ES2691731T3 - Métodos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de una enfermedad ocular en un sujeto - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica formulada con un ácido nucleico terapéutico de interés insertada en un plásmido para el uso en el tratamiento de una enfermedad ocular en un sujeto, en donde el tratamiento comprende las etapas de i) suministrar dicha composición farmacéutica al interior del espacio supracoroideo de un ojo enfermo y ii) exponer la región en la que se suministraba la composición farmacéutica a un campo eléctrico para la electroporación, y estando la intensidad de campo del campo eléctrico entre 15 voltios y 70 voltios, y en donde el campo eléctrico se aplica al usar dos electrodos, (i) cuando se elige como diana la coroides, introduciéndose uno de dichos electrodos en el espacio supracoroideo y aplicándose el otro sobre la superficie de la esclerótica en la cara opuesta a la que se realizaba la inyección supracoroidea; o (ii) cuando se elige como diana la retina: * introduciéndose uno de dichos electrodos en el espacio supracoroideo y aplicándose el otro sobre la superficie del ojo en la cara opuesta a la que se realizaba la inyección supracoroidea; o * aplicándose uno de dichos electrodos sobre la superficie de la esclerótica adyacente a la región en la que se realizaba la inyección supracoroidea y aplicándose el otro sobre la superficie del ojo, p. ej. la esclerótica o la conjuntiva, en la cara opuesta a la que se realizaba la inyección supracoroidea.

Description

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DESCRIPCION

Metodos y composiciones farmaceuticas para el tratamiento de una enfermedad ocular en un sujeto Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a metodos y composiciones farmaceuticas para el tratamiento de una enfermedad ocular en un sujeto.

Antecedentes de la invencion

En los ultimos anos, ha habido nuevos avances interesantes para el tratamiento de enfermedades oculares tales como degeneracion macular asociada a la edad y retinopatia diabetica, usando bioterapias. Debido a que el ojo es un organo pequeno confinado aislado por barreras, se ha identificado como un organo de eleccion para la terapia genica local.

Por ejemplo, las distrofias retinianas hereditarias se deben a mutaciones en proteinas codificantes de genes en fotorreceptores (conos y bastones) o en celulas epiteliales pigmentarias retinianas (RPE). Aunque la sustitucion genica en celulas fotorreceptoras todavia esta bajo evaluacion preclinica, los avances mas notables en este campo se han hecho para la sustitucion genica de RPE65 en celulas RPE, para el tratamiento de la amaurosis congenita de Leber (LCA). No solo se mostraba que la transferencia genica viral en las RPE era factible y eficaz en modelos animales, sino que, recientemente, los pacientes han recibido la inyeccion subretiniana de rAAV4 con resultados funcionales prometedores, proporcionando esperanzas para pacientes que sufren enfermedades que provocan ceguera.

Los vectores virales permiten una transfeccion eficaz de celulas RPE y han servido para validar demostraciones preliminares, pero la persistencia a largo plazo de particulas virales en la retina y el cerebro continua aumentando los problemas de seguridad, particularmente cuando el tratamiento se este aplicando en ninos pequenos.

Cuando se inyectan en el humor vitreo, los vectores virales no alcanzan las celulas RPE y solo su inyeccion subretiniana se ha mostrado eficaz para dirigirse a celulas RPE o fotorreceptores. Por otra parte, usando la inyeccion subretiniana, las celulas RPE solo se transfectan en y en la vecindad de la zona retiniana separada, lo que implica desprender la macula cuando se busca la recuperacion de la vision central. Este desprendimiento macular se puede asociar con una amenaza para la vision. En efecto, se sabe bien que una recuperacion pobre de la vision despues de un desprendimiento de retina se correlaciona con un desprendimiento macular. Un trabajo reciente que usa OCT de dominio espectral ha proporcionado evidencia de que despues de un tratamiento quirurgico satisfactorio del desprendimiento de retina, 62% de los ojos presentaban anormalidades anatomicas foveales y que, particularmente, la ruptura de la membrana limitativa externa, observada solo cuando la macula se separaba antes de la cirugia, estaba asociada con el peor pronostico de la vision. Aunque todavia existen controversias relativas a los factores que pueden predecir la recuperacion de la vision despues del desprendimiento macular, la salud de la macula en el momento de la reinsercion es probablemente la variable mas critica. En ojos enfermos, conociendo la incertidumbre de la recuperacion de la vision central despues del desprendimiento macular, es dificil asegurar que la inyeccion submacular no sea arriesgada.

Muchos vectores o metodos de transferencia genica no virales se han desarrollado o adaptado para la terapia genica ocular (Andrieu-Soler C Mol Vis 2006 12:1334; Bejjani RA Surv Ophthalmol 2007 52:196; Bloquel C Adv Drug Deliv Rev 2006 58:1224). Entre estos, la electroporacion, tambien llamada "electrotansferencia", en la que la corriente conduce ADN plasmidico a las celulas, esta entre los mas eficaces ((Mir LM Adv Genet 2005 54:83; Mir LM Methods Mol Biol 2008 423:3; Isaka Y Expert Opin Drug Deliv 2007 4:561) y se ha desarrollado hasta una evaluacion clinica (Daud AI J Clin Oncol 2008 26:5896). Informes previos han mostrado que despues de la administracion subretiniana de los plasmidos, la electroporacion permitia la transfeccion eficaz de RPE murinas de recien nacido (Matsuda T Proc Natl Acad Sci USA 2004 101:16) y retrasaba la degeneracion retiniana en modelos animales (Chen B Science 2009 323:256). La transfeccion de RPE eficaz y prolongada tambien se alcanzaba en la rata adulta usando una combinacion de la inyeccion subretiniana de plasmidos que contiene promotor de RPE especifico y electroporacion (Kachi S Gene Ther 2005 12:843; Johnson CJ Mol Vis 2008 14:2211).

El documento WO 02/083184 divulga un metodo para potenciar el suministro in vivo de oligonucleotidos quimericos en celulas retinianas, que comprende una etapa de iontoforesis.

El documento WO 2010/019786 divulga un metodo para inhibir la muerte de celulas neuronales que comprende poner en contacto las celulas con un agente. La administracion de la composicion que comprende el agente de interes se puede realizar en el espacio supracoroideo de un ojo enfermo.

El espacio supracoroideo es un espacio potencial del ojo que esta situado entre la coroides, que es la tunica vascular interna, y la esclerotica, la capa externa del ojo. El espacio supracoroideo se extiende desde la porcion

anterior del ojo posterior al cuerpo ciliar hacia la region posterior del ojo hasta el nervio optico. El espacio supracoroideo del ojo se ha estudiado asi como una posible via para el suministro de farmacos. Vease, p. ej., Olsen y cols., American J. Opthamology 142(5): 777-87 (noviembre 2006); la Publicacion de Solicitud de Patente PCT N° WO 2007/100745 de Iscience Interventional Corporation. En efecto, el espacio supracoroideo puede proporcionar 5 una via potencial de acceso desde la region anterior del ojo para tratar la region posterior. Peden y cols. ("Ab- Externo AAV-Mediated Gene Delivery to Suprachoroidal space using a 250 Micron Flexible Microcatheter"; PLOS ONE; vol. 6, n° 2; 2011) ensena que una inyeccion en el espacio supracoroideo es menos agresiva que una inyeccion combinada con una vitrectomia. Sin embargo, dicha via no se ha previsto para una terapia genica no viral.

Sumario de la invencion

10 La presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica formulada con un acido nucleico terapeutico de interes insertado en un plasmido para el uso en el tratamiento de una enfermedad ocular en un sujeto, en donde el tratamiento comprende las etapas que consisten en i) suministrar una composicion farmaceutica formulada con un acido nucleico terapeutico de interes en el espacio supracoroideo del ojo enfermo y ii) exponer la region a la que se suministraba la composicion farmaceutica a un campo electrico para la electroporacion.

15 Descripcion detallada de la invencion

Los inventores han evaluado si la inyeccion supracoroidea de una solucion de plasmido en el ojo de rata, asociada con una electroporacion extraocular, podia ser eficaz para la transfeccion de la coroides y las celulas RPE y/o la neurorretina. Realizaron la demostracion preliminar de que usando esta tecnica minimamente invasiva, que no requiere inyeccion subretiniana ni desprendimiento posterior, se transfectan eficazmente no solo celulas RPE y

20 celulas coroideas, sino tambien fotorreceptores. La invencion se refiere asi a una composicion farmaceutica formulada con un acido nucleico terapeutico de interes insertada en un plasmido para el uso en el tratamiento de una enfermedad ocular en un sujeto, segun se define posteriormente en la presente.

Segun esto, la presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica formulada con un acido nucleico

25 terapeutico de interes insertado en un plasmido para el uso en el tratamiento de una enfermedad ocular en un sujeto, en donde el tratamiento comprende las etapas que consisten en i) suministrar una composicion farmaceutica formulada con un acido nucleico terapeutico de interes al espacio supracoroideo del ojo enfermo y ii) exponer la region en la que se suministraba la composicion farmaceutica a un campo electrico, en donde la intensidad de campo del campo electrico esta entre 15 voltios y 70 voltios, y en donde el campo electrico se aplica al usar dos

30 electrodos,

(i) cuando se elige como diana la coroides, uno de dichos electrodos se introduce en el espacio supracoroideo y el otro se aplica sobre la superficie de la esclerotica en la cara opuesta a la que se realizaba la inyeccion supracoroidea; o

(ii) cuando se elige como diana la retina:

35 ■ uno de dichos electrodos se introduce en el espacio supracoroideo y el otro se aplica sobre la superficie

del ojo en la cara opuesta a la que se realizaba la inyeccion supracoroidea; o

■ uno de dichos electrodos se aplica sobre la superficie de la esclerotica adyacente a la region en la que se realizaba la inyeccion supracoroidea y el otro se aplica sobre la superficie del ojo, p. ej. la esclerotica o la conjuntiva, en la cara opuesta a la que se realizaba la inyeccion supracoroidea.

40 El acido nucleico que se va a usar en esta invencion puede ser cualquier acido nucleico de interes que exhiba una propiedad biologica. Mas particularmente, el acido nucleico puede ser cualquier acido nucleico que codifique un producto natural, truncado, artificial, quimerico o recombinante [p. ej., un polipeptido de interes (incluyendo una proteina o un peptido), un ARN, etc.] que exhiba una actividad biologica.

45 El acido nucleico es preferiblemente una molecula de acido desoxirribonucleico (ADN) (ADNc, ADNg, ADN sintetico, ADN artificial, ADN recombinante, etc.) o una molecula de acido ribonucleico (ARN) (ARNm, ARNt, ARNi, ARNsi, ARN catalitico, ARN antisentido, ARN viral, etc.). El acido nucleico puede ser un acido nucleico monocatenario o multicatenario, preferiblemente acido nucleico bicatenario, o puede estar complejado. El acido nucleico puede comprender secuencias hibridas o secuencias sinteticas o semisinteticas. Se puede obtener mediante cualquier

50 tecnica conocida por los expertos en la especialidad, y especialmente mediante bibliotecas de cribado, mediante sintesis quimica, o alternativamente mediante metodos mixtos incluyendo modificacion quimica o enzimatica de secuencias obtenidas mediante bibliotecas de cribado.

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En una realizacion particular, el acido nucleico terapeutico es de origen sintetico o biosintetico, o se extrae de un virus o de un organismo eucariotico o procariotico unicelular o pericelular.

El acido nucleico terapeutico usado en la presente invencion puede estar desnudo, puede estar complejado con cualquier agente quimico, bioquimico o biologico, puede estar insertado en un vector, etc., cuando se administra al espacio supracoroideo.

