JP2014532637A - 肺高血圧症 - Google Patents
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Abstract
Description
i)そのヌクレオチドの少なくとも2つは、ヌクレオシド間合成結合(すなわち、1つのヌクレオチドの5’末端と別のヌクレオチドの3’末端の間のホスホジエステル結合以外の結合)により共有結合的に連結している。代替的には、又は好ましくは、前記結合は、1つのヌクレオチドの5’末端と別のヌクレオチドの5’末端との結合、又は1つのヌクレオチドの3’末端と別のヌクレオチドの3’末端との結合であり得る;
及び/又は
ii)通常は核酸と結合しない化学基、例えばコレステロール等が、二本鎖核酸に共有結合的に付加されている。
iii)好ましいヌクレオシド間合成結合は、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホロアミデート、カルバメート、リン酸トリエステル、アセトアミデート、ペプチド、及びカルボキシメチルエステルである。
i)試験の対象となる単離された生体サンプルを用意するステップと、
ii)前記サンプル及び配列番号2に示すような核酸配列を含む核酸分子にアニーリングするように構成されたオリゴヌクレオチドプライマーの対、熱安定性DNAポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドトリホスフェート、並びに補助因子を含む調製物を形成するステップと、
iii)前記核酸分子を増幅するのに十分なポリメラーゼ連鎖反応条件を与えるステップと、
iv)配列番号2に由来するヌクレオチド配列を含む核酸分子の有無について、前記ポリメラーゼ連鎖反応の増幅生成物を分析するステップと、任意選択で
v)増幅生成物を正常な対応対照と比較するステップと
を含む。
i)試験の対象となる単離された生体サンプルを用意するステップと、
ii)前記サンプル、及び前記サンプル中の、配列番号1に示すアミノ酸配列により表される1つ又は複数のポリペプチドと特異的に結合して抗体/ポリペプチド複合体を形成する1つ又は複数の抗体を含む調製物を形成するステップと、
iii)そのように形成された1つ又は複数の複合体を検出するステップと、
iv)前記ポリペプチド(複数可)の発現量を正常な対応対照と比較するステップと
を含む。
動物
ラット
非近交系のオス、アルビノスプラーグドーリーラット(Charles River又はHarlan、英国)(開始時体重約200g)を実験で用いた。肺動脈性高血圧症を誘発するのに、モノクロタリン(MCT)(Sigma Aldrich、英国)の左側大腿部への単回皮下注射を用いた。5〜6週間内に致命的となる重度のPAHを発症せしめるような、十分に立証された用量である60mg/kgを用いた。
すべての近交系マウスは、C57BL/6バックグラウンド上にあり、アポリポタンパク質E欠損であった(アポE−/−)。マウスは、University of Sheffieldの学内コロニーから入手可能であった。アポE−/−(Jax2052)マウスを、Jackson laboratories(Bar Habor、ME、米国)から当初調達した。8〜14週齢のオスマウスを、すべてのin vivo実験で用いた。OPG−/−マウスを、JAX labs、米国(B6.129S4−Tnfrsf11b<tm1Eac>/J、ストック番号010672)から入手し、その後Jackson laboratoriesから当初調達したアポE−/−(Jax 2052)と7世代交配して、アポE−/−/OPG−/−マウスを作製した。
齧歯類を、標準実験飼料(4.3%脂肪、0.02%コレステロール、及び0.28%ナトリウム、Harlan、英国)で飼育した。適応される場合には、18.5%脂肪、0.9%コレステロール、0.5%コール酸塩、及び0.259%ナトリウムから構成される高脂肪アテローム生成食(以後パイゲンと呼ぶ)で、実験マウスを8週間又は12週間飼育した(special Diet services、英国)。すべての動物は、飲料水が提供され、自由に飼育された。マウスは、温湿度、及び12時間昼夜サイクルが制御された専用の検査室に収容された。
