JP2015154809A - 人工骨およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】生体内に移植後に低分子化合物を長時間にわたって徐放し続ける。【解決手段】リン酸カルシウムの多孔体からなる基材２と、該基材２の外表面を被覆する積層膜３とを備え、該積層膜３は、正に荷電した生体親和性材料からなる正電荷層３ａと、負に荷電した生体親和性材料からなる負電荷層３ｂとが交互に積層されてなり、正電荷層３ａおよび負電荷層３ｂに、低分子化合物４が内包されている人工骨１を提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、人工骨およびその製造方法に関するものである。

従来、リン酸カルシウムを主成分とする人工骨が知られている（例えば、特許文献１，２参照。）。骨組織に移植された人工骨が自家骨に置換されるためには、この人工骨を足場として骨を形成する骨芽細胞が必要である。特許文献１，２では、移植前に、デキサメタゾン（ＤＥＸ）のような分化誘導因子を添加した培地を用いて人工骨上で幹細胞を培養して骨芽細胞へ分化させている。

特開２００７−２０９２０３号公報 特開２０１３−２１６６６１号公報

人工骨を骨組織に移植した後、生体内の血液や骨髄に存在する幹細胞も骨芽細胞へ分化させることができれば、人工骨の自家骨への置換に要する期間の短縮を図ることができる。しかしながら、無機物であるリン酸カルシウムに対して、ＤＥＸのような低分子化合物を化学的に結合させることは難しく、人工骨に低分子化合物を安定的に担持させることが困難であるという問題がある。また、人工骨の表面に単に低分子化合物を吸着させただけでは、生体内に移植後、短時間の内に低分子化合物が人工骨から放出されてしまうために、幹細胞に対する分化誘導効果を得ることが難しいという問題がある。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、生体内に移植後に低分子化合物を長時間にわたって徐放し続けることができる人工骨およびその製造方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、リン酸カルシウムの多孔体からなる基材と、該基材の外表面を被覆する積層膜とを備え、該積層膜は、正に荷電した生体親和性材料からなる正電荷層と、負に荷電した生体親和性材料からなる負電荷層とが交互に積層されてなり、前記正電荷層および前記負電荷層に、低分子化合物が内包されている人工骨を提供する。

本発明によれば、リン酸カルシウムからなる基材の表面は水中において負に荷電するので、基材の外表面上に、該外表面側から順番に正電荷層と負電荷層とが交互に積層されてなる積層膜は、基材の外表面に静電気力によって安定に結合した膜となる。この積層膜に低分子化合物を内包させることによって低分子化合物を基材に安定に担持させることができる。

この場合に、人工骨が生体内に移植された後、積層膜が外側から徐々に分解されるにつれて低分子化合物が徐々に放出される。これにより、生体内に移植後に低分子化合物を長時間にわたって徐放し続けることができる。

上記発明においては、前記低分子化合物が、少なくともデキサメタゾンを含むことが好ましい。
このようにすることで、人工骨を骨組織に移植した後に、人工骨の周囲に存在する幹細胞の骨芽細胞への分化がデキサメタゾンによって誘導され、分化した骨芽細胞によって人工骨を足場とした骨形成が行われる。これにより、人工骨の自家骨への置換を促進することができる。

また、本発明は、リン酸カルシウムの多孔体からなる基材を正に荷電した生体親和性材料と低分子化合物とを含む溶液に浸漬する正電荷層形成ステップと、前記基材を負に荷電した生体親和性材料と前記低分子化合物とを含む溶液に浸漬する負電荷層形成ステップとを含み、前記正電荷層形成ステップと前記負電荷層形成ステップとを交互に繰り返すことにより、前記正に荷電した生体親和性材料からなる正電荷層と前記負に荷電した生体親和性材料からなる負電荷層とが交互に積層されてなり前記低分子化合物を内包した積層膜を前記基材の外表面上に形成する人工骨の製造方法を提供する。

本発明によれば、生体内に移植後に低分子化合物を長時間にわたって徐放し続けることができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る人工骨の構成を示す図である。 図１の人工骨の製造方法を示すフローチャートである。 積層膜を備えない人工骨のＤＥＸの放出量を継時的に測定した結果を示す吸光度スペクトルである。 １０層のＰＥＩ層／ゼラチン層からなる積層膜を備える人工骨のＤＥＸの放出量を継時的に測定した結果を示す吸光度スペクトルである。 ２０層のＰＥＩ層／ゼラチン層からなる積層膜を備える人工骨のＤＥＸの放出量を継時的に測定した結果を示す吸光度スペクトルである。 ４０層のＰＥＩ層／ゼラチン層からなる積層膜を備える人工骨のＤＥＸの放出量を継時的に測定した結果を示す吸光度スペクトルである。 図４から図６の吸光度スペクトルから求めた、ＤＥＸの放出量の時間変化を表わすグラフである。

