JP2015154729A - 細胞解析方法及び装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】細胞培養面に対物レンズを介さずに近接させたフォトセンサを用いて、透過照明下、当該培養細胞に基づいて得られる光学パターンを撮像し、培地中に形成される細胞コロニーをモニタリングする、細胞解析方法。
【選択図】図1
Description
1)細胞培養面に対物レンズを介さずに近接させたフォトセンサを用いて、透過照明下、当該培養細胞に基づいて得られる光学パターンを撮像し、培地中に形成される細胞コロニーをモニタリングする、細胞解析方法。
2)細胞コロニーの形成の有無、又は細胞コロニーのサイズ若しくは立体形状が測定される、上記1)の細胞解析方法。
3)2次元フォトセンサを有する撮像装置、前記撮像装置の受光面上に載置された培養チャンバー、前記培養チャンバー内の細胞培養面に対して透過照明する透過照明光学系、及び演算装置を含む細胞解析装置によって光学パターンが撮像される、上記1)又は2)の細胞解析方法。
4)2次元フォトセンサを有する撮像装置、前記撮像装置の受光面上に載置された培養チャンバー、前記培養チャンバー内の細胞培養面に対して透過照明する透過照明光学系、及び演算装置を含む、上記1)〜3)の細胞解析を行うための装置。
また、本発明の細胞解析方法では、細菌の培養経過を高い時間分解能で経時的に記録することが可能であり、時間経過に伴う変化を生じないバックグラウンドに対して、動的変化を示すコロニー像をシグナルとして判別することにより、コロニー形成の迅速な判定が可能となる。
当該細胞解析に用いられる装置は、フォトセンサを有する撮像装置と、前記撮像装置の受光面上に載置される培養チャンバーと、培養チャンバー内の細胞培養面に対して透過照明する透過照明光学系と、演算装置とを含む。図1に、一実施形態である細胞解析装置の構成例を示す。
図1には、スライドガラス3とカバーガラス4を、スペーサー5を介して重ね合わせて作製されたチャンバーを示した。スライドガラスとカバーガラスにより培養チャンバーを形成する場合は、例えばスライドガラスにスペーサーシールを貼り、そこに培地を流し込んだ後、固化し、当該培地上に測定対象の細胞をプレーティングし、カバーガラスを載せることにより、作製できる。
また、本発明のフォトセンサ画像中のコロニー像においては、菌体の単層ないし軽度の積層部分は高輝度部として、多層集積した中心部分は低輝度部として、さらに異なる積層状態の境界部では帯状の低輝度部として、それぞれ可視化される(図7)。したがって、得られたフォトセンサ画像中のコロニー像の光学パターンから、コロニーの立体形状の推定が可能となる。
(1)培養チャンバーの作製
スライドガラス(厚さ:1.2mm)に9mm角のスペーサーシール(厚さ:300μm)を2枚重ねて貼り、4.0%(w/v)低融点アガロース添加LB培地を流し込み、20分間室温で放置することでLB寒天培地を固化し、培養チャンバーを作製した。
LB液体培地中37℃で12時間振とう培養したE.coli ATCC8739株の懸濁液を遠心(8000g,24℃,5min)した後、リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、菌体濃度が105cells/mLとなるように希釈調製した。培養チャンバーの寒天培地上に菌体懸濁液1μL(含有細胞数:100 cells)を滴下し、プレーティングを行った。プレーティングした寒天培地にカバーガラス(厚さ:170μm)を載せ、インキュベートした(37℃)。
E.coliを培養した上記培養チャンバーを、プレーティング面を下にしてCMOSセンサ(pixel size:3.2μm,受光領域:6.6mm×4.9mm)の保護ガラス上に設置した状態で、波長465nmのLED光照射下で撮像する広域イメージング系を構築した(図1)。
受光領域全面に対応する6.6mm×4.9mmの透過光画像を取得した結果、高輝度部と低輝度部から構成される光学パターンが観察された(図2下段)。同位置の明視野顕微鏡画像(図2上段)と比較したところ、E.coliコロニー由来の像であることが確認された。
さらに、CMOSセンサ画像で得られたコロニー像と明視野顕微鏡画像におけるコロニー像に対し、その辺縁に外接する円を描き、その直径をコロニーサイズとして計測した。
その結果、CMOSセンサを用いた広域イメージング系によって、実際のコロニーサイズと相関のあるコロニー像の取得が可能であることが示された(図3)。
コロニー形成モニタリングを実施するために、培養チャンバーの厚さ600μmの寒天培地上でE.coliを培養し、室温かつLED光源を用いた波長465nmの光照射下で、5分間隔で7時間、計84枚の画像を取得した。
菌体のプレーティング直後(t=0h)には像が観察されていなかった位置から、約2時間後にE.coliコロニー由来と考えられる像が観察された(図4)。その後、時間経過に伴い、CMOSセンサ画像中のコロニー像の拡大が確認された。広域を対象としたE.coliの培養経過をモニタリングすることにより、時間経過に伴う変化を生じないバックグラウンドや矢印で示した不純物に対して、動的変化を示すコロニー像をシグナルとして検出することが可能であった。この手法により、約2−3時間でコロニー形成判定を行うことが可能であった。また、CMOSセンサの受光領域(6.6mm×4.9mm)中に点在する全コロニーについて、それぞれのサイズ変化を同時多並列に追跡可能であった。
種々の抗菌薬濃度条件下でのコロニー形成評価を行うために、抗菌薬ストレプトマイシン(SM,終濃度=0,2,4,8,16μg/mL)含有の1.5%(w/v)低融点アガロース添加LB培地を流し込み、20分間室温で放置することでLB寒天培地を固化させた培養チャンバーを作製した。各寒天培地上に菌体懸濁液1μL(含有細胞数:100 cells)を滴下し、カバーガラス(厚さ:170μm)を載せた。
