JP2014519321A - ヌクレオシド逆転写酵素阻害に基づく処置を改善および管理するための方法 - Google Patents
ヌクレオシド逆転写酵素阻害に基づく処置を改善および管理するための方法 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、逆転写酵素をコードする核酸配列、逆転写インジケーター、デオキシシチジンキナーゼ(dCK)をコードする核酸配列、およびヌクレオシドトランスポーターをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む、形質転換された酵母細胞、ならびに逆転写を阻害する能力を有する化合物をスクリーニングするための方法およびNRTI化合物に対する逆転写酵素、特に、被験体に感染しているウイルスに由来する逆転写酵素の感度を予測するための方法におけるその使用に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
Description
本特許出願は、参照により本願明細書に援用される、2011年5月17日に出願された欧州特許出願公開第110040557号明細書の優先権の利益を主張するものである。
本発明は、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤を検出するためおよびヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(NRTI)処置に対する逆転写酵素の感度を予測するための細胞および方法に関する。
いくつかのウイルス感染症は、社会にとって実際に重要な健康問題を構成している。それらのうち、HIV(ヒト免疫不全ウイルス)感染は、人類に影響を及ぼす最も深刻な疾患の1つである。新しい治療ストラテジー(例えば、化学療法の併用)の開発によって、実際に、HIVに感染した患者の生活の質および平均余命が改善された。抗逆転写酵素化合物、抗インテグラーゼ化合物、抗侵入化合物および抗プロテアーゼ化合物をはじめとした種々のクラスの抗HIV薬が存在する。逆転写酵素阻害剤には、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(NRTI)および非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(NNRTI)が含まれる。
残念なことに、ウイルスは、これらの薬物に応答して、弱まり、薬物耐性が現れ、治療失敗に至る。したがって、ウイルスの薬物耐性および感度は、治療ストラテジーの改善について研究している科学者にとって重要な主題であり、新しい抗ウイルス薬を同定するためおよび抗ウイルス処置を管理するためにそのような機序を研究する重大な必要性がある。
HIVの逆転写酵素は、変異を受けて、逆転写酵素阻害剤に対して耐性になる。新しい逆転写酵素阻害剤を検出するためのいくつかの試験が開発された。特許文献1および特許文献2は、酵母細胞において逆転写酵素阻害剤を検出するための高価でない単純な試験を記載している。しかしながら、この方法は、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(NNRTI)に対しては使用できるとしても、そのような試験は、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(NRTI)の検出には適合していない。実際に、NRTIは、ヌクレオシドトランスポーターを介して細胞に侵入する必要がありかつ有効であるためには細胞のキナーゼによって三リン酸化される必要があるプロドラッグであり、酵母ゲノムは、一リン酸化されたヌクレオシドの生成に関わるトランスポーターおよびキナーゼにとって必要な遺伝情報を欠いている。
したがって、NRTIまたは候補NRTI化合物を試験するために、特許文献1および特許文献2に記載されている試験を適合させる必要がある。
本発明者らは、形質転換された酵母細胞を開発した(ここで、デオキシシチジンキナーゼ(dCK)および少なくとも1つのヌクレオシドトランスポーターの特異的発現によって、上記形質転換された酵母細胞においてヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(NRTI)が機能的になることが可能になる)。
本発明は、
逆転写酵素をコードする核酸配列、
逆転写インジケーター(reverse transcription indicator)、
デオキシシチジンキナーゼ(dCK)をコードする核酸配列、および
ヌクレオシドトランスポーターをコードする少なくとも1つの核酸配列、
を含む、形質転換された酵母細胞に関する。
逆転写酵素をコードする核酸配列、
逆転写インジケーター(reverse transcription indicator)、
デオキシシチジンキナーゼ(dCK)をコードする核酸配列、および
ヌクレオシドトランスポーターをコードする少なくとも1つの核酸配列、
を含む、形質転換された酵母細胞に関する。
上記形質転換された酵母細胞は、上記逆転写酵素に対するヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(NRTI)の活性を試験することが可能である。
本発明はまた、逆転写を阻害する能力を有する化合物をスクリーニングするための方法にも関し、その方法は、
i.本発明に係る逆転写酵素インジケーターを含む形質転換された酵母細胞を化合物と接触させる工程、
ii.上記形質転換された酵母細胞を選択培地中で培養する工程、
iii.上記化合物と接触していない上記形質転換された酵母細胞と比較して、形質転換された酵母細胞の増殖の抑制を検出する工程、および
iv.形質転換された酵母細胞の増殖を抑制する能力を有する化合物を、逆転写を阻害する化合物であるとして選択する工程、
を包含する。
i.本発明に係る逆転写酵素インジケーターを含む形質転換された酵母細胞を化合物と接触させる工程、
ii.上記形質転換された酵母細胞を選択培地中で培養する工程、
iii.上記化合物と接触していない上記形質転換された酵母細胞と比較して、形質転換された酵母細胞の増殖の抑制を検出する工程、および
iv.形質転換された酵母細胞の増殖を抑制する能力を有する化合物を、逆転写を阻害する化合物であるとして選択する工程、
を包含する。
本発明はまた、NRTI化合物に対する逆転写酵素の感度を予測するための方法にも関し、上記方法は、
i.研究されている逆転写酵素を含む、先に記載されたような形質転換された酵母細胞を作製する工程、
ii.上記形質転換された酵母細胞を上記NRTI化合物と接触させる工程、
iii.形質転換された酵母細胞を選択培地中で培養する工程、
iv.NRTI化合物有りまたは無しで、形質転換された酵母細胞の増殖を測定する工程、および
v.そこから、研究されている逆転写酵素が上記NRTI処置に対して感受性であるかまたは耐性であるかを推定する工程、