Segun se usa en la presente, el termino "ADN desnudo" se refiere a cualquier molecula de acido nucleico que no este combinada con un agente sintetico, biosintetico, quimico, bioquimico o biologico que mejore el suministro o la transferencia de dicho ADN, o que facilite su entrada en la celula.

Segun se usa en la presente, el termino "vector" se refiere a una molecula de acido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico al que se ha ligado. Este termino tambien se refiere en la presente solicitud a cualquier portador de suministro, tal como una composicion asociada a un acido nucleico terapeutico o profilactico a fin de incrementar su suministro celular.

Vectores preferidos son los capaces de replicacion y/o expresion autonoma de acidos nucleicos a los que estan ligados. Los vectores capaces de dirigir la expresion de genes a los que estan ligados operativamente se denominan en la presente "vectores de expresion". En general, los vectores de expresion de utilidad en tecnicas de ADN recombinante estan a menudo en la forma de "plasmidos", que se refieren a bucles de DNA bicatenario circulares que, en su forma de vector, no estan unidos al cromosoma. En la presente invencion, el plasmido es la forma de vector mas comunmente usada. El plasmido es una forma preferida de ADN desnudo segun la invencion.

Los vectores tambien pueden ser ADN episomico, cromosomas artificiales de levadura, minicromosomas o vectores virales en donde el vector viral se selecciona del grupo que consiste en lentivirus, un adenovirus, un virus adenoasociado y un vector viroide.

El vector tambien puede ser una vesicula lipidica tal como un liposoma. Se pueden usar ademas compuestos basados en lipidos que no son liposomas. Por ejemplo, las lipofectinas y citofectinas son iones positivos basados en lipidos que se unen a acido nucleico cargado negativamente y forman un complejo que puede transportar el ADN a traves de una membrana celular. La invencion esta destinada a incluir estas otras formas de vectores de expresion que ejercen funciones equivalentes y que se conoceran en la especialidad de ahora en adelante.

Ademas, el acido nucleico segun la invencion tambien puede contener una o mas regiones adicionales, por ejemplo elementos reguladores de pequeno o gran tamano que estan disponibles para el experto tales como una region promotora (constitutiva, regulada, inducible, tisularmente especifica, etc.), por ejemplo secuencias que permiten y/o promueven la expresion en tejido (p. ej. la coroides o la retina) o celulas (p. ej. RPE o fotorreceptores) elegidos como diana, una senal de terminacion de la transcripcion, secuencias de secrecion, un origen de replicacion y/o secuencias senalizadoras de la localizacion nuclear (nls) que potencian adicionalmente la transferencia de polinucleotidos al nucleo celular. Estas secuencias nls se han descrito en la tecnica anterior incluyendo la secuencia del antigeno T grande de SV40.

Adicionalmente, el acido nucleico puede comprender ademas marcadores seleccionables utiles para seleccionar, medir y comprobar los resultados de la transferencia de acido nucleico (transferencia a que tejidos, duracion de la expresion, etc.). Los tipos de sistemas de expresion y genes indicadores que se pueden usar o adaptar para el uso son muy conocidos en la especialidad. Por ejemplo, se usan comunmente genes que codifican una actividad de luciferasa, una actividad de fosfatasa alcalina o una actividad de proteina fluorescente verde.

El acido nucleico segun la invencion puede contener cualquier secuencia nucleotidica de cualquier tamano. El acido nucleico puede asi variar de tamano de un simple oligonucleotido a una molecula mayor tal como una secuencia nucleotidica que incluye exones y/o intrones y/o elementos reguladores de cualesquiera tamanos (pequenos o grandes), un gen de cualquier tamano, por ejemplo de gran tamano, o un cromosoma, por ejemplo, y puede ser un plasmido, un episoma, un genoma viral, un fago, un cromosoma artificial de levadura, un minicromosoma, una molecula antisentido, etc.

En una realizacion particularmente preferida, el polinucleotido es un ADN circular bicatenario, tal como un plasmido, que codifica un producto con actividad biologica.

El acido nucleico se puede preparar y producir segun tecnicas de ADN recombinante convencionales, tales como amplificacion, cultivo en celulas hospedadoras procarioticas o eucarioticas, purificacion, etc. Las tecnicas de la tecnologia de ADN recombinante son conocidas por los expertos normales en la especialidad.

En una realizacion particular, el acido nucleico de interes es capaz de ejercer un efecto beneficioso sobre las celulas elegidas como diana, Puede compensar una deficiencia en o reducir un exceso de una sustancia endogena. Alternativamente, puede conferir nuevas propiedades a las celulas elegidas como diana. Por ejemplo, puede ser una

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secuencia antisentido o un acido nucleico que codifica un polipeptido que puede afectar a la funcion, la morfologia, la actividad y/o el metabolismo de las celulas oculares.

La regulacion a la baja de la expresion genica usando acidos nucleicos antisentido se puede alcanzar a nivel de la traduccion o la transcripcion. Los acidos nucleicos antisentido de la invencion son preferiblemente fragmentos de acido nucleico capaces de hibridarse especificamente con un acido nucleico que codifica una sustancia activa ocular endogena o el correspondiente ARN mensajero. Estos acidos nucleicos antisentido pueden ser oligonucleotidos sinteticos, opcionalmente modificados para mejorar su estabilidad y selectividad. Tambien pueden ser secuencias de ADN cuya expresion en la celula produzca aRn complementario a la totalidad o parte del ARNm que codifica una sustancia activa ocular endogena. Los acidos nucleicos antisentido se pueden preparar mediante la expresion de la totalidad o parte de un acido nucleico que codifica una sustancia activa ocular endogena, en la orientacion opuesta. Cualquier longitud de la secuencia antisentido es adecuada para la puesta en practica de la invencion con la condicion de que sea capaz de regular a la baja o bloquear la expresion de la sustancia activa ocular endogena. Preferiblemente, la secuencia antisentido tiene una longitud de al menos 20 nucleotidos. La preparacion y el uso de acidos nucleicos antisentido, ADN que codifica ARNs antisentido y el uso de una cadena antisentido oligo y genetica se divulga en el documento WO92/15680.

Entre los polipeptidos o las proteinas biologicamente activos opcionalmente expresados por un acido nucleico segun se describe anteriormente y adecuados para la puesta en practica de la invencion estan enzimas, derivados sanguineos, hormonas, linfocinas, citocinas, quimiocinas, factores antiinflamatorios, factores de crecimiento, factores troficos, factores neurotroficos, factores hematopoyeticos, factores angiogenicos, factores antiangiogenicos, inhibidores de metaloproteinasa, reguladores de la apoptosis, factores de coagulacion, receptores de los mismos, en particular receptores solubles, un peptido que es un agonista o antagonista de un receptor o de una proteina de adhesion, antigenos, anticuerpos, fragmentos o derivados de los mismos y otros constituyentes esenciales de la celula, proteinas implicadas en el ciclo visual dentro de celulas RPE, y proteinas estructurales de celulas retinianas (proteinas estructurales, proteinas implicadas en el proceso de fototransduccion y/o en el ciclo visual; reciclado retiniano) y/o fagocitosis de la fagocitosis del segmento externo del fotorreceptor).

Diversos factores neurotroficos derivados de la retina tienen el potencial de rescatar celulas fotoprotectoras degenerativas, y se pueden suministrar a traves de un metodo segun la presente invencion. Agentes biologicamente activos preferidos se pueden seleccionar de VEGF, angiogenina, angiopoyetina-1, DeM, factores de crecimiento de fibroblastos acidos o basicos (aFGF y bFGF), FGF-2, folistatina, factor estimulante de colonias de granulocitos (G- CSF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de dispersion (SF), leptina, midcina, factor de crecimiento placentario (PGF), factor de crecimiento de celulas endoteliales derivado de plaquetas (PD- ECGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB (PDGF-BB), pleiotrofina (PTN), RdCVF (factor de viabilidad de conos derivado de bastones), progranulina, proliferina, factor de crecimiento transformante alfa (TGF-alfa), PEDF, factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de permeabilidad vascular (VPF), CNTF, bDnF, GdNf, PEDF, NT3, BFGF, angiopoyetina, efrina, EPO, NGF, IGF, GMF, aFGF, NT5, Gax, una hormona del crecimiento, [alfa]-1 -antitripsina, calcitonina, leptina, una apolipoproteina, una enzima para la biosintesis de vitaminas, hormonas o neuromediadores, quimiocinas, citocinas tales como IL-1, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, un receptor de las mismas, un anticuerpo que bloquea uno cualquiera de dichos receptores, TIMP tal como TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, TIMP-4, angioarrestina, endostatina tal como endostatina XVIII y endostatina XV, ATF, angiostatina, una proteina de fusion de endostatina y angiostatina, el dominio de hemopexina C-terminal de metaloproteinasa-2 de matriz, el dominio Kringle 5 e plasminogeno humano, una proteina de fusion de endostatina y el dominio Kringle 5 de plasminogeno humano, el inhibidor de ribonucleasa placentario, el inhibidor del activador del plasminogeno, el factor plaquetario-4 (PF4), un fragmento de prolactina, la proteina relacionada con proliferina (PRP), la antitrombina antiangiogenica III, el inhibidor derivado del cartilago (CDI), un fragmento del complemento CD59, inhibidores de C3a y C5a, inhibidores membranarios de ataque complejos, factor H, ICAM, VCAM, caveolina, PKC zeta, proteinas de union, JAMs, CD36, MERTK vasculostatina, vasostatina (fragmento de calreticulina), trombospondina, fibronectina, en particular el fragmento de fibronectina gro-beta, una heparinasa, gonadotropina corionica humana (hCG), interferon alfa/beta/gamma, proteina inducible por interferon (IP-10), la monocina inducida por interferon-gamma (Mig), la proteina 10 inducible por interferon-alfa (IP10), una proteina de fusion de Mig e IP10, receptor de tirosina cinasa 1 de tipo Fms soluble (FLT-1), receptor del dominio de insercion de cinasa (KDR), reguladores de la apoptosis tales como Bcl-2, Bad, Bak, Bax, Bik, isoforma corta de BcI-X y Gax, fragmentos o derivados de los mismos y similares.

En una realizacion particular, el acido nucleico codifica un fragmento soluble del receptor de TNF[alfa], el receptor de TGF[beta]2, de VEGFR-1, VeGFR-2, VEGFR-3, CCR2 o MIP1. En otra realizacion preferida, el acido nucleico tambien puede codificar un anticuerpo, un fragmento variable de un anticuerpo monocatenario (ScFv) o cualquier otro fragmento de anticuerpo que tenga capacidades de reconocimiento con propositos de inmunoterapia.

En una realizacion particular de la presente invencion, el acido nucleico biologicamente activo codifica un precursor de una proteina terapeutica utilizable en la presente invencion tal como las descritas anteriormente.

