JP2015174843A - 細胞死促進剤 - Google Patents

Abstract

【課題】副作用が少なく、かつ、所望の細胞を効果的に殺傷することができる細胞死促進剤を提供する。【解決手段】ＥＬＡモチーフを少なくとも一部分として含んでいるタンパク質、または、上記タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを少なくとも一部分として含んでいる核酸、を含んでいる細胞死促進剤を用いる。【選択図】なし

Description

本発明は、各種薬剤または各種刺激との相乗効果によって、細胞死を促進させることができる細胞死促進剤に関する。

癌は、ヒトの死因の多くを占める疾患であって、従来から、癌の治療に用いられる薬剤の開発が精力的に進められている。

癌の治療に用いられる薬剤には、様々な機序によって癌細胞を殺傷する、様々な種類の薬剤が存在している。

例えば、ＤＮＡの合成を阻害することによって癌細胞を殺傷する薬剤、細胞分裂を阻害することによって癌細胞を殺傷する薬剤、ＤＮＡ（染色体）に損傷を与えることによって癌細胞を殺傷する薬剤、癌細胞内の代謝に拮抗することによって癌細胞を殺傷する薬剤、および、栄養を阻害することによって癌細胞を殺傷する薬剤、等が存在している（非特許文献１および２参照）。

しかしながら、従来の癌の治療に用いられる薬剤は、薬剤自体が毒性を有していることが多く、それ故に、当該薬剤が投与された患者において、深刻な副作用を生じる場合が多々ある。

従来の薬剤の副作用を抑えようとすれば、患者に投与する薬剤の量を少なくすることが考えられる。しかしながら、この場合、副作用を抑えることができる反面、癌細胞を効果的に殺傷することができなくなり、治療効果が低下するという問題が生じる。

それ故に、現在、副作用が少なく、かつ、癌細胞を効果的に殺傷することができる薬剤の開発に注目が集まっている。

N J Curtin, "Inhibiting the DNA damage response as a therapeutic manoeuvre in cancer" British Journal of Pharmacology, （2013）, 169 , 1745-1765 Khurum H. Khan et al., "Cancer therapeutics: Targeting the apoptotic pathway", Critical Reviews in Oncology / Hematology, (2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.critrevonc.2013.12.012

上述したように、副作用が少なく、かつ、癌細胞を効果的に殺傷することができる薬剤の開発に注目が集まっているものの、このような薬剤の開発には至っていないのが現状である。

副作用が少なく、かつ、癌細胞を効果的に殺傷することができる薬剤を開発することができれば、癌に苦しんでいる膨大な数の患者を救うことができ、医療分野に対して大きく貢献することができる。

また、上述したような薬剤は、癌細胞のみならず、所望の細胞のみを特異的に殺傷することができる薬剤として機能することが期待される。

例えば、分子生物学などの分野では、細胞集団の中の特定の細胞のみを殺傷し、その後の細胞集団に生じた事象を観察することによって、殺傷された特定の細胞の機能が解明される場合がある。それ故に、副作用が少なく、かつ、癌細胞を効果的に殺傷することができる薬剤を開発することができれば、医療分野のみならず、分子生物学などの学術分野に対しても大きく貢献することができる。

本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、副作用が少なく、かつ、所望の細胞を効果的に殺傷することができる細胞死促進剤を提供することにある。

本発明者らは、細胞周期を研究する過程において、サイクリンと、ＰＰ２Ａ（Protein Phosphatase 2A）のＢ'γサブユニットとが結合することに着目し、当該結合を阻害することができれば細胞を殺すことができるのではないか、との独自の仮説の元、更なる研究を進めた。

そして、サイクリンと、ＰＰ２Ａ（Protein Phosphatase 2A）のＢ'γサブユニットとの結合を阻害する物質を用いれば、ＤＮＡに損傷を負った細胞を効果的に殺すことができることを見出し、本発明を完成させるに至った。

本発明の細胞死促進剤は、上記課題を解決するために、ＥＬＡモチーフを少なくとも一部分として含んでいるタンパク質、または、上記タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを少なくとも一部分として含んでいる核酸、を含んでいることを特徴としている。

本発明の細胞死促進剤は、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のポリペプチドを少なくとも一部分として含んでいるタンパク質、または、上記タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを少なくとも一部分として含んでいる核酸、を含んでいることが好ましい。つまり、
（ａ）配列番号１または２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１または２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、サイクリンとＰＰ２Ａ Ｂ’γサブユニットとの結合を阻害するポリペプチド。

本発明の細胞死促進剤は、投与対象が、ＤＮＡ二本鎖切断を発症している生体、または、ＤＮＡ二本鎖切断を発症させるための処置が施される生体、であることが好ましい。

本発明の細胞死促進剤では、上記生体は、γ線照射、Ｘ線照射、トポイソメラーゼＩ阻害剤の投与（例えば、カンプトテシン投与、イリノテカン投与）、または、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤の投与（例えば、エトポシド投与）によって、ＤＮＡ二本鎖切断を発症している生体、または、ＤＮＡ二本鎖切断を発症させるための処置が施される生体であることが好ましい。

本発明の細胞死促進剤は、ＤＮＡ二本鎖切断を発症させる薬剤を含んでいることが好ましい。

本発明の細胞死促進剤では、上記薬剤は、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、カンプトテシン、イリノテカン）およびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、エトポシド）からなる群より選択される少なくとも１つであることが好ましい。

本発明の細胞死促進剤では、上記タンパク質をコードしているポリヌクレオチドは、以下の（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡを少なくとも一部分として含んでいるポリヌクレオチドであることが好ましい。つまり、
（ｃ）配列番号３または４に示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号３または４に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、サイクリンとＰＰ２Ａ Ｂ’γサブユニットとの結合を阻害するポリペプチドをコードするＤＮＡ。

本発明の細胞死促進剤では、上記タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを少なくとも一部分として含んでいる核酸は、発現ベクター内に、上記タンパク質をコードしているポリヌクレオチドが挿入されたものであることが好ましい。

本発明の細胞死促進剤では、上記発現ベクターは、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター（例えば、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および、レトロウイスルベクター）、または、ウイルス粒子であることが好ましい。

本発明の細胞死促進剤は、アポトーシスを誘導するものであることが好ましい。

本発明は、ＤＮＡに損傷（例えば、ＤＮＡ二本鎖切断）を負った細胞を、特異的に、かつ、効率よく死滅させることができるという効果を奏する。

抗癌剤は多種多様であって、様々な機序によって癌細胞を殺す。例えば、抗癌剤の中には、癌細胞のＤＮＡに対して損傷（例えば、ＤＮＡ二本鎖切断）を負わせることによって、当該癌細胞を殺すものがある。このような抗癌剤と本発明の細胞死促進剤とを併用すれば、ＤＮＡに対して損傷を負った癌細胞を、特異的に、かつ、効率よく殺すことができる。

本発明は、副作用が極めて少なく生体にとって安全な細胞死促進剤を実現することができるという効果を奏する。

具体的には、本発明では、副作用が極めて少なく生体にとって安全なポリペプチド（具体的には、実施例に記載のＥＬＡＳ１およびＥＬＡＳ２参照）を利用するので、副作用が極めて少なく、生体にとって安全な薬学的組成物を実現することができるという効果を奏する。

本発明の細胞死促進剤は、サイクリンＧ１またはサイクリンＧ２の機能を阻害する可能性がある。しかしながら、サイクリンＧ１のノックアウトマウス、サイクリンＧ２のノックアウトマウス、および、サイクリンＧ１およびサイクリンＧ２のダブルノックアウトマウスの何れもが、正常に誕生して健常に生育する。また、これらのノックアウトマウスは、野生型のマウスと比較して、化学発癌剤を投与しても肝臓癌ができにくい。このことは、たとえ、本発明の細胞死促進剤がサイクリンＧ１またはサイクリンＧ２の機能を阻害したとしても、本発明の細胞致死促進剤が生体にとって安全であることを示している。

更に、本発明は、薬剤（例えば、ＤＮＡ二本鎖切断を発生させる薬剤）に対する生体の感受性を高めることができるので、少ない量の薬剤によって、十分に当該薬剤の効果を発揮させることができる。つまり、本発明は、使用する薬剤の量を少なくすることができるので、生体において、薬剤による副作用が発生することを防ぐことができる。

例えば、現在使用されている抗癌剤は、副作用が深刻なものが数多くある。副作用を低減させようとすれば、生体に投与する薬剤の量を減らす必要があるが、生体へ投与する薬剤の量を減らすと、抗癌効果が低下してしまう。この場合、本発明の細胞死促進剤を用いれば、副作用の低減と、十分な抗癌効果との両方を同時に実現することができる。

本発明の実施例に用いた様々なポリペプチドの構造を示す図である。 本発明の実施例における、結合ドメインを決定するための試験の結果を示す図である。 本発明の実施例における、結合ドメインを決定するための試験の結果を示す図である。 本発明の実施例における、結合阻害試験の結果を示す図である。 本発明の実施例における、ノックアウトマウスの作製ストラテジーを示す図である。 本発明の実施例において、ノックアウトマウスの肝臓に生じた腫瘍を示す図である。 本発明の実施例において、ノックアウトマウスの肝臓に生じた腫瘍の特徴を示す図である。 本発明の実施例における、ＥＬＡＳ１およびＥＬＡＳ２の副作用に関する試験の結果を示す図である。 本発明の実施例における、γ線によるアポトーシスの誘導試験の結果を示す図である。 本発明の実施例における、薬剤によるアポトーシスの誘導試験の結果を示す図である。 本発明の実施例における、薬剤によるアポトーシスの誘導試験の結果を示す図である。 本発明の実施例における、薬剤によるアポトーシスの誘導試験の結果を示す図である。

