JP2014519315A - 診断及び予後の方法 - Google Patents

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Abstract

血液悪性腫瘍であると判っているか疑われる被験者から得た細胞、例えばCD138発現細胞の試料中のGadd45β発現レベルを測定するステップを有するGadd45β発現の測定方法である。発現レベルは、例えば多発性骨髄腫の診断、例えば多発性骨髄腫である患者の予後の予測、又は適切な治療薬の選択をガイドに用いられる。特に治療薬にはGadd45β及び/又はMKK7阻害剤が含まれる。さらに、データセットは多数の被験者から測定された発現レベルを含む。
【選択図】図1

Description

本発明は、癌及び他の炎症性疾患の診断に関し、並びに、それらの疾患における予後情報及びセラノスティック(治療的調節)情報の提供に関する。
[Gadd45β及び癌]
c−Jun N−末端キナーゼ、すなわちJNK経路を含め、発癌や癌の進行に関与する多数の細胞経路が存在する。JNK経路は、サイトカイン並びに紫外線照射、熱衝撃及び浸透圧衝撃などのストレス刺激に応答する。また、サイトカインや細胞ストレスに応答して活性化するものとして、NF−κB経路がある。NF−κB経路は、Gadd45β及びJNKキナーゼ、すなわちマイトジェン活性化プロテイン−キナーゼ7(MKK7/JNKK2)の仲介によるクロストークによってJNK経路を阻害することができる。MKK7の活性は、誘導因子であるGadd45βファミリーのメンバーでありNF−κBの直接転写標的であるGadd45βにより阻害される。これは、Gadd45βが、MKK7に結合しその活性を阻害することによりJNKシグナル伝達のNF−κBによる抑制を仲介することを意味する(非特許文献1)。
NF−κB阻害剤の使用は、癌及び炎症性疾患の治療における使用を提案されてきた。しかしながら、NF−κBは、計画的細胞死(PCD)、免疫、炎症及び組織成長における役割を含む多くの活性を有しているので、NF−κB自体よりもむしろNF−κBの特定の機能を阻害することが好ましい。従って、多数のGadd45β阻害剤が提案されてきた(特許文献1参照)。
国際特許出願公開WO2011/048390号公報 米国特許出願公開第2005/0112630号公報 米国特許出願公開第2009/0264306号公報 米国特許出願公開第2010/0144673号公報 国際特許出願公開WO03/068935号公報 国際特許出願公開WO2010/040124号公報 国際特許出願公開WO2004/016744号公報 米国特許第6410707号明細書 米国特許第5936092号明細書 米国特許第6093692号明細書 米国特許第6225445号明細書 米国特許第4179337号明細書
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本発明は、Gadd45βの細胞レベルの測定に関し、かつ、Gadd45βレベルの指標が所定の癌に関する診断並びに予後情報及びセラノスティック情報の提供の双方に有用であるとの発見に基づいている。
多発性骨髄腫(MM)は、形質細胞性骨髄腫及びカーレル病としても知られているが、形質細胞の癌である。多発性骨髄腫は、ステロイド、化学療法、サリドマイド及び肝細胞移植によって一時的な寛解へと誘導することができるが、現在のところ治療不能である。米国癌協会によると、米国では約45,000人が多発性骨髄腫と共に生活し、毎年約15,000人が新たな症例と診断されている。診断後の平均生存期間は約3年である。多発性骨髄腫は、非ホジキンリンパ腫に次ぐ最も一般的な血液癌であり、全ての癌の約1%を、そして全ての癌による死亡の約2%を占める。多発性骨髄腫の発生率は増加しているように見え、病気の発症年齢が低下しているという証拠もある。多発性骨髄腫の診断の際に支援するために、患者や医者に対し予後情報を提供する際に支援するために、そして特定の治療に効果を示す可能性の最も高い患者の選択において有用な情報を提供する際に支援するために、多発性骨髄腫に関する診断、予後情報及びセラノスティック情報の提供を改善することが明らかに必要とされている。
多くの方法が、多発性骨髄腫に関する診断及び/又は予後情報の提供において使用するために提案されている。例えば、特許文献2は、正常な形質細胞分化に関与すると考えられる遺伝子群の発現差に応じて多発性骨髄腫患者を異なる臨床的サブグループに分けることを開示している。特許文献3は、多数の血液悪性腫瘍に関する診断及び予後情報を提供するためにDNAメチル化プロフィールの使用を開示している。特許文献4は、CKS1B遺伝子の発現レベルに基づいて多発性骨髄腫の予後に関する有用な情報の提供を開示している。特許文献5は、腫瘍細胞表面上に存在し、多発性骨髄腫を含む多数の悪性細胞の治療、診断及び予後に使用するために提案された新規RNA及びタンパク質抗原を開示している。特許文献6は、多発性骨髄腫を含む癌の治療、予後及び監視のためにGOLPH3遺伝子の使用を提案している。
特許文献7は、Gadd45β発現の低下が疾患又は疾患のリスク増大と相関性がある場合に、肝疾患へ罹りやすさの診断又は予測においてGadd45β発現を使用することを開示している。
多発性骨髄腫は、通常、血清及び/又は尿中のMタンパク質(単クローン性免疫グロブリン又はパラプロテイン)の検出並びに組織病理学による骨髄中のクローン形質細胞の検出の後に診断される。多発性骨髄腫及び他の単クローン性免疫グロブリン血症の分類の報告については非特許文献2を参照されたい。癌細胞は、通常、CD138陽性細胞であり、それらの細胞は血漿、骨髄又はそれらが浸潤している他の組織(例えば、リンパ節、腎臓、脾臓及び骨)で検出することができる。多発性骨髄腫の既存の診断方法は、多くの目的において適切であるが、それらは一般に信頼性の高い予後情報を提供するものではない。
Gadd45β発現が、軟骨肉腫(非特許文献3)でもヒト肝細胞肉腫(非特許文献4)でも癌の進行と共に低下することが報告されている。
本発明は、血液及びリンパ系の癌に関してGadd45β発現が、癌の指標であり、かつ、予後不良及びGadd45β阻害剤を用いた治療の適切さの指標でもあるという発見に基づいている。
本発明の第1の態様によれば、Gadd45β発現を測定する方法が提供され、その方法は、血液悪性腫瘍であることが判っているか又は疑われる被験者から予め得られた細胞の試料中のGadd45β発現レベルを測定するステップを含む。
本発明の第2の態様によれば、特定の血液悪性腫瘍であることが疑われるか又は判っている一群の複数被験者から得た細胞において測定されたGadd45β発現レベルを有するデータセットが提供される。
図1は、MGUS、多発性骨髄腫(MM)又は慢性リンパ球性白血病(CLL)のいずれかと診断された患者から得た細胞中のGadd45β mRNA発現を、健常者の細胞から得た値と比較したものを示す。Gadd45β mRNAの値は、健常者の末梢血由来の精製されたCD19リンパ球の4試料、毎年1%の発生率で多発性骨髄腫に進行する可能性のある前癌状態である、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症(MGUS)の患者の骨髄吸引から得た精製されたCD138形質細胞の12試料、新たに多発性骨髄腫と診断された患者の骨髄吸引から得た精製されたCD138形質細胞の58試料、及び、慢性リンパ性白血病(CLL)の患者の末梢血から精製されたCD19リンパ球の5試料についての定量的リアルタイムPCR測定から計算された。MGUS患者の精製された形質細胞中のmRNAレベルは、MM患者と比べて有意に(p<0.0001)異なっていた。比較は、t−スチューデント検定を用いて行い、0.05未満のp値は有意とみなした。 図1aは、MGUS、多発性骨髄腫(MM)又は慢性リンパ球性白血病(CLL)のいずれかと診断された患者におけるGadd45β mRNA発現を示す。発現は、図中に示すように精製されたCD138又はCD19細胞中で測定された。単クローン性(すなわち癌)CD138形質細胞は、多発性骨髄腫(MM)(n=101)又は意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症(MGUS)(n=14)を患っている患者からのものであった。多クローン性(すなわち非癌)CD138形質細胞は、MM以外の癌(非MM)(n=10)を患っている癌患者からのものであった。CD19Bリンパ球は、慢性リンパ性白血病(CLL)(n=5)の患者又は健常者(n=4)からのものであった。Gadd45β mRNAレベルは、定量的リアルタイムPCR測定により診断時に決定され、それらの値はβ−アクチンに対して正規化された。MM患者対MUGS患者から得たCD138細胞中のGadd45β発現の統計的有意性は、t−スチューデント検定により非常に高い(p=0.00018)と決定された。 図2は、多発性骨髄腫を患っておりVMP(ベルケイド−メルファラン−プレドニゾン)の標準治療プロトコルで治療されている患者の群における無増悪生存曲線を示す。患者は、定量的リアルタイムPCR測定による彼らのCD138細胞中のGadd45β発現が低又は中/高のいずれであるかにより区分されている。 58人の多発性骨髄腫の患者が、診断時に得られたGadd45βのmRNA値によって3つのグループに分けられた。カットオフ値は、33%と66%を用いて識別された。よって、全患者を、Gadd45β mRNAの低レベル、中レベル及び高レベルをもつ均等な患者数からなる3つのサブグループに分けた。カプラン・マイヤー法を用いて無増悪生存期間(PFS)を推定し、曲線同士の差をログランク検定により解析した。 結果として、低発現のグループと、中/高発現を合わせたグループとの間にPFSにおける差が現れ、低Gadd45β mRNAレベルの患者は、他のグループに比べて良好な結果であった。 図3は、Gadd45β阻害剤による死滅に対する感受性とGadd45β発現レベルの間の腫瘍細胞株における相関を示している。(A)の上枠は、29個の癌細胞株の枠におけるGadd45βの発現(定量的リアルタイムPCRにより測定)を示しているのに対し、下枠は、特定のGadd45β阻害剤である”Z−DTP2”(D配置のアミノ酸を伴うTyr−Glu−Arg−Pheシーケンスを有しかつC末端にてNH基に結合しN末端にてベンジルオキシカルボニル基に結合したテトラペプチド)10μMによる144時間の処理後の同じ細胞株における細胞死の割合([3H]チミジン取り込みにより測定)を示している。(B)は、Gadd45β発現と細胞死の相関を示す。2つのパラメータ間の相関係数の有意性はp<0.01(GraphPadソフトウェアにより計算されたピアソン相関)である。 図4は、Gadd45β発現と、初代培養造血細胞中のmDTP3上のGadd45β/MK7阻害剤の細胞障害活性との相関を示す。(A)の上枠は、健常者から得た末梢血単核細胞(PBMC)及び多発性骨髄腫(MM)の患者(n=9)又はワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症(WM)の患者(n=2)から得たCD138造血細胞の中のGadd45β発現を示す。下枠は、初代培養細胞中の50%(IC50)細胞死を誘発する化合物mDTP3の平均濃度を示す。形質細胞(すなわちCD138)は、抗CD138磁性マイクロビーズ(Miltenyi Biotech GmbH、ドイツ)を用いて精製し、細胞の純度は、フローサイトメトリーにより確認した。細胞死アッセイにおいて、CD138形質細胞は、mDTP3の濃度を増加させて(すなわち0.0001、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1.3、10μΜ)48時間処理した。PBMCは、100μΜのmDTP3で144時間処理した。IC50値は、細胞生存率アッセイにより決定した。Gadd45β発現値は、エンドゲン対照(すなわち18SリボソームRNA)に対して正規化した。値は、平均±標準偏差を示す。(B)は、Gadd45β発現対mDTP3 IC50値の相関プロットを示す。図示の通り、非癌細胞中のmDTP3細胞障害の欠如は、これらの細胞中の低Gadd45β発現の統計的有意性と相関する。2つのパラメータのドメイン間の相関係数の有意性は高く(p=0.017)、初代培養MM細胞中のmDTP3の高い標的特異性を確認するものである。
本発明の第1の態様によれば、血液悪性腫瘍又はその疑いのある被験者から得た細胞試料中のGadd45β発現レベルを測定するステップを含むGadd45β発現の測定方法が提供される。
