CN115820735B - 一种Timp4基因缺陷所致的近视大鼠模型及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程和生物医药领域，具体涉及一种Timp4基因缺陷所致的近视大鼠模型及其构建方法与应用，本发明通过敲除大鼠基因组中Timp4基因序列获得近视疾病模型。本发明构建的近视大鼠模型表现出近视疾病的相关特征，包括基因计量依赖性出现视网膜结构的改变和眼组织胶原含量的减少，如视网膜变薄，玻璃体腔延长，视网膜电流图显示b波振幅下降，视网膜形态结构的改变可被形觉剥夺实验放大；巩膜、角膜和视网膜胶原含量下降，巩膜胶原纤维直径减小等特征。因此，本发明构建的Timp4基因缺陷所致的近视大鼠模型，为近视的发病过程、机制及相关预防或治疗药物的筛选提供一种新模型且更具优势。

Description

一种Timp4基因缺陷所致的近视大鼠模型及其构建方法与 应用

技术领域

本发明属于生物工程和生物医药领域，涉及动物模型构建领域，具体涉及一种Timp4基因缺陷所致的近视大鼠模型及其构建方法与应用。

背景技术

近视(Myopia)是全球最常见的视力损害原因，且发病率不断上升，已经成为21世纪重大的公共卫生问题。遗传和环境因素在近视的发生发展中起到重要作用。识别导致近视或和近视相关的基因，能帮助理解近视发生的机理，为近视防控提供重要依据。目前，基于连锁分析已发现了25个近视位点(MYP1-26)，基于高通量测序已发现了17个非综合征性近视的致病基因，基于全基因组关联分析发现了近百个近视的易感位点，但已发现的基因仅能解释部分病例，近视的分子机制仍然不明确，治疗也以对症治疗为主。因此，寻找新的近视致病基因或相关基因，揭示其导致近视的机理和分子作用机制，对于近视防控有重要意义。

迄今为止，多种动物已被用于研究近视的发生发展，其中最常用的是小鸡、树鼩、豚鼠、小鼠模型，其他研究中也有用到恒河猴、大鼠、斑马鱼、兔子等，都需要进过实验诱导才能形成近视模型，诱导方法包括：1.不同波长的光诱导动物出现近视的表型；2.给动物口服药物或者进行玻璃体药物注射；3.进行形觉剥夺实验：引起形觉剥夺性近视(Form-Deprivation Myopia，FDM)，这种方法利用安装在动物眼睛表面的半透明散射镜片，不会改变太多的光照强度，但是会显著降低透过光线的空间对比度，这样的操作在小鸡身上在不到2周的时间内引起了20D的近视；4.透镜离焦实验：引起透镜离焦性近视(Lens-InducedMyopia，LIM)，这种方法是将负性透镜安装在发育中的眼球表面，此时眼球会相对应做出补偿的增长加速，直到中和离散的焦距。但目前的近视模型，小鼠豚鼠或猴子造模时间长(超过20天)，小鸡近视模型时间段(2天)但无法很好的模拟人类真实状态下的近视发生发展过程。

根据已知近视基因，通过生物工程构建动物的近视基因缺陷模型，包括小鼠基因缺陷模型(SCO2、SLC39A5、XYLT、DZIP1、LRPAP1、LOXL3、ARR3基因)和斑马鱼(ZNF644、CPSF1基因)，但遗憾的是都没有自然发展出近视的病理改变。

针对现有近视模型造模时间长且未能模拟人类真实状态下的近视发生发展过程的问题，有必要提供一种新的近视模型。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明旨在于提供一种Timp4基因缺陷所致的近视大鼠模型及其构建方法与应用。

基于上述目的，本发明采用的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种Timp4基因缺陷所致的近视大鼠模型的构建方法，所述近视大鼠模型经Timp4基因敲除构建而成。

通过3～52周的观察，在自然生长状态下，同正常大鼠相比，Timp4基因缺陷大鼠在生长发育期(3～10周)出现了病理近视的眼底改变，包括视网膜较正常大鼠变薄，大鼠的视网膜电流图b波振幅显著降低，上述结果表明Timp4基因敲除后的大鼠在自然状态下能够更好地模拟人类近视的发生发展过程，使得本发明构建的Timp4基因缺陷所致的近视大鼠模型在预防或治疗人类近视的药物筛选中更具优势。