記載する場合には、ポリクロナールヤギ抗マウスOPG(抗OPG)又は対照のヤギIgGアイソタイプ抗体(R&D systems、英国)を、皮下に埋め込まれた浸透圧ポンプ(Durect Corp.、CA、米国)を経由して齧歯類に送達した。Alzet(登録商標)1004マイクロポンプ(100μlリザーバー、0.1μl/時で4週間)を経由してマウスに、及びAlzet(登録商標)2002ミニポンプ(200μlリザーバー、0.5μl/時、85ng/時で2週間)を経由してラットに介入物を送達した。
クラスII層流フード内、滅菌状態の下で、各ポンプを該当する介入物で充填し、移植前に37℃、24時間、滅菌状態で、0.9%生理食塩水中に配置した。100%酸素(流速1.5L/分)を通じてイソフルラン蒸気麻酔(2〜3%、IsoFlo(登録商標)100%w/w吸入用気化性液体、Abbot laboratories Ltd、Kent、英国)の下で表面の毛皮をクリッピングし、皮膚を洗浄、滅菌した後、下部肋骨縁下の左後方外側の胸部壁上で1〜1.5cm皮膚切開した。滅菌外科条件下で、事前充填されたポンプを鈍的切開により形成された皮下ポケットに埋め込んだ。創傷をその後洗浄し、断続的な2−0バイクリル吸収性縫合糸(B−Braun、Sheffield、英国)を用いて閉鎖した。マウスに対する移植は、ポンプを48時間プライミングし、頚椎(スクラッフライン)後方に埋め込み、そして断続的な絹製縫合糸(Silkam(登録商標)、B−Braun Sheffield、英国)により創傷を閉鎖した以外、同一であった。
マウス
アポE−/−ノックアウトマウス(10〜16週齢、n=4〜7/群)を、疾患表現型構築前8週間、通常食又はパイゲンのいずれかで飼育した(下記を参照)。
タイムコース実験では、ラット(200〜260g、n=7/群/時点)に、MCT(60mg/kg)又は生理食塩水対照で注射した後、2、7、14、21、又は28日目に血行動態試験を行い、これを絶命せしめた。
各齧歯類について、心エコー検査(適応される場合)を心臓カテーテル治療前に実施し、次になおも麻酔下で絶命せしめた。血清を得、RNAを単離(適応される場合)するために、心臓穿刺により血液を収集した。腹部大動脈を切断し、また肺が目視上白くなるまで、右心室内の針を経由して肺をPBSで灌流した。心臓及び肺を一括して除去した。後続する生化学分析用として、右肺を手早く分離した後、液体窒素内で急速冷凍した。左肺を、10%(v/v)ホルマリンを用いて、膨張圧力20cm H2O、気管経由で灌流固定し、次に10%ホルマリン中にオーバーナイト、40℃で心臓と共に配置した。左肺を、その後組織学分析及び免疫組織化学分析で用いた。
RMV707B(マウス)又はRMV710B(ラット)スキャンヘッドを備えた前臨床高周波超音波画像処理システム(Vevo770(登録商標)、Visual Sonics、Toronto、カナダ)を用いて、経胸壁心エコー検査を実施した。齧歯類を、酸素経由のイソフルランで麻酔した後、加熱プラットフォーム上に仰臥位で配置し、そして熱損失を最小限に抑えるために覆った。酸素を用いた維持用イソフルラン(0.5〜1.5%)をノーズコーン経由で送達し、呼吸速度及び直腸温度と共に連続記録の対象とされた心拍数について最大心拍数(マウスにつき約500bpm及びラットにつき350bpm)を実現するように調整した。マウスの胸部を脱毛し、そして後続する画像取得用として事前加熱された超音波ゲルを塗布した(Aquasonics 100 Gel、Parker Labs Inc.、New Jersey、米国)。
左心室:乳頭筋中央レベルの短軸像において左心室の標準パラメータを測定した。収縮性の一次インデックスとして左室内径面積変化率(FAC)を導くために、LVの拡張末期面積及び収縮末期面積のマニュアルトレーシングを行った。LV壁及び空洞寸法(LVIDd)についてMモード測定を行い、これから駆出率(EF%)、短縮率(FS%)、及び補正後のLV心筋重量を標準自動分析により求めた。脈波組織ドップラー(TDI)速度を、左心室後壁の心内膜側から手動により記録し、収縮性の別の独立したインデックスとして提示した。一回心拍出量を、大動脈弁輪レベルで流量及び直径の速度時間積分値(VTi)の測定から導き、これに心拍数を掛け算して心拍出量を得た。