を包含する。
i.研究されている逆転写酵素を含む、先に記載されたような形質転換された酵母細胞を作製する工程、
ii.上記形質転換された酵母細胞を上記NRTI化合物と接触させる工程、
iii.形質転換された酵母細胞を選択培地中で培養する工程、
iv.NRTI化合物有りまたは無しで、形質転換された酵母細胞の増殖を測定する工程、および
v.そこから、研究されている逆転写酵素が上記NRTI処置に対して感受性であるかまたは耐性であるかを推定する工程、
を包含する。
図面は、本願明細書の一部分を形成し、本発明のある特定の態様をさらに証明するために含められる。本発明は、本願明細書中に提示される特定の実施形態の詳細な説明と併せてこれらの図面の1つ以上を参照することによりよりよく理解され得る。
ゲノム内にdCKおよびプラスミド内にOAT1を有する株における逆転写酵素(RT)活性および阻害剤感受性。図1は、酵母A株(Mat a、URA−、HIS−、LEU−)(したがって、dCKおよびOAT1を有しない)において、米国特許第5,714,313号明細書に記載されているようにHIV−1由来の逆転写酵素が発現されるとき、ザルシタビン(ddC)(A株+ddc 100μM)、ジダノシン(ddI)(A株+ddI 100μM)、ザルシタビン(AZT)(A株+AZT 100μM)またはスタブジン(d4T)(A株+d4T 100μM)の存在下における72時間にわたるインキュベーションは、600nmにおける吸光度(OD@600nm)によって測定される、細胞の増殖、ひいては逆転写を阻害できないことを示している。OAT1トランスポーターをコードする核酸配列を含むプラスミドを有する遺伝的に改変されたA株(ここで、dCKの核酸コード配列は、酵母ゲノム内に組み込まれていた)(A#株)において、米国特許第5,714,313号明細書に記載されているようにHIV−1由来の逆転写酵素が発現されるとき、ddC(A#株+ddc 100μM)、ddI(A#株+ddI 100μM)、AZT(A#株+AZT 100μM)またはd4T(A#株+d4T 100μM)の存在下における72時間にわたるインキュベーションは、600nmにおける吸光度(OD@600nm)によって測定される、細胞の増殖、ひいては逆転写を阻害する。
ゲノム内にdCKおよびOAT1を有する株におけるRT活性およびNRTI感受性。図2は、遺伝的に改変されたB株(Mat a、URA+、HIS−、LEU+)(ここで、dCK酵素およびOAT1をコードする両方の核酸配列は、酵母ゲノムに組み込まれていた)(B##株:Mat a、URA−、HIS−、LEU−、dCK+、OAT1+)において、米国特許第5,714,313号明細書に記載されているようにHIV−1由来の逆転写酵素が発現されるとき、ddC(ddc 100μM)、ddI(ddI 100μM)、AZT(AZT 100μM)またはd4T(d4T 100μM)の存在下における72時間にわたるインキュベーションは、600nmにおける吸光度によって測定される、細胞の増殖(%阻害)、ひいては逆転写を阻害することを示している。
ゲノム内にdCKおよびOAT1を有する酵母株におけるNRTIのIC50測定。B##株(Mat a、URA−、HIS−、LEU−、dCK+、OAT1+)において、米国特許第5,714,313号明細書に記載されているようにHIV−1由来の逆転写酵素活性を発現させ、試験し、種々の濃度のddC、ddI、AZT、d4TまたはTFVの存在下において72時間インキュベートした。細胞の増殖ひいては逆転写の阻害を600nmにおける吸光度(OD@600nm)によって測定し、各阻害剤に対するIC50値を、増殖抑制を50%に誘導する阻害剤の濃度として定義した。
したがって、本発明者らは、米国特許第5,714,313号明細書および同第5,462,873号明細書(これらは参照により本願明細書に援用される)に記載されている方法から得られる系においてNRTI化合物を検出かつ試験するために有用な新しい構築物および酵母細胞を開発し、試験した。
(本発明の酵母細胞)
本発明の第1の目的は、
逆転写酵素をコードする核酸配列、
逆転写インジケーター、
デオキシシチジンキナーゼ(dCK)をコードする核酸配列、および
ヌクレオシドトランスポーターをコードする少なくとも1つの核酸配列、
を含む、形質転換された酵母細胞に関する。
本発明の第1の目的は、
逆転写酵素をコードする核酸配列、
逆転写インジケーター、
デオキシシチジンキナーゼ(dCK)をコードする核酸配列、および
ヌクレオシドトランスポーターをコードする少なくとも1つの核酸配列、
を含む、形質転換された酵母細胞に関する。
これらのエレメントは、ゲノムまたはプラスミドに含められ得る。
好ましい実施形態において、本発明は、
プラスミド内の、逆転写酵素をコードする核酸配列および逆転写インジケーター、ならびに
ゲノム内の、デオキシシチジンキナーゼ(dCK)をコードする核酸配列およびヌクレオシドトランスポーターをコードする少なくとも1つの核酸配列、
を含む、形質転換された酵母細胞に関する。
プラスミド内の、逆転写酵素をコードする核酸配列および逆転写インジケーター、ならびに
ゲノム内の、デオキシシチジンキナーゼ(dCK)をコードする核酸配列およびヌクレオシドトランスポーターをコードする少なくとも1つの核酸配列、
を含む、形質転換された酵母細胞に関する。
上記形質転換された酵母細胞は、上記逆転写酵素に対するヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(NRTI)の活性を試験することが可能である。
用語「NRTI」または「ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤」とは、化学構造が天然のヌクレオシドの改変バージョンを構成している、抗レトロウイルス薬として使用されるヌクレオシドアナログのことを指す。そのような化合物は、ウイルスのレトロ転写事象における生理学的ヌクレオシドに取って代わることによってレトロウイルス逆転写酵素に干渉することによってレトロウイルスの複製を抑制し、ウイルスの新生DNAのランダムな停止をもたらす。それらは、すべての形態の逆転写酵素、特に、非レトロウイルス逆転写酵素を阻害するためにも使用され得る。
NRTIの群は、ジドブジン(AZT、RETROVIRとも呼ばれる)、ジダノシン(ddI、VIDEXとも呼ばれる)、ザルシタビン(ddC、HIVIDとも呼ばれる)、スタブジン(d4T、ZERITとも呼ばれる)、ラミブジン(3TC、EPIVIRとも呼ばれる)、アバカビル(ABC、ZIAGENとも呼ばれる)、エムトリシタビン(Emtricitabine)(FTC、EMTRIVAとも呼ばれる)、テノホビル(TFV VIREADとも呼ばれる)、エンテカビル(BARACLUDE)、アプリシタビン(Apricitabine)(第III相臨床試験)を含むがこれらに限定されない。
