JP2015108601A - 液面位置の検出方法、装置、液体供給装置、および分析システム - Google Patents

Abstract

【課題】 本発明は、光透過性容器内に配置された液体の液面高さを測定する方法を提供する。【解決手段】 光透過性容器内の液面位置を測定する方法であって、前記容器の底部に受光面が存在する状態で、液体と接する内壁では光が透過し、空気と接する内壁では全反射するように光を液面に対して斜めから照射させ、前記全反射によって生じる暗部と明部の境界位置を前記受光面で検出することを特徴とする方法。【選択図】 図１

Description

本発明は、光透過性容器内に配置された液体の液面位置を検出する方法に関する。

近年、１枚のチップ上で化学または生化学分析に必要な要素を組み込むマイクロトータルアナリシスシステム（μ−ＴＡＳ）と呼ばれる技術についての研究開発が盛んである。チップはマイクロ流路、試薬保持機構、温度制御機構、送液機構、反応検出機構などから構成され、マイクロ流体デバイスと呼ばれている。

通常、試薬保持機構はデバイスに組込まれるが、検査を繰返し行うために比較的多量なマイクロリットルオーダーの試薬が必要な場合には、マイクロプレートなどの外部ウェルから分注するのが一般的である。その場合、ピペットロボットを用いて外部ウェル内の試薬を吸引し、マイクロ流体デバイスの試薬保持機構へ吐出することで試薬の分注が行われる。

ここで、ピペットロボットがウェル内の試薬を繰り返し分注すると、分注される試薬量が変動するという問題が生じる。図８に容器５１内の液面高さ減少前後でのピペットチップの液体吸引量変化の模式図を示す。まず図８（Ａ）において、液面からチップ先端までの距離ｈ_１、ピペットチップ内に先端からＨの高さまで液体が入っている。次に、分注により図８（Ｂ）のように液面からチップ先端までの距離がｈ_２に減少したと仮定し、この時のピペットチップ内の液面高さの減少量ΔＨを求める。液体５２の密度をρ_ｗ、ピペットチップ内の液面の制御圧力Ｐを一定とし、毛管力により液体がピペットチップを上昇する力（毛管力）をＴとし、ピペットチップの断面積をｓ、重力加速度をｇとすると、図８（Ａ）でのピペットチップ内の液体にかかる力のつり合いから、次式（１）が得られる。
ρ_ｗｇ（Ｈ−ｈ_１）ｓ＝Ｐ＋Ｔ （１）

また、図８（Ｂ）でのピペットチップ内の液体にかかる力のつり合いから、次式（２）が得られる。
ρ_ｗｇ（Ｈ−ΔＨ−ｈ_２）ｓ＝Ｐ＋Ｔ （２）

式（１）と式（２）をまとめると、以下のように表すことができる。
ΔＨ＝ｈ_１−ｈ_２ （３）

以上より、ウェル内の液面が下降した分だけ、ピペットチップ内の液面高さも下降することがわかる。つまり、ピペットの制御圧力Ｐを精度よく一定に制御して試薬を分注したとしても、分注の繰り返しにより液面が低下するにつれて、吸引する試薬量が減少してしまうという課題があった。

この課題を解決する方法として、液面の位置を測定し、測定された液面位置に応じてピペット先端位置を機械的に調整する、あるいは制御圧力Ｐを調整することが有効である。

液面位置の測定には、接触式と非接触式の２通りの方法があるが、微量の液体を扱う場合は特にコンタミネーションによる影響を避ける必要があるため、非接触式の方法が望まれている。

非接触式の液面位置測定方法として、缶容器の開口部上方から光を照射し、缶上端部から液面上端部をカメラで撮像することで充填された液面位置を計測する方法が開示されている（特許文献１参照）。

