JP2015065970A - 骨形成材とその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】未分化の幹細胞やマクロファージによる捕食を促進して骨再生能を向上する。【解決手段】粒径１００μｍ以下のリン酸カルシウム多孔体顆粒からなる基材と、該基材に付着または吸着させた低分子化合物とを備える骨形成材を提供する。粒径１００μｍ以下とすることにより単核球細胞であるマクロファージによる捕食を容易にし、粒径１０μｍ以下とすることによりマクロファージより小さい未分化の幹細胞による取り込みを容易にすることができる。そして低分子化合物を吸着させることで、マクロファージや未分化の幹細胞による骨形成作用を促進し、迅速な骨再生を図ることができる。【選択図】図１

Description

本発明は、骨形成材とその製造方法に関するものである。

従来、体内に供給するβリン酸三カルシウム多孔体顆粒としては、０．１ｍｍ未満のサイズでは体液の流れによって移動してしまうので好ましくなく、０．５ｍｍ〜１．０ｍｍのサイズが好ましいことが開示されている（例えば、特許文献１参照。）。

特開２００９−１０１１７４号公報

しかしながら、０．５ｍｍ以上の粒径では、多核の破骨細胞にとっては取り付きやすく、酸（カテプシンＫ等）を分泌して顆粒を溶解することができるが、マクロファージのような単核球細胞には大きすぎて、顆粒を溶解して吸収することが困難であるという不都合がある。また、さらに小さい未分化の幹細胞にとっては、マクロファージに適した粒径でも大きすぎて内部に取り込むことができず、迅速な骨再生を行うことができないという不都合がある。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであり、未分化の幹細胞やマクロファージによる捕食を促進して骨再生能を向上した骨形成材とその製造方法を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、粒径１００μｍ以下のリン酸カルシウム多孔体顆粒からなる基材と、該基材に付着または吸着させた低分子化合物とを備える骨形成材を提供する。

本態様によれば、基材の粒径が１００μｍ以下であるので、マクロファージおよび未分化の幹細胞が取り付きやすく、マクロファージが分泌する酸で容易に溶解し、あるいは、ファゴソームを通して未分化の幹細胞内に容易に取り込んだ基材をライソソーム等で溶解、分解することができる。さらに、基材に低分子化合物が付着または吸着させられているので、マクロファージや未分化の幹細胞による骨形成を促進して、骨再生を迅速に行うことができる。

上記態様においては、前記基材が、粒径１０μｍ以下のリン酸カルシウム多孔体顆粒を含むことが好ましい。
このようにすることで、未分化の幹細胞による基材の細胞内への取り込みが容易となり、骨再生をさらに迅速に行うことができる。

また、上記態様においては、前記低分子化合物がデキサメタゾンであってもよい。
また、上記態様においては、前記デキサメタゾンが、前記基材の気孔内に入り込むように物理的に付着されていてもよい。
さらに、上記態様においては、前記基材が、βリン酸三カルシウム多孔体顆粒からなっていてもよい。

また、本発明の他の態様は、リン酸カルシウム多孔体ブロックを作製するステップと、作製されたリン酸カルシウム多孔体ブロックを粉砕するステップと、粉砕されたリン酸カルシウム多孔体を分級して１００μｍ以下の顆粒からなる基材を作製するステップと、作製された基材の気孔内に入り込むようにデキサメタゾンを物理的に付着させるステップとを含む骨形成材の製造方法を提供する。

本発明によれば、未分化の幹細胞やマクロファージによる捕食を促進して骨再生能を向上することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る骨形成材の製造方法を示すフローチャートである。 図１の骨形成材を構成する基材の第１の粒径分布を示すグラフである。 図１の骨形成材を構成する基材の第２の粒径分布を示すグラフである。 図１の骨形成材の製造方法を示す模式図である。 ０．２％エタノール含有ＰＢＳで調製した（ａ）異なる濃度のデキサメタゾンの吸光度特性および（ｂ）検量線を示すグラフである。 １００％エタノール含有で調製した（ａ）異なる濃度のデキサメタゾンの吸光度特性および（ｂ）検量線を示すグラフである。 図５（ｂ）および図６（ｂ）の検量線を重ね合わせたグラフである。 ０．２％エタノール含有ＰＢＳで調製した（ａ）図３の基材のデキサメタゾン吸着前後の吸光度、（ｂ）図２の基材のデキサメタゾン吸着前後の吸光度を示すグラフである。 １００％エタノール含有で調製した（ａ）図３の基材のデキサメタゾン吸着前後の吸光度、（ｂ）図２の基材のデキサメタゾン吸着前後の吸光度を示すグラフである。 βリン酸三カルシウムの異なる濃度に対するアルカリフォスファターゼ測定結果を示すグラフである。