以下に、本発明の一実施形態に係る人工骨１とその製造方法について図１および図２を参照して説明する。
本実施形態に係る人工骨１は、図１に示されるように、リン酸カルシウムの多孔体からなる基材２と、該基材２の外表面を被覆する積層膜３とを備えている。

基材２は、その移植部位に適した形状および寸法を有している。図１には、微細な顆粒状の基材２が示されているが、基材２は、例えば、ブロック状であってもよい。
積層膜３は、基材２の外表面上に正電荷層３ａと負電荷層３ｂとが交互に積層されてなる多層構造を有している。積層膜３のうち、基材２に隣接する最内層は正電荷層３ａである。正電荷層３ａは、正に荷電した生体親和性材料（以下、生体親和性材料（＋）と言う。）、好ましくはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）のような高分子材料からなる。負電荷層３ｂは、負に荷電した生体親和性材料（以下、生体親和性材料（−）と言う。）、好ましくはゼラチンのような高分子材料からなる。

基材２の外表面とその内部に形成された多数の細孔の内表面とには、低分子化合物４が略均一に分散して吸着している。また、正電荷層３ａおよび負電荷層３ｂにも、低分子化合物４が内包されている。低分子化合物４は、人工骨１の移植部位の治癒に寄与する化合物であり、少なくともデキサメタゾン（ＤＥＸ）を含む。また、低分子化合物４は、正電荷層３ａおよび負電荷層３ｂのいずれにも安定に担持されるように、電気的に略中性であることが好ましい。

次に、上述した人工骨１の製造方法について説明する。
本実施形態に係る人工骨１の製造方法は、図２に示されるように、基材２に低分子化合物４を担持させる低分子化合物担持ステップＳ１と、正電荷層３ａを形成する正電荷層形成ステップＳ２と、正電荷層３ａを形成した基材２を洗浄する洗浄ステップＳ３と、負電荷層３ｂを形成する負電荷層形成ステップＳ４と、負電荷層３ｂを形成した基材２を洗浄する洗浄ステップＳ５と、ステップＳ２〜ステップＳ５を繰り返す繰り返しステップＳ６とを含む。

まず、低分子化合物担持ステップＳ１において、基材２を、低分子化合物４を含む低分子化合物水溶液に浸漬させる。これにより、低分子化合物水溶液が多孔質の基材２の内部にまで浸透し、低分子化合物水溶液中の低分子化合物４が、基材２の外表面のみならず細孔の内表面にも吸着する。

次に、正電荷層形成ステップＳ２において、低分子化合物４を担持させた基材２を、生体親和性材料（＋）と低分子化合物４とを含む水溶液（以下、水溶液（＋）と言う。）に浸漬させる。水溶液（＋）中において、リン酸カルシウムからなる基材２の表面は、負に荷電する。したがって、基材２と生体親和性材料（＋）との間に働く静電気力によって、生体親和性材料（＋）は基材２の外表面全体を覆うように該外表面上に安定に吸着して正電荷層３ａを形成する。この正電荷層３ａの形成過程において、水溶液（＋）に含まれている低分子化合物４が正電荷層３ａに取り込まれることによって、正電荷層３ａに低分子化合物４が内包される。

次に、洗浄ステップＳ３において、水溶液（＋）から抽出した基材２を洗浄液に浸漬することによって、過剰な生体親和性材料を（＋）を除去する。この後、洗浄液から抽出した基材２を乾燥させる工程をさらに行った後に、次のステップに移ることが好ましい。このようにすることで、正電荷層３ａを安定化することができ、構造的により安定した積層膜３を形成することができる。

次に、負電荷層形成ステップＳ４において、正電荷層３ａを形成した基材２を、生体親和性材料（−）と低分子化合物４とを含む水溶液（以下、水溶液（−）と言う。）に浸漬させる。これにより、正電荷層３ａと、負に荷電した生体親和性材料（−）との間に働く静電気力によって、生体親和性材料（−）は、正電荷層３ａの外表面全体を覆うように該外表面上に安定に吸着して負電荷層３ｂを形成する。この負電荷層３ｂの形成過程においても、水溶液（−）に含まれている低分子化合物４が負電荷層３ｂに取り込まれることによって、負電荷層３ｂに低分子化合物４が内包される。

次に、洗浄ステップＳ５において、上述したステップＳ３と同様に、水溶液（−）から抽出した基材２を洗浄液に浸漬することによって、過剰な生体親和性材料（−）を除去する。このときも、負電荷層３ｂを安定化するために、洗浄液から抽出した基材２を乾燥させる工程をさらに行った後に、次のステップに移ることが好ましい。