En otra realizacion particular, la composicion farmaceutica de la invencion es particularmente adecuada para realizar sustitucion genica. Segun esto, el acido nucleico puede codificar una proteina viable a fin de reemplazar la proteina

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defectuosa que se expresa naturalmente en el tejido elegido como diana. Tipicamente, genes defectuosos que se pueden reemplazar incluyen, pero no se limitan a, genes que son responsables de enfermedades degenerativas retinianas tales como retinitis pigmentaria (RP), amaurosis congenita de Leber (LCA), RP recesiva, retinitis pigmentaria dominante, retinitis pigmentaria ligada al cromosoma X, retinitis pigmentaria ligada al cromosoma X incompleta, dominante, amaurosis congenita de Leber dominante, ataxia recesiva, columna posterior con retinitis pigmentaria, retinitis pigmentaria recesiva con conservacion paraarteriolar de RPE, retinitis pigmentaria RP12, sindrome de Usher, retinitis pigmentaria dominante con sordera sensorineural, retinitis punteada albescente recesiva, sindrome de Alstrom recesivo, sindrome de Bardet-Biedl recesivo, ataxia espinocerebelar dominante con distrofia macular o degeneracion retiniana, abetalipoproteinemia recesiva, retinitis pigmentaria recesiva con degeneracion macular, enfermedad de Refsum recesiva, forma adulta, enfermedad de Refsum recesiva, forma infantil, sindrome de conos en S potenciado recesivo, retinitis pigmentaria con retardo mental, retinitis pigmentaria con miopatia, distrofia de bastones-conos de Newfoundland recesiva, retinitis pigmentaria sin pigmento, retinitis pigmentaria sectorial, retinitis pigmentaria regional, sindrome de Senior-Loken, sindrome de Joubert, enfermedad de Stargardt, juvenil, enfermedad de Stargardt de inicio tardio, distrofia macular dominante, tipo Stargardt, distrofia macular similar a Stargardt dominante, distrofia macular recesiva, fondo flavimaculado recesivo, distrofia de conos- bastones recesiva, distrofia de conos-bastones progresiva ligada al cromosoma X, distrofia de conos-bastones dominante, distrofia de conos-bastones; sindrome de de Grouchy, distrofia de los conos dominante, distrofia de los conos ligada al cromosoma X, distrofia de los conos recesiva, distrofia de los conos recesiva con electrorretinograma de bastones supernormal, distrofia macular atrofica ligada al cromosoma X, retinosquisis ligada al cromosoma X, distrofia macular dominante, drusas maculares radiales dominantes, distrofia macular dominante, herpes iris, distrofia macular dominante, forma de mariposa, distrofia macular viteliforme dominante del adulto, distrofia macular dominante, tipo Carolina del norte, distrofia de los conos retinianos dominante 1, distrofia macular dominante, cistoide, distrofia macular dominante, viteliforme atipica, atrofia foveomacular, distrofia macular dominante, tipo Best, distrofia macular dominante, similar a la de Carolina del norte con distrofia macular recesiva progresiva, juvenil con hipotricosis, hipoplasia foveal recesiva y disgenesis del segmento anterior, adaptacion de los conos retardada recesiva, distrofia macular en monocromatismo de conos azules, distrofia de patron macular con diabetes tipo II y sordera, retina moteada de Kandori, distrofia en patron, sindrome de Stickler dominante, sindrome de Marshall dominante, degeneracion vitreorretiniana dominante, vitreorretinopatia exudativa familiar dominante, vitreorretinocoroidopatia dominante; vitreorretinopatia inflamatoria neovascular dominante, sindrome de Goldmann- Favre, acromatopsia recesiva, tritanopia dominante, monocromatismo de bastones recesivo, deficiencia de rojo- verde congenita, deuteranopia, protanopia, deuteranomalia, protanomalia, enfermedad de Oguchi recesiva, distrofia macular dominante, inicio tardio, atrofia girada recesiva, atrofia greata dominante, distrofia coroidea areolar central dominante, coroideremia ligada al cromosoma X, atrofia coroidea, areolar central, central, peripapilar, atrofia coriorretiniana bifocal progresiva dominante, atrofia coriorretiniana bifocal progresiva, degeneracion retiniana en panal de Doyne dominante (Malattia Leventinese), amelogenesis imperfecta, distrofia corneorretiniana cristalina de Bietti recesiva, retinopatia vascular hereditaria dominante con fenomeno de Raynaud y migrana, enfermedad de Wagner dominante y vitreorretinopatia erosiva, microftalmia recesiva y sindrome de enfermedad retiniana; nanoftalmia recesiva, retardo, espasticidad y degeneracion retiniana recesivos, distrofia de Bothnia recesiva, pseudoxantoma elastico recesivo, pseudoxantoma elastico dominante; enfermedad de Batten recesiva (lipofuscinosis ceroidea), juvenil, sindrome de Alagille dominante, sindrome de McKusick-Kaufman, hipoprebetalipoproteinemia, acantocitosis, degeneracion paladial; sindrome de Hallervorden-Spatz recesivo; distrofia de fondo de Sorsby dominante, enfermedad ocular de Oregon, sindrome de Kearns-Sayre, retinitis pigmentaria con anormalidades del desarrollo y neurologicas, sindrome de Basseb Korenzweig, enfermedad de Hurler, enfermedad de Sanfilippo, enfermedad de Scieie, retinopatia asociada a melanoma, distrofia retiniana de Sheen, distrofia macular de Duchenne, distrofia macular de Becker y retinocoroidopatia de Birdshot. Ejemplos de genes incluyen, pero no se limitan a, genes que codifican el transportador del casete que se une a ATP, RPE65, RdCVF, CP290...

En otra realizacion, la composicion farmaceutica de la invencion es particularmente adecuada para realizar un salto de exones para restaurar la funcion de proteinas mutadas responsables de una enfermedad degenerativa retiniana. El salto de exones implica bloquear o evitar la incorporacion en ARNm maduro de uno o mas exones elegidos como diana que codifican aminosecuencias que son responsables de una disfuncion proteinica. Esto se efectua al exponer el pre-ARNm que incluye exones que codifican la proteina a oligonucleotidos antisentido (AONs) que son complementarios a motivos de secuencia que se requieren para el empalme correcto del uno o mas exones elegidos como diana. Los AONs se unen a secuencias requeridas complementarias en el pre-ARNm y evitan el empalme normal. En cambio, los exones elegidos como diana se cortan y no se incluyen en el ARNm maduro que se traduce en proteina, y las secuencias de aminoacidos codificadas por los exones elegidos como diana faltan de la proteina traducida.

Por otra parte, en otra realizacion de la presente invencion, se puede usar una mezcla de acidos nucleicos que codifican distintos productos biologicamente activos. Esta variante permite la coexpresion de diferentes productos en las celulas oculares.

La composicion farmaceutica de la invencion tambien puede comprender un portador, excipiente o diluyente compatible o fisiologicamente aceptable.

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El termino "farmaceuticamente" o "farmaceuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reaccion adversa, alergica u otra inconveniente cuando se administran a un mamifero, especialmente un ser humano, segun sea apropiado. Un portador o excipiente farmaceuticamente aceptable se refiere a un material o encapsulante, diluyente, de carga, solido, semisolido o liquido, atoxico, o un auxiliar de formulacion de cualquier tipo.

Un portador, excipiente o diluyente farmaceuticamente compatible o fisiologicamente aceptable incluye diluyentes y cargas que son farmaceuticamente aceptables para los metodos de la invencion, son esteriles y se pueden seleccionar de solucion salina tamponada isotonica de neutra a ligeramente acida (que incluye fosfatos, cloruro, etc.), soluciones o suspensiones acuosas u oleaginosas y mas preferiblemente de sacarosa, trehalosa, tensioactivos, proteinas y aminoacidos. El portador, excipiente o diluyente farmaceuticamente compatible o fisiologicamente aceptable se formula preferiblemente usando agentes dispersantes, humectantes, de suspension, calmantes, isotonicos o promotores de la viscosidad adecuados, estabilizantes, conservantes y tampones apropiados para formar una solucion isotonica. El portador farmaceuticamente aceptable particular y la relacion de compuesto activo a portador estan determinados por la solubilidad y las propiedades quimicas de la composicion, el modo particular de administracion y la practica farmaceutica estandar. Los expertos en la especialidad entenderan como formular estos vehiculos mediante tecnicas conocidas.

Un ejemplo de estabilizantes es el edetato disodico o similares. Ejemplos de agentes isotonicos son glicerina, propilenglicol, polietilenglicol, cloruro sodico, cloruro potasico, sorbitol y manitol o similares. Ejemplos de tampones son acido citrico, hidrogenofosfato sodico, acido acetico glacial y trometamol o similares. Ejemplos de ajustadores del pH son acido clorhidrico, acido citrico, acido fosforico, acido acetico, hidroxido sodico, carbonato sodico e hidrogenocarbonato sodico o similares. Un ejemplo de agentes calmantes es el alcohol bencilico o similares. Ejemplos de conservantes son cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, esteres de p-hidroxibenzoato, benzoato sodico y clorobutanol o similares.

Puede ser deseable una viscosidad mayor que la de las soluciones acuosas simples para incrementar la absorcion ocular del compuesto activo, para disminuir la variabilidad al distribuir las formulaciones, para disminuir la separacion fisica de los componentes de una suspension o emulsion de la formulacion y/o para mejorar de otro modo la formulacion oftalmica. Estos agentes promotores de la viscosidad incluyen, por ejemplo, poli(alcohol vinilico), polivinilpirrolidona, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa u otros agentes conocidos por los expertos en la especialidad. Estos agentes se emplean tipicamente a un nivel de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 2% en peso.

Las formas de preparacion de la composicion farmaceutica destinadas a la administracion al espacio supracoroideo son preferiblemente preparaciones liquidas. Las preparaciones liquidas se pueden preparar, por ejemplo, al disolver el agente biologicamente activo en BSS (solucion salina equilibrada), una solucion de glicerina, una solucion de acido hialuronico y similares. Una composicion particular comprende por ejemplo BBS (60%) y acido hialuronico (40%). Un estabilizante, un agente isotonico, un tampon, un ajustador del pH, un agente calmante, un conservante, electrolitos, tales como sodio, potasio, calcio, magnesio y/o cloruro o similares, se pueden anadir opcionalmente en una cantidad adecuada a las preparaciones liquidas.

La composicion farmaceutica puede comprender o el agente biologicamente activo se puede combinar (en un uso segun la presente invencion) con un ingrediente activo o adyuvante adicional. El adyuvante se puede seleccionar de cualquier sustancia, mezcla, soluto o composicion que facilite o incremente la actividad biologica del agente profilactico o terapeutico tal como cualquier agente biologico, sintetico o biosintetico que mejore el suministro o la transferencia de dicho agente y se pueda asimilar a un vector (como portador de suministro) segun la invencion. El adyuvante se puede acondicionar y administrar separadamente o secuencialmente con respecto a la composicion que contiene agente profilactico o terapeutico y/o en un punto de inyeccion distinto. El tratamiento con multiples agentes y/o adyuvantes segun la invencion no necesita realizarse usando una mezcla de agentes y/o adyuvantes sino que se puede realizar usando preparaciones farmaceuticas separadas. Las preparaciones no necesitan suministrarse exactamente al mismo tiempo, sino que se pueden coordinar para ser suministradas a un paciente durante el mismo periodo de tratamiento, es decir, dentro de una semana o un mes entre si

Cualesquiera agentes terapeuticos adecuados se pueden coordinar con las composiciones de la presente invencion. Ejemplos no limitativos de agentes terapeuticos que se pueden administrar ademas del agente o los agentes biologicamente activos (profilacticos o terapeuticos) anteriores a traves de un metodo segun la presente invencion tambien incluyen agentes permeabilizantes tales como un virus, una vesicula lipidica, acido hialuronico, iones positivos basados en lipidos, emulsiones policationicas, peptidos cationicos, Polyplex, etc.; antibioticos y agentes antimicrobianos tales como hidrocloruro de tetraciclina, leucomicina, penicilina, derivados de penicilina, eritromicina, sulfatiazol y nitrofurazona; anestesicos locales tales como benzocaina; vasoconstrictores tales como hidrocloruro de fenilefrina, hidrocloruro de tetrahidrozolina, nitrato de nafazolina, hidrocloruro de oximetazolina e hidrocloruro de tramazolina; cardiotonicos tales como digitalicos y digoxina; vasodilatadores tales como nitroglicerina e hidrocloruro de papaverina; antisepticos tales como hidrocloruro de clorhexidina, hexilresorcinol, cloruro de decualinio y etacridina; enzimas tales como cloruro de lisozima y dextranasa; hipotensores; sedantes; agentes antitumorales; agentes antiinflamatorios esteroideos tales como hidrocortisona, prednisona, fluticasona, prednisolona, acetonido de

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triamcinolona, dexametasona, betametasona, beclometasona y dipropionato de beclometasona; agentes antiinflamatorios no esteroideos tales como acetaminofeno, aspirina, aminopirina, fenilbutazona, acido mefanamico, ibuprofeno, diclofenaco sodico, indometacina, colchicina y probenecid; agentes antiinflamatorios enzimaticos tales como quimotripsina y bromelaina seratiopeptidasa; agentes antihistaminicos tales como hidrocloruro de difenhidramina, maleato de clorofeniramina y clemastina; agentes antialergicos; y compuestos analgesicos.