[血液悪性腫瘍]
本発明に関連する血液悪性腫瘍としては、リンパ腫や白血病があり得る。所与の実施形態によれば、本発明は血液悪性腫瘍に関連し、当該腫瘍は、次の群中の1又は複数のものである。
1.リンパ腫
2.白血病
3.成熟B細胞悪性腫瘍
4.成熟T細胞悪性腫瘍
5.成熟ナチュラルキラー細胞悪性腫瘍
6.ホジキンリンパ腫
7.慢性リンパ性白血病
8.急性リンパ性白血病
9.慢性骨髄性白血病
10.急性骨髄性白血病
所与の好適な実施形態によれば、本発明は次の郡中の1つに該当する血液悪性腫瘍に関連することがあり得る。
1.バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DCBCL)T細胞白血病、急性骨髄性白血病(AML)、急性リンパ性白血病(ACL)、多発性骨髄腫(MM)、マントル細胞リンパ腫、MALTリンパ腫、ホジキンリンパ腫(HL)、白血病、成人T細胞白血病、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、皮膚T細胞リンパ腫、骨髄異形成症候群及びプロモノリティック白血病
2.プロモノリティック白血病、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、T細胞白血病、B細胞白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病(CML)
3.バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、多発性骨髄腫
4.びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、多発性骨髄腫
所与の好適な実施形態によれば、本発明はGadd45β mRNAの細胞発現の増加に関係する血液悪性腫瘍に関連する。
所与の好適な実施形態によれば、本発明は多発性骨髄腫に関連する。
[細胞の試料]
細胞の試料は、血液、リンパ液、リンパ節生検若しくは骨髄から、又は、癌細胞に浸潤されている末梢組織(例えば癌細胞に浸潤されていると判っている腎臓、脾臓若しくは骨又は他の組織)から得ることができる。所与の実施形態によれば、細胞の試料は、骨髄から得られる。”細胞の試料”の用語は、生きている細胞と死んだ細胞の両方を含み、独立した細胞及び組織内に存在している細胞の両方を含み、さらに細胞由来物質(例えば細胞物質を含む均質化細胞又は液)も含む。試料は、好適には、腫瘍細胞又は腫瘍の疑いのある細胞の物質量を含んでいるが、他の細胞も含んでいてもよい。つまり、必ずしも完全に精製することは必要ないということである。
所与の実施形態によれば、本発明の第1の態様の方法は、細胞の試料を得るステップを含む。本発明の第1の態様の他の実施形態によれば、この方法は、被験者から細胞の試料を得るステップを含まない。すなわち、この方法は被験者から予め得た試料に対して実施されるということである。
[被験者]
被験者は、好適には、人間被験者である。従って、本明細書は、人間被験者を診断し、予後を見通し、そして治療するという文脈で読まれることが好適である。
血液悪性腫瘍が疑われる被験者は、病気の兆候や診断症状を理由として悪性腫瘍を有するのではないかと疑われる。例えば、多発性骨髄腫を疑われる被験者は、高い血漿カルシウム、腎臓の問題や腎不全、貧血、骨病変及び/又は骨痛を有することがある。多発性骨髄腫と判っている被験者は、クローン性形質細胞又はMタンパク質の検出によって診断されている場合がある。
[試料処理]
被験者から得た細胞の試料は、Gadd45β発現レベルを測定する前に調製することができる。例えば、細胞を、殺菌し、精製し、固定し、又は保存することがある。細胞の試料が組織試料である場合、その組織を粉砕する、例えば、その中の細胞をばらばらにすることがある。当初得られた試料を特定の細胞サブセットについて濃縮することができる。その細胞サブセットは、通常、癌又は癌の疑いの有る細胞のサブセットである。細胞サブセットを選択するために適切な細胞マーカーを用いてもよい。多発性骨髄腫に関する本発明の態様の場合、CD138が適切な細胞マーカーとなり得る。濃縮プロセスにおける細胞サブセットの選択には、任意の適切な方法を用いてよい。例えば、CD138細胞は、蛍光活性化細胞選別又は磁気細胞選別などの細胞選別法により選択することができる。このような方法は、他の細胞型特異的表面マーカーを用いた細胞サブセットの選択にも適用可能である。別の方法として、高速乗算細胞として細胞試料を濃縮することにより細胞を調製してもよい。高速乗算細胞は、一定期間、増殖培地で試料を培養することにより濃縮することができる。
所与の実施形態においては、Gadd45β発現レベルを測定できるように細胞を壊したり溶解したりすることが必要となる。例えば、細胞は、核酸またはタンパク質の抽出及び調製方法に供されてもよい。
[診断における本発明の使用]
所与の実施形態においては、本発明の第1の態様である方法は、診断に有用な情報の提供を含む。場合によっては、この方法は、診断を行うステップを含むことができる。他の場合、診断を行うステップは、特許請求の方法から除外される。
好適には、(核酸、タンパク質又は活性レベルにおいて)高いGadd45β発現の測定は、血液悪性腫瘍をもつ被験者を示す。血液悪性腫瘍は、[血液悪性腫瘍]の見出しにおいて上記した通り定義することができる。
所与の実施形態においては、血液悪性腫瘍は多発性骨髄腫である。
所与の実施形態においては、本発明の方法は、その他の疾患(例えばMGUS)に対する多発性骨髄腫の判別診断に有用な情報の提供を含む。
[Gadd45βレベルの評価]
細胞の試料中のGadd45β発現レベルは、mRNA発現レベル、タンパク質発現レベル、又は発現したGadd45βタンパク質活性のレベルでもよい。
mRNA発現レベルの決定のために任意の方法を使用することができる。例えば、核酸増幅技術(例えば、利用可能な定量的及び半定量的リアルタイムPCRの多様なバージョン)又は定量的又は半定量的ハイブリダイゼーション技術である。
タンパク質発現レベルの決定のために任意の方法を使用することができる。例えば、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、タンパク質アレイ、RIA及びELISA等のイムノアッセイを用いてもよい。
発現したGadd45βタンパク質活性を決定するために任意の方法を使用することができる。適切な方法は、酵素アッセイ(例えば、リン酸化アッセイ)及び結合アッセイが挙げられる。Gadd45β活性は、直接的(例えば、その結合活性を測定することにより)又は間接的(例えば、Gadd45βにより活性化した細胞シグナル伝達タンパク質であるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ7(MKK7)のリン酸化又は活性を測定することにより)測定することができる。
Gadd45β発現レベルは、相対的又は絶対的に測定することができる。絶対発現レベルが使用される場合、測定値は、それらが上昇しているかどうかを判断するためにしきい値と比較することができる。あるいは、それらを同時に測定することができるか、または予め測定された対照試料中のレベルと比較して測定することができる。
種々の対照試料を使用することができる。限定しないが、対照試料には細胞株を含む(例えば多発性骨髄腫又はそれが疑われる被験者から得た試料中のレベルを、多発性骨髄腫細胞株(例えばU266)中のレベルと比べて測定でき、かつ/又は、非多発性骨髄腫細胞株中のレベルと比べて測定できる)。
別の方法として、対照試料を健常者から得てもよい。
別の方法として、Gadd45β発現レベルは、血液悪性腫瘍を有していると疑われると診断された他の被験者又は他の被験者の群と比べて測定してもよい。
所与の実施形態において、この方法は、特定の血液悪性腫瘍(例えば多発性骨髄腫)を診断するためのものである。それは、測定されたGadd45β発現レベルが、健常な1又は複数の別の被験者の群から得た細胞において予め測定されたGadd45β発現レベルに対応するGadd45β発現レベルを含むデータセットと比較されたときに、細胞の試料が高いGadd45β発現レベルを示す場合である。別の方法として、1又は複数の別の被験者は、特定の血液悪性腫瘍(例えば多発性骨髄腫)を有すると判っている別の被験者でもよい。
通常、細胞の試料が健常者から得た試料に比べて高いGadd45β発現レベルを示したとき、又は、細胞の試料が血液悪性腫瘍と判っている被験者から得た試料に見られるものと同程度のGadd45β発現レベルを示したとき、血液悪性腫瘍と診断される。
本発明の診断の態様は、実施例1及び図1により示される。それらは、多発性骨髄腫である患者から得たCD138陽性細胞が、MGUS、CLLの患者及び健常者から得たB細胞又は形質細胞(例えばCD138又はCD19細胞)の試料におけるよりも高いGadd45β発現を示す可能性が高いことを示している。
[予後の決定における本発明の方法の使用]
特定の血液悪性腫瘍(例えば多発性骨髄腫)を診断する際に使用することに加えて、本発明の方法は、既に血液悪性腫瘍と診断された(この診断は本発明の方法の使用によるものでも、別の方法、例えば骨髄組織病理又は形質細胞や尿中のMタンパク質の検出により多発性骨髄腫と診断されたものでもよい)被験者の予想される予後の指標を提供するために用いることもできる。
通常、このようなアプローチは、それ以前に同じ特定の血液悪性腫瘍と診断された他の被験者と比べて相対的に高い又は相対的に低いというように、被験者から得られた細胞で測定されたGadd45β発現レベルを(例えば、2又はそれ以上の領域にその発現を割り当てることにより)分類することを含む。
例えば、測定されたGadd45β発現レベルを、それ以前に多数(例えば10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、500、750又は1000)の別の被験者から得た対応する細胞で測定された対応するGadd45β発現レベルを含むデータセットと比較してもよい。その場合、それらの別の被験者は、特定の血液悪性腫瘍であると判っておりかつGadd45β発現レベルが相対的に高いか相対的に低いと分類されている。
別の方法として、適用可能な特定の悪性腫瘍及び適切な細胞型についてのGadd45β発現の基準レベルと比較することにより、特定の悪性腫瘍について相対的に高い又は相対的に低いというように、Gadd45β発現レベルを分類してもよい。
相対的に高い又は相対的に低いというGadd45β発現レベルの分類は、被験者の予後を予測するために(例えば、生存率若しくは無増悪生存率の予測又は今後のタイムスケール上の特定の症状若しくは症状の重症度の可能性の指標を提供するために)用いることができる。通常、相対的に高い発現レベルは、比較的不良の予後を予測し、相対的に低い発現レベルは比較的良好な予後を予測する。
本発明の予後予測の態様は、実施例2及び図2を参照して説明される。それによれば、診断上多発性骨髄腫とされる相対的に高いGadd45β発現を有する患者は、診断上相対的に低いGadd45β発現を有する患者よりも、その後のフォローアップ期間中に疾患の悪化を呈する可能性が高いことが示されている。
[テラノスティックへの適用における本発明の方法の使用]
予測される予後の指標は、当該患者における適切な治療を選択するために用いることができる。一般に、より悲観的な予後はより積極的な治療を示唆するものであるが、さほど効果の無い治療と組み合わされた予後不良が、ほとんど又は全く何もしない治療の副作用の回避のためだけに、死亡リスク低減法による緩和ケアを提供する決定へと誘導してしまうという状況がある。
所与の実施形態によれば、本発明の方法は、適切な治療を選択するために予後情報を用いるステップを含む。
所与の実施形態によれば、相対的に高いGadd45β発現レベルの指標は、Gadd45β阻害剤(例えばGadd45β発現、活性又はシグナル伝達の阻害剤)及び/又はNF−kBの阻害剤を用いた特定の血液悪性腫瘍(例えば多発性骨髄腫)の治療を示すために用いることができる。必要に応じて、相対的に低いGadd45β発現の指標は、別の(非Gadd45β阻害剤による)治療を示してもよい。
もちろん、どのような治療が示されたとしても、Gadd45β阻害剤であれ別の治療であれ、それらの治療は、治療プロトコル及び/又は臨床的判断により示されるような他の治療(例えば外科手術、化学療法、免疫療法又は放射性療法)と組み合わせて提供することができる。
