JP2015051931A - Melanosome protein degradation promoter, melanin degradation promoter and cosmetics comprising the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ツボクサエキス、またはアジア酸、マデカッソ酸およびアジアチコシドの混合物の新規用途および化粧料に関する。 The present invention relates to novel uses and cosmetics of the centella extract, or a mixture of asiatic acid, madecassic acid and asiaticoside.
メラニンは、ヒトを含む動物、植物、原生動物、また一部の菌類、真正細菌において形成される色素である。脊椎動物では、大半が皮膚の表皮最下層の基底層や毛髪の毛母などにあるメラノサイト（色素細胞）で生成され、一部は網膜色素上皮細胞で生成される。
メラノサイト内では、メラノソームと呼ばれる顆粒中でメラニンが合成され、その後、メラノソームは、周囲のケラチノサイト（表皮細胞）へ輸送される。メラニンは、細胞核のDNAを破壊する紫外線を吸収し、皮膚ガンのリスクを減らす、医学上重要な因子である。しかしながら、皮膚内でメラニンが過剰に生成される現象はしばしば起こり、これがクスミ、シミ、ソバカスなど、美容上の大きな問題となる。
Melanin is a pigment formed in animals including humans, plants, protozoa, and some fungi and eubacteria. In vertebrates, most are produced by melanocytes (pigment cells) in the basal layer of the lowermost epidermis of the skin and hair matrix of the hair, and some are produced by retinal pigment epithelial cells.
Within melanocytes, melanin is synthesized in granules called melanosomes, which are then transported to the surrounding keratinocytes (epidermal cells). Melanin is a medically important factor that absorbs ultraviolet light that destroys the DNA of the cell nucleus and reduces the risk of skin cancer. However, a phenomenon in which melanin is excessively generated in the skin often occurs, and this becomes a major cosmetic problem such as kusumi, blemishes, and freckles.
現在知られているクスミ、シミ、ソバカスなどの対策としては、増悪因子である紫外線をサンスクリーン剤で遮光する方法、メラニン生合成を阻害する、またはメラニン生合成を促す情報伝達物質を抑制する物質を適用する方法などが知られている。
しかしながら、これらの方法は予防手段としては有効だが、一旦できてしまったシミ・ソバカスに対する根本的な改善手段にはなり得ない。シミ部位では、表皮基底層に過剰のメラニンが蓄積しており、この蓄積されたメラニンは、ターンオーバーという新陳代謝機構において必ずしも排出されるものではない。このような背景から、当業界では基底層に蓄積しているメラニンを減少させることのできる「メラニン分解促進剤」が新規美白剤として強く望まれていた。
The currently known countermeasures for Kusumi, Blemish, Sobacus, etc. include a method of shielding ultraviolet rays, which are an exacerbation factor, with a sunscreen agent, a substance that inhibits melanin biosynthesis, or a signal transmission substance that promotes melanin biosynthesis. A method of applying is known.
However, these methods are effective as a preventive measure, but cannot be a fundamental improvement measure for once-stained freckles. In the spot site, excess melanin is accumulated in the basal layer of the epidermis, and this accumulated melanin is not necessarily excreted in a metabolic mechanism called turnover. Against this background, a “melanin degradation accelerator” capable of reducing melanin accumulated in the basal layer has been strongly desired as a new whitening agent in the art.
一方、ツボクサエキスは、皮膚外用剤の成分として使用されており、例えばツボクサ抽出物およびビタミン類を含有する皮膚外用剤（特許文献１）や、ツボクサ抽出物およびδ−トコフェロールを含有する美白用の外用組成物（特許文献２）が知られている。 On the other hand, the camellia extract is used as a component of an external preparation for skin, for example, an external preparation for skin containing a cypress extract and vitamins (Patent Document 1), and a whitening agent containing a crumpled extract and delta-tocopherol. A composition for external use (Patent Document 2) is known.
しかしながら、ツボクサエキスが、単独でメラノソームタンパク質またはメラニンの分解促進作用を示すことについては、従来知られていない。
本発明の目的は、ツボクサエキスの新たな用途を提供することである。
また、本発明の目的は、新規なメラノソームタンパク質分解促進剤またはメラニン分解促進剤に基づく種々の新規な生理活性剤を提供することである。
However, it has not been conventionally known that the centella extract alone exhibits an action of promoting the degradation of melanosome protein or melanin.
The object of the present invention is to provide a new use of the centella extract.
Another object of the present invention is to provide various novel bioactive agents based on a novel melanosome protein degradation accelerator or melanin degradation accelerator.
本発明者らは、ツボクサエキスがメラノソームタンパク質の分解効果を有するとの知見を得た。また、本発明者らは、ツボクサエキスが優れたメラニン分解促進効果を奏するとの知見を得た。本発明は、このような新しい知見に基づいて達成されたものである。
本発明は以下のとおりである。
[１]ツボクサエキスを有効成分として含有するメラノソームタンパク質分解促進剤。
[２]ツボクサエキスが、アジア酸、マデカッソ酸およびアジアチコシドからなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有する[１]に記載のメラノソームタンパク質分解促進剤。
[３][１]または[２]に記載のメラノソームタンパク質分解促進剤を含有する化粧料。
[４]ツボクサエキスを有効成分として含有するメラニン分解促進剤。
[５]ツボクサエキスが、アジア酸、マデカッソ酸およびアジアチコシドからなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有する[４]に記載のメラニン分解促進剤。
[６][４]または[５]に記載のメラニン分解促進剤を含有する化粧料。
The present inventors have obtained knowledge that the centella extract has a melanosomal protein degradation effect. In addition, the present inventors have obtained the knowledge that the centella extract has an excellent melanin decomposition promoting effect. The present invention has been achieved based on such new findings.