心エコー検査の後、右室及び左室(適応される場合)カテーテル治療を、右外頸静脈及び右内頸動脈経由で、閉胸法を用いて実施した。事前浸漬されたMillarハイフィデリティ微圧計カテーテル(マウスにつき1Fr SPR−1000圧力カテーテル/1Fr PVR−1045圧容積カテーテル、及びラットにつき2Fr SPR−320圧力カテーテル/SPR−838圧容積カテーテルを使用した、Millar instruments、Houston、Texas、USA)により、データを取得した。カテーテルをMillar MPVS300及びPowerLab8/30データ取得システム(AD Instruments、Oxfordshire、英国)と連結し、Chart v6及びv7ソフトウェア(AD Instruments)を用いて記録した。圧力トレーシングを、トレーシングが安定化し、定常状態に達したときに記録した。右心室収縮期圧(RVSP)を、肺高血圧症を定義するのに用い、またこれは、右心室と肺動脈の間に閉塞がなければ肺動脈収縮期圧(PASP)と等価である。適応される場合には、PVAN v2.3を用いて圧容積分析を実施した。
麻酔剤ヴェポライザー及び誘発チャンバー(Harvard Apparatus、英国)を用い、100%医療用酸素(流速2l/分)を通じて、3〜5%イソフルランにより動物を麻酔した。マウス及びラットの手術プロトコールは、最近公表されたプロトコール(Pacher、Nagayamaら、2008年)を踏襲した。
動物を加熱パッド(#TR200 Fine Science Tools Inc)上に配置した。足の神経反射が消失したら、正中線右側に小規模の頸部切開を行った。解剖顕微鏡及び横方向鈍的切開法を用いて、右外頸静脈(RJV)を識別した。弯曲鉗子を使用して、鈍的切開法により血管を自由にした。遠位側のRJVを5−0非吸収性絹製縫合糸(Silkam(登録商標)、B−Braun、Sheffield、英国)でしっかりと緊結して、静脈が心臓側に還流するのを止めた。右鎖骨下静脈の挿入点の近位側で、RJVに牽引力を加えながら絹製縫合糸をモスキートクリップにゆるく取り付けた。こうして、本実験のカテーテルを挿入するための約1cmの長さの血管が得られた。顕微鏡により直接的可視化を行いながら、血管を脂肪組織について徹底洗浄して、血管真腔へのカニューレ挿入が失敗しないようにした。900で先端が屈曲し、下方に向いた斜角を有する25G5/8’’のオレンジ色の針を用いて血管を穿刺し、血管の上壁を速やかに、但し軽く上方に懸架して、カテーテルの同時挿入及び進入を可能にした。カテーテルを、生理食塩水中で少なくとも30分間、事前浸漬した。
RVSP測定終了後、気管に対して深部及び横方向に右頸動脈を識別した。弯曲鉗子を用いて、静脈と同様に右頸動脈を自由にした。遠位側のセグメントには締め付けられた緊結材を、中央部及び近位側セグメントには緩い緊結材(5−0絹製縫合糸)を適用した。後者は、モスキートクリップに取り付けられ、牽引力が付加された。静脈の場合と類似した技法を用いて、動脈切開を実施し、カテーテルを大動脈及び左心室内に進入させた。圧力及び容積のトレーシングが安定し、明瞭となったら、記録を行った。LVからカテーテルを引き戻すことによる大動脈圧のトレーシングを記録した後、カテーテルを抜去した。少なくとも10〜20回の心拍動の記録が、圧力測定値を平均するのに用いられた。
血液
血液をベンチ上で放置して凝固させ、その後1200rpmで15分間遠心分離した。血清を採取、分取、ラベル表示し、そして後続の分析を行うまで−80℃で凍結した。RNA用の全血を収納するチューブ(PAXgene(登録商標)、Qiagen/BD、英国、又はTempus(登録商標)、Applied Biosystems、英国)を、後続するRNA単離を行うまで−20℃で凍結した。
プロトコール