Los niveles de dosificacion reales de ingredientes activos en las composiciones de la presente invencion se pueden adaptar a fin de obtener una cantidad de ingrediente activo que sea eficaz para obtener una actividad biologica deseada. Sin embargo, se debe entender que el nivel de dosis especifico para cualquier paciente particular dependera de una variedad de factores incluyendo el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el momento, las velocidades de absorcion y excrecion, la combinacion con otros farmacos y la gravedad de la enfermedad particular que se trate.

Los medios para inyectar la composicion farmaceutica en el espacio supracoroideo pueden ser una aguja de inyeccion o preferiblemente un cateter o una microcanula flexibles. Metodos para inyectar una inyeccion farmaceutica en el espacio supracoroideo son muy conocidos en la especialidad (p. ej. Einmahl S. Invest Ophtamol Vis Sci 2001 42:695: Galimova VU. Vestn Oftalmo 2001 117:20; Olsen TW Am J. Ophtalmol 2006 142:777). Dispositivos para inyectar una composicion farmaceutica en el espacio supracoroideo tambien son muy conocidos en la especialidad (p. ej. Olsen TW Am J. Ophtalmol 2006 142:777, documentos US 2010173866, WO 2007100745 y WO 2011053512).

La exposicion a un campo electrico de la region en la que se suministraba la composicion farmaceutica se puede realizar a traves de una electroporacion extraocular. En efecto, la electroporacion es adecuada para, o incrementa, la permeabilidad de una membrana celular y/o al menos una porcion de un tejido elegido como diana adyacente al espacio supracoroideo a un agente biologicamente activo tal como un acido nucleico. Ademas, se usa un breve impulso electrico con una fuerza de campo dada para permitir el transporte o la migracion de agentes a traves del tejido a o traves de las membranas celulares hacia el interior de las celulas, mediante un efecto electroforetico. La tecnica de electroporacion es muy conocida por los expertos normales en la espacialidad. Sin embargo, hasta ahora, la electroporacion fallaba en la transfeccion de celulas fotorreceptoras adultas cuando los plasmidos se inyectaban bien en la cavidad ocular o bien en el espacio subretiniano.

En una realizacion particular, se aplica un campo electrico constituido por uno o mas impulsos electricos.

La intensidad de campo esta entre 15 voltios y 70 voltios.

La duracion total de aplicacion del campo electrico puede estar entre 0,01 milisegundos y 1 segundo, preferiblemente entre 0,01 y 500 milisegundos, mas preferiblemente entre 1 y 500 milisegundos, aun mas preferiblemente mayor de 1 o 10 milisegundos. En una realizacion preferida, la duracion total de aplicacion del campo electrico esta entre 10 milisegundos y 100 milisegundos y es preferiblemente de 20 milisegundos.

Los impulsos electricos aplicados pueden estar entre, por ejemplo, 1 y 100.000. Su frecuencia puede estar comprendida entre 0,1 y 1000 hertzios. Preferiblemente, es una frecuencia regular.

Los impulsos electricos tambien se pueden suministrar de un modo irregular unos con relacion a otros, siendo preferiblemente variable la funcion que describe la intensidad del campo electrico como una funcion del tiempo para un impulso.

Los impulsos electricos pueden ser impulsos de onda unipolar o bipolar. Se pueden seleccionar, por ejemplo, de impulsos de onda cuadrada, impulsos de onda que disminuye exponencialmente, impulsos de onda unipolar oscilante de duracion limitada, impulsos de onda bipolar oscilante de duracion limitada u otras formas de onda. Preferentemente, los impulsos electricos comprenden impulsos de onda cuadrada o impulsos de onda bipolar oscilante.

En la presente invencion, cuando se elige como diana la coroides, el campo electrico se aplica al usar dos electrodos, introduciendose uno de dichos electrodos en el espacio supracoroideo y el otro se aplica sobre la superficie de la esclerotica en la cara opuesta a la que se realizaba la inyeccion supracoroidea.

Alternativamente, cuando se elige como diana la retina, son posibles dos realizaciones. En una primera realizacion, el campo electrico se aplica al usar dos electrodos, introduciendose uno de dichos electrodos en el espacio supracoroideo y el otro se aplica sobre la superficie del ojo en la cara opuesta a la que se realizaba la inyeccion supracoroidea. En una segunda realizacion, el campo electrico se aplica al usar dos electrodos, uno de dichos electrodos se aplica sobre la superficie de la esclerotica adyacente a la region en la que se realizaba la inyeccion supracoroidea y el otro se aplica sobre la superficie del ojo (p. ej., esclerotica o conjuntiva) en la cara opuesta a la que se realizaba la inyeccion supracoroidea.

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Los electrodos se eligen preferiblemente de un electrodo de tipo alambre y un electrodo de tipo contacto de placa, adaptandose opcionalmente cada tipo de electrodo para ser aplicado reversiblemente sobre la superficie del ojo. Preferiblemente, el electrodo de tipo contacto de placa esta curvado.

En una realizacion particular, el electrodo de contacto de placa esta hecho de un material rigido y de una forma curvada adaptada a la geometria de la superficie de la esclerotica o el ojo (p. ej. conjuntiva). Los electrodos estan hechos ventajosamente de un metal no oxidativo conductor seleccionado por ejemplo de iridio o platino.

Tipicamente, el campo electrico se aplica por medio de dispositivos como los descritos en el ejemplo.

La composicion farmaceutica de la presente invencion es particularmente adecuada para el tratamiento de enfermedades oculares que afectan a la region posterior del ojo, y mas particularmente enfermedades oculares que afectan a la coroides, la retina o la neurorretina. Ejemplos no limitativos de enfermedades oculares que se pueden tratar mediante el metodo de la presente invencion incluyen enfermedades oculares que afectan a la macula tales como degeneracion macular (humeda y seca) asociada a la edad o degeneracion macular hereditaria, edema macular de cualquier origen (degeneracion macular asociada a la edad, diabetes, inflamacion, degeneracion, coriorretinitis serosa central o epiteliopatia difusa....), distrofias retinianas hereditarias, tales como amaurosis congenita de Leber, retinitis pigmentaria, distrofias de los conos y los bastones, maculopatia viteliforme de Best, inflamacion intraocular tal como retinitis, coriorretinitis, coroiditis, retinopatia isquemica (en particular retinopatia de la prematuridad y retinopatia diabetica), enfermedades vascular retinianas, sindrome de isquemia ocular y otras anomalias vasculares, trastornos y tumores coroideos, trastornos del humor vitreo, proliferacion glial tal como vitreorretinoparia proliferativa y proliferacion glial asociada a angiogenesis prerretiniana diabetica, retinopatia diabetica isquemica o proliferativa.

Las distrofias retinianas hereditarias o la retinitis pigmentaria son enfermedades que provocan ceguera debidas a mutaciones o eliminaciones en genes implicados en el ciclo visual. Comienzan en la juventud y progresan lentamente hasta la ceguera total. La perdida de fotorreceptores se asocia con la perdida de celulas pigmentarias retinianas y con atrofia vascular y del nervio optico en las fases tardias. Algunas de estas degeneraciones hereditarias se deben a una mutacion en el ADN mitocondrial. En particular, ejemplos no limitativos de enfermedades degenerativas retinianas incluyen, pero no se limitan a retinitis pigmentaria (RP), amaurosis congenita de Leber (LCA), RP recesiva, retinitis pigmentaria dominante, retinitis pigmentaria ligada al cromosoma X, retinitis pigmentaria ligada al cromosoma X incompleta, dominante, amaurosis congenita de Leber dominante, ataxia recesiva, columna posterior con retinitis pigmentaria, retinitis pigmentaria recesiva con conservacion paraarteriolar de RPE, retinitis pigmentaria RP12, sindrome de Usher, retinitis pigmentaria dominante con sordera sensorineural, retinitis punteada albescente recesiva, sindrome de Alstrom recesivo, sindrome de Bardet-Biedl recesivo, ataxia espinocerebelar dominante con distrofia macular o degeneracion retiniana, abetalipoproteinemia recesiva, retinitis pigmentaria recesiva con degeneracion macular, enfermedad de Refsum recesiva, forma adulta, enfermedad de Refsum recesiva, forma infantil, sindrome de conos en S potenciado recesivo, retinitis pigmentaria con retardo mental, retinitis pigmentaria con miopatia, distrofia de bastones-conos de Newfoundland recesiva, retinitis pigmentaria sin pigmento, retinitis pigmentaria sectorial, retinitis pigmentaria regional, sindrome de Senior-Loken, sindrome de Joubert, enfermedad de Stargardt, juvenil, enfermedad de Stargardt de inicio tardio, distrofia macular dominante, tipo Stargardt, distrofia macular similar a Stargardt dominante, distrofia macular recesiva, fondo flavimaculado recesivo, distrofia de conos-bastones recesiva, distrofia de conos-bastones progresiva ligada al cromosoma X, distrofia de conos-bastones dominante, distrofia de conos-bastones; sindrome de de Grouchy, distrofia de los conos dominante, distrofia de los conos ligada al cromosoma X, distrofia de los conos recesiva, distrofia de los conos recesiva con electrorretinograma de bastones supernormal, distrofia macular atrofica ligada al cromosoma X, retinosquisis ligada al cromosoma X, distrofia macular dominante, drusas maculares radiales dominantes, distrofia macular dominante, herpes iris, distrofia macular dominante, forma de mariposa, distrofia macular viteliforme dominante del adulto, distrofia macular dominante, tipo Carolina del norte, distrofia de los conos retinianos dominante 1, distrofia macular dominante, cistoide, distrofia macular dominante, viteliforme atipica, atrofia foveomacular, distrofia macular dominante, tipo Best, distrofia macular dominante, similar a la de Carolina del norte con distrofia macular recesiva progresiva, juvenil con hipotricosis, hipoplasia foveal recesiva y disgenesis del segmento anterior, adaptacion de los conos retardada recesiva, distrofia macular en monocromatismo de conos azules, distrofia de patron macular con diabetes tipo II y sordera, retina moteada de Kandori, distrofia en patron, sindrome de Stickler dominante, sindrome de Marshall dominante, degeneracion vitreorretiniana dominante, vitreorretinopatia exudativa familiar dominante, vitreorretinocoroidopatia dominante; vitreorretinopatia inflamatoria neovascular dominante, sindrome de Goldmann-Favre, acromatopsia recesiva, tritanopia dominante, monocromatismo de bastones recesivo, deficiencia de rojo-verde congenita, deuteranopia, protanopia, deuteranomalia, protanomalia, enfermedad de Oguchi recesiva, distrofia macular dominante, inicio tardio, atrofia girada recesiva, atrofia greata dominante, distrofia coroidea areolar central dominante, coroideremia ligada al cromosoma X, atrofia coroidea, areolar central, central, peripapilar, atrofia coriorretiniana bifocal progresiva dominante, atrofia coriorretiniana bifocal progresiva, degeneracion retiniana en panal de Doyne dominante (Malattia Leventinese), amelogenesis imperfecta, distrofia corneorretiniana cristalina de Bietti recesiva, retinopatia vascular hereditaria dominante con fenomeno de Raynaud y migrana, enfermedad de Wagner dominante y vitreorretinopatia erosiva, microftalmia recesiva y sindrome de enfermedad retiniana; nanoftalmia recesiva, retardo, espasticidad y degeneracion retiniana recesivos, distrofia de Bothnia recesiva, pseudoxantoma elastico recesivo, pseudoxantoma

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elastico dominante; enfermedad de Batten recesiva (lipofuscinosis ceroidea), juvenil, sindrome de Alagille dominante, sindrome de McKusick-Kaufman, hipoprebetalipoproteinemia, acantocitosis, degeneracion paladial; sindrome de Hallervorden-Spatz recesivo; distrofia de fondo de Sorsby dominante, enfermedad ocular de Oregon, sindrome de Kearns-Sayre, retinitis pigmentaria con anormalidades del desarrollo y neurologicas, sindrome de Basseb Korenzweig, enfermedad de Hurler, enfermedad de Sanfilippo, enfermedad de Scieie, retinopatia asociada a melanoma, distrofia retiniana de Sheen, distrofia macular de Duchenne, distrofia macular de Becker y retinocoroidopatia de Birdshot.