The present invention is as follows.
[1] A melanosome proteolysis promoter containing a camellia extract as an active ingredient.
[2] The melanosome protein degradation promoter according to [1], wherein the centella extract contains at least one selected from the group consisting of asiatic acid, madecassic acid and asiaticoside as an active ingredient.
[3] A cosmetic comprising the melanosome protein degradation promoter according to [1] or [2].
[4] A melanin degradation accelerator containing a centella extract as an active ingredient.
[5] The melanin degradation promoter according to [4], wherein the centella extract contains at least one selected from the group consisting of asiatic acid, madecassic acid and asiaticoside as an active ingredient.
[6] A cosmetic comprising the melanin degradation accelerator according to [4] or [5].
本発明によれば、ツボクサエキスの新たな用途を提供することができる。
また、本発明によれば、新規なメラノソームタンパク質分解促進剤またはメラニン分解促進剤に基づく種々の新規な生理活性剤を提供することができる。
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the new use of a cinnamon extract can be provided.
Moreover, according to this invention, the various novel bioactive agent based on a novel melanosome protein degradation promoter or a melanin degradation promoter can be provided.
本発明のメラノソームタンパク質分解促進剤またはメラニン分解促進剤は、それぞれ、ツボクサエキスを有効成分とする生理活性剤である。
なお、本明細書では、特に断らない限り、メラノソームタンパク質分解促進剤またはメラニン分解促進剤を「生理活性剤」と総称する。
本明細書では、特に断らない限り、紫外線や老化によって生じる皮膚の黒化を予防または回復させること、メラニンの過剰産生による日焼け、シミまたはソバカスといった皮膚の色調変化または色素変化を予防または回復させること、皮膚本来の色調を維持すること、本来の肌の色を白くすること等の効果を、「美白効果」と総称する。
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
また本明細書において「〜」は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示すものとする。
さらに本明細書において組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
以下、本発明について説明する。
The melanosome proteolysis promoter or melanin degradation promoter of the present invention is a bioactive agent that contains a camellia extract as an active ingredient.
In the present specification, unless otherwise specified, melanosome proteolysis promoters or melanin degradation promoters are collectively referred to as “bioactive agents”.
In this specification, unless otherwise specified, prevention or recovery of skin darkening caused by ultraviolet rays or aging, prevention or recovery of skin color change or pigment change such as sunburn, spots or freckles due to excessive production of melanin The effects such as maintaining the original color tone of the skin and whitening the original skin color are collectively referred to as “whitening effect”.
In this specification, the term “process” is not limited to an independent process, and is included in the term if the intended purpose of the process is achieved even when it cannot be clearly distinguished from other processes. .
In the present specification, “to” indicates a range including the numerical values described before and after the values as a minimum value and a maximum value, respectively.
Furthermore, in this specification, the amount of each component in the composition is the total amount of the plurality of substances present in the composition unless there is a specific indication when there are a plurality of substances corresponding to each component in the composition. means.
The present invention will be described below.
本発明にかかる生理活性剤は、ツボクサエキスを有効成分として単独で含有することによりメラノソームタンパク質分解効果またはメラニン分解効果を示す。ここで、単独とは、ツボクサエキスが、他の有効成分との相互作用などによらず、単独でメラニン分解効果などを奏し得ることを意味するものであり、好ましくはツボクサエキスが有効成分としてメラニン分解効果などを奏し得ることを意味する。 The bioactive agent according to the present invention exhibits a melanosome proteolytic effect or a melanin decomposing effect by containing a cypress extract alone as an active ingredient. Here, “single” means that the centella extract can independently exhibit a melanin-decomposing effect or the like regardless of the interaction with other active ingredients, and preferably centella extract is melanin as the active ingredient. It means that a decomposition effect can be achieved.
本発明にかかる生理活性剤において有効成分となるツボクサエキスとは、ツボクサの各種部位（全体、茎、葉、根皮、根、花、果実、果皮、種子など）をそのまま、あるいは乾燥したもの、粉砕したもの、又は粉砕後搾取したものを、水および／または有機溶媒などの抽出溶媒で抽出したものを意味する。
本発明では、ツボクサエキスとしては、茎または葉から抽出したものが好ましい。
As for the camellia extract which becomes an active ingredient in the bioactive agent according to the present invention, various parts of the camellia (whole, stem, leaf, root bark, root, flower, fruit, fruit skin, seed, etc.) are left as they are or dried, The pulverized product or the product extracted after pulverization is extracted with an extraction solvent such as water and / or an organic solvent.
In the present invention, the extract of the camellia extract is preferably extracted from stems or leaves.
抽出溶媒としては、水（熱水を含む）、メタノール、エタノール、２−プロパノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、グリセリンなどのアルコール類；酢酸エチルなどのエステル類；アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類；アセトニトリルなどのニトリル類；ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類；ペンタン、ヘキサン、シクロペンタン、シクロヘキサンなどの飽和炭化水素類；トルエンなどの芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類；その他ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどの有機溶媒（すべて含水であってもよい）などを適宜用いることができ、１種または２種以上の任意の混合液であってもよい。
本発明において、抽出溶媒としては、アルコール類が好ましく、エタノール、プロピレングリコール、ブチレングリコールがより好ましい。
Extraction solvents include water (including hot water), methanol, ethanol, 2-propanol, ethylene glycol, propylene glycol, butylene glycol, glycerin and other alcohols; ethyl acetate and other esters; acetone and methyl ethyl ketone and other ketones Nitriles such as acetonitrile; ethers such as diethyl ether and tetrahydrofuran; saturated hydrocarbons such as pentane, hexane, cyclopentane, and cyclohexane; aromatic hydrocarbons such as toluene; halogenated hydrocarbons such as dichloromethane and chloroform; Other organic solvents such as dimethylformamide and dimethyl sulfoxide (all of which may be water-containing) may be appropriately used, and one or two or more arbitrary mixed liquids may be used.
