）を含む培地で自己複製可能であるし、またＥＳ細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、生殖幹細胞を得ることができる（竹林正則ら（２００８），実験医学，２６巻，５号（増刊），４１〜４６頁，羊土社（東京、日本））。
（Ｃ）胚性生殖細胞
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ＥＳ細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、幹細胞因子などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる（Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847；J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551）。
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ＥＳ細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、幹細胞因子などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる（Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847；J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551）。
（Ｄ）人工多能性幹細胞
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、ある特定の核初期化物質を、ＤＮＡまたはタンパク質の形態で体細胞に導入することまたは薬剤によって当該核初期化物質の内在性のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を上昇させることによって作製することができる、ＥＳ細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676；K. Takahashi et al. (2007) Cell, 131: 861-872；J. Yu et al. (2007) Science, 318: 1917-1920；M. Nakagawa et al. (2008) Nat. Biotechnol., 26: 101-106；WO 2007/069666；およびWO 2010/068955）。核初期化物質は、ＥＳ細胞に特異的に発現している遺伝子またはＥ
Ｓ細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子もしくはそれらの遺伝子産物であればよく、特に限定されないが、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ５、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ１８、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ Ｌａｒｇｅ Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７、Ｂｍｉｌ、Ｌｉｎ２８、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｎａｎｏｇ、Ｅｓｒｒｂ、Ｅｓｒｒｇ、およびＧｌｉｓ１が例示される。これらの初期化物質は、ｉＰＳ細胞樹立の際には、組み合わされて使用されてもよい。例えば、上記初期化物質を、少なくとも１つ、２つもしくは３つ含む組み合わせであり、好ましくは４つを含む組み合わせである。
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、ある特定の核初期化物質を、ＤＮＡまたはタンパク質の形態で体細胞に導入することまたは薬剤によって当該核初期化物質の内在性のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を上昇させることによって作製することができる、ＥＳ細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676；K. Takahashi et al. (2007) Cell, 131: 861-872；J. Yu et al. (2007) Science, 318: 1917-1920；M. Nakagawa et al. (2008) Nat. Biotechnol., 26: 101-106；WO 2007/069666；およびWO 2010/068955）。核初期化物質は、ＥＳ細胞に特異的に発現している遺伝子またはＥ
Ｓ細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子もしくはそれらの遺伝子産物であればよく、特に限定されないが、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ５、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｓｏｘ１８、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ Ｌａｒｇｅ Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７、Ｂｍｉｌ、Ｌｉｎ２８、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｎａｎｏｇ、Ｅｓｒｒｂ、Ｅｓｒｒｇ、およびＧｌｉｓ１が例示される。これらの初期化物質は、ｉＰＳ細胞樹立の際には、組み合わされて使用されてもよい。例えば、上記初期化物質を、少なくとも１つ、２つもしくは３つ含む組み合わせであり、好ましくは４つを含む組み合わせである。
上記の各核初期化物質のマウスおよびヒトｃＤＮＡのヌクレオチド配列並びに当該ｃＤＮＡにコードされるタンパク質のアミノ酸配列情報は、WO 2007/069666に記載のＮＣＢＩアクセッション番号を参照することにより得られる。また、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｅｓｒｒｂ、Ｅｓｒｒｇ、およびＧｌｉｓ１のマウスおよびヒトのｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列の情報については、それぞれ下記ＮＣＢＩアクセッション番号を参照することにより取得できる。当業者は、当該ｃＤＮＡ配列またはアミノ酸配列情報に基づいて、常法により所望の核初期化物質を調製することができる。
遺伝子名 マウス ヒト
Ｌ−Ｍｙｃ ＮＭ＿００８５０６ ＮＭ＿００１０３３０８１
Ｌｉｎ２８ ＮＭ＿１４５８３３ ＮＭ＿０２４６７４
Ｌｉｎ２８ｂ ＮＭ＿００１０３１７７２ ＮＭ＿００１００４３１７
Ｅｓｒｒｂ ＮＭ＿０１１９３４ ＮＭ＿００４４５２
Ｅｓｒｒｇ ＮＭ＿０１１９３５ ＮＭ＿００１４３８
Ｇｌｉｓ１ ＮＭ＿１４７２２１ ＮＭ＿１４７１９３
遺伝子名 マウス ヒト
Ｌ−Ｍｙｃ ＮＭ＿００８５０６ ＮＭ＿００１０３３０８１
Ｌｉｎ２８ ＮＭ＿１４５８３３ ＮＭ＿０２４６７４
Ｌｉｎ２８ｂ ＮＭ＿００１０３１７７２ ＮＭ＿００１００４３１７
Ｅｓｒｒｂ ＮＭ＿０１１９３４ ＮＭ＿００４４５２
Ｅｓｒｒｇ ＮＭ＿０１１９３５ ＮＭ＿００１４３８
Ｇｌｉｓ１ ＮＭ＿１４７２２１ ＮＭ＿１４７１９３
これらの核初期化物質は、タンパク質の形態で、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチドとの結合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよいし、あるいは、ＤＮＡの形態で、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクターの使用、リポフェクション、リポソームの使用、またはマイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006；Cell, 131, pp.861-872, 2007；Science, 318, pp.1917-1920, 2007）、アデノウイルスベクター（Science, 322, 945-949, 2008）、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-62, 2009）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ、ＰＡＣ）などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる（Science, 322:949-953, 2008）。ベクターには、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができる。使用されるプロモーターとしては、例えばＥＦ１αプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）ＬＴＲ、ＨＳＶ−ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、ＥＦ１αプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが好ましい。さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ＦＬＡＧなどのレポーターの遺伝子配列；などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、核初期化物質をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合す
る核初期化物質をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にＬｏｘＰ配列を有してもよい。別の好ましい一実施態様においては、トランスポゾンを用いて染色体に導入遺伝子を組み込んだ後に、プラスミドベクターもしくはアデノウイルスベクターを用いて細胞に転移酵素を作用させ、導入遺伝子を完全に染色体から除去する方法が用いられ得る。好ましいトランスポゾンとしては、例えば、鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンであるｐｉｇｇｙＢａｃ等が挙げられる（Kaji, K. et al., (2009), Nature, 458: 771-775；Woltjen et al., (2009), Nature, 458: 766-770；WO 2010/012077）。さらに、ベクターには、染色体への組み込みがなくとも複製されて、エピソーマルに存在するように、リンパ指向性ヘルペスウイルス（lymphotrophic herpes virus）、ＢＫウイルスまたは牛乳頭腫ウイルス（Bovine papillomavirus）の起点とそれらの複製に係る配列を含んでいてもよい。例えば、ＥＢＮＡ−１およびｏｒｉＰ配列、またはＬａｒｇｅ ＴおよびＳＶ４０ｏｒｉ配列を含むことが挙げられる（WO 2009/115295、WO 2009/157201、およびWO 2009/149233）。また、複数の核初期化物質を同時に導入するために、ポリシストロニックに発現させる発現ベクターを用いてもよい。ポリシストロニックに発現させるためには、遺伝子をコードする配列の間は、ＩＲＥＳまたは口蹄病ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａコード領域により結合されていてもよい（Science, 322:949-953, 2008およびWO 2009/092042 2009/152529）。
