JP2014525238A - 造血幹細胞の骨髄ニッチのinvitroモデリング:造血の調節の研究のための、造血移植片の生着能の評価のための、および医薬品の薬理毒性の試験のためのツール - Google Patents
造血幹細胞の骨髄ニッチのinvitroモデリング:造血の調節の研究のための、造血移植片の生着能の評価のための、および医薬品の薬理毒性の試験のためのツール Download PDFInfo
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Abstract
Description
成人の造血
造血は、造血幹細胞(HSC)と呼ばれる少数部隊の細胞から形成された全血液成分の産生および連続的かつ調節された再生を可能とする、生理学的プロセスである。成人においては、造血は骨髄の特定の場所(ニッチと呼ばれる)で起こり、そこで造血は、分泌因子および/または細胞成分およびそれを囲む細胞外マトリックスとの直接的な相互作用によって厳密に調節されて、これは「微小環境」を形成している。多くの場合、このプロセスの調節異常は、悪性血液疾患の発症につながる。その種々の分化レベルにおける(HSC、未成熟前駆細胞、分化が方向づけられた前駆細胞、成熟細胞および機能細胞)造血の調節の研究は、微小環境およびそれが発生するシグナルの重要性を強調する可能性を与えた。実際に、微小環境を模倣することによって、骨髄造血およびBリンパ球新生並びに未成熟前駆細胞LTC−IC(長期培養開始細胞)の研究をin vitroで可能とするのは、骨髄ストローマ細胞上での造血細胞の共培養系の開発である。これに対して、in vitroにおけるTリンパ球新生は、胸腺の微小環境の存在下または直接的にFTOC(胎児胸腺器官培養)型の器官典型的培養においてのみ可能であった。骨髄ストローマにおいてのその研究は、近年、これらのストローマを改変することによって可能となった(遺伝子導入によるDelta like−1の過剰発現)(De Smedt et al, Blood Cells Mol Dis, 2004, 33(3):227-32)。
造血ニッチの概念は、初めて、1978年にSchofieldによって紹介されたが、一連の実験の議論がその存在の実証に貢献するのは2000年の初頭になってからである。
HSCとオステオコンピテントな細胞との間のその調節ニッチ内での相互作用に関与する機序は、生理機能または病態においても依然としてあまりよく分かっていない。これらの機序の解明は、実際に、特にその微小環境的局面を統合して全体的な状況で造血を研究することを可能とする、in vitroのツールがないために限られている。
培養支持体
本発明の第1の局面は、
a.カルシウム生体材料;
b.破骨細胞;
c.内皮細胞;および
d.間葉系幹細胞(MSC)および/または骨芽細胞および/または脂肪細胞
を含む、造血幹細胞(HSC)および/または造血前駆細胞(HP)の培養支持体に関する。
本発明の別の局面は、カルシウム生体材料に、破骨細胞、内皮細胞および間葉系幹細胞(MSC)および/または骨芽細胞および/または脂肪細胞、並びに場合によりECMの1つ以上の成分を移植することからなる工程を含む、本発明による培養支持体を調製するための方法に関する。
本発明の別の局面は、
a.上で定義したような少なくとも1つの培養支持体に、造血幹細胞(HSC)および/または造血前駆細胞(HP)を播種する工程;および
b.前記造血幹細胞(HSC)および/または造血前駆細胞を培養する工程
からなる工程を含む、造血幹細胞(HSC)および/または造血前駆細胞(HP)をin vitroで培養するための方法に関する。
その調節ニッチ内でのHSCとオステオコンピテント細胞との間の相互作用に関与する機序は、生理学および病理学の両方において依然としてあまりよく分かっていない。これらの機序の解明は、実際に、特にその微小環境的局面を統合した全体的な状況で造血を研究することを可能とする、in vitroのツールがないために限られている。
本発明の最後の局面は、
a.カルシウム生体材料;
b.破骨細胞、あるいは破骨細胞においてHSCの分化を可能とする1セットのサイトカインおよび/または増殖因子;
c.内皮細胞、あるいは循環中の内皮前駆細胞または骨髄の単核細胞の内皮細胞への分化を可能とする1セットのサイトカインおよび/または増殖因子;