好適には、相対的に高いGadd45β発現レベルは、Gadd45βに特異なGadd45β阻害剤による治療を示す。
[Gadd45β阻害剤]
多数の特定のGadd45β阻害剤が、特許文献1で論じられており、単に例示としてそれらを以下に開示する。出願人は、以下において特に開示されたGadd45β阻害剤を利用することを、本発明のテラノスティック態様の実施形態と考えている。本発明のテラノスティック態様に関係する以下に特に開示された阻害剤は、特許請求の範囲で権利要求することについても、又は、権利否定することについても、それらの権利が保持されている。
Gadd45β阻害剤は、式Iの化合物とすることができる。
式I: X−A−X
上記式Iにおいて、
Aは、A””であるか、又は、A”−[M−A’−]M−A”’である。
A””は、A”、A’”又はZ−Y−Y−Zである。ここで、Y−Yはオリゴペプチド部分又はY−Y残基を有するオリゴペプトイド部分であり、ZはY−YのN末端窒素に結合し、ZはY−YのC末端炭素に結合している。
A”は、A’であるか、又は、Y−Y−Y−Zである。ここで、Y−Y−Yはオリゴペプトイド部分又はY−Y−Y残基を含むオリゴペプトイド部分であり、ZはY−Y−YのC末端炭素に結合している。
A’”は、A’であるか、又は、Z−Y−Y−Yである。ここでY−Y−Yは,オリゴペプトイド部分又はY−Y−Yの残基を含むオリゴペプトイド部分であり、ZはY−Y−YのN末端窒素に結合している。
それぞれのA’は、個々に独立して、オリゴペプチド部分、又はY−Y−Y−Y残基を含むオリゴペプトイド部分である。
nは0から18の整数である。
及びYは、個々に独立して、芳香族側鎖を有するアミノ酸残基又はアミノ酸誘導体残基である。所与の実施形態においては、各側鎖が、1個から3個までの炭素のアルキレン基を有する。この1個から3個までの炭素のアルキレン基は、5員から10員までの炭素環式又は複素環式芳香族基により1回又は2回置換されており、かつ必要に応じてさらに1個から4個までの炭素のアルキルにより置換されている。ここでの芳香族は、必要に応じて、ヒドロキシル基、ハロゲン又はC1からC4までのアルキル基若しくはC1からC4までのアルコキシ基から選択された少なくとも1つの置換基により置換されている。
は無いか又はアミノ酸残基若しくはアミノ酸誘導体である。L配置又D配置の20個の天然アミノ酸のいずれかが好適であり、及び/又は、pH7水溶液中で好適には負電荷をもつ側鎖を有するアミノ酸残基又はアミノ酸誘導体残基が好適である。
はアミノ酸残基又はアミノ酸誘導体である。L配置又D配置の20個の天然アミノ酸のいずれかが好ましく、及び/又は、pH7水溶液中で好適には負電荷をもつ側鎖を有するアミノ酸残基又はアミノ酸誘導体残基が好ましい。
所与の実施形態においてY及びYの双方とも存在する場合、Y及びYは、好適にはその側鎖の正と負の各電荷間に塩橋が形成できることが好ましく、かつ/又は、YとY、XとX、XとY若しくはYとXの芳香族中心間の距離が10又は20オングストロームより大きくなくかつ3オングストロームより小さくないことが好ましい。Y及びYの側鎖は30原子を超えないことが好ましい。Y及びYは天然に生じたアミノ酸でもよく、又は、L配置又はD配置のN−メチル−アミノ酸でもよい。
は、式IIの基である。
Figure 2014519315
式IIの基は、YのN末端窒素に結合している。
Wは無いか又は酸素、窒素若しくは1個から3個までの炭素のアルキレン基である。ここで1個から3個までのアルキレン基は、必要に応じて、少なくとも1個の置換基により置換されている。この置換基は1個から4個までの炭素のアルキル基又は5員から10員までの炭素環式若しくは複素環式芳香族基である。
Jは、5員から10員までの炭素環式又は複素環式芳香族基である。ここで芳香族基は、必要に応じて、少なくとも1つの置換基で置換されている。この置換基はヒドロキシル、ハロゲン、1個から4個までの炭素のアルキル基又は1個から4個までの炭素のアルコキシ基から選択される。
は、式IIIの基を表す。
Figure 2014519315
この基は、YのC末端炭素に結合している。
Rは、水素又は1個から4個までの炭素のアルキル基である。
W’は無いか又は1個から3個までの炭素のアルキレン基である。ここで1個から3個までのアルキレン基は、必要に応じて、1個から4個までの炭素のアルキル基又は5員から10員までの炭素環式若しくは複素環式芳香族基から選択された少なくとも1つの置換基により置換されている。
J’は3員から10員までの脂肪族炭素環式基又は5員から10員までの炭素環式若しくは複素環式芳香族基である。ここで脂肪族基又は芳香族基は、必要に応じて、ヒドロキシル基、ハロゲン、1個から4個までの炭素のアルキル基又は2個から4個までの炭素のアルコキシ基から選択された少なくとも1つの置換基により置換されている。
Mは、先のオリゴペプチド部分又はオリゴペプトイド部分(A’、A”、A’”)と、次のオリゴペプチド部分又はオリゴペプトイド部分(A’、A”、A’”)との間のペプチド結合である。あるいはMは、先のオリゴペプチド部分又はオリゴペプトイド部分(A’、A”、A’”)の末端炭素基にアミド結合、エステル結合、エーテル結合又はチオエーテル結合を介して結合しかつ次のオリゴペプトイド結合(A’、A”、A’”)の末端アミノ基にアミド結合、エステル結合、エーテル結合又はチオエーテル結合を介して結合したリンカー部分である。
は無いか又は遊離アミノ基をブロッキングするためにAのアミノ末端に付加された部分である。
は無いか又は遊離カルボキシル基をブロッキングするためにAの炭素末端に付加された部分である。
所与の実施形態においては、Wは無いか又は1個から3個までの炭素のアルキレン基である。
好適にはX及びXは、AがZを有する場合にXが無くかつAがZを有する場合にXが無い(すなわち、分子の末端に遊離アミノ基又は遊離カルボキシル基が無い場合はXとXが必要無い)という条件下において、原子が30個を超えない(又は、より好適には20個を超えない、又は10個を超えない)部分である。
またはX及びXは、上記部分の誘導体であり、それらの誘導体は、次の群から選択される。
a)式Iの化合物の分子のオリゴマー又はマルチマー(多量体)であって、2個又はそれ以上の式Iの化合物の分子を有し、その各々が、式Iの化合物の分子に存在するアミノ酸基又はカルボン酸基と、少なくとも2個のアミド結合中に関与する骨格部分上の対向するアミノ酸基又はカルボン酸基との間のアミド結合を介して共通骨格部分に結合されているオリゴマー又はマルチマー。
b)式Iの化合物の分子又は上記a)で定義されたそれらのオリゴマー若しくはマルチマーを有する誘導体であって、アミド結合、エステル結合、エーテル結合又はチオエーテル結合を介して次のものと結合した誘導体。
PEG、PEG系化合物、細胞透過性ペプチド、蛍光染料、ビオチン若しくは他のタグ部分、脂肪酸、離散的サイズのナノ粒子、又は、金属イオン若しくは放射性イオンとのキレート配位子錯体
c)式Iの化合物の分子又は上記a)で定義されたそれらのオリゴマー若しくはマルチマーを有する誘導体であって、アミド化、グリコシル化、カルバミル化、アシル化、硫酸化、リン酸化、環化、脂質化、ペグ化、又は、融合ペプチド若しくは融合ペプトイドを形成するためのペプチド若しくはペプトイドの融合パートナーに対するリンケージにより修飾されている誘導体。
d)式Iの化合物又は上記a)若しくはb)で定義されたそれらの誘導体の分子の、塩及び溶媒和物。
所与の実施形態においてYは、
D−トリプトファン、
L−トリプトファン、
D−チロシン、
L−チロシン、
D−3,3−ジフェニルアラニン、
L−3,3−ジフェニルアラニン、
D−H−3−(4−ピリジル)アラニン、
L−H−3−(4−ピリジル)アラニン、
D−H−3−(3−ピリジル)アラニン、
L−H−3−(3−ピリジル)アラニン、
D−H−3−(2−ピリジル)アラニン、
L−H−3−(2−ピリジル)アラニン、
D−2−アミノ−4−フェニル酪酸、
L−2−アミノ−4−フェニル酪酸、
D−H−4−ヒドロキシフェニルグリシン、
L−H−4−ヒドロキシフェニルグリシン、
D−3−(2−フリル)アラニン、
L−3−(2−フリル)アラニン、
L−ホモフェニルアラニン、
D−ホモフェニルアラニン、
D−3−(4−キノリル)アラニン、
L−3−(4−キノリル)アラニン、
D−ナフチルアラニン、
L−ナフチルアラニン、
p−ヒドロキシ安息香酸、
p−ヒドロキシフェニル酢酸、
3−(p−ヒドロキシフェニル)−プロピオン酸、
又は上記いずれかのL配置又はD配置のN−メチル誘導体である。
あるいはYは,
D−フェニルアラニン、
L−フェニルアラニン、
D−トリプトファン、
L−トリプトファン、
D−チロシン、
L−チロシン、
D−3,3−ジフェニルアラニン、
L−3,3−ジフェニルアラニン、
D−H−3−(4−ピリジル)アラニン、
L−H−3−(4−ピリジル)アラニン、
D−H−3−(3−ピリジル)アラニン、
L−H−3−(3−ピリジル)アラニン、
D−H−3−(2−ピリジル)アラニン、
L−H−3−(2−ピリジル)アラニン、
D−2−アミノ−4−フェニル酪酸、
L−2−アミノ−4−フェニル酪酸、
D−フェニルグリシン、
L−フェニルグリシン、
D−H−4−ヒドロキシフェニルグリシン、
L−H−4−ヒドロキシフェニルグリシン、
D−3−(2−フリル)アラニン、
L−3−(2−フリル)アラニン、
L−シクロヘキシルアラニン、
D−シクロヘキシルアラニン、
L−ホモフェニルアラニン、
D−ホモフェニルアラニン、
D−3−(4−キノリル)アラニン、
L−3−(4−キノリル)アラニン、
D−ナフチルアラニン
又はL−ナフチルアラニンでもよい。
所与の実施形態においては、Yが無いか又は、
D−グルタミン酸、
L−グルタミン酸、
D−アスパラギン酸、
L−アスパラギン酸、
L−ロイシン、
D−ロイシン、
L−グルタミン、
D−グルタミン、
L−メチオニン、
D−メチオニン、
D−2−アミノヘプタン二酸、
L−2−アミノヘプタン二酸、
これらのいずれかのメチルエステル又はエチルエステル、
L−ホモセリン、
D−ホモセリン、
又は上記いずれかのL配置又はD配置のN−メチル誘導体である。
別の例としてYは、
D−グルタミン酸、
L−グルタミン酸、
D−アスパラギン酸、
L−アスパラギン酸、
D−2−アミノヘプタン二酸、
L−2−アミノヘプタン二酸、
これらのいずれかのメチルエステル又はエチルエステル、
L−ホモセリン、
又はD−ホモセリンであってもよい。
所与の実施形態においてはYは、
D−アルギニン、
L−アルギニン、
L−プロリン、
D−プロリン、
D−ヒスチジン、
L−ヒスチジン、
D−リジン、
D−α,β−ジアミノプロピオン酸(D−Dap)、
L−α,β−ジアミノプロピオン酸(L−Dap)、
L−α,δ−ジアミノ酪酸(L−Dab)、
D−α,δ−ジアミノ酪酸(D−Dab)、
L−オルニチン、
D−オルニチン、
L−リジン、
又は上記いずれかのL配置又はD配置のN−メチル誘導体である。
別の例としてYは、
D−アルギニン、
L−アルギニン、
D−ヒスチジン、
L−ヒスチジン、
D−リジン、
D−α,β−ジアミノプロピオン酸(D−Dap)、
L−α,β−ジアミノプロピオン酸(L−Dap)、
D−α,δ−ジアミノ酪酸(D−Dab)、
L−α,δ−ジアミノ酪酸(L−Dab)、
L−オルニチン、
D−オルニチン、
又はL−リジンであってもよい。
所与の実施形態においてYは、
D−フェニルアラニン、
L−フェニルアラニン、
D−トリプトファン、
L−トリプトファン、
D−チロシン、
L−チロシン、
D−3,3−ジフェニルアラニン、
L−3,3−ジフェニルアラニン、
D−H−3−(4−ピリジル)アラニン、
L−H−3−(4−ピリジル)アラニン、
D−H−3−(3−ピリジル)アラニン、
L−H−3−(3−ピリジル)アラニン、
D−H−3−(2−ピリジル)アラニン、
L−H−3−(2−ピリジル)アラニン、
D−2−アミノ−4−フェニル酪酸、
L−2−アミノ−4−フェニル酪酸、
D−フェニルグリシン、
L−フェニルグリシン、
D−H−4−ヒドロキシフェニルグリシン、
L−H−4−ヒドロキシフェニルグリシン、
D−3−(2−フリル)アラニン、
L−3−(2−フリル)アラニン、
L−ホモフェニルアラニン、
D−ホモフェニルアラニン、
D−3−(4−キノリル)アラニン、
L−3−(4−キノリル)アラニン、
D−ナフチル−アラニン、
L−ナフチル−アラニン、
これらのL配置又はD配置のN−メチル誘導体、
アニリン、
ベンジルアミン、
又は2−フェニルエチルアミンである。
別の例としてYは、