本発明は、以下に説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。

なお、本明細書において「Ａ〜Ｂ」と記載した場合には、当該記載は「Ａ以上Ｂ以下」を意図するものとする。

〔１．細胞死促進剤〕
本発明の細胞死促進剤は、それ自体は生体にとって非常に安全なものであるが、他の薬剤または刺激等と併用することによって、所望の細胞を効果的に殺す（具体的には、アポトーシス）ことができる。本発明の細胞死促進剤の実施形態の一例について、以下に説明する。

本実施の形態の細胞促進剤は、サイクリンとＰＰ２Ａ Ｂ’γサブユニットとの結合を阻害する物質を含んでいる。

更に具体的には、本実施の形態の細胞死促進剤は、ＥＬＡモチーフを少なくとも一部分として含んでいるタンパク質、または、上記タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを少なくとも一部分として含んでいる核酸、を含んでいる。

「ＥＬＡモチーフ（EGF/Erb1-like Auto-phosphorylation motif）」とは、サイクリンのＣ末端近傍に存在する２３個のアミノ酸からなる領域を意図する。

「ＥＬＡモチーフ」としては、例えば、配列番号１または２に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から１番目から２３番目のアミノ酸に対応するポリペプチド、および、当該ポリペプチドにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、を挙げることができる。

本実施の形態の細胞死促進剤は、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のポリペプチドを少なくとも一部分として含んでいるタンパク質（上述した、ＥＬＡモチーフを少なくとも一部分として含んでいるタンパク質に対応）、または、上記タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを少なくとも一部分として含んでいる核酸（上述した、ＥＬＡモチーフを少なくとも一部分として含んでいるタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを少なくとも一部分として含んでいる核酸に対応）、を含んでいてもよい。つまり、
（ａ）配列番号１または２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１または２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、サイクリンとＰＰ２Ａ Ｂ’γサブユニットとの結合を阻害するポリペプチド。

また、本実施の形態の細胞死促進剤は、以下の（ｅ）に記載のポリペプチドを少なくとも一部分として含んでいるタンパク質、または、上記タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを少なくとも一部分として含んでいる核酸、を含んでいてもよい。つまり、
（ｅ）配列番号１または２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、サイクリンとＰＰ２Ａ Ｂ’γサブユニットとの結合を阻害するポリペプチド。

また、本実施の形態の細胞死促進剤は、上記（ａ）、（ｂ）または（ｅ）に記載のポリペプチドからなるタンパク質、または、上記タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを少なくとも一部分として含んでいる核酸、を含んでいてもよい。

ここで、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとは、サイクリン Ｇ１の部分ペプチドであって、サイクリン Ｇ１の、ＥＬＡモチーフ（EGF/Erb1-like Auto-phosphorylation motif）を含む部分ペプチドである。

一方、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドとは、サイクリン Ｇ２の部分ペプチドであって、サイクリン Ｇ２の、ＥＬＡモチーフ（EGF/Erb1-like Auto-phosphorylation motif）を含む部分ペプチドである。

つまり、本実施の形態の細胞死促進剤は、上述した（ａ）、（ｂ）または（ｅ）に記載のポリペプチドを少なくとも一部分として含んでいるタンパク質を生体（例えば、細胞、組織、個体など）に投与できる形態であれば、如何なる形態であってもよい。

例えば、本実施の形態の細胞死促進剤は、上記タンパク質自体を含むものであってもよいし、生体内において上記タンパク質を発生（例えば、翻訳）させ得る核酸（例えば、ＤＮＡ、または、ＲＮＡ）を含むものであってもよい。

より簡単に、かつ、より確実に細胞を死滅させる観点から、本実施の形態の細胞死促進剤は、生体内において上記タンパク質を発生させ得るポリヌクレオチドを含むものであることが好ましいといえる。

本実施の形態において、（ａ）または（ｂ）に記載のポリペプチドを少なくとも一部分として含んでいるタンパク質を構成するアミノ酸の総数は特に限定されないが、例えば、２００個以下であってもよく、１９０個以下であってもよく、１８０個以下であってもよく、１７０個以下であってもよく、１６０個以下であってもよく、１５０個以下であってもよく、１４０個以下であってもよく、１３０個以下であってもよく、１２０個以下であってもよく、１１０個以下であってもよく、１００個以下であってもよく、９０個以下であってもよく、８０個以下であってもよく、７０個以下であってもよく、６０個以下であってもよく、５０個以下であってもよく、４０個以下であってもよく、３０個以下であってもよい。

生体への投与のし易さ（例えば、細胞内への取り込み易さ）、タンパク質の安定性、所望の効果以外の効果の排除、の観点から、アミノ酸の総数は、少ないほど好ましいといえる。例えば、５０個以下であることが好ましく、４０個以下であることが更に好ましく、３０個以下であることが最も好ましい。

本明細書における「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸」では、欠失、置換若しくは付加が生じる位置は特に限定されない。

また、「１若しくは数個のアミノ酸」が意図するアミノ酸の数は特に限定されないが、２０個以内のアミノ酸であることが好ましく、１９個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、１８個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、１７個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、１６個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、１５個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、１４個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、１３個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、１２個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、１１個のアミノ酸であることが更に好ましく、１０個以内のアミノ酸であることが好ましく、９個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、８個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、７個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、６個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、５個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、４個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、３個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、２個以内のアミノ酸であることが更に好ましく、１個のアミノ酸であることが最も好ましい。

アミノ酸の置換は、保存的置換であることが好ましい。なお、保存的置換とは、特定のアミノ酸から、当該アミノ酸と同様な化学的性質および／または構造を有する他のアミノ酸に置換されることをいう。化学的性質としては、例えば、疎水性度（疎水性および親水性）、電荷（中性、酸性および塩基性）が挙げられる。構造としては、例えば、側鎖、または、側鎖の官能基として存在する芳香環、脂肪炭化水素基およびカルボキシル基が挙げられる。

保存的置換の例としては、例えば、セリンとスレオニンとの置換、リジンとアルギニンとの置換、およびフェニルアラニンとトリプトファンアミノとの置換、が挙げられる。勿論、本発明は、これらの置換に限定されない。

また、アミノ酸配列の相同性は、公知の方法で求めることができる。具体的には、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ（株式会社ゼネティックス社製）を、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮのマニュアルに従って使用し、例えば、特定のアミノ酸配列と比較対象のアミノ酸配列とのホモロジーサーチ（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｓｅａｒｃｈ）を行い、同一のアミノ酸の割合（％）として相同性を算出することができる。

更に具体的には、比較するアミノ酸配列のうちの長い方のアミノ酸配列の総アミノ酸数に対する、同一のアミノ酸の数の割合（％）として、相同性を算出することができる。

上述した（ｅ）に記載のポリペプチドは、配列番号１または２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するものであるが、相同性は、９１％以上であってもよく、９２％以上であってもよく、９３％以上であってもよく、９４％以上であってもよく、９５％以上であってもよく、９６％以上であってもよく、９７％以上であってもよく、９８％以上であってもよく、９９％以上であってもよい。

上述した（ａ）、（ｂ）および（ｅ）に記載のポリペプチドは、サイクリンとＰＰ２Ａ Ｂ’γサブユニットとの結合を阻害するポリペプチドである。

ＰＰ２Ａ Ｂ’γサブユニットの種類としては特に限定されないが、例えば、Ｂ’３サブユニット、Ｂ’２サブユニット、または、Ｂ’１サブユニットを挙げることができる。

ポリペプチドが、サイクリンとＰＰ２Ａ Ｂ’γサブユニットとの結合を阻害するポリペプチドであるか否かを確認する方法は特に限定されないが、例えば、試験対象であるポリペプチドが存在する条件下にてサイクリンとＰＰ２Ａ Ｂ’γサブユニットとの共沈試験（coprecipitation test）を行うことによって確認することができる。

例えば、サイクリン（例えば、サイクリン Ｇ１、または、サイクリン Ｇ２）、ＰＰ２Ａ Ｂ’γサブユニット（例えば、ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニット）、および、試験対象であるポリペプチドが共存している溶液から、免疫沈降法などによって、サイクリンを沈殿および分離する（当該沈殿物を沈殿物Ａと呼ぶ）。なお、上記溶液中の試験対象であるポリペプチドの濃度は特に限定されないが、例えば、上記溶液中のサイクリンの濃度とＰＰ２Ａ Ｂ’γサブユニットの濃度とが略同じであると仮定すると、上記溶液中の試験対象であるポリペプチドの濃度は、サイクリンの濃度の１０倍以上であることが好ましく、１００倍以上であることがより好ましい。

また、ネガティブコントロールとして、サイクリン（例えば、サイクリン Ｇ１、または、サイクリン Ｇ２）、および、ＰＰ２Ａ Ｂ’γサブユニット（例えば、ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニット）が共存している溶液から、免疫沈降法などによって、サイクリンを沈殿および分離する（当該沈殿物を沈殿物Ｂと呼ぶ）。