In the present invention, as the extraction solvent, alcohols are preferable, and ethanol, propylene glycol, and butylene glycol are more preferable.
抽出して得られるツボクサエキスは液状であり、エキスをそのまま用いることもできるが、有機溶媒が含まれている場合、減圧蒸留などにより有機溶媒を除去することが好ましい。また、本発明においてツボクサエキスは、液状以外に、必要に応じて、減圧乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥などの乾燥処理を行って水分を低減または除去することにより、濃縮液状、半固形状、固形状または粉末状にして使用してもよい。 The cinnamon extract obtained by extraction is liquid, and the extract can be used as it is, but when the organic solvent is contained, it is preferable to remove the organic solvent by distillation under reduced pressure or the like. In addition, in the present invention, the centella extract is a concentrated liquid, semi-solid, solid by reducing or removing moisture by performing drying treatment such as reduced pressure drying, freeze drying, spray drying, etc. as necessary in addition to liquid. You may use it in a shape or powder form.
本発明に用いるツボクサエキスは、上述した溶媒抽出して得られるツボクサエキス以外に、市販品も制限なく使用できる。ツボクサエキスの市販品としては、たとえば、アジア酸、マデカッソ酸およびアジアチコシドを含有するツボクサエキス（商品名：TECA；バイエル社製）や、アジアチコシドおよびマデカッソシドを含有するツボクサエキス（商品名：HETEROSIDES；バイエル社製）が例示できる。 As for the cinnamon extract used in the present invention, a commercially available product can be used without limitation in addition to the above-mentioned cinnabar extract obtained by solvent extraction. As a commercial product of the centella extract, for example, a centella extract containing Asian acid, madecassic acid and asiaticoside (trade name: TECA; manufactured by Bayer) or a centella extract containing Asiaticoside and madecassoside (trade name: HETEROSIDES; Bayer)).
本発明に用いるツボクサエキスは、より高い美白効果と細胞賦活効果を得る観点から、アジア酸、マデカッソ酸、アジアチコシドおよびマデカッソシドからなる群より選択される１種または２種以上を含有することが好ましく、アジア酸、マデカッソ酸またはアジアチコシドからなる群より選択される１種または２種以上を含有することがより好ましく、アジア酸、マデカッソ酸およびアジアチコシドを含有することが特に好ましい。
また、本発明に用いるツボクサエキスは、合成品のアジア酸、マデカッソ酸、アジアチコシド、マデカッソシドを含んでいても良い。
From the viewpoint of obtaining a higher whitening effect and cell activation effect, the cinnamon extract used in the present invention preferably contains one or more selected from the group consisting of asiatic acid, madecassic acid, asiaticoside and madecassoside. More preferably, it contains one or more selected from the group consisting of Asian acid, madecassic acid and asiaticoside, and particularly preferably contains asiatic acid, madecassic acid and asiaticoside.
In addition, the centella extract used in the present invention may contain a synthetic product of Asian acid, Madecassoic acid, Asiaticoside and Madecassoside.
本発明にかかる生理活性剤は、アジア酸、マデカッソ酸およびアジアチコシドからなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として含有する。
アジア酸、マデカッソ酸およびアジアチコシドは、ツボクサ抽出物を精製したものであってもよく、合成品であってもよい。
アジア酸、マデカッソ酸およびアジアチコシドの組成比（質量比）としては、２：２：１６〜９：９：２が好ましく、３：３：１４〜８：８：４がより好ましく、４：４：１２〜７：７：６が更に好ましい。
The bioactive agent according to the present invention contains at least one selected from the group consisting of asiatic acid, madecassic acid and asiaticoside as an active ingredient.
Asiatic acid, madecassic acid, and asiaticoside may be purified from the extract of camellia extract or may be a synthetic product.
The composition ratio (mass ratio) of asiatic acid, madecassic acid and asiaticoside is preferably 2: 2: 16 to 9: 9: 2, more preferably 3: 3: 14 to 8: 8: 4, and 4: 4. : 12-7: 7: 6 is more preferable.
本発明にかかる生理活性剤は、ツボクサエキスを有効成分として含有することにより、基底層のケラチノサイト内に蓄積しているメラニンを分解することができる。それによって、美白効果を得ることができる。そのため、生理活性剤またはこれを含有する化粧料を、皮膚に付与することにより、メラニンの過剰産生に起因する色素斑（たとえば老人性色素斑（シミ）、雀卵斑（ソバカス）、肝斑、炎症性色素沈着、母斑など）の予防または治療の効果が期待できる。 The bioactive agent according to the present invention can decompose melanin accumulated in the keratinocytes of the basal layer by containing a camellia extract as an active ingredient. Thereby, a whitening effect can be obtained. Therefore, by applying a bioactive agent or a cosmetic containing the same to the skin, pigment spots (for example, senile pigment spots (spots), sparrow eggs spots, liver spots, The effect of prevention or treatment of inflammatory pigmentation, nevus, etc. can be expected.
本発明にかかる生理活性剤またはこれを含有する化粧料を組成物の形態で用いる場合、当該組成物におけるツボクサエキスの含有量は、剤型によって異なる。
一般に組成物の全質量に対して、ツボクサエキスの含有量としては、たとえば、組成物の全質量に対して、特に限定されることはないが、０．０００１質量％〜１０質量％であることが好ましく、０．００１質量％〜１質量％であることがより好ましく、０．００１質量％〜０．１質量％であることがさらに好ましい。
ツボクサエキスが０．００１質量％以上であれば、十分な美白効果を得ることができるため好ましい。また、ツボクサエキスの含有量が１質量％以下であれば、組成物中他の成分と凝集、沈降、分離などを引き起こさず、安定であるため好ましい。
また、皮膚浸透性を考慮したうえでの十分な美白効果およびツボクサエキスの溶解性の観点から、ツボクサエキスの含有量は、組成物の全質量に対して０．００１質量％〜０．５質量％であることがより好ましい。
When the physiologically active agent according to the present invention or a cosmetic containing the same is used in the form of a composition, the content of the camellia extract in the composition varies depending on the dosage form.