る核初期化物質をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にＬｏｘＰ配列を有してもよい。別の好ましい一実施態様においては、トランスポゾンを用いて染色体に導入遺伝子を組み込んだ後に、プラスミドベクターもしくはアデノウイルスベクターを用いて細胞に転移酵素を作用させ、導入遺伝子を完全に染色体から除去する方法が用いられ得る。好ましいトランスポゾンとしては、例えば、鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンであるｐｉｇｇｙＢａｃ等が挙げられる（Kaji, K. et al., (2009), Nature, 458: 771-775；Woltjen et al., (2009), Nature, 458: 766-770；WO 2010/012077）。さらに、ベクターには、染色体への組み込みがなくとも複製されて、エピソーマルに存在するように、リンパ指向性ヘルペスウイルス（lymphotrophic herpes virus）、ＢＫウイルスまたは牛乳頭腫ウイルス（Bovine papillomavirus）の起点とそれらの複製に係る配列を含んでいてもよい。例えば、ＥＢＮＡ−１およびｏｒｉＰ配列、またはＬａｒｇｅ ＴおよびＳＶ４０ｏｒｉ配列を含むことが挙げられる（WO 2009/115295、WO 2009/157201、およびWO 2009/149233）。また、複数の核初期化物質を同時に導入するために、ポリシストロニックに発現させる発現ベクターを用いてもよい。ポリシストロニックに発現させるためには、遺伝子をコードする配列の間は、ＩＲＥＳまたは口蹄病ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａコード領域により結合されていてもよい（Science, 322:949-953, 2008およびWO 2009/092042 2009/152529）。
核初期化に際して、ｉＰＳ細胞の誘導効率を高めるために、上記の因子の他に、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤［例えば、バルプロ酸（ＶＰＡ）（Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008)）、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、ＭＣ１２９３、Ｍ３４４等の低分子阻害剤、ＨＤＡＣに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ（例、ＨＤＡＣ１ ｓｉＲＮＡ Ｓｍａｒｔｐｏｏｌ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＨｕＳＨ ２９ｍｅｒ ｓｈＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ＨＤＡＣ１（ＯｒｉＧｅｎｅ）等）等の核酸性発現阻害剤など］、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば５’−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）（Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008)）、Ｇ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤［例えば、ＢＩＸ−０１２９４（Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008)）等の低分子阻害剤、Ｇ９ａに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ（例、Ｇ９ａ ｓｉＲＮＡ（ｈｕｍａｎ）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）等）等の核酸性発現阻害剤など］、Ｌ−ｃｈａｎｎｅｌ ｃａｌｃｉｕｍ ａｇｏｎｉｓｔ（例えばＢａｙｋ８６４４）（Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008)）、ｐ５３阻害剤（例えばｐ５３に対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）（Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008)）、Ｗｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｃｔｉｖａｔｏｒ（例えばｓｏｌｕｂｌｅ Ｗｎｔ３ａ）（Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008)）、ＬＩＦまたはｂＦＧＦなどの増殖因子、ＡＬＫ５阻害剤（例えば、ＳＢ４３１５４２）（Nat. Methods, 6: 805-8 (2009)）、ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ阻害剤、ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ
ｋｉｎａｓｅ−３阻害剤（PLoS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008)）、ｍｉＲ−２９１−３ｐ、ｍｉＲ−２９４、ｍｉＲ−２９５などのｍｉＲＮＡ（R.L. Judson et al., Nat. Biotech., 27:459-461 (2009)）、等を使用することができる。
ｋｉｎａｓｅ−３阻害剤（PLoS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008)）、ｍｉＲ−２９１−３ｐ、ｍｉＲ−２９４、ｍｉＲ−２９５などのｍｉＲＮＡ（R.L. Judson et al., Nat. Biotech., 27:459-461 (2009)）、等を使用することができる。
核初期化物質の内在性のタンパク質の発現上昇に使用する薬剤としては、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム、インジルビン−５−ニトロ−３’−オキシム、バルプロ酸、２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン、１−（４−メチルフェニル）−２−（４，５，６，７−テトラヒドロ−２−イミノ−３（２Ｈ）−ベンゾチアゾリル）エタノン ＨＢｒ（ピフィスリン−アルファ）、プロスタグランジンＪ２およびプロスタグランジンＥ２等が例示される（WO 2010/068955）。
ｉＰＳ細胞誘導のための培地としては、例えば（１）１０〜１５％ＦＢＳを含有するＤ
ＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＤＭＥ培地（これらの培地にはさらに、ＬＩＦ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）、（２）ｂＦＧＦまたはＳＣＦを含有するＥＳ細胞用培地、例えばマウスＥＳ細胞用培地（例えばＴＸ−ＷＥＳ培地、トロンボＸ社）または霊長類ＥＳ細胞用培地（例えば霊長類（ヒト＆サル）ＥＳ細胞用培地（リプロセル、京都、日本）、ｍＴｅＳＲ−１）、などが含まれる。
ＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＤＭＥ培地（これらの培地にはさらに、ＬＩＦ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）、（２）ｂＦＧＦまたはＳＣＦを含有するＥＳ細胞用培地、例えばマウスＥＳ細胞用培地（例えばＴＸ−ＷＥＳ培地、トロンボＸ社）または霊長類ＥＳ細胞用培地（例えば霊長類（ヒト＆サル）ＥＳ細胞用培地（リプロセル、京都、日本）、ｍＴｅＳＲ−１）、などが含まれる。
培養法の例としては、たとえば、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で体細胞と核初期化物質（ＤＮＡまたはタンパク質）を接触させ約４〜７日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞（たとえば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上にまきなおし、体細胞と核初期化物質の接触から約１０日後からｂＦＧＦ含有霊長類ＥＳ細胞用培地で培養し、該接触から約３０〜約４５日またはそれ以上ののちにＥＳ細胞様コロニーを生じさせることができる。また、ｉＰＳ細胞の誘導効率を高めるために、５−１０％と低い酸素濃度の条件下で培養してもよい。
あるいは、その代替培養法として、体細胞は、フィーダー細胞（たとえば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上で１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（これにはさらに、ＬＩＦ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、培養から約２５〜約３０日またはそれ以上ののちにＥＳ様コロニーを生じさせることができる。
あるいは、その代替培養法として、体細胞は、フィーダー細胞（たとえば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上で１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（これにはさらに、ＬＩＦ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、培養から約２５〜約３０日またはそれ以上ののちにＥＳ様コロニーを生じさせることができる。
上記培養の間には、培養開始２日目以降から毎日１回新鮮な培地と培地交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ１００ｃｍ２あたり約５×１０３〜約５×１０６細胞の範囲である。
マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を含む遺伝子を用いた場合は、対応する薬剤を含む培地（選択培地）で培養を行うことによりマーカー遺伝子発現細胞を選択することができる。またマーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、マーカー遺伝子発現細胞を検出することができる。
本明細書中で使用する「体細胞」は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット等）由来の生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、Ｉ型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Ｔリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、およびそれらの前駆細胞（組織前駆細胞）等が挙げられる。細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞（体性幹細胞も含む）であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。
本発明において、体細胞を採取する由来となる哺乳動物個体は特に制限されないが、好ましくはヒトである。
本発明において、体細胞を採取する由来となる哺乳動物個体は特に制限されないが、好ましくはヒトである。
（Ｅ） 核移植により得られたクローン胚由来のＥＳ細胞
ｎｔ ＥＳ細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のＥＳ細胞であり、受精卵由来のＥＳ細胞とほぼ同じ特性を有している（T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743；S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936；J. Byrne et al. (2007), Nature, 450:497-502）。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたＥＳ細胞がｎｔ ＥＳ（ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ＥＳ）細胞である。ｎｔ ＥＳ細胞の作製のためには、核移植技術（J.B. Cibelli et al. (1998), Nat. Biotechnol., 16:642-646）とＥＳ細胞作製技術（上記）との組み合わせが利用される（若山清香ら（２００８），実験医学，２６巻，５号（増刊），４７〜５２頁）。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで再プログラム化することができる。
ｎｔ ＥＳ細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のＥＳ細胞であり、受精卵由来のＥＳ細胞とほぼ同じ特性を有している（T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743；S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936；J. Byrne et al. (2007), Nature, 450:497-502）。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたＥＳ細胞がｎｔ ＥＳ（ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ＥＳ）細胞である。ｎｔ ＥＳ細胞の作製のためには、核移植技術（J.B. Cibelli et al. (1998), Nat. Biotechnol., 16:642-646）とＥＳ細胞作製技術（上記）との組み合わせが利用される（若山清香ら（２００８），実験医学，２６巻，５号（増刊），４７〜５２頁）。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで再プログラム化することができる。
（Ｆ）融合幹細胞
体細胞と卵子もしくはＥＳ細胞とを融合させることにより、融合させたＥＳ細胞と同様な多能性を有し、さらに体細胞に特有の遺伝子も有する幹細胞である（Tada M et al. Curr Biol. 11:1553-8, 2001；Cowan CA et al. Science. 2005 Aug 26;309(5739):1369-73）。
体細胞と卵子もしくはＥＳ細胞とを融合させることにより、融合させたＥＳ細胞と同様な多能性を有し、さらに体細胞に特有の遺伝子も有する幹細胞である（Tada M et al. Curr Biol. 11:1553-8, 2001；Cowan CA et al. Science. 2005 Aug 26;309(5739):1369-73）。
本発明の方法は、上述の初期化因子を導入した体細胞を含む細胞試料から多能性細胞を選別する場合に用いることができる。
本発明はまた、体細胞への分化を誘導された多能性細胞を含む細胞試料から多能性細胞を選別する場合にも用いることができる。
ここで、多能性細胞は、特定の臓器細胞およびその前駆細胞へ分化を誘導されるのみでなく、内胚葉細胞、中胚葉細胞および外胚葉細胞等の広範な細胞型を含む細胞集団へと分化を誘導されてもよい。本発明の標的となる臓器の例としては、皮膚、血管、角膜、腎臓、心臓、肝臓、臍帯、腸、神経、肺、胎盤、膵臓、脳、四肢末梢、および網膜等が挙げられるが、これらに限定されない。当業者に自明の任意の分化誘導法を用いることができる。例としては、特開2002-291469に記載される神経幹細胞への分化誘導法、特開2004-121165に記載される膵幹様細胞への分化誘導法、および特表2003-505006に記載される造血細胞への分化誘導法が挙げられる。さらに、胚様体の形成による分化誘導法の例として、特表2003-523766等に記載される方法等が挙げられる。
本発明はまた、体細胞への分化を誘導された多能性細胞を含む細胞試料から多能性細胞を選別する場合にも用いることができる。
ここで、多能性細胞は、特定の臓器細胞およびその前駆細胞へ分化を誘導されるのみでなく、内胚葉細胞、中胚葉細胞および外胚葉細胞等の広範な細胞型を含む細胞集団へと分化を誘導されてもよい。本発明の標的となる臓器の例としては、皮膚、血管、角膜、腎臓、心臓、肝臓、臍帯、腸、神経、肺、胎盤、膵臓、脳、四肢末梢、および網膜等が挙げられるが、これらに限定されない。当業者に自明の任意の分化誘導法を用いることができる。例としては、特開2002-291469に記載される神経幹細胞への分化誘導法、特開2004-121165に記載される膵幹様細胞への分化誘導法、および特表2003-505006に記載される造血細胞への分化誘導法が挙げられる。さらに、胚様体の形成による分化誘導法の例として、特表2003-523766等に記載される方法等が挙げられる。
他の態様において、本発明の方法は、前記化合物を蓄積した細胞を選択することにより多能性細胞を選択するために使用することができる。
他の態様において、本発明の方法は、前記化合物を蓄積した細胞を除去することにより分化した細胞を選択するために使用することができる。
他の態様において、多能性細胞を選別するためのキットが提供される。該キットは上述の化合物、培養液等を含んでいてよい。該キットはさらに選別のための手順書または説明書を含んでいてよい。
他の態様において、本発明の方法は、前記化合物を蓄積した細胞を除去することにより分化した細胞を選択するために使用することができる。
他の態様において、多能性細胞を選別するためのキットが提供される。該キットは上述の化合物、培養液等を含んでいてよい。該キットはさらに選別のための手順書または説明書を含んでいてよい。
＜材料＞
シクロスポリンＡを和光純薬工業株式会社より購入した。マウスモノクローナル抗ＭＤＲ１抗体（ＭＲＫ１６）を協和メデックス株式会社より購入した。蛍光標識二次抗体を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓより購入した。牛胎児血清（ＦＢＳ）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入した。Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）をナカライテスク株式会社より購入した。
シクロスポリンＡを和光純薬工業株式会社より購入した。マウスモノクローナル抗ＭＤＲ１抗体（ＭＲＫ１６）を協和メデックス株式会社より購入した。蛍光標識二次抗体を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓより購入した。牛胎児血清（ＦＢＳ）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより購入した。Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）をナカライテスク株式会社より購入した。
＜化合物１とともにインキュベートしたヒトｉＰＳ細胞の、蛍光顕微鏡およびＦＡＣＳ分析による評価＞
ヒトｉＰＳ細胞（クローン＃２０１Ｂ７）（Takahashi, K. et al. Cell 2007, 131, 861-872）を、６穴プレート中、ＳＮＬフィーダー細胞上に２×１０５細胞／ウェルの密度でプレーティングした（McMahon, A.P. and Bradley, A., Cell, 62, 1073-1085, 1990）。プレーティングの６日後、細胞を２μＭ 化合物１（表２）とともに３時間インキュベートした（この時点で蛍光顕微鏡像を取得した）。細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で単一細胞に分離し、ａ−ＳＳＥＡ−４−Ａｌｅｘａ ６４７で３０分間室温にて染色した。洗浄後、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ）分析を行った。
ヒトｉＰＳ細胞（クローン＃２０１Ｂ７）（Takahashi, K. et al. Cell 2007, 131, 861-872）を、６穴プレート中、ＳＮＬフィーダー細胞上に２×１０５細胞／ウェルの密度でプレーティングした（McMahon, A.P. and Bradley, A., Cell, 62, 1073-1085, 1990）。プレーティングの６日後、細胞を２μＭ 化合物１（表２）とともに３時間インキュベートした（この時点で蛍光顕微鏡像を取得した）。細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で単一細胞に分離し、ａ−ＳＳＥＡ−４−Ａｌｅｘａ ６４７で３０分間室温にて染色した。洗浄後、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ）分析を行った。