La inflamacion intraocular reagrupa todos los tipos de inflamacion de los tejidos intraoculares, principalmente la uvea y la retina. Las inflamaciones intraoculares pueden provenir de causas inmunologicas, causas infecciosas, causas iatrogenicas o de etiologias desconocidas. Pueden ser agudas, recurrentes o cronicas. Las inflamaciones intraoculares estan entre las causas mas comunes de ceguera curable. Las inflamaciones intraoculares del segmento posterior pueden estar asociadas con vasculitis, neuritis optica, vitritis y coriorretinitis, retinitis, coriditis, neovascularizacion coroidea, neovascularizacion coroidea debida a AMD, a miopia, inflamacion, epitelopatia difusa, ruptura de la membrana de Bruch, vasculopatia coroidea polipoidal, postraumatica...

Existen dos tipos principales de glaucoma: glaucoma cronico o glaucoma primario de angulo abierto (POAG) y glaucoma agudo de angulo cerrado. Otras variaciones incluyen glaucoma congenito, glaucoma pigmentario, glaucoma neovascular y glaucoma secundario. El glaucoma es similar a la hipertension ocular pero con dano al nervio optico y perdida de vision concomitantes. El glaucoma se trata habitualmente con gotas oculares, laser o cirugia ocular convencional. Si no se trata, el glaucoma provocara ceguera.

La angiogenesis es la formacion de nuevos vasos sanguineos capilares que conducen a neovascularizacion. La angiogenesis es un proceso complejo que incluye una serie de etapas secuenciales incluyendo degradacion mediada por celulas endoteliales de la membrana basal vascular y las matrices intersticiales, migracion de celulas endoteliales, proliferacion de celulas endoteliales y formacion de circuitos capilares por celulas endoteliales. Aunque la angiogenesis es un proceso normal para el desarrollo o el mantenimiento de la vasculatura, surgen afecciones patologicas (es decir, enfermedades dependientes de la angiogenesis) cuando el crecimiento de los vasos sanguineos es realmente danino. La angiogenesis esta asociada notablemente con enfermedades importantes del tejido ocular, incluyendo retinopatias diabeticas, degeneracion macular asociada a la edad, retinopatia de la prematuridad, rechazo de injertos corneales, glaucoma neovascular y formacion de cicatrices corneales. Cualquier crecimiento anormal de los vasos sanguineos en el ojo puede dispersar y bloquear la luz incidente antes de alcanzar la retina. La neovascularizacion se puede producir casi en cualquier punto del ojo y alterar significativamente la funcion de los tejidos oculares. Algunas de las enfermedades neovasculares oculares mas amenazadoras son las que implican a la retina. Por ejemplo, muchos pacientes diabeticos desarrollan una retinopatia que se caracteriza por la formacion de nuevos vasos sanguineos exudativos sobre la superficie anterior de la retina y en el humor vitreo que provocan vitreorretinopatia proliferativa. Un subgrupo de pacientes con degeneracion macular asociada a la edad desarrolla neovascularizacion subretiniana que conduce a su ceguera final.

La retinopatia diabetica se produce cuando los vasos retinianos del interior del ojo exudan sangre y fluidos al interior del tejido circundante. Aproximadamente 80% de los pacientes con diabetes desarrollan retinopatia diabetica. Esta enfermedad se trata generalmente usando un laser. Sin embargo, la terapia con laser implica complicaciones incluyendo oclusion de la vena retiniana, perdida de agudeza visual, hemorragia vitrea y a veces insuficiencia. Si se deja sin tratar, la retinopatia diabetica puede provocar ceguera.

La retinopatia de la prematuridad (ROP) afecta a ninos prematuros. Consiste en el crecimiento anormal de vasos sanguineos dentro de la retina y el humor vitreo. La progresion hasta fases tardias de ROP puede conducir a la formacion de tejido cicatrizal sobre la retina, hemorragia vitrea y desprendimiento de retina. El tratamiento se realiza habitualmente bien mediante laser o bien mediante crioterapia (congelacion).

Las retinopatias isquemicas son retinopatias asociadas con oclusion vascular (capilares o vasos grandes) que conducen a enfermedad neurorretiniana, muerte celular y neoangiogenesis. La degeneracion macular es una enfermedad que afecta a la vision central y conduce a perdida de vision. Aunque existen formas de degeneracion macular que atacan a la gente joven, la afeccion se produce lo mas comunmente en personas que tienen mas de 60 anos. Este trastorno se llama asi degeneracion macular asociada a la edad (AMD). Debido a que habitualmente solo se ve afectado el centro de la vision de la persona, raramente se produce ceguera por esta enfermedad. Sin embargo, la lesion a la macula en el centro de la retina puede destruir la capacidad para ver claramente de frente. Las formas secas se asocian a la degeneracion de la neurorretina, las celulas RPE y la coroides. Las formas humedas se asocian a fenomenos previamente descritos y al crecimiento de neovasos a partir de los coriocapilares y/o los vasos retinianos, desprendimiento y hemorragias subretinianos, hemorragias subepiteliales y lagrimas, etc. La degeneracion macular se produce habitualmente despues de los sesenta anos de edad. Aunque su vision central se reduzca, la mayoria de los pacientes retienen algo de vision y nunca se quedan totalmente ciegos.

Un aspecto particular de la invencion es una composicion farmaceutica para el uso para el tratamiento de neovasos intraoculares o edema macular que comprende suministrar al espacio supracoroideo de un sujeto que sufre los

mismos un acido nucleico que codifica un anti-VEGF, un receptor de anti-VEGF o un anti-PLGF, segun se describen anteriormente.

Un aspecto particular adicional de la invencion es una composicion farmaceutica para el uso para el tratamiento o el 5 retardo de la retinitis pigmentaria que comprende suministrar al espacio supracoroideo de un sujeto que sufre la misma un acido nucleico que codifica un factor neurotrofico segun se describe anteriormente.

Otro aspecto particular de la invencion es una composicion farmaceutica para el uso para el tratamiento de la retinopatia diabetica que comprende suministrar al espacio supracoroideo de un sujeto que sufre la misma un acido 10 nucleico que codifica un anti-IRS-1 o IGF-1, segun se describen anteriormente.

Segun las composiciones farmaceuticas de la presente invencion, se preven estuches para prevenir o tratar una enfermedad ocular. Los dispositivos y la composicion farmaceutica segun la presente invencion se pueden proveer conjuntamente en un estuche. Dentro del estuche, los componentes pueden estar envasados o contenidos 15 separadamente. Tambien se pueden suministrar en el estuche otros componentes tales como excipientes, portadores, otros farmacos o adyuvantes, instrucciones para la administracion de la sustancia activa o la composicion y dispositivos de administracion o inyeccion. Las instrucciones pueden estar en forma escrita, de video o de audio, pueden estar contenidas en papel, un medio electronico o incluso como una referencia a otra fuente, tal como un manual internetico o de referencia.

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La invencion se ilustrara adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, no se debe interpretar de ningun modo que estos ejemplos y figuras limiten el alcance de la presente invencion.

Ejemplo:

Material y metodos 25 Animales

Se usaron en la mayoria de los experimentos ratas Lewis albinas hembra de ocho a diez semanas de edad (Elevage Janvier, Le Genest Saint Isle, Francia) y se manejaron segun the ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. Para el seguimiento angiografico con fluoresceina, se usaron ratas Brown-Norway pigmentadas macho de 8-10 semanas (Charles River, L.'Arbresle, Francia). Las ratas fueron anestesiadas mediante 30 una inyeccion intramuscular de ketamina (75 mg/kg) (Virbac, Francia) + largactil (0,5 mg/kg) (Sanofi-Aventis, Francia). Al final de los experimentos, los animales fueron sacrificados mediante inhalacion de dioxido de carbono.

Plasmidos

El plasmido pVAX1 LacZ disponible comercialmente que codifica el gen indicador de p-galactosidasa, bajo el control de un promotor de citomegalovirus (CMV) (6 kpb, 25 nm, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU. de A.) se uso para 35 localizar la expresion genica despues de una inyeccion supracoroidea seguida o no por electrotransferencia. El plasmido pVAX2-sFlt-1 (4,9 kpb), que codifica el receptor 1 de factor de crecimiento endotelial vascular soluble de rata (sFlt-1), se construyo despues del aislamiento y la transcripcion inversa del ARNm de sFlt-1 extraido de placenta de rata seguido por amplificacion y subclonacion del ADNc aguas abajo del promotor de CMVp en el esqueleto de pVAX2. Su secuencia se ha comprobado mediante secuenciacion de ADN y se ha validado en un 40 modelo en ratas de neovascularizacion coroidea despues del suministro a traves de electrotransferencia del musculo ciliar. En este estudio, se uso para evaluar su eficacia a traves del suministro por electrotransferencia supracoroidea en el mismo modelo. Los esqueletos de los plasmidos pVAX1 y pVAX2 no codificantes se usaron como controles negativos. Los plasmidos se amplificaron en bacterias Escherichia coli y se prepararon libres de endotoxinas (EndoFree Plamid Kit; Qiagen, Courtaboeuf, Francia). Los plasmidos se diluyeron en agua libre de endotoxinas (EF) 45 que contenia 77 mM de NaCl (solucion semisalina) (solucion salina, NaCl 0,9%, Versol", Laboratoire Aguettant, Lyon, Francia) segun se describe previamente [24]. La concentracion de ADN se determino mediante medidas espectroscopicas (densidad optica a 260 nm).

Inyeccion de ADN en el espacio supracoroideo

Se inyectaron ADN plasmidico (30 gg), vehiculo (solucion semisalina) o solucion de hemalumbre de Mayer en el 50 espacio supracoroideo usando una aguja desechable de 30 G curvada (Micro-Fine + jeringa Demi, 0,30 x 8 mm, BD Biosciences, Le Pont de Claix, Francia) y bajo un volumen de treinta microlitros (a menos que se indique otra cosa). La inyeccion se realizo en el hemisferio temporal del ojo a 1 mm posterior al limbo. Despues de perforar la esclerotica, la aguja se podia visualizar facilmente en el espacio supracoroideo. La inyeccion se realizo lentamente para inducir progresivamente la apertura de este espacio virtual.