心臓穿刺後、齧歯類に麻酔剤を過量投与し、その後に頸椎脱臼を行った。上腹部壁を切開して肝臓を露出した。上方向の牽引力を胸骨の剣状突起に加えながら、横隔膜を微小なハサミで慎重に切り取った。胸骨及び胸壁を切除した。腹部大動脈を識別し、切断した(失血させるために)。25Gオレンジ色の針及びシリンジを用いて、右心室を識別し、肺が青白くなるまでPBSでフラッシュした。気管を識別し、中間鎖骨境界(medial clavicular border)間で自由にした。気管に上方向の強い牽引力を加えながら、胸腔の後壁から心臓及び肺を一括して除去した。不注意で肺を穿刺してしまうのを避けるように注意を払った。
RVHを、Fultonらが最初に記載した通りに、RV重量を左心室/中隔の重量(RV/LV+S)で割り算したものとして定義した。
小型の一対の微小なハサミを用いて、周囲を取り巻く脂肪、組織、及び大血管を心臓の周囲から除去した。心房を切除し、血栓をすべて除去し、そして秤量した。解剖学的ランドマークを利用して、右心室を左心室及び中隔から分離した。
組織の処理及び組織学検査
左肺を球欠平面(ラット)又は横断面(マウス)で分割した。肺を、段階的濃度のアルコール(50%、最高100%)中で最初に脱水して処理した。次に、キシレン中に配置した後、溶融パラフィンワックス内に埋め込んだ。厚さ5μmのパラフィンに埋め込まれた切片を切り取り、後続する組織検査、免疫組織化学染色、及び形態測定分析のためにスライドにマウントした。
脱脂及び再水和したスライドを、0.25%過マンガン酸カリウム中で3分間酸化し、そして蒸留水中でリンスした後、1%シュウ酸で3分間漂白した。リンス後、スライドをCarazziのヘマトキシリンで2分間染色し、酸アルコール(70%IMSを溶媒とする1%v/v HCl)中で数秒間、識別化した後、高温の水道水中に5分間浸漬した。スライドを、次にアルシアンブルー(3%酢酸水溶液を溶媒とする1%w/v、pH2.5)で5分間染色した。スライドを水で再度リンスし、95%IMS中に急速に浸漬した後、Millerのエラスチン染色液に30分間浸漬した。スライドを次にリンスし、95%IMS中に数秒間配置し、そして水で再度リンスした。次にスライドを、Curtisの改変されたワンギーソン試薬で6分間染色した。次にスライドを、上記再水和の際のスライドと同一であるが逆転した順番で脱水した後、DPXにマウントした。
パラフィンに包埋された5μm肺切片を、血管平滑筋細胞についてα−SMA、内皮細胞を局所化させるためにvWF、及び増殖性細胞についてPCNAの免疫組織化学染色を行った。肺血管病変内のあらゆる発現を識別するために、OPGについて免疫染色を実施した。アポトーシスレベルを、DNAの断片化を検出する比色分析法(FRAGEL(登録商標)、Calbiochem、英国)により、製造業者の説明書の規定に従い求めた。対照スライドのDNAse処理により、陽性対照を作製した。
スライドの脱脂及び再水和後、3%(v/v)過酸化水素に10分間インキュベーションすることにより、内因性の組織ペルオキシダーゼをブロックした後、スライドを水道水でリンスした。スライドを下記のいずれかでインキュベーションすることにより、抗原回復(スライド透過化処理)を行った:
a)クエン酸バッファー、pH6.0中で95℃で20分間、事前加熱した後、RTで20分間冷却する。次に、組織を0.5%(v/v)トリトンX100に10分間、RTでインキュベーションすることにより透過化処理した(OPGのIHCの場合)
b)0.1%(w/v)トリプシン/TBS、pH7.8中、37℃で10分間、事前加熱した後、水に浸漬することにより反応を停止した(vWFのIHCの場合)
c)SMA染色の場合、抗原回復ステップは実施しなかった
PBSで希釈された関連する一次抗体を、以下の通り添加及びインキュベーションした:
a)モノクロナールマウス抗ヒトα−SMA 1:150(#m081、Dako)、RTで1時間
b)ポリクロナールウサギ抗ヒトvWF 1:300(#A0082、Dako)、RTで1時間。
c)ポリクロナールウサギ抗ヒトOPG 1:100(#ab73400、Abcam)、4℃でオーバーナイト。