＜部分的に分化したヒトｉＰＳ細胞の蛍光顕微鏡イメージング＞
ヒトｉＰＳ細胞（クローン＃２０１Ｂ７）を９６穴プレート中のＳＮＬフィーダー細胞上にプレーティングした。プレーティングの５日後、ｉＰＳ細胞のドーナツ型コロニーが偶然いくつか得られた。これらの細胞を、４μＭ 化合物１とともに、４．５時間３７℃でインキュベートした。蛍光顕微鏡像をＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐを使用して取得した。
ヒトｉＰＳ細胞（クローン＃２０１Ｂ７）を９６穴プレート中のＳＮＬフィーダー細胞上にプレーティングした。プレーティングの５日後、ｉＰＳ細胞のドーナツ型コロニーが偶然いくつか得られた。これらの細胞を、４μＭ 化合物１とともに、４．５時間３７℃でインキュベートした。蛍光顕微鏡像をＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐを使用して取得した。
＜ヒトのＥＳ細胞および分化した細胞の蛍光顕微鏡イメージング＞
ｈＥＳ細胞株、ＫｈＥＳ−１を、先に記載の通り維持した（Suemori, H. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006, 345, 926-932）。ｈＥＳＣの分化を誘導するため、細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ被覆プレート上に播種し、１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ中で５００ｎＭのａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ Ｒ２６２５）とともに４日間培養した。１μＭの化合物１で２時間染色後、細胞をＰＢＳでリンスし、新鮮な（色素を含まない）培地中に保持した。ＤＰ７２を使用し、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１による蛍光顕微鏡観察を行った。
ｈＥＳ細胞株、ＫｈＥＳ−１を、先に記載の通り維持した（Suemori, H. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006, 345, 926-932）。ｈＥＳＣの分化を誘導するため、細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ被覆プレート上に播種し、１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ中で５００ｎＭのａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ Ｒ２６２５）とともに４日間培養した。１μＭの化合物１で２時間染色後、細胞をＰＢＳでリンスし、新鮮な（色素を含まない）培地中に保持した。ＤＰ７２を使用し、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１による蛍光顕微鏡観察を行った。
＜細胞培養＞
ヒトＭＤＲ１を安定に発現しているＫＢ／ＭＤＲ１、およびＫＢ３−１宿主細胞（Ueda, K et al., PNAS 84, 3004-3008, 1987）を、３７℃の加湿インキュベーター（５％ＣＯ２）中において、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中で維持した。
ヒトＭＤＲ１を安定に発現しているＫＢ／ＭＤＲ１、およびＫＢ３−１宿主細胞（Ueda, K et al., PNAS 84, 3004-3008, 1987）を、３７℃の加湿インキュベーター（５％ＣＯ２）中において、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中で維持した。
＜蛍光化合物の蓄積＞
細胞を、３５ｍｍ／ガラスベースディッシュ（ＩＷＡＫＩ）中で、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中、ディッシュあたり５×１０５細胞の密度で２４〜４８時間継代培養した。その後、細胞を、１０％ＦＢＳおよび前記化合物を添加したＤＭＥＭ中、３７℃にて２時間インキュベートし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ ７００；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で観察した。
細胞を、３５ｍｍ／ガラスベースディッシュ（ＩＷＡＫＩ）中で、１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中、ディッシュあたり５×１０５細胞の密度で２４〜４８時間継代培養した。その後、細胞を、１０％ＦＢＳおよび前記化合物を添加したＤＭＥＭ中、３７℃にて２時間インキュベートし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、共焦点顕微鏡（ＬＳＭ ７００；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で観察した。
＜免疫染色＞
細胞をカバーガラス上で増殖させ、ＰＢＳ＋（０．１ｍｇ／ｍｌ ＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏを含むＰＢＳ）中の４％パラホルムアルデヒドで２０分間室温にて固定した。ＰＢＳ＋で希釈した１０％ヤギ血清で１時間ブロッキングを行った後、細胞を５μｇ／ｍｌ ＭＲＫ１６とともにインキュベートし、次いで蛍光標識二次抗体とともにインキュベートした。
細胞をカバーガラス上で増殖させ、ＰＢＳ＋（０．１ｍｇ／ｍｌ ＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏを含むＰＢＳ）中の４％パラホルムアルデヒドで２０分間室温にて固定した。ＰＢＳ＋で希釈した１０％ヤギ血清で１時間ブロッキングを行った後、細胞を５μｇ／ｍｌ ＭＲＫ１６とともにインキュベートし、次いで蛍光標識二次抗体とともにインキュベートした。
＜ＰＣＲ＞
ＲＮＡを５種類のヒトＥＳ（ｈＥＳ）細胞株（ＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２、ＫｈＥＳ−３、ＫｈＥＳ−４、ＫｈＥＳ−５）および３種類のヒトｉＰＳ（ｈｉＰＳ）細胞株（ＩＭＲ９０−１、ＩＭＲ９０−４、２０１Ｂ７）から調製した。ファーストストランドｃＤＮＡを逆転写酵素（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて合成した。遺伝子
発現プロファイルを、４４種類のＡＢＣトランスポーターと４種類のハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ、１８Ｓ、ＨＰＲＴ１、ＧＵＳＢ）とをカバーするＴａｑＭａｎ Ａｒｒａｙ Ｇｅｎｅ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ９６−Ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅ，Ｈｕｍａｎ ＡＢＣ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により分析した。発現量をＧＡＰＤＨに対して標準化した。
ＲＮＡを５種類のヒトＥＳ（ｈＥＳ）細胞株（ＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２、ＫｈＥＳ−３、ＫｈＥＳ−４、ＫｈＥＳ−５）および３種類のヒトｉＰＳ（ｈｉＰＳ）細胞株（ＩＭＲ９０−１、ＩＭＲ９０−４、２０１Ｂ７）から調製した。ファーストストランドｃＤＮＡを逆転写酵素（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて合成した。遺伝子
発現プロファイルを、４４種類のＡＢＣトランスポーターと４種類のハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ、１８Ｓ、ＨＰＲＴ１、ＧＵＳＢ）とをカバーするＴａｑＭａｎ Ａｒｒａｙ Ｇｅｎｅ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ９６−Ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅ，Ｈｕｍａｎ ＡＢＣ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により分析した。発現量をＧＡＰＤＨに対して標準化した。
＜化合物１とともにインキュベートしたヒトＥＳ細胞および分化した細胞の、ＦＡＣＳ分析による評価＞
細胞を上記のように調製した。１μＭの化合物１で１時間染色した後、細胞をＰＢＳでリンスし、さらに２４時間培養した。ＤＰ７２を使用し、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１による蛍光顕微鏡観察を行った。化合物１による染色中およびその後の分析を行うまでの培養中、ＣｓＡを１０μＭの濃度で添加した。ＦＡＣＳ分析のため、細胞を氷冷ＰＢＳで二回洗浄した後、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて単一細胞に分離し、直接分析のための懸濁液を得た。未処理の未分化または分化したｈＥＳＣのベースラインを参照することにより、化合物１を含む細胞の割合を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）上で試験した。
細胞を上記のように調製した。１μＭの化合物１で１時間染色した後、細胞をＰＢＳでリンスし、さらに２４時間培養した。ＤＰ７２を使用し、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１による蛍光顕微鏡観察を行った。化合物１による染色中およびその後の分析を行うまでの培養中、ＣｓＡを１０μＭの濃度で添加した。ＦＡＣＳ分析のため、細胞を氷冷ＰＢＳで二回洗浄した後、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて単一細胞に分離し、直接分析のための懸濁液を得た。未処理の未分化または分化したｈＥＳＣのベースラインを参照することにより、化合物１を含む細胞の割合を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）上で試験した。
＜ヒトｉＰＳ細胞のスクリーニング＞
Ｙｏｕｎｇ−Ｔａｅ Ｃｈａｎｇのグループより蛍光化合物ライブラリーの提供を受けた（Ahn, Y-H., Lee, J-S. and Chang, Y-T. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 4510-4511）。ヒトｉＰＳ細胞（クローン＃２０１Ｂ２）を９６穴プレート内のＳＮＬフィーダー細胞上にプレーティングした。プレーティングして５日後、蛍光化合物を最終濃度４μＭで添加した。一晩インキュベートしたあと、蛍光顕微鏡像をＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐを用いて取得した。