优选地，Timp4基因敲除对象为Timp4基因外显子1～5。

本发明通过将Timp4基因外显子1～5敲除，使得大鼠Timp4基因功能丧失。

优选地，基于CRISPR/Case9基因编辑技术，构建用于Timp4基因的第1～5外显子敲除的gRNA1和gRNA2。

优选地，所述gRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述gRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，通过将含所述gRNA1序列的载体和含gRNA2序列的载体注入大鼠受精卵，并由孕鼠孵育、再经基因型鉴定得到成功敲除大鼠Timp4基因外显子1～5的F0代大鼠；

F0代大鼠繁衍F1代，并通过基因型鉴定子代大鼠中杂合和野生大鼠；

选取F1代中杂合的雌鼠和雄鼠繁育，经基因型鉴定所得纯合和杂合后代大鼠，即为本发明所述Timp4基因缺陷所致的近视大鼠模型。

优选地，基于PCR扩增和Sanger测序进行Timp4基因外显子1-5是否敲除的基因型鉴定，所用的扩增引物如下：

Prime-F:5’-CCCTGAGTAGCTTGTCTCATTCCCAG-3’；

Prime-R:5’-AGAAACCTAACGGAACTGAAGAGAAGTCT-3’；

所述测序引物如下：

5’-GGTCCGTCCTCCTCTGTCACTGT-3’。

优选地，基于PCR扩增和Sanger测序进行纯合和杂合大鼠基因型鉴定，所用的扩增引物如下：

Prime-F:5’-CCCTGAGTAGCTTGTCTCATTCCCAG-3’；

Prime-R:5’-AGAAACCTAACGGAACTGAAGAGAAGTCT-3’；

所用测序引物如下：

Primer-Wt/He-F:5’-GAAGTATCTTATCTGCCTTGCCCTCAG-3’。

第二方面，本发明提供一种由上述方法构建得到的Timp4基因缺陷所致的近视大鼠模型。

经试验发现，本发明构建的Timp4基因缺陷所致的近视大鼠模型在自然状态下，Timp4基因缺陷影响SD大鼠眼球生长发育，出现基因计量依赖性出现视网膜结构的改变和眼组织胶原含量的减少，包括视网膜变薄，玻璃体腔延长，视网膜电流图显示b波振幅下降，视网膜形态结构的改变可被形觉剥夺实验放大；巩膜、角膜和视网膜胶原含量下降，巩膜胶原纤维直径减小。因此，本发明构建的Timp4基因缺陷所致的近视大鼠模型，为近视的发病过程、机制及相关预防或治疗药物的筛选提供一种新模型，并更具优势。

第三方面，本发明提供上述近视大鼠模型在预防或治疗近视药物筛选中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明基于CRISPR/Case9技术基因敲除介导的基因编辑工程，构建了Timp4基因缺陷SD大鼠，并首次证实Timp4基因缺陷SD大鼠在自然状态下，其眼球生长发育受到影响，出现基因计量依赖性的病理近视样改变，并可被性觉剥夺实验放大改变。本发明提供的Timp4基因缺陷所致的近视大鼠能够在自然状态下能够更好地模拟人类近视的发生发展过程，使得本发明构建的Timp4基因缺陷所致的近视大鼠模型在预防或治疗人类近视的药物筛选中更具优势。

附图说明

图1为SD大鼠的Timp4基因的外显子1-5敲除示意图；

图2为含gRNA1序列的质粒图谱；

图3为含gRNA2序列的质粒图谱；

图4为F0代建立者PCR电泳基因分型图；

图5为F1代建立者PCR电泳基因分型图；

图6为Timp4基因敲除大鼠三种基因型PCR电泳分型图；

图7为形觉剥夺大鼠模型示意图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本实施例构建Timp4基因缺陷所致的近视大鼠模型的构建方法，包括如下步骤：

1、SD大鼠的Timp4基因位于大鼠基因组4号染色体(GenBank accession number:NM_001109393.1；Ensembl:ENSRNOG00000007955)。基因敲除对象为SD大鼠Timp4基因的外显子1-5。SD大鼠的Timp4基因的外显子1-5敲除示意图如图1所示。基于CRISPR/Case9基因编辑技术，构建用于Timp4基因的第1～5外显子敲除的gRNA1和gRNA2。

