JP2015033365A - Dna結合ドメインを含むポリペプチド - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明は、35〜55のアミノ酸からなるポリペプチドにより接続されたDNA結合ドメインおよび機能ドメインを含み、DNA結合ドメインに含まれるDNA結合モジュールにおける2つの位置のアミノ酸が、4つのDNA結合モジュールごとに異なる繰り返し様式を呈する人工ヌクレアーゼ;当該人工ヌクレアーゼを発現するためのベクター;当該ベクターを作製するためのベクターライブラリー;および当該ベクターライブラリーを作製するためのベクターセットを提供する。
【選択図】なし
Description
DNA結合ドメインおよび機能ドメインを含むポリペプチドであって、
ここで、DNA結合ドメインと機能ドメインは、35〜55のアミノ酸からなるポリペプチドにより接続されており、
DNA結合ドメインは、複数のDNA結合モジュールをN末端側から連続的に含み、
N末端から4n−3番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n−2番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n−1番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n−3番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、N末端から4n−2番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、N末端から4n−1番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、およびN末端から4n番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、nは、1〜10の自然数であり、xは、1〜40の自然数であり、yは、1〜40の自然数であり、xとyは、異なる自然数である、
ポリペプチド
を提供するものである。
第3の態様に記載のベクターを作製するためのベクターライブラリーであって、
ここで、ベクターライブラリーは、5’末端から順に、第1の制限酵素切断部位、4つのDNA結合モジュールをコードするポリヌクレオチド、および第2の制限酵素切断部位を有する複数のベクターによって構成され、
ここで、第1の制限酵素切断部位および第2の制限酵素切断部位の組合せは、A型の制限酵素切断部位およびB型の制限酵素切断部位の組合せ、A型の制限酵素切断部位およびC型の制限酵素切断部位の組合せ、A型の制限酵素切断部位およびD型の制限酵素切断部位の組合せ、A型の制限酵素切断部位およびE型の制限酵素切断部位の組合せ、B型の制限酵素切断部位およびC型の制限酵素切断部位の組合せ、C型の制限酵素切断部位およびD型の制限酵素切断部位の組合せ、ならびにD型の制限酵素切断部位およびE型の制限酵素切断部位の組合せのいずれかであり、ここで、A型の制限酵素切断部位〜E型の制限酵素切断部位は、同一の制限酵素による切断によって、いずれも、互いに異なる切断末端を生じさせるものであり、
4つのDNA結合モジュールのうち、
5’末端から1番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のベクターに関して同一であり、
5’末端から2番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のベクターに関して同一であり、
5’末端から3番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のベクターに関して同一であり、
5’末端から4番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のベクターに関して同一であり、
5’末端から1番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、5’末端から2番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、5’末端から3番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、および5’末端から4番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、xは、1〜40の自然数であり、yは、1〜40の自然数であり、xとyは、異なる自然数である、
ベクターライブラリーを提供するものである。
第4の態様に記載のベクターライブラリーを作製するためのベクターセットであって、
ここで、ベクターセットは、5’末端から順に、1番目の制限酵素切断部位、DNA結合モジュール、および2番目の制限酵素切断部位を含む複数のベクターを含み、
1番目の制限酵素切断部位、および2番目の制限酵素切断部位は、同一の制限酵素による切断によって、互いに異なる切断末端を生じさせるものであり、
DNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、4つの異なる組合せのいずれかであり、
ここで、xは、1〜40の自然数であり、yは、1〜40の自然数であり、xとyは、異なる自然数である、
ベクターセットを提供するものである。
図2に示した塩基配列の両端に制限酵素BsaIの認識サイトを付加した配列を、人工遺伝子合成により作製し、pBluescript SK vectorに挿入して、図1のSTEP1に用いるベクターセット(p1HD−p4HD、p1NG−p4NG、p1NI−p4NI、p1NN−p4NN)を作製した。
pFUS_B6ベクター(Addgene)を鋳型とし、In−Fusionクローニング(クロンテック)によって、図1のSTEP1に示すpFUS2ベクターを作製した。図1のSTEP1に示すように、作製したpFUS2ベクターと、実施例1において作製したベクターセットを用いて、Golden Gate反応を行い、ベクターライブラリーを作製した。
pTALEN_v2およびpcDNA−TAL−NC2(共にAddgene)を用いて、In−Fusionクローニングによって、作製した後、モジュールを組込むBsmBIサイト周辺配列をIn−Fusionクローニングによって調製し、更に開始コドンの上流にglobin leader配列をIn−Fusionクローニングによって挿入して、図1のSTEP2に示すptCMVベクターを作製した。作製したptCMVベクター、実施例2において作製したベクターライブラリー、およびGolden Gate TALEN and TAL Effector Kit、Yamamoto Lab TALEN Accessory Pack(共にAddgene)に含まれるベクター類を用いて、図1のSTEP2に示すように、Golden Gate法によって、DNA結合ドメインを挿入し、TALEN発現ベクターを作製した。ptCMVベクターとしては、DNA結合ドメインのN末端側に隣接する領域(TALEN−N’)のアミノ酸数が153であり、DNA結合ドメインのC末端側とDNA切断ドメインに挟まれた領域(TALEN−C’)のアミノ酸数が47であるものを用いた。作製したTALENの塩基配列ならびにアミノ酸配列の一例を、図3に示す。
図3に示すように、実施例3のTALEN発現用ベクターにおけるDNA結合モジュール(全34アミノ酸)の4番目および32番目のアミノ酸は、4n−3番目、4n−2番目、4n−1番目、および4n番目(nは自然数)のDNA結合モジュールにおいて、それぞれ異なっていた。また、4n−3番目(nは自然数)のDNA結合モジュールにおける4番目および32番目のアミノ酸は、それぞれのDNA結合モジュールにおいて共通であった。このことは、4n−2番目、4n−1番目、および4n番目(nは自然数)のDNA結合モジュールにおいても、同様であった。このように、実施例1のベクターセットおよび実施例2のベクターライブラリーを用いることによって、4つのDNA結合モジュールごとに繰り返し様式を呈するTALEN発現ベクターを作製することができた。
実施例1において作製したベクターセットの代わりに、Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit(Addgene)に含まれるpHD1−6、pNG1−6、pNI1−6、pNN1−6を使用し、また、反応に使用するpFUSベクターとして、Yamamoto Lab TALEN Accessory Pack(Addgene)を使用した他は、実施例2と同様にGolden Gate反応を行い、ベクターライブラリーを作製した。作製したベクターライブラリーを用いて、実施例3と同様の方法によってGolden Gate反応を行い、TALEN発現ベクターを作製した。
ptCMVベクターとして、DNA結合ドメインのN末端側に隣接する領域(TALEN−N’)のアミノ酸数が136でありDNA結合ドメインのC末端側とDNA切断ドメインに挟まれた領域(TALEN−C’)のアミノ酸数が63であるものを用いた他は、実施例3と同様の方法を行い、TALEN発現ベクターを作製した。
ptCMVベクターとして、DNA結合ドメインのN末端側に隣接する領域(TALEN−N’)のアミノ酸数が136でありDNA結合ドメインのC末端側とDNA切断ドメインに挟まれた領域(TALEN−C’)のアミノ酸数が63であるものを用いた他は、比較例1と同様の方法を行い、TALEN発現ベクターを作製した。
図4Bに示すとおりの部位を認識するTALEN発現ベクター(L14〜L20、およびR14〜R20)を、実施例3、または比較例1〜3と同様の方法によって作製した。作製したL14〜L20から1種と、R14〜R20から1種とを、図4Cの表に示すように組み合わせて左右のTALEN発現ベクターとし、図4Bに示す配列をTALENの標的配列として用いて、HEK293T細胞を用いたシングル・ストランド・アニーリングアッセイ(非特許文献5参照)によって、TALEN活性評価を行った。
