JP2014525930A - 被験者における眼疾患の処置のための方法および薬学的組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、被験者における眼疾患の処置のための方法および薬学的組成物に関する。
近年、生物学的療法を使用した、加齢黄斑変性および糖尿病性網膜症などの眼疾患の処置のためのエキサイティングな新たな進展があった。眼は、バリアによって隔離された小さく限局された器官であるため、局所的な遺伝子療法のために選択される器官であると同定されている。
本発明は、
i)対象となる治療核酸を用いて製剤化された薬学的組成物を、病的眼の脈絡膜上腔に送達する工程、およびii)薬学的組成物が送達された領域を電場にかける工程からなる工程を含む、被験者における眼疾患を処置するための方法に関する。
本発明者らは、眼球外電気穿孔法を伴う、ラット眼球の上脈絡膜へのプラスミド溶液の注射が、脈絡膜およびRPE細胞および/または神経網膜のトランスフェクションに対して効率的であり得るかどうかを評価した。本発明者らは、本明細書において、網膜下への注射およびその後の剥離を必要としないこの最少限に侵襲的な手法を使用すると、RPE細胞および脈絡膜細胞だけでなく光受容体も効率的にトランスフェクションされるという概念証明をもたらす。従って、本発明は被験者における眼疾患の処置のためのこのような方法の使用に関する。
i)対象となる治療核酸を用いて製剤化された薬学的組成物を、病的眼の脈絡膜上腔に送達する工程、およびii)薬学的組成物が送達された領域を電場にかける工程からなる工程を含む、被験者における眼疾患を処置するための方法に関する。
材料および方法
動物
8〜10週令の雌のアルビノルイスラット(Elevage Janvier, Le Genest Saint Isle, France)を大半の実験において使用し、そして視覚および眼科研究における動物の使用についてのARVO宣言に従って取り扱った。蛍光眼底血管造影による追跡のために、8〜10週令の雄の色素沈着Brown-Norwayラット(Charles River, L.’Arbresle, France)を使用した。ラットを、ケタミン(75mg/kg)(Virbac、France)+ラーガクティル(0.5mg/kg)(Sanofi-Aventis, France)の筋肉内注射によって麻酔した。実験終了時に、動物を二酸化炭素吸入によって屠殺した。
サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター制御下のβ−ガラクトシダーゼリポーター遺伝子をコードしている市販されているpVAX1 LacZプラスミド(6kbp、25nm、Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)を使用して、脈絡膜上への注射後、エレクトロトランスファーを行ないまたは行なわず、遺伝子の発現を局在化させた。ラット可溶性血管内皮細胞増殖因子レセプター1(sFlt−1)をコードしているpVAX2−sFlt−1プラスミド(4.9kbp)を、ラット胎盤から抽出したsFlt−1mRNAの単離および逆転写後に構築し、その後、pVAX2骨格におけるCMVβプロモーターの下流のcDNAの増幅およびサブクローニングを行なった。その配列はDNAシークエンスによって確認され、そして、それは毛様体筋へのエレクトロトランスファーを通した送達後に脈絡膜新血管新生ラットモデルにおいて検証された。この研究において、それは、同じモデルにおいて脈絡膜上へのエレクトロトランスファーによる送達を通してその効力を評価するために使用された。コードされていないpVAX1およびpVAX2プラスミド骨格を陰性対照として使用した。プラスミドをEscherichia coli菌において増幅させ、そしてエンドトキシンフリーで調製した(EndoFree Plamid Kit; Qiagen, Courtaboeuf, France)。プラスミドを、以前に記載されているように77mMのNaCl(半生理食塩水)(生理食塩水、NaCl 0.9%、Versol", Laboratoire Aguettant, Lyon, France)を含むエンドトキシンフリーな水(EF)で希釈した[24]。DNAの濃度は、分光測定によって決定された(260nmにおける吸光度)。