2、将体外转录产生的含gRNA1序列的载体(VB170502-1020vqk，见图2)和含gRNA2序列的载体(VB170502-1021yzm，见图3)注入SD大鼠受精卵，并由孕鼠孵育。其中所用到的gRNA序列如下：

gRNA1(matches reverse strand of gene)：

5’TAGGGCCAATCCCGCCCCCATGG3’(SEQ ID NO.1)；

gRNA2(matches reverse strand of gene)：

5’CTTCCATAGCGCACATCGCAAGG3’(SEQ ID NO.2)；

具体方法如下：

1)受精卵的准备：筛选3-4周SD雌鼠，分别注射孕马血清(PMSG)与绒毛膜促性腺激素(hcg)，两者时间间隔48-50h；注射HCG后将雌鼠与成年的可育雄鼠交配，使雌鼠受精；次日将雌鼠安乐死后，从输卵管内收集受精卵，放置37℃恒温5％的CO₂培养箱内备用。

2)电转受精卵：打开电穿孔仪，连接正负极，设置好电转参数，待用；将准备好的受精卵放入酸式液中进行透明带弱化，10-20S；同时将制备好的含gRNA1序列的质粒载体(VB170502-1020vqk，见图2)和含gRNA2序列的质粒载体(VB170502-1021yzm，见图3)加样到电极皿中；将弱化后的受精卵，清洗3遍，并转移至电极皿中进行电转；电转完毕后的受精卵转移到M16培养基中，并放入37℃恒温5％的CO₂培养箱内，培养0.5-1h后进行移植；或者培养至2cell，待第二天进行移植。

3)代孕鼠制备及胚胎移植：准备假孕母鼠：选取适龄的可育母鼠与输精管结扎后绝育的雄鼠交配，剌激母鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠，作为受精卵转基因后的代孕鼠；将已经注射了外源基因的受精卵移植到见栓当天的代孕母鼠的输卵管内；移植后将代孕母鼠放在干净的笼盒中，并保温待其清醒后放回笼架饲养；输卵管移植成功后，母鼠一般会在手术后21-22d产仔；老鼠出生1周后，可对老鼠进行剪爪编号，同时进行PCR鉴定；老鼠出生3周后，可分笼独立饲养。

4)出生F0大鼠的鉴定：采集1-2周龄的幼鼠组织(尾巴)；对组织进行裂解和提取基因组；用针对目的基因的特异性引物进行PCR扩增及电泳检测，筛选出外源基因整合的后代；有整合的鼠称为首建鼠(founder)，可进行传代和建系，同时有需要可进行蛋白表达水平的鉴定。

3、通过PCR扩增和Sanger测序进行基因型鉴定，挑选成功敲除SD大鼠Timp4基因外显子1-5的F0代大鼠，如图4所示，其中，扩增引物如下，

Prime-F:5’-CCCTGAGTAGCTTGTCTCATTCCCAG-3’(SEQ ID NO.3)；

Prime-R:5’-AGAAACCTAACGGAACTGAAGAGAAGTCT-3’(SEQ ID NO.4)；

扩增产物：WT:6718bp；MT:730bp；缺失片段：5990bp；

测序引物Forward Sequencing：5’-GGTCCGTCCTCCTCTGTCACTGT-3’(SEQ IDNO.5)；

删除区域(Deletion)从5’至3’的序列如SEQ ID NO.6所示。

对步骤2的孕鼠分娩小鼠进行了基因分型，通过上述引物扩增，正常野生型大鼠理论上将产生6718bp片段但实际上该长度超过PCR扩增条件范围无法生成PCR产物；成功敲除目的片段的MT大鼠，由于缺失5990bp理论上将产生728bp大小的片段；大鼠扩增产物在500-750bp之间，且条带单一，即为携带敲除基因型大鼠。对两只大鼠PCR产物进行Sanger测序证实基因敲除的正确性。选取编号#46和编号#51的雌性大鼠进行繁衍。