肺血管リモデリングの程度を、細動脈を対象に2つの方法により数値化し、血管サイズに応じてカテゴリー分類した(20〜50μm、50〜100μm、及び>100μm)(Schermuly、Donyら、2005年)。齧歯類の実験的状態を伏せて血管をスコア化した。
全血管面積の割合を表す中膜面積/CSAを、α−SMA染色スライドより求めた中膜の筋肉化から得た。サイズ群毎に6本の血管を40倍対物レンズで分析した(血管18本/1切片、及び1切片/齧歯類)。断面積は、血管の内弾性板と外弾性板の間の領域として定義される中膜を含む血管周辺部として定義される総面積であった。
血管肥厚率(%)を、ABEVG染色スライドを用いて求めた。スライド毎に、ランダムな視野3〜4箇所を、10倍対物レンズ(倍率100倍)を用いてサンプリングした。サイズ群毎に、完全閉塞、部分閉塞、及び非肥厚性の血管数を計測し、視野毎の各血管の合計数の割合(%)として表した。
リモデリングした血管内の増殖レベルを求めるために、PCNA陽性染核数を計測し、血管内の全核に占める割合(%)として表した。関連する場合、対象とする血管から直接延在するようなとき、外膜又は血管周囲領域内の核も計測した。各切片(1切片/動物)について、サイズ毎に6本の血管を40倍対物レンズでスコア化した。
肺組織由来のタンパク質及びRNAの単離及び精製
液体窒素中で凍結した肺セグメントを、乳棒及び液体窒素を含む乳鉢を用いて微粉末に粉砕し、秤量した。RNAaseによる汚染を最小限に抑えるために、注意を払った。総タンパク質及びRNAを、市販のRNA/タンパク質精製キット(Norgen Biotek、Ontario、カナダ)を用いて、製造業者が提供するプロトコールに従い単離した。精製キットは、スピンカラムクロマトグラフィー技法を採用し、30分以内に同一サンプルからタンパク質及びRNAを溶出することが可能であった。
プロトコール
簡潔には、肺組織に溶解溶液を添加し、次にエタノールを添加した。これをスピンカラムにロードした。14000rpmで遠心分離した後、溶液内のすべての核酸は、樹脂によって捕捉され、一方タンパク質は、通過画分内に除去された。捕捉されたRNAを洗浄し、再度遠心し、次に精製されたRNAを溶離した。溶出液中のRNA濃度を、分光光度計(NanoDrop(登録商標)、Thermo Scientific)を用いて求め、そして−80℃で凍結した。
プロトコール
タンパク質を、市販の電気泳動キット(NuPAGE(登録商標)キット、Invitrogen)を用いて、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。すべてのバッファー及び試薬は、別途記載がなければ、NuPAGEレンジの一部であった。タイムコース実験に由来するラット肺から精製されたタンパク質35μg、サンプルバッファー、及び還元剤を含む、最終容積を30μl(脱イオン水中)とした容積を、70℃で10分間加熱した。次にサンプル及び事前染色されたマーカーラダーを、10ウェルの事前成形したSDSポリアクリルアミドゲル(NuPAGE(登録商標)4〜12%Bis−Tris Miniゲル、Invitrogen)上にロードした。さらに、混合した実験肺組織サンプルも、後続する定量分析を可能にするために、追加の対照として各ゲル上にロードした。
ファーストストランド合成のためのRNAの逆転写
このステップは、SuperScriptTM IIIファーストストランド合成システム(InvitrogenTM Life technologies、英国)において提供される成分を用いて実施した。実験用齧歯類の肺(及びPAX−遺伝子チューブを用いて全血)から単離された全RNA3μgを含む容積を、分子グレードの水を用いて10μlとした。1μlのランダム六量体プライマー(50ng)及び1μlの10mM dNTPをこれに添加し、そして変性ステップとして65℃で5分間加熱した。10μlのcDNA合成混合物[10×RTバッファー(2μl)、25mM MgCl2(4μl)、0.1M DTT(2μl)、RNaseOUT(商標)(1μl)、及びSuperScript(商標)III逆転写酵素(1μl)を含む]を本溶液に添加するまで、サンプルを氷上に配置し、そして混合した。サンプルをサーマルサイクラー(G Storm GS1、GRI Ltd、Essex、英国)内で、パラメータを以下のように設定して加熱した。i)25℃、10分間(アニーリングステップ)、ii)50℃、50分間(cDNA合成)、及び最終的にiii)85℃、5分後、4℃に維持(反応停止)。1μlのRNaseHを各チューブに添加した後、37℃で20分間、最終インキュベーションステップ。