本発明の一実施形態に係る骨形成材とその製造方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る骨形成材は、粒径１００μｍ以下のβリン酸三カルシウム多孔体顆粒からなる基材と、該基材に付着させられたデキサメタゾン（ＤＥＸ：低分子化合物）とを備えている。

本実施形態に係る骨形成材は、以下の方法によって製造する。
本実施形態に係る骨形成材の製造方法は、図１に示されるように、リン酸カルシウム多孔体ブロックを作製する第１のステップＳ１と、第１のステップＳ１において作製されたリン酸カルシウム多孔体ブロックを粉砕する第２のステップＳ２と、第２のステップＳ２において粉砕されたリン酸カルシウム多孔体を分級して１００μｍ以下の顆粒からなる基材を作製する第３のステップＳ３と、該第３のステップＳ３により作製された基材の気孔内に入り込むようにデキサメタゾンを物理的に付着させる第４のステップＳ４とを含んでいる。

第１のステップＳ１は、界面活性剤により見かけの気孔率を７５％としたβリン酸三カルシウム多孔体ブロックを作製する。
第２のステップＳ２は、βリン酸三カルシウム多孔体ブロックを機械的に粉砕する。
第３のステップＳ３は、粉砕されたβリン酸三カルシウム多孔体顆粒をステンレス製フルイおよび空気分級法により所望の粒径を有する顆粒に分級する。
第４のステップＳ４は、デキサメタゾンを溶媒に混合して生成した溶液内にβリン酸三カルシウム多孔体顆粒を浸漬し、遠心分離後に静置して、上澄み液を除去し、残った顆粒を乾燥させる。

このようにして製造された本実施形態に係る骨形成材によれば、基材が１００μｍ以下の粒径を有しているので、マクロファージによる捕食を容易にすることができるという利点がある。また、基材に１〜１０μｍの粒径のβリン酸三カルシウム多孔体顆粒が含まれていれば、未分化の幹細胞がファゴソームを介して細胞内に容易に取り込むことができるという利点がある。

さらに、本実施形態に係る骨形成材は、このような１００μｍ以下の粒径を有する基材にデキサメタゾンが付着させられているので、マクロファージに捕食されあるいは未分化の幹細胞内に取り込まれることにより、マクロファージあるいは未分化の幹細胞による骨形成を促進することができ、早期に骨を再生することができるという利点がある。

次に、本実施形態に係る骨形成材とその製造方法の実施例について説明する。
本実施例においては、第１のステップＳ１において、純度９９．９％のリン酸水素カルシウム二水和物（Ｃａ_３ＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ）と純度９９．９９％の炭酸カルシウム（ＣａＣＯ_３）とをＣａ／Ｐ原子比が、１．５となるように混合し、これに純水を加えて固形物濃度が１０重量％のスラリーを調整した。このスラリーをジルコニア製ボールミルに入れて２４時間摩砕しながら反応させた後に取り出して、固形物をステンレス製バットに入れて電気乾燥炉によって８０℃で乾燥させた。

乾燥した粉末を粉砕し、電気炉を用いて、７５０℃で１時間仮焼し、仮焼した粉末６０ｇに、解膠剤としてポリアクリル酸アンモニウムエチレンノニルフェニルエーテル５ｍＬを加え、攪拌発泡させてスラリーを調製し、成形用型に注入した。この状態で２４時間、８０℃で乾燥させた後、１時間に１００℃の割合で昇温し、１０５０℃で３０分間焼結した。
その結果、得られた焼結体は、粉末Ｘ線回折法により、βリン酸三カルシウムであり、見かけの気孔率が７５％であることが確認された。