次いで、沈殿物Ａおよび沈殿物Ｂの各々の中に含まれるＰＰ２Ａ Ｂ’γサブユニットを、各々定量する。なお、定量の方法は特に限定されないが、例えば、抗ＰＰ２Ａ Ｂ’γサブユニット抗体を用いたウエスタンブロット法を挙げることができる。なお、抗ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３抗体としては、適宜、市販の抗体を用いればよい。勿論、周知の方法にしたがって作製した抗体を用いることも可能である。

次いで、沈殿物Ａ中に含まれるＰＰ２Ａ Ｂ’γサブユニットの量と、沈殿物Ｂ中に含まれるＰＰ２Ａ Ｂ’γサブユニットの量とを比較し、沈殿物Ａ中に含まれるＰＰ２Ａ Ｂ’γサブユニットの量が、沈殿物Ｂ中に含まれるＰＰ２Ａ Ｂ’γサブユニットの量よりも少なければ（例えば、好ましくは１／２以下、より好ましくは１／５以下、最も好ましくは１／１０以下）、試験対象であるポリペプチドは、サイクリンとＰＰ２Ａ Ｂ’γサブユニットとの結合を阻害するポリペプチドであると判定することができる。

また、上述した方法とは別の方法によって、ポリペプチドが、サイクリンとＰＰ２Ａ Ｂ’γサブユニットとの結合を阻害するポリペプチドであるか否かを確認することも可能である。

例えば、サイクリン（例えば、サイクリン Ｇ１、または、サイクリン Ｇ２）、ＰＰ２Ａ Ｂ’γサブユニット（例えば、ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニット）、および、試験対象であるポリペプチドが共存している溶液から、免疫沈降法などによって、ＰＰ２Ａ Ｂ’γサブユニットを沈殿および分離する（当該沈殿物を沈殿物Ｃと呼ぶ）。なお、上記溶液中の試験対象であるポリペプチドの濃度は特に限定されないが、例えば、上記溶液中のサイクリンの濃度とＰＰ２Ａ Ｂ’γサブユニットの濃度とが略同じであると仮定すると、上記溶液中の試験対象であるポリペプチドの濃度は、サイクリンの濃度の１０倍以上であることが好ましく、１００倍以上であることがより好ましい。

また、ネガティブコントロールとして、サイクリン（例えば、サイクリン Ｇ１、または、サイクリン Ｇ２）、および、ＰＰ２Ａ Ｂ’γサブユニット（例えば、ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニット）が共存している溶液から、免疫沈降法などによって、ＰＰ２Ａ Ｂ’γサブユニットを沈殿および分離する（当該沈殿物を沈殿物Ｄと呼ぶ）。

次いで、沈殿物Ｃおよび沈殿物Ｄの各々の中に含まれるサイクリンを、各々定量する。なお、定量の方法は特に限定されないが、例えば、抗サイクリン抗体を用いたウエスタンブロット法を挙げることができる。なお、抗サイクリン抗体としては、適宜、市販の抗体を用いればよい。勿論、周知の方法にしたがって作製した抗体を用いることも可能である。

次いで、沈殿物Ｃ中に含まれるサイクリンの量と、沈殿物Ｄ中に含まれるサイクリンの量とを比較し、沈殿物Ｃ中に含まれるサイクリンの量が、沈殿物Ｄ中に含まれるサイクリンの量よりも少なければ（例えば、好ましくは１／２以下、より好ましくは１／５以下、最も好ましくは１／１０以下）、試験対象であるポリペプチドは、サイクリンとＰＰ２Ａ Ｂ’γサブユニットとの結合を阻害するポリペプチドであると判定することができる。

本実施の形態の細胞死促進剤は、投与対象が、ＤＮＡ損傷（例えば、ＤＮＡ二本鎖切断）を発症している生体、または、ＤＮＡ損傷（例えば、ＤＮＡ二本鎖切断）を発症させるための処置が施される生体、であってもよい。

本実施の形態の細胞死促進剤は、ＤＮＡ（換言すれば、染色体）に生じる損傷の中でも特にＤＮＡ二本鎖切断を発症している生体を死滅させる効果が高い。それ故に、上記構成であれば、所望の生体を特異的に、かつ、効率よく死滅させることができる。

なお、本明細書において「ＤＮＡ二本鎖切断を発症している生体」とは、本実施の形態の細胞死促進剤を投与する時点において、既にＤＮＡ二本鎖切断が生じている生体を意図している。

例えば、ＤＮＡ二本鎖切断を生じる薬剤が投与された後の生体に対して本実施の形態の細胞死促進剤を投与する場合、などが意図される。勿論、当該場合は一例にすぎず、本実施の形態は、当該場合に限定されない。

また、本明細書において「ＤＮＡ二本鎖切断を発症させるための処置が施される生体」とは、本実施の形態の細胞死促進剤を投与する時と同時、または、本実施の形態の細胞死促進剤を投与した後で、ＤＮＡ二本鎖切断を発症させるための処置が施される生体を意図している。

例えば、ＤＮＡ二本鎖切断を生じる薬剤と本実施の形態の細胞死促進剤とを同時に生体へ投与する場合、または、本実施の形態の細胞死促進剤が投与された後の生体に対してＤＮＡ二本鎖切断を生じる薬剤を投与する場合、などが意図される。勿論、これらの場合は一例にすぎず、本実施の形態は、これらの場合に限定されない。

具体的に、上記生体は、γ線照射、Ｘ線照射、トポイソメラーゼＩ阻害剤の投与（例えば、カンプトテシン投与、イリノテカン投与）、または、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤の投与（例えば、エトポシド投与）によって、ＤＮＡ二本鎖切断を発症している生体、または、ＤＮＡ二本鎖切断を発症させるための処置が施される生体であってもよい。

γ線照射、Ｘ線照射、トポイソメラーゼＩ阻害剤の投与（例えば、カンプトテシン投与、イリノテカン投与）、または、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤の投与（例えば、エトポシド投与）は、高頻度にて、生体内でＤＮＡ二本鎖切断を発症させることができる。それ故に、上記構成であれば、所望の生体を特異的に、かつ、効率よく死滅させることができる。

本実施の形態の細胞死促進剤は、ＤＮＡ二本鎖切断を発症させる薬剤を含んでいてもよい。

ＤＮＡ二本鎖切断を発症させる薬剤としては特に限定されないが、例えば、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、カンプトテシン、イリノテカン）およびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、エトポシド）からなる群より選択される少なくとも１つであってもよい。

細胞死促進剤中に含まれる上記薬剤の量としては特に限定されないが、例えば、細胞死促進剤の投与対象の体重１００ｇあたり、１０ｍｇ以下、１ｍｇ以下、０．１ｍｇ以下、０．０１ｍｇ以下、または、０．００１ｍｇ以下の薬剤を投与できる量であり得る。勿論、本発明は、上述した量に限定されない。

本実施の形態の細胞死促進剤は、上記薬剤の効果を増幅することができる。それ故に、本実施の形態の細胞死促進剤であれば、含有する薬剤の量が少なくても、所望の生体を特異的に、かつ、効率よく死滅させることができる。

上述したように、本実施の形態の細胞死促進剤は、上記（ａ）、（ｂ）または（ｅ）に記載のポリペプチドを少なくとも一部分として含んでいるタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを少なくとも一部分として含んでいる核酸、を含んでいてもよい。つまり、本実施の形態の細胞死促進剤は、生体内において上記タンパク質を発生（例えば、翻訳）させ得る核酸（例えば、ＤＮＡ、または、ＲＮＡ）を含むものであってもよい。

更に具体的に、上記タンパク質をコードしているポリヌクレオチドは、以下の（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡを少なくとも一部分として含んでいるポリヌクレオチドであってもよい。つまり、
（ｃ）配列番号３または４に示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｄ）配列番号３または４に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、サイクリンとＰＰ２Ａ Ｂ’γサブユニットとの結合を阻害するポリペプチドをコードするＤＮＡ。

ここで、配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡとは、サイクリン Ｇ１の部分ペプチドであって、サイクリン Ｇ１の、ＥＬＡモチーフ（EGF/Erb1-like Auto-phosphorylation motif）を含む部分ペプチド、をコードしているＤＮＡである。換言すれば、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡの一例である。

一方、配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡとは、サイクリン Ｇ２の部分ペプチドであって、サイクリン Ｇ２の、ＥＬＡモチーフ（EGF/Erb1-like Auto-phosphorylation motif）を含む部分ペプチド、をコードしているＤＮＡである。換言すれば、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードしているＤＮＡの一例である。

本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図されるが、ハイブリダイゼーションさせるポリヌクレオチドによって、高ストリンジェンシーでの洗浄条件は適宜変更され、例えば、哺乳類由来ＤＮＡを用いる場合は、０．１％ ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣ中にて６５℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ＤＮＡを用いる場合は、０．１％ ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にて６８℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、ＲＮＡを用いる場合は、０．１％ ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にて６８℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、オリゴヌクレオチドを用いる場合は、０．１％ ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にてハイブリダイゼーション温度での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましい。また、上記ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている周知の方法で行うことができる。

上記タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを少なくとも一部分として含んでいる核酸は、発現ベクター内に、上記タンパク質をコードしているポリヌクレオチドが挿入されたものであってもよい。