Ｙｏｕｎｇ−Ｔａｅ Ｃｈａｎｇのグループより蛍光化合物ライブラリーの提供を受けた（Ahn, Y-H., Lee, J-S. and Chang, Y-T. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 4510-4511）。ヒトｉＰＳ細胞（クローン＃２０１Ｂ２）を９６穴プレート内のＳＮＬフィーダー細胞上にプレーティングした。プレーティングして５日後、蛍光化合物を最終濃度４μＭで添加した。一晩インキュベートしたあと、蛍光顕微鏡像をＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐを用いて取得した。
＜二次元ゲル電気泳動（２−ＤＥ）＞
ヒトｉＰＳ細胞を化合物１のクロロアセチル誘導体（化合物２２）（１μＭ）で４時間処理し、その後ＰＢＳで２回洗浄した。ＣＴＫ溶液（Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ）処理によってＳＮＬフィーダー細胞を除去した後、ヒトｉＰＳ細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ処理により回収した。ＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔＲ Ｃｙｔｏｓｏｌ／Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｋｉｔを添付の説明書に従って使用し、細胞ペレットからミトコンドリア分画を得た。Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ（ｐＨ３．５−１０，Ｐｈａｍａｌｙｔｅ
３−１０ ｆｏｒ ＩＥＦ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて等電点電気泳動（ＩＥＦ）を行った。その後、ＩＥＦストリップを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、二次元解析を行った。二次元蛍光イメージをＴｙｐｈｏｏｎ ９４００スキャナー（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅｓ）を用いて５３２ｎｍ／５８０ｎｍの励起／発光波長にて取得した。蛍光標識スポットをゲルから切り出し、質量分析を行った。
ヒトｉＰＳ細胞を化合物１のクロロアセチル誘導体（化合物２２）（１μＭ）で４時間処理し、その後ＰＢＳで２回洗浄した。ＣＴＫ溶液（Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ）処理によってＳＮＬフィーダー細胞を除去した後、ヒトｉＰＳ細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ処理により回収した。ＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔＲ Ｃｙｔｏｓｏｌ／Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｋｉｔを添付の説明書に従って使用し、細胞ペレットからミトコンドリア分画を得た。Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ（ｐＨ３．５−１０，Ｐｈａｍａｌｙｔｅ
３−１０ ｆｏｒ ＩＥＦ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて等電点電気泳動（ＩＥＦ）を行った。その後、ＩＥＦストリップを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、二次元解析を行った。二次元蛍光イメージをＴｙｐｈｏｏｎ ９４００スキャナー（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅｓ）を用いて５３２ｎｍ／５８０ｎｍの励起／発光波長にて取得した。蛍光標識スポットをゲルから切り出し、質量分析を行った。
＜部分的に分化したヒトｉＰＳ細胞の蛍光顕微鏡イメージング＞
ヒトｉＰＳ細胞（クローン＃２０１Ｂ７）を２４穴プレート内のＳＮＬフィーダー細胞上にプレーティングした。プレーティングから１日後、細胞を１μＭの化合物１とともに４時間３７℃にてインキュベートした。化合物１をＰＢＳによる洗浄で除いた後、細胞を９．６ｎＭ ＭｉｔｏＲｅｄとともに３０分間３７℃にてインキュベートした。細胞をＰＢＳでリンスし、新鮮な（色素を含まない）培地で保持した。蛍光顕微鏡像をＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｉｎｖｅｒｔ １００Ｍを用いて取得した。
ヒトｉＰＳ細胞（クローン＃２０１Ｂ７）を２４穴プレート内のＳＮＬフィーダー細胞上にプレーティングした。プレーティングから１日後、細胞を１μＭの化合物１とともに４時間３７℃にてインキュベートした。化合物１をＰＢＳによる洗浄で除いた後、細胞を９．６ｎＭ ＭｉｔｏＲｅｄとともに３０分間３７℃にてインキュベートした。細胞をＰＢＳでリンスし、新鮮な（色素を含まない）培地で保持した。蛍光顕微鏡像をＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｉｎｖｅｒｔ １００Ｍを用いて取得した。
＜化合物２３、２４、２５、および２２の合成＞
化合物２３
１，１０−ジクロロデカン（８．７３ｇ、４１．３ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（６ｍＬ）を、ＤＭＦ（４０ｍＬ）中のｍ−アミノフェノール（３．８５ｇ、３５．３ｍｍｏｌ）溶液に添加した。該混合物を１００℃で３日間撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で反応をクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出を行った。有機層を合わせて食塩水で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し（シリカゲル、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝９：１〜１：１）、表題化合物を得た（１．９２ｇ、６．７６ｍｍｏｌ、収率１９％）。褐色油；Ｒｆ＝０．５７（３３％ＥｔＯＡｃ−ｈｅｘａｎｅ）；１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．８４（ｓ，１Ｈ），６．８０（ｄｄ，Ｊ＝７．６，８．３Ｈｚ，１Ｈ），５．９７（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），５．９４（ｓ，１Ｈ），５．９２（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），５．３６（ｓ，１Ｈ），３．６１（ｍ，２Ｈ），２．８９（ｍ，２Ｈ），１．６９（ｍ，２Ｈ），１．４９（ｍ，２Ｈ），１．３５−１．２５（ｍ，１２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１５８．３，１５０．６，１２９．５，１０３．７，１０３．０，９８．９，４５．６，４３．１，３２．２，２９．２，２９．１×２，２８．９，２８．４，２６．９，２６．４；ＦＡＢＭＳ ｍ／ｚ ２８３［Ｍ＋］；Ｃ１６Ｈ２６ＮＯＣｌに対するＨＲＭＳ計算値［Ｍ＋］２８３．１７０３，測定値２８３．１７０８。
１，１０−ジクロロデカン（８．７３ｇ、４１．３ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（６ｍＬ）を、ＤＭＦ（４０ｍＬ）中のｍ−アミノフェノール（３．８５ｇ、３５．３ｍｍｏｌ）溶液に添加した。該混合物を１００℃で３日間撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で反応をクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出を行った。有機層を合わせて食塩水で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し（シリカゲル、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝９：１〜１：１）、表題化合物を得た（１．９２ｇ、６．７６ｍｍｏｌ、収率１９％）。褐色油；Ｒｆ＝０．５７（３３％ＥｔＯＡｃ−ｈｅｘａｎｅ）；１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．８４（ｓ，１Ｈ），６．８０（ｄｄ，Ｊ＝７．６，８．３Ｈｚ，１Ｈ），５．９７（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），５．９４（ｓ，１Ｈ），５．９２（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），５．３６（ｓ，１Ｈ），３．６１（ｍ，２Ｈ），２．８９（ｍ，２Ｈ），１．６９（ｍ，２Ｈ），１．４９（ｍ，２Ｈ），１．３５−１．２５（ｍ，１２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１５８．３，１５０．６，１２９．５，１０３．７，１０３．０，９８．９，４５．６，４３．１，３２．２，２９．２，２９．１×２，２８．９，２８．４，２６．９，２６．４；ＦＡＢＭＳ ｍ／ｚ ２８３［Ｍ＋］；Ｃ１６Ｈ２６ＮＯＣｌに対するＨＲＭＳ計算値［Ｍ＋］２８３．１７０３，測定値２８３．１７０８。
化合物２４
フタルイミドカリウム（１．８８ｇ、１０．１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）中の化合物２３（１．９２ｇ、６．７６ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。該混合物を１００℃で一晩撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で反応をクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出を行った。有機層を合わせて食塩水で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し（シリカゲル、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝５：１〜１：１）、表題化合物を得た（１．８３ｇ、４．６４ｍｍｏｌ、収率６９％）。褐色油；Ｒｆ＝０．５１（３３％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）；１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．８３（ｓ，１Ｈ），７．８３（ｍ，２Ｈ），７．８１（ｍ，２Ｈ），６．７９（ｄｄ，Ｊ＝８．３，７．６Ｈｚ，１Ｈ），５．９７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），５．９４（ｓ，１Ｈ），５．９１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），５．