以上のステップＳ２からステップＳ５までが繰り返しステップＳ６において繰り返されることにより、多層構造を有する積層膜３が形成され、本実施形態に係る人工骨１が製造される。
ここで、積層膜３は、上述したように、基材２と正電荷層３ａとの間、および、正電荷層３ａと負電荷層３ｂとの間に働く静電気力によって、基材２の外表面に安定に結合して存在することができる。

次に、このように構成された人工骨１の作用について説明する。
本実施形態に係る人工骨１が生体内の骨組織の欠損部に移植された後、積層膜３が外側から徐々に分解されるにつれて、積層膜３に内包されていたＤＥＸが徐々に周囲へ放出される。放出されたＤＥＸは、人工骨１の周囲に存在する幹細胞に作用し、該幹細胞の骨芽細胞への分化を誘導する。そして、移植前から骨組織に存在していた骨芽細胞と新たに分化した骨芽細胞とが基材２を足場として骨を形成することによって、基材２が徐々に自家骨に置換されて骨欠損部が治癒する。

このように、本実施形態によれば、基材２の外表面上に安定に結合した積層膜３にＤＥＸのような低分子化合物４を内包させることによって、リン酸カルシウムからなる基材２に対して低分子化合物４を安定的に担持させることが可能となる。また、積層膜３に内包された低分子化合物４は、積層膜３が分解されるまで該積層膜３に留まる。これにより、人工骨１を生体内に移植後に低分子化合物４を長時間にわたって徐放し続け、ＤＥＸによる幹細胞の分化誘導効果を十分に得ることができるという利点がある。

なお、本実施形態においては、ＤＥＸを分化誘導剤として使用することとしたが、これに代えて、抗炎症剤として使用してもよい。生体内に移植後のＤＥＸの作用は、その濃度によって異なる。すなわち、ＤＥＸを抗炎症剤として使用するときは、人工骨１に担持させるＤＥＸの濃度を、分化誘導剤として使用するときよりも高くすればよい。

例えば、整形外科分野において、滑膜の炎症の治療として、患部にＤＥＸを注射する方法が用いられている。このような用途において、微小な顆粒状の基材２を用いた人工骨１を注射で患部に投与することで、ＤＥＸの抗炎症効果を従来に比べて長時間にわたって持続させることができる。

また、本実施形態に係る人工骨１およびその製造方法においては、低分子化合物４として、ＤＥＸに代えて、またはＤＥＸに加えて、他の薬剤も使用可能である。他の薬剤を使用した場合にも、生体内に移植後に積層膜３が外側から徐々に分解されるにつれて薬剤が長時間にわたって徐放され続けることにより、薬剤の効果を長時間にわたって持続させることができる。なお、骨以外の組織に移植された基材２は、自家骨化することなく分解されて消失するので、生体に影響を及ぼすことはない。

次に、上述した人工骨１の実施例について、図３から図７を参照して以下に説明する。
以下の材料を使用して本発明の一実施例に係る人工骨を製造した。
基材として、βリン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）多孔体ブロックを使用した。
低分子化合物水溶液として、０．２％のＥｔＯＨを含むＰＢＳに、０．５×１０^−４ＭのＤＥＸを添加したＤＥＸ溶液を使用した。
水溶液（＋）として、０．５×１０^−４ＭのＮａＣｌを含む０．１ＭのＰＢＳに、０．５×１０^−４ＭのＤＥＸと１ｍｇ／ｍＬのＰＥＩ（分子量１００００）とを添加したＰＥＩ溶液を使用した。

水溶液（−）として、０．５×１０^−４ＭのＮａＣｌを含む０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に、０．５×１０^−４ＭのＤＥＸと１．０ｍｇ／ｍＬのゼラチンとを添加したゼラチン溶液を使用した。
洗浄液として、１ＭのＮａＣｌを含む０．１ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に、０．５×１０^−４ＭのＤＥＸを添加した洗浄液を使用した。

上記の材料を使用し、次の（１）〜（６）の手順に沿ってβ−ＴＣＰ多孔体ブロックを処理することにより、本実施例に係る人工骨を製造した。
（１）４５ｍｇのβ−ＴＣＰ多孔体ブロックに１ｍＬのＤＥＸ溶液を混合し、２時間静置した。これにより、β−ＴＣＰ多孔体ブロックにＤＥＸを担持させた。
（２）（１）でＤＥＸを担持させたβ−ＴＣＰ多孔体ブロックを、４ｍＬのＰＥＩ溶液に５分間浸漬させた。
（３）（２）でＰＥＩ層を形成したβ−ＴＣＰ多孔体ブロックを、洗浄液に１分間浸漬させた。
（４）（３）で洗浄したβ−ＴＣＰ多孔体ブロックを、４ｍＬのゼラチン溶液に５分間浸漬させた。
（５）（４）でゼラチン層を形成したβ−ＴＣＰ多孔体ブロックを、洗浄液に１分間浸漬させた。
（６）（２）〜（５）を、１０回、２０回または４０回繰り返した。