「形質転換された酵母細胞」とは、任意の手段(例えば、感染、結合体化、形質転換、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション)によって目的のベクター(またはDNAフラグメント)が移入された酵母細胞のことを意味する。細胞の形質転換の方法は、当該分野で周知である。
1つの実施形態において、本発明の形質転換された酵母細胞は、形質転換されたSaccharomyces cerevisiae細胞である。
本願明細書中で使用されるとき、「逆転写酵素」とは、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性および/またはRNaseH活性および/またはDNA依存性DNAポリメラーゼ活性を含むいくつかの活性、好ましくは少なくともRNA依存性DNAポリメラーゼ活性を有するタンパク質のことを指す。本願明細書中で使用される「逆転写酵素」は、任意のウイルス、より詳細には、任意のレトロウイルスまたは任意のレトロトランスポゾンに由来する逆転写酵素、ならびに変異を有しかつ上で言及された逆転写酵素活性を維持しているそのような逆転写酵素バリアントを含む。
本願明細書中で使用されるとき、「バリアント」または「機能保存的バリアント」は、1つまたはいくつかのヌクレオチドが変更されており、かつBLASTまたはFASTAアルゴリズムによって測定されたとき少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、さらにより好ましくは少なくとも99%のヌクレオチド同一性を有し、かつそれと比較される天然遺伝子または親遺伝子と同じまたは実質的に類似の特性または機能を有する、核酸配列を含む。
本発明によると、上記方法において使用される逆転写酵素は、特に、レトロウイルス逆転写酵素である。
本発明において使用される逆転写酵素は、例えば、ヒト免疫不全ウイルスHIV−1およびHIV−2、サル免疫不全ウイルス、トリ免疫不全ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルスまたはウマ伝染性貧血ウイルスに由来し得る。好ましくは、本発明の逆転写酵素は、HIV−1またはHIV−2逆転写酵素である。
本発明によると、逆転写酵素をコードする核酸は、作製されてもよいし、被験体サンプルから得られてもよく、当該被験体は、逆転写酵素を発現する目的のウイルス、またはより詳細には目的のレトロウイルスに感染している。
本願明細書中で使用されるとき、用語「被験体」は、ウイルス、特に、レトロウイルスに感染した動物、より詳細には、レトロウイルスに感染した哺乳動物(例えば、げっ歯類、ネコ、イヌおよび霊長類)を表す。好ましくは、本発明に係る被験体は、ヒトである。より好ましくは、被験体は、HIV−1またはHIV−2に感染したヒト患者である。
被験体から得られた逆転写酵素をコードする核酸配列は、遺伝子増幅(ポリメラーゼ連鎖反応法,PCR)または精製されたウイルスDNAに対する制限酵素の作用による逆転写酵素の放出によって得られる場合がある。この場合、レトロウイルスのゲノム情報を含む生物学的サンプルは、被験体から得られる。例えば、その被験体が、HIV−1またはHIV−2ウイルスに感染したヒト患者である場合、HIV−1またはHIV−2逆転写酵素をコードする核酸配列は、当該患者から得られた全血サンプルのリンパ球もしくは血漿から、または他の任意の感染器官から得られる場合がある。そのような方法は、当該分野で周知である(例えば、DWIGHT et al,Journal of Clinical Microbiology 2005,vol43,n11,pp5696−5704;およびSHAFER et al,Journal of Clinical Microbiology 1996,vol34,n7,pp1849−1853に開示されている方法を参照のこと)。
参照HIV−1逆転写酵素をコードする核酸配列は、核酸配列の配列番号1によって定義される。参照HIV−2逆転写酵素をコードする核酸配列は、核酸配列の配列番号2によって定義される。これらのHIV−1とHIV−2の両方の参照逆転写酵素は、NRTI処置に対して感受性である。
これらの核酸配列に基づいて、当業者は、その一般的な知識に基づいて、感染した患者のサンプルから得られたDNAに対するHIV−1またはHIV−2逆転写酵素核酸配列のPCRによって増幅できるプライマーを容易にデザインできる。
例として、HIV−1またはHIV−2逆転写酵素をコードする核酸配列は、核酸配列の配列番号3および配列番号4によって定義されるプライマー対または核酸配列の配列番号5および配列番号6によって定義されるプライマー対を使用する、感染した患者の血液サンプルからのPCRによって増幅され得る。
好ましい実施形態において、逆転写酵素をコードする核酸配列は、誘導性プロモーターの支配下にある。
用語「誘導性プロモーター」とは、ある特定の環境条件が存在するとき適切な遺伝子の転写を促進する転写プロモーターのことを指す。上記プロモーターは、本発明の酵母細胞において有効である。誘導性プロモーターの例としては、ガラクトースによって誘導可能なGAL−1プロモーターおよびグルコース枯渇によって誘導可能なADH−2およびメチオニンによって阻止されるMETが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「逆転写インジケーター」とは、本発明の形質転換された細胞、好ましくは、形質転換された細胞のゲノム(染色体DNA)に挿入された、逆転写酵素をコードする核酸配列の組み込み、発現および機能性の検査を可能にするマーカー核酸配列のことを指す。他の用語において、本発明に係る「逆転写インジケーター」は、逆転写酵素の活性の存在を示唆する。好ましい実施形態において、本発明のために使用される逆転写酵素インジケーターは、当該分野で周知であり、特に、米国特許第5,714,313号明細書および同第5,462,873号明細書に記載されている、his3AI遺伝子である。
米国特許第5,714,313号明細書および同第5,462,873号明細書は、レトロ転位が生じている形質転換された酵母細胞を選択するための方法を記載しており、その方法は、本発明のために使用され得る。この方法は、(i)形質転換された酵母細胞を選択培地上に置く工程、(ii)その細胞を培養する工程、および(iii)増殖中のコロニー(増殖している細胞のコロニー)について選択する工程を包含する。
本願明細書中で使用されるとき、用語「デオキシシチジンキナーゼ(dCK)」とは、ホスフェートをデオキシシチジンに移行させるポリペプチドのことを指す。dCKは、いくつかのデオキシリボヌクレオシドおよびそれらのヌクレオシドアナログのリン酸化に必要である。この用語は、天然に存在するdCKならびにそのバリアントおよび改変型を含み得る。dCKは、任意の種に由来し得、特に、哺乳動物のdCK、好ましくは、ヒトdCKであり得る。例示的な天然のヒトdCK mRNA配列は、アクセッション番号NM_000788としてGenBankデータベースに提供されている(配列番号7)。