この場合、上記発現ベクターの種類は特に限定されないが、例えば、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター（例えば、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および、レトロウイスルベクター）、または、ウイルス粒子であり得る。

これらの発現ベクターの中では、ウイルスベクターが好ましいといえる。その理由は、宿主内へ安定的に核酸を導入することができるからである。

〔２．細胞死促進剤の有効成分のスクリーニング方法〕
上述した〔１．細胞死促進剤〕では、本発明の一例として、上記（ａ）、（ｂ）または（ｅ）に記載のポリペプチドを少なくとも一部分として含んでいるタンパク質、または、上記タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを少なくとも一部分として含んでいる核酸、を含んでいる細胞死促進剤について説明した。

しかしながら、本発明の細胞死促進剤の有効成分は、上述した有効成分に限定されず、本発明の思想に基づいてスクリーニングしたものを、有効成分として利用することができる。

以下では、細胞死促進剤に含まれる有効成分のスクリーニング方法について説明する。

〔２−１．スクリーニング方法（例１）〕
本実施の形態の細胞死促進剤の有効成分のスクリーニング方法は、
培養細胞に対して、臨床現場で使用されているよりも低濃度のＤＮＡ二本鎖切断を発症させる薬剤、および、試験試料を投与する投与工程と、
上記培養細胞がアポトーシスを生じているか否かを判定する判定工程と、
上記アポトーシスを生じさせる上記試験試料を、細胞死促進剤の有効成分であると決定する決定工程と、を含む方法であってもよい。

上記投与工程では、臨床現場で使用されているよりも低濃度のＤＮＡ二本鎖切断を発症させる薬剤によって、培養細胞に対して、軽度のＤＮＡ二本鎖切断を発症させる。なお、通常、このような軽度のＤＮＡ二本鎖切断では、培養細胞は、アポトーシスを起こすことはない。しかしながら、本発明の細胞死促進剤の有効成分として利用可能なものであれば、このような軽度のＤＮＡ二本鎖切断であっても、培養細胞は、アポトーシスを起こす。

上記培養細胞としては特に限定されないが、例えば、骨肉腫細胞（例えば、Ｕ２ＯＳ）、前立腺癌細胞（ＰＣ−３、ＤＵ−１４５）、舌癌細胞（ＳＡＳ）、子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）、膵臓癌細胞（ＰＡＮＣ−１）、または、卵巣癌細胞（ＯＶＣＡＲ−３）を用いることができる。

上記ＤＮＡ二本鎖切断を発症させる薬剤としては特に限定されないが、例えば、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、カンプトテシン、イリノテカン）およびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、エトポシド）からなる群より選択される少なくとも１つであり得る。

本明細書中で「臨床現場で使用されているよりも低濃度」は、例えば、臨床現場で使用されている濃度の１／２以下、１／３以下、１／４以下、１／５以下、１／６以下、１／７以下、１／８以下、１／９以下、１／１０以下、１／２０以下、１／３０以下、１／４０以下、１／５０以下、１／６０以下、１／７０以下、１／８０以下、１／９０以下、１／１００以下、１／１５０以下、１／２００以下、１／３００以下、１／４００以下、１／５００以下、１／６００以下、１／７００以下、１／８００以下、１／９００以下、または、１／１０００以下であってもよい。

更に具体的に、「臨床現場で使用されているよりも低濃度」は、５０μＭ以下、４０μＭ以下、３０μＭ以下、２０μＭ以下、１０μＭ以下、９μＭ以下、８μＭ以下、７μＭ以下、６μＭ以下、５μＭ以下、４μＭ以下、３μＭ以下、２μＭ以下、１μＭ以下、０．９μＭ以下、０．８μＭ以下、０．７μＭ以下、０．６μＭ以下、０．５μＭ以下、０．４μＭ以下、０．３μＭ以下、０．２μＭ以下、０．１μＭ以下、０．０９μＭ以下、０．０８μＭ以下、０．０７μＭ以下、０．０６μＭ以下、０．０５μＭ以下、０．０４μＭ以下、０．０３μＭ以下、０．０２μＭ以下、または、０．０１μＭ以下であってもよい。

より安全で、かつ、感度が高い細胞死促進剤を実現するという観点から、投与工程に用いる薬剤の濃度は、低いほど好ましいといえる。

上記判定工程では、培養細胞がアポトーシスを生じているか否かを判定する。なお、当該判定工程に用いる具体的な方法としては周知の方法を用いればよく、例えば、ＦＡＣＳ（fluorescence activated cell sorting）を用いればよい。

上記決定工程では、アポトーシスを生じさせる試験試料を、細胞死促進剤の有効成分であると決定する。

なお、アポトーシスは、観察する培養細胞の全てにおいて起こっていなくてもよい。例えば、観察する培養細胞の１０％以上、好ましくは２０％以上、更に好ましくは３０％以上、更に好ましくは４０％以上、更に好ましくは５０％以上、更に好ましくは６０％以上、更に好ましくは７０％以上、更に好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上がアポトーシスを生じていれば、試験試料を細胞死促進剤の有効成分であると決定することができる。

但し、アポトーシスが生じている培養細胞の割合が高いほど、より安全で、かつ、感度が高い細胞死促進剤を実現することができる。

〔２−２．スクリーニング方法（例２）〕
本実施の形態の細胞死促進剤の有効成分のスクリーニング方法は、
培養細胞に対して、臨床現場で使用されているよりも弱いγ線またはＸ線を照射するとともに、当該培養細胞へ試験試料を投与する投与工程と、
上記培養細胞がアポトーシスを生じているか否かを判定する判定工程と、
上記アポトーシスを生じさせる上記試験試料を、細胞死促進剤の有効成分であると決定する決定工程と、を含む方法であってもよい。

上記投与工程では、臨床現場で使用されているよりも弱いγ線またはＸ線を培養細胞に照射することによって、軽度のＤＮＡ二本鎖切断を発症させる。なお、通常、このような軽度のＤＮＡ二本鎖切断では、培養細胞は、アポトーシスを起こすことはない。しかしながら、本発明の細胞死促進剤の有効成分として利用可能なものであれば、このような軽度のＤＮＡ二本鎖切断であっても、培養細胞は、アポトーシスを起こす。

上記培養細胞としては特に限定されないが、例えば、骨肉腫細胞（例えば、Ｕ２ＯＳ）、前立腺癌細胞（ＰＣ−３、ＤＵ−１４５）、舌癌細胞（ＳＡＳ）、子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）、膵臓癌細胞（ＰＡＮＣ−１）、または、卵巣癌細胞（ＯＶＣＡＲ−３）を用いることができる。

上記ＤＮＡ二本鎖切断を発症させる薬剤としては特に限定されないが、例えば、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、カンプトテシン、イリノテカン）およびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、エトポシド）からなる群より選択される少なくとも１つであり得る。

本明細書中で「臨床現場で使用されているよりも弱いγ線またはＸ線」は、例えば、臨床現場で使用されているγ線の強度の１／２以下、１／３以下、１／４以下、１／５以下、１／６以下、１／７以下、１／８以下、１／９以下、１／１０以下、１／２０以下、１／３０以下、１／４０以下、１／５０以下、１／６０以下、１／７０以下、１／８０以下、１／９０以下、１／１００以下、１／１５０以下、１／２００以下、１／３００以下、１／４００以下、１／５００以下、１／６００以下、１／７００以下、１／８００以下、１／９００以下、または、１／１０００以下であってもよい。

更に具体的に、「臨床現場で使用されているよりも弱いγ線またはＸ線」は、１００グレイ以下、１０グレイ以下、５グレイ以下、または、１グレイ以下の強度のγ線またはＸ線であり得る。勿論、本発明は、これらの強度のγ線およびＸ線に限定されない。

より安全で、かつ、感度が高い細胞死促進剤を実現するという観点から、投与工程に用いるγ線およびＸ線の強度は、弱いほど好ましいといえる。

本実施の形態の判定工程および決定工程は、上述した〔２−１．スクリーニング方法（例１）〕における判定工程および決定工程と同じである。それ故に、ここでは、その説明を省略する。

〔２−３．スクリーニング方法（例３）〕
本実施の形態の細胞死促進剤の有効成分のスクリーニング方法は、
培養細胞を移植したヌードマウスに対して、臨床現場で使用されているよりも少量のＤＮＡ二本鎖切断を発症させる薬剤、および、試験試料を投与する投与工程と、
上記ヌードマウスにおいて、移植された培養細胞に由来する腫瘍が小さくなっているか否かを判定する判定工程と、
上記移植された培養細胞に由来する腫瘍を小さくする上記試験試料を、細胞死促進剤の有効成分であると決定する決定工程と、を含む方法であってもよい。

上記投与工程では、臨床現場で使用されているよりも低濃度のＤＮＡ二本鎖切断を発症させる薬剤によって、ヌードマウスに移植された培養細胞に対して、軽度のＤＮＡ二本鎖切断を発症させる。なお、通常、このような軽度のＤＮＡ二本鎖切断では、培養細胞は、アポトーシスを起こすことはない。しかしながら、本発明の細胞死促進剤の有効成分として利用可能なものであれば、このような軽度のＤＮＡ二本鎖切断であっても、培養細胞は、アポトーシスを起こす。そして、培養細胞がアポトーシスを起こせば、移植された培養細胞に由来する腫瘍は小さくなる。また、培養細胞がアポトーシスを起こせば、ヌードマウスの生存率が上昇する。