D−フェニルアラニン、
L−フェニルアラニン、
D−トリプトファン、
L−トリプトファン、
D−チロシン、
L−チロシン、
D−3,3−ジフェニル−アラニン、
L−3,3−ジフェニル−アラニン、
D−H−3−(4−ピリジル)アラニン、
L−H−3−(4−ピリジル)アラニン、
D−H−3−(3−ピリジル)アラニン、
L−H−3−(3−ピリジル)アラニン、
D−H−3−(2−ピリジル)アラニン、
L−H−3−(2−ピリジル)アラニン、
D−2−アミノ−4−フェニル酪酸、
L−2−アミノ−4−フェニル酪酸、
D−フェニルグリシン、
L−フェニルグリシン、
D−H−4−ヒドロキシフェニルグリシン、
L−H−4−ヒドロキシフェニルグリシン、
D−3−(2−フリル)アラニン、
L−3−(2−フリル)アラニン、
L−シクロヘキシルアラニン、
D−シクロヘキシルアラニン、
L−ホモフェニルアラニン、
D−ホモフェニルアラニン、
D−3−(4−キノリル)−アラニン、
L−3−(4−キノリル)−アラニン、
D−ナフチル−アラニン
又はL−ナフチル−アラニンであってもよい。
所与の好適な実施形態においては、Y、Y、Y及びYは全て上述した通りである。
所与の実施形態においては、Y及びYが以下であるという条件でY、Y、Y及びYが全て上述した通りである。その条件においてYは、
D−グルタミン酸、
L−グルタミン酸、
D−アスパラギン酸、
L−アスパラギン酸、
D−2−アミノヘプタン二酸、
L−2−アミノヘプタン二酸、
これらのいずれかのメチルエステル又はエチルエステル;
L−ホモセリン、
L−ロイシン
D−ロイシン
L−グルタミン
D−グルタミン
L−メチオニン
D−メチオニン
D−ホモセリン、
又は上記いずれかのL配置又D配置のN−メチル誘導体であり、かつ、Yは、
D−アルギニン、
L−アルギニン、
D−ヒスチジン、
L−ヒスチジン、
D−リジン、
L−リジン、
L−プロリン、
D−プロリン、
D−α,β−ジアミノプロピオン酸(D−Dap)、
L−α,β−ジアミノプロピオン酸(L−Dap)、
D−α,δ−ジアミノ酪酸(D−Dab)、
L−α,δ−ジアミノ酪酸(L−Dab)、
D−オルニチン
L−オルニチン
又は上記のいずれかのL配置又はD配置のN−メチル誘導体である。
所与の実施形態においては、Y及びYは双方とも上述した通りであるが、Y及びYの双方又は一方が無い。所与の実施形態においてはMがペプチド結合である。
所与の実施形態においては、Xは水素であるか、又は、Xは、アミノ結合を形成するためにオリゴペプチド配列のアミノ末端に付加された、次の群の1つである。当該群は、
アセチル基、
ベンジルオキシカルボニル基、
2−クロロベンジルオキシカルボニル基、
3−メトキシ−3,4−ヒドロキシベンゾイル基、
3−ヒドロキシ−3,4−メトキシ−ベンゾイル基、
ベンゾイル基、
又はフルオレニルメトキシカルボニル基からなる。
はヒドロキシル基であるか、又は、Xは、アミノ結合を形成するためにオリゴペプチド配列のカルボニル酸末端に付加された、次の群の1つである。当該群は、
アミン、
D−フェニルアラニン、
L−フェニルアラニン、
D−トリプトファン、
L−トリプトファン、
D−チロシン、
L−チロシン、
D−3,3−ジフェニルアラニン、
L−3,3−ジフェニルアラニン、
D−H−3−(4−ピリジル)アラニン、
L−H−3−(4−ピリジル)アラニン、
D−H−3−(3−ピリジル)アラニン、
L−H−3−(3−ピリジル)アラニン、
D−H−3−(2−ピリジル)アラニン、
L−H−3−(2−ピリジル)アラニン、
D−2−アミノ−4−フェニル酪酸、
L−2−アミノ−4−フェニル酪酸、
D−フェニルグリシン、
L−フェニルグリシン、
D−H−4−ヒドロキシフェニルグリシン、
L−H−4−ヒドロキシフェニルグリシン、
D−3−(2−フリル)アラニン、
L−3−(2−フリル)アラニン、
L−シクロヘキシルアラニン、
D−シクロヘキシルアラニン、
L−ホモフェニルアラニン、
D−ホモフェニルアラニン、
D−3−(4−キノリル)アラニン、
L−3−(4−キノリル)アラニン、
D−ナフチルアラニン
L−ナフチルアラニン
又は上記いずれかのL配置又はD配置のN−メチル誘導体からなる。
所与の実施形態においては、Z、Y、Y及びZは次の通りである。
は、
4−ヒドロキシベンゾイル基、
(4−ヒドロキシ−フェニル)アセチル基、
3−(4−ヒドロキシ−フェニル)プロピオニル基、
ベンゾイル基、
ベンジルオキシカルボニル基、
2−フェニル−アセチル基、
3−フェニル−プロピオニル基、
3、3−ジフェニル−プロピオニル基、
3−(1H−インドール−3−イル)プロピオニル基、
(1H−インドール−3−イル)アセチル基、
フラン−2−イル−アセチル基、
フラン−3−イル−アセチル基、
3−ピリジン−4−イル−プロピオニル基、
3−ピリジン−3−イル−プロピオニル基、
3−ピリジン−2−イル−プロピオニル基、
3−ピリミジン−4−イル−プロピオニル基、
3−ピリダジン−4−イル−プロピオニル基、
3−[1,3,5]トリアジン−2−イル−プロピオニル基、
2−ピリジン−4−イル−アセチル基、
2−ピリジン−3−イル−アセチル基、
2−ピリジン−2−イル−アセチル基、
2−ピリミジン−4−イル−アセチル基、
2−ピリダジン−4−イル−アセチル基、
2−[1,3,5]トリアジン−2−イル−アセチル基、
ナフタレン−1−イル−アセチル基、
ナフタレン−2−イル−アセチル基、
2−ナフタレン−1−イル−プロピオニル基、
又は2−ナフタレン−2−イル−プロピオニルである。
は、
D−グルタミン酸、
L−グルタミン酸、
D−アスパラギン酸、
L−アスパラギン酸、
L−ロイシン、
D−ロイシン、
L−グルタミン、
D−グルタミン、
L−メチオニン、
D−メチオニン、
D−2−アミノヘプタン二酸、
L−2−アミノヘプタン二酸、
これらのいずれかのメチルエステル又はエチルエステル、
L−ホモセリン、
D−ホモセリン、
又は上記のいずれかのL又はD配置のN−メチル誘導体である。
は、
D−アルギニン、
L−アルギニン、
D−ヒスチジン、
L−ヒスチジン、
L−プロリン、
D−プロリン、
D−リジン、
L−リジン、
D−α,β−ジアミノプロピオン酸(D−Dap)、
L−α,β−ジアミノプロピオン酸(L−Dap)、
D−α,δ−ジアミノ酪酸(D−Dab)、
L−α,δ−ジアミノ酪酸(L−Dab)、
D−オルニチン、
L−オルチニン、
又は上記のいずれかのL配置又はD配置のN−メチル誘導体である。
は、
フェニルアミン、
ベンジルアミン、
フェネチルアミン、
シクロヘキシルアミン、
2−シクロヘキシルエチルアミン、
3−シクロヘキシルプロピルアミン、
4−(2−アミノエチル)フェノール、
4−アミノ−フェノール、
4−アミノメチル−フェノール、
1H−インドール−3−イル−アミン、
2−(1H−インドール−3−イル)エチルアミン、
C−(1H−インドール−3−イル)メチルアミン、
2,2−ジフェニル−エチルアミン、
2,2−ジピリジン−4−イル−エチルアミン、
2−ピリジン−4−イル−エチルアミン、
2−ピリジン−3−イル−エチルアミン、
2−ピリジン−2−イル−エチルアミン、
2−ピリミジン−4−イル−エチルアミン、
2−[1、3、5]トリアジン−2−イル−エチルアミン、
C−フラン−2−イル−メチルアミン、
C−フラン−3−イル−メチルアミン、
又はC−ナフタレン−2−イル−メチルアミンである。
慣例の通り、全てのペプチド及びペプトイドとそれらの領域は、N末端からC末端へと記載している。
nは、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17又は18でもよい。所与の好適例において、n=0である。
所与の好適例においてAはA’である。このような例において、化合物は本質的に、1又はそれ以上の末端で必要に応じてブロッキング基XとXを有するテトラペプチド、トリペプチド又はジペプチド(又は対応するペプトイド)である。
<オリゴペプチド>
オリゴペプチドは、αアミノ酸(本明細書では単に“アミノ酸”と称する)の縮合により形成された短いポリマーである。1つのアミノ酸残基と次のそれとの結合は、ペプチド結合又はアミド結合として知られている。
<アミノ酸>
本明細書中で使用される用語“アミノ酸”は、D配置とL配置の光学立体配置の両方における20個の標準的なアミノ酸(イソロイシン、アラニン、ロイシン、アスパラギン、リジン、アスパラギン酸、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン、グルタミン、トリプトファン、グリシン、バリン、プロリン、セリン、チロシン、アルギニン、及びヒスチジン)を含む。また、D配置とL配置の両方における合成αアミノ酸も含む。所与の実施形態においてはD配置が好ましい。
<アミノ酸誘導体>
本明細書中で使用されるこの用語は、N−置換グリシンを含み、これは、側鎖が(アミノ酸におけるような)α炭素ではなく、分子の主鎖に沿った窒素原子に結合するという点でαアミノ酸とは異なる。またこの用語は、αアミノ酸のメチルエステル及びエチルエステル、β−アミノ酸及びN−メチル化αアミノ酸も含む。
<オリゴペプトイド>
厳密に言えば、用語“オリゴペプチド”はαアミノ酸のオリゴマーにのみ関連する。アミノ酸誘導体(例えば、N置換グリシン)を、(全ての又はいくつかの残基位置で)組み込んだ類似オリゴマーは、オリゴペプトイドとして知られている。
<誘導体>
好適には、ここで例示されたGadd45β阻害剤の誘導体は、機能的誘導体である。用語“機能的誘導体”は、(例えば、式Iによる対応する未修飾の化合物の生理学的機能と同じであるか、又は、それに替えて機能アッセイにおけるインビトロ生理学的機能が同じであるような)同じ生理学的機能をもつ式Iの化合物の化学的誘導体を示すために用いられる。機能アッセイは例えば、本明細書中の実施形態の1つに記載されたアッセイの1つにおけるものである。
化合物の誘導体は、アミド化、グリコシル化、カルバミル化、アシル化(例えばアセチル化)、硫酸化、リン酸化、環化、脂質化、ペグ化を含む周知のプロセスにより修飾された式Iの構造を有してもよい。式Iの構造は、分子内のランダムの位置で修飾されてもよく、又は、分子内の予め決められた位置で修飾されてもよい。そして、1個、2個、3個又はそれ以上の化学部分を付加されてもよい。誘導体には、その内部でN末端NH基が別の基、例えばメトキシ基で置換された化合物も含まれる。
Gadd45β阻害剤は融合タンパク質でもよく、その場合、式Iの構造は、公知技術の方法を用いて別のタンパク質又はポリペプチド(融合パートナー)に融合させられる。いかなる適切なポリペプチド又はタンパク質(例えば血清アルブミン、炭酸脱水酵素、グルタチオンSトランスフェラーゼ、又はチオレドキシン等)も、融合パートナーとして用いることができる。好適な融合パートナーは、生体内で有害な生物活性を有していないであろう。このような融合タンパク質は、融合パートナーのカルボキシ末端を式Iの構造のアミノ末端に結合することにより、又はその逆に結合することにより形成することができる。必要に応じて、式Iの構造を融合パートナーに結合するために、切断可能なリンカーを用いてもよい。得られた切断可能な融合タンパク質は、阻害剤の活性型が放出されるように生体内で切断することができる。このような切断可能なリンカーは例えば、リンカーD−D−D−D−Y[配列番号:227]、G−P−R、A−G−G及びH−P−F−H−L[配列番号:228]を含むが、これらに限定されない。これらはそれぞれ,エンテロキナーゼ、トロンビン、ユビキチン切断酵素及びレニンによって切断することができる例えば特許文献8を参照されたい。
Gadd45β化合物は、式Iの構造をもつ生理学的な機能的誘導体であってもよい。用語”生理学的な機能的誘導体”は、本明細書では、対応する式1の非修飾化合物と同じ生理学的機能を有する式Iの化合物の化学的誘導体を意味するために用いる。例えば、生理学的な機能的誘導体は、体内で式Iの化合物に転換可能であってもよい。生理学的な機能的誘導体の例は、エステル、アミド及びカルバメートが挙げられる。
その化合物の薬学的に許容されるエステル及びアミドとしては、例えば酸基の位置などの適切な部位に結合したC1−20アルキル−、C2−20アルケニル−、C5−10アリル−、C5−10若しくはC1−20アルキル−、又は、アミノ酸−エステル若しくは−アミド、を有するものが挙げられる。適切な部分の例としては、4個から26個までの炭素原子、好ましくは5個から19個までの炭素原子をもつ疎水性置換基である。適切な脂質基としては、限定しないが、次のものが含まれる。すなわちラウロイル(C1223)、パルミチル(C1531)、オレイル(C1529)、ステアリル(C1735)、コール酸及びデオキシコール酸である。