Generally, the content of the centella extract is not particularly limited with respect to the total mass of the composition, for example, based on the total mass of the composition, but is 0.0001% by mass to 10% by mass Is more preferable, 0.001% by mass to 1% by mass is more preferable, and 0.001% by mass to 0.1% by mass is further preferable.
It is preferable that the centella extract is 0.001% by mass or more because a sufficient whitening effect can be obtained. Moreover, it is preferable if the content of the centella extract is 1% by mass or less because it is stable without causing aggregation, sedimentation, separation, or the like with other components in the composition.
In addition, from the viewpoint of sufficient whitening effect in consideration of skin permeability and solubility of the centella extract, the content of the centella extract is 0.001% by mass to 0.5% by mass with respect to the total mass of the composition. % Is more preferable.
本発明にかかる生理活性剤またはこれを含有する化粧料を組成物の形態で用いる場合、当該組成物におけるアジア酸、マデカッソ酸およびアジアチコシドの少なくとも１種の混合物の含有量は、剤型によって異なる。
一般に組成物の全質量に対して、アジア酸、マデカッソ酸およびアジアチコシドの少なくとも１種の混合物の含有量としては、たとえば、組成物の全質量に対して、特に限定されることはないが、０．０００１質量％〜１０質量％であることが好ましく、０．００１質量％〜１質量％であることがより好ましく、０．００１質量％〜０．１質量％であることがさらに好ましい。
アジア酸、マデカッソ酸およびアジアチコシドの少なくとも１種の混合物の含有量が０．００１質量％以上であれば、十分な美白効果を得ることができるため好ましい。また、アジア酸、マデカッソ酸およびアジアチコシドの混合物の含有量が１質量％以下であれば、組成物中でアジア酸、マデカッソ酸およびアジアチコシドの少なくとも１種の混合物が他の成分と凝集、沈降、分離などを引き起こさず、安定であるため好ましい。
また、皮膚浸透性を考慮したうえでの十分な美白効果およびアジア酸、マデカッソ酸およびアジアチコシドの少なくとも１種の混合物の溶解性の観点から、アジア酸、マデカッソ酸およびアジアチコシドの少なくとも１種の混合物の含有量は、組成物の全質量に対して０．００１質量％〜０．５質量％であることがより好ましい。
When the bioactive agent according to the present invention or a cosmetic containing the same is used in the form of a composition, the content of at least one mixture of asiatic acid, madecassic acid and asiaticoside in the composition varies depending on the dosage form. .
In general, the content of at least one mixture of asiatic acid, madecassic acid and asiaticoside with respect to the total mass of the composition is not particularly limited, for example, with respect to the total mass of the composition, The content is preferably 0.0001% by mass to 10% by mass, more preferably 0.001% by mass to 1% by mass, and still more preferably 0.001% by mass to 0.1% by mass.
If the content of at least one mixture of asiatic acid, madecassic acid and asiaticoside is 0.001% by mass or more, a sufficient whitening effect can be obtained, which is preferable. In addition, if the content of the mixture of Asian acid, Madecassoic acid and Asianticoside is 1% by mass or less, at least one mixture of Asian acid, Madecassoic acid and Asianticoside aggregates and settles with other components in the composition. It is preferable because it is stable without causing separation.
Further, from the viewpoint of sufficient whitening effect in consideration of skin permeability and the solubility of at least one mixture of Asian acid, Madecassoic acid and Asianticoside, at least one of Asian acid, Madecassoic acid and Asianticoside is used. The content of the mixture is more preferably 0.001% by mass to 0.5% by mass with respect to the total mass of the composition.
本発明にかかる生理活性剤またはこれを含有する化粧料の形態には特に制限はない。組成物の形態としては、具体的には、オイル組成物、乳化組成物、粉末組成物などが挙げられる。オイル組成物、乳化組成物、粉末組成物は、公知の方法に従い調製することができる。 There is no restriction | limiting in particular in the form of the bioactive agent concerning this invention, or the cosmetics containing this. Specifically as a form of a composition, an oil composition, an emulsion composition, a powder composition etc. are mentioned. The oil composition, emulsion composition, and powder composition can be prepared according to a known method.
本発明の化粧料の形態には特に制限はなく、化粧水（ローション）、美容液（エッセンス）、クリーム、乳液などの化粧料を例示することができる。これらのいずれも通常の方法で調製することができ、たとえば乳液などの場合、水相および油相をそれぞれ過熱溶解し、乳化分散して冷却することで製造することができる。 There is no restriction | limiting in particular in the form of the cosmetics of this invention, Cosmetics, such as lotion (lotion), a cosmetic liquid (essence), cream, and milky lotion, can be illustrated. Any of these can be prepared by an ordinary method. For example, in the case of an emulsion, the aqueous phase and the oil phase can be dissolved by heating, emulsified and dispersed, and then cooled.
本発明にかかる生理活性剤またはこれを含有する化粧料は、経口的または非経口的に投与することができるが、効果発現の観点から、非経口的に投与することが好ましい。具体的には、ツボクサエキスを直接皮膚へ投与可能な局所投与が好ましく、経皮投与がより好ましい。 The physiologically active agent according to the present invention or a cosmetic containing the same can be administered orally or parenterally, but is preferably administered parenterally from the viewpoint of effect expression. Specifically, topical administration capable of directly administering the camellia extract to the skin is preferable, and transdermal administration is more preferable.
