JP2015221820A - Bリンパ球上のヒトmIgEに結合可能な抗CεmX抗体 - Google Patents
Bリンパ球上のヒトmIgEに結合可能な抗CεmX抗体 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】ヒト膜結合イプシロン鎖上のCH4ドメインとC末端膜アンカーペプチドとの間に位置する52アミノ酸のCεmXドメインは、mIgEを発現するB細胞の免疫標的化の抗原部位の一つであることが示唆されていた。CεmXのC末端でRADWPGPPペプチドと結合するa20を含む従来報告されていたモノクローナル抗体は、現在では、ヒトB細胞上のmIgEとの結合が弱いことが見出されている。出願人らは、CεmXのGLAGGSAQSQRAPDRVL及びHSGQQQGLPRAAGGSVPHPR等の所定の断片に特異的なモノクローナル抗体のみが、ヒトB細胞上のmIgEに有効に結合し得ること、ひいてはIgEが介在する疾患の処置のためにB細胞を標的化する用途に有用であることを見出した。
【選択図】図1
Description
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抗CεmX免疫応答を誘導するために、BALB/cマウスを、説明書に従って、TiterMax Gold adjuvant (Sigma-Aldrich)中で乳化した、50μgのn-ウンデシル−β−d−マルトピラノシド(UDM;Anatrace)可溶化mIgE.FcL組換えタンパク質を用いて、皮下投与により、2週間の間隔で、2回免疫化した。出願人らは、マウスが優勢なRADWPGPPエピトープに対してのみ抗体を産生することのないように、超免疫化(hyper-immunization)プロトコールの使用を避けた。0.1mgのUDM可溶化mIgE.FcL組換えタンパク質を、アジュバント無しで腹腔内投与して、最終的なブーストが与えられた。融合の1日前、NSO細胞を、10%ウシ胎児不活化血清(FBS; Invitrogen)及び1%ペニシリン−ストレプトマイシン(100x Pen-Strep solution; Invitrogen)混合物を添加した新鮮なDMEM培地(Invitrogen)中に、5x105 cells/mlの細胞密度で再播種した。最後のブーストの3日後、免疫化したマウス2頭の脾臓細胞を回収し、無血清DMEM培地で2回洗浄した。5x107個のNSO細胞を回収し、無血清DMEM培地で2回洗浄した。洗浄後、脾臓細胞及びNSO細胞に、予め温めておいた50%ポリエチレングリコール1500(PEG 1500, Roche Applied Science)を添加して融合させ、1分間ピペットチップを用いて静かに細胞を攪拌し、更に1分間攪拌し、2mlの予め温めておいた無血清DMEMを2分間かけて添加し、そして最後に8mlの予め温めておいた無血清DMEMを2分間かけて添加した。200xgで10分間遠心分離した後、融合した細胞を、600mlのHAT培地[2%ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン混合物(50 x HAT solution; Invitrogen)、10% BM-Condimed H1(Roche Applied Science)、10%不活化FBS、及び1%ペニシリン−ストレプトマイシン混合物を添加したDMEM培地]に再懸濁し、200μl/ウェルずつ、96ウェル培養プレート30枚に分注した。3日目に、各ウェルに100μlのHAT培地を添加した。7日目及び10日目に、各ウェルの培地の半量を吸引し、同量のHAT培地を添加して、培地をリフレッシュした。14日目に、ハイブリドーマの上澄を用いて、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)により、UDM可溶化mIgE.FcL又はmIgE.Fcsタンパク質に結合する抗CεmX mAbsのスクリーニングを行った。