d.間葉系幹細胞(MSC)および/または骨芽細胞および/または脂肪細胞および場合によりMSCの骨芽細胞および/または脂肪細胞への分化;および/または骨芽細胞および/または脂肪細胞の分化を可能とする1セットのサイトカインおよび/または増殖因子;および
e.場合により細胞外マトリックス(ECM)の1つ以上の成分
を含むキットに関する。
実施例1:ニッチを形成する種々の細胞型の調製
間葉系幹細胞(MSC)の単離および培養
骨髄単核細胞を、全人工股関節手術を行なった患者の手術残留物からの癌性骨片から単離し、そして10%ウシ胎児血清(SVF, Hyclone)および1%シプロフロキサシン(Bayer)を含むMEMα(ATGC/biological Industries)に基づいた培地中で100,000個の細胞/cm2の濃度で75cm2のフラスコに播種する。培養フラスコを37℃で5%CO2および20%O2を含む雰囲気中でインキュベーションする。培養培地を、コンフルエンスに近い状態(80%から90%)となるまで、培養3日後、最初の週、その後は1週間に1回新しくする。細胞がコンフルエンスに達した場合、それらを、37℃で5分間トリプシンの酵素作用(トリプシン1:250、Sigma)によってプラスチック支持体から剥離し、数を数え(トリパンブルー)、そしてその後、5%ヒトアルブミンおよび10%DMSOを含む凍結保護溶液中で凍結させる。その使用の観点から、その後、MSCを37℃の水浴中で解凍し、そしてその後、再度希釈し、そしてMEMα、1%シプロフロキサシンおよび20%アルブミンからなる培地中で洗浄する。数を数えてトリパンブルーを用いての染色によって生存度を評価した後、その後、MSCを、下記した種々の実験条件下で、MEMα、10%SVF、1%シプロフロキサシンに基づいた培養培地中に播種する。培養培地を、細胞が80%のコンフルエンスを得るまで1週間に1回新しくする。その後、それらをトリプシン処理し、そして2回目の継代のために再播種する。
− 骨芽細胞への分化:骨芽細胞への分化は、0.1μMのデキサメタゾン、0.05mMのL−アスコルビン酸2リン酸および10mMのβ−グリセロリン酸(Sigma)で強化されたMEMα、10%SVF、1%シプロフロキサシンの培地中でコンフルエンスとなったMSCから誘導される。誘導培地は、1週間に2回、3週間新しくする。分化の質は、位相差顕微鏡でミネラル化レベルを評価することによって、ナフトールAS−BIリン酸(Sigma)を用いた化学反応によりアルカリホスファターゼ(ALP)活性を検出することによる免疫組織化学法によって、並びにオステオカルシン、オステオポンチンおよびALPの検出による間接的な免疫蛍光法(IFI)によって評価される。IFI反応は、4%パラホルムアルデヒド(Sigma)と結合させた後、3%ウシアルブミンおよび0.1%TritonX100(Prolabo)で強化されたPBSにより飽和/透過処理を行うことにより実施される。抗オステオカルシン、抗オステオポンチンおよび抗ALP抗体は、1%ウシアルブミンおよび0.05%Tween20(Biorad)で強化されたPBS溶液中でインキュベーションし、そしてその後、標識を、フィコエリトリンと結合させたマウスIgを標的とする抗体(ヤギ抗マウスPE;Caltag)によって明らかとする。最後に、核を見ることを可能とするヘキストを用いての対比染色を実施する(Hoechst 33258, Molecular Probes)。
全人工股関節手術を行なった患者の手術残留物からの癌性骨片から得られたヒト骨髄の単核細胞を、フィコールクッションでの密度勾配によって分離し、そしてその後、37℃のインキュベーター中で、5%CO2を含む加湿雰囲気中で一晩培養する。翌日、Lin−除去を、アフィニティカラムで行ない、これにより、以下の抗原系列を発現している分化細胞を除去する:CD2、CD3、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD56、CD123、GPA。これにより得られたLin−細胞(約107個の細胞)を、サイトカインの混液(10ng/mlのSCF、Flt3およびTPO)を含む培地中でHA/TCP生体材料上で培養する。Lin−細胞(2×106個のLin−細胞)を2Dまたは3Dの生体材料上に蒔く。5日間培養した後、培養培地を、以下のサイトカインを含む骨髄分化培地と交換する:10ng/mlのSCF、Flt3、TPO、IL−6およびGM−CSF。15日間培養した後、細胞を、M−CSF、RANK−LおよびIL−6を20ng/mlで含む破骨細胞誘導培地中でインキュベーションする。