本願明細書中で使用されるとき、用語「ヌクレオシドトランスポーター」とは、細胞および/または小胞の膜を越えてヌクレオシド(および特に、ヌクレオシドアナログ)を輸送する膜輸送タンパク質の大きな群のことを指す。ヌクレオシドトランスポーターは、特に、平衡ヌクレオシドトランスポーター(ENT)および濃縮型ヌクレオシドトランスポーター(CNT)を含むがこれらに限定されない。本発明によると、この用語は、有機アニオントランスポーター(OAT)および有機カチオントランスポーター(OCT)も含む。
本発明によると、ヌクレオシドトランスポーターは、例えば、CNT1、CNT2、CNT3、ENT1、ENT2、OAT1、OAT3およびOCT1を含む群において選択され得るがこれらに限定されない。
特定の実施形態において、ヌクレオシドトランスポーターは、CNT1、CNT2、CNT3、ENT1、ENT2およびOAT1を含む群において選択されるがこれらに限定されない。
平衡ヌクレオシドトランスポーター1に対するENT1という用語は、ヒトにおいてSLC29A1遺伝子によってコードされるタンパク質のことを指す。この用語は、天然に存在するSLC29A1遺伝子ならびにそのバリアントおよび改変型を含み得る。SLC29A1遺伝子は、典型的には、哺乳動物のSLC29A1遺伝子、好ましくは、ヒトSLC29A1遺伝子である。例示的な天然のヒトSLC29A1 mRNA配列は、アクセッション番号NM_001078174としてGenBankデータベースに提供されている(配列番号8)。
ENT2(平衡ヌクレオシドトランスポーター2)という用語は、ヒトにおいてSLC29A2遺伝子によってコードされるタンパク質のことを指す。この用語は、天然に存在するSLC29A2遺伝子ならびにそのバリアントおよび改変型を含み得る。SLC29A2遺伝子は、典型的には、哺乳動物のSLC29A2遺伝子、好ましくは、ヒトSLC29A2遺伝子である。例示的な天然のヒトSLC29A2 mRNA配列は、アクセッション番号NM_001532としてGenBankデータベースに提供されている(配列番号9)。
CNT1(濃縮型ヌクレオシドトランスポーター1)という用語は、ヒトにおいてSLC28A1遺伝子によってコードされるタンパク質である。この用語は、天然に存在するSLC28A1遺伝子ならびにそのバリアントおよび改変型を含み得る。SLC28A1遺伝子は、典型的には、哺乳動物のSLC28A1遺伝子、好ましくは、ヒトSLC28A1遺伝子である。例示的な天然のヒトSLC28A1 mRNA配列は、アクセッション番号NM_004213としてGenBankデータベースに提供されている(配列番号10)。
CNT2(濃縮型ヌクレオシドトランスポーター2)という用語は、ヒトにおいてSLC28A2遺伝子によってコードされるタンパク質である。この用語は、天然に存在するSLC28A2遺伝子ならびにそのバリアントおよび改変型を含み得る。SLC28A2遺伝子は、典型的には、哺乳動物のSLC28A2遺伝子、好ましくは、ヒトSLC28A2遺伝子である。例示的な天然のヒトSLC28A2 mRNA配列は、アクセッション番号NM_004212としてGenBankデータベースに提供されている(配列番号11)。
CNT3(濃縮型ヌクレオシドトランスポーター3)という用語は、ヒトにおいてSLC28A3遺伝子によってコードされるタンパク質である。この用語は、天然に存在するSLC28A3遺伝子ならびにそのバリアントおよび改変型を含み得る。SLC28A3遺伝子は、典型的には、哺乳動物のSLC28A3遺伝子、好ましくは、ヒトSLC28A3遺伝子である。例示的な天然のヒトSLC28A3 mRNA配列は、アクセッション番号NM_001199633としてGenBankデータベースに提供されている(配列番号12)。
OAT1(有機アニオントランスポーター1)という用語は、ヒトにおいてSLC22A6遺伝子によってコードされるタンパク質である。この用語は、天然に存在するSLC22A6遺伝子ならびにそのバリアントおよび改変型を含み得る。SLC22A6遺伝子は、典型的には、哺乳動物のSLC22A6遺伝子、好ましくは、ヒトSLC22A6遺伝子である。例示的な天然のヒトSLC22A6 mRNA配列は、アクセッション番号NM_004790としてGenBankデータベースに提供されている(配列番号13)。
OAT3(有機アニオントランスポーター3)という用語は、ヒトにおいてSLC22A8遺伝子によってコードされるタンパク質である。この用語は、天然に存在するSLC22A8遺伝子ならびにそのバリアントおよび改変型を含み得る。SLC22A8遺伝子は、典型的には、哺乳動物のSLC22A8遺伝子、好ましくは、ヒトSLC22A8遺伝子である。例示的な天然のヒトSLC22A8 mRNA配列は、アクセッション番号NM_001184732としてGenBankデータベースに提供されている(配列番号14)。
OCT1(有機カチオントランスポーター1)という用語は、ヒトにおいてSLC22A1遺伝子によってコードされるタンパク質である。この用語は、天然に存在するSLC22A1遺伝子ならびにそのバリアントおよび改変型を含み得る。SLC22A1遺伝子は、典型的には、哺乳動物のSLC22A8遺伝子、好ましくは、ヒトSLC22A1遺伝子である。例示的な天然のヒトSLC22A1 mRNA配列は、アクセッション番号NM_003057としてGenBankデータベースに提供されている(配列番号15)。
本発明によると、形質転換された酵母細胞は、そのゲノム内に、ヌクレオシドトランスポーターをコードする1、2、3、4、5、6、7または8つの核酸配列を含み得る。
本発明の1つの実施形態において、本発明の形質転換された酵母細胞は、最低でも、OAT1をコードする核酸配列を含む。
実際に、本発明者らは、OAT1の発現が、ジドブジン、スタブジン、ジダノシンまたはザルシタビンによるHIV RTの良好な阻害を得ることを可能にすること立証した。特定の実施形態において、上記形質転換された酵母細胞は、最低でも、別のヌクレオシドトランスポーターをコードするもう1つの核酸配列を含む。
本発明の別の実施形態において、本発明の形質転換された酵母細胞は、最低でも、CNT3をコードする核酸配列を含む。
実際に、本発明者らは、CNT3の発現が、AZT(ジドブジン)またはd4T(スタブジン)によるHIV RTの良好な阻害を得ることを可能にすること立証した。特定の実施形態において、上記形質転換された酵母細胞は、最低でも、別のヌクレオシドトランスポーターをコードするもう1つの核酸配列を含む。
本発明の特定の実施形態において、本発明の形質転換された酵母細胞は、チミジンキナーゼをコードする核酸配列をさらに含む。