第２のステップＳ２においては、第１のステップＳ１において得られた焼結体を、室温に戻した後に粉砕して、ステンレス製のフルイによって１５００μｍ以下にした顆粒３１５ｇを、ウレタン製分級ロータを用いたターボクラッシャ（ＴＣ１５Ｎ、日清エンジニアリング株式会社製）を用いて、回転数１３００ｒｐｍ、風量２．０ｍ^３／ｍｉｎ、供給速度１．０（ｋｇ／ｈ）で１次分級し、微粉側部分から６９ｇ取り出した。次に、取り出した微粉６９ｇのうち４１ｇを用いて回転数２５００ｒｐｍ、風量２．０ｍ^３／ｍｉｎ、供給速度１．０（ｋｇ／ｈ）で２次分級を行い、微粉として２７ｇの顆粒を得た。

得られた顆粒の粒径分布を、日機装株式会社製マイクロトラックＨＲＡを用いて測定した。その結果、粒径分布は図２に示されるように、２．６μｍにピークを有する（粒径０．８１７６〜９．２４９９μｍの顆粒である）ことがわかった。

また、ステンレス製のフルイによって１５００μｍ以下にした顆粒３１５ｇを、ウレタン製分級ロータを用いたターボクラッシャ（ＴＣ１５Ｎ、日清エンジニアリング株式会社製）を用いて、回転数１３００ｒｐｍ、風量２．０ｍ^３／ｍｉｎ、供給速度１．０（ｋｇ／ｈ）で１次分級し、微粉側部分から６９ｇ取り出した。次に、取り出した微粉６９ｇのうち４１ｇを用いて回転数２５００ｒｐｍ、風量２．０ｍ^３／ｍｉｎ、供給速度１．０（ｋｇ／ｈ）で２次分級を行い、粗粉として１４ｇの顆粒を得た。

得られた顆粒の粒径分布を、日機装株式会社製マイクロトラックＨＲＡを用いて測定した。その結果、粒径分布は図３に示されるように、３μｍと３０μｍにピークを有することがわかった。

次に、第３のステップＳ３においては、図４に示されるように、２種類のデキサメタゾン溶液を調製した。一方は、０．２％エタノール含有ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を用いてデキサメタゾンを調製した０．５×１０^−４Ｍのデキサメタゾン溶液である。他方は、１００％エタノールを用いてデキサメタゾンを調製した、同じく０．５×１０^−４Ｍのデキサメタゾン溶液である。調製されたこれらのデキサメタゾン溶液に対して紫外線分光法を用いて、デキサメタゾンの吸収波長が２４０ｎｍであることを利用して吸光度測定を行った。

そして、第２のステップＳ２で得られた２種類の粒径分布のβリン酸三カルシウム多孔体顆粒７０ｍｇに、それぞれ２種類のデキサメタゾン溶液２ｍＬを加えることにより４種類の混合液を作製し、各混合液に対して２０回ずつピペッティングを行った後に、１２０ｍｉｎ静置した。これにより、デキサメタゾンをβリン酸三カルシウム多孔体顆粒に吸着させた。
なお、吸着時間としての１２０ｍｉｎは、実験により測定された平衡吸着時間を採用した。

静置後、遠心分離（２００００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）を行うことにより、各混合液から未吸着のデキサメタゾンを上澄み液として分離し、これを回収して紫外線分光法を用いて吸光度測定を行った。ブランクとしては、０．２％エタノール含有ＰＢＳで作製したサンプルについてはＰＢＳとし、１００％エタノールで作製したサンプルについては１００％エタノールとした。

そして、遠心分離後の上澄み液内のデキサメタゾン濃度を吸光度から定量することにより、βリン酸三カルシウム多孔体顆粒へのデキサメタゾンの吸着量を算出した。
また、吸着量の算出にあたっては、以下の式を用いた。