以上の手順により、β−ＴＣＰ多孔体ブロックの表面上に、ＰＥＩ層／ゼラチン層が１０層、２０層または４０層積層されてなる積層膜を形成し、本実施例に係る人工骨を製造した。また、本実施例の比較例に係る人工骨として、β−ＴＣＰ多孔体ブロックに（１）の処理のみを施すことにより、積層膜を備えない人工骨も製造した。

次に、本実施例に係る人工骨と比較例に係る人工骨とのＤＥＸの放出機能を比較するために、以下の実験を行った。
本実施例および比較例に係る人工骨をそれぞれ１ｍＬのＰＢＳに浸漬し、所定時間毎に上澄みを回収するとともに等量のＰＢＳを残りのＰＢＳに添加し、回収した上澄みの吸光度を測定することにより、上澄みに含まれるＤＥＸの量を測定した。吸光度測定においては、ＰＢＳの測定値をブランクとして用いた。これにより、各人工骨からＰＢＳ中に放出されたＤＥＸの量を評価した。なお、上記の吸光度測定においては、８．００ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．２０ｇ／ＬのＫＣｌ、１．４４ｇ／ＬのＮａ_２ＨＰＯ_４および０．２４ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４を含むＰＢＳを使用した。

図３から図６に、本実施例に係る人工骨と比較例に係る人工骨の上澄みから得られた吸光度スペクトルを示す。各人工骨について、ＰＢＳに浸漬してから０、３０、６０、…１８０、３００、３３０分間、および２４時間経過時に上澄み液を回収し、吸光度測定を行った。ＤＥＸの最大吸収波長は、２４０ｎｍである。図７は、図３から図６のそれぞれについて、波長２４０ｎｍにおける吸光度を時系列に並べたグラフである。

図３から図６から分かるように、人工骨からＰＢＳ中へ放出されたＤＥＸの量を示す２４０ｎｍにおけるピークが、比較例の０層の場合と比べて、１０、２０および４０層の場合には顕著に大きくなっていた。これにより、積層膜にＤＥＸが担持されることが確認された。さらに、図７からより明確に分かるように、１０、２０および４０層においては、ＤＥＸの十分な量の放出が２４時間経過時にも確認された。積層数とＤＥＸの放出量との関係に着目すると、１０層と２０層との間では、放出量が積層数に比例して２倍となったが、２０層と４０層との間では、積層数と放出量との間に比例関係は認められなかった。

以上の実験結果から、本実施例に係る人工骨は、その外表面に形成された積層膜によってＤＥＸを安定的に担持し、ＤＥＸを長時間にわたって放出し続けることが確認された。生体内におけるＤＥＸの放出は、上記の試験管内でのそれよりも緩やかに進むと考えられる。したがって、本実施例の人工骨は、生体内に移植後、２４時間以上ＤＥＸを徐放し続けることができると期待される。

１ 人工骨
２ 基材
３ 積層膜
３ａ 正電荷層
３ｂ 負電荷層
４ 低分子化合物
Ｓ１ 低分子化合物担持ステップ
Ｓ２ 正電荷層形成ステップ
Ｓ３，Ｓ５ 洗浄ステップ
Ｓ４ 負電荷層形成ステップ

Claims (3)

1. リン酸カルシウムの多孔体からなる基材と、
   該基材の外表面を被覆する積層膜とを備え、
   該積層膜は、正に荷電した生体親和性材料からなる正電荷層と、負に荷電した生体親和性材料からなる負電荷層とが交互に積層されてなり、
   前記正電荷層および前記負電荷層に、低分子化合物が内包されている人工骨。
2. 前記低分子化合物が、少なくともデキサメタゾンを含む請求項１に記載の人工骨。
3. リン酸カルシウムの多孔体からなる基材を正に荷電した生体親和性材料と低分子化合物とを含む溶液に浸漬する正電荷層形成ステップと、
   前記基材を負に荷電した生体親和性材料と前記低分子化合物とを含む溶液に浸漬する負電荷層形成ステップとを含み、
   前記正電荷層形成ステップと前記負電荷層形成ステップとを交互に繰り返すことにより、前記正に荷電した生体親和性材料からなる正電荷層と前記負に荷電した生体親和性材料からなる負電荷層とが交互に積層されてなり前記低分子化合物を内包した積層膜を前記基材の外表面上に形成する人工骨の製造方法。

Images