内皮細胞は、2つの入手源から得ることができる:
1)末梢血からの循環中の内皮前駆細胞(ECP)。このために、ECPに由来するコロニーを、20mLの血液から得られた単核細胞から生成する。各コロニーは、2回の継代後に約106個の細胞を産生する。従って、3または4回の継代後、108個の機能性内皮細胞を得ることが可能である。
Lin−:骨髄細胞または単核球中の造血細胞は、フィコールハイパック密度勾配での遠心分離後に得られる。その後、Lin−細胞(lineage陰性)は、種々の分化抗原に対して標的化される抗体の混液(Lineage cell depletion kit, Miltenyi Biotec)を用いて標識した後に選別される。緩衝液媒体中で洗浄した後、選別は、オートマトン(Automacs, Miltenyi Biotech)での除去によって実施される。
ニッチのモデリングは、同じ骨誘導性2Dまたは3D支持体上での種々のストローマの共有を必要とする。これらの生体材料(BM)は、特に、ヒドロキシアパタイト(HA)およびリン酸三カルシウム(TCP)を種々の比率で含み得、そして様々な多孔度を有する。後者の中から、65%のHAおよび35%のβTCPを含む二相性セラミックであるB2DおよびB3D(BD Biocoat Osteologic Bone Cell Culture System)並びにCalciresorb 35(Ceraver)に言及させて頂きたい。実施例5に示された結果は、Calciresorb 35(Ceraver)を用いて得られた。
天然グリコサミノグリカン(GAG)またはその模倣体(これはグリカナーゼによって分解されないという利点を有する)を、生体材料と結合させ得る。優先的に使用される模倣体GAGは、OTR3(Organ, Tissue, Regeneration, Repair and Replacement)によって、「ReGeneraTing Agents」に対するRGTAの名称で販売され、そして10〜50mg/mlの濃度で理想的に使用される。実施例5に示された結果は、OTR4131を用いて得られた。
ニッチのモデリングは、同じウェル中に種々のストローマを共有することを必要とし、MSC、破骨細胞および内皮細胞は、同じBMまたは異なる2Dもしくは3DのBM上に理想的に播種される(1つの細胞型につき1つ)(図1)。実施例5で示された結果は、Calciresorb35型の種々の3DのBM上に播種することによって得られた。MSCは、破骨細胞および脂肪細胞への分化に向けて誘導される。種々の型のストローマ細胞によって細胞化されたハイブリッドBMがこれにより得られる。その後、後者は、全ハイブリッドBMを含む単一のウェルに収集され、これにその後、HSC/HPが種々の濃度で加えられ、これにより共培養液が産生される。実施例5で示された結果は、Lin−細胞を1×105個の細胞/ml/ウェルの濃度となるまで加えた後に得られた。この手順の代替方法は、球状の形態で各々の分化した細胞型の培養液を産生することからなる(それらがその分化中に支持体に付着することを防ぐことによって)。その後、種々の細胞型を混合し、そして単一の同じ生体材料上に播種する(De Barros et al., PLoS One. 2010; 5(2)、11頁、第3段落)。
ニッチの種々の細胞型の特徴付け
特異的誘導の試験を用いての骨芽細胞、脂肪細胞および破骨細胞の分化の評価は、実施例1に記載されているように染色によって実施される。
3Dニッチによって分泌された因子の評価
造血の調節に関与しそしてそこでモデリングされたニッチ内で産生された主な分子は、HSC/HP CD34+の存在下、7日間の共培養後にELISA試験によって定量された。結果は、105個のストローマ細胞(MSC、骨芽細胞、破骨細胞および脂肪細胞)および5×104個の最初に播種されたCD34+細胞あたりのpg/mlで表現される。以下の表1は、種々の因子の有意な産生を示す;骨芽細胞およびMSCが産生細胞の大半である。これらの結果は、そこでモデリングされたニッチを形成している細胞の機能的能力を証明する。