吸着前後におけるデキサメタゾン由来の吸光度（波長：２４０ｎｍ）の差から検量線を用いて、吸着されたデキサメタゾン濃度を計算した値をＸｍｏｌ／Ｌとすると、吸着されたデキサメタゾンのｍｏｌ数は、
Ｘ［ｍｏｌ／Ｌ］×（２×１０^−３［Ｌ］）
により計算した。

βリン酸三カルシウムの比表面積をＡ［ｍ^２／ｇ］（粒径分布１〜８８μｍの顆粒においてはＡ＝８．０８３［ｍ^２／ｇ］、粒径分布１〜１０μｍの顆粒においてはＡ＝１．５９６２［ｍ^２／ｇ］である）とすると、１ｎｍ^２当たりに吸着されたデキサメタゾンは、
Ｘ×（２×１０^−３）×６．０２×１０^２３／（Ａ×１０^１８×７０×１０^−３）［個／ｎｍ^２］
である。

検量線は、０．２％エタノール含有ＰＢＳと１００％エタノールとを用いて種々のデキサメタゾン濃度（０，０．１，０．２，０．４，０．５［×１０−４ｍｏｌ／Ｌ］）の異なるサンプルを作製し、作製されたサンプルの吸光度を測定することにより、図５（ｂ）、図６（ｂ）に示されるように作製した。図５（ａ）、図６（ａ）は吸光度測定を行った生データであり、図５（ｂ）、図６（ｂ）の検量線は、図５（ａ）、図６（ａ）の２４０ｎｍで観察される吸収の極大値をプロットすることにより作製した。また、傾きからデキサメタゾンの溶媒に対する親和性を確認した。

作製した検量線はいずれもＲ^２＝０．９９９以上となり、信頼性の高いものである。
図７に２つの検量線を比較した結果を示す。
１００％エタノールの場合の方が、０．２％エタノール含有ＰＢＳの検量線よりも傾きが大きくなった。これにより、デキサメタゾンの溶解性は、エタノールの含有量が大きい方が高いということができる。

図８に０．２％エタノール含有ＰＢＳを用いてデキサメタゾンを吸着させた場合における吸着前後のＵＶスペクトルデータを示す。図８（ａ）が粒径１〜８８μｍの顆粒に吸着させた時のデータであり、図８（ｂ）が粒径１〜１０μｍの顆粒に吸着させたときのデータである。

同様に、図９に１００％エタノールを用いてデキサメタゾンを吸着させた場合における吸着前後のＵＶスペクトルデータを示す。図９（ａ）が粒径１〜８８μｍの顆粒に吸着させた時のデータであり、図９（ｂ）が粒径１〜１０μｍの顆粒に吸着させたときのデータである。

吸光度の差から算出したデキサメタゾンの吸着量は表１および表２の通りである。

表１は、０．２％エタノール含有ＰＢＳを用いてデキサメタゾンを吸着させた場合における吸着量を示している。また、表２は、１００％エタノールを用いてデキサメタゾンを吸着させた場合における吸着量を示している。

エタノール含有率の差によるデキサメタゾンの吸着量の有意差はほとんどないものの、小さい方の粒径１〜１０μｍの顆粒サンプルの方が、吸着量が大きい結果となった。これは、βリン酸三カルシウム多孔体顆粒の比表面積が大きいほど吸着量が増えるという吸着の基本原理に反している。すなわち、比表面積以外の粒子の他の性状が吸着結果に影響したものと考えられる。

また、平均吸着量は、１０^−９分子／ｎｍ^２のオーダーであり、デキサメタゾン分子の大きさから判断すると、βリン酸三カルシウム多孔体顆粒にはほとんど吸着せず、表面の溶出によって吸着できない表面状態にあると考えられる。多孔質材料のガス吸着から求められる比表面積の場合、高分子等の大きな分子ではその分子の大きな排除体積によって有効な吸着面積が得られない場合がある。しかし、デキサメタゾンはガス分子より大きな分子直径を持つと考えられるものの、高分子とは異なるものと考えられる。