4、F0代大鼠#51和野生型SD大鼠繁衍F1代，并通过基因分型鉴定子代大鼠中杂合和野生大鼠，如图5所示，通过步骤3引物，产生730bp大小的电泳片段的即为MT突变大鼠，如#16、#18、#19，无法产生PCR产物的为野生型大鼠，如WT。

表1基因型鉴定所用到的试剂

5、选取F1代中杂合的雌鼠和雄鼠交配，繁育纯合、杂合和野生的Timp4外显子1-5敲除大鼠。鉴定方法：用Takara的MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction KitVer.5.0试剂盒裂解鼠尾提取DNA。PCR扩增试剂：TaKaRa TaqTM Hot Start Version，扩增引物如下：

Prime-F:5’-CCCTGAGTAGCTTGTCTCATTCCCAG-3’(SEQ ID NO.3)；

Prime-R:5’-AGAAACCTAACGGAACTGAAGAGAAGTCT-3’(SEQ ID NO.4)；

产物大小:WT:6718bp；MT:～730bp，删除片段大小～5990bp；

退火温度:60℃；

测序引物(Forward Sequencing):5’-GGTCCGTCCTCCTCTGTCACTGT-3’(SEQ IDNO.5)；

反应体系如下：

反应条件如下：

一个条带：730bp；为阳性纯合子或杂合子(杂合子的野生型链有可能扩增不出来)；

两个条带：730bp,6718bp；为阳性杂合子；

一个条带或无条带：6718bp或0bp；为野生型小鼠。

用以下引物再对纯合子或杂合子进行鉴定(防止杂合子的野生型链扩增不出来误判为纯合子)(图1)：

Prime-F:5’-CCCTGAGTAGCTTGTCTCATTCCCAG-3’(SEQ ID NO.3)；

Primer-R:5’-AGAAACCTAACGGAACTGAAGAGAAGTCT-3’(SEQ ID NO.4)；

Primer-Wt/He-F:5’-GAAGTATCTTATCTGCCTTGCCCTCAG-3’(SEQ ID NO.7)；

Product Size:513bp and 730bp；

退火温度:60℃；

反应条件和反应体系同上；

结果判读如图6：

一个条带：730bp；为阳性纯合子(HOM)；

两个条带：730bp和513bp；为阳性杂合子(HET)；

一个条带：513bp；为野生型对照(WT)。

6、OCT观察大鼠眼部参数：根据基因型将基因编辑大鼠分为三组：纯合(timp4-/-)，杂合(timp4+/-)和野生(timp4+/+)大鼠，所有实验动物从3周龄开始观察，分别在3周、6周、8周、9周、10周、15周、20周、32周、52周进行观察，每组在每个时间点确保数量≥4只。

将麻醉后的大鼠置于OCT的大鼠仓中，用咬器固定好，实验过程中每2min用三角海绵补充羟甲基纤维素于眼球表面，另一侧眼在观测过程中用羟甲基纤维素保持湿润。设置OCT拍摄模式：Radial模式，Frame/B scan＝120，B scan＝5；图像聚焦于大鼠视网膜后，调节镜头距离以及reference arm，使镜头在竖直、水平切面都与视乳头垂直；调整OCTadjust旋钮，待图像的清晰度最高时拍摄；调整镜头距离、reference arm以及镜头直径大小，依次聚焦于晶体后囊、晶体前囊、前房及角膜；保存图片，将图片Average处理，导出数据；实验结束后将大鼠置于保温垫上复苏，双眼涂抹抗生素眼膏防止感染。

视网膜厚度测量：利用InvivoVue系统配套软件DIVER测定视网膜厚度，每张图测量环绕视乳头360°数据(距离视乳头0.65mm-1mm)进行统计后取平均值代表该眼在视网膜中央的视网膜厚度。

角膜、眼前段深度(Anterior chamber depth，ACD)、玻璃体腔深度(Vitreouschamber depth,VCD)测量：在InVivoVue软件中进行测量，当满足界面中同时出现水平与垂直闪光时才能拍照测量(此时测量为最大直径)。眼轴测量：由于大鼠眼球较大，因此在测量范围内无法测量全眼轴长度，因此将各组分最大径相加作为眼轴长度。晶体测量：方法同ACD与VCD，但由于晶体的厚度在15周龄后过厚超过测量范围，因此仅有15周及15周前的晶体厚度数据。