３４（ｂｒｓ，１Ｈ），３．５４（ｍ，２Ｈ），２．８８（ｍ，２Ｈ），１．５６（ｍ，２Ｈ），１．４７（ｍ，２Ｈ），１．２９−１．２２（ｍ，１２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６８．１，１６８．３，１５０．６，１３４．５，１３１．８，１２９．５，１２３．１，１０３．７，１０３．１，９８．９，６０．９，４３．１，３７．５，３２．７，２９．２，２９．１，２９．０×２，２８．９，２８．７，２８．０，２６．９，２６．４，２５．７；ＦＡＢＭＳ ｍ／ｚ ３９４［Ｍ＋］；Ｃ２４Ｈ３０Ｎ２Ｏ３に対するＨＲＭＳ計算値［Ｍ＋］３９４．２２５６，実測値３９４．２２５０。
フタルイミドカリウム（１．８８ｇ、１０．１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）中の化合物２３（１．９２ｇ、６．７６ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。該混合物を１００℃で一晩撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で反応をクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出を行った。有機層を合わせて食塩水で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し（シリカゲル、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝５：１〜１：１）、表題化合物を得た（１．８３ｇ、４．６４ｍｍｏｌ、収率６９％）。褐色油；Ｒｆ＝０．５１（３３％ＥｔＯＡｃ−ヘキサン）；１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．８３（ｓ，１Ｈ），７．８３（ｍ，２Ｈ），７．８１（ｍ，２Ｈ），６．７９（ｄｄ，Ｊ＝８．３，７．６Ｈｚ，１Ｈ），５．９７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），５．９４（ｓ，１Ｈ），５．９１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），５．
３４（ｂｒｓ，１Ｈ），３．５４（ｍ，２Ｈ），２．８８（ｍ，２Ｈ），１．５６（ｍ，２Ｈ），１．４７（ｍ，２Ｈ），１．２９−１．２２（ｍ，１２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６８．１，１６８．３，１５０．６，１３４．５，１３１．８，１２９．５，１２３．１，１０３．７，１０３．１，９８．９，６０．９，４３．１，３７．５，３２．７，２９．２，２９．１，２９．０×２，２８．９，２８．７，２８．０，２６．９，２６．４，２５．７；ＦＡＢＭＳ ｍ／ｚ ３９４［Ｍ＋］；Ｃ２４Ｈ３０Ｎ２Ｏ３に対するＨＲＭＳ計算値［Ｍ＋］３９４．２２５６，実測値３９４．２２５０。
化合物２５
４−フルオロベンズアルデヒド（２４２ｇ、１．９５ｍｍｏｌ）およびｍ−アミノフェノール（２１３ｇ、１．９５ｍｍｏｌ）を６０％ Ｈ２ＳＯ４（１０ｍＬ）中の化合物２４（７７０ｇ、１．９５ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。該混合物を１３０℃で一晩撹拌した。反応液を氷水で希釈し、濾過した。沈殿物を蒸留水（ＤＷ）で洗浄し、メタノールに溶解し、減圧下で濃縮した。残渣をＨＰＬＣ（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３、ｍｅｔｈａｎｏｌ：０．１％ ＴＦＡ−ＤＷ＝０：１〜１：０）で精製し、表題化合物を得た（３４ｇ、０．０５９ｍｍｏｌ、収率３％）。紫色油；１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，酢酸−ｄ４）δ７．５１（ｄｄ，Ｊ＝８．９，５．５Ｈｚ，２Ｈ），７．４０（ｄｄ，Ｊ＝８．９，８．９Ｈｚ，２Ｈ），７．３１（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），６．９８−６．９３（ｍ，２Ｈ），３．４０（ｍ，２Ｈ），３．０４（ｍ，２Ｈ），１．７４−１．６７（ｍ，４Ｈ），１．４４−１．３２（ｍ，１２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６４．０，１６２．４，１５８．６，１５８．３，１５８．１，１５７．９，１３２．２，１３２．０８，１３２．０２，１２８．４，１１８．２，１１７．０，１１６．２，１１６．１，１１３．２，１１３．０，９７．３，９４．１，４３．０，３９．０，２９．１，２９．０×２，２８．９，２８．７，２８．２，２７．２，２６．６，２６．０；ＦＡＢＭＳ ｍ／ｚ ４６０［Ｍ＋］；Ｃ２９Ｈ３５ＦＮ３Ｏに対するＨＲＭＳ計算値［Ｍ＋］４６０．２７６４，実測値４６０．２７６５。
４−フルオロベンズアルデヒド（２４２ｇ、１．９５ｍｍｏｌ）およびｍ−アミノフェノール（２１３ｇ、１．９５ｍｍｏｌ）を６０％ Ｈ２ＳＯ４（１０ｍＬ）中の化合物２４（７７０ｇ、１．９５ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。該混合物を１３０℃で一晩撹拌した。反応液を氷水で希釈し、濾過した。沈殿物を蒸留水（ＤＷ）で洗浄し、メタノールに溶解し、減圧下で濃縮した。残渣をＨＰＬＣ（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３、ｍｅｔｈａｎｏｌ：０．１％ ＴＦＡ−ＤＷ＝０：１〜１：０）で精製し、表題化合物を得た（３４ｇ、０．０５９ｍｍｏｌ、収率３％）。紫色油；１Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，酢酸−ｄ４）δ７．５１（ｄｄ，Ｊ＝８．９，５．５Ｈｚ，２Ｈ），７．４０（ｄｄ，Ｊ＝８．９，８．９Ｈｚ，２Ｈ），７．３１（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），６．９８−６．９３（ｍ，２Ｈ），３．４０（ｍ，２Ｈ），３．０４（ｍ，２Ｈ），１．７４−１．６７（ｍ，４Ｈ），１．４４−１．３２（ｍ，１２Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６４．０，１６２．４，１５８．６，１５８．３，１５８．１，１５７．９，１３２．２，１３２．０８，１３２．０２，１２８．４，１１８．２，１１７．０，１１６．２，１１６．１，１１３．２，１１３．０，９７．３，９４．１，４３．０，３９．０，２９．１，２９．０×２，２８．９，２８．７，２８．２，２７．２，２６．６，２６．０；ＦＡＢＭＳ ｍ／ｚ ４６０［Ｍ＋］；Ｃ２９Ｈ３５ＦＮ３Ｏに対するＨＲＭＳ計算値［Ｍ＋］４６０．２７６４，実測値４６０．２７６５。
化合物２２
塩化クロロアセチル（３０μＬ、０．３９ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１００μＬ）をＤＭＦ（１．５ｍＬ）中の化合物２５（８２．５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。該混合物を３７℃で３日間撹拌した。反応液をメタノールで希釈し、濾過した。ろ液をＨＰＬＣ（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３、ｍｅｔｈａｎｏｌ：０．１％ＴＦＡ−ＤＷ＝０：１〜１：０）で精製し、表題化合物を得た（２１ｍｇ，０．０３２ｍｍｏｌ、収率２７％）。紫色油；ＦＡＢＭＳ ｍ／ｚ ５３６［Ｍ＋］；Ｃ３１Ｈ３６ＣｌＦＮ３Ｏ２に対するＨＲＭＳ計算値［Ｍ＋］５３６．２４８０，実測値５３６．２４８８。
塩化クロロアセチル（３０μＬ、０．３９ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１００μＬ）をＤＭＦ（１．５ｍＬ）中の化合物２５（８２．５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。該混合物を３７℃で３日間撹拌した。反応液をメタノールで希釈し、濾過した。ろ液をＨＰＬＣ（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３、ｍｅｔｈａｎｏｌ：０．１％ＴＦＡ−ＤＷ＝０：１〜１：０）で精製し、表題化合物を得た（２１ｍｇ，０．０３２ｍｍｏｌ、収率２７％）。紫色油；ＦＡＢＭＳ ｍ／ｚ ５３６［Ｍ＋］；Ｃ３１Ｈ３６ＣｌＦＮ３Ｏ２に対するＨＲＭＳ計算値［Ｍ＋］５３６．２４８０，実測値５３６．２４８８。
＜化合物３５の合成＞
化合物３５
Ｎ−メチルアミノフェノールを先の論文の通り合成した（Charng-Sheng Tsai, et al.,
Chem.Comm., 46, 5575-5577, 2010）。簡単に述べると、ＤＭＦ中のｍ−アミノフェノール（１．５１ｇ、１３．８４ｍｍｏｌ）、ＣＨ３Ｉ（２．１６ｇ、１５．２２ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（２．１０ｇ、１５．１９ｍｍｏｌ）を室温で１９時間撹拌した。該混合物を蒸留水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出を行った。有機層を合わせて食塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し（シリカゲル、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１：０〜３：７）、表題化合物を得た（褐色油、６５８ｍｇ、５．３４ｍｍｏｌ、収率３９％）。
Ｎ−メチルアミノフェノールを先の論文の通り合成した（Charng-Sheng Tsai, et al.,
Chem.Comm., 46, 5575-5577, 2010）。簡単に述べると、ＤＭＦ中のｍ−アミノフェノール（１．５１ｇ、１３．８４ｍｍｏｌ）、ＣＨ３Ｉ（２．１６ｇ、１５．２２ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（２．１０ｇ、１５．１９ｍｍｏｌ）を室温で１９時間撹拌した。該混合物を蒸留水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出を行った。有機層を合わせて食塩水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し（シリカゲル、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１：０〜３：７）、表題化合物を得た（褐色油、６５８ｍｇ、５．３４ｍｍｏｌ、収率３９％）。