また、容器内にあらかじめ液位ゲージを設置し、光の全反射により液内部と液外部での見え方の違いから液面位置を検出する方法も開示されている（特許文献２参照）。

特開平９−２１８０７７号公報 特開２００８−２９２３６４号公報

上記したいずれの液面を検出する方法も、マイクロプレートのような容積の小さい容器の液面を測定することに適さない。

たとえば、特許文献１のように液面上端部をカメラで撮像し気液界面の位置を観測する方法は、透明な容器ではコントラストが得られず、液面を検出することは困難である。

また、特許文献２のように、液面ゲージを、マイクロプレートのようなミリまたはマイクロリットルオーダーの小さい容器内にそれぞれ設置することは難しい。また、多数の検体を分析するなど、多種類の液体を扱う必要がある場合、再使用のための洗浄による劣化が生じやすく、また使い捨てとする場合にはコストの増加が避けられなくなる。

本発明は、このような背景技術を鑑みてなされたものであり、透明で容積の小さい容器内の液面位置を簡便に検出する方法を提供するものである。

上記課題を解決するために、本発明に係る液面位置の検出方法は、
光透過性容器内の液面位置を測定する方法であって、
前記容器の底部に受光面が存在する状態で、液体と接する内壁では光が透過し、空気と接する内壁では全反射するように光を液面に対して斜めから照射させ、前記全反射によって生じる暗部と明部の境界位置を前記受光面で検出することを特徴とする方法。

また、本発明に係る液面位置を測定する方法は、光透過性部材からなる側壁面を有する容器を用いて、該容器内に配置された液体の液面位置を測定する方法であって、光源から前記液面に前記光透過性部材を介さずに入射する第一の光と、前記光透過性部材を通過した後に前記液体に入射する第二の光と、が共に前記容器の底部に配置された受光面に到達するように前記液面に対し、斜め上から光を照射する工程と、前記光透過性部材が大気と接触する位置において光を全反射させることで生じる前記第一の光と第二の光の間の暗部の長さを測定する工程と、を有することを特徴とする。

本発明によれば、容積が小さい光透過性容器においても簡便に液面位置を測定できる。

本発明の液面位置の測定方法を実施するための全体構成図 光源から受光面に到達するまでの光の経路を示した概念図 液面位置と暗部長さの関係を示す概念図 複数のウェルを有する容器に係る全体構成図 液体供給装置の構成を示す模式図 分析システムの構成を示す模式図 本実施例で用いた光透過性容器の模式図 液面位置減少前後でのピペットチップの液体吸引量変化の模式図

以下、本発明の実施形態を図面に基づいて説明する。

（実施形態１：液面高さ測定方法および液面測定装置）
図１は、本形態に係る液面位置の測定方法を実施するための全体構成を示す図である。図１（Ａ）は上面図であり、図１（Ｂ）は縦断面図である。光透過性容器１には液体２が注入され、光透過性容器１の斜め上方には光源３が設置してある。光源３から発せられた光４は光透過性容器の底面に接するように配置された受光面５に到達する。受光面５は、ＣＣＤなどの受光手段によって形成されており、容器１を載置するための載置手段を兼ねている。

ここで、照射手段である光源３から発せられた光４が光透過性容器１側壁面と液体２の界面において全反射しないために、光源３は、光４の光透過性容器上面への入射角度Θ_１が次式（４）を満たすように設置する。空気の屈折率はｎ_１、光透過性容器の屈折率をｎ_２、液体の屈折率をｎ_３とした。

なお、光透過性容器１は、光源からの照射により容器の底面に存在する受光面に光が到達するように構成されていれば良く、透明または半透明の容器である。容器の材質は、プラスチックやガラスなど、特に限定はされない。以下では透明容器を用いて説明する。

液体２を注入する凹部は、１つだけ配置されてもよいし、複数個配置されてもよい。

また、この凹部を形成するプロセスは、射出成型や機械的な加工など、材料に合わせて選択することが好ましい。透明容器における容器の容積は特に限定されるものではないが、例えば０．０１μＬ〜１０００μＬ、好ましくは０．１μＬ〜１００μＬの容積をもつウエルを有することが好ましい。