プラスミドDNA(30μg)、ビヒクル(半生理食塩水)またはマイヤーヘマトキシリン溶液を、湾曲した30Gの使い捨て針(マイクロファイン+デミシリンジ、0.30×8mm、BD Biosciences、Le Pont de Claix、France)を使用して30μlの容量で脈絡膜上腔に注射した(特記しない限り)。注射を、角膜縁よりも1mm後方の眼の耳側の半球に実施した。強膜を穿孔した後、針は、脈絡膜上腔で容易に可視化することができた。注射はゆっくりと実施して、この実質的な空間の開口を徐々に誘導した。
脈絡膜上腔へのプラスミドDNAの注射直後に、接種した領域を、装置2として提示した装置を使用して電場にかけた。接触湾曲プラチナ/イリジウムシート(陽極、+)を、注射した領域のすぐ上の強膜に付着させた。半環状プラチナ/イリジウムシート(陰極、−)を、眼の反対側の陽極に面した強膜上に配置した。全ての電極は、Good Fellow(Lille, France)から購入した白金ホールド(folds)から手作りされた。エレクトロトランスファーは、830BTX電気パルス発生器(Genetronics, san Diego, CA)によって発生した8つの方形波電気パルス(20V電圧、20ミリ秒の期間、5Hzの周波数)を印加することによって実施された。この標準的な手順(装置および電気パラメーター)を、他の電気装置または他の電気パラメーターを評価するために設計された実験を除く、大半の実験において使用した(詳細については結果の章を参照されたい)。
脈絡膜上への注射直後、眼底を、角膜表面上に適用したカバーガラスを使用して、手術用顕微鏡下で調べて、注射の正確な配置を評価し、そして網膜剥離が起こった領域が全くないことを確かめた。写真を数値カメラ(Coolpix, Nikon, Fnac, Paris, France)を使用して撮影した。蛍光眼底血管造影を、脈絡膜新血管新生誘導前に、処置から3日後に麻酔した色素沈着ラットに実施した(「治療適用」の章を参照されたい)。この目的のために、瞳孔を1%トロピカミドを用いて散大させ、そしてフルオレセイン(生理食塩水中10%フルオレセイン0.2mL)を静脈内投与した。血管造影図を、耳側の処置した領域においておよび視神経乳頭において、共焦点レーザー走査型検眼鏡(cSLO)(HRA, Heidelberg Engineering, Dossenheim, Germany)を使用して確立した[32]。
マイヤーヘマトキシリン溶液の上脈絡膜への注射の2〜5分後、眼球を摘出し、そして室温で2時間かけてリン酸緩衝食塩水(PBS)中4%パラホルムアルデヒドおよび0.5%グルタルアルデヒドの混合物を用いて固定した。それらをPBS中で2時間かけて濯ぎ、漸増濃度のエタノールを用いて室温で脱水し、その後、Leica Historesin Embeddingキットに提供された浸潤溶液と共に4℃で一晩かけてインキュベーションした。試料をレジン(Leica)に包埋し、そして5μmの厚さの組織学的薄片の切開を、ミクロトーム(Leica)を使用して眼の鼻耳側面に沿って実施した。薄片をゼラチンでコーティングされたスライド上に固着し、1%トルイジンブルー溶液を用いて2分間かけて染色し、そしてLeica DFC480カメラと連結させたAristoplan光学顕微鏡(Leica, Rueil-Malmaison, France)下で光学顕微鏡によって観察した。
眼組織におけるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現の場所を決定するために、pVAX1LacZの脈絡膜上へのエレクトロトランスファーから7日後、14日後、1か月後または4.5カ月後に眼球を摘出した。pVAX1骨格を対照として使用した。新たに眼球を摘出された眼の角膜縁に切り込みをいれ、そして2%パラホルムアルデヒドおよび0.2%グルタルアルデヒドを含むPBS中で4℃で1時間かけて固定した。それらを、PBS中で3回濯ぎ、その後、室温で1mg/mLのX−gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルガラクトピラノシド;Sigma-Aldrich、Saint-Quentin Fallavier、France)と共に、5mMのK3Fe(CN)6、5mMのK4Fe(CN)6、2mMのMgCl2および0.02%NP40を含むPBS中で以前に詳述されているように一晩かけてインキュベーションした[33]。PBSで洗浄後、眼の外側からの直接的な造影を、数値カメラ(Coolpix, Nikon, Fnac, Paris, France)を使用して実現した。