上記培養細胞としては特に限定されないが、例えば、骨肉腫細胞（例えば、Ｕ２ＯＳ）、前立腺癌細胞（ＰＣ−３、ＤＵ−１４５）、舌癌細胞（ＳＡＳ）、子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）、膵臓癌細胞（ＰＡＮＣ−１）、または、卵巣癌細胞（ＯＶＣＡＲ−３）を用いることができる。

上記ＤＮＡ二本鎖切断を発症させる薬剤としては特に限定されないが、例えば、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、カンプトテシン、イリノテカン）およびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、エトポシド）からなる群より選択される少なくとも１つであり得る。

本明細書中で「臨床現場で使用されているよりも少量」は、例えば、臨床現場で使用されている濃度の１／２以下、１／３以下、１／４以下、１／５以下、１／６以下、１／７以下、１／８以下、１／９以下、１／１０以下、１／２０以下、１／３０以下、１／４０以下、１／５０以下、１／６０以下、１／７０以下、１／８０以下、１／９０以下、１／１００以下、１／１５０以下、１／２００以下、１／３００以下、１／４００以下、１／５００以下、１／６００以下、１／７００以下、１／８００以下、１／９００以下、または、１／１０００以下であってもよい。

更に具体的に、「臨床現場で使用されているよりも少量」は、ヌードマウスの体重１００ｇあたり、１０ｍｇ以下、１ｍｇ以下、０．１ｍｇ以下、０．０１ｍｇ以下、または、０．００１ｍｇ以下であってもよい。勿論、本発明は、上述した量に限定されない。

より安全で、かつ、感度が高い細胞死促進剤を実現するという観点から、投与工程に用いる薬剤の量は、少ないほど好ましいといえる。

上記判定工程では、ヌードマウスに移植された培養細胞に由来する腫瘍が小さくなっているか否かを判定する。なお、当該判定工程に用いる具体的な方法としては特に限定されず、例えば、ヌードマウスの体表に生じた腫瘍の直径を測定すればよい。

上記決定工程では、移植された培養細胞に由来する腫瘍を小さくする上記試験試料を、細胞死促進剤の有効成分であると決定する。

例えば、上記決定工程では、試験試料を投与していないヌードマウスに生じた腫瘍の直径と比較して、試験試料を投与したヌードマウスに生じた腫瘍の直径が小さくなっていれば、試験試料を細胞死促進剤の有効成分であると決定することができる。

更に具体的には、試験試料を投与していないヌードマウスに生じた腫瘍の直径を１とした場合、試験試料を投与したヌードマウスに生じた腫瘍の直径が、１／２以下、好ましくは１／３以下、更に好ましくは１／４以下、更に好ましくは１／５以下、更に好ましくは１／６以下、更に好ましくは１／７以下、更に好ましくは１／８以下、更に好ましくは１／９以下、または、最も好ましくは１／１０以下になっていれば、試験試料を細胞死促進剤の有効成分であると決定することができる。

判定工程および決定工程は、上述したものとは別の工程とすることも可能である。

例えば、判定工程は、培養細胞を移植したヌードマウスの生存率を判定する工程であってもよい。

生存率を判定する具体的な日は特に限定されないが、例えば、投与工程を行ってから、１０日後であってもよいし、２０日後であってもよいし、３０日後であってもよいし、１ケ月後であってもよいし、２ケ月後であってもよいし、３ケ月後であってもよいし、４ケ月後であってもよいし、５ケ月後であってもよいし、６ケ月後であってもよいし、７ケ月後であってもよいし、８ケ月後であってもよいし、９ケ月後であってもよいし、１０ケ月後であってもよいし、１１ケ月後であってもよいし、または、１年後であってもよい。勿論、１年後以降に生存率を判定してもよい。

当該判定工程を採用する場合、決定工程は、生存率が高いヌードマウスに投与された試験試料を、細胞死促進剤の有効成分であると決定する工程であってもよい。

例えば、上記決定工程では、試験試料を投与していないヌードマウスの生存率と比較して、試験試料を投与したヌードマウスの生存率が高ければ、試験試料を細胞死促進剤の有効成分であると決定することができる。

更に具体的には、試験試料を投与したヌードマウスの生存率が、試験試料を投与していないヌードマウスの生存率の１．５倍以上、好ましくは２倍以上、好ましくは３倍以上、更に好ましくは４倍以上、更に好ましくは５倍以上、更に好ましくは６倍以上、更に好ましくは７倍以上、更に好ましくは８倍以上、更に好ましくは９倍以上、または、最も好ましくは１０倍以上になっていれば、試験試料を細胞死促進剤の有効成分であると決定することができる。

＜１．Ｃyｃｌｉｎ Ｇ１とＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットとの結合、および、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ２とＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットとの結合に関する解析＞
＜１−１．試験に用いたポリペプチドの説明＞
本実施例では、Ｃyｃｌｉｎ Ｇ１とＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットとの結合に関与する、Ｃyｃｌｉｎ Ｇ１内の結合ドメイン、および、ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニット内の結合ドメインを同定した。また、本実施例では、Ｃyｃｌｉｎ Ｇ２とＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットとの結合に関与する、Ｃyｃｌｉｎ Ｇ２内の結合ドメイン、および、ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニット内の結合ドメインを同定した。以下に、試験方法および試験結果について説明する。

Ｃyｃｌｉｎ Ｇ１、Ｃyｃｌｉｎ Ｇ２、および、ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３の各々について、試験に用いる様々なポリペプチドを作製した。各種ポリペプチドの概略を、図１（Ａ）〜（Ｃ）に示す。なお、Ｃyｃｌｉｎ Ｇ１、Ｃyｃｌｉｎ Ｇ２、および、ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットの全長のアミノ酸配列を、各々、配列番号５、６および７にて示す。

更に具体的に、図１（Ａ）には、Ｃyｃｌｉｎ Ｇ１に由来する様々なポリペプチドが記載されており、これらのポリペプチドには、ＦｌａｇタグまたはＭｙｃタグが連結されている。

図１（Ａ）において、「Ｆ−Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ１」は、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ１の全長に対応するポリペプチドにＦｌａｇタグが連結されたものであり、「Ｆ−Ｇ１＿Ｎ」は、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ１のアミノ末端から１番目のアミノ酸から１６０番目のアミノ酸に対応するポリペプチドにＦｌａｇタグが連結されたものであり、「Ｆ−Ｇ１＿Ｃ」は、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ１のアミノ末端から１５４番目のアミノ酸から２９５番目のアミノ酸に対応するポリペプチドにＦｌａｇタグが連結されたものであり、「Ｆ−Ｇ１＿ΔＥＬＡ」は、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ１のアミノ末端から１番目のアミノ酸から２７５番目のアミノ酸に対応するポリペプチドにＦｌａｇタグが連結されたものであり、「Ｍ−Ｇ１＿ＥＬＡ＋６」は、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ１のアミノ末端から２６７番目のアミノ酸から２９５番目のアミノ酸に対応するポリペプチドにＭｙｃタグが連結されたものである。

また、図１（Ａ）には図示しないが、後述する＜１−４＞の試験のために、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ１の全長に対応するポリペプチドにＭｙｃタグが連結されたものも作製した。

図１（Ｂ）には、Ｃyｃｌｉｎ Ｇ２に由来する様々なポリペプチドが記載されており、これらのポリペプチドには、ＦｌａｇタグまたはＭｙｃタグが連結されている。

図１（Ｂ）において、「Ｆ−Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ２」は、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ２の全長に対応するポリペプチドにＦｌａｇタグが連結されたものであり、「Ｆ−Ｇ２＿Ｎ」は、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ２のアミノ末端から１番目のアミノ酸から１８６番目のアミノ酸に対応するポリペプチドにＦｌａｇタグが連結されたものであり、「Ｆ−Ｇ２＿Ｃ」は、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ２のアミノ末端から１７５番目のアミノ酸から３４５番目のアミノ酸に対応するポリペプチドにＦｌａｇタグが連結されたものであり、「Ｆ−Ｇ２＿ΔＣ」は、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ２のアミノ末端から１番目のアミノ酸から２６３番目のアミノ酸に対応するポリペプチドにＦｌａｇタグが連結されたものであり、「Ｆ−Ｇ２＿ΔＥＬＡ」は、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ２のアミノ末端から１番目のアミノ酸から２６４番目のアミノ酸と、アミノ末端から２９５番目のアミノ酸から３４５番目のアミノ酸とを連結させたポリペプチドにＦｌａｇタグが連結されたものであり、「Ｍ−Ｇ２＿ＥＬＡ＋６」は、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ２のアミノ末端から２７２番目のアミノ酸から３００番目のアミノ酸に対応するポリペプチドにＭｙｃタグが連結されたものである。

また、図１（Ｂ）には図示しないが、後述する＜１−４＞の試験のために、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ２の全長に対応するポリペプチドにＭｙｃタグが連結されたものも作製した。

図１（Ｃ）には、ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３に由来する様々なポリペプチドが記載されており、これらのポリペプチドには、ＦｌａｇタグまたはＭｙｃタグが連結されている。