光源３は、ＬＥＤ、レーザ、点光源、面光源など特に限定はされないが、凹部壁面への光入射角がほぼ一定となる点光源あるいは平行光を放出する面光源が望ましい。

受光面５に用いるセンサーは、ラインセンサー、エリアセンサーなど、照射光の明部と暗部の境界位置を特定できるセンサーであれば特に限定はされない。

続いて、本発明の原理について説明する。図２（Ａ）から（Ｄ）は本発明の液面位置を測定する際に光源３から受光面５に到達するまでの光４の経路を示した概念図である。光源３は透明容器１に対して一定の角度で光照射する面光源を想定している。図２（Ａ）の経路１１は、光４が透明容器１の容器上面を介さずに液体２に入射し、受光面５に到達する経路を示す。

図２（Ｂ）の経路１２は、光４が透明容器１の容器上面に入射した後、透明容器１側壁面の容器上端から液面までの界面に光が入射する場合の経路を示す。この経路１２を通る光は、屈折率の関係から透明容器と大気界面で全反射するため透明容器から脱出することができず、直接受光面５に到達する。

図２（Ｃ）の経路１３は、光４が透明容器１の容器上面に入射した後、透明容器１の液面よりも下部を光が通過する場合の経路を示す。

図２（Ｄ）は、経路１１、１２、１３により受光面に形成される暗部１４を示した概念図である。容器上端から液面までの界面に到達する経路１２の光は、界面で全反射してしまうために、経路１１を通過した光と、経路１３を通過した光との間に暗部１４が形成される。

この暗部１４の長さを受光面５により測定し、以下で説明する式（５）を用いて透明容器１上端から液面までの高さに変換することで、液面位置を測定することができる。

図３に液面位置と暗部長さの関係を示す概念図を示す。容器上面を基準とし、上面から液面までの高さをＬ、容器深さをＢ、容器底面から受光面までの距離をＴ、暗部長さをＤとし、透明容器の上面に対する光４の入射角をΘ_１、空気の屈折率をｎ_１、透明容器の屈折率をｎ_２、液体の屈折率をｎ_３とした。各界面での光の入射角及び屈折角は図３に示したとおりである。その時、暗部長さＤは、次の式（５）で表される。
Ｄ＝Ｌ（ｔａｎθ_１−ｔａｎθ_７＋ｔａｎθ_５）＋Ｂ（ｔａｎθ_７−ｔａｎθ_５）＋Ｔ（ｔａｎθ_８＋ｔａｎθ_６） （５）

ここで、光の入射角Θ_２〜Θ_８は、スネルの法則から既知の入射角度Θ_１で表すことができる。よって、暗部長さＤを求めることで液面高さＬを求めることができる。以上は面光源すなわち透明容器１に対して光の入射角がΘ_１で一定の場合で説明したが、点光源の場合は照射位置によってΘ_１を変えることで面光源の場合と同様に暗部長さＤを特定することができる。

すなわち、液体と接する内壁では光が透過し、空気と接する内壁では全反射するように光を液面に対して斜めから照射させることで、全反射によって生じる暗部と明部の境界位置を受光面で検出するものである。

そして、光源から前記液面に前記光透過性部材を介さずに入射する第一の光と、前記光透過性部材を透過した後に前記液体に入射する第二の光と、がともに前記容器の底部に配置された受光面に到達するように液面に対し斜め上から光を照射する工程と、光透過性部材が大気と接触する位置において光を全反射させることで生じる前記第一の光と第二の光の間の暗部の長さを測定する工程と、を有することで、液面位置、特に容器の上面を基準とした高さ情報を正確に取得することができる。

本発明に係る液面位置の測定方法および測定装置は、複数のウェルの液面位置の情報を、同一の光源および受光手段によって、同時または連続的に、あるいは一括して簡便に取得することができるという効果も有している。

また図４に示すように、複数のウェルが並列して配置された構成であっても、上述のように照射位置の関係に応じてΘ_１を求めることで、同時に液面位置を取得することができる。

本方法によれば、光透過性容器内の液面の位置を検出することができる。

光透過性容器は、液面の位置の検出に必要な部分を光透過性とすれば良いが、全体が透明容器で構成されたマイクロプレートのような透明容器であると好ましい。この場合、受光面を透明容器の底面に接触するように配置することができる。すなわち、透明容器を載置する載置部に受光面を有する受光手段を設けた構成が好ましい。