本願明細書中で使用されるとき、用語「チミジンキナーゼ」(TK)は、当該分野におけるその一般的な意味を有し、キナーゼ(多くの抗ウイルス薬の作用に必要である)のことを指す。TKは、いくつかのヌクレオシドアナログのリン酸化に必要である。この用語は、天然に存在するTKならびにそのバリアントおよび改変型を含み得る。TKは、任意の種由来であり得る。TKは、例えば、ヒトTKであり得るが、ウイルスTKでもあり得る。典型的には、本発明に従って使用されるTKは、ヒト単純ヘルペスウイルスタイプ1由来のTK、HSV1−TK(配列番号16)であり得る。
(本発明の方法)
本発明の形質転換された酵母細胞は、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(NRTI)を使用する治療を改善および管理するために使用され得る。
本発明の形質転換された酵母細胞は、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(NRTI)を使用する治療を改善および管理するために使用され得る。
したがって、本発明の第2の目的は、逆転写を阻害する能力を有する化合物をスクリーニングするための方法に関し、その方法は、
i.本発明に係る逆転写インジケーターを含む形質転換された酵母細胞を化合物と接触させる工程、
ii.上記形質転換された酵母細胞を選択培地中で培養する工程、
iii.上記化合物と接触していない上記形質転換された酵母細胞と比較して、形質転換された酵母細胞の増殖の抑制を検出する工程、および
iv.形質転換された酵母細胞の増殖を抑制する能力を有する化合物を、逆転写を阻害する化合物であるとして選択する工程、
を包含する。
i.本発明に係る逆転写インジケーターを含む形質転換された酵母細胞を化合物と接触させる工程、
ii.上記形質転換された酵母細胞を選択培地中で培養する工程、
iii.上記化合物と接触していない上記形質転換された酵母細胞と比較して、形質転換された酵母細胞の増殖の抑制を検出する工程、および
iv.形質転換された酵母細胞の増殖を抑制する能力を有する化合物を、逆転写を阻害する化合物であるとして選択する工程、
を包含する。
本発明によると、用語「増殖抑制」は、スクリーニングされるまたは試験される化合物と接触していない細胞と比べたときの増殖の有意な減少を含む。したがって、それは、定量され得る増殖の任意の相対的な阻害を含む。
特定の実施形態において、上記増殖抑制とは、スクリーニングされるまたは試験される化合物と接触していない細胞と比べたときの増殖の少なくとも30%、より詳細には、少なくとも50%、さらにより詳細には、少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも90%の減少のことを指し、ここで、上記化合物は、水性媒質における溶解が可能であるより高い濃度で使用される。
本発明によると、逆転写インジケーターは、形質転換されていない酵母細胞(または逆転写が生じない形質転換された酵母細胞)が増殖できなかった特定の条件において、本発明の形質転換された酵母細胞が増殖するのを可能にする。したがって、逆転写インジケーターは、本発明にとって興味深い、逆転写が生じている形質転換された酵母細胞の選択を可能にする。
選択培地は、上記特定の条件において増殖することができる、逆転写が効率的に生じる酵母細胞を選択するように選択される。
例えば、逆転写インジケーターとしてhis3AIを使用する場合、逆転写が生じる酵母細胞は、ヒスチジンを欠く培地中で増殖することができる。したがって、逆転写インジケーターとしてhis3AI遺伝子とともに使用される選択培地は、ヒスチジンを欠く培地である。
本発明によると、試験されるNRTI化合物と接触させた本発明の形質転換された酵母細胞は、古典的な細胞培養液(選択的でない)において増殖する。
試験されるNRTI化合物の逆転写に対する効果を研究するために、上記化合物は、逆転写(reverse transposition)が生じる前に加えられなければならない。
それゆえ、好ましくは、逆転写酵素をコードする核酸配列は、誘導性プロモーターの支配下にあり、逆転写(例えば、逆転写酵素をコードする核酸配列の発現を誘導する)が、試験されるNRTI化合物を本発明の形質転換された酵母細胞と接触させた後に誘導される。
したがって、好ましい実施形態において、本発明は、逆転写を阻害する能力を有する化合物をスクリーニングするための方法に関し、その方法は、
i.逆転写インジケーターおよび本発明に係る誘導性プロモーターの支配下の逆転写酵素を含む形質転換された酵母細胞を化合物と接触させる工程、
ii.逆転写を誘導する工程、
iii.上記形質転換された酵母細胞を選択培地中で培養する工程、
iv.上記化合物と接触していない上記形質転換された酵母細胞と比較して、形質転換された酵母細胞の増殖の阻害を検出する工程、および
v.形質転換された酵母細胞の増殖を阻害する能力を有する化合物を、逆転写を阻害する化合物であるとして選択する工程
を包含する。
i.逆転写インジケーターおよび本発明に係る誘導性プロモーターの支配下の逆転写酵素を含む形質転換された酵母細胞を化合物と接触させる工程、
ii.逆転写を誘導する工程、
iii.上記形質転換された酵母細胞を選択培地中で培養する工程、
iv.上記化合物と接触していない上記形質転換された酵母細胞と比較して、形質転換された酵母細胞の増殖の阻害を検出する工程、および
v.形質転換された酵母細胞の増殖を阻害する能力を有する化合物を、逆転写を阻害する化合物であるとして選択する工程
を包含する。
本発明の方法によると、本発明に従って試験され得る化合物は、ヌクレオシドおよび公知のNRTIと類似の化学構造を有する。
本発明によると、この方法に従って選択された化合物は、形質転換された酵母細胞の逆転写酵素が由来するレトロウイルスに対する治療ストラテジーを開発するために使用され得る。
本発明によると、上記逆転写酵素は、レトロトランスポゾンまたはウイルス由来、特に、レトロウイルス由来であり得る。
レトロトランスポゾンエレメントにおいてコードされる逆転写酵素は、癌の機序およびウイルス感染症におけるウイルスの逆転写酵素(より詳細には、レトロウイルス逆転写酵素)に結びつけられる。
特定の実施形態において、上記逆転写酵素は、レトロウイルス由来であり得る。
この場合、本発明の方法は、レトロウイルスの複製を阻害する新規化合物の検出を可能にする。
本発明によると、「レトロウイルスの複製を阻害する」は、レトロウイルス逆転写酵素の場合において「逆転写酵素を阻害する」または「逆転写を阻害する」と交換可能に使用され得る。
本発明のより特定の実施形態において、この方法において使用される形質転換された細胞の逆転写酵素は、HIV−1およびHIV−2、サル免疫不全ウイルス、トリ免疫不全ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルスまたはウマ伝染性貧血ウイルスを含む群において選択されるレトロウイルスに由来する。好ましくは、その逆転写酵素は、HIV−1またはHIV−2に由来する。