（機能性油性成分）
機能性油性成分としては、水性媒体に溶解せず、油性媒体に溶解する油溶性成分であれば、特に限定はなく、目的に応じた物性や機能性を有するものを適宜選択して使用することができる。機能性油性成分としては、紫外線吸収剤、抗炎症剤（ツボクサエキス以外）、保湿剤、毛髪保護剤、細胞賦活剤、エモリエント剤、角質溶解剤、帯電防止剤、脂溶性ビタミン剤、メタ簿リックシンドローム改善剤、降圧剤、鎮静剤などとして使用されているものが挙げられる。
ここで、機能性油性成分とは、生物体内に存在した場合に生体において所望の生理学的作用の発揮が期待され得る油性成分を意味する。
(Functional oil component)
The functional oily component is not particularly limited as long as it is an oil-soluble component that does not dissolve in an aqueous medium but dissolves in an oily medium, and those having physical properties and functionality according to the purpose are appropriately selected and used. Can do. Functional oily ingredients include UV absorbers, anti-inflammatory agents (other than cinnamon extract), moisturizers, hair protectants, cell activators, emollients, keratolytic agents, antistatic agents, fat-soluble vitamins, metabooks What is used as a syndrome improving agent, an antihypertensive agent, a sedative, etc. is mentioned.
Here, the functional oily component means an oily component that can be expected to exert a desired physiological action in a living body when it is present in a living body.
（その他の添加成分）
上記成分の他、医薬品、機能性食品、化粧品などの分野において通常用いられる添加成分を、組成物に、その形態に応じて適宜含有させてもよい。他の添加成分は、その特性によって、油溶性または水溶性の添加成分として、組成物に含有させることができる。
(Other additive components)
In addition to the above components, additive components usually used in the fields of pharmaceuticals, functional foods, cosmetics and the like may be appropriately added to the composition according to the form. The other additive component can be contained in the composition as an oil-soluble or water-soluble additive component depending on its characteristics.
たとえば、その他の添加成分としては、グリセリン、１，３−ブチレングリコールなどの多価アルコール；グルコース、加糖、乳糖、麦芽糖、ショ糖、ペクチン、カッパーカラギーナン、ローカストビーンガム、グアーガム、ヒドロキシプロピルグアガム、キサンタンガム、カラヤガム、タマリンド種子多糖、アラビアガム、トラガカントガム、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸ナトリウム、デキストリンなどの単糖類または多糖類；ソルビトール、マンニトール、マルチトール、ラクトース。マルトトリイトール、キシリトールなどの糖アルコール；塩化ナトリウム、硫酸ナトリウムなどの無機塩；カゼイン、アルブミン、メチル化コラーゲン、加水分解コラーゲン、水溶性コラーゲン、ゼラチンなどの分子量５０００超のタンパク質；グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、シスチン、メチオニン、リジン、ヒドロキシリジン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、ヒドロキシプロリン、アセチルヒドロキシプロリンなどのアミノさんおよびそれらの誘導体；カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、酸化エチレン・酸化プロピレンブロック共重合体などの合成高分子；ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロースなどの水溶性セルロース誘導体；などを挙げることができ、その機能に基づいて、たとえば機能性成分、賦形剤、粘度調整剤、ラジカル捕捉剤などとして含んでもよい。
その他、ｐＨ調整剤、ｐＨ緩衝剤、防腐剤、香料、着色剤など、通常、その用途で使用される他の添加物を併用することができる。
For example, other additive components include polyhydric alcohols such as glycerin and 1,3-butylene glycol; glucose, sugar added, lactose, maltose, sucrose, pectin, copper carrageenan, locust bean gum, guar gum, hydroxypropyl guar gum, xanthan gum Monosaccharides or polysaccharides such as, gum karaya, tamarind seed polysaccharide, gum arabic, gum tragacanth, hyaluronic acid, sodium hyaluronate, sodium chondroitin sulfate, dextrin; sorbitol, mannitol, maltitol, lactose. Sugar alcohols such as maltotriitol and xylitol; inorganic salts such as sodium chloride and sodium sulfate; proteins with a molecular weight of over 5000 such as casein, albumin, methylated collagen, hydrolyzed collagen, water-soluble collagen, and gelatin; glycine, valine, and leucine Amino and their derivatives such as isoleucine, serine, threonine, aspartic acid, glutamic acid, cystine, methionine, lysine, hydroxylysine, arginine, histidine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, proline, hydroxyproline, acetylhydroxyproline; carboxyvinyl Polymer, sodium polyacrylate, polyvinyl alcohol, polyethylene glycol, ethylene oxide / propylene oxide block copolymer Synthetic water polymers such as hydroxyethylcellulose and water-soluble cellulose derivatives such as methylcellulose, and the like. Based on their functions, they may be included as functional components, excipients, viscosity modifiers, radical scavengers, and the like. .
In addition, other additives usually used for the application such as a pH adjuster, a pH buffer, a preservative, a fragrance, and a colorant can be used in combination.
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to them.