全視野ERG記録のために、ラットを、ケタミン(40mg/ml)およびキシラジン(4mg/ml、Rompun)を含む溶液の筋肉内注射(0.8〜1.2ml/kg)によって麻酔した。動物を、25cdm2 cd#s/m2のバックグラウンド光を用いて10分間かけて光に適応させた。角膜をノベシン(Novartis Ophthalmics)の液滴を用いて脱感作させ、そして瞳孔をトロピカミド(Novartis Ophthalmics)の液滴を用いて散大させた。両眼の各膜上に配置されたゴールドワイヤーリング電極および前頭部に挿入された電極は、それぞれ、作用電極および基準電極として作用した。ステンレス鋼針状電極を、接地のために動物の尾に挿入した。全ての操作は、暗赤色灯下で実施され、測定は、市販のVisioSystem装置(Siem Biomedicale)を使用して実施された。
脈絡膜新血管新生が、Browm Norwayの処置されていない対照眼において、または耳側上脈絡膜への30μgのpVAX2またはpVAX2−sFlt−1のエレクトロトランスファーによって3日前に処置された眼において、レーザー光凝固によって誘導された。細隙灯(Hagg-Streitt, BQ 900)に積載された532nmのアルゴンレーザー(Viridis 532nm, Quantel Medical, Clermont-Ferrand, France)を初めから終わりまで使用した。カバーガラスは、レーザー伝送中にコンタクトレンズの役割を果たした。耳側網膜における4つの病変および鼻側網膜における4つの病変という、1眼あたり8つのレーザースポット(100μmのスポットサイズ、0.1秒の期間および175mWの電力)を実施した。レーザー伝送後に網膜表面で観察された反応性バブルは、適切に焦点が合わせられたことの証拠として、およびブルッフ膜の破裂の徴候として考えられた。
各実験のために、1条件あたりに処置された眼の数を、図の説明文に記載した。数値データについては、結果は、平均±平均の標準誤差(SEM)として表現され、そしてノンパラメトリックマンホイットニーU検定(Prism 4.0、Graph Pad Software Inc., San Diego, CA)を使用して比較した。p<0.05を有意と判断した。
上脈絡膜への注射
脈絡膜上腔(すなわち、強膜と下にある脈絡膜との間)への注射を検証するために、手順をまずマイヤーヘマトキシリン溶液を使用してin vivoにおいてモニタリングした。注射中の脈絡膜上腔への染料の拡散は、リアルタイムでアルビノラットの眼の外側から可視化できた。注射針が、注射が終わった後に除去されると、脈絡膜上ポケットの推定領域に対応する着色円形領域を、眼の外側から観察することができた。光受容体外節(OS)と網膜色素上皮細胞(RPE)との間の剥離に対応する網膜下ブレブは、眼底には全く認められず、染料は、脈絡膜上腔により深く局在していた。これらの肉眼的観察を確認するために、樹脂による組織切開を、注射から数分後に固定された眼に対して実施した。脈絡膜と強膜との間の剥離を、全神経網膜を、ブルッフ膜および脈絡毛細管/脈絡膜に依然として付着した網膜色素上皮(RPE)細胞に付着させたままで、強調することができた。剥離は、耳側半球の前半分に広がった。それは、針挿入部位の近くの前部分では大きく完全であり、そして後ろでは除々に減少し、脈絡膜と強膜との間では明らかに局所的に付着していた。上脈絡膜剥離の後ろで行われた観察は、脈絡膜が、処置されていない対照眼において観察されたように、強膜と密接に接触していたことを示した。どの眼にも出血は認められなかった(n=5)。以下の全ての実験において、眼底検査を注射後に実施して、分析から網膜剥離のバブルを有する眼が除外された。全ての処置された眼の中で2つの眼だけが、偶発的な網膜下への注射のために分析から除外された。出血(bleeding)または出血(hemorrhage)は、手術中または手術直後にも全く認められず、注射のみの7日後にも認められなかったことを注記する。pVAX1−LacZプラスミドDNAの簡単な上脈絡膜への注射から7日後に非常に僅かなβ−ガラクトシダーゼ活性が観察されたか、またはβ−ガラクトシダーゼ活性は全く観察されず、そしてpVAX1プラスミド骨格を用いて青色の着色は全く見られず、これは、注射のみではトランスフェクションが全く起こらないかまたは非常に僅かなトランスフェクションしか起こらないことを実証する。