図１（Ｃ）において、「ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３」は、ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットの全長に対応するポリペプチドにＦｌａｇタグまたはＭｙｃタグが連結されたものであり、「Ｂ’γ３＿１−１５１」は、ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットのアミノ末端から１番目のアミノ酸から１５１番目のアミノ酸に対応するポリペプチドにＦｌａｇタグまたはＭｙｃタグが連結されたものであり、「Ｂ’γ３＿１４９−３００」は、ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットのアミノ末端から１４９番目のアミノ酸から３００番目のアミノ酸に対応するポリペプチドにＦｌａｇタグまたはＭｙｃタグが連結されたものであり、「Ｂ’γ３＿２８８−４５０」は、ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットのアミノ末端から２８８番目のアミノ酸から４５０番目のアミノ酸に対応するポリペプチドにＦｌａｇタグまたはＭｙｃタグが連結されたものであり、「Ｂ’γ３＿４５１−５２４」は、ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットのアミノ末端から４５１番目のアミノ酸から５２４番目のアミノ酸に対応するポリペプチドにＦｌａｇタグまたはＭｙｃタグが連結されたものである。

＜１−２．Ｃyｃｌｉｎ Ｇ１とＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットとの結合に関与する、Ｃyｃｌｉｎ Ｇ１内の結合ドメインの決定＞
図１（Ａ）に示したポリペプチドの各々と、ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットの全長に対応するポリペプチドにＭｙｃタグが連結されたものと、を含む溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％ Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０、１ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．５ｍＭ フェニルメチルスルホニルフッ化物、１ｍＭ ベンズアミジン、プロテアーゼ阻害剤のカクテル、２０％ グリセロール）に対して、抗Ｆｌａｇタグ抗体およびｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（GE healthcare）を用いた免疫沈降処理（４℃、３時間）を行った。

抗Ｍｙｃタグ抗体を用いたウエスタンブロット法によって、免疫沈降物中に、ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットが含まれているか否かを確認した。その結果を、図２（Ａ）に示す。

図２（Ａ）に示すように、「Ｆ−Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ１」、「Ｆ−Ｇ１＿Ｃ」および「Ｆ−Ｇ１＿ΔＥＬＡ」を含む溶液の場合、免疫沈降物中に、ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットが含まれていることが確認された。つまり、「Ｆ−Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ１」、「Ｆ−Ｇ１＿Ｃ」および「Ｆ−Ｇ１＿ΔＥＬＡ」の各々は、ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットと結合することが確認された。なお、図１（Ａ）の右側に、結合の強さを記載する。

＜１−３．Ｃyｃｌｉｎ Ｇ２とＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットとの結合に関与する、Ｃyｃｌｉｎ Ｇ２内の結合ドメインの決定＞
図１（Ｂ）に示したポリペプチドの各々と、ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットの全長に対応するポリペプチドにＭｙｃタグが連結されたものとを含む溶液（＜１−２＞に記載のものと同じ組成）に対して、抗Ｆｌａｇタグ抗体およびｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（GE healthcare）を用いた免疫沈降処理（４℃、３時間）を行った。

抗Ｍｙｃタグ抗体を用いたウエスタンブロット法によって、免疫沈降物中に、ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットが含まれているか否かを確認した。その結果を、図２（Ｂ）に示す。

図２（Ｂ）に示すように、「Ｆ−Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ２」および「Ｆ−Ｇ２＿Ｃ」を含む溶液の場合、免疫沈降物中に、ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットが含まれていることが確認された。つまり、「Ｆ−Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ２」および「Ｆ−Ｇ２＿Ｃ」の各々は、ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットと結合することが確認された。なお、図１（Ｂ）の右側に、結合の強さを記載する。

＜１−４．Ｃyｃｌｉｎ Ｇ１内またはＣyｃｌｉｎ Ｇ２内の結合ドメインの詳細な解析＞
Ｃyｃｌｉｎ Ｇ１とＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットとの結合に関与するＣyｃｌｉｎ Ｇ１内の結合ドメイン、および、Ｃyｃｌｉｎ Ｇ２とＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットとの結合に関与するＣyｃｌｉｎ Ｇ２内の結合ドメインを、更に短い領域へと絞り込むための試験を行った。

Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ１の全長に対応するポリペプチドにＭｙｃタグが連結されたもの、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ１のアミノ末端から２６７番目のアミノ酸から２９５番目のアミノ酸に対応するポリペプチドにＭｙｃタグが連結されたもの（Ｍ−Ｇ１＿ＥＬＡ＋６）、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ２の全長に対応するポリペプチドにＭｙｃタグが連結されたもの、または、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ２のアミノ末端から２７２番目のアミノ酸から３００番目のアミノ酸に対応するポリペプチドにＭｙｃタグが連結されたもの（Ｍ−Ｇ２＿ＥＬＡ＋６）と、ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットの全長に対応するポリペプチドにＦｌａｇタグが連結されたものと、を含む溶液（＜１−２＞に記載のものと同じ組成）に対して、抗Ｍｙｃタグ抗体およびｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（GE healthcare）を用いた免疫沈降処理（４℃、３時間）を行った。

抗Ｆｌａｇタグ抗体を用いたウエスタンブロット法によって、免疫沈降物中に、ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットが含まれているか否かを確認した。その結果を、図２（Ｃ）に示す。

図２（Ｃ）に示すように、「Ｍ−Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ１」、「Ｍ−Ｇ１＿ＥＬＡ＋６」、「Ｍ−Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ２」および「Ｍ−Ｇ２＿ＥＬＡ＋６」を含む溶液の場合、免疫沈降物中に、ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットが含まれていることが確認された。つまり、「Ｍ−Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ１」、「Ｍ−Ｇ１＿ＥＬＡ＋６」、「Ｍ−Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ２」および「Ｍ−Ｇ２＿ＥＬＡ＋６」の各々は、ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットと結合することが確認された。なお、図１（Ａ）および（Ｂ）の右側に、結合の強さを記載する。

＜１−５．Ｃyｃｌｉｎ Ｇ１とＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットとの結合に関与する、ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニット内の結合ドメインの決定＞
Ｍｙｃタグが連結された図１（Ｃ）に示したポリペプチドの各々と、図１（Ａ）の「Ｆ−Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ１」とを含む溶液（＜１−２＞に記載のものと同じ組成）に対して、抗Ｍｙｃタグ抗体およびｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（GE healthcare）を用いた免疫沈降処理（４℃、３時間）を行った。

抗Ｆｌａｇタグ抗体を用いたウエスタンブロット法によって、免疫沈降物中に、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ１が含まれているか否かを確認した。その結果を、図３（Ａ）に示す。

図３（Ａ）に示すように、「Ｍ−ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３」、「Ｍ−１−１５１」、「Ｍ−１４９−３００」および「Ｍ−４５１−５２４」を含む溶液の場合、免疫沈降物中に、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ１が含まれていることが確認された。つまり、「Ｍ−ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３」、「Ｍ−１−１５１」、「Ｍ−１４９−３００」および「Ｍ−４５１−５２４」の各々は、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ１と結合することが確認された。なお、図１（Ｃ）の右側に、結合の強さを記載する。

＜１−６．Ｃyｃｌｉｎ Ｇ２とＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットとの結合に関与する、ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニット内の結合ドメインの決定＞
Ｆｌａｇタグが連結された図１（Ｃ）に示したポリペプチドの各々と、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ２の全長に対応するポリペプチドにＭｙｃタグが連結されたものとを含む溶液（＜１−２＞に記載のものと同じ組成）に対して、抗Ｆｌａｇタグ抗体およびｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（GE healthcare）を用いた免疫沈降処理（４℃、３時間）を行った。

抗Ｍｙｃタグ抗体を用いたウエスタンブロット法によって、免疫沈降物中に、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ２が含まれているか否かを確認した。その結果を、図３（Ｂ）に示す。

図３（Ｂ）に示すように、「Ｆ−ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３」、「Ｆ−１−１５１」、「Ｆ−１４９−３００」および「Ｆ−４５１−５２４」を含む溶液の場合、免疫沈降物中に、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ２が含まれていることが確認された。つまり、「Ｆ−ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３」、「Ｆ−１−１５１」、「Ｆ−１４９−３００」および「Ｆ−４５１−５２４」の各々は、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ２と結合することが確認された。なお、図１（Ｃ）の右側に、結合の強さを記載する。

＜２．結合阻害試験＞
上記＜１−１＞〜＜１−６＞の試験から、Ｃyｃｌｉｎ Ｇ１とＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットとの結合に関与するＣyｃｌｉｎ Ｇ１内の結合ドメインは、図１（Ａ）に示す「Ｍ−Ｇ１＿ＥＬＡ＋６」に対応するポリペプチドであり、Ｃyｃｌｉｎ Ｇ２とＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットとの結合に関与するＣyｃｌｉｎ Ｇ２内の結合ドメインは、図１（Ｂ）に示す「Ｍ−Ｇ２＿ＥＬＡ＋６」に対応するポリペプチドであることが明らかになった。

そこで、これらのポリペプチドが、実際にＣyｃｌｉｎ Ｇ１とＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットとの結合、および、Ｃyｃｌｉｎ Ｇ２とＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットとの結合を阻害するか試験した。

まず、図１（Ａ）に示す「Ｍ−Ｇ１＿ＥＬＡ＋６」に対応するポリペプチド（ＥＬＡＳ１と呼ぶ（配列番号１））、および、図１（Ｂ）に示す「Ｍ−Ｇ２＿ＥＬＡ＋６」に対応するポリペプチド（ＥＬＡＳ２と呼ぶ（配列番号２））を化学合成した。なお、化学合成の具体的な方法は、周知の方法にしたがった。