別の好ましい実施形態において、本発明の方法によって選択される化合物はさらに、形質転換された酵母細胞の逆転写酵素が由来するレトロウイルスによる感染のモデルにおいて試験され得る。
本発明の第3の目的は、NRTI化合物に対する逆転写酵素の感度を予測するための方法に関し、上記方法は、
i.研究されている逆転写酵素インジケーターおよび逆転写酵素を含む、先に記載されたような形質転換された酵母細胞を作製する工程、
ii.上記形質転換された酵母細胞を上記NRTI化合物と接触させる工程、
iii.形質転換された酵母細胞を選択培地中で培養する工程、
iv.NRTI化合物有りまたは無しで、形質転換された酵母細胞の増殖を測定する工程、および
v.そこから、研究されている逆転写酵素が上記NRTI化合物に対して感受性であるかまたは耐性であるかを推定する工程
を包含する。
i.研究されている逆転写酵素インジケーターおよび逆転写酵素を含む、先に記載されたような形質転換された酵母細胞を作製する工程、
ii.上記形質転換された酵母細胞を上記NRTI化合物と接触させる工程、
iii.形質転換された酵母細胞を選択培地中で培養する工程、
iv.NRTI化合物有りまたは無しで、形質転換された酵母細胞の増殖を測定する工程、および
v.そこから、研究されている逆転写酵素が上記NRTI化合物に対して感受性であるかまたは耐性であるかを推定する工程
を包含する。
1つの実施形態において、形質転換された酵母細胞をNRTI化合物と接触させた後の増殖抑制は、研究されている逆(reserve)転写酵素が、上記NRTI化合物に対して感受性であることを示唆する。
本発明によると、用語「増殖抑制」は、感受性であると知られている参照逆転写酵素を含む本発明の形質転換された酵母細胞(形質転換された参照酵母細胞)と比べたときの、研究されている逆転写酵素を含む上記形質転換された酵母細胞(試験されている形質転換された酵母細胞)における増殖の任意の減少を含む。
そのような阻害は、試験されている形質転換された酵母細胞と、形質転換された参照酵母細胞とに対する接触されたNRTI化合物のIC50値の比(IC50(研究RT)/IC50(参照RT))を測定することによって判断され得る。
本発明によると、1以下のIC50(研究RT)/IC50(参照RT)比は、研究されている逆転写酵素が、上記NRTI化合物に対して感受性であることを示唆し、1より大きいIC50(研究RT)/IC50(参照RT)比は、研究されている逆転写酵素が上記NRTI化合物に対して参照逆転写酵素よりも感受性でないことを示唆する。
したがって、好ましい実施形態において、上記方法は、試験されている形質転換された酵母細胞に対する接触されたNRTI化合物のIC50値と、上記NRTI化合物に感受性であると知られている参照逆転写酵素を含む形質転換された参照酵母細胞に対する接触されたNRTI化合物のIC50値との比を測定する工程からなる(consisting in)さらなる工程を工程(iv)の後に包含する。
上記好ましい実施形態によると、1以下の比は、研究されている逆転写酵素が、上記NRTI化合物に感受性であることを示唆する。
本発明によると、研究されている逆転写酵素は、レトロトランスポゾンまたはウイルス、特に、レトロウイルスに由来し得る。
特に、上記逆転写酵素は、レトロウイルスに由来する。
例えば、この方法において研究される逆転写酵素は、HIV−1およびHIV−2、サル免疫不全ウイルス、トリ免疫不全ウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルスまたはウマ伝染性貧血ウイルスを含む群において選択されるレトロウイルスに由来し得る。
したがって、特定の実施形態において、本発明は、被験体に感染しているレトロウイルスに由来する逆転写酵素のNRTI化合物に対する感度を予測するための方法に関し、上記方法は、
i.先に記載されたような形質転換された酵母細胞を作製する工程(その逆転写酵素は、上記被験体に感染しているレトロウイルスに由来する)、
ii.上記形質転換された酵母細胞を上記NRTI化合物と接触させる工程、
iii.形質転換された酵母細胞を選択培地中で培養する工程、
iv.NRTI化合物有りまたは無しで、形質転換された酵母細胞の増殖を測定する工程、および
v.そこから、上記被験体に感染しているレトロウイルスに由来する逆転写酵素が上記NRTI処置に対して感受性であるかまたは耐性であるかを推定する工程、
を包含する。
i.先に記載されたような形質転換された酵母細胞を作製する工程(その逆転写酵素は、上記被験体に感染しているレトロウイルスに由来する)、
ii.上記形質転換された酵母細胞を上記NRTI化合物と接触させる工程、
iii.形質転換された酵母細胞を選択培地中で培養する工程、
iv.NRTI化合物有りまたは無しで、形質転換された酵母細胞の増殖を測定する工程、および
v.そこから、上記被験体に感染しているレトロウイルスに由来する逆転写酵素が上記NRTI処置に対して感受性であるかまたは耐性であるかを推定する工程、
を包含する。
好ましくは、上記逆転写酵素は、HIV−1またはHIV−2逆転写酵素である(かつ上記被験体は、HIV−1またはHIV−2に感染したヒト患者である)。
1つの実施形態において、形質転換された酵母細胞をNRTI化合物と接触させた後の増殖抑制は、被験体に感染しているレトロウイルスの逆転写酵素およびそのレトロウイルス自体が、上記NRTI化合物に対して感受性であることを示唆する。したがって、その被験体は、上記NRTI化合物に応答する可能性がある。
本発明によると、用語「増殖抑制」は、感受性であると知られている上記レトロウイルスの参照逆転写酵素を含む本発明の形質転換された酵母細胞(形質転換された参照酵母細胞)と比べたときの、レトロウイルスに感染した上記被験体に由来する逆転写酵素を含む形質転換された酵母細胞(試験されている形質転換された酵母細胞)における増殖の任意の減少を含む。
そのような抑制は、試験されている形質転換された酵母細胞に対する接触されたNRTI化合物のIC50値と、形質転換された参照酵母細胞に対する接触されたNRTI化合物のIC50値との比(IC50(被験体RT)/IC50(参照RT))を測定することによって測定され得る。
本発明によると、1以下のIC50(被験体RT)/IC50(参照RT)比は、研究されている逆転写酵素が、上記NRTI化合物に対して感受性であり、被験体が、上記NRTI化合物に基づく処置に応答する可能性があることを示唆する。1より大きいIC50(研究RT)/IC50(参照RT)比は、研究されている逆転写酵素が上記NRTI化合物に対して参照逆転写酵素よりも感受性でなく、被験体が、上記NRTI化合物に基づく処置に応答しないリスクがあることを示唆する。
本発明によると、HIV−1およびHIV−2参照逆転写酵素は、それぞれ核酸配列の配列番号1および配列番号2によって定義され得る。
好ましくは、逆転写酵素をコードする核酸配列は、誘導性プロモーターの支配下にあり、逆転写(例えば、逆転写酵素をコードする核酸配列の発現を誘導する)は、試験されているNRTI化合物を本発明の形質転換された酵母細胞と接触させた後に誘導される。