シングル・ストランド・アニーリングアッセイは、具体的には、以下のようにして行った。まず、CMVプロモーターの下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子を分断化して連結したレポーターベクター(pGL4−SSA;Addgene)に、目的のTALENの標的配列を挿入したレポーターベクターを作製した。この際、TALENの標的配列は、合成オリゴをアニーリングして作製し、BsaI処理したpGL4−SSAベクターにLigation−Convenience Kit(ニッポンジーン)を用いて挿入した。その後、作製したレポーターベクターを、TALEN発現ベクター、およびウミシイタケルシフェラーゼの発現ベクターであるpRL−CMVベクター(プロメガ)と共に、96ウェルプレート上で、リポフェクション法によってHEK293T細胞に導入し、24時間培養した後、Dual−Glo Luciferase Assay System(プロメガ)を用いてレポーター活性を測定した。導入したDNA量は、左右のTALEN発現ベクターは、それぞれ200ng、レポーターベクターが100ng、pRL−CMVベクターが20ngである。化学発光の計測にはTriStar LB 941 plate reader(ベルトールド)を用いた。
実施例3、および比較例1〜3における各左右のTALEN発現ベクターの組合せのそれぞれの場合について、比較例1のL20およびR17の組合せの場合と比較したレポーター活性の相対値を図4Cに示す。各左右のTALENの組合せについての左右のTALENの認識部位に挟まれるスペーサー領域の長さ(塩基数)を、図4Bの表に示す。
図4Cに示すように、実施例3および比較例1の場合には、スペーサー領域が、12〜15などの限られた場合において、特異的に高い活性が得られ、限られたスペーサー領域に対する特異的な切断が可能であることが分かる。これに対して、比較例2および比較例3の場合には、活性の高さは、スペーサー領域の長さと特に関係がなく、スペーサー配列の長さが異なる配列をも認識して切断する可能性が高いことが分かる。このことから、実施例3のTALEN発現ベクターを用いることによって、スペーサー領域の異なる配列に対する非特異的切断の少ない効果的なDNA切断を行うことができることが分かる。
図5Aに示すとおりの部位を認識するTALEN発現ベクターの左右のペア(ATM(左としてL17、右としてR17)、APC(左としてL17、右としてR17)、およびeGFP(左としてL20、右としてR18))を、実施例3、または比較例1〜3と同様の方法によって作製した。それぞれの方法によって作製した左右のペアを左右のTALEN発現ベクターとして用いて、図5Aに示す配列をTALENの標的配列として用いて、試験例1と同様の方法を用いて、HEK293T細胞を用いたシングル・ストランド・アニーリングアッセイ(非特許文献5)を行い、TALEN活性評価を行った。
結果を図5Bに示す。図5Bにおいて、縦軸の数値は、試験例1において作製した比較例1のL20およびR17の組合せの場合と比較したレポーター活性の相対値である。図5Bに示すように、実施例3の場合には、ATM、APC、およびeGPFのいずれの場合においても、比較例1に比して高いTALENのDNA切断活性が観察された。このことから、DNA結合モジュールについての本発明の繰り返し構造を持たせることによって、TALENのDNA切断活性を向上させることができることが分かった。
図6Aに示すとおりの部位を認識するTALEN発現ベクターの左右のペア(左としてL19および右としてR18)を、実施例3、または比較例1〜3と同様の方法によって作製した。それぞれの方法によって作製した左右のペアを左右のTALEN発現ベクターとして用いて、図6Aに示す配列(ミスマッチなし(no mismatches)、左1ミスマッチ右0ミスマッチ(L:1mismatch/R:0mismatch)、左1ミスマッチ右1ミスマッチ(L:1mismatch/R:1mismatch)、または左2ミスマッチ右2ミスマッチ(L:2mismatches/R:2mismatches))をTALENの標的配列として用いて、試験例1と同様の方法を用いて、HEK293T細胞を用いたシングル・ストランド・アニーリングアッセイ(非特許文献5)を行い、TALEN活性評価を行った。TALENの標的配列として図6A中のそれぞれの配列を用いた場合には、図6Aにおける小文字の部分においてミスマッチが生じるため、用いたTALENの標的配列についてTALEN活性評価の結果を比較することによって、用いたTALENの認識特異性の高さを比較することができる。
結果を図6Bに示す。図6Bの縦軸の数値は、ホタルルシフェラーゼ活性の測定値をウミシイタケルシフェラーゼ活性の測定値で割った相対活性を示す。図6Bに示すように、比較例2のTALEN発現ベクターを用いた場合には、左2ミスマッチ右2ミスマッチの配列を用いた場合であっても、高い活性が観察され、比較例2のTALEN発現ベクターの認識特異性は、低かった。これに対して、実施例3のTALEN発現ベクターを用いた場合には、左2ミスマッチ右2ミスマッチの配列を用いた場合には、活性のほぼ完全な消失が観察された。このことから、実施例3のTALEN発現ベクターは、試験例2に示すような高い切断活性を保持しつつ、特異性の高いDNA切断を行うことができるものであり、実施例3のTALEN発現ベクターを用いることによって、目的とする標的DNAを高確率で安全に切断できることが分かった。