上記Ｎ−メチルアミノフェノール（４１１ｍｇ、３．３４ｍｍｏｌ）をメタンスルホン酸（１１ｍＬ）中の４−フルオロベンズアルデヒド（１５０ｍｇ、１．２１ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。該混合物を１２０℃で２２時間撹拌した。反応液を蒸留水で希釈し、Ｋ２ＣＯ３で中和した。得られた混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を合わせて食塩水で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をＨＰＬＣ（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３、ｍｅｔｈａｎｏｌ：０．１％ＴＦＡ−ＤＷ＝０：１〜１：０）で精製し、表題化合物を得た（２３ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ、収率４％）。紫色油；１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ７．４５−７．３６（ｍ，４Ｈ），７．２１（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），６．８１（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，２Ｈ），６．６９（ｓ，２Ｈ），２．９９（ｓ，６Ｈ）。
＜化合物３６の合成＞
化合物３６
ｍ−アミノフェノール（１．３１ｇ、１２ｍｍｏｌ）をメタンスルホン酸（１２ｍＬ）中の２−フルオロベンズアルデヒド（５０２ｍｇ、４．０４ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。該混合物を１２０℃で２４時間撹拌した。反応液を蒸留水で希釈し、Ｋ２ＣＯ３で中和した。沈殿物を濾過し、メタノールに溶解した。得られた溶液をセライト濾過し、ろ液をＨＰＬＣ（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３、メタノール：０．１％ ＴＦＡ−ＤＷ＝０：１〜１：０）で精製し、表題化合物を得た（１０ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ、収率０．６％）。紫色油；１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ７．７６−７．６９（ｍ，１Ｈ），７．５１−７．４０（ｍ，３Ｈ），７．２４（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），６．８２（ｓ，２Ｈ）。
ｍ−アミノフェノール（１．３１ｇ、１２ｍｍｏｌ）をメタンスルホン酸（１２ｍＬ）中の２−フルオロベンズアルデヒド（５０２ｍｇ、４．０４ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。該混合物を１２０℃で２４時間撹拌した。反応液を蒸留水で希釈し、Ｋ２ＣＯ３で中和した。沈殿物を濾過し、メタノールに溶解した。得られた溶液をセライト濾過し、ろ液をＨＰＬＣ（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３、メタノール：０．１％ ＴＦＡ−ＤＷ＝０：１〜１：０）で精製し、表題化合物を得た（１０ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ、収率０．６％）。紫色油；１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ７．７６−７．６９（ｍ，１Ｈ），７．５１−７．４０（ｍ，３Ｈ），７．２４（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），６．８２（ｓ，２Ｈ）。
＜結果＞
ヒト多能性幹細胞に対して選択的な蛍光プローブを見いだすため、３２６種の蛍光化合物の化学ライブラリーをスクリーニングした。ヒトｉＰＳ細胞をフィーダー細胞よりも強く染色する３１種のローダミン系分子（表２に示す化合物１〜２１および２６〜３４）が、画像ベースのスクリーニングにより単離された（図１Ａ）。さらに、表２に示す合成化
合物３５および３６により、ヒトｉＰＳ細胞をフィーダー細胞よりも強く染色することができた（図１Ａ）。
ヒト多能性幹細胞に対して選択的な蛍光プローブを見いだすため、３２６種の蛍光化合物の化学ライブラリーをスクリーニングした。ヒトｉＰＳ細胞をフィーダー細胞よりも強く染色する３１種のローダミン系分子（表２に示す化合物１〜２１および２６〜３４）が、画像ベースのスクリーニングにより単離された（図１Ａ）。さらに、表２に示す合成化
合物３５および３６により、ヒトｉＰＳ細胞をフィーダー細胞よりも強く染色することができた（図１Ａ）。
化合物１のヒトｉＰＳ細胞に対する選択性をフローサイトメトリーにより定量的に分析した（図１Ｂ〜Ｄ）。ヒトｉＰＳ細胞とフィーダー細胞との混合物を、化合物１（図１Ｂ）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７標識抗ＳＳＥＡ−４抗体（図１Ｃ）、またはその両者（図１Ｄ）で処理した。フローサイトメトリーにより、化合物１陽性集団（４３．４％）が化合物１陰性集団（５６．６％）から明瞭に分離された。ＳＳＥＡ−４陽性（３７．６％）および陰性（６２．４％）集団は同様な分布パターンを示し、細胞が二重染色された際には基本的にすべてのＳＳＥＡ−４陽性細胞が化合物１によっても同時に染色された（４２．４％）が、ＳＳＥＡ−４陰性細胞はそうではなかった（５５．２％）。これらの結果は、化合物１はｉＰＳ細胞を特異的に染色することができ、ヒトｉＰＳ細胞のフィーダー細胞からの分離に好適に使用できることを示している。
ｉＰＳ細胞が過剰に増殖すると、ｉＰＳ細胞コロニーの中央部が分化を始め、ｉＰＳ細胞のドーナツ型コロニーが形成される傾向がある。化合物１ではこれらのコロニーの未分化の部分が選択的に染色されたが、前記中央部分は染色されなかった（図２ａ）。この観察を検証するため、ヒトＥＳ細胞を用いた同様な実験を行った。ヒトＥＳ細胞を化合物１で処理すると、ＥＳ細胞コロニーはフィーダー細胞よりも強く染色された（図２ｂ）。レチノイン酸による部分的な分化により、コロニーにより薄く染まった部分が生じた（図２ｃ）。これらの観察から、化合物１によって、分化した細胞から多能性幹細胞を区別することができる可能性が示唆された。
化合物１は細胞透過性であると思われ、その細胞内分布はミトコンドリアマーカーであるＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ（ＭｉｔｏＲｅｄ）の細胞内分布と重複する（Minamikawa, T. et al. J. Cell Sci. 1999, 112, 2419-2430）（図３ａ−ｄ）。ＭｉｔｏＲｅｄではヒトｉＰＳ細胞およびフィーダー細胞両者のミトコンドリアが染色されたが、化合物１ではｉＰＳ細胞のミトコンドリアのみが染色された。これらの結果は、化合物１がヒト多能性細胞のミトコンドリア中に局在することを示唆する。化合物１の染色を、ミトコンドリア膜電位を変化させる脱共役試薬であるＣＣＣＰ（Ｃａｒｂｏｎｙｌ ｃｙａｎｉｄｅ ｍ−ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ ｈｙｄｒａｚｏｎｅ）の存在下で試験した。化合物１の染色パターンはＣＣＣＰの存在下でも同一のままであった。この結果は、化合物１の染色特性が膜電位に依存しないものであることを示している（図３ｅ）。化合物１と相互作用するミトコンドリアタンパク質を単離するため、化合物１のクロロアセチル誘導体（化合物２２）を合成した。化合物２２の選択性は化合物１のものよりもやや低いが、ヒトｉＰＳ細胞のミトコンドリアにやはり局在する。染色されたミトコンドリアを化合物２２を用いた処理によってヒトｉＰＳ細胞から単離し、蛍光標識されたミトコンドリアタンパク質を二次元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。マスシークエンシング分析の結果、蛍光標識されたタンパク質のペプチド配列はこれまでに報告されているＡＤＨ１タンパク質のものであることが分かった（Kim, Y. K. et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 2761-2763）。しかし、ＡＤＨ１は数多くの細胞型で多量に発現される酵素であることから、化合物１の選択性のメカニズムは依然として不明である。
ヒトｉＰＳ細胞およびヒトＥＳ細胞の異物排出に関与する４種のＡＢＣタンパク質の発現パターンを、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって調べた（図４ａ）。これら両者のヒト多能性細胞がＡＢＣＣ１（ＭＲＰ１）およびＡＢＣＧ２を高度に発現していたが、ＡＢＣＢ１（ＭＤＲ１）およびＡＢＣＣ２（ＭＲＰ２）トランスポーターは（たとえ発現していたとしても）わずかしか発現していなかった。ヒトＥＳ細胞と、ヒトＥＳ細胞からレチノイン酸により調製された分化した細胞（ＣＤＸ２を高度に発現する栄養外胚葉様細胞）とで発現パターンの比較を行った（図４ｂ）。ＡＢＣＧ２およびＡＢＣＢ１（ＭＤＲ１）は分化し
た細胞において高度に発現していた（それぞれ２９倍および２４倍）。これらの結果は、ＡＢＣＢ１（ＭＤＲ１）が化合物１の排除に重要な役割を担っている可能性を示している。
た細胞において高度に発現していた（それぞれ２９倍および２４倍）。これらの結果は、ＡＢＣＢ１（ＭＤＲ１）が化合物１の排除に重要な役割を担っている可能性を示している。
ＭＤＲ１発現モデル細胞株（ＫＢ／ＭＤＲ１）を、ＭＤＲ１を発現しない細胞株であるＫＢ３−１から樹立した。ＫＢ／ＭＤＲ１およびＫＢ３−１を化合物１で２時間処理した。その後、蛍光顕微鏡下でそれらの画像を観察した（図４ｃ、４ｄ）。ＭＤＲ１を発現しないＫＢ３−１細胞は化合物１で強く染色されたが、ＭＢ／ＭＤＲ１細胞においては蛍光シグナルは検出不可能であった。すなわち、化合物１はＡＢＣＢ１（ＭＤＲ１）の優れた基質であることが示された。同様な実験をＡＢＣＧ２およびＡＢＣＣ１（ＭＲＰ１）で行った。ＡＢＣＧ２およびＡＢＣＣ１（ＭＲＰ１）の発現量に関わらず、化合物１によって細胞が染色された。すなわち、化合物１はこれら２種のトランスポーターの基質でなないことが示された。以上の結果を総合的に見ると、化合物１はＡＢＣＢ１（ＭＤＲ１）の選択的基質であり、ＡＢＣＢ１（ＭＤＲ１）の発現量によって化合物１による染色強度が変化することが示唆される。