脈絡膜上腔へのプラスミド注射(30μl中30μgのpVAX1−LacZ)直後、注射領域を、種々の電極形および電極配置の適用によって作られた電場にかけた(エレクトロトランスファー手順)。電場は、5Hzの周波数を有する20Vの電圧強度および20ミリ秒の期間の8つのパルスを使用して作られた。注射のみに比べて、β−ガラクトシダーゼ遺伝子発現は、試験した全ての電極を用いてのETによって有意に増強された。しかしながら、各装置は、異なるトランスフェクション効力を示した。事前の実験において、使用した装置は、両電極の位置に関して幾分適応させた、本発明者らの研究室においてETによってin vivoにおいて眼の毛様体筋線維に伝達するために開発されたものであった[24]。プラチナ/イリジウム(Pt/Ir)ワイヤー(250μmの直径、陰極)を、注射針を引っ張り出した後に、注射部位の反対側の強膜に付着した半環状Pt/Irシート(陽極)に面して、脈絡膜上腔に挿入した。このような状態において、眼の外側から観察されたβ−ガラクトシダーゼを発現している組織の領域は、ワイヤー電極が挿入された部位に対応する線として出現した。細胞によるプラスミドDNAの取り込みおよび発現を拡大するために、本発明者らはより大きな電極を使用し、そしてそれらを外部に配置することを決定した。半環状Pt/Irシート(陽極)を、強膜表面上の眼後極の底部に配置された半環状Pt/Irワイヤー電極(陰極)と共に、接種領域の上に位置する強膜表面上に配置した場合(装置1)、β−ガラクトシダーゼ発現は、シート電極が位置していた後眼部の前部分に局在していた。接触湾曲プラチナ/イリジウムシート(陽極、+)を、強膜上に配置された半環状プラチナ/イリジウムシート(陰極、−)と共に、眼の反対側の陽極に面して、注射領域の上の強膜に付着させた場合(装置2)、β−ガラクトシダーゼリポーター遺伝子を発現している組織の領域は、2つの他の装置と比べて大きく広がっていた。このような装置を用いて、陽極は、上脈絡膜剥離の全領域を網羅し、そしてリポーター遺伝子は、電場が全く発生しなかった、接触湾曲電極を維持するために眼表面に配置されたプラスチック製接続用ピンセットに対応する僅かなゾーンを除いて、ほぼ全ての剥離表面において発現された。どのような電気装置を使用したとしても、pVAX1骨格のETによって処置された眼においては青い着色は全く観察されなかった。電場印加中またはETの7日後には出血は全く認められなかった。
装置2を使用して、いくつかのセットの電気パラメーターを、電圧強度(V)およびパルス期間(ミリ秒)を変化させて、30μg(30μl中)のpVAX1−LacZの脈絡膜上腔への注射後に試験した。処置から数日後、β−ガラクトシダーゼ発現によって可視化されたトランスフェクション効率(青い着色)は、注射のみによって処置された眼で得られたものと比べて、7Vの8つのパルス(20ミリ秒、5Hz)にかけた眼において違いはなかった。逆に、15V、30Vおよび60Vの電圧強度を有する8つのパルス(20ミリ秒、5Hz)の印加は、注射のみによって処置された眼と比べて、β−ガラクトシダーゼ発現を有意に増強させた。トランスフェクション効率は電圧の増加と共に増加し、より良好な効率は30Vで得られた。この条件を使用して、リポーター遺伝子発現を、ほぼ全部の耳側半球において検出することができた。本発明者らは、別様に、リポーター遺伝子活性は、30Vの電圧を使用するよりも20Vの電圧を使用すると、さらにより効率的であることを実証した。
平らに乗せられたRPE−脈絡膜−強膜の複合体および神経網膜の低倍率での観察は、脈絡膜細胞および血管が、神経組織と同様にトランスフェクションされていることを示す。組織薄片は、脈絡膜血管を含む脈絡膜細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を確認したが、RPE細胞および光受容体内節および外節における活性も示した。より大きな倍率は、脈絡膜血管のトランスフェクション、RPE細胞の通常のトランスフェクション、光受容体の外節およびより低い程度で内節におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を確認する。染色されていない薄片の位相差分析を使用して、β−ガラクトシダーゼ活性から生じた青色の着色が、脈絡膜血管を含む脈絡膜細胞、RPE細胞およびより高倍率で光受容体核周辺および内節においてより良好に検出され、このことは光受容体がトランスフェクションされたことを示唆する。