＜２−１．ＥＬＡＳ１の結合阻害効果＞
ＧＳＴ、または、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ１の全長に対応するポリペプチドにＧＳＴが連結されたものと、ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットの全長に対応するポリペプチドにＭｙｃタグが連結されたものと、を含む溶液（＜１−２＞に記載のものと同じ組成）を準備した。

当該溶液に対して、ＥＬＡＳ１非存在下、または、ＥＬＡＳ１存在下にて、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄ（GE healthcare）を用いた沈降処理（４℃、３時間）を行った。

抗Ｍｙｃタグ抗体を用いたウエスタンブロット法によって、沈降物中に、ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットが含まれているか否かを確認した。その結果を、図４（Ａ）に示す。

図４（Ａ）から明らかなように、ＥＬＡＳ１非存在の条件下では沈降物中にＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットが含まれていたのに対し、ＥＬＡＳ１存在の条件下では沈降物中にＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットが含まれていなかった。

つまり、ＥＬＡＳ１によって、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ１とＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットとの結合が阻害されることが明らかになった。

＜２−２．ＥＬＡＳ２の結合阻害効果＞
ＧＳＴ、または、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ２の全長に対応するポリペプチドにＧＳＴが連結されたものと、ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３の全長に対応するポリペプチドにＭｙｃタグが連結されたものと、を含む溶液（＜１−２＞に記載のものと同じ組成）を準備した。

当該溶液に対して、ＥＬＡＳ２非存在下、または、ＥＬＡＳ２存在下にて、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｂｅａｄ（GE healthcare）を用いた沈降処理（４℃、３時間）を行った。

抗Ｍｙｃタグ抗体を用いたウエスタンブロット法によって、沈降物中に、ＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットが含まれているか否かを確認した。その結果を、図４（Ｂ）に示す。

図４（Ｂ）から明らかなように、ＥＬＡＳ２非存在の条件下では沈降物中にＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットが含まれていたのに対し、ＥＬＡＳ２存在の条件下では沈降物中にＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットが含まれていなかった。

つまり、ＥＬＡＳ２によって、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ２とＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットとの結合が阻害されることが明らかになった。

＜３．ＥＬＡＳ１およびＥＬＡＳ２の副作用に関する試験−１＞
上述した＜２＞の試験によって、ＥＬＡＳ１が、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ１とＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットとの結合を阻害し、ＥＬＡＳ２が、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ２とＰＰ２Ａ Ｂ’γ３サブユニットとの結合を阻害することが明らかになった。このことは、ＥＬＡＳ１およびＥＬＡＳ２が、投与された生体内においてＣｙｃｌｉｎ Ｇ１およびＣｙｃｌｉｎ Ｇ２の機能を阻害し得ることを示唆している。

そこで、生体内においてＣｙｃｌｉｎ Ｇ１およびＣｙｃｌｉｎ Ｇ２の機能を阻害した場合、当該生体において悪影響が生じ得るか否かを検討した。

まず、周知の方法にしたがって、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ１のノックアウトマウス、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ２のノックアウトマウス、および、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ１とＣｙｃｌｉｎ Ｇ２とのダブルノックアウトマウスを作製した。なお、図５（Ａ）に、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ１のノックアウトマウスの作製ストラテジーを示し、図５（Ｂ）に、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ２のノックアウトマウスの作製ストラテジーを示す。

また、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ１とＣｙｃｌｉｎ Ｇ２とのダブルノックアウトマウスは、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ１のノックアウトマウスとＣｙｃｌｉｎ Ｇ２のノックアウトマウスとの交配によって作製した。

Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ１のノックアウトマウス（２週齢）、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ２のノックアウトマウス（２週齢）、および、Ｃｙｃｌｉｎ Ｇ１とＣｙｃｌｉｎ Ｇ２とのダブルノックアウトマウス（２週齢）の各々に、発癌剤であるジエチルニトロサミン（diethylnitrosamine：ＤＥＮ）を投与した。そして、投与してから３６週間後に、各ノックアウトマウスの肝臓に生じた腫瘍を観察した。

図６に、各ノックアウトマウスの肝臓に生じた腫瘍の写真を示す。なお、図６に示す円は、腫瘍の位置を示している。

図７（Ａ）に、体重あたりの肝臓の重量の割合を示し、図７（Ｂ）に、直径が３ｍｍ以上の腫瘍の数を示す。

図６、図７（Ａ）、図７（Ｂ）から明らかなように、野生型のマウスに発癌剤を投与した場合には、肝臓に、多数の大きな腫瘍が生じていた。一方、ノックアウトマウスに発癌剤を投与した場合には、野生型のマウスと比較して、肝臓に生じた腫瘍の数が少ないとともに、腫瘍のサイズも小さかった。

以上の結果は、たとえ、ＥＬＡＳ１およびＥＬＡＳ２を投与することによって生体内のＣｙｃｌｉｎ Ｇ１およびＣｙｃｌｉｎ Ｇ２の機能を阻害したとしても、当該生体に悪影響を及ぼすことがないことを示している。

それどころか、以上の結果は、ＥＬＡＳ１およびＥＬＡＳ２を投与することによって生体内のＣｙｃｌｉｎ Ｇ１およびＣｙｃｌｉｎ Ｇ２の機能を阻害すれば、かえって、生体は発癌し難くなることを示している。

＜４．ＥＬＡＳ１およびＥＬＡＳ２の副作用に関する試験−２＞
周知の方法にしたがって、Ｕ２ＯＳ細胞にｐＴｅｔ−Ｏｎを導入し、ｐＴｅｔ−Ｏｎを安定的に保持するＵ２ＯＳ細胞を、Ｇ４１８を含む培地中で選別した。選別された細胞を、Ｕ２ＯＳ／Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞と名付けた。

次いで、当該Ｕ２ＯＳ／Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞に対して、ＥＬＡＳ１またはＥＬＡＳ２が挿入されたｐＴＲＥＴ３−６Ｍｙｃと、Ｌｉｎｅａｒ Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｍａｒｋｅｒ（Clontech）と、を導入した。

次いで、各遺伝子が導入されたＵ２ＯＳ／Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞にドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を与えることによってＥＬＡＳ１またはＥＬＡＳ２の発現を誘導し、このときの、当該Ｕ２ＯＳ／Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞の細胞周期の変化を観察した。なお、細胞周期の変化は、フローサイトメトリーによる周知の方法によって解析した。

図８（Ａ）に、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を与える前後における、Ｕ２ＯＳ／Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞内でのＥＬＡＳ１およびＥＬＡＳ２の発現量の変化を示す。なお、図８（Ａ）〜図８（Ｃ）において、「Ｍｙｃ−ｖｅｃ」および「Ｍ−ｖｅｃ」は、空のｐＴＲＥＴ３−６Ｍｙｃが導入されたＵ２ＯＳ／Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞を示し、「Ｍｙｃ−ＥＬＡＳ１」および「Ｍ−ＥＬＡＳ１」は、ＥＬＡＳ１が挿入されたｐＴＲＥＴ３−６Ｍｙｃが導入されたＵ２ＯＳ／Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞を示し、「Ｍｙｃ−ＥＬＡＳ２」および「Ｍ−ＥＬＡＳ２」は、ＥＬＡＳ２が挿入されたｐＴＲＥＴ３−６Ｍｙｃが導入されたＵ２ＯＳ／Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞を示している。

図８（Ａ）に示すように、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）によって、ＥＬＡＳ１またはＥＬＡＳ２の発現が誘導されることが確認された。

図８（Ｂ）および図８（Ｃ）に、フローサイトメトリーの結果を示す。図８（Ｂ）および図８（Ｃ）から明らかなように、細胞内でＥＬＡＳ１およびＥＬＡＳ２の発現が誘導されても、細胞周期に変化はなかった。このことは、ＥＬＡＳ１およびＥＬＡＳ２が、極めて副作用が少なく、生体にとって安全であることを示している。

＜５．γ線によるアポトーシスの誘導＞
上記＜４＞にて説明したＵ２ＯＳ／Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞について、γ線によって誘導されるアポトーシスにおける、ＥＬＡＳ１およびＥＬＡＳ２の影響を検討した。

具体的には、ＥＬＡＳ１が挿入されたｐＴＲＥＴ３−６Ｍｙｃが導入されたＵ２ＯＳ／Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞、ＥＬＡＳ２が挿入されたｐＴＲＥＴ３−６Ｍｙｃが導入されたＵ２ＯＳ／Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞、および、空のｐＴＲＥＴ３−６Ｍｙｃが導入されたＵ２ＯＳ／Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞の各々に対して、１０グレイ（Ｇｙ）のγ線を照射し、その後、経時的に各細胞の細胞周期（特に、ｓｕｂ−Ｇ１）を観察した。

図９（Ａ）に示すように、ＥＬＡＳ１およびＥＬＡＳ２が発現しているＵ２ＯＳ／Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞では、ｓｕｂ−Ｇ１期にある細胞の割合が経時的に上昇していった。また、ＥＬＡＳ１が発現しているＵ２ＯＳ／Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞では、ＥＬＡＳ２が発現しているＵ２ＯＳ／Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞と比較して、ｓｕｂ−Ｇ１期にある細胞の割合の変化が大きかった。なお、ｓｕｂ−Ｇ１期にある細胞の割合が上昇することは、当該細胞が死滅しつつあることを示している。