表2

表3

表4

表5

由表2-5野生型(WT)、杂合型(HET)和纯合型(HOM)大鼠视网膜、角膜、ACD、VCD在3-52周的变化可知，在自然生长状态下，同正常大鼠相比，Timp4基因缺陷大鼠在生长发育期(3-10周)出现了病理近视的眼底改变，包括：视网膜较正常大鼠变薄，在第3-10周差异最显著周；第6周时，大鼠的视网膜电流图b波振幅显著降低；改变呈现基因计量依赖效应(HOM<HET<WT)。

在视网膜改变最显著的3/6/9周，HE染色发现，同正常大鼠相比，Timp4基因缺陷大鼠视网膜变薄主要集中在内核层和内丛层，即双极细胞所在位置，免疫荧光染色观察到，基因缺陷大鼠双极细胞形态较差，树突长度和分支变短。

7、视网膜电流图评价视网膜功能

根据基因型将基因编辑大鼠分为三组：纯合(timp4-/-)，杂合(timp4+/-)和野生(timp4+/+)大鼠，3-12周龄，体重50-200g同胞大鼠。本实验用同胞大鼠共13只，其中野生型大鼠4只，杂合大鼠5只，纯合大鼠4只。所有实验动物分别在3周龄、6周龄进行视觉电生理检测。所有待实验大鼠于实验前一晚置于完全黑暗环境暗适应至少8小时，期间保证大鼠有充足的饲料、饮用水以及足够的活动空间。

将麻醉后的大鼠置于罗兰电生理仪的台面上固定，参考电极选择针电极，插入大鼠双耳背侧皮下；刺激电极选择环状角膜电极，环绕双侧角膜放置，地电极插入尾部上方皮下；选择ISCVE/ERG(GF)模式，输入大鼠信息；测试不同通道的电阻，保证每个通道电阻都小于5Ω方可开始测试；依次选择0.1Hz、3.0Hz、10.0Hz和振荡电位，每次刺激后间隔至少5秒以上，暗场拍摄完后进入明场适应10min，依次选择1.0Hz、3.0Hz明场模式；选择Flash VEP(GF)模式，输入大鼠信息；更换电极位置，将两个针电极分别作为刺激电极和参考电极，至于双眼间皮下及头皮下，地电极位置不变；用凝胶保湿左眼球，用锡纸遮盖左眼阻止光线射入；测试不同通道电阻，保证每个通道电阻都小于5Ω方可开始测试，每次刺激之间间隔5s以上；更换锡纸遮盖部位，再次测试不同通道电阻，保证每个通道电阻都小于5Ω方可开始测试，每次刺激之间间隔5s以上；保存实验结果；实验结束后大鼠置于保温垫上复苏，双眼涂抹抗生素眼膏防止感染。

利用Roland系统自带软件进行处理，将数据以CSV格式导出后进行后续统计分析及绘图。

在3周龄大鼠中，没有观察到a波或b波的明显差异。从趋势上来看，无论3周龄和6周龄野生型大鼠的a波及b波振幅都是三个基因型中最高的。在6周龄大鼠中，杂合子和纯合子大鼠b波振幅降低(暗适应0.01ERG，b波振幅：F＝4.876，*P＝0.037。其中6W WT vs.6WHET：124.14±26.23μV vs.73.66±55.16μV，*P＝0.041；暗适应3.0ERG，b波振幅：F＝9.256，**P＝0.007。其中6W WTvs.HET：191.88±29.96μV vs.173.27±124.70μV，*P＝0.012；其中6W WTvs.HOM：191.88±29.96μV vs.151.34±64.53μV，*P＝0.012；暗适应10.0ERG，b波振幅：F＝5.347，*P＝0.029。其中6W WT vs.HOM：190.63±31.15μV vs.145.69±59.96μV，*P＝0.040)。

8、形觉剥夺观察

本研究采用15只3周龄雄性大鼠，体重50g-100g，所有大鼠均来自于同样2对杂合亲本。根据基因型将基因编辑大鼠分为三组：纯合HOM(Timp4-/-)，杂合HET(Timp4+/-)和野生WT(Timp4+/+)大鼠，所有鼠右眼(OD)为实验眼，左眼(OS)为对照眼。