本発明によると、試験されているNRTI化合物と接触された本発明の形質転換された酵母細胞は、古典的な細胞培養液(選択的でない)において増殖する。
本発明のさらに別の実施形態において、形質転換された酵母細胞において使用される逆転写インジケーターは、his3AIであり、工程(ii)において使用される選択培地は、ヒスチジンを欠く細胞培地である。
好ましい実施形態において、上記NRTI化合物は、ジドブジン、ジダノシン、スタブジン、ラミブジン、アバカビル、エムトリシタビン、テノホビルおよびザルシタビンを含むまたはそれらからなる群において選択され得る。
特定の実施形態において、NRTI化合物の組み合わせが試験され得る。例えば、テノホビル、ラミブジン、アバカビルおよびエムトリシタビンの組み合わせ、スタブジン、ジドブジンおよびジダノシンの組み合わせが試験され得る。
1つの実施形態において、本発明は、NRTI化合物に対する逆転写酵素の逆転写酵素の耐性または感度を予測するための上記方法に関し、ここで、試験されるNRTIは、ジドブジンまたはスタブジンであり、形質転換された酵母細胞は、最低でも、ヌクレオシドトランスポーターCNT3をコードする核酸を含む。
別の特定の実施形態において、本発明は、NRTI化合物に対する逆転写酵素の逆転写酵素の耐性または感度を予測するための前記方法に関し、ここで、試験されるNRTIは、ジドブジン、スタブジン、ジダノシンまたはザルシタビンであり、形質転換された酵母細胞は、最低でも、ヌクレオシドトランスポーターOAT1をコードする核酸配列を含む。
以下の実施例は、本発明を行うおよび実施する好ましい形式のいくつかを記載する。しかしながら、これらの実施例は、単に例示目的であって、本発明の範囲を限定すると意図されていないことが理解されるべきである。
実施例1:dCKおよびCNT3を有する株におけるRTに対するチミジンアナログ逆転写酵素阻害剤の活性
S.cerevisiae A株(Mat a、URA−、HIS−、LEU−)を、ura3酵母遺伝子をコードする核酸配列を有するPCR増幅されたDNAフラグメントで、標準的な酢酸リチウムプロトコルを使用して形質転換した。形質転換された細胞であるA1株(Mat a、URA+、HIS−、LEU−)は、そのゲノム遺伝子座にura3遺伝子を組み込んだ。A1株(Mat a、URA+、HIS−、LEU−)を、StuI制限酵素によって予め直線化しておいたp426GPDhdCKプラスミド(ヒトdCKおよびura3をコードする核酸配列を含み、ura3オープンリーディングフレーム内で直線化は生じた)で、標準的な酢酸リチウムプロトコルを使用して形質転換した。ura3遺伝子座においてdCKの組み込みが生じたその新しい株(A#株)は、以下の表現型(Mat a、URA−、HIS−、LEU−、dCK+)を有する。
A#株を、ヌクレオシドトランスポーターCNT3をコードする核酸配列を含む発現ベクタープラスミドおよび米国特許第5,714,313号明細書に記載されているプラスミドpHART21で形質転換した。得られた酵母株および改変されていないA株におけるHIV−1 RT活性を、200μMのAZT(ジドブジン)またはd4T(スタブジン)の存在下または非存在下における72時間のインキュベーションの後に、米国特許第5,714,313号明細書に記載されているように測定した。外来タンパク質が存在したとき、HIV−1 RTのNRTI依存性阻害が生じた(表1)。
実施例2:ゲノム内にdCKおよびプラスミド内にOAT1を有する株におけるRT活性および阻害剤感受性
A#株(Mat a、URA−、HIS−、LEU−、dCK+)を、ヌクレオシドトランスポーターOAT1をコードする核酸配列を含む発現ベクタープラスミドおよび米国特許第5,714,313号明細書に記載されているプラスミドpHART21で形質転換した。得られた酵母株および改変されていないA株(Mat a、URA−、HIS−、LEU−)におけるHIV−1 RT活性を、100μMのAZT、ddC(ザルシタビン)、ddI(ジダノシン)またはd4Tの存在下または非存在下における72時間のインキュベーションの後に米国特許第5,714,313号明細書に記載されているように測定した。外来タンパク質が存在したとき、HIV−1 RTのNRTI依存性阻害が生じた(図1)。
実施例3:ゲノム内にdCKおよびOAT1を有する株におけるRT活性および阻害剤感受性
S.cerevisiae B株(Mat a、URA+、HIS−、LEU+)を、StuI制限酵素によって予め直線化しておいたp426GPDhdCKプラスミド(dCKおよびura3をコードする核酸配列を含み、ura3オープンリーディングフレーム内で直線化は生じた)で、標準的な酢酸リチウムプロトコルを使用して形質転換した。ura3遺伝子座においてdCKの組み込みが生じたその新しい株(B#株)は、以下の表現型(Mat a、URA−、HIS−、LEU+、dCK+)を有する。
B#株を、PCR増幅されたDNAフラグメントを用いた形質転換によって、標準的な方法で遺伝的に改変した。この核酸フラグメントは、leu2遺伝子座の5’および3’非コード領域に隣接した、OAT1トランスポーターをコードする核酸配列を含む。dCおよびOAT1が酵母ゲノムに組み込まれたその新しい改変された株であるB##株(Mat a、URA−、HIS−、LEU−、dCK+、OAT1+)を、米国特許第5,714,313号明細書に記載されているプラスミドpHART21で形質転換した。B##株におけるHIV−1 RT活性を、100μMのAZT、ddC、ddIまたはd4Tの存在下における72時間のインキュベーションの後に米国特許第5,714,313号明細書に記載されているように測定した。外来タンパク質が存在したとき、HIV−1 RTのNRTI依存性阻害が生じ(図2)、これは、それらのタンパク質の活性が、それらが発現される方法に関係しないことを示している(プラスミドとして、図1または酵母ゲノム内において、図2)。
実施例4:ゲノム内にdCKおよびOAT1を有する酵母株(B##株)におけるNRTIのIC50の測定
HIV−1 RTに対するNRTIのIC50値の測定を、米国特許第5,714,313号明細書に記載されている方法に従って、B##株において行った。種々の濃度のddI、AZT、TFV(テノホビル)、ddCまたはd4Tの存在下または非存在下における72時間のインキュベーションの後、細胞の増殖を600nmにおけるODで測定した。酵母の増殖を半分(50%)に抑制するNRTIの量(濃度)として定義されるIC50値を、増殖抑制のパーセンテージをNRTI濃度に対してプロットすることによって測定した(対数スケールで表される)(図3)。
実施例5:dCKおよびヌクレオシドトランスポーターを有する株と比べたときのNT5Cおよびヌクレオシドトランスポーターを有する株の非効率