ただし、容器の底部に受光面が存在する状態であればよく、例えば貫通孔を有する透明部材と、受光面を有する底部材とを貼りあわせて凹部を形成した光透過性容器であってもよい。

（実施形態２：液体供給装置）
上記のように、容器内における液面位置、すなわち液面高さが測定されることにより、ピペットロボットの簡便な制御によって精度のよい液体供給を実現することができる。

以下に、液体供給装置１９の詳細について説明する。

図５は、本形態に係る液体供給装置１９を示す図であり、１５は実施形態１で示した液面測定装置（光源３および受光面５を有する）を示す。また、１６は容器から液体を吸引するためのピペットを有する、垂直方向または水平方向に移動可能なピペットロボットを示す。また、１７は載置台を示している。

ピペットの制御手段としては、液面位置に応じてピペットの吸引量を調整する手段、液面位置に応じてピペットの高さを調整する手段、液面位置に応じて容器の位置を調整する手段、の少なくともいずれかの手段を有していることが好ましい。

実施形態１で示したように、容器内に配置された試薬または検体などの液面の高さは正確に測定されているので、後述する実施例のように、ピペットあるいは容器の位置を制御することで、正確な液体の吸引を行うことができる。

これにより、正確な量の液体を異なるマイクロプレート１８やμ―ＴＡＳなどの分析手段に供給することができるようになる。

（実施形態３：分析システム）
本形態は、図６のような分析システムである。

分析システム２５は、実施形態２で示した液体供給装置１９、および流体デバイス２０を載置するための載置部２１、流体デバイス内の液体を制御するための液体制御機構２２を有する。さらに、処理手段として、流体デバイス内での化学または生化学反応を生ぜしめるための電極（あるいはヒーター）を制御するための電圧制御部２３を有する。

またさらに、および反応の結果生じる蛍光発光などの信号を検出する信号検出部２４を有する。信号検出部は、例えば光照射部２４ａおよび光検出部２４ｂからなり、流体デバイス内に存在する試料に光を照射することで発する蛍光を検出することができるようになっている。

この分析システムは、具体的に例えば、分析対象となる検体核酸とＰＣＲ試薬を混合したものを流体デバイス内に供給し、ヒーターに温度サイクルを印加することでＰＣＲ反応処理を生じさせることができる。ＰＣＲ試薬に含まれる蛍光試薬によって、ＰＣＲ反応を蛍光量の増加として検出することができる。

本形態においては、ピペットロボットが流体デバイスに供給する液体を極めて正確な量で常に供給することができ、分析の信頼性の向上に貢献することができる。

以下、実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明する。なお、以下の実施例は本発明をより詳細に説明するための例であって、実施形態は以下の実施例のみに限定されない。

実施例では液体を繰り返し吸引することを例にとって説明する。具体的には、液体を吸引する直前に液面高さを測定し、ピペットロボットのピペット先端位置を調整することで、分注を繰り返しても分注量を均一にできることを示した。

図７に本実施例で用いた透明容器の模式図を示す。実施例では図７に示すような透明容器４１に液体４２を注入しておき、ピペットロボット（不図示）を用いて液体の分注を行った。

透明容器４１は、アクリル（屈折率：１．４９）を射出成型することで作製した。外寸及び内寸は図４に示すとおりである。透明容器４１の底面に受光面４３としてラインセンサーを設置した。ラインセンサーの分解能は０．１ｍｍである。光源（不図示）はＬＥＤを用い、透明容器への光の入射角度は５０°とした。

透明容器４１には液体をあらかじめ５０μＬ分注されている。この透明容器４１内の液体４２をピペットロボットを用いて吸引し、化学はかりに対して分注する行為を繰り返し行った。そして、化学はかりに分注された液体４２の質量を測定し、体積に変換することでピペットの吸引体積のばらつきを評価した。なお、ピペットチップは２０μＬ用（内側の断面積０．７ｍｍ^２）を用い、ピペットの設定吸引量は３μＬ／回とした。