脂肪酸誘導体をもつスルフィドリル含有化合物の脂質化のための方法は、特許文献9、特許文献10及び特許文献11に開示されている。ジスルフィド結合を介して脂肪酸に結合された阻害剤を有する、阻害剤の脂肪酸誘導体は、神経細胞及び神経組織への阻害剤の送達のために用いることができる。脂質化は、対応する非脂質化化合物の吸収率に対する当該化合物の吸収率を格段に増大させるとともに、当該化合物の血液及び組織における滞留を格段に延長させる。さらに、脂質化誘導体におけるジスルフィド結合は、細胞内で比較的不安定であるため、脂肪酸部分からの分子の細胞内放出を容易とする。適切な脂質含有部分は、4個から26個までの炭素原子、好適には5個から19個までの炭素原子をもつ疎水性置換基である。適切な脂質基としては、限定しないが、次のものが含まれる。すなわちパルミチル(C1531)、オレイル(C1529)、ステアリル(C1735)、コール酸及びデオキシコール酸塩である。
環化方法は、環化樹脂を用いたジスルフィド架橋及びヘッドトゥテイル環化の形成による環化を含む。環化ペプチドは、その立体配座の制約として安定性が増し、酵素分解に対する耐性が強化されている。環化は、非環化ペプチドがN末端システイン基を含む場合に特に好都合となり得る。適切な環化ペプチドは、モノマー又はダイマーのヘッドトゥテイル環化構造を含む。環化ペプチドは、特にジスルフィド結合の形成のために組み込まれる付加的なシステイン、又は、樹脂ベース環化のために組み込まれる側鎖のような1又は複数の付加的残基を含んでもよい。
化合物は、式Iのペグ化構造であってもよい。ペグ化阻害剤化合物は、可溶性、安定性及びポリペプチドの循環時間の向上、又は抗原性の低減という追加の利点を提供できる(特許文献12参照)。
化合物の誘導体における化学的部分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール/プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなどの水溶性ポリマーから選択されてもよい。阻害剤の誘導体化のためのポリマー部分は、任意の分子量でよく、分岐又は非分岐のいずれでもよい。例えば徐放の持続が所望されるなどの所望する治療プロファイルに応じて、生物学的活性に対する効果が有る場合のその効果に応じて、取り扱いの容易さに応じて、治療タンパク質若しくは類似のものに対するポリエチレングリコールの抗原性及び他の既知の効果の程度若しくは欠如に応じて、他の分子量のポリマーを用いてもよい。例えば、ポリエチレングリコールは、平均分子量が約200、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10,000、10,500、11,000、11,500、12,000、12,500、13,000、13,500、14,000、14,500、15,000、15,500、16,000、16,500、17,000、17,500、18,000、18,500、19,000、19,500、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000、又は100,000kDaである。
医薬における使用に適している化合物の塩及び溶媒和物は、対イオン又は関係する溶媒が薬学的に許容されるものである。しかしながら、薬学的に許容できない対イオン又は関係する溶媒を有する塩及び溶媒和物を使用してもよい。例えば、式Iの化合物及びそれらの薬学的に許容される塩又は溶媒和物の調製における中間体としての使用のためである。
適切な塩としては、有機酸、無機酸、有機塩基又は無機塩基と形成されるものを含む。薬学的に許容可能な酸付加塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、クエン酸、酒石酸、酢酸、リン酸、乳酸、ピルビン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、コハク酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、オキサロ酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−2−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸、及びイセチオン酸と形成されるものが挙げられる。シュウ酸のような他の酸は、それ自体は薬学的に許容されないが、阻害剤化合物及びそれらの薬学的に許容される塩を得る際の中間体としては有用であり得る。塩基をもつ薬学的に許容可能な塩は、アンモニウム塩、例えばカリウム塩およびナトリウム塩のようなアルカリ金属塩、例えばカルシウム塩およびマグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、並びに、例えばジシクロヘキシルアミン及びN−メチル−D−グルコミンのような有機塩基との塩である。
有機化学分野の当業者は、多くの有機化合物が、それらがその中で反応させられたりその中から沈殿若しくは結晶化させられたりする溶媒との錯体を形成可能であることは理解できよう。このような錯体は、”溶媒和物”として知られている。例えば、水との錯体は”水和物”として知られている。
所与の好適な実施形態においては、化合物の、人間の循環系における半減期は少なくとも0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、??9、10、11時間であるか又は最も好ましくは少なくとも12時間である。
好ましくは、化合物は、インビトロ結合アッセイにおいて評価されるGadd45β及び/又はMKK7(及び/又は両方に関係)に対し結合する能力の少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90%を保持することが好ましく、又は最も好ましくは99%を保持する。あるいは、化合物は、通常のヒト血清中で24時間37℃にて培養した後のインビトロ競合結合アッセイにおいて評価されるGadd45βのMKK7との相互作用を阻害する能力の少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90%を保持することが好ましく、又は最も好ましくは99%を保持する。
これに替えて又は追加して、化合物は、次の活性のうち少なくとも1つを有する。
a)実施例に記載したアッセイ条件下にてMKK7のGadd45βとの相互作用を少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90%阻害し、又は最も好ましくは99%阻害する能力。
b)U266、KMS−11、NCI−H929、ARH−77、JJN−3、KMS−12、KMS−18、及びKMS−27からなる群から選択されたヒト骨髄腫細胞株の培地中の細胞のうち、又は、DLBCL細胞株LY−3の培地中の細胞のうち、又は、プロ単球細胞株U937の培地中の細胞のうち、又は、バ−キットリンパ腫細胞細胞株BJABの培地中の細胞のうち、又は、原発腫瘍細胞(例えば一次多発性骨髄腫腫瘍細胞)の培地中の細胞のうち、T細胞株JURKATの少なくとも90%が死滅しない条件下にて少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90%の細胞を死滅させ、又は最も好ましくは99%の細胞を死滅させるインビトロでの能力。
所与の好適な実施形態においては、式IにおいてAで識別される、化合物のオリゴペプチドのコア部分は、次の群から選択されたアミノ酸配列を有する。
(L−Tyr)−(L−Asp)−(L−His)−(L−Phe)[配列番号:2]
(L−Tyr)−(L−Glu)−(L−Arg)−(L−Phe)[配列番号:3]
(L−Tyr)−(L−Glu)−(L−His)−(L−Phe)[配列番号:4]
(L−Trp)−(L−Asp)−(L−His)−(L−Phe)[配列番号:5]
(L−Trp)−(L−Glu)−(L−His)−(L−Phe)[配列番号:6]
(L−Tyr)−(L−Asp)−(L−Arg)−(L−Phe)[配列番号:7]
(L−Tyr)−(L−Asp)−(L−Lys)−(L−Phe)[配列番号:8]
(L−Tyr)−(L−Glu)−(L−Lys)−(L−Phe)[配列番号:9]
(L−Trp)−(L−Glu)−(L−Lys)−(L−Phe)[配列番号:10]
(L−Trp)−(L−Glu)−(L−Arg)−(L−Phe)[配列番号:11]
(L−Trp)−(L−Asp)−(L−Lys)−(L−Phe)[配列番号:12]
(L−Trp)−(L−Asp)−(L−Arg)−(L−Phe)[配列番号:13]
(L−Tyr)−(L−Asp)−(L−His)−(L−Trp)[配列番号:14]
(L−Tyr)−(L−Glu)−(L−His)−(L−Trp)[配列番号:15]
(L−Trp)−(L−Asp)−(L−His)−(L−Trp)[配列番号:16]
(L−Trp)−(L−Glu)−(L−His)−(L−Trp)[配列番号:17]
(L−Tyr)−(L−Asp)−(L−Arg)−(L−Trp)[配列番号:18]
(L−Tyr)−(L−Asp)−(L−Lys)−(L−Trp)[配列番号:19]
(L−Tyr)−(L−Glu)−(L−Lys)−(L−Trp)[配列番号:20]
(L−Tyr)−(L−Glu)−(L−Arg)−(L−Trp)[配列番号:21]
(L−Trp)−(L−Glu)−(L−Lys)−(L−Trp)[配列番号:22]
(L−Trp)−(L−Glu)−(L−Arg)−(L−Trp)[配列番号:23]
(L−Trp)−(L−Asp)−(L−Lys)−(L−Trp)[配列番号:24]
(L−Trp)−(L−Asp)−(L−Arg)−(L−Trp)[配列番号:25]
(L−Tyr)−(L−Asp)−(L−His)−(L−Tyr)[配列番号:26]
(D−Tyr)−(D−Glu)−(D−Arg)−(D−Phe)[配列番号:27]
(D−Tyr)−(D−Asp)−(D−His)−(D−Phe)[配列番号:28]
(D−Trp)−(D−Glu)−(D−Arg)−(D−Phe)[配列番号:29]
(D−=Trp)−(D−Asp)−(D−His)−(D−Phe)[配列番号:30]
(D−Tyr)−(D−Asp)−(D−Arg)−(D−Phe)[配列番号:31]
(D−Tyr)−(D−Asp)−(D−His)−(D−Tyr)[配列番号:32]
(D−Tyr)−(D−Glu)−(D−Arg)−(D−Tyr)[配列番号:33]
(D−Trp)−(D−Asp)−(D−His)−(D−Typ)[配列番号:34]
(D−Trp)−(D−Glu)−(D−Arg)−(D−Typ)[配列番号:35]
(D−Tyr)−(D−Asp)−(D−Lys)−(D−Phe)[配列番号:36]
(D−Tyr)−(D−Glu)−(D−His)−(D−Phe)[配列番号:208]
(D−Tyr)−(D−Asp)−(D−Lys)−(D−Phe)[配列番号:209]
(D−Trp)−(D−Glu)−(D−His)−(D−Phe)[配列番号:210]
(D−Tyr)−(D−Glu)−(D−Lys)−(D−Phe)[配列番号:211]
(D−Trp)−(D−Glu)−(D−Lys)−(D−Phe)[配列番号:212]
(D−Trp)−(D−Asp)−(D−Lys)−(D−Phe)[配列番号:213]
(D−Tyr)−(D−Asp)−(D−His)−(D−Trp)[配列番号:214]
(D−Tyr)−(D−Glu)−(D−His)−(D−Trp)[配列番号:215]
(D−Trp)−(D−Asp)−(D−His)−(D−Trp)[配列番号:216]
(D−Trp)−(D−Glu)−(D−His)−(D−Trp)[配列番号:217]
(D−Tyr)−(D−Asp)−(D−Arg)−(D−Trp)[配列番号:218]
(D−Tyr)−(D−Asp)−(D−Lys)−(D−Trp)[配列番号:219]
(D−Tyr)−(D−Glu)−(D−Lys)−(D−Trp)[配列番号:220]
(D−Tyr)−(D−Glu)−(D−Arg)−(D−Trp)[配列番号:221]
(D−Trp)−(D−Glu)−(D−Lys)−(D−Trp)[配列番号:222]
(D−Trp)−(D−Glu)−(D−Arg)−(D−Trp)[配列番号:223]