実施例１：メラノソームタンパク(gp100)分解促進作用の評価
（１）ヒト膣黒色腫（HMV-II）の培養
ヒト膣黒色腫（HMV-II）を10体積％ Fetal Bovine Serum（GIBCO社製）および1質量％ Penicillin-Streptomycin（GIBCO社製）含有HamF12培地（SIGMA社製）でT225フラスコに8000 cells/cm2で播種し1週間37 ℃のCO2インキュベーターで培養した。T225フラスコから細胞を回収し、10体積％ Fetal Bovine Serum（GIBCO社）および1質量％ Penicillin-Streptomycin（GIBCO社製）含有DMEM/F12，GlutaMAX（登録商標）培地（GIBCO社製）でHYPER Flask（登録商標）に播種し1週間37 ℃のCO2インキュベーターで培養した。細胞を回収し、-80℃で保存した。
Example 1: Evaluation of melanosome protein (gp100) degradation promoting action
(1) Culture of human vaginal melanoma (HMV-II) Human vaginal melanoma (HMV-II) in HamF12 medium containing 10% by volume Fetal Bovine Serum (GIBCO) and 1% by weight Penicillin-Streptomycin (GIBCO) (Manufactured by SIGMA) was seeded at 8000 cells / cm 2 in a T225 flask and cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 1 week. Cells were collected from the T225 flask, and HYPER Flask (GIBCO) containing 10% by volume Fetal Bovine Serum (GIBCO) and 1% by weight Penicillin-Streptomycin (GIBCO) in DMEM / F12, GlutaMAX (registered trademark) medium (GIBCO). Cultivated in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 1 week. Cells were harvested and stored at -80 ° C.
（２）メラノソームの抽出
ヒト膣黒色腫（HMV-II）2×108細胞に細胞破砕液（0.1 M Tris，1質量％IgepalCA630， 0.01質量％SDS， pH 7.5）4mLを加えボルテックスを5秒行い、氷上でピペッティングを行い破砕した。氷上で10分放置し再度ピペッティングを行いさらに10分放置した。細胞破砕液を遠心し（1000 G、 10 分）、上清を回収し再度遠心した（20000 G、10 分）。沈殿をPBSで洗浄し遠心（20000 G、 10 分）により回収し、PBS 100mLに懸濁しメラノソーム抽出ペレットを調製した。
(2) Extraction of melanosomes Human vaginal melanoma (HMV-II) 2 × 10 8 cells were added with 4 mL of cell disruption solution (0.1 M Tris, 1% by weight IgepalCA630, 0.01% by weight SDS, pH 7.5) and vortexed for 5 seconds. Then, it was crushed by pipetting on ice. The plate was left on ice for 10 minutes, pipetted again and left for another 10 minutes. The cell lysate was centrifuged (1000 G, 10 minutes), and the supernatant was collected and centrifuged again (20000 G, 10 minutes). The precipitate was washed with PBS, collected by centrifugation (20000 G, 10 minutes), and suspended in 100 mL of PBS to prepare a melanosome extracted pellet.
（３）メラノソーム貪食ケラチノサイトの調製
ヒト表皮ケラチノサイト（HaCaT）を10 体積％ Fetal Bovine Serum（GIBCO社製）および1 質量％ Penicillin-Streptomycin-Glutamine（GIBCO社製）含有DMEM培地（GIBCO社製）でT225フラスコに6500 cells/cm2で播種し4日間培養した。（２）で調製したメラノソーム抽出ペレットを添加し18時間培養した。培養後、PBSで洗浄しトリプシンを5 mL加え5分間37 ℃でインキュベートした。DMEM培地を5 mL加えピペッティングし遠沈管に移し、室温300 Gで遠心分離した。上清を捨て沈殿した細胞をDMEM培地でほぐし、これをメラノソーム貪食ケラチノサイトの懸濁液とした。
(3) Preparation of melanosome-phagocytic keratinocytes T225 in human epidermis keratinocytes (HaCaT) in a DMEM medium (GIBCO) containing 10% by volume Fetal Bovine Serum (GIBCO) and 1% by weight Penicillin-Streptomycin-Glutamine (GIBCO) The flask was seeded at 6500 cells / cm 2 and cultured for 4 days. The melanosome extraction pellet prepared in (2) was added and cultured for 18 hours. After incubation, the plate was washed with PBS, 5 mL of trypsin was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 5 minutes. 5 mL of DMEM medium was added, pipetted, transferred to a centrifuge tube, and centrifuged at 300 G at room temperature. The supernatant cells were discarded and the precipitated cells were loosened with DMEM medium, which was used as a suspension of melanosome-phagocytosed keratinocytes.
（４）細胞播種・薬剤添加
メラノソーム貪食ケラチノサイトを10 体積％ Fetal Bovine Serum（GIBCO社製）および1 質量% Penicillin-Streptomycin-Glutamine（GIBCO社製）含有DMEM培地（GIBCO社製）で12穴プレートに50000 cells/cm2、96穴プレートに32000 cells/cm2になるように播種し3時間培養した。前培養後、DMSOを用いて1μg/ml（約０．０００１質量％）、10μg/ml（約０．０１質量％）、100μg/ml（約０．１質量％）、1000μg/ml（約１質量％）の濃度に調製したツボクサエキス（商品名：ＴＥＣＡ、バイエル社製）を培地に1質量％添加し2日間培養を行った。
使用したツボクサエキスは、アジア酸、マデカッソ酸およびアジアチコシドの混合物であり、５：５：１０の組成比で混合されている。
(4) Cell seeding / drug addition Melanosome-phagocytic keratinocytes in a 12-well plate with DMEM medium (GIBCO) containing 10% by volume Fetal Bovine Serum (GIBCO) and 1% by weight Penicillin-Streptomycin-Glutamine (GIBCO) 50000 cells / cm 2, and seeded cultured for 3 hours so as to 32000 cells / cm 2 in 96 well plates. After pre-culture, 1 μg / ml (about 0.0001% by weight), 10 μg / ml (about 0.01% by weight), 100 μg / ml (about 0.1% by weight), 1000 μg / ml (about 1) using DMSO. 1% by mass of a centella extract (trade name: TECA, manufactured by Bayer) prepared to a concentration of (mass%) was added to the medium and cultured for 2 days.
The camellia extract used is a mixture of asiatic acid, madecassic acid and asiaticoside, and is mixed at a composition ratio of 5: 5: 10.