次に、このようにして構成された本実施形態に係る骨形成材の効果を確認する実験について説明する。
まず、実験に用いる試料としてラットの骨髄間葉系幹細胞の培養を行った。
ラット（Ｆ３４４、７週齢、オス）の大腿骨を摘出し、両端を切除し、骨髄液を培養液で洗い出して採取した。この骨髄液を培養用フラスコ（７５Ｔ、大腿骨１本／１個）で培養を開始した。培養液はＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清＋抗生剤を使用した。３〜４日ごとに培養液を交換し、９日目にトリプシン−ＥＤＴＡを使用して細胞を剥離した。

次に、デキサメタゾンを吸着させたβリン酸三カルシウム多孔体顆粒（粒径１〜８８μｍ、デキサメタゾン含有量：１．１×１０^−７ｍｏｌ／ｇ）を実験群とした。コントロール群はデキサメタゾンを含有しない同サイズのβリン酸三カルシウム多孔体顆粒とした。

各顆粒にＦＢＳを加え、１ｍｇ／ｍＬおよび０．１ｍｇ／ｍＬの濃度でＦＢＳ中に分散させた。６ウェルカルチャープレートの各ウェルに８００μＬずつ入れ、プレートを降ったり傾けたりすることで、均一に広げた（各サンプル３ウェルずつ）。ラット骨髄間葉系幹細胞を抗生剤のみを含むＤＭＥＭに浮遊させ、各ウェルに７．２ｍＬずつ播種した。

このときの細胞数は、１×１０^５個／ウェルである。
翌日にアスコルビン酸リン酸（ＡＡ）（５０μｇ／ｍＬ）とβグリセロリン酸（ｂＧＰ）（５ｍＭ）とを加え、分化誘導を開始した。３〜４日おきに培養液（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋抗生剤＋ＡＡ＋ｂＧＰ）を交換し、分化誘導１１日目にＲＮＡを採取・精製した。

採取精製されたＲＮＡを使用し、リアルタイプＰＣＲで骨分化マーカであるアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）を測定した。図１０に示されるように、アルカリフォスファターゼは、βリン酸三カルシウム多孔体顆粒単独と比較して、０．１ｍｇ／ｍＬはほぼ同じであったが、０．０１ｍｇ／ｍＬではデキサメタゾンを吸着させた顆粒群の方が優位であった。
これにより、デキサメタゾンを吸着させた本実施形態に係る骨形成材によれば、デキサメタゾンを吸着させていないものに比べて骨再生力が高いことが確認された。

本実施形態に係る骨形成材によれば、粒径１００μｍ以下の非常に細かいβリン酸三カルシウム多孔体顆粒を用いているので、血清等とともに注射器等で患部に容易に導入することができる。したがって、本実施形態に係る骨形成材を骨折や骨粗鬆症等の患者の患部に注射することにより、低侵襲で患部の治療を行うことができる。そして、患部に多く存在するマクロファージや未分化の幹細胞の活動により、またデキサメタゾンの作用により、早期に患部を治癒させることができるという利点がある。

Ｓ１ 第１のステップ
Ｓ２ 第２のステップ
Ｓ３ 第３のステップ
Ｓ４ 第４のステップ

Claims (6)

1. 粒径１００μｍ以下のリン酸カルシウム多孔体顆粒からなる基材と、該基材に付着または吸着させた低分子化合物とを備える骨形成材。
2. 前記基材が、粒径１０μｍ以下のリン酸カルシウム多孔体顆粒を含む請求項１に記載の骨形成材。
3. 前記低分子化合物がデキサメタゾンである請求項１または請求項２に記載の骨形成材。
4. 前記デキサメタゾンが、前記基材の気孔内に入り込むように物理的に付着されている請求項３に記載の骨形成材。
5. 前記基材が、βリン酸三カルシウム多孔体顆粒からなる請求項１から請求項４のいずれかに記載の骨形成材。
6. リン酸カルシウム多孔体ブロックを作製するステップと、
   作製されたリン酸カルシウム多孔体ブロックを粉砕するステップと、
   粉砕されたリン酸カルシウム多孔体を分級して１００μｍ以下の顆粒からなる基材を作製するステップと、
   作製された基材の気孔内に入り込むようにデキサメタゾンを物理的に付着させるステップとを含む骨形成材の製造方法。

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