β−ガラクトシダーゼ活性は7日目に最大となり(試験した最初の時点)、この時にトランスフェクションが、上脈絡膜剥離領域に相当する全領域で観察された。その後、遺伝子発現は、強度レベルおよび範囲レベルの両方において、7日後から4.5カ月後まで時間をかけて減少した。7日目に行われた観察と比較して、染色は、依然として強力ではあったが、14日目には均一度が低かった。エレクトロトランスファーから1カ月後、β−ガラクトシダーゼ活性は、僅かであり、大半の発現は、環状環を随伴し、これは上脈絡膜剥離ブレブの縁に相当する。4.5カ月後、リポーター遺伝子発現は、制限された領域においてのみ依然として検出可能であった。観察期間中、外部にまたは眼底において病的変化は全く認められなかった。CMVプロモーターを使用すると、有意な発現が少なくとも1か月間達成され、その後、4.5カ月後まで減少した。
上脈絡膜への注射およびエレクトロトランスファー手順によって誘導された、脈絡膜および網膜脈管構造における可能性ある変化を評価するために、眼底血管造影を、プラスミド骨格を用いての処置の3日後に実施した。耳側の処置された領域においては、処置されていない対照眼の同じ領域と比べて、血管漏出またはウィンドウ効果は全く観察されず、このことは、処置が明らかに血管およびRPEの完全性を維持したことを実証する。さらに、両群において視神経乳頭レベルでの漏出血管は全く検出できず、このことは、主要な早期の血管網膜バリアの崩壊はないことを示唆する。上脈絡膜への注射およびエレクトロトランスファーの手順が、網膜電気生理に対して機能的な結果を及ぼしたかどうかを分析するために、ERGを処置の7日後に記録した。処置されていない対照眼と比較して、ビヒクル溶液(半生理食塩水)の注射のみでは、a波およびb波振幅の有意な改変を全く誘導しなかった。さらに、ビヒクル注射後のエレクトロトランスファーにかけられた眼と、注射のみによって処置された眼または処置されていない対照眼との間で、a波およびb波振幅の統計学的差異は、全く検出できなかった。さらに、眼内炎症は、同時点で臨床検査によって認められなかった。
ラット可溶性血管内皮増殖因子レセプター1(sFlt−1)をコードしているプラスミドの上脈絡膜へのエレクトロトランスファーの抗血管新生効力を、脈絡膜新血管新生(CNV)ラットモデルにおいて評価した。全群において、耳側と鼻側との間にはCNV領域の統計学的差異は認められず、このことは、1眼あたりに測定された全ての数値が、1つの数値へと平均化された理由である。疾患のピーク時に実施された血管新生領域の観察および定量によって示されるように、有意な減少とレーザー誘導CNV領域の25%が、治療プラスミド(18500±1430μm2)のエレクトロトランスファーによって処置されたラットにおいて、対応する空プラスミド(25100±1710μm2)のエレクトロトランスファーによって処置された対照眼および処置されていない対照眼(25700±1400μm2)と比較して観察された。さらに、CNVの悪化は、処置されていない対照眼と比べて、pVAX2で処置された眼においては認められなかった。
本発明者らは、すでに、上脈絡膜への投与が、徐放性ポリマーの徐放を可能とする、安全かつ再現性のある手順であることを実証した[25]。それ以来、他のグループが、この投与経路の実行可能性を確認した。特に、T. Olsenのグループは、後極までの注射器の適切な配置を追跡するための照明システムの備えられたエレガントな上脈絡膜カテーテルを開発した[26]。本研究において、本発明者らは、この経路をまた使用して、脈絡膜および隣接する網膜細胞にプラスミドDNAを送達することができ、そして前記プラスミドは、この空間に、エレクトロトランスファー電流のab externo適用によるその伝達を可能とするのに十分な長さで閉じ込められたままであることを実証する。脈絡膜における非常に多い血流のために、溶液中のプラスミドは、数秒以内に流されるだろうと予期することができた。しかしながら、脈絡膜上腔への適切な注射は、おそらく、「ポケット」を作り、この中にプラスミド溶液が捕捉され、そしてトランスフェクションを可能とするに十分な時間の間、RPE細胞に対する圧力を維持する。プラスミドDNAがどのようにブルッフ膜を通してRPE細胞に到達することができるかは、300KDを超える分子はそれを通過することはないと推定されているので明らかではない[27]。しかしながら、網膜を起源とする20〜30nmのリポタンパク質の粒子(プラスミドのサイズ範囲の粒子)が、ブルッフ膜に見られたことが示された[28]。より意外な観察は、RPE細胞だけでなく光受容体もトランスフェクションされたことであった。類似の結果がちょうど、ウサギの眼へのAAVの上脈絡膜への投与後に公開された[29]。脈絡膜上腔からRPE細胞および神経網膜へのプラスミドの拡散に関与する輸送機序を分析するために、さらなる研究が必要とされる。