（５）細胞生存率試験
被験物質溶液を添加し培養した96穴プレートについて、細胞をPBSで洗浄した後、培地100 μLとCell Counting Kit-8溶液（DOJINDO社製）10 μLを加え、37 ℃のCO2インキュベーターで1時間保温した。その後、450 nm（対照600 nm）における吸光度を測定し生細胞数の指標とした。ツボクサエキスを添加しない場合の生細胞数を100として、被験物質を添加した場合の細胞生存率（%）を求めた。
(5) Cell viability test For 96-well plates cultured with the test substance solution added, the cells were washed with PBS, and then 100 μL of medium and 10 μL of Cell Counting Kit-8 solution (DOJINDO) were added at 37 ° C. Incubated for 1 hour in a CO 2 incubator. Thereafter, the absorbance at 450 nm (control 600 nm) was measured and used as an index of the number of living cells. The cell viability (%) when the test substance was added was determined with the number of viable cells when no communis extract was added as 100.
（６）メラノソームタンパク（gp100）の定量
被験物質溶液を添加し48時間培養した12穴プレートについて、細胞をPBSで洗浄した後、トリプシン200 μLを加え5分間37 ℃インキュベートした。DMEM培地を200 μL加えピペッティングし、96穴ディープウェルプレートに移し室温300 Gで遠心分離した。上清を捨て沈殿した細胞をPBSで洗浄し再度300Gで遠心分離した。
4質量％パラホルムアルデヒドで固定した後（室温、 15 分）、メタノールで固定し（4 ℃、 30 分）、1質量％BSA （Bovine Serum Albumin）溶液で1時間ブロッキングした。PBSで1回洗浄後、Can Get Signal（登録商標）immunostain（solution A）で一次抗体を終濃度2μg/mLになるように希釈し50 μLを加え懸濁し一晩4 ℃で反応させた。PBSで2回洗浄後、二次抗体を終濃度2 μg/mLになるように希釈し50μLを加え懸濁し1時間室温で反応させた。PBSで2回洗浄後、TPBSを100 μL加えU字96穴プレートに移し、BD（登録商標）FACSCalibur（登録商標）付随High Throughput Sampler (HTS) を用い測定し、蛍光強度積算値を求めた。
(6) Quantification of melanosome protein (gp100) About the 12-well plate which added the test substance solution and culture | cultivated for 48 hours, after wash | cleaning a cell by PBS, trypsin 200microliter was added and incubated at 37 degreeC for 5 minutes. 200 μL of DMEM medium was added and pipetted, transferred to a 96-well deep well plate and centrifuged at 300 G at room temperature. The supernatant was discarded and the precipitated cells were washed with PBS and centrifuged again at 300G.
After fixing with 4 mass% paraformaldehyde (room temperature, 15 minutes), it was fixed with methanol (4 ° C, 30 minutes), and blocked with 1 mass% BSA (Bovine Serum Albumin) solution for 1 hour. After washing once with PBS, the primary antibody was diluted with Can Get Signal (registered trademark) immunostain (solution A) to a final concentration of 2 μg / mL, suspended by adding 50 μL, and reacted at 4 ° C. overnight. After washing twice with PBS, the secondary antibody was diluted to a final concentration of 2 μg / mL, suspended by adding 50 μL, and allowed to react at room temperature for 1 hour. After washing twice with PBS, 100 μL of TPBS was added, transferred to a U-shaped 96-well plate, and measured using a BD (registered trademark) FACSCalibur (registered trademark) High Throughput Sampler (HTS) to determine the integrated fluorescence intensity.
一次抗体：Anti-Melanoma Associated Anigen 100+/7ｋDa antibody [NKI/beteb]（ab34165: abcam社製）
二次抗体：Alexa 488 Goat Anti-Mouse IgG2b（A-21141: life technologies社製）
Primary antibody: Anti-Melanoma Associated Anigen 100 + / 7 kDa antibody [NKI / beteb] (ab34165: manufactured by abcam)
Secondary antibody: Alexa 488 Goat Anti-Mouse IgG2b (A-21141: life technologies)
（７）データの解析
（６）で求めた蛍光強度積算値に（５）で求めた細胞生存率を積算し補正を行い、メラノソームタンパク（gp100）のタンパク量とした。
(7) Data analysis The fluorescence intensity integrated value obtained in (6) was added to the cell viability obtained in (5) for correction to obtain the protein amount of melanosome protein (gp100).
（８）結果
図１より、ツボクサエキスは濃度依存的にメラノソームタンパク（gp100）を減少させることを見出した。この結果、ツボクサエキスはケラチノサイト内において、メラノソームタンパクであるgp100の分解を促進する作用を持つことが明らかとなった。
(8) Results From FIG. 1, it was found that the centella extract reduces melanosome protein (gp100) in a concentration-dependent manner. As a result, it has been clarified that the centella extract has an action of promoting the degradation of gp100 which is a melanosome protein in keratinocytes.