(D−Trp)−(D−Asp)−(D−Lys)−(D−Trp)[配列番号:224]
(D−Trp)−(D−Gln)−(D−Arg)−(D−Trp)[配列番号:225]
(D−Trp)−(D−Asn)−(D−Lys)−(D−Trp)[配列番号:226]
(L−Tyr)−(L−Asp)−(L−Phe)、
(D−Tyr)−(D−Asp)−(D−Phe)、
(L−Tyr)−(L−Glu)−(L−Phe)、
(L−Tyr)−(L−Arg)−(L−Phe)、
(D−Tyr)−(D−Arg)−(D−Phe)、
(D−Tyr)−(D−Glu)−(D−Phe)、
(D−Tyr)−(D−Pro)−(D−Phe)、
(D−Tyr)−(D−Leu)−(D−Phe)、
(D−Tyr)−(D−Asp)−(D−Tyr)、
(D−Tyr)−(D−Glu)−(D−Tyr)、
(D−Tyr)−(D−Arg)−(D−Tyr)、
(D−Tyr)−(D−Pro)−(D−Tyr)、
(D−Tyr)−(D−Leu)−(D−Tyr)、
(D−Phe)−(D−Pro)−(D−Phe)、
(D−Phe)−(D−Leu)−(D−Phe)、
(D−Phe)−(D−Arg)−(D−Tyr)、
(D−Phe)−(D−Glu)−(D−Tyr)、
(D−Phe)−(D−Asp)−(D−Tyr)、
(D−Phe)−(D−Pro)−(D−Tyr)、
(D−Phe)−(D−Leu)−(D−Tyr)、
(D−Tyr)−(D−Pro)−(D−Trp)、
(D−Tyr)−(D−Leu)−(D−Trp)、
(D−Tyr)−(D−Asp)−(D−Trp)、
(D−Tyr)−(D−Glu)−(D−Trp)、
(D−Tyr)−(D−Arg)−(D−Trp)、
(D−Tyr)−(D−Pro)−(D−Trp)、
(D−Tyr)−(D−Leu)−(D−Trp)、
(D−Phe)−(D−Pro)−(D−Trp)
(D−Phe)−(D−Leu)−(D−Trp)、
(D−Phe)−(D−Arg)−(D−Trp)、
(D−Phe)−(D−Glu)−(D−Trp)、
(D−Phe)−(D−Asp)−(D−Trp)、
(D−Phe)−(D−Pro)−(D−Trp)及び
(D−Phe)−(D−Leu)−(D−Trp)
他の実施形態において、A部分は、次の群から選択される。
p−ヒドロキシ安息香酸−(L−Glu)−(L−Arg)−アニリン、
p−ヒドロキシ安息香酸−(D−Glu)−(L−Arg)−アニリン、
p−ヒドロキシ安息香酸−(L−Glu)−(D−Arg)−アニリン、
p−ヒドロキシ安息香酸−(D−Glu)−(D−Arg)−アニリン、
p−ヒドロキシ安息香酸−(L−Glu)−(L−Arg)−ベンジルアミン、
p−ヒドロキシ安息香酸−(D−Glu)−(L−Arg)−ベンジルアミン、
p−ヒドロキシ安息香酸−(L−Glu)−(D−Arg)−ベンジルアミン、
p−ヒドロキシ安息香酸−(D−Glu)−(D−Arg)−ベンジルアミン、
p−ヒドロキシ安息香酸−(L−Glu)−(L−Arg)−2−フェニルエチルアミン、
p−ヒドロキシ安息香酸−(D−Glu)−(L−Arg)−2−フェニルエチルアミン、
p−ヒドロキシ安息香酸−(L−Glu)−(D−Arg)−2−フェニルエチルアミン、
p−ヒドロキシ安息香酸−(D−Glu)−(D−Arg)−2−フェニルエチルアミン、
2−(4−ヒドロキシ−フェニル)酢酸−(L−Glu)−(L−Arg)−アニリン、
2−(4−ヒドロキシ−フェニル)酢酸−(D−Glu)−(L−Arg)−アニリン、
2−(4−ヒドロキシ−フェニル)酢酸−(L−Glu)−(D−Arg)−アニリン、
2−(4−ヒドロキシ−フェニル)酢酸−(D−Glu)−(D−Arg)−アニリン、
2−(4−ヒドロキシ−フェニル)酢酸−(L−Glu)−(L−Arg)−ベンジルアミン、
2−(4−ヒドロキシ−フェニル)酢酸−(D−Glu)−(L−Arg)−ベンジルアミン、
2−(4−ヒドロキシ−フェニル)酢酸−(L−Glu)−(D−Arg)−ベンジルアミン、
2−(4−ヒドロキシ−フェニル、酢酸−(D−Glu)−(D−Arg)−ベンジルアミン、
2−(4−ヒドロキシ−フェニル)酢酸−(L−Glu)−(L−Arg)−2−フェニルエチルアミン、
2−(4−ヒドロキシ−フェニル)酢酸−(D−Glu)−(L−Arg)−2−フェニルエチルアミン、
2−(4−ヒドロキシ−フェニル)酢酸−(L−Glu)−(D−Arg)−2−フェニルエチルアミン、
2−(4−ヒドロキシ−フェニル)酢酸−(D−Glu)−(D−Arg)−2−フェニルエチルアミン、
3−(4−ヒドロキシ−フェニル)プロオピオン酸−(L−Glu)−(L−Arg)−アニリン、
3−(4−ヒドロキシ−フェニル)プロオピオン酸−(D−Glu)−(L−Arg)−アニリン、
3−(4−ヒドロキシ−フェニル)プロオピオン酸−(L−Glu)−(D−Arg)−アニリン、
3−(4−ヒドロキシ−フェニル)プロオピオン酸−(D−GIu)−(D−Arg)−アニリン、
3−(4−ヒドロキシ−フェニル)プロオピオン酸−(L−Glu)−(L−Arg)−ベンジルアミン、
3−(4−ヒドロキシ−フェニル)プロオピオン酸−(D−Glu)−(L−Arg)−ベンジルアミン、
3−(4−ヒドロキシ−フェニル)プロオピオン酸−(L−Glu)−(D−Arg)−ベンジルアミン、
3−(4−ヒドロキシ−フェニル)プロオピオン酸−(D−Glu)−(D−Arg)−ベンジルアミン、
3−(4−ヒドロキシ−フェニル)プロオピオン酸−(L−Glu)−(L−Arg)−2−フェニルエチルアミン、
3−(4−ヒドロキシ−フェニル)プロオピオン酸−(D−Glu)−(L−Arg)−2−フェニルエチルアミン、
3−(4−ヒドロキシ−フェニル)プロオピオン酸−(L−Glu)−(D−Arg)−2−フェニルエチルアミン、
3−(4−ヒドロキシ−フェニル)プロオピオン酸−(D−Glu)−(D−Arg)−2−フェニルエチルアミン、
p−ヒドロキシ安息香酸−(L−Arg)−アニリン、
p−ヒドロキシ安息香酸−(D−Arg)−アニリン、
p−ヒドロキシ安息香酸−(L−Glu)−アニリン、
p−ヒドロキシ安息香酸−(D−Glu)−アニリン、
p−ヒドロキシ安息香酸−(L−Arg)−ベンジルアミン、
p−ヒドロキシ安息香酸−(D−Arg)−ベンジルアミン、
p−ヒドロキシ安息香酸−(L−Glu)−ベンジルアミン、
p−ヒドロキシ安息香酸−(D−Glu)−ベンジルアミン、
p−ヒドロキシ安息香酸−(L−Arg)−2−フェニルエチルアミン、
p−ヒドロキシ安息香酸−(D−Arg)−2−フェニルエチルアミン、
p−ヒドロキシ安息香酸−(D−Glu)−2−フェニルエチルアミン、
p−ヒドロキシ安息香酸−(L−Glu)−2−フェニルエチルアミン、
2−(4−ヒドロキシ−フェニル)酢酸−(L−Arg)−アニリン、
2−(4−ヒドロキシ−フェニル)酢酸−(D−Arg)−アニリン、
2−(4−ヒドロキシ−フェニル)酢酸−(L−Glu)−アニリン、
2−(4−ヒドロキシ−フェニル)酢酸−(D−Glu)−アニリン、
2−(4−ヒドロキシ−フェニル)酢酸−(D−Arg)−ベンジルアミン、
2−(4−ヒドロキシ−フェニル)酢酸−(L−Arg)−ベンジルアミン、
2−(4−ヒドロキシ−フェニル)酢酸−(D−Glu)−ベンジルアミン、
2−(4−ヒドロキシ−フェニル)酢酸−(L−Glu)−ベンジルアミン、
2−(4−ヒドロキシ−フェニル)酢酸−(L−Arg)−2−フェニルエチルアミン、
2−(4−ヒドロキシ−フェニル)酢酸−(D−Arg)−2−フェニルエチルアミン、
2−(4−ヒドロキシ−フェニル)酢酸−(L−Glu)−2−フェニルエチルアミン、
2−(4−ヒドロキシ−フェニル)酢酸−(D−Glu)−2−フェニルエチルアミン、
3−(4−ヒドロキシ−フェニル)プロオピオン酸−(L−Arg)−アニリン、
3−(4−ヒドロキシ−フェニル)プロオピオン酸−(D−Arg)−アニリン、
3−(4−ヒドロキシ−フェニル)プロオピオン酸−(L−Glu)−アニリン、
3−(4−ヒドロキシ−フェニル)プロオピオン酸−(D−Glu)−アニリン、
3−(4−ヒドロキシ−フェニル)プロオピオン酸−(L−Arg)−ベンジルアミン、
3−(4−ヒドロキシ−フェニル)プロオピオン酸−(D−Arg)−ベンジルアミン、
3−(4−ヒドロキシ−フェニル)プロオピオン酸−(L−Glu)−ベンジルアミン、
3−(4−ヒドロキシ−フェニル)プロオピオン酸−(D−Glu)−ベンジルアミン、
3−(4−ヒドロキシ−フェニル)プロオピオン酸−(L−Arg)−2−フェニルエチルアミン、
3−(4−ヒドロキシ−フェニル)プロオピオン酸−(D−Arg)−2−フェニルエチルアミン、
3−(4−ヒドロキシ−フェニル)プロオピオン酸−(L−Glu)−2−フェニルエチルアミン、
3−(4−ヒドロキシ−フェニル)プロオピオン酸−(D−Glu)−2−フェニルエチルアミン
他の実施形態においては、A部分は、本明細書とともに提出した配列リスト中に開示された配列のうちの1つから選択される。
別の例として、式IにおいてA’でラベル付けされた部分は、すぐ上で挙げた群から選択されたアミノ酸配列を有するオリゴペプチドでもよい。
所与の実施形態においては、A’部分は、残基Xaa−Xaa−Xaa−Xaaを有するペプチド部分又はペプトイド部分である。
ここで、Xaaは、L−Tyr、D−Tyr、N−メチル−L−Tyr、N−メチル−D−Tyr、p−ヒドロキシ安息香酸、2−(4−ヒドロキシフェニル)酢酸、3−(4−ヒドロキシフェニル)プロピオン酸、又はアセチルであり、
Xaaは、L−Glu、D−Glu、L−Asp、D−Asp、N−メチル−L−Glu、N−メチル−D−Glu、N−メチル−L−Asp、N−メチル−D−Asp、L−Pro、D−Pro、N−メチル−L−Pro、N−メチル−D−Pro、L−Leu、D−Leu、N−メチル−L−Leu、N−メチル−D−Leu、又は存在せず、
Xaaは、L−Arg、D−Arg、L−His、D−His、L−Lys、D−Lys、N−メチル−L−Arg、N−メチル−D−Arg、N−メチル−L−His、N−メチル−D−His、N−メチル−L−Lys、N−メチル−D−Lys、又は存在せず、
Xaaは、アニリン、ベンジルアミン、2−フェニルエチルアミン、L−Phe、D−Phe、N−メチル−L−Phe、N−メチル−D−Phe、L−Trp、D−Trp、N−メチル−L−Trp、又はN−メチル−D−Trpである。
所与の実施形態においては、Xaa又はXaaのいずれかが無いが、Xaa及びXaaの両方が無いということはない。他の実施形態においては、Xaa及びXaaの両方が無い。
Mは、隣のペプチド部分又はペプトイド部分との間の単なるアミノ結合でもよい。別の例として、スペーサとして導入され、アミド結合により隣のペプチド部分又はペプトイド部分に結合された分子の部分であってもよい。
Mは、付加的なアミノ酸でもよい。好適には、嵩高でない側鎖をもつ付加的なアミノ酸であり、例えばグリシン、アラニン若しくはセリン又はこれらのいずれかの誘導体である。別の例として、Mは、非アミノ酸部分でもよく、例えば、ε−アミノカプロン酸、3−アミノプロピオン酸、4−アミノ酪酸である。他の部分は、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン、メチレン、ジメチレン、トリメチレン、又はテトラメチレンとすることができる。全ての場合において、Mは、その存在がA’部分と、Gadd45β及び/又はMKK7との間の結合を物理的に妨げないようにすべきである。潜在的な干渉の程度は、インビトロ結合アッセイを用いて評価することができる。
<オリゴマー及びマルチマー>
Gadd45β阻害剤は、式Iの化合物の分子のオリゴマー又はマルチマーを包含してもよい。当該オリゴマー及びマルチマーは、式Iの化合物の分子を2個又はそれ以上有し、その各々が、式Iの化合物の分子中に存在するアミン又はカルボキシル酸基と、骨格部分上における対向するアミノ又はカルボキシル酸基との間のアミド結合を介して共通骨格部分に結合している。当該共通骨格部分は少なくとも2個のアミド結合により関与している。
所与の実施形態においては、共通骨格部分は、アミノ酸リジンとしてもよい。リジンは、それをアミノ酸として規定する官能基に加えて、その側鎖上にアミノ基を有する三官能性アミノ酸である。この三官能性により、リジンは、ペプチド、ペプトイド又は類似の分子と3つのアミド結合を形成することが可能である。共通骨格部分として使用可能な他の三官能性アミノ酸は、D−α−β−ジアミノプロピオン酸(D−Dap)、L−α,β−ジアミノプロピオン酸(L−Dap)、L−α,δ−ジアミノ酪酸(L−Dab)、D−α,δ−ジアミノ酪酸(L−Dab)、及びL−オルニチン、D−オルニチンを含む。他の三官能性の非標準アミノ酸を用いてもよい。共通骨格部分は、分岐したペプチド、ペプトイド又は類似の分子を有していてもよく、それらは三官能性アミノ酸をその配列中に組み込んでおり、少なくともアミド結合を形成することができる三官能性の活性末端基を有している。