興味深いことに、プラスミドの網膜下注射を、成体動物において電気穿孔法と組み合わせて実施した場合にさえ、光受容体はトランスフェクションされなかった[22、23]。これは、異なる電極形および電極配置を使用して本発明者らが作製した異なる電流場に関連し得る。注射に加えて、プラスミドを電流の適用なしに注射した場合にはトランスフェクションがなされないことによって示されるように、電場は電気穿孔が起こるのに必須である。適切なパラメーターは、各組織について、効力および毒性閾値を規定するために適合させなければならない。これらの実験において、効力は20〜30ボルト(約66および100V/cm)において影響を及ぼし、そして毒性は、電流が200V/cm以上の場合に認められた。これらのパラメーターは、毛様体筋[24]または骨格筋細胞[16、30]について記載されたものより低い。選択されたパラメーターを使用して、エレクトロトランスファーは、蛍光血管造影、網膜電図検査および組織診断において安全であり、このことは、安全性の懸念なく後極においてさえそれを使用することができることを実証する。これは勿論、黄斑を標的化すべき場合には最も重要である。
これは、安全な手順を使用して、脈絡膜新血管標的化のための可能性ある適用により、脈絡膜だけでなく、RPE細胞および潜在的には光受容体をもトランスフェクションすることができるという初めての実証である。非ウイルス性のベクターが使用されるだけでなく、最小限に侵襲的な手順が、網膜剥離およびあらゆる眼内電極配置を回避しつつ実施された。ヒトサイズの眼の後極を特異的に処置するための簡単な使い捨ての装置を設計するための、さらなる技術的改良が行われている。
本出願全体を通して、種々の参考文献が本発明が属する当技術分野の最新技術を記載する。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により本明細書に組み入れられる。
Claims (15)
- i)対象となる治療核酸を用いて製剤化された薬学的組成物を、病的眼の脈絡膜上腔に送達する工程、およびii)薬学的組成物が送達された領域を電場にかける工程からなる工程を含む、被験者における眼疾患を処置するための方法。
- 対象となる核酸がプラスミドに挿入される、請求項1記載の方法。
- 対象となる核酸が、酵素、血液製剤、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、ケモカイン、抗炎症因子、成長因子、栄養因子、神経栄養因子、造血因子、血管新生因子、抗血管新生因子、メタロプロテイナーゼ阻害剤、アポトーシスのレギュレーター、凝固因子、そのレセプター、特に可溶性レセプター、レセプターもしくは接着タンパク質のアゴニストもしくはアンタゴニストであるペプチド、その抗原、抗体、フラグメントもしくは誘導体、および細胞の他の必須構成成分、RPE細胞内の視覚サイクルに関与するタンパク質、または網膜細胞の構造タンパク質をコードする、請求項1または2記載の方法。
- 眼疾患が網膜疾患である、請求項1〜3のいずれか記載の方法。
- 前記の眼疾患が、眼内増殖性疾患、眼神経変性疾患、緑内障、眼感染症、眼炎症疾患、例えば結膜炎、角膜炎、内皮炎、ブドウ膜炎、脈絡膜炎、網膜炎、脈絡網膜炎、前部ブドウ膜炎、および炎症性視神経症、網膜変性、特に網膜色素変性症、末梢網膜変性、黄斑変性症、例えばドライ型加齢黄斑変性症、虚血性網膜症、特に未熟児網膜症、および糖尿病性網膜症、網膜血管障害、眼虚血症候群、および他の血管形成異常、脈絡膜異常、および脈絡膜腫瘍、硝子体の異常、グリア細胞の増殖、例えば増殖性硝子体網膜症、および糖尿病性網膜前血管新生に関連したグリア細胞の増殖からなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか記載の方法。
- 前記核酸が、TNF[α]レセプター、TGF[β]2レセプター、VEGFR−1、VEGFR−2、VEGFR−3、CCR2またはMIP1の可溶性フラグメントをコードするか、あるいはさもなくば、免疫療法の目的のための認識能を有する抗体、一本鎖抗体の可変フラグメント(ScFv)、または任意の他の抗体フラグメントをコードするか、あるいはこれらの治療タンパク質のいずれか1つの前駆体をコードする、請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
- 薬学的組成物が、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースからなる群より選択される増粘剤を含む、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