例えば、ＥＬＡＳ１が発現しているＵ２ＯＳ／Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞では、γ線を照射後２４時間目でｓｕｂ−Ｇ１期にある細胞の割合が１４．９％となり、γ線を照射後４８時間目でｓｕｂ−Ｇ１期にある細胞の割合が２７．２％となり、γ線を照射後７２時間目でｓｕｂ−Ｇ１期にある細胞の割合が３８．６％となった。

次いで、細胞死がアポトーシスによるものであるか否かを確認するために、周知の方法にしたがって、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖアッセイ、および、ＴＵＮＥＬアッセイを行った。

図９（Ｂ）に、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖアッセイの結果を示す。

図９（Ｂ）に示すように、ＥＬＡＳ１が発現しているＵ２ＯＳ／Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞では、γ線を照射後７２時間目で、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖに対して陽性の細胞が増加していた。より具体的には、「early apoptosis」にある細胞が、全細胞のうちの略３２％であり、「late apoptosis」にある細胞が、全細胞のうちの略２３％であった。

図９（Ｃ）に、ＴＵＮＥＬアッセイの結果を示す。なお、図９（Ｃ）において、「ＮＴ」は、γ線を照射する前のデータを示し、「ＩＲ７２」は、γ線を照射後７２時間目のデータを示している。

空のｐＴＲＥＴ３−６Ｍｙｃが導入されたＵ２ＯＳ／Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞と比較して、ＥＬＡＳ１が挿入されたｐＴＲＥＴ３−６Ｍｙｃが導入されたＵ２ＯＳ／Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞、および、ＥＬＡＳ２が挿入されたｐＴＲＥＴ３−６Ｍｙｃが導入されたＵ２ＯＳ／Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞では、ＴＵＮＥＬに対して陽性の細胞が顕著に増加していた。特に、ＥＬＡＳ１が挿入されたｐＴＲＥＴ３−６Ｍｙｃが導入されたＵ２ＯＳ／Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞は、ＥＬＡＳ２が挿入されたｐＴＲＥＴ３−６Ｍｙｃが導入されたＵ２ＯＳ／Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞と比較して、ＴＵＮＥＬに対して陽性の細胞の数が多かった。

以上のことは、ＥＬＡＳ１およびＥＬＡＳ２が、γ線によるアポトーシスを、効率よく引き起こし得ることを示している。

＜６．薬剤によるアポトーシスの誘導−１＞
細胞にγ線を照射すると、細胞の染色体ＤＮＡがダメージを受ける。当該染色体のダメージには幾つかの種類が存在する。例えば、当該ダメージとして、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ：DNA double strand break）およびＤＮＡ一本鎖切断（ＳＳＢ：DNA single strand break）などを挙げることができる。

本発明者等は、γ線によって誘起される、ＥＬＡＳ１およびＥＬＡＳ２を介したアポトーシスは染色体のダメージの種類に依存しているのではないか、との仮説の元、以下の試験を行った。

現在用いられている抗癌作用を有する薬剤の中には、ＤＳＢを誘導することなく抗癌作用を発揮するもの、および、ＤＳＢを誘導しながら抗癌作用を発揮するもの、等の様々な作用機序を有する薬剤が存在する。

ＤＳＢを誘導しながら抗癌作用を発揮する薬剤としては、現在までに多くの薬剤が知られている。なお、ＤＳＢが誘導されていることは、ＤＳＢのマーカーとして周知であるＨ２ＡＸおよびＣｙｃＧ２の二重染色によって確認することができる（具体的には、Ｈ２ＡＸおよびＣｙｃＧ２の局在が一致すれば、当該細胞においてＤＳＢが生じていると判定することができる）。

例えば、図１０に、各種薬剤によって４時間処理された後の骨肉腫（Ｕ２ＯＳ）細胞における、Ｈ２ＡＸおよびＣｙｃＧ２の二重染色の結果を示す。なお、染色は、市販の抗体を用いて、周知の方法にしたがって行った。

具体的に、Ｈ２ＡＸの染色には、一次抗体として抗γＨ２ＡＸ抗体（Millipore社製）を用い、二次抗体としてＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ／ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ抗体（Capel社製）を用いた。一方、ＣｙｃＧ２の染色には、一次抗体として抗ＣｙｃＧ２抗体（周知の方法にて作製したもの）を用い、二次抗体としてＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ／ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ抗体（Capel社製）を用いた。

また、薬剤としては、カンプトテシン（Camptothecin：ＣＰＴ）（sigma社製）、シスプラチン（Cisplatin）（LKT Laboratories,Inc製）、エトポシド（Etoposide）（sigma社製）、５−フルオロウラシル（5-fluorouracil：５−ＦＵ）（sigma社製）、および、イリノテカン（Irinotecan）（CAMPTO yakult社製）を用いた。

図１０に示すように、骨肉腫（Ｕ２ＯＳ）細胞を、１０グレイのγ線にて処理した場合、１０μＭのカンプトテシン（ＣＰＴ）にて処理した場合、２０μｇ／ｍＬのエトポシドにて処理した場合、２０μＭのイリノテカンにて処理した場合、核の内部において、Ｈ２ＡＸおよびＣｙｃＧ２の局在が一致した。このことは、γ線、カンプトテシン、エトポシド、および、イリノテカンが、骨肉腫（Ｕ２ＯＳ）細胞においてＤＳＢを引き起こしていることを示している。

＜７．薬剤によるアポトーシスの誘導−２＞
上記＜４＞にて説明したＵ２ＯＳ／Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞について、様々な濃度のカンプトテシン、イリノテカン、シスプラチン、または、エトポシドと、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）との存在下において、経時的に各細胞の細胞周期（特に、ｓｕｂ−Ｇ１）を観察した。

図１２（Ａ）に示すように、ＤＳＢを生じさせないシスプラチンに対する細胞の感受性（換言すれば、シスプラチンによる細胞死の生じ易さ）は、ＥＬＡＳ１およびＥＬＡＳ２によって変化しなかった。

一方、図１１（Ａ）に示すように、ＤＳＢを生じさせるカンプトテシンに対する細胞の感受性（換言すれば、カンプトテシンによる細胞死の生じ易さ）は、ＥＬＡＳ１およびＥＬＡＳ２によって増強された。

また、図１１（Ｃ）に示すように、ＤＳＢを生じさせるイリノテカンに対する細胞の感受性（換言すれば、イリノテカンによる細胞死の生じ易さ）は、ＥＬＡＳ１およびＥＬＡＳ２によって増強された。

また、図１２（Ｂ）に示すように、ＤＳＢを生じさせるエトポシドに対する細胞の感受性（換言すれば、エトポシドによる細胞死の生じ易さ）は、ＥＬＡＳ１およびＥＬＡＳ２によって増強された。

本発明は、細胞死（例えば、アポトーシスによる細胞死）を誘導するための薬剤として利用することができる。

本発明は、ＤＮＡ二本鎖切断が生じた細胞を特異的に細胞死（例えば、アポトーシスによる細胞死）させるための薬剤として利用することができる。

本発明は、抗癌剤として利用することができる。

Claims (10)

1. ＥＬＡモチーフを少なくとも一部分として含んでいるタンパク質、または、上記タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを少なくとも一部分として含んでいる核酸、を含んでいることを特徴とする細胞死促進剤。
2. 以下の（ａ）または（ｂ）に記載のポリペプチドを少なくとも一部分として含んでいるタンパク質、または、上記タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを少なくとも一部分として含んでいる核酸、を含んでいることを特徴とする請求項１に記載の細胞死促進剤：
   （ａ）配列番号１または２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
   （ｂ）配列番号１または２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、サイクリンとＰＰ２Ａ Ｂ’γサブユニットとの結合を阻害するポリペプチド。
3. 投与対象が、ＤＮＡ二本鎖切断を発症している生体、または、ＤＮＡ二本鎖切断を発症させるための処置が施される生体、であることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞死促進剤。
4. 上記生体は、γ線照射、Ｘ線照射、トポイソメラーゼＩ阻害剤の投与、または、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤の投与によって、ＤＮＡ二本鎖切断を発症している生体、または、ＤＮＡ二本鎖切断を発症させるための処置が施される生体であることを特徴とする請求項３に記載の細胞死促進剤。
5. ＤＮＡ二本鎖切断を発症させる薬剤を含んでいることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の細胞死促進剤。
6. 上記薬剤は、トポイソメラーゼＩ阻害剤およびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１つであることを特徴とする請求項５に記載の細胞死促進剤。
7. 上記タンパク質をコードしているポリヌクレオチドは、以下の（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡを少なくとも一部分として含んでいるポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載の細胞死促進剤。
   （ｃ）配列番号３または４に示される塩基配列からなるＤＮＡ；
   （ｄ）配列番号３または４に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、サイクリンとＰＰ２Ａ Ｂ’γサブユニットとの結合を阻害するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
8. 上記タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを少なくとも一部分として含んでいる核酸は、発現ベクター内に、上記タンパク質をコードしているポリヌクレオチドが挿入されたものであることを特徴とする請求項１〜７の何れか１項に記載の細胞死促進剤。
9. 上記発現ベクターは、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、または、ウイルス粒子であることを特徴とする請求項８に記載の細胞死促進剤。
10. アポトーシスを誘導するものであることを特徴とする請求項１〜９の何れか１項に記載の細胞死促進剤。