2Dのモデリングニッチ(骨芽細胞、脂肪細胞、MSCおよび破骨細胞)は、動員されていない健康被験者(CD34+細胞の豊富度は30%に等しい)の末梢血からのLin−細胞群からのCD34+細胞の増殖を促進する。結果は、7日間の共培養後、CD34+群が、産生された生細胞の約96.25%+/−1.71%(n=4)を示すことを示す。
未分化造血細胞のプールを維持する造血ニッチの能力を実証するために、本発明者らはまた、3〜7日間培養した後、Lin−骨髄細胞のSP機能を維持するその能力を評価した。SP機能は、幹細胞および特にHSCが、蛍光着色剤ヘキスト−33342または他の着色剤および薬物の流出を引き起こす能力によって定義される。この機能は、特徴的なサイトグラムの形態の細胞の残留蛍光の定量によってフローサイトメトリーによって評価され得、最も高い流出能を有する細胞が、最も未分化であると判断される。この目的のために、本発明者らは、2D細胞化ニッチ(n=3〜4)の存在下または非存在下でLin−骨髄細胞(2×105個)を培養した。
Claims (12)
- a.カルシウム生体材料;
b.破骨細胞;
c.内皮細胞;および
d.間葉系幹細胞(MSC)および/または骨芽細胞および/または脂肪細胞
を含む、造血幹細胞(HSC)および/または造血前駆細胞(HP)の培養支持体。 - 前記カルシウム生体材料が、ヒドロキシアパタイト(HA)およびリン酸三カルシウム(TCP)を含む、請求項1記載の培養支持体。
- 前記カルシウム生体材料が2次元または3次元である、請求項1または2記載の培養支持体。
- 前記カルシウム生体材料が、生体材料B2DおよびB3D(BD Biocoat Osteologic Bone Cell Culture System)並びにCalciresorb35(Ceraver, France)からなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか1項記載の培養支持体。
- 細胞外マトリックス(ECM)の1つ以上の成分をさらに含む、請求項1〜4のいずれか1項記載の培養支持体。
- 生物学的接着剤をさらに含む、請求項1〜5のいずれか1項記載の培養支持体。
- 少なくとも1つのカルシウム生体材料を、破骨細胞、内皮細胞および間葉系幹細胞(MSC)および/または骨芽細胞および/または脂肪細胞および場合によりECMの1つ以上の成分と共に移植することから構成される工程を含む、請求項1〜6のいずれか1項に定義された培養支持体を調製するための方法。
- a.請求項1〜5のいずれか1項に定義された少なくとも1つの培養支持体に、造血幹細胞(HSC)および/または造血前駆細胞(HP)を播種すること;および
b.前記造血幹細胞(HSC)および/または造血前駆細胞を培養すること
から構成される工程を含む、造血幹細胞(HSC)および/または造血前駆細胞(HP)をin vitroで培養するための方法。 - 造血幹細胞(HSC)および/または造血前駆細胞(HP)の造血および/または分化に関与する細胞機序を研究するための、請求項1〜6のいずれか1項に定義された培養支持体の使用。
- 造血移植片の生着能を評価するための請求項1〜6のいずれか1項に定義された培養支持体の使用。
- 医薬品候補の効力および/または毒性を研究するための請求項1〜6のいずれか1項に定義された培養支持体の使用。
- a.カルシウム生体材料;
b.破骨細胞、または造血幹細胞(HSC)および/または造血前駆細胞(HP)の破骨細胞への分化を可能とする1セットのサイトカインおよび/または増殖因子;
c.内皮細胞、または循環中の内皮前駆細胞もしくは骨髄の単核細胞の、内皮細胞への分化を可能とする1セットのサイトカインおよび/または増殖因子;
d.間葉系幹細胞(MSC)および/または骨芽細胞および/または脂肪細胞、および場合により、MSCの骨芽細胞/脂肪細胞および/または骨芽細胞および/または脂肪細胞への分化を可能とする1セットのサイトカインおよび/または増殖因子;および
e.場合により、細胞外マトリックス(ECM)の1つ以上の成分
を含むキット。
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