Electrotransferencia al espacio supracoroideo

Inmediatamente despues de la inyeccion de ADN plasmidico en el espacio supracoroideo, la zona inoculada se sometio a un campo electrico usando el dispositivo presentado como Dispositivo 2. Una hoja de contacto curvada de platino/iridio (anodo, +) se unio a la esclerotica, justo por encima de la zona inyectada. Una hoja semianular de 5 platino/iridio (catodo, -) se puso sobre la esclerotica, frente al anodo en la cara opuesta del ojo. Todos los electrodos se elaboraban en las propias instalaciones a partir de laminas de platino adquiridas de Good Fellow (Lille, Francia). La electrotransferencia se realizo al aplicar 8 impulsos electricos de onda cuadrada (20 V de voltaje, 20 ms de duracion, 5 Hz de frecuencia) generadas por el electropulsador 830 BTX (Genetronics, san Diego, CA). Este procedimiento estandar (dispositivo y parametros electricos) se uso en la mayoria de los experimentos, excepto los 10 disenados para evaluar otros dispositivos electricos u otros parametros electricos (vease la seccion de Resultados para los detalles).

Examenes de los fondos de ojo

Inmediatamente despues de la inyeccion supracoroidea, se examinaron los fondos de ojo bajo un microscopio quirurgico, usando un cubreobjetos aplicado sobre la superficie corneal, para evaluar el emplazamiento exacto de la 15 inyeccion y para asegurar que no se ha presentado ninguna zona de desprendimiento de retina. Se tomaron fotografias usando una camara digital (Coolpix, Nikon, Fnac, Paris, Francia). Se realizo angiografia con fluoresceina sobre ratas pigmentadas anestesiadas 3 dias despues del tratamiento, antes de la induccion de la neovascularizacion coroidea (vease la seccion "Aplicacion terapeutica"). Con este proposito, las pupilas se dilataron con tropicamida al 1% y se administro venosamente fluoresceina (0,2 ml de fluoresceina al 10% en solucion salina). 20 Se establecieron angiogramas en la zona temporal tratada y en la cabeza del nervio optico usando un oftalmoscopio laser de barrido confocal (cSLO) (HRA, Heidelberg Engineering, Dossenheim, Alemania) [32].

Analisis histologico del desprendimiento supracoroideo

De dos a cinco minutos despues de la inyeccion supracoroidea de solucion de hemalumbre de Mayer, los ojos se enuclearon y se fijaron con una mezcla de paraformaldehido al 4% y glutaraldehido al 0,5% en solucion salina 25 tamponada con fosfato (PBS) durante 2 horas a temperatura ambiente. Se enjuagaron durante 2 horas en PBS, se deshidrataron a temperatura ambiente con concentraciones crecientes de etanol antes de incubarse durante la noche a 4°C con solucion de infiltracion proporcionada en estuche Leica Historesin Embedding. Las muestras se embebieron en resina (Leica) y se realizaron secciones histologicas de 5 pm de grosor a lo largo del plano nasotemporal del ojo usando un microtomo (Leica). Las secciones se pegaron sobre portaobjetos revestidos con 30 gelatina, se tineron durante 2 min con solucion de azul de toluidina al 1% y se observaron mediante microscopia optica bajo un microscopio optico Aristoplan (Leica, Rueil-Malmaison, Francia) acoplado con una camara Leica DFC480.

Visualizacion de la actividad de p-galactosidasa

Para localizar la expresion del gen de p-galactosidasa en tejidos oculares, los ojos se enuclearon 7 dias, 14 dias, 1 35 mes o 4,5 meses despues de la electrotransferencia supracoroidea del pVAX1 LacZ. El esqueleto de pVAX1 se uso como control. Se realizo una incision en el limbo de los ojos recientemente enucleados y se fijaron durante 1 h a 4°C en PBS que contenia paraformaldehido al 2% y glutaraldehido al 0,2%. Se enjuagaron tres veces en PBS antes de incubarse durante la noche a temperatura ambiente con 1 mg/ml de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil- galactopiranosido; Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Francia) en PBS que contenia 5 mM de K3Fe(CN)6, 5 mM 40 de K4Fe(CN)6, 2 mM de MgCl2 y 0,02% de NP40, segun se detalla previamente [33]. Despues de lavar con PBS, se realizo una toma de imagen desde el exterior de los ojos usando una camara digital (Coolpix, Nikon, Fnac, Paris, Francia).

A continuacion, se llevaron a cabo analisis sobre secciones histologicas y preparaciones planas. Para los analisis 45 histologicos, los globos oculares se deshidrataron a temperatura ambiente con concentraciones crecientes de etanol antes de embeberse en parafina. Las secciones nasotemporales (10 pm de grosor) realizadas en las zonas de color azul que expresan el gen indicador de p-galactosidasa se tineron por contraste con hematoxilina-eosina y se observaron mediante microscopia optica bajo un microscopio optico Aristoplan (Leica, Rueil-Malmaison, Francia) acoplado con una camara Leica DFC480.

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Para los analisis de preparaciones planas, los ojos se disecaron cuidadosamente mediante seccion transversal a 1 mm desde el limbo. Los segmentos anteriores se descartaron y las neurorretinas se separaron cuidadosamente de los complejos de RPE-coroides-esclerotica restantes. Las neurorretinas y los complejos RPE-coroides-esclerotica se prepararon en plano separadamente en PBS/glicerol (1/1, v/v) y se observaron bajo un microscopio optico usando 55 una camara digital (Coolpix, Nikon, Fnac, Paris, Francia).

Electrorretinografia (ERG)

Para los registros ERG de campo completo, las ratas fueron anestesiadas mediante inyeccion intramuscular (0,8-1,2 ml/kg) de una solucion que contiene ketamina (40 mg/ml) y xilacina (4 mg/ml, Rompun). Los animales se adaptaron a la luz durante 10 minutos con una luz de fondo de 25 cdm2 cd#s/m2. La cornea se desensibilizo con una gota de 5 Novesine (Novartis Ophthalmics) y las pupilas se dilataron con una gota de Tropicamide (Novartis Ophthalmics). Electrodos anulares de alambre de oro colocados sobre las corneas de ambos ojos y electrodos insertados en la frente servian como electrodos de trabajo y electrodos de referencia, respectivamente. Un electrodo de aguja de acero inoxidable se inserto en la cola de los animales para la puesta a tierra. Todas las manipulaciones se realizaron bajo luz roja tenue. Las medidas se realizaron usando el dispositivo comercial VisioSystem (Siem Biomedicale).

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A continuacion, se aplicaron flashes luminosos, siendo la intensidad de luz del flash 10 cd.s/m2. Se promediaron cinco registros con un intervalo entre estimulos de 10 segundos. Las amplitudes de ondas a y una onda b se midieron (en pV) y los datos obtenidos de cada ojo perteneciente al mismo grupo experimental se promediaron.

Aplicacion terapeutica

15 Se indujo neovascularizacion coroidea mediante fotocoagulacion laser en ojos de control no tratados de Brown Norway o en ojos tratados tres dias antes mediante la electrotransferencia supracoroidea temporal de 30 pg de pVAX2 o pVAX2-sFlt-1. Se uso en todas partes un laser de argon de 532 nm (Viridis 532 nm, Quantel Medical, Clermont-Ferrand, Francia) montado sobre una lampara de ranura (Hagg-Streitt, BQ 900). Un cubreobjetos de vidrio cumplia el papel de una lente de contacto durante el suministro del laser. Se realizaron ocho punteos laser (tamano 20 del punto 100 pm, 0,1 s de duracion y 175 mW de potencia) por ojo, con 4 lesiones en la retina temporal y 4 lesiones en la retina nasal. La burbuja reactiva observada en la superficie retiniana despues del suministro de laser se consideraba una evidencia del enfoque apropiado y como una indicacion de la ruptura de la membrana de Bruch.

Los ojos se enuclearon 15 dias despues de la induccion de CNV y se fijaron inmediatamente durante 15 min con solucion al 4% de paraformaldehido (PAF) en PBS. Despues de lavar en PBS, los complejos RPE-coroides- 25 esclerotica se separaron cuidadosamente de las neurorretinas y se posfijaron con metanol al 100% durante 15 min a

-20°C. Los tejidos se rehidrataron en PBS que contenia Triton X-100 al 1% y se incubaron durante la noche con lectina de Bandeiraea simplicifolia conjugada a isotiocianato de fluoresceina (Lectin, FITC labeled, from Bandeiraea simplicifolia, BS-I, Ref. L9381, Sigma Aldrich). Despues de lavar en PBS, los tejidos se prepararon en plano usando una preparacion de gel (Biomeda Corp., VWR, Fontenay-sous-Bois, Francia) y se observaron mediante microscopia 30 fluorescente usando un microscopio Olympus BX51. Se tomaron fotografias usando los mismos tiempos de

exposicion y ajustes de contraste. Las zonas de CNV (en pm2) se determinaron mediante fluorescencia de FITC- lectina y se midieron al remarcar los margenes de la zona marcada en imagenes de preparaciones planas usando el software ImageJ. Las medidas de la zona neovascular obtenidas de multiples lesiones se promediaron en un solo valor para cada ojo.

35 Analisis estadistico

Para cada experimento, se escribio el numero de ojos tratados por afeccion en la leyenda de las figuras. Para los datos numericos, los resultados se expresaron como medias ± error estandar de la media (SEM) y se compararon usando la prueba de la U de Mann-Whitney no parametrica (Prism 4.0, Graph Pad Software Inc., San Diego, CA). p<0,05 se consideraba significativa.

40 Resultados

Inyeccion supracoroidea

Para validar las inyecciones en el espacio supracoroideo, es decir, entre la esclerotica y la coroides subyacente, el procedimiento se verifico en primer lugar in vivo usando solucion de hemalumbre de Mayer. La difusion del colorante en el espacio supracoroideo durante la inyeccion se podia visualizar en tiempo real desde la cara externa de ojos de 45 ratas albinas. Cuando la aguja de inyeccion se retiraba despues de que se finalizara la inyeccion, una zona circular coloreada correspondiente a la zona putativa del bolsillo supracoroideo se podia observar desde el exterior del ojo. No se podia apreciar en el fondo de ojo una ampolla subretiniana, correspondiente a un desprendimiento entre segmentos externos (OS) del fotorreceptor y celulas epiteliales pigmentarias retinianas (RPE), situandose el colorante mas profundamente en el espacio supracoroideo. Para confirmar estas observaciones macroscopicas, se 50 realizaron secciones histologicas en ojos fijados unos pocos minutos despues de la inyeccion. Podria destacarse un desprendimiento entre la coroides y la esclerotica, manteniendo toda la retina neural adherida a las celulas epiteliales pigmentarias retinianas (RPE) que todavia estaban adheridas a la membrana de Bruch y el coriocapilar/la coroides. El desprendimiento se extendia sobre la parte anterior media del hemisferio temporal. Era grande y completo en la parte anterior, proxima al punto de insercion de la aguja, y disminuia progresivamente con

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posterioridad, con uniones focales aparentes entre la coroides y la esclerotica. Observaciones realizadas posteriormente al desprendimiento supracoroideo mostraban que la coroides estaba en estrecho contacto con la esclerotica, segun se observaba en ojos de control no tratados. No se podia apreciar hemorragia en ninguno de los ojos (n=5). En todos los experimentos siguientes, el examen del fondo de ojo se realizo despues de la inyeccion para excluir del analisis ojos con burbuja de desprendimiento de retina. Solo dos ojos de entre todos los ojos tratados se excluyeron del analisis debido a una inyeccion subretiniana accidental. Notese que no se apreciaron sangrado o hemorragias durante o inmediatamente despues de la cirugia, ni 7 dias despues de la inyeccion sola. Se observo una actividad de p-galactosidasa muy debil o nula 7 dias despues de la inyeccion supracoroidea simple de ADN del plasmido pVAXI-LacZy no se encontro coloracion azul con el esqueleto del plasmido pVAXI, demostrando que se producia una transfeccion nula o muy pobre con la inyeccion sola.