- 電場が、電気穿孔法によって実施される、請求項1〜7のいずれか1項記載の方法。
- 電場の磁場強度が、1〜600ボルト、好ましくは1〜400ボルト、さらにより好ましくは1〜200ボルト、有利には10〜100ボルト、またはさらには15〜70ボルトである、請求項1〜8のいずれか1項記載の方法。
- 電場を印加する全期間が、0.01ミリ秒〜1秒、好ましくは0.01〜500ミリ秒、より好ましくは1〜500ミリ秒、有利には10ミリ秒〜100ミリ秒、最も好ましくは20ミリ秒である、請求項1〜9のいずれか1項記載の方法。
- 電場が、2つの電極を使用することによって印加され、前記電極の一方が、脈絡膜上腔に導入され、そして他方が、脈絡膜上への注射が実施されたのとは反対側の眼の表面上に適用される、請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。
- 電場が、2つの電極を使用することによって印加され、前記電極の一方が、脈絡膜上への注射が実施された領域に隣接した強膜の表面上に適用され、そして他方が、脈絡膜上への注射が実施されたのとは反対側の、眼の表面上、例えば強膜または結膜に適用される、請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。
- 眼疾患が眼内新生血管または黄斑浮腫であり、そして前記方法がそれを患う被験者の脈絡膜上腔に、抗VEGF、抗VEGFレセプターまたは抗PLGFをコードする治療核酸を用いて製剤化された薬学的組成物を送達することを含む、請求項1〜12のいずれか1項記載の方法。
- 眼疾患が網膜色素変性症であり、そして前記方法が、それを患う被験者の脈絡膜上腔に、神経栄養因子をコードする治療核酸を用いて製剤化された薬学的組成物を送達することを含む、請求項1〜12のいずれか1項記載の方法。
- 眼疾患が糖尿病性網膜症であり、そして前記方法が、それを患う被験者の脈絡膜上腔に、抗IRS−1またはIGF−1をコードする治療核酸を用いて製剤化された薬学的組成物を送達することを含む、請求項1〜12のいずれか1項記載の方法。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020535184A (ja) * | 2017-09-27 | 2020-12-03 | レジェンクスバイオ インコーポレーテッド | 翻訳後修飾された完全ヒト抗VEGF Fabによる眼疾患の治療 |
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EP3823567A1 (en) * | 2018-07-20 | 2021-05-26 | The USA, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services | Intraocular delivery of gene therapy expression vectors |
US20220023389A1 (en) | 2018-12-10 | 2022-01-27 | University Of Copenhagen | Vasodilators for use in the treatment of a retinal ischemic disorder |
WO2020161342A1 (en) * | 2019-02-08 | 2020-08-13 | Curevac Ag | Coding rna administered into the suprachoroidal space in the treatment of ophtalmic diseases |
EP3934742A4 (en) * | 2019-03-06 | 2022-11-23 | Centre For Eye Research Australia Ltd | ELECTRICAL DEVICE AND METHOD FOR AN EYE |
AU2020308909A1 (en) * | 2019-06-27 | 2022-01-27 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Enhancing AAV-mediated transduction of ocular tissues with hyaluronic acid |