出願人らは、更に、mεL(CH2-CM)又はmεs(CH2-CM)のいずれかをコードする組換えDNAをトランスフェクションしたCHO及びRamos細胞株に結合する多数のCεmX特異的モノクローナル抗体の性能を試験した。トランスフェクションされた2つのCHO細胞株はそれぞれmIgE.FcL又はmIgE.Fcsを生産したが、いずれもIgα及びIgβ等の副受容体と完全なB細胞受容体を形成しなかった。CHO細胞はそれらのタンパク質を発現しなかったためである。トランスフェクションされたRamos細胞株は、それぞれmIgE.FcL又はmIgE.Fcsを生産したが、いずれも内在(native)副受容体と複合体を形成した。抗CεmX mAbsの内在CεmXに対する結合を調査するために、mIgE.FcL又はmIgE.Fcsのいずれかを発現するCHO又はRamos細胞を、FACS緩衝剤[PBS、1% FBS、0.1%アジ化ナトリウム、及び2mM EDTA(pH8.0)]に、107 cells/mlの密度で再懸濁した。そして、106個の細胞を、100μlのハイブリドーマ上澄と、氷上で30分間インキュベーションし、続いてFACS緩衝剤で洗浄した。結合した抗体を、マウスIgGに対するFITC標識ウサギF(ab')2断片特異的抗体(AbD Secrotec)と氷上で30分間インキュベーションし、続いてFACS緩衝剤で2回洗浄したものを解析することにより検出した。FACSCanto IIフローサイトメーター(BD Bioscience)を使用してフローサイトメトリー試験を行い、そしてFCSExpressソフトウェア(De Novo Software)を使用して解析を行った。全てのCεmX特異的モノクローナル抗体において、mIgE.Fcsを発現するCHO及びRamos細胞に対する結合は確認されなかった。全てのCεmX特異的モノクローナル抗体は、mIgELを発現するCHO細胞に結合することが判明した。しかしながら、4B12及び26H2のみ、mIgE.FcLを発現するRamos細胞に結合したが、他の全てのCεmX特異的モノクローナル抗体は、を発現するRamos細胞に結合できなかった(図2)。
キメラ抗CεmX mAbsのADCC活性を調査するために、出願人らは、末梢血単核細胞(PBMC)をエフェクター細胞として使用して、mIgE.FcLを発現するRamos細胞を標的化した。健康なドナーの軟膜(Taiwan Blood Service Foundation)から、Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare)を用いた密度勾配遠心により、PBMCを精製し、これを90% FBS/10% DMSO (Hybri-Max(商標); Sigma- Aldrich)中で冷凍保存した。使用の前に、PBMCを融解し、2x106 cells/mlで、10%熱不活化FBS及び1%ペニシリン−ストレプトマイシン混合物を添加したMIDM培地(Invitrogen)中、一昼夜培養した。PBMCと共培養される標的細胞を特定するために、mIgE.FcL発現Ramos細胞を、0.1% BSA/PBS中の2.5μMの5−(及び−6)−カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル(CFDA, SE; Invitrogen)で、10分間、37℃で標識した。10%FBSを含有する冷却RPMI培地(Invitrogen)で3回洗浄した後、細胞を105 cells/mlに調整した。エフェクター−標的(E/T)比を滴定するために、200μlの完全RPMI培地中の20000個の標識した細胞を、1μg/mlの抗体に37℃で30分間曝露し、続いてこれを、同体積のPBMCと、50〜3.125の複数のE/T比で組み合わせた。抗体の滴定のために、完全RPMI培地200μl中の20000個のラベルした細胞を、様々な濃度の抗体(1000〜0.01 ng/ml)で、37℃で30分間オプソニン化して、続いて、E/T比25:1で、PBMCと組み合わせた。抗体非依存的な細胞死を測定するために、ラベルした標的細胞を、所定のE/T比で、抗体非存在下で、PBMCと組み合わせた。24時間のインキュベーションを終えて、氷上で15分間、死んだ細胞を2.5μg/mlの7−アミノアクチノマイシン(7-AAD; Invitrogen)で染色した。細胞を、Becton Dickinson FACSCanto IIフローサイトメーターで解析した。生きた標的細胞は、ドットプロット解析上で、CFSE-陽性/7-AAD-陰性のパーセンテージとして定義された。所定のE/T比で死んだ細胞のパーセンテージは、以下の式に従って計算された:
100x[(抗体非依存的対照中の生きた標的細胞の%−試料中の生きた標的細胞の%)/抗体非依存的対照中の生きた標的細胞の%]