三组大鼠在分别在戴镜前和实验眼戴镜72小时后进行双眼的眼部参数测量，其中先观察实验眼，再观察对照眼。制作软性半透明镜片，制作方法如下：将圆形尼龙扣用打孔铳在中央打11mm大小的圆孔；将半透明软性PVC塑料纸剪成和尼龙扣相近大小的圆形，可叠加一层增加镜片的坚固程度；用百得胶将刚才剪得的PVC塑料纸与打孔后的尼龙扣粘在一起；将尼龙扣的另一半用于固定于实验动物眼球周围；观测大鼠造模前眼球的基本参数：用OCT观测大鼠眼球不同部位大小，方法同上述OCT使用介绍；完成观察后，将大鼠双侧眼球涂上适量抗生素眼膏以免感染；将右眼尼龙扣与软性镜片用百得胶粘在一起，注意不要让胶水进入眼球，保留足够的空间以免镜片损伤角膜；用胶水反复固定眼周镜片以免脱落，用剪刀将大鼠的指甲修剪以减少后续对镜片的破坏；将实验动物置于保温垫上复苏；每日检查镜片固定情况，并用胶水加固镜片；镜片脱落的大鼠不再纳入实验组，如图7所示；

连续上述操作3天后，将大鼠右眼的镜片取下，并立刻用OCT检测右眼视网膜厚度、后段深度、晶状体厚度、前房深度以及角膜厚度，然后再检测左眼；计算每只大鼠实验眼与对照眼差值(OD-OS)，作为戴镜前后的净增长值，这样的方法可以减少动物自然生长和个体差异的影响。在戴镜前后，大鼠的视网膜厚度稍有下降，野生型大鼠视网膜厚度由平均0.248±0.004mm变为0.243±0.009mm(正常对照眼)，但下降并不明显；而左右眼视网膜厚度差值增大，其中纯合大鼠的差值最明显，可达0.022mm，即厚度变化达本身厚度1/10左右，除纯合大鼠在造模前后本身变化比较明显外(视网膜厚度差值：戴镜后HOM vs.戴镜前HOM：-0.002±0.002mm vs.-0.022±0.008mm，*P＝0.026)，三种基因型之间左右眼在戴镜前后差值也具有统计学意义(视网膜厚度差值：F＝8.709，**P＝0.005。其中戴镜后WT vs.戴镜后HOM：-0.001±0.006mm vs.-0.022±0.008mm，**P＝0.005；戴镜后HET vs.戴镜后HOM：-0.005±0.01mm vs.-0.022±0.008mm，*P＝0.024)。

另外可以观察到，在戴镜前后，纯合大鼠玻璃体腔深度增加，戴镜眼明显高于对照眼(玻璃体腔深度差值：戴镜前HOM vs.戴镜后HOM：0.001±0.017mmvs.0.084±0.029mm，**P＝0.008)；戴镜后纯合大鼠与野生型大鼠左右眼差异有统计学差异(玻璃体腔深度差值：F＝7.784，**P＝0.007。其中戴镜后WT vs.戴镜后HOM：-0.026±0.060mm vs.0.084±0.029mm，**P＝0.006)。

形觉剥夺实验72小时后，同正常大鼠相比，Timp4基因缺陷大鼠出现了更加明显的病理近视的眼底改变：造模眼玻璃体腔深度明显加深和视网膜变薄；改变呈现基因计量依赖效应(HOM<HET<WT)。

9、大鼠眼球各部分胶原含量测定

本实验根据Collagen Kit标准方法进行。将组织样本置于冰上化冻，在称上称量50mg，放入标记好的冻存管中；每管冻存管加入500μl的6M HCl，置于恒温仪上加热水解95℃，20小时；加热后取出降温到室温，室温离心13000g，10分钟；取上清液到EP管中，避免取到任何黑色颗粒组织；加入现有液体体积一半的ddH2O，将盐酸浓度稀释到4M HCl；将相应体积的混合液加入到新的EP管中，加入4M HCl稀释到200μl，振荡后瞬时离心；配置标准品，将标准品取125μl置于EP管中，加入125μl的12M HCl；置于恒温仪上95℃加热水解20小时；降温到室温后，室温离心13000g，10分钟；取上清液置于新的EP管中，不要取到任何黑色颗粒组织；取8个EP管，按照表6所示比例进行梯度稀释：