実施例２：細胞内メラニンの分解促進作用の評価
（１）メラノソーム貪食ケラチノサイトの調製
ヒト表皮ケラチノサイト（HaCaT）を10 体積％ Fetal Bovine Serum（GIBCO社製）および1 質量％ Penicillin-Streptomycin-Glutamine（GIBCO社製）含有DMEM培地（GIBCO社製）でT225フラスコに6500 cells/cm2で播種し4日間培養した。実施例１の（２）で調整したメラノソーム抽出ペレットを添加し18時間培養した。培養後、PBSで洗浄しトリプシンを5 mL加え5分間37 ℃でインキュベートした。DMEM培地を5 mL加えピペッティングし遠沈管に移し、室温300 Gで遠心分離した。上清を捨て沈殿した細胞をDMEM培地でほぐし、これをメラノソーム貪食ケラチノサイトの懸濁液とした。
メラニン貪食ケラチノサイトの作製は前述と同じ方法を用いた。
Example 2: Evaluation of intracellular melanin degradation promoting action (1) Preparation of melanosome-phagocytic keratinocytes Human epidermal keratinocytes (HaCaT) were added at 10% by volume Fetal Bovine Serum (GIBCO) and 1% by weight Penicillin-Streptomycin-Glutamine (GIBCO The T225 flask was seeded at 6500 cells / cm 2 in a DMEM medium (manufactured by GIBCO) and cultured for 4 days. The melanosome extraction pellet prepared in Example 1 (2) was added and cultured for 18 hours. After incubation, the plate was washed with PBS, 5 mL of trypsin was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 5 minutes. 5 mL of DMEM medium was added, pipetted, transferred to a centrifuge tube, and centrifuged at 300 G at room temperature. The supernatant cells were discarded and the precipitated cells were loosened with DMEM medium, which was used as a suspension of melanosome-phagocytosed keratinocytes.
The same method as described above was used to prepare the melanin phagocytic keratinocytes.
（２）細胞培養
メラノソーム貪食ケラチノサイトを2×106 cellsをT75フラスコに播種し、10 体積％Fetal Bovine Serum（GIBCO社製）および1 質量％ Penicillin-Streptomycin-Glutamine（GIBCO社製）含有DMEM培地（GIBCO社製）で6時間培養した。
＜基準細胞の作製＞
PBSで洗浄しトリプシンを2 mL加え5分間37 ℃でインキュベートした。DMEM培地を4 mL加えピペッティングし遠沈管に移し、室温300 Gで遠心分離した。沈殿した細胞を培養0時間の基準細胞とした。
＜サンプルの作製＞
DMEM培地を交換後、ツボクサエキス（商品名：ＴＥＣＡ、バイエル社製）を最終濃度50μg/mL（約０．０５質量％）となるように添加し、24時間培養した。コントロールとしては被験物質を添加せずに培地交換し培養を継続した。
PBSで洗浄しトリプシンを2 mL加え5分間37 ℃でインキュベートした。DMEM培地を4 mL加えピペッティングし遠沈管に移し、室温300Gで遠心分離した。上清を捨て沈殿した細胞をサンプルとした。
使用したツボクサエキスは、アジア酸、マデカッソ酸およびアジアチコシドの混合物であり、５：５：１０の組成比で混合されている。
(2) Cell culture 2 × 10 6 cells of melanosome-phagocytic keratinocytes are seeded in a T75 flask, and 10% by volume Fetal Bovine Serum (GIBCO) and 1% by weight Penicillin-Streptomycin-Glutamine (GIBCO) -containing DMEM medium ( (GIBCO) for 6 hours.
<Preparation of reference cells>
After washing with PBS, 2 mL of trypsin was added and incubated at 37 ° C. for 5 minutes. 4 mL of DMEM medium was added and pipetted, transferred to a centrifuge tube, and centrifuged at 300 G at room temperature. The precipitated cells were used as reference cells for 0 hours of culture.
<Preparation of sample>
After exchanging the DMEM medium, Clover extract (trade name: TECA, manufactured by Bayer) was added to a final concentration of 50 μg / mL (about 0.05% by mass) and cultured for 24 hours. As a control, the medium was changed without adding the test substance, and the culture was continued.
After washing with PBS, 2 mL of trypsin was added and incubated at 37 ° C. for 5 minutes. 4 mL of DMEM medium was added, pipetted, transferred to a centrifuge tube, and centrifuged at 300 G at room temperature. The supernatant cells were discarded and the precipitated cells were used as samples.
The camellia extract used is a mixture of asiatic acid, madecassic acid and asiaticoside, and is mixed at a composition ratio of 5: 5: 10.
（３）細胞内メラニンの定量
（１）で作製した細胞ペレットに100 μLの水を加えピペッティングを行い、1 mLのエーテル / エタノール = 1 / 1溶液を加えボルテックスを行った。遠心分離後（4 ℃、300 G、3 分）、上清を除去し一晩乾燥させた。乾燥した細胞塊を10 体積％ジメチルスルホキシドを含有する1 mol / L水酸化ナトリウム水溶液500 μLを加え80 ℃で30分間加温し、溶解させ、400 nmの吸光度を測定した。
(3) Quantification of intracellular melanin 100 μL of water was added to the cell pellet prepared in (1), pipetting was performed, and 1 mL of ether / ethanol = 1/1 solution was added and vortexed. After centrifugation (4 ° C., 300 G, 3 minutes), the supernatant was removed and dried overnight. 500 μL of 1 mol / L sodium hydroxide aqueous solution containing 10% by volume of dimethyl sulfoxide was added to the dried cell mass, and the mixture was heated at 80 ° C. for 30 minutes to dissolve, and the absorbance at 400 nm was measured.
（４）データの解析
（３）で求めた吸光度に対して、既知のメラニン量で測定した吸光度の関係から細胞内メラニン量を求めた。
(4) Analysis of data The amount of intracellular melanin was calculated | required from the relationship of the light absorbency measured by the amount of known melanins with respect to the light absorbency calculated | required by (3).
図２より、ツボクサエキスを添加することで、細胞内のメラニン量が減少し、メラニン分解が促進されることを見出した。この結果から、ツボクサエキスはケラチノサイト内において、メラニン色素自体の分解を促進する作用を持つことが明らかとなった。 From FIG. 2, it was found that the addition of a camellia extract reduces the amount of intracellular melanin and promotes melanin degradation. From this result, it was clarified that the camellia extract has an action of promoting the degradation of the melanin pigment itself in the keratinocytes.
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