c4B12、c26H2及びオマリズマブのADCC活性は、複数のE/T比で観察された。E/T比が50であるとき、c4B12、c26H2及びオマリズマブは60%の特異的溶解を引き起こし;一方、ca20の活性は低く、引き起こされた特異的溶解は僅か20%であった(図3A)。c4B12及びc26H2の濃度が0.01 μg/mlを超える場合、顕著なADCCが観察された。最大用量の10μg/mlにおいて、c4B12及びc26H2による標的細胞の特異的溶解は80〜90%で、一方ca20の特異的溶解は50%であった(図3B)。CD20を指向する陽性対照リツキシマブ及びオマリズマブは、複数のE/T比で、濃度依存的に、ADCCを効果的に誘導した。従って、出願人らは、c4B12及びc26H2は、ADCCの誘導において、ca20よりも強力な抗CεmX mAbsであって、インビボでmIgE発現B細胞を標的とするためのエフェクターを効率的に集合させることが出来る。
ホスファチジルセリン(PS)露出(exposure)を検出するために、mIgE.FcL-発現Ramos細胞(5x105 cell/ml)を、所定の濃度で、完全培養培地中、1時間、37℃で、キメラ抗CεmXmAbs、オマリズマブ又は対照抗体とインキュベーションした。続いて細胞を、濃度10μg/mlのヒトIgGのFc断片に特異的なヤギF(ab')2断片(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.)で処理し、更に、37℃で24時間インキュベーションした。ホスファチジルセリン(PS)露出の検出は、1/200に希釈したフルオレセインイソチオシアネート(FITC)ラベルアネキシンV(Bio Vision)、及び2.5μg/mlプロビジウムヨーダイド(PI, Sigma- Aldrich)を含有する200μlのアネキシン緩衝剤中で、細胞を暗所、室温で15分間染色することにより評価された。細胞は、FACSCanto IIフローサイトメーター上で解析された。アポトーシス細胞は、ドットプロット解析上で、アネキシンV陰性/PI陽性細胞のパーセンテージとして検出された。mIgE.FcL発現Ramos細胞の約80%は、c4B12、c26H2、又はオマリズマブの濃度を増大させることによりアポトーシスで死滅したが、ca20の場合、最大で1μg/mlを与えてもそのようにならなかった(図4A)。
Claims (15)
- ヒトBリンパ球上の膜結合IgEと結合可能で、かつRADWPGPPペプチドと結合不可能な、CεmX-特異的抗体。
- マウスモノクローナル抗体である、請求項1に記載の抗体。
- マウスモノクローナル抗体の可変領域及びヒト抗体の定常領域を含むキメラ抗体である、請求項1に記載の抗体。
- 本質的にマウスモノクローナル抗体の超可変領域、並びにヒト抗体のフレームワーク領域及び定常領域を含む、請求項1に記載の抗体。
- ヒト抗体である、請求項1に記載の抗体。
- 請求項1に記載のCεmX-特異的抗体の断片であって、ヒトBリンパ球上の膜結合IgEと結合可能で、かつRADWPGPPペプチドと結合不可能な断片。
- Fab、F(ab)'2、又は単鎖Fvである、請求項6に記載の抗体の断片。
- 請求項1に記載の抗体を用いてIgE介在性疾患を処置する治療方法。
- 前記IgE介在性疾患がアレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、又はアトピー性皮膚炎である、請求項8に記載の治療方法。
- 前記IgE介在性疾患が、冷却誘導性のじんましん、慢性じんましん、コリン性じんましん、慢性鼻副鼻腔炎、全身性脂肪細胞症、皮膚脂肪細胞症、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、再発性特発性血管性浮腫、及び間質性膀胱炎、又は好酸球関連胃腸障害である、請求項8に記載の治療方法。
- GLAGGSAQSQRAPDRVL、又は同様の抗原的特徴を有する類似体と結合する、請求項1に記載の抗体。
- HSGQQQGLPRAAGGSVPHPR、又は同様の抗原的特徴を有する類似体と結合する、請求項1に記載の抗体。
- GLAGGSAQSQRAPDRVLを含む免疫原又は同様の抗原的特徴を有する類似体を用いて、インビボで患者の免疫応答を誘導する治療方法。
- HSGQQQGLPRAAGGSVPHPRを含む免疫原又は同様の抗原的特徴を有する類似体を用いて、インビボで患者の免疫応答を誘導する治療方法。
- GLAGGSAQSQRAPDRVLを含む免疫原又は同様の抗原的特徴を有する類似体、及びHSGQQQGLPRAAGGSVPHPRを含む免疫原又は同様の抗原的特徴を有する類似体を用いて、インビボで患者の免疫応答を誘導する治療方法。
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