E.coliをプレーティングした寒天培地をCMOSセンサの保護ガラス上に設置し、室温で保持し、LED光源を用いた波長465nmの光照射下で、1時間ごとに計9時間、画像を取得した。このとき、プレーティングを行った時間をt=0hとした。
終濃度が0,2,4,8μg/mLのSM含有LB寒天培地上において、プレーティング直後には像が観察されなかった位置から、t=4hでE.coliコロニー像が観察された。
比較のために、10cmディッシュを用いて作製したSM含有寒天培地上にE.coliをプレーティングし、12時間インキュベートしたのち、目視確認を行う従来法を実施した結果、終濃度8,16μg/mLのSM条件では目視可能なコロニーは確認されなかった。一方で、終濃度0,2,4μg/mL条件ではコロニーが確認された。これは、広域イメージング系においてE.coliの増殖が確認されたSM含有濃度条件と一致するものであった。
以上より、広域イメージング系を用いて異なる培養条件におけるコロニーサイズ推移を評価することが可能であった。また、その評価結果が従来法の目視判定結果と相関をもつことが確認された。
実施例1の培養において、培養チャンバー上に形成されたコロニーの高さを計測したところ、4.5時間培養したコロニーは8μm、5.5時間培養したコロニーは11μm、7.5時間のコロニーについては14μmとなり、培養経過に伴うコロニーの高さの上昇が確認された。また、顕微鏡観察により、菌体が単層状態から積層状態へと推移していくコロニーの立体形状の変化が確認された。
一方で、CMOSセンサ画像中の対応するコロニー像においても、高輝度部と低輝度部から構成される光学パターンの推移が観察された(図7)。菌体の単層ないし軽度の積層部分は、高輝度部として可視化された。また、多層集積した中心部分に対応した低輝度領域が生じ、さらに異なる積層状態の境界部では帯状の低輝度部が確認された。
これより、CMOSセンサ画像中のコロニー由来光学パターンから、コロニーの立体形状の推定が可能であることが示唆された。
2 培養チャンバー
3 スライドガラス
4 カバーガラス
5 スペーサー
6 透過照明光源
Claims (4)
- 細胞培養面に対物レンズを介さずに近接させたフォトセンサを用いて、透過照明下、当該培養細胞に基づいて得られる光学パターンを撮像し、培地中に形成される細胞コロニーをモニタリングする、細胞解析方法。
- 細胞コロニーの形成の有無、又は細胞コロニーのサイズ若しくは立体形状が測定される、請求項1記載の細胞解析方法。
- 2次元フォトセンサを有する撮像装置、前記撮像装置の受光面上に載置された培養チャンバー、前記培養チャンバー内の細胞培養面に対して透過照明する透過照明光学系、及び演算装置を含む細胞解析装置によって光学パターンが撮像される、請求項1又は2記載の細胞解析方法。
- 2次元フォトセンサを有する撮像装置、前記撮像装置の受光面上に載置された培養チャンバー、前記培養チャンバー内の細胞培養面に対して透過照明する透過照明光学系、及び演算装置を含む、請求項1〜3のいずれか1項記載の細胞解析を行うための装置。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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JP2014030550A JP2015154729A (ja) | 2014-02-20 | 2014-02-20 | 細胞解析方法及び装置 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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JP2014030550A JP2015154729A (ja) | 2014-02-20 | 2014-02-20 | 細胞解析方法及び装置 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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JP2015154729A true JP2015154729A (ja) | 2015-08-27 |
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ID=54774508
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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JP2014030550A Pending JP2015154729A (ja) | 2014-02-20 | 2014-02-20 | 細胞解析方法及び装置 |
Country Status (1)
Country | Link |
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JP (1) | JP2015154729A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2018033430A (ja) * | 2016-09-02 | 2018-03-08 | 国立大学法人東京農工大学 | 微生物の判別方法 |
-
2014
- 2014-02-20 JP JP2014030550A patent/JP2015154729A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
BIOSENSORS & BIOELECTRONICS, 1996, 11(1/2):81-90, JPN6017045825 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2018033430A (ja) * | 2016-09-02 | 2018-03-08 | 国立大学法人東京農工大学 | 微生物の判別方法 |
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