<細胞透過性ペプチド>
所与の実施形態においては、式Iの化合物は、細胞透過性ペプチド(CPP)に結合させられる。
このようなペプチドは、1又は複数の共有結合を介して、又は、非共有結合により式Iの化合物に結合されてもよい。
CPPは、例えばCPPがTatすなわちアンテナペディア配列由来のペプチドである誘導体、又はPTD−4ペプチドであるポリアルギニンタグ、又は機能的に等価な細胞透過性ペプチド(非特許文献5)である場合のように、直接的に形質膜を透過してもよい。
あるいはCPPは、エンドサイトーシス又は一時的な膜貫通構造の形成により細胞に入ってもよい。細胞透過性ペプチドの議論については、非特許文献6及びそれらの参考文献を参照されたい。
所与の実施形態においては、化合物は、細胞取り込みを促進するためにナノ粒子(例えばナノ金)と結合してもよい。
<蛍光色素、タグ部分及び脂質化誘導体>
式Iの化合物は、その標的の組織又は細胞への透過をモニタリングするために蛍光色素と結合させてもよい。蛍光色素は、アミノ基(例えばコハク酸イミド、イソチオシアネート、ヒドラジン)、カルボキシル基(例えばカルボジイミド)、チオール基(例えばマレイミド及びアセチルブロミド)及びアジド基を有して得られ、これらの基は式Iの化合物のペプチド部分と選択的に反応するために用いられる。蛍光色素の例は、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体が挙げられる。
式Iの化合物は、非特許文献7に記載の離散的サイズのナノ粒子と結合させてもよい。非特許文献7では100nmまでの離散的サイズのものが記載されている。それによりペプチド又はその誘導体をジスルフィド架橋に結合できることによって、細胞質ゾルの還元性環境内で特定の放出を可能とする。さらに、アミド、エーテル、エステル、チオエーテル結合を介して結合されたペプチド−ナノ粒子も、これらの化合物が低毒性である場合に同じ目的で用いることができる。ナノ粒子は、細胞を取り込み易いと同時に蛍光技術による細胞取り込みの可視化及び定量化のための手段を提供する(非特許文献8)。
タグ部分は同様の手段により結合され、同様に、組織及び細胞を標的とすることの成果をモニタリングできる。
ジスルフィド架橋を介して脂肪酸に結合された、式Iの化合物を有する化合物の脂肪酸誘導体は、細胞及び組織への阻害剤化合物の送達のために用いることができる。脂質化は、対応する非脂質化化合物の吸収率に対して化合物の吸収率を格段に向上させると共に、化合物の血液及び組織における滞留を延長させる。さらに、脂質化誘導体のジスルフィド結合は細胞内では比較的不安定であるため、脂肪酸部分からの分子の細胞内放出を容易とする。適切な脂質含有部分は、4個から26個までの炭素原子、好ましくは5個から19個までの炭素原子を有する疎水性置換基である。適切な脂質基は、限定しないが、パルミチル(C1531)、オレイル(C1529)、ステアリル(C1735)、コール酸、リノール酸及びデオキシコール酸が含まれる。
<イオン結合体>
式Iの化合物は、機能的に、金属イオン又は放射性イオンに結合させることができる。この結合は、典型的には、イオンとキレート化されるイオンキレート剤(例えばEDTA)の共役結合によって達成される。このような手段によって放射性イオン(例えば99mTc、111In、64Cu、67Cu、89Sr、90Y、117mSn、153Sm、186Re、188Re、又は177Lu)を、放射線治療として標的細胞に送達することができる。非放射性金属イオン(例えばガドリニウムイオン)は、NMR検出可能なマーカーとして用いることができる。
<塩及び溶媒和物>
医薬としての使用に適切な化合物の塩及び溶媒和物は、対イオン又は関係溶媒が薬学的に許容できるものである。しかしながら、薬学的に許容できない対イオン又は関係溶媒を有する塩及び溶媒和物も使用可能である。例えば、式Iの化合物及びそれらの薬学的に許容できる塩又は溶媒和物の調製における中間体として使用する場合である。
適切な塩は、有機酸、無機酸、有機塩基又は無機塩基により形成されるものである。薬学的に許容できる酸付加塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、クエン酸、酒石酸、酢酸、リン酸、乳酸、ピルビン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、コハク酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、オキサロ酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−2−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸、及びイセチオ酸で形成されるものを含む。シュウ酸などのその他の酸はそれ自体は薬学的に許容されないが、阻害剤化合物及びそれらの薬学的に許容される塩を得る際の中間体として有用である場合がある。薬学的に許容される塩基性の塩は、アンモニウム塩、カリウム塩やナトリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩やマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、及びジシクロヘキシルアミンやN−メチル−D−グルコサミンなどの有機塩基性塩を含む。
有機化学分野の当業者は、多くの有機化合物が、その中で反応している溶媒、又はその中から沈殿若しくは結晶化している溶媒と錯体を形成できることを理解しているであろう。このような錯体は“溶媒和物”として知られている。例えば,水との錯体は“水和物”として知られている。
式Iの好適な分子の例を以下に挙げる。アミノ酸残基のL配置及びD配置は特定しないが、両方の配置が包括される。
アセチル−Tyr−Glu−Arg−Phe−NH[配列番号:37]
パラヒドロキシ安息香酸−Glu−Arg−アニリン
パラヒドロキシ安息香酸−Glu−Arg−ベンジルアミン
パラヒドロキシ安息香酸−Glu−Arg−2−フェニルエチルアミン
2−(4−ヒドロキシフェニル)酢酸−Glu−Arg−アニリン
2−(4−ヒドロキシフェニル)酢酸−Glu−Arg−ベンジルアミン
2−(4−ヒドロキシフェニル)酢酸−Glu−Arg−2−フェニルエチルアミン
3−(4−ヒドロキシフェニル)酢酸−Glu−Arg−3−アニリン
3−(4−ヒドロキシフェニル)酢酸−Glu−Arg−ベンジルアミン、
3−(4−ヒドロキシフェニル)酢酸−Glu−Arg−2−フェニルエチルアミン
アセチル−Tyr−Asp−His−Phe−NH[配列番号:38]
パラヒドロキシ安息香酸−Asp−His−アニリン
パラヒドロキシ安息香酸−Asp−His−ベンジルアミン
パラヒドロキシ安息香酸−Asp−His−3−Phe−プロピルアミン2−(4−ヒドロキシフェニル)酢酸−Asp−His−アニリン
2−(4−ヒドロキシフェニル)酢酸−Asp−His−ベンジルアミン
2−(4−ヒドロキシフェニル)酢酸−Asp−His−2−フェニルエチルアミン
3−(4−ヒドロキシフェニル)プロピオン酸−Asp−His−アニリン
3−(4−ヒドロキシフェニル)プロピオン酸−Asp−His−ベンジルアミン
3−(4−ヒドロキシフェニル)プロピオン酸−Asp−His−2−フェニルエチルアミン
アセチル−Tyr−Asp−Lys−Phe−NH[配列番号:39]
アセチル−Tyr−Glu−Lys−Phe−NH[配列番号:40]
アセチル−Tyr−Glu−His−Phe−NH[配列番号:41]
アセチル−Tyr−Asp−Arg−Phe−NH[配列番号:42]
アセチル−Trp−Glu−His−Phe−NH[配列番号:43]
アセチル−Trp−Glu−Lys−Phe−NH[配列番号:44]
アセチル−Trp−Asp−His−Phe−NH[配列番号:45]
アセチル−Trp−Asp−Lys−Phe−NH[配列番号:46]
アセチル−Tyr−Glu−Arg−Tyr−NH[配列番号:47]
アセチル−Tyr−Asp−Lys−Tyr−NH[配列番号:48]
アセチル−Tyr−Glu−Lys−Tyr−NH[配列番号:49]
アセチル−Tyr−Glu−His−Tyr−NH[配列番号:50]
アセチル−Tyr−Asp−Arg−Tyr−NH[配列番号:51]
アセチル−Trp−Glu−His−Tyr−NH[配列番号:52]
アセチル−Trp−Glu−Lys−Tyr−NH[配列番号:53]
アセチル−Trp−Asp−His−Tyr−NH[配列番号:54]
アセチル−Trp−Asp−Lys−Tyr−NH[配列番号:55]
アセチル−Tyr−Glu−Lys−Phe−NH[配列番号:56]のインターナルラクタム
アセチル−Tyr−Glu−Arg−Phe−NH[配列番号:57]
アセチル−Tyr−Met−Arg−Phe−NH[配列番号:58]
アセチル−Tyr−Leu−Arg−Phe−NH[配列番号:59]
アセチル−Tyr−Arg−Phe−NH
アセチル−Tyr−Arg−Tyr−NH
アセチル−Tyr−Glu−Phe−NH
アセチル−Tyr−Glu−Tyr−NH
アセチル−Tyr−Asp−Phe−NH
アセチル−Tyr−Asp−Tyr−NH
アセチル−Tyr−Pro−Phe−NH
アセチル−Tyr−Lys−Phe−NH
アセチル−Tyr−His−Phe−NH
H−Tyr−Arg−Phe−NH
H−Tyr−Arg−Tyr−NH
H−Tyr−Glu−Phe−NH
H−Tyr−Glu−Tyr−NH
H−Tyr−Asp−Phe−NH
H−Tyr−Asp−Tyr−NH
H−Tyr−Pro−Phe−NH
H−Tyr−Lys−Phe−NH
H−Tyr−His−Phe−NH
ベンジルオキシカルボニル−Tyr−Arg−Phe−NH
ベンジルオキシカルボニル−Tyr−Arg−Tyr−NH
ベンジルオキシカルボニル−Tyr−Glu−Phe−NH
ベンジルオキシカルボニル−Tyr−Glu−Tyr−NH
ベンジルオキシカルボニル−Tyr−Asp−Phe−NH
ベンジルオキシカルボニル−Tyr−Asp−Tyr−NH
ベンジルオキシカルボニル−Tyr−Pro−Phe−NH
ベンジルオキシカルボニル−Tyr−Lys−Phe−NH
ベンジルオキシカルボニル−Tyr−His−Phe−NH
ベンジルオキシカルボニル−Tyr−Glu−Arg−Phe−NH[配列番号:60]
ベンジルオキシカルボニル−Tyr−Asp−His−Phe−NH[配列番号:61]
ベンジルオキシカルボニル−Tyr−Asp(OMe)−His−Phe−NH[配列番号:62]
ベンジルオキシカルボニル−Tyr−Arg−Phe−NH
ベンジルオキシカルボニル−Tyr−Glu−Phe−NH
ベンジルオキシカルボニル−(N−メチル)Tyr−(N−メチル)Arg−(N−メチル)Phe−NH
ベンジルオキシカルボニル−(N−メチル)Tyr−Glu−(N−メチル)Phe−NH
ベンジルオキシカルボニル−Tyr−(N−メチル)Arg−(N−メチル)Phe−NH
ベンジルオキシカルボニル−(N−メチル)Tyr−(N−メチル)Arg−Phe−NH
ベンジルオキシカルボニル−Tyr−Glu−(N−メチル)Phe−NH
ベンジルオキシカルボニル−Tyr−(N−メチル)Glu−Phe−NH
ベンジルオキシカルボニル−(N−メチル)Tyr−Glu−Phe−NH
アセチル−(N−メチル)Tyr−(N−メチル)Arg−(N−メチル)Phe−NH
アセチル−(N−メチル)Tyr−Glu−(N−メチル)Phe−NH
アセチル−Tyr−(N−メチル)Arg−(N−メチル)Phe−NH
アセチル−(N−メチル)Tyr−(N−メチル)Arg−Phe−NH
アセチル−Tyr−Glu−(N−メチル)Phe−NH
アセチル−Tyr−(N−メチル)Glu−Phe−NH
アセチル−(N−メチル)Tyr−Glu−Phe−NH
H−(N−メチル)Tyr−(N−メチル)Arg−(N−メチル)Phe−NH
H−(N−メチル)Tyr−Glu−(N−メチル)Phe−NH
H−Tyr−(N−メチル)Arg−(N−メチル)Phe−NH
H−(N−メチル)Tyr−(N−メチル)Arg−Phe−NH
H−Tyr−Glu−(N−メチル)Phe−NH