WO2021207500A2 (en) * | 2020-04-08 | 2021-10-14 | President And Fellows Of Harvard College | TGFβ THERAPY FOR OCULAR AND NEURODEGENERATIVE DISEASES |
CN115820735B (zh) * | 2022-11-14 | 2024-07-16 | 中山大学中山眼科中心 | 一种Timp4基因缺陷所致的近视大鼠模型及其构建方法与应用 |
CN115868451A (zh) * | 2022-11-22 | 2023-03-31 | 清华大学 | 脉络膜缺血模型的制备方法 |
CN117467025B (zh) * | 2023-12-28 | 2024-04-16 | 上海鼎新基因科技有限公司 | 一种抗vegf和补体双功能融合蛋白及其应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008538370A (ja) * | 2005-04-18 | 2008-10-23 | アンスティテュー・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル・(イ・エヌ・エス・ウ・エール・エム) | 対象の眼球に対して治療用生成物を送達するための改良型方法及び装置 |
JP2009523545A (ja) * | 2006-01-17 | 2009-06-25 | フォーサイト ラブズ リミテッド ライアビリティ カンパニー | 薬剤投与処置装置 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2108144A1 (en) | 1991-03-06 | 1992-09-07 | Jack A. Roth | Methods and compositions for the selective inhibition of gene expression |
US20030045830A1 (en) * | 2001-04-17 | 2003-03-06 | De Bizemont Therese | Gene therapy with chimeric oligonucleotides delivered by a method comprising a step of iontophoresis |
US20100173866A1 (en) | 2004-04-29 | 2010-07-08 | Iscience Interventional Corporation | Apparatus and method for ocular treatment |
US7947267B2 (en) * | 2004-10-08 | 2011-05-24 | Potentia Pharmaceuticals, Inc. | Viral complement control proteins for eye disorders |
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US8912153B2 (en) * | 2008-08-13 | 2014-12-16 | President And Fellows Of Harvard College | HDAC4 nucleic acid administration to treat retinal disease |
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008538370A (ja) * | 2005-04-18 | 2008-10-23 | アンスティテュー・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル・(イ・エヌ・エス・ウ・エール・エム) | 対象の眼球に対して治療用生成物を送達するための改良型方法及び装置 |
JP2009523545A (ja) * | 2006-01-17 | 2009-06-25 | フォーサイト ラブズ リミテッド ライアビリティ カンパニー | 薬剤投与処置装置 |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020535184A (ja) * | 2017-09-27 | 2020-12-03 | レジェンクスバイオ インコーポレーテッド | 翻訳後修飾された完全ヒト抗VEGF Fabによる眼疾患の治療 |
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