サイトゾルの5’ヌクレオチダーゼであるNT5Cは、NRTIのリン酸化に関わるリン酸基転移能力を有すると示されている(Johnson MA,Fridland 1989 A.Mol Pharmacol.36:291−5 Phosphorylation of 2’,3’−dideoxyinosine by cytosolic 5’−nucleotidase of human lymphoid cells)。したがって、このタンパク質を、「dCK様タンパク質」として本発明の形質転換された酵母細胞において試験し、RT、RTインジケーター、NT5Cおよびヌクレオシドトランスポーターを含む本発明に類似の構築を行った。
ヒトサイトゾル5’ヌクレオチダーゼNT5Cをコードする核酸配列を、以下のとおり酵母ゲノムに組み込んだ。S.cerevisiae A1株(Mat a、URA+、HIS−、LEU−)を、酵母ura3遺伝子の開始コドンの上流の50ヌクレオチド長の配列と同一の核酸配列に続いてGPDプロモーター配列に続いて5’ヌクレオチダーゼをコードする核酸配列に続いて酵母ura3遺伝子の終止コドンの下流の50ヌクレオチド長の配列と同一の核酸配列を含むPCR増幅されたDNAフラグメントで、標準的な酢酸リチウム法を使用して形質転換した。ura3遺伝子座において外来遺伝子の組み込みが生じたその改変された酵母株A§株(Mat a、HIS−、LEU−、URA−、NT5C+)を、ADHプロモーターの支配下にヒトヌクレオチドトランスポーターCNT2の核酸コード配列を有するプラスミドで、標準的な方法に従ってさらに形質転換した。この株をA§§株と命名した(Mat a、HIS−、LEU+、URA−、NT5C+、CNT2+)。
実施例1からのS.cerevisiae A#株(Mat a、URA−、HIS−、LEU−、dCK+)を、ADHプロモーターの支配下にヒトヌクレオチドトランスポーターCNT2の核酸コード配列を有するプラスミドで、標準的な方法を用いて形質転換した。この株をA#§株と命名した(Mat a、URA−、HIS−、LEU+、dCK+、CNT2+)。
以下のとおり、米国特許第5,714,313号明細書に記載されているように両方の株においてHIV RT活性を測定した。HIV1 RTを発現する両方の株を、SD−ura+グルコースにおいて飽和するまで生育した。1DOの飽和培地(約107個の細胞)を1mlのSGal−uraに播種し、6時間生育した。次いで、グルコースを加えることによって、RTの活性化を停止した。12時間後、誘導された細胞を、SD−His培地に0.2DO/mlで播種し、72時間インキュベートした。振盪しながら30℃でインキュベーションを行った。表IIに示されるように、200μM濃度のABC(アバカビル)またはTFV(テノホビル)阻害剤の存在下における増殖抑制を測定することによって、HIV−1 RT活性の阻害を測定した。得られた結果は、酵母にdCKが存在することにより、NRTI阻害剤の実質的な活性がもたらされるが、NT5Cの存在は、NRTI阻害剤の実質的な活性をもたらさないことを証明した。
Claims (15)
- 逆転写酵素をコードする核酸配列、
逆転写インジケーター、
デオキシシチジンキナーゼ(dCK)をコードする核酸配列、および
ヌクレオシドトランスポーターをコードする少なくとも1つの核酸配列
を含む、形質転換された酵母細胞。 - プラスミド内の、逆転写酵素をコードする核酸配列および逆転写インジケーター、ならびに
ゲノム内の、dCKをコードする核酸配列およびヌクレオシドトランスポーターをコードする少なくとも1つの核酸配列
を含む、請求項1記載の形質転換された酵母細胞。 - 前記逆転写酵素をコードする核酸配列が、誘導性プロモーターの支配下にある、請求項1〜2のいずれか1項記載の形質転換された酵母細胞。
- 前記逆転写酵素が、HIV−1またはHIV−2逆転写酵素である、請求項1〜3のいずれか1項記載の形質転換された酵母細胞。
- 前記逆転写酵素をコードする核酸配列が、レトロウイルス、好ましくは、HIV−1またはHIV−2に感染した被験体に由来する、請求項1〜4のいずれか1項記載の形質転換された酵母細胞。
- 前記逆転写インジケーターが、his3AIである、請求項1〜5のいずれか1項記載の形質転換された酵母細胞。
- CNT1、CNT2、CNT3、ENT1、ENT2 OAT1、OAT3およびOCT1を含む群において選択されるヌクレオシドトランスポーターをコードする1、2、3、4、5、6、7または8つの核酸配列を、最低でも含む、請求項1〜6のいずれか1項記載の形質転換された酵母細胞。
- 最低でも、ヌクレオシドトランスポーターOAT1をコードする核酸配列を含む、請求項1〜7のいずれか1項記載の形質転換された酵母細胞。
- 逆転写を阻害する能力を有する化合物をスクリーニングするための方法であって、
i.請求項1〜7において定義された形質転換された酵母細胞を化合物と接触させる工程、
ii.前記形質転換された酵母細胞を選択培地中で培養する工程、
iii.前記化合物と接触していない前記形質転換された酵母細胞と比較して、前記形質転換された酵母細胞の増殖の抑制を検出する工程、および
iv.前記形質転換された酵母細胞の増殖を抑制する能力を有する化合物を、逆転写を阻害する化合物であるとして選択する工程、
を包含する、方法。 - 前記形質転換された酵母細胞の逆転写酵素が、HIV−1またはHIV−2逆転写酵素である、請求項9に記載の方法。
- 前記逆転写インジケーターが、his3AIであり、前記選択培地が、ヒスチジンを欠く細胞培養液である、請求項9〜10のいずれか1項記載の方法。
- NRTI化合物に対する逆転写酵素の感度を予測するための方法であって、前記方法は、
i.請求項5において定義された形質転換された酵母細胞を作製する工程、
ii.前記形質転換された酵母細胞を前記NRTI化合物と接触させる工程、
iii.前記形質転換された酵母細胞を選択培地中で培養する工程、
iv.NRTI化合物有りまたは無しで、前記形質転換された酵母細胞の増殖を測定する工程、および
v.そこから、研究されている逆転写酵素が前記NRTI化合物に対して感受性であるかまたは耐性であるかを推定する工程、
を包含する、方法。 - 前記形質転換された酵母細胞を前記NRTI化合物と接触させた後の増殖抑制が、前記被験体に感染しているレトロウイルスの逆転写酵素が前記NRTI化合物に対して感受性であることを示唆する、請求項12に記載の方法。
- 前記逆転写インジケーターが、his3AIであり、前記選択培地が、ヒスチジンを欠く細胞培養液である、請求項12または13のいずれか1項記載の方法。
- 前記NRTI化合物が、ジドブジン、ジダノシン、スタブジン、ラミブジン、アバカビル、エムトリシタビン、テノホビルおよびザルシタビンからなる群において選択される、請求項12〜14のいずれか1項記載の方法。
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