Claims (5)
- DNA結合ドメインおよび機能ドメインを含むポリペプチドであって、
ここで、DNA結合ドメインと機能ドメインは、35〜55のアミノ酸からなるポリペプチドにより接続されており、
DNA結合ドメインは、複数のDNA結合モジュールをN末端側から連続的に含み、
N末端から4n−3番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n−2番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n−1番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のnに関して同一であり、
N末端から4n−3番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、N末端から4n−2番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、N末端から4n−1番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、およびN末端から4n番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、nは、1〜10の自然数であり、xは、1〜40の自然数であり、yは、1〜40の自然数であり、xとyは、異なる自然数である、
ポリペプチド。 - 機能ドメインがDNA切断ドメインである、請求項1に記載のポリペプチド。
- 請求項1または2に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 請求項3に記載のベクターを作製するためのベクターライブラリーであって、
ここで、ベクターライブラリーは、5’末端から順に、第1の制限酵素切断部位、4つのDNA結合モジュールをコードするポリヌクレオチド、および第2の制限酵素切断部位を有する複数のベクターによって構成され、
ここで、第1の制限酵素切断部位および第2の制限酵素切断部位の組合せは、A型の制限酵素切断部位およびB型の制限酵素切断部位の組合せ、A型の制限酵素切断部位およびC型の制限酵素切断部位の組合せ、A型の制限酵素切断部位およびD型の制限酵素切断部位の組合せ、A型の制限酵素切断部位およびE型の制限酵素切断部位の組合せ、B型の制限酵素切断部位およびC型の制限酵素切断部位の組合せ、C型の制限酵素切断部位およびD型の制限酵素切断部位の組合せ、ならびにD型の制限酵素切断部位およびE型の制限酵素切断部位の組合せのいずれかであり、ここで、A型の制限酵素切断部位〜E型の制限酵素切断部位は、同一の制限酵素による切断によって、いずれも、互いに異なる切断末端を生じさせるものであり、
4つのDNA結合モジュールのうち、
5’末端から1番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のベクターに関して同一であり、
5’末端から2番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のベクターに関して同一であり、
5’末端から3番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のベクターに関して同一であり、
5’末端から4番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、任意のベクターに関して同一であり、
5’末端から1番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、5’末端から2番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、5’末端から3番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せ、および5’末端から4番目のDNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、xは、1〜40の自然数であり、yは、1〜40の自然数であり、xとyは、異なる自然数である、
ベクターライブラリー。 - 請求項4に記載のベクターライブラリーを作製するためのベクターセットであって、
ここで、ベクターセットは、5’末端から順に、1番目の制限酵素切断部位、DNA結合モジュール、および2番目の制限酵素切断部位を含む複数のベクターを含み、
1番目の制限酵素切断部位、および2番目の制限酵素切断部位は、同一の制限酵素による切断によって、互いに異なる切断末端を生じさせるものであり、
DNA結合モジュールにおけるx番目のアミノ酸とy番目のアミノ酸の組合せは、4つの異なる組合せのいずれかであり、
ここで、xは、1〜40の自然数であり、yは、1〜40の自然数であり、xとyは、異なる自然数である、
ベクターセット。
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