（比較例１）
本発明の比較例として、液面高さを測定せずに、液体４２を繰り返し吸引した場合について示す。

まず、ピペットチップの先端位置が透明容器４１内の液面から約２．０ｍｍ程度浸るような位置に設定し、繰り返し分注を行った。その結果、１回目の分注では３．０μＬを計量できたが、分注を繰り返す度に、分注量が０．１μＬずつ減少した。そして、分注を４回目繰り返した時には０．３μＬ減少し、分注量は１０％減の２．７μＬとなった。

（実施例１）
実施例１では、液面高さを測定し、それに応じて吸引量を調整し、繰り返し分注を行った。

まず、１回目の分注前に上記方法により液面高さを測定した。その結果、受光面に形成された暗部長さは６．０ｍｍであり、分注前の液面は容器底面から３．１ｍｍの位置にあることがわかった。そこで、ピペットチップの先端を液面から容器底面から１．１ｍｍの位置に設定し、１回目の分注を行った。この結果、３．０μＬであった。１回目の分注を終えた後、本発明の測定方法により液面高さを測定した結果、液面は容器底面から２．９ｍｍの位置にあった。背景技術で記載したように、ピペットの吸引量は、容器内の液面高さ変化に対して直接的に影響を受けるため、ピペットチップの内断面０．７ｍｍ^２×０．２ｍｍ（≒０．１μＬ）だけ吸引量を増加させ、ピペットの吸引量を３．１μＬに設定し、分注を行った。その結果、２回目の分注を行い、計量したところ３．０μＬであった。以上の動作を４回繰り返しても、分注量は３．０μＬを維持することができた。

このように、分注前に液面高さを測定し、吸引量を調整することで、均一に繰り返し分注することができた。

（実施例２）
実施例２では、液面高さを測定し、それに応じてピペット高さを調整し、繰返し分注を行った。

まず、１回目の分注前に上記方法により液面高さを測定した。その結果、受光面に形成された暗部長さは６．０ｍｍであり、分注前の液面は容器底面から３．１ｍｍの位置にあることがわかった。そこで、ピペットチップの先端を液面から容器底面から１．１ｍｍの位置に設定し、１回目の分注を行った。この結果、３．０μＬであった。１回目の分注を終えた後、本発明の測定方法により液面高さを測定した結果、液面は初期位置よりも０．２ｍｍ低い、容器底面から２．９ｍｍの位置にあった。そこで、液面高さに対するピペットチップの先端位置をそろえるべく、初期の容器底面から１．１ｍｍから液面高さ減少分０．２ｍｍ下降させた０．９ｍｍの位置に設定し、２回目の分注を行った。その結果、２回目の分注を行い、計量したところ３．０μＬであった。以上の動作を４回繰り返しても、分注量は３．０μＬを維持することができた。

このように、分注前に液面高さを測定し、液面高さに対するピペットチップ先端位置の高さを均一に調整することで、均一に繰り返し分注することができた。

（実施例３）
実施例３では、液面高さを測定し、それに応じてピペット高さを調整し、繰返し分注を行った。

まず、１回目の分注前に上記方法により液面高さを測定した。その結果、受光面に形成された暗部長さは６．０ｍｍであり、分注前の液面は容器底面から３．１ｍｍの位置にあることがわかった。そこで、ピペットチップの先端を液面から容器底面から１．１ｍｍの位置に設定し、１回目の分注を行った。この結果、３．０μＬであった。１回目の分注を終えた後、本発明の測定方法により液面高さを測定した結果、液面は初期位置よりも０．２ｍｍ低い、容器底面から２．９ｍｍの位置にあった。そこで、ウェルプレートの位置を０．２ｍｍだけ上昇させることで、液面に対するピペット先端位置を初回と同一となるように調整した。そして、２回目の分注を行った。その結果、２回目の分注を行い、計量したところ３．０μＬであった。以上の動作を４回繰り返しても、分注量は３．０μＬを維持することができた。