化合物１の選択性と分化の際のＭＤＲ１誘導との関係を調べるため、ヒトＥＳ細胞とヒトＥＳ細胞からレチノイン酸によって得られた分化した細胞とを化合物１で処理した（図５ａ、ｂ）。ヒトＥＳ細胞は強い蛍光を示した一方で、分化した細胞は弱い蛍光しか示さなかった。細胞のフローサイトメトリー分析では、ヒトＥＳ細胞は分化した細胞の約１００倍の強度で染色された（図５ｃ）。同様なフローサイトメトリー分析を蛍光標識ＭＤＲ１抗体を用いて行ったところ、分化した細胞におけるＭＤＲ１の選択的発現が確認された（図５ｄ）。分化した細胞を化合物１および公知のＭＤＲ１阻害剤であるシクロスポリンＡで処理したところ、分化した細胞も化合物１で標識された（図５ｅ）。これらの結果を総合的に見ると、化合物１の選択性を決定するのは、ヒト多能性細胞では発現が抑制されており、分化の際に誘導されるＡＢＣＢ１（ＭＤＲ１）による選択的輸送であることがわかる。
ＫＰ−１による、ヒトＥＳ細胞由来造血細胞の染色が試験された（Takayama et al., Blood 111, 5298-5306, 2008 または Takayama et al., J Exp Med 207, 2817-2830, 2010）（図６Ａ）。ＦＡＣＳ分析の結果、ＫＰ−１によってＳＳＥＡ−４陽性ヒトＥＳ細胞と、ＣＤ４５、ＣＤ２３５、ＣＤ４１ａまたはＣＤ４３を発現するヒト初期造血細胞とが区別されることが示され、ＫＰ−１は初期造血をモニタリングするのに有用であることが示唆された。
次に、臨床的に重要な別の分化過程である心筋形成について、ＫＰ−１によるモニタリングが可能かどうか調べた。先の研究（Wang et al., Bba-Biomembranes 1461, 177-200,
2011）に記載の方法に変更を加えて心筋分化を行った。簡単に述べると、ヒトｉＰＳ細胞をヒトラミニン２１１（ＢｉｏＬａｍｉｎａ，Ｓｗｅｄｅｎ）でコートした３．５ｃｍの培養皿上で培養した。心筋コロニーの生成を促進するため、ＷＮＴシグナル伝達阻害剤を心筋分化３〜９日目に添加した。心筋コロニーを１５日目に回収し、浮遊培養で７〜１０日間培養した。フローサイトメトリーで確認したところ、ＫＰ−１によってヒトｉＰＳ細胞とヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞とを区別することができた（図６Ｂ）。ヒトｉＰＳ細胞に由来する心筋細胞における４４種のヒトＡＢＣトランスポーターの発現パターンをＲＴ−ＰＣＲによって調べた（図７Ａ）。驚くべき事に、ＡＢＣＧ２もＡＢＣＢ１も心筋形成中に誘導されなかった。代わりに、２種の細胞表面膜ＡＢＣトランスポーター、ＡＢＣＡ１およびＡＢＣＣ５が分化中に誘導された。ＡＢＣＤ３も誘導されたが、このペルオキシゾームＡＢＣタンパク質はＫＰ−１の選択性には関与していないと思われた。ＡＢＣＡ１およびＡＢＣＣ５がＫＰ−１の排出を引き起こす能力を、ＨＥＫ２９３細胞で各トランスポーターを過剰発現させることによって調べた。その結果、ＫＰ−１はＡＢＣＣ５の優れた基質である（図７Ｂ）が、ＡＢＣＡ１に対してはそうではないことが示された（図示せず）。ＫＰ−１は分化によって誘導される広範なＡＢＣトランスポーターの基質として作用する可能性がある。
ＫＰ−１による、ヒトＥＳ細胞由来造血細胞の染色が試験された（Takayama et al., Blood 111, 5298-5306, 2008 または Takayama et al., J Exp Med 207, 2817-2830, 2010）（図６Ａ）。ＦＡＣＳ分析の結果、ＫＰ−１によってＳＳＥＡ−４陽性ヒトＥＳ細胞と、ＣＤ４５、ＣＤ２３５、ＣＤ４１ａまたはＣＤ４３を発現するヒト初期造血細胞とが区別されることが示され、ＫＰ−１は初期造血をモニタリングするのに有用であることが示唆された。
次に、臨床的に重要な別の分化過程である心筋形成について、ＫＰ−１によるモニタリングが可能かどうか調べた。先の研究（Wang et al., Bba-Biomembranes 1461, 177-200,
2011）に記載の方法に変更を加えて心筋分化を行った。簡単に述べると、ヒトｉＰＳ細胞をヒトラミニン２１１（ＢｉｏＬａｍｉｎａ，Ｓｗｅｄｅｎ）でコートした３．５ｃｍの培養皿上で培養した。心筋コロニーの生成を促進するため、ＷＮＴシグナル伝達阻害剤を心筋分化３〜９日目に添加した。心筋コロニーを１５日目に回収し、浮遊培養で７〜１０日間培養した。フローサイトメトリーで確認したところ、ＫＰ−１によってヒトｉＰＳ細胞とヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞とを区別することができた（図６Ｂ）。ヒトｉＰＳ細胞に由来する心筋細胞における４４種のヒトＡＢＣトランスポーターの発現パターンをＲＴ−ＰＣＲによって調べた（図７Ａ）。驚くべき事に、ＡＢＣＧ２もＡＢＣＢ１も心筋形成中に誘導されなかった。代わりに、２種の細胞表面膜ＡＢＣトランスポーター、ＡＢＣＡ１およびＡＢＣＣ５が分化中に誘導された。ＡＢＣＤ３も誘導されたが、このペルオキシゾームＡＢＣタンパク質はＫＰ−１の選択性には関与していないと思われた。ＡＢＣＡ１およびＡＢＣＣ５がＫＰ−１の排出を引き起こす能力を、ＨＥＫ２９３細胞で各トランスポーターを過剰発現させることによって調べた。その結果、ＫＰ−１はＡＢＣＣ５の優れた基質である（図７Ｂ）が、ＡＢＣＡ１に対してはそうではないことが示された（図示せず）。ＫＰ−１は分化によって誘導される広範なＡＢＣトランスポーターの基質として作用する可能性がある。
Claims (15)
- 以下の工程を含む、多能性細胞を選別する方法：
（ｉ）細胞試料を、ＭＤＲ１トランスポーターを介して多能性細胞から排除される化合物と接触させる工程；および
（ｉｉ）前記化合物を蓄積した細胞を、多能性細胞として検出する工程。 - 前記化合物が式（Ｉ）
［式中、
Ｒ１は式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）：
（ここで、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９はそれぞれ水素、ハロゲン、炭素数１〜６のアルキル、フェニル、−ＯＲ１０および−ＳＲ１０からなる群より選択され、Ｒ１０は炭素数１〜６のアルキルまたはアリールである）
からなる群より選択され；
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ水素、炭素数１〜６のアルキルおよび−（ＣＨ２）ｍＮＲ１１Ｒ１２からなる群より選択され、ここでｍは１〜１２の整数であり、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ水素、炭素数１〜６のアルキルおよびクロロアセチルからなる群より選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、Ｒ２およびＲ３が結合する窒素原子と共に式（Ｖ）：
（Ｖ）（ｌは１〜６の整数である）
の環状構造を形成し；
ＸはＯ、Ｓ、ＮＨおよびＮＲ１３（Ｒ１３は炭素数１〜６のアルキル）からなる群より選択される］
の構造を有する、請求項１記載の方法。 - Ｒ２およびＲ３がそれぞれ水素、メチル、エチル、ジメチルアミノエチルおよび１０−クロロアセチルアミノデシルからなる群より選択されるか、またはＲ２およびＲ３が１−ピペリジニルの環状構造を形成し；
Ｒ４がメチルであり；
Ｒ５が水素、フッ素、メトキシ、フェノキシ、メチルチオ、メチル、プロピルおよびフェニルからなる群より選択され；
Ｒ６およびＲ７がそれぞれ水素、フッ素、塩素、メトキシおよびメチルからなる群より選択され；
Ｒ８がフッ素であり；
Ｒ９がメトキシであり；そして
ＸがＯ、Ｓおよびメチルアミノからなる群より選択される；
請求項２記載の方法。 - 前記化合物が以下の表１に示す式からなる群より選択される、請求項３記載の方法。
- 前記化合物が次の式：
である、請求項４記載の方法。 - 前記細胞試料が初期化因子を導入した体細胞である、請求項１記載の方法。
- 前記初期化因子がＯｃｔファミリー遺伝子またはその遺伝子産物、Ｓｏｘファミリー遺伝子またはその遺伝子産物、Ｋｌｆ４ファミリー遺伝子またはその遺伝子産物、およびＭｙｃファミリー遺伝子またはその遺伝子産物、からなる群より選択される少なくとも１つの因子である、請求項６記載の方法。
- 前記細胞試料が、体細胞への分化を誘導された多能性細胞からなる、請求項１記載の方法。
- 請求項１記載の方法により多能性細胞を選別し、選別された前記細胞を選択する工程を含む、多能性細胞を選択する方法。
- 請求項１記載の方法により多能性細胞を選別し、選別された前記細胞を細胞試料から排除する工程を含む、分化した細胞を選択する方法。
- ＭＤＲ１トランスポーターを介して多能性細胞から排除される化合物を含む、多能性細胞を選別するためのキット。
- 前記化合物が式（Ｉ）：
［式中、
Ｒ１は式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）：
（ここで、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９はそれぞれ水素、ハロゲン、炭素数１〜６のアルキル、フェニル、−ＯＲ１０および−ＳＲ１０からなる群より選択され、Ｒ１０は炭素数１〜６のアルキルまたはアリールである）
からなる群より選択され；
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ水素、炭素数１〜６のアルキルおよび−（ＣＨ２）ｍＮＲ１１Ｒ１２からなる群より選択され、ここでｍは１〜１２の整数であり、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ水素、炭素数１〜６のアルキルおよびクロロアセチルからなる群より
選択されるか、またはＲ２およびＲ３は、Ｒ２およびＲ３が結合する窒素原子と共に式（Ｖ）：
（Ｖ）（ｌは１〜６の整数である）
の環状構造を形成し；
ＸはＯ、Ｓ、ＮＨおよびＮＲ１３（Ｒ１３は炭素数１〜６のアルキル）からなる群より選択される］
の構造を有する、請求項１１記載のキット。 - Ｒ２およびＲ３がそれぞれ水素、メチル、エチル、ジメチルアミノエチルおよび１０−クロロアセチルアミノデシルからなる群より選択されるか、またはＲ２およびＲ３が１−ピペリジニルの環状構造を形成し；
Ｒ４がメチルであり；
Ｒ５が水素、フッ素、メトキシ、フェノキシ、メチルチオ、メチル、プロピルおよびフェニルからなる群より選択され；
Ｒ６およびＲ７がそれぞれ水素、フッ素、塩素、メトキシおよびメチルからなる群より選択され；
Ｒ８がフッ素であり；
Ｒ９がメトキシであり；そして
ＸがＯ、Ｓおよびメチルアミノからなる群より選択される；
請求項１２記載のキット。 - 前記化合物が表１に示す式からなる群より選択される、請求項１３記載のキット。
- 前記化合物が次の式：
である、請求項１４記載のキット。
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| JPN6017012022; ＮＡＴＵＲＥ ＭＥＴＨＯＤＳ Ｖｏｌ． ７， Ｎｏ． １, 201001, ｐ． ６１-６６ * |
| JPN6017012023; Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｖｏｌ． １２９, 2007, ｐ． ４５１０， ４５１１ * |
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