表6

名称	样品来源	4M HCL用量(μL)	DdH2O用量(μL)	浓度(μg/ml)
					S1	125μL水解产物	62.5	62.5	300
S2	120μL水解产物	60	-	200
					S3	90μL水解产物	90	-	100
S4	90μL水解产物	90	-	50
					S5	90μL水解产物	90	-	25
S6	90μL水解产物	90	-	12.5
					S7	90μL水解产物	90	-	6.25
S8	0μL水解产物	90	-	0

将35μl标准品(S1-S8)加入到样板上相应的孔中；将35μl稀释水解样品(在4M HCl中)加入到相应的孔中；加入75μl Assay Buffer到每个孔中并且充分混匀；将板用密封胶密封后置于摇床上，在室温下孵育20分钟；将检测试剂A和检测试剂B按照2:3(即每孔30μl+45μl)混合，制得满足待测孔数的检测试剂，分装到样板中，用密封胶板将板密封；置于摇床上充分混匀，在烘箱中60℃孵育60分钟；将板放在冰上快速降温5分钟，混匀板；小心去除密封胶，清洁待测板的底部，用风光光度仪读取570nm处的OD值。利用多功能酶标仪进行分光光度检测后计算标准曲线，当R2>0.98时方可利用该曲线计算样本浓度。不同眼部组织中总胶原含量。*μg/ml为每50μg干重的组织溶入200μl盐酸后的浓度单位：

表7

μg/ml	WT	HET	HOM
				cornea	854.2±156.4	676.3±148.5	522.4±101.4
lens	38±5.4	39.8±3.1	32.1±3.2
				viterous	80.4±27.1	68.5±26.3	51±7.8
retina	62.8±21.5	33.5±5.5	32.6±5.8
				sclera	2719.9±535.7	2112.9±167.4	1941.2±190.9

由表7可知，对大鼠眼各部分胶原含量测量后发现，同正常大鼠相比，Timp4基因缺陷大鼠巩膜、角膜、视网膜总胶原含量减少，改变呈现基因计量依赖效应(HOM<HET<WT)。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.一种Timp4基因缺陷所致的近视大鼠模型的构建方法，其特征在于，所述近视大鼠模型经Timp4基因敲除构建而成。

2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述Timp4基因敲除对象为Timp4基因外显子1～5。

3.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，基于CRISPR/Case9基因编辑技术，构建用于Timp4基因的第1～5外显子敲除的gRNA1和gRNA2。

4.根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，所述gRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述gRNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，通过将含所述gRNA1序列的载体和含gRNA2序列的载体注入大鼠受精卵，并由孕鼠孵育、再经基因型鉴定得到成功敲除大鼠Timp4基因外显子1～5的F0代大鼠；

F0代大鼠繁衍F1代，并通过基因型鉴定子代大鼠中杂合和野生大鼠；

选取F1代中杂合的雌鼠和雄鼠繁育，经基因型鉴定所得纯合和杂合后代大鼠，即为所述Timp4基因缺陷所致的近视大鼠模型。

6.根据权利要求5所述构建方法，其特征在于，基于PCR扩增和Sanger测序进行Timp4基因外显子1-5是否敲除的基因型鉴定，所用的扩增引物如下：

Prime-F:5’-CCCTGAGTAGCTTGTCTCATTCCCAG-3’；

Prime-R:5’-AGAAACCTAACGGAACTGAAGAGAAGTCT-3’；

所用测序引物如下：

5’-GGTCCGTCCTCCTCTGTCACTGT-3’。

7.根据权利要求5所述构建方法，其特征在于，基于PCR扩增和Sanger测序进行纯合和杂合大鼠基因型鉴定，所用的扩增引物如下：

Prime-F:5’-CCCTGAGTAGCTTGTCTCATTCCCAG-3’；

Prime-R:5’-AGAAACCTAACGGAACTGAAGAGAAGTCT-3’；

所用测序引物如下：

Primer-Wt/He-F:5’-GAAGTATCTTATCTGCCTTGCCCTCAG-3’。

8.权利要求1～7任一项所述方法构建得到的Timp4基因缺陷所致的近视大鼠模型在预防或治疗近视药物筛选中的应用。