Dispositivos electricos para la electrotransferencia supracoroidea (ET)

Inmediatamente despues de la inyeccion del plasmido (30 pg en 30 pl de pVAX1-LacZ) en el espacio supracoroideo, la zona inyectada se sometio a un campo electrico (procedimiento de electrotransferencia), creado por la aplicacion de una conformacion y una colocacion diferentes de los electrodos. El campo electrico se creo usando 8 impulsos de una intensidad de voltaje de 20 V y una duracion de 20 ms, con una frecuencia de 5 Hz. En comparacion con la inyeccion sola, la expresion del gen de p-galactosidasa se potenciaba significativamente mediante ET con todos los electrodos probados. Sin embargo, cada dispositivo exhibia una eficacia de transfeccion diferente. En experimentos preliminares, el dispositivo usado era el que se ha desarrollado en el laboratorio de los presentes inventores para transducir fibras del musculo ciliar ocular in vivo mediante ET [24], con algunas adaptaciones relativas a la colocacion de ambos electrodos. Un alambre de platino/iridio (Pt/Ir) (250 pm de diametro, polo negativo) se inserto en el espacio supracoroideo, despues de que se retirara la aguja de inyeccion, frente a una lamina semianular de Pt/Ir (anodo) unida a la esclerotica en la cara opuesta del punto de inyeccion. En estas condiciones, la zona de tejido que expresa p-galactosidasa observada desde el exterior del ojo aparecia como una linea correspondiente al punto en el que se ha insertado el electrodo de alambre. Para ampliar la captacion celular y la expresion de ADN plasmidico, los presentes inventores decidieron usar electrodos mas grandes y situarlos externamente. Cuando se colocaba una lamina semianular de Pt/Ir (anodo) sobre la superficie de la esclerotica situada por enzima de la zona inoculada con un electrodo de alambre de Pt/Ir semianular (catodo) situado sobre la superficie de la esclerotica, en la base del polo posterior del ojo (Dispositivo 1), la expresion de p-galactosidasa se localizaba en la parte anterior del segmento posterior, donde se situaba el electrodo laminar. Cuando una lamina de contacto de platino/iridio curvada (anodo, +) se unfa a la esclerotica por encima de la zona inyectada con una lamina de platino/iridio semianular (catodo, -) situada sobre la esclerotica, frente al anodo en la cara opuesta del ojo (Dispositivo 2), la zona de tejido que expresa el gen indicador de p-galactosidasa se ampliaba mucho en comparacion con los otros dos dispositivos. Con este dispositivo, el anodo cubria toda la zona de desprendimiento supracoroideo y el gen indicador se expresaba en casi toda la superficie desprendida, excepto para la pequena zona en la que no se generaba campo electrico y correspondiente al forceps conector de plastico situado sobre la superficie del ojo para mantener el electrodo de contacto curvado. No se podia observar coloracion azul en ojos tratados mediante ET del esqueleto de pVAX1, siempre que se usara el dispositivo electrico. No se apreciaba hemorragia durante la aplicacion del campo o 7 dias despues de la ET.

Parametros electricos optimos para la electrotransferencia supracoroidea

Usando el dispositivo 2, se probaron varios grupos de parametros electricos despues de la inyeccion de 30 pg (en 30 pl) de pVAX1-LacZ en el espacio supracoroideo, que variaban en intensidad de voltaje (V) y duracion de los impulsos (ms). Siete dias despues del tratamiento, la eficacia de transfeccion visualizada por la expresion de p- galactosidasa (coloracion azul) no era diferente en ojos sometidos a ocho impulsos de 7 V (20 ms, 5 Hz) que la obtenida en ojos tratados mediante una inyeccion sola. Por el contrario, la aplicacion de ocho impulsos (20 ms, 5 Hz) con una intensidad de voltaje de 15 V, 30 V y 60 V potenciaba significativamente la expresion de p-galactosidasa en comparacion con ojos tratados mediante inyeccion sola. La eficacia de transfeccion se incrementaba con los voltajes crecientes, obteniendose la mejor eficacia con 30 V. Usando esta condicion, se podia detectar la expresion del gen indicador en casi todo el hemisferio temporal. Los presentes inventores demostraron de otro modo que la actividad del gen indicador era tan, aun mas, eficaz usando un voltaje de 20 V que usando un voltaje de 30 V.

Segun se juzgaba por analisis de secciones histologicas en parafina, la morfologia retiniana se conservaba bien en ojos sometidos a voltajes inferiores o iguales a 30 V en comparacion con ojos de control tratados mediante inyeccion sola. En efecto, las capas retinianas tenian una organizacion y grosores similares en las zonas transfectadas por medio de la aplicacion de un campo electrico a los observados en zonas solamente inyectadas. Sin embargo, la aplicacion de un voltaje de 60 V inducia una notable desorganizacion retiniana de todas las capas retinianas y se puede inducir un incremento en el grosor retiniano por un fenomeno de edema. Notese que no se podia detectar hemorragia 7 dias despues de la aplicacion del campo electrico, fuera cual fuera el voltaje considerado. Asi, la aplicacion de un campo electrico parecia ser segura bajo las condiciones seleccionadas, al menos desde el punto de vista retiniano. Puesto que el voltaje mas bajo coherente con una transferencia genica segura y eficaz era 20 V, se realizaron experimentos adicionales usando este parametro.

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Con respecto a la duracion de los impulsos, la eficacia de transfeccion era significativamente superior usando impulsos de 20 ms que de 10 ms (ambos a 20 V y 30 V, no mostrados), explicando por que se ha elegido esta duracion en experimentos adicionales. En cuanto al volumen de inyeccion, experimentos preliminares han demostrado que se requerian volumenes de 30 gl (o 40 gl) para alcanzar una buena eficacia de transfeccion cuando se combinaban con ET (30 V, 20 ms, 5 Hz) y que no se adaptaban volumenes menores como 20 gl (no mostrado). Usando 30 gl, la zona de desprendimiento supracoroideo era mayor permitiendo que la transfeccion fuera mas amplia y mas reproducible. No se podia observar una diferencia detectable entre todos los volumenes usando inyeccion sola.

Eficacia de la electrotransferencia supracoroidea

La observacion a baja amplificacion de complejos de RPE-coroides-esclerotica y neurorretinas preparados en plano muestra que las celulas y los vasos coroideos se han transfectado tan bien como los tejidos neuronales. Las secciones histologicas confirmaban la actividad de p-galactosidasa en celulas coroideas incluyendo vasos coroideos, pero tambien mostraban actividad en celulas RPE y en segmentos externos e internos de fotorreceptores. Una amplificacion mayor confirma la transfeccion de vasos coroideos, la transfeccion regular de celulas RPE y la actividad de p-galactosidasa en segmentos externos y en un menor grado internos de los fotorreceptores. Usando analisis por contraste de fases de secciones no tenidas, se detectaba mejor la coloracion azul resultante de la actividad de p-galactosidasa en celulas coroideas incluyendo vasos coroideos, en celulas RPE y a una amplificacion superior alrededor de los nucleos de los fotorreceptores y en los segmentos internos, sugiriendo que los fotorreceptores se transfectaban.

Duracion de la expresion transgenica

La actividad de p-galactosidasa era maxima el dia 7 (primer momento probado) cuando se detectaba transfeccion en toda la zona correspondiente a la zona de desprendimiento supracoroideo. A continuacion, la expresion genica disminuia a lo largo del tiempo desde el dia 7 hasta 4,5 meses, tanto en el nivel de intensidad como en el grado. En comparacion con las observaciones realizadas el dia 7, la tincion era menos uniforme el dia 14, aunque todavia era fuerte. Un mes despues de la electrotransferencia, la actividad de p-galactosidasa era debil con la mayoria de la expresion siguiendo un anillo circular, correspondiente a los bordes de la ampolla de desprendimiento supracoroideo. Despues de 4,5 meses, la expresion del gen indicador todavia era detectable solamente en una zona restringida. No se apreciaron cambios patologicos externamente o en el fondo de ojo durante el periodo de observacion. Usando un promotor de CMV, se alcanzaba una expresion significativa durante al menos un mes y a continuacion disminuia hasta los 4,5 meses.

Seguridad del procedimiento

Para evaluar los posibles cambios inducidos por el procedimiento de inyeccion supracoroidea y electrotransferencia sobre las vasculaturas coroidea y retiniana, se realizaron angiografias de los fondos 3 dias despues del tratamiento con el esqueleto de plasmido. No se podian observar fuga o ventana vasculares en las zonas temporales tratadas en comparacion con la misma zona de ojos de control no tratados, demostrando que el tratamiento mantenia aparentemente la integridad de los vasos y las RPE. Por otra parte, no se podia detectar un vaso exudativo al nivel de la cabeza del nervio optico en ninguno de los grupos, sugiriendo que no habia rotura temprana importante de la barrera hematorretiniana. Para analizar si el procedimiento de inyeccion supracoroidea y electrotransferencia tenia consecuencias funcionales sobre la electrofisiologia retiniana, se registraron ERGs 7 dias despues del tratamiento. En comparacion con ojos de control no tratados, la inyeccion sola de solucion de vehiculo (solucion semisalina) no inducia ninguna modificacion significativa de amplitudes de ondas a y b. Por otra parte, no se podia detectar una diferencia estadistica en las amplitudes de ondas a y b entre ojos sometidos a electrotransferencia despues de la inyeccion de vehiculo y ojos tratados mediante inyeccion sola u ojos de control no tratados. Por otra parte, no se podia apreciar inflamacion intraocular mediante examen clinico en el mismo momento.

Eficacia terapeutica

La eficacia antiangiogenica de la electrotransferencia supracoroidea de un plasmido que codifica el receptor 1 de factor de crecimiento endotelial vascular soluble de rata (sFlt-1) se evaluo en un modelo en ratas de neovascularizacion coroidea (CNV). En ninguno de los grupos se podia apreciar diferencia estadistica en la zona CNV entre las caras temporal y nasal, explicando por que todos los valores medidos por ojo se promediaban en uno solo. Segun se muestra mediante la observacion y la cuantificacion de zonas neovasculares realizada en el pico de la enfermedad, se observa una reduccion significativa mayor de 25% de la zona CNV inducida por laser en ratas tratadas mediante electrotransferencia del plasmido terapeutico (18.500 ± 1430 gm2) en comparacion con ojos de control tratados mediante la electrotransferencia del correspondiente plasmido vacio (25.100 ± 1710 gm2) y con ojos de control no tratados (25.700 ± 1.400 gm2). Por otra parte, no se podia observar exacerbacion de CNV en ojos tratados con pVAX2 en comparacion con ojos de control no tratados.