上記RTステップに由来する標的肺cDNAの増幅を次に実施した。各cDNAを50ng含む容積を、滅菌水を用いて、4.5μlの容積に希釈した。5μlのTaqMan(登録商標)遺伝子発現マスターミックス−2X(Applied BiosystemsTM Life Technologies、英国)を、0.5μlの関連する標的遺伝子プライマー(10×)と共に、384ウェルプレート内の関連するウェル内のcDNAに添加した。試験した標的遺伝子を、表1に記載し(すべてのApplied BiosystemsTMより入手した)、18s及びATP5Bを事前の試験(GeNORMアッセイ)で確認された内在性対照遺伝子として選択した。各遺伝子のサンプル(二重)を同一プレート上にロードした。プレートを、1000rpmで1分間遠心分離し、反応を7900HT高速リアルタイムPCRシステム(Applied BiosystemsTM)上で行った。試験遺伝子をハウスキーピング対照遺伝子と比較し、またSDSソフトウェア(v2.2.1、Applied BiosystemsTM)を用いて、遺伝子毎に実験対象とコントロール対象の間のこの比を比較する(デルタデルタCT法)ことにより、各遺伝子の相対的発現量を数値化した。
遺伝子 ラットプライマー マウスプライマー
ATP5B Rn01756316 Mm00443967−g1
18s Hs03003631−m1 Hs03003631−m1
TRAIL Rn00595556−m1 Mm00437174−m1
OPG Rn00563499−m1 Mm00435452−m1
BMPR2 Rn01437210−m1 Mm03023976−m1
CCL5 Rn00579590−m1 Mm1302428−m1
IL1R1 Rn00565482−m1 Mm00434237−m1
IL1R2 Rn00588589_ml Mm00439622−m1
Prism(登録商標)v5.0 (Graphpad、米国)ソフトウェアを用いて、データをプロット及び分析した。別途明記しない限り、データを平均値[標準誤差]として表した。Studentの独立t検定を用いて両群を比較し、3群以上の場合、ボンフェローニの比較後検定(適応される場合)を用いたANOVAにより比較した。統計的有意性は、p値≦0.05として規定した。
特発性肺動脈性高血圧症患者の移植後の肺に由来し、体外移植及びin vitroで増殖した肺動脈平滑筋細胞(PASMC)から単離したmRNAを用いて、OPG遺伝子発現(図1A)、及びタンパク質の血清濃度(図1B)が、対照サンプルから単離されたものと比較して、増加していることを実証した。
ヒトPASMCに対して、セロトニン(5−ヒドロキシトリプタミン、5−HT)(Sigma)の添加(A)、骨形成タンパク質受容体タイプ2(BMP−R2 siRNA、Dharmacon)のノックダウン(B)、又はインターロイキン−1β(IL−1b、R&D Systems)の添加(C)を行うと、その結果OPG分泌量が有意に増加する。
ヒトPASMCに対して、組換えヒトOPG(R&D Systems)を添加すると、その結果増殖(図1F)及び移動(図1G)が、用量依存性で増加する。