このように、分注前に液面高さを測定し、ウェルの位置を調整することで、均一に繰り返し分注することができた。

１ 透明容器
２ 液体
３ 光源
４ 光
５ 受光面
１１ 容器を介さない光の経路
１２ 容器側壁面と大気界面で全反射する光の経路
１３ 容器側壁面と液体の界面を通過する光の経路
１４ 暗部
１６ ピペットロボット
１７ 載置台
１８ マイクロプレート
１９ 液体供給装置
２０ 流体デバイス
２１ 載置部
２２ 流体制御機構
２３ 電圧制御部
２４ａ 光照射部
２４ｂ 光検出部
２５ 分析システム
４１ 透明容器
４２ 液体
４３ 受光面
５１ 容器
５２ 液体

Claims (15)

1. 光透過性容器内の液面位置を測定する方法であって、
   前記容器の底部に受光面が存在する状態で、液体と接する内壁では光が透過し、空気と接する内壁では全反射するように光を液面に対して斜めから照射させ、前記全反射によって生じる暗部と明部の境界位置を前記受光面で検出することを特徴とする方法。
2. 光透過性部材からなる側壁面を有する容器を用いて、該容器内に配置された液体の液面位置を測定する方法であって、光源から前記液面に前記光透過性部材を介さずに入射する第一の光と、前記光透過性部材を透過した後に前記液体に入射する第二の光と、がともに前記容器の底部に配置された受光面に到達し、前記光透過性部材が大気と接触する位置において光を全反射するように前記液面に対し斜め上から光を照射する工程と、前記第一の光と第二の光の間の暗部の長さを測定する工程と、を有することを特徴とする方法。
3. 前記容器の上面に対する光の入射角をΘ_１、空気の屈折率をｎ_１、前記容器の屈折率をｎ_２、液体の屈折率をｎ_３とした時、以下の式を満たすような入射角（Θ_１）で入射させることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
   
4. 前記液面位置が、前記容器の上面を基準とした液面の高さである請求項２または３に記載の方法。
5. 前記液面の高さに応じて吸引量を調整し、分注を行うことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
6. 前記液面の高さに応じてピペット高さを調整し、分注を行うことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
7. 前記液面の高さに応じて前記容器の位置を調整し、分注を行うことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
8. 前記容器が、複数のウェルを有するマイクロプレートである請求項１から７のいずれかに記載の方法。
9. 光透過性部材からなる側壁面を有する容器内に配置された、液体の液面位置を検出する装置であって、
   前記容器を載置する載置手段と、
   前記容器に光を照射する照射手段と、
   前記載置手段に設けられた受光面を有する受光手段と、を有しており、
   前記照射手段は、液体と接する内壁では光が透過し、空気と接する内壁では全反射するように光を液面に対して斜めから照射する手段であり、
   前記全反射によって生じる暗部と明部の境界位置を前記受光面で検出することを特徴とする装置。
10. 前記照射手段は、該手段から前記液面に前記光透過性部材を介さずに入射する第一の光と、前記光透過性部材を透過した後に前記液体に入射する第二の光と、がともに前記容器の底部に配置された受光手段に到達するように前記液面に対し斜め上から光を照射する手段であり、
    前記光透過性部材が大気と接触する位置において光を全反射させることで生じる前記第一の光と第二の光の間の暗部の長さを前記受光面において測定することで前記液面の高さを取得することを特徴とする請求項９に記載の装置。
11. 液体を供給するための液体供給装置であって、
    請求項９または１０に記載の装置と、
    前記容器から液体を吸引するためのピペットを有するピペットロボットと、
    を有することを特徴とする液体供給装置。
12. 前記液面位置に応じて前記ピペットの吸引量を調整する手段を有する請求項１１に記載の液体供給装置。
13. 前記液面位置に応じて前記ピペットの高さを調整する手段を有する請求項１１に記載の液体供給装置。
14. 前記液面位置に応じて前記容器の位置を調整する手段を有する請求項１１に記載の液体供給装置。
15. 流体デバイスを用いた試料の分析システムであって、
    前記流体デバイスを載置する手段と、
    前記流体デバイス内の液体を処理する処理手段と、
    請求項１０から１４に記載の液体供給装置と、
    を有する分析システム。