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Analisis

Los presentes inventores ya han demostrado que la administracion supracoroidea es un procedimiento seguro y reproducible, que permite el deposito de un polfmero de liberacion lenta [25]. Desde entonces, otros grupos han confirmado la viabilidad de esta vfa de administracion y particularmente el grupo de T. Olsen ha desarrollado un elegante cateter supracoroideo equipado con un sistema de iluminacion para seguir la colocacion adecuada del inyector hasta el polo posterior [26]. En el presente estudio, se demostro que esta vfa tambien se puede usar para aportar ADN plasmfdico en la coroides y las celulas retinianas adyacentes y que los plasmidos permanecfan confinados en el espacio suficiente tiempo para permitir su transduccion mediante una aplicacion desde el exterior de una corriente de electrotransferencia. Debido al flujo sangufneo muy alto en la coroides, se podrfan anticipar que los plasmidos en una solucion se habrfan eliminado por lavado en segundos. Sin embargo, la inyeccion adecuada en el espacio supracoroideo crea probablemente un "bolsillo" en el que la solucion de plasmido se atrapa y mantiene una presion sobre celulas RPE durante un tiempo suficiente para permitir la transfeccion. Como el ADN plasmfdico puede alcanzar las celulas RPE a traves de la membrana de Bruch no esta claro ya que se supone que una molecula mayor de 300 KD no la cruza [27]. Sin embargo, se ha mostrado que partfculas lipoprotefnicas de 20-30 nm que se originan a partir de la retina se encontraban en la membrana de Bruch, una partfcula en el intervalo de tamano del plasmido [28]. La observacion mas inesperada era que no solo las celulas RPE sino tambien los fotorreceptores se transfectaban. Se acaban de publicar resultados similares acerca de la administracion supracoroidea de un AAV en el ojo de conejo [29]. Se requieren estudios adicionales para analizar los mecanismos de transporte responsables de la difusion del plasmido desde el espacio supracoroideo hasta las celulas RPE y la neurorretina. De forma interesante, aunque la inyeccion subretiniana de plasmido se efectuara combinada con electroporacion en animales adultos, los fotorreceptores no se transfectaban [22, 23]. Esto se puede relacionar con el diferente campo de corriente que los presentes inventores han creado usando diferentes conformacion y colocacion de los electrodos. Ademas de la inyeccion, el campo electrico es crucial para que se produzca la electroporacion segun se muestra por la ausencia de transfeccion cuando el plasmido se inyectaba sin aplicacion de corriente. Se deben adaptar parametros apropiados para cada tejido para definir los umbrales de eficacia y toxicos. En estos experimentos, se alcanzaba eficacia a 20-30 voltios (aproximadamente 66 y 100 V/cm) y se apreciaba toxicidad cuando la corriente > 200 V/cm. Estos parametros son inferiores que los descritos para celulas del musculo ciliar [24] o el musculo esqueletico [16, 30]. Usando parametros seleccionados, la electrotransferencia era segura en la angiograffa con fluorescefna, la electrorretinograffa y la histologfa, demostrando que se podfa usar incluso en el polo posterior sin problemas de seguridad. Por supuesto, es de extrema importancia si se va a elegir como diana la macula.

En estos experimentos, los presentes inventores no usaron un promotor genico especffico, sino en cambio el promotor de CMV, que se sabe que induce una transfeccion a corto plazo en celulas RPE. Experimentos en marcha estan evaluando la eficacia de un promotor especffico para prolongar la duracion de la expresion segun se publico por otros [22, 23].

En comparacion con la inyeccion supracoroidea de vectores virales recientemente desarrollada, se espera que el uso de ADN plasmfdico y electroporacion sea mas seguro ya que el ADN plasmfdico desnudo no tiene la capacidad de transfectar celulas, aunque se libere en la circulacion sistemica, como ya se demostro en estudios clfnicos usando electrotransferencia de ADN plasmfdico en musculos esqueleticos [31].

La electroporacion supracoroidea de plasmidos se podrfa usar para dirigirse a celulas retinianas asf como celulas coroideas para producir protefnas o peptidos antiangiogenicos in situ para el tratamiento de la neovascularizacion coroidea. Como una demostracion preliminar, los presentes inventores han usado sFlt-1 que inhibfa eficazmente la CNV no solo en la retina temporal tratada sino tambien en la retina nasal no tratada, demostrando que se podrfa producir difusion local. Estan en marcha otros experimentos para evaluar el potencial real de este nuevo metodo para el tratamiento de enfermedades coroideas y retinianas.

Conclusion

Esta es la primera demostracion de que se puede usar un producto seguro para transfectar no solo la coroides, con aplicaciones potenciales para elegir como diana neovasos coroideos, sino tambien celulas RPE y potencialmente fotorreceptores. No solo se usaron vectores no virales, sino que se realizo un procedimiento mfnimamente invasivo evitando el desprendimiento de retina y cualquier colocacion de electrodos intraoculares. Estan en marcha mejoras tecnicas adicionales para disenar un dispositivo desechable simple para tratar especfficamente el polo posterior de ojos de tamano humano.

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REFERENCIAS

A lo largo de esta solicitud, diversas referencias describen el estado de la especialidad de la que trata esta invencion.

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Claims (10)

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   REIVINDICACIONES

   1. Una composicion farmaceutica formulada con un acido nucleico terapeutico de interes insertada en un plasmido para el uso en el tratamiento de una enfermedad ocular en un sujeto, en donde el tratamiento comprende las etapas de i) suministrar dicha composicion farmaceutica al interior del espacio supracoroideo de un ojo enfermo y ii) exponer la region en la que se suministraba la composicion farmaceutica a un campo electrico para la electroporacion,

   y

   estando la intensidad de campo del campo electrico entre 15 voltios y 70 voltios, y en donde el campo electrico se aplica al usar dos electrodos,

   (i) cuando se elige como diana la coroides, introduciendose uno de dichos electrodos en el espacio supracoroideo y aplicandose el otro sobre la superficie de la esclerotica en la cara opuesta a la que se realizaba la inyeccion supracoroidea; o

   (ii) cuando se elige como diana la retina:

   • introduciendose uno de dichos electrodos en el espacio supracoroideo y aplicandose el otro sobre la superficie del ojo en la cara opuesta a la que se realizaba la inyeccion supracoroidea; o

   • aplicandose uno de dichos electrodos sobre la superficie de la esclerotica adyacente a la region en la que se realizaba la inyeccion supracoroidea y aplicandose el otro sobre la superficie del ojo, p. ej. la esclerotica o la conjuntiva, en la cara opuesta a la que se realizaba la inyeccion supracoroidea.
2. 2. Una composicion farmaceutica para en el tratamiento de una enfermedad ocular segun la reivindicacion 1, en donde el acido nucleico de interes codifica un agente biologicamente activo seleccionado de VEGF, angiogenina, angiopoyetina-1, DeM, factores de crecimiento de fibroblastos acidos o basicos (aFGF y bFGF), FGF-2, folistatina, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de dispersion (SF), leptina, midcina, factor de crecimiento placentario (PGF), factor de crecimiento de celulas endoteliales derivado de plaquetas (PD- ECGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB (PDGF-BB), pleiotrofina (PTN), RdCVF (factor de viabilidad de conos derivado de bastones), progranulina, proliferina, factor de crecimiento transformante alfa (TGF-alfa), PEDF, factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de permeabilidad vascular (VPF), CNTF, BDNF, GDNF, PEDF, NT3, BFGF, angiopoyetina, efrina, EPO, NGF, IGF, GMF, aFGF, NT5, Gax, una hormona del crecimiento, [alfa]-1 -antitripsina, calcitonina, leptina, una apolipoproteina, una enzima para la biosintesis de vitaminas, hormonas o neuromediadores, quimiocinas, citocinas tales como IL-1, IL-8, IL-10, IL-12, IL- 13, un receptor de las mismas, un anticuerpo que bloquea uno cualquiera de dichos receptores, TIMP tal como TIMP-1, TiMp-2, TIMP-3, TIMP-4, angioarrestina, endostatina tal como endostatina XVIII y endostatina XV, ATF, angiostatina, una proteina de fusion de endostatina y angiostatina, el dominio de hemopexina C-terminal de metaloproteinasa-2 de matriz, el dominio Kringle 5 e plasminogeno humano, una proteina de fusion de endostatina y el dominio Kringle 5 de plasminogeno humano, el inhibidor de ribonucleasa placentario, el inhibidor del activador del plasminogeno, el factor plaquetario-4 (PF4), un fragmento de prolactina, la proteina relacionada con proliferina (PRP), la antitrombina antiangiogenica III, el inhibidor derivado del cartilago (CDI), un fragmento del complemento CD59, inhibidores de C3a y C5a, inhibidores membranarios de ataque complejos, factor H, ICAM, VCAM, caveolina, PKC zeta, proteinas de union, JAMs, CD36, MERTK vasculostatina, vasostatina (fragmento de calreticulina), trombospondina, fibronectina, en particular el fragmento de fibronectina gro-beta, una heparinasa, gonadotropina corionica humana (hCG), interferon alfa/beta/gamma, proteina inducible por interferon (IP-10), la monocina inducida por interferon-gamma (Mig), la proteina 10 inducible por interferon-alfa (IP10), una proteina de fusion de Mig e IP10, receptor de tirosina cinasa 1 de tipo Fms soluble (FLT-1), receptor del dominio de insercion de cinasa (KDR), reguladores de la apoptosis tales como Bcl-2, Bad, Bak, Bax, Bik, isoforma corta de Bcl-X y Gax, .
3. 3. Una composicion farmaceutica para el uso en el tratamiento de una enfermedad ocular segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicha enfermedad ocular es una enfermedad retiniana.
4. 4. Una composicion farmaceutica para el uso en el tratamiento de una enfermedad ocular segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicha enfermedad ocular se selecciona del grupo que consiste en enfermedades oculares proliferativas, enfermedades oculares neurodegenerativas, glaucoma, enfermedades oculares infecciosas, enfermedades oculares inflamatorias tales como conjuntivitis, queratitis, endotelitis, uveitis, coroiditis, retinitis, retinocoroiditis, uveitis anterior, y neuropatias opticas inflamatorias, degeneraciones retinianas, en particular retinitis pigmentaria, degeneracion retiniana periferica, degeneracion macular tal como degeneracion macular seca asociada a la edad, retinopatia isquemica, en particular retinopatia de la prematuridad y retinopatia diabetica, enfermedades

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   vasculares retinianas, sindrome de isquemia ocular, trastornos y tumores coroideos, trastornos del humor vitreo, proliferacion glial tal como vitreorretinopatia proliferativa y proliferacion glial asociada a angiogenesis prerretiniana diabetica.
5. 5. Una composicion farmaceutica para el uso en el tratamiento de una enfermedad ocular segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el acido nucleico codifica un fragmento soluble del receptor de TNF [alfa], el receptor de TGF [beta]2, de VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, CCR2 o MIP1, o tambien codifica un anticuerpo, un fragmento variable de un anticuerpo monocatenario (ScFv), o codifica un precursor de una cualquiera de estas proteinas terapeuticas.
6. 6. Una composicion farmaceutica para el uso en el tratamiento de una enfermedad ocular segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la composicion farmaceutica comprende agentes promotores de la viscosidad elegidos del grupo que consiste en poli(alcohol vinilico), polivinilpirrolidona, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa.
7. 7. Una composicion farmaceutica para el uso en el tratamiento de una enfermedad ocular segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la duracion total de aplicacion del campo electrico esta entre 0,01 milisegundos y 1 segundo, preferiblemente entre 0,01 y 500 milisegundos, mas preferiblemente entre 1 y 500 milisegundos, ventajosamente entre 10 milisegundos y 100 milisegundos y lo mas preferiblemente 20 milisegundos.
8. 8. Una composicion farmaceutica para el uso en el tratamiento de una enfermedad ocular segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la enfermedad ocular es neovasos intraoculares o edema macular y el metodo comprende suministrar al espacio supracoroideo de un sujeto que sufre la misma una composicion farmaceutica formulada con un acido nucleico terapeutico que codifica un anti-VEGF, un receptor de anti-VEGF o un anti-PLGF.
9. 9. Una composicion farmaceutica para el uso en el tratamiento de una enfermedad ocular segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la enfermedad ocular es retinitis pigmentaria y el metodo comprende suministrar al espacio supracoroideo de un sujeto que sufre la misma una composicion farmaceutica formulada con un acido nucleico terapeutico que codifica un factor neurotrofico.
10. 10. Una composicion farmaceutica para el uso en el tratamiento de una enfermedad ocular segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la enfermedad ocular es retinopatia diabetica y el metodo comprende suministrar al espacio supracoroideo de un sujeto que sufre la misma una composicion farmaceutica formulada con un acido nucleico terapeutico que codifica un anti-IRS-1 o IGF-1.