各時点、1群当たり7匹のラットに、60mg/mlのモノクロタリン又は対照として生理食塩水のいずれかを注射した。ラットは、心臓カテーテル術を受けた後、絶命せしめられ、そして疾患発症後の2、7、14、21、及び28日目に心臓及び肺組織を採集された。これまでの公表データの通り、疾患プロセスと整合して血行動態が上昇するのが14日目から認められ、21日目及び28日目には有意な増加が認められた(図1H&図1I)。ラット血清について実施したELISAにより、Mctで処置を受けたラットでは、血行動態が変化する前、早くも7日目からOPGの有意な上昇が検出されたことが明らかとなり(図1J)、また全肺RNAのTaqMan PCR分析により、Mctで処置を受けたラットでは、21日目からOPG遺伝子発現が有意に増加することが明らかとなった(図1K)。ラットから単離された全肺タンパク質のウェスタン分析は、抗OPG抗体を用いてプローブされた。ブロットをOPG発現量について半定量的に分析し、β−アクチンに対してノーマライズした。OPGタンパク質の有意な増加が、生理食塩水対照と比較してモノクロタリンで処置を受けたラットで、21日目から検出された(図1L)。
1群当たり4匹のラットに、抗OPG抗体又は対照としてIgGのいずれかを送達し、同時に60mg/kgの用量のモノクロタリンを投与するために、浸透圧ミニポンプを埋め込んだ。21日後、ラットは心臓カテーテル術を受けた後、絶命せしめられ、上記と同様に心臓及び肺組織の採集を行った。抗OPG抗体の投与を受けたラットでは、IgGの投与を受けたラットと比較してRVSPの有意な低下が認められた(図1M)。RVSPの低下は、小肺動脈/細動脈(<50μm、図1N)及び小〜中肺動脈(51〜100μm、図1O)の肺血管のリモデリング(中膜面積/CSA)の有意な低下とも関連した。
パイゲン食で8週間飼育したアポE−/−又はアポE−/−/IL−1R1−/−マウスでは、RVSPの有意な増加が発現した(図1P)。全肺RNAのTaqMan PCR分析により、パイゲンで飼育されたマウスでOPG遺伝子発現が有意に増加することが明らかとなった(図1Q)。マウスから単離された全肺タンパク質のウェスタン分析は、抗OPG抗体を用いてプローブされた。ブロットをOPG発現量について半定量的に分析し、β−アクチンに対してノーマライズした。OPGタンパク質の有意な増加が、パイゲンで飼育されたマウスで検出された(図1R)。
パイゲン食で8週間飼育した後のアポE−/−(図S)又はアポE−/−/IL−1R1−/−(図T)マウスに、浸透圧ポンプを、抗OPG抗体又はIgGのいずれかを4週間送達するために埋め込んだ。抗OPG抗体の投与を受けたマウスは、IgGで治療を受けたマウスと比較して、ほぼ正常レベルまでRVSPの有意な低下を示した。
Claims (27)
- 肺高血圧症の治療で使用するための、オステオプロテゲリン[OPG]の発現、又はOPG遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を阻害する薬剤。
- 前記阻害剤が、アンタゴニスト抗体又はその活性な抗体結合断片である、請求項1に記載の薬剤。
- 前記抗体又は結合断片が、配列番号1のアミノ酸配列を含む又はこれからなるポリペプチド、抗原結合部分、又は配列番号1のアミノ酸配列と75%〜99%の配列同一性を有する配列変異体と結合し、その活性を阻害する、請求項2に記載の薬剤。
- 前記抗体が、配列番号1に示すアミノ酸配列と結合する抗体と競合する、請求項2又は3に記載の薬剤。
- 前記抗体が、ポリクロナール抗体である、請求項2から4のいずれか一項に記載の薬剤。
- 前記抗体が、モノクロナール抗体である、請求項2から4のいずれか一項に記載の薬剤。
- 前記抗体結合断片が、Fab、Fab2、F(ab’)2、Fv、Fc、Fd、一本鎖抗体断片からなる群より選択される、請求項2から6のいずれか一項に記載の薬剤。
- 前記抗体が、キメラ抗体である、請求項6又は7に記載の薬剤。
- 前記抗体が、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項6又は7に記載の薬剤。
- 前記抗体又は結合断片が、OPGのリガンド結合ドメインと結合する、請求項2から9のいずれか一項に記載の薬剤。
- 前記薬剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項1に記載の薬剤。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、アンチセンスRNA分子であり、かつsiRNA又はshRNA分子の一部である、請求項11に記載の薬剤。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスRNAが、19〜29ヌクレオチド[nt]の長さである、請求項11又は12に記載の薬剤。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスRNAが、21ntの長さである、請求項13に記載の薬剤。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、又はshRNA分子が、修飾されたヌクレオチドを含む、請求項11から14のいずれか一項に記載の薬剤。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、又はshRNA分子が、配列番号2を参照して設計されたヌクレオチド配列を含む、請求項11から15のいずれか一項に記載の薬剤。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、又はshRNA分子を細胞又は組織に送達するように構成された担体と併用される、請求項11から16のいずれか一項に記載の薬剤。
- 前記組成物が、肺高血圧症の治療に有効な少なくとも1つの追加薬剤を有効量含む、請求項1から17のいずれか一項に記載の薬剤。
- 前記薬剤がカルシウムチャンネル遮断薬、利尿薬、エンドセリン受容体アンタゴニスト、プロスタサイクリン、可溶性グアナレートシクラーゼ、及びホスホジエステラーゼ阻害剤からなる群より選択される、請求項18に記載の薬剤。
- 肺高血圧症が、肺動脈性高血圧症及び肺疾患と関連したPHからなる群より選択される、請求項1から19のいずれか一項に記載の薬剤。
- 治療を必要とするヒト対象に、オステオプロテゲリンアンタゴニストを有効量投与するステップを含む、肺高血圧症を治療する方法。
- OPGの発現量を決定するステップを含む、対象が肺高血圧症を有するか又はこれに対する素因を有するかを判断するための診断又は予知方法であって、対照サンプルと比較したOPGの過剰発現が肺高血圧症又は肺高血圧症に対する素因を示す、方法。
- i)試験対象となる単離された生体サンプルを用意するステップと、
ii)前記サンプル及び配列番号2に示す核酸配列を含む核酸分子にアニーリングするように構成されたオリゴヌクレオチドプライマーの対、熱安定性DNAポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドトリホスフェート、並びに補助因子を含む調製物を形成するステップと、
iii)前記核酸分子を増幅するのに十分なポリメラーゼ連鎖反応条件を与えるステップと、
iv)配列番号2に由来するヌクレオチド配列を含む核酸分子の有無について、前記ポリメラーゼ連鎖反応の増幅生成物を分析するステップと、任意選択で
v)増幅生成物を正常な対応対照と比較するステップと、
を含む、請求項22に記載の方法。 - i)試験対象となる単離された生体サンプルを用意するステップと、
ii)前記サンプル、及び、前記サンプル中の配列番号1に示すアミノ酸配列により表される1つ又は複数のポリペプチドと特異的に結合して抗体/ポリペプチド複合体を形成する1つ又は複数の抗体を含む調製物を形成するステップと、
iii)そのように形成された1つ又は複数の複合体を検出するステップと、
iv)前記1つ又は複数のポリペプチドの発現量を正常な対応対照と比較するステップと、
を含む、請求項22に記載の方法。 - OPGの発現量が、前記サンプル中のTRAILの発現量と比較される、請求項23又は24に記載の方法。
- OPG:TRAILの比が、対照サンプル中のOPG:TRAILの比と比較される、請求項23又は24に記載の方法。
- 前記対象が肺高血圧症の治療を必要とする場合に、前記対象に、請求項2から10のいずれか一項に記載のOPG抗体を有効量投与することを含む、請求項22から26のいずれか一項に記載の方法。
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