H−Tyr−(N−メチル)Glu−Phe−NH
H−(N−メチル)Tyr−Glu−Phe−NH
アセチル−Tyr−Glu−(β−ホモ)Phe−NH
アセチル−Tyr−(β−ホモ)Glu−Phe−NH
アセチル−(β−ホモ)Tyr−Glu−Phe−NH
アセチル−Tyr−Phe−NH
アセチル−Phe−Tyr−NH2、
ベンジルオキシカルボニル−Tyr−Phe−NH2、
ベンジルオキシカルボニル−Phe−Tyr−NH2、
H−Tyr−Phe−NH2、
H−Phe−Tyr−NH2、
(3−メトキシ,4−ヒドロキシベンゾイル)−Tyr−Glu−Arg−Phe−NH2[配列番号:63]
(3−メトキシ,4−ヒドロキシベンゾイル)−Tyr−Asp−His−Phe−NH2[配列番号:64]
(3−メトキシ,4−ヒドロキシベンゾイル)−Tyr−Asp(OMe)−His−Phe−NH2[配列番号65]
(3−メトキシ,4−ヒドロキシベンゾイル)−Tyr−Arg−Phe−NH
(3−メトキシ,4−ヒドロキシベンゾイル)−Tyr−Glu−Phe−NH
フルオレニルメチルオキシカルボニル−Tyr−Glu−Arg−Phe−NH[配列番号:66]
フルオレニルメチルオキシカルボニル−Tyr−Asp−His−Phe−NH[配列番号:67]
フルオレニルメチルオキシカルボニル−Tyr−Asp(OMe)−His−Phe−NH[配列番号:68]
フルオレニルメチルオキシカルボニル−Tyr−Asp(OMe)−His−Phe−NH[配列番号:69]
フルオレニルメチルオキシカルボニル−Tyr−Arg−Phe−NH
フルオレニルメチルオキシカルボニル−Tyr−Glu−Phe−NH
ミリスチル−Tyr−Glu−Arg−Phe−NH[配列番号:70]
ミリスチル−Tyr−Asp−His−Phe−NH[配列番号:71]
ミリスチル−Tyr−Arg−Phe−NH
ミリスチル−Tyr−Glu−Phe−NH
ミリスチル−Tyr−Asp(OMe)−His−Phe−NH[配列番号:72]
アセチル−Tyr−Glu−Arg−Phe−Gly−Tyr−Glu−Arg−Phe−NH[配列番号:73]
アセチル−Tyr−Asp−His−Phe−Gly−Tyr−Asp−His−Phe−NH[配列番号:74]
アセチル−Tyr−Arg−Phe−Gly−Tyr−Arg−Phe−NH[配列番号:75]
アセチル−Tyr−Asp(OMe)−His−Phe−Gly−Tyr−Asp(OMe)−His−Phe−NH[配列番号:76]
ベンジルオキシカルボニル−Tyr−Glu−Arg−Phe−Gly−Tyr−Glu−Arg−Phe−NH[配列番号:77]
ベンジルオキシカルボニル−Tyr−Asp−His−Phe−Gly−Tyr−Asp−His−Phe−NH[配列番号:78]
ベンジルオキシカルボニル−Tyr−Arg−Phe−Gly−Tyr−Arg−Phe−NH[配列番号:79]
ベンジルオキシカルボニル−Tyr−Asp(OMe)−His−Phe−Gly−Tyr−Asp(OMe)−His−Phe−NH[配列番号:80]
Gadd45β阻害剤のさらに別の例として以下を含む。
Figure 2014519315
化合物A1
Ac−Tyr−Phe−NH
Figure 2014519315
化合物A3
Ac−Tyr−bAla−Phe−NH
Figure 2014519315
化合物A6
Ac−Tyr−(6−アミノ−カプロン酸)−Phe−NH
化合物A7
Ac−Tyr−Tyr−NH
化合物A8
Ac−Phe−Tyr−NH
化合物A9
Ac−Phe−Arg−Phe−NH
Figure 2014519315
化合物B2
Ac−Tyr−Lys−Phe−NH
Figure 2014519315
化合物B13
Ac−Tyr−Pro−Phe−NH
Figure 2014519315
化合物B16
Ac−Tyr−His−Phe−NH
化合物H1
L−3,3−ジフェニル−アラニン、
化合物H2
L−H−3(4−ピリジル)アラニン、
化合物H3
L−H−4−ヒドロキシフェニルグリシン、
化合物H4
L−2−アミノ−4−フェニル酪酸、
化合物H5
L−フェニルグリシン、
化合物H6
L−H−4−ヒドロキシフェニルグリシン、
化合物H7
L−ホモフェニルアラニン、
化合物H8
L−3−(2−フリル)−アラニン、
化合物H9
L−3−(4−キノリル)−アラニン、
化合物H10
L−ナフチル−アラニン、
Figure 2014519315
化合物I1
Ac−Tyr−Arg−(N−Me)Phe−NH
Figure 2014519315
化合物I2
Ac−Tyr−(N−Me)Arg−Phe−NH
Figure 2014519315
化合物I3
Ac−(N−Me)Tyr−Arg−Phe−NH
Figure 2014519315
化合物I4
Ac−(N−Me)Tyr−(N−Me)Arg−(N−Me)Phe−NH
Figure 2014519315
化合物I5
Ac−(N−Me)Tyr−Arg−(N−Me)Phe−NH
Figure 2014519315
化合物O1
Ac−Phe−ArgTyr−NH
Figure 2014519315
化合物O2
Ac−Phe−Arg−Phe−NH
Figure 2014519315
化合物O3
Ac−Tyr−Arg−Tyr−NH
Figure 2014519315
化合物O5
H−Phe−His−Tyr−NH
Figure 2014519315
化合物O7
H−Phe−His−Phe−NH
化合物O8
H−Phe−Arg−Tyr−NH
化合物O9
H−Phe−Arg−Phe−NH
化合物O10
H−Tyr−Arg−Tyr−NH
化合物P1
4−(ヒドロキシル)−フェニル−酢酸−Arg−3−フェニル−エチルアミン、
化合物P2
4−(ヒドロキシル)−フェニル−酢酸−His−3−フェニル−エチルアミン、
化合物P3
4−(ヒドロキシル)−フェニル−酢酸−Glu−3−フェニル−エチルアミン、
Figure 2014519315
化合物G1
シクロ(Tyr−Arg−Phe)、
化合物G2
シクロ(Phe−Arg−Tyr)、
Figure 2014519315
化合物G3
シクロ(Tyr−Phe)、
化合物N1
ナノ金−Tyr−Arg−Phe−NH
Gadd45β阻害剤のさらに別の例としては、本明細書と共に提出された配列表に開示されたペプチドがある。
所与の実施形態においては、本明細書に具体的に開示された化合物は、実施例中のものも含めて好適な化合物であり、又は、式IのA’部分の好適な形態である。マルチマーのバージョン又は本明細書に明示的に開示された特定の化合物を用いることもできる。例えば、本明細書に開示された特定の化合物の3個又は4個の残基のペプチド部分又はペプトイド部分が、式Iの化合物のA、A’、A”、A’”又はA””部分に対応してもよい。
本発明のテラノスティック態様は、基本的に図3(A)、図3(B)及び図4に示された結果により説明される。qRT−PCRアッセイによる評価として、29個の異なる原発組織の癌細胞株の枠に示されたここでの結果は、Z−DTP誘導死滅に感受性を有する癌細胞が、内因性Gadd45β発現レベルと相関することを、非常に高度な統計的有意性をもって証明している。実際に、Z−DTP2による治療後の細胞生存/増殖割合対Gadd45β発現の相関プロットは、2つのパラメータのドメイン間の相関係数の有意性が非常に高い(p<0.01)(ピアソン相関)ことを示している。これらのデータは、単純で費用対効果の高いqRT−PCR解析によりGadd45β阻害剤に対する患者レスポンダー集団を予測することが可能であることを示している。例えば、多発性骨髄腫患者からの初代培養細胞がGadd45β発現のレベルについて分析され、この発現が高レベルの患者はGadd45β阻害剤による最も大きな治療効果を得るであろうと見なすことができる。故に、本発明の重要な態様はテラノスティック態様である。すなわち、Gadd45β阻害剤治療に対する患者の反応を予測するための臨床的に有用なアッセイの適用である。
[データセット]
本発明の第2の態様においては、特定の血液悪性腫瘍と判っている又はその疑いのある多数の被験者群から得た細胞について測定されたGadd45β発現レベルを有するデータセットが提供される。
データセットは、書面若しくは電子形態にて又は他の任意の形態にて保管されてもよい。好適には、特定の血液悪性腫瘍を有する被験者から得た細胞のGadd45β発現レベルを、同じ特定の血液悪性腫瘍を有する別の多数の被験者から得た比較可能な細胞におけるGadd45β発現レベルと比較できるコンピュータデータベースである。
[材料及び方法]
<定量的リアルタイムPCR反応>
RNAは、DNA/RNA Purification Kit(Norgen、ソロルド、カナダ)を使用して凍結ペレットから抽出した。RNA量と純度は、BioPhotometer PLUS(Eppendorf、ハンブルク、ドイツ)を用いて同定され、260/280の吸光度比1.7〜2.0内の試料のみを使用した。相補的DNAは、High capacity cDNA RT Kit(Applied Biosystems、フォスターシティ、カリフォルニア、USA)を使用して製造した。定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(qRT−PCR)を、ΔΔCtアプローチに基づく相対的定量によりABI Prism 7900 HT(Applied Biosystems)を用いて行った。JUM2細胞株を数学的キャリブレータとして、そしてGUSをハウスキーピング遺伝子として用いた。全てのmRNAの測定は、二重に実施した。分析の再現性を評価するために、プレート間の10個のランダム試料の両方の遺伝子の発現を検査した。0.9989%のプレート内中央値変動が得られ、0.9586 %のプレート間変動は全ての反応に匹敵する有効性を示した。
<患者及び健常被験者>
実施例で使用した試料は、次の被験者のグループに由来するものである。健常者、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症(MGUS)の患者、未治療の多発性骨髄腫患者(MM)、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症(WM)の患者、慢性リンパ性白血病のCLLの患者、MMに関係しない癌(例えば乳癌)(非MM)をもつ腫瘍患者の各グループである。MM患者は、VMP−VMPTフェーズIII臨床試験で登録されたもので、この臨床試験は、メンテナンス有り又は無しの高齢の骨髄腫患者におけるベルケイドメルファランプレドニゾンサリドマイドの9サイクルに対するベルケイドメルファランプレドニゾンの9サイクルを比較するものである(非特許文献9)。この試験では、メンテナンス無しで標準的投薬量のベルケイドメルファランプレドニゾンの6週間9サイクルにより治療された患者の代表的グループに由来する試料のみを分析した。
MMの診断は、国際規格基準(非特許文献10)に従って行った。血液細胞数、血清バイオマーカーを用いた臓器機能評価、ベータ−2−ミクログロブリン及びアルブミンのレベル、血清及び尿中の単クローン成分、X線を用いた骨病変が、各患者において検査された。さらに、診断において腫瘍の骨髄浸潤性の評価のために骨髄吸引が行われた。形質細胞の分離のために、抗CD138−被覆磁性マイクロビーズ及びAutoMACS Pro Separator(Miltenyi Biotech GmbH、ドイツ)を用いた。CD19とB細胞は、抗CD19磁性ビーズを用いて同様に分離された。
[実施例1]
診断におけるCD138細胞中のGadd45β mRNA発現:MGUS対MM
Gadd45β mRNAの発現が、MGUS(12例)又はMM(58例)の患者から診断時に得た精製形質細胞(すなわちCD138細胞)において定量的リアルタイムPCRにより測定された。データは、健常者(4例)又は慢性リンパ性白血病の患者(5例)から精製されたCD19細胞(CD19は正常B細胞のマーカーである)において観察されたGadd45βの発現と比較された。結果は図1に示されており、MMの患者においてMGUSの患者に比べて有意に高いGadd45βの発現が見られたことを示している。
[実施例1A]
MGUS、MM、CLL及び非MM悪性腫瘍の診断におけるCD138細胞中のGadd45β mRNA発現
Gadd45β mRNAの発現が、MM(101例)又はMGUS(14例)の患者から診断時に得た精製形質細胞(すなわちCD138細胞)において定量的リアルタイムPCRにより測定された。発現は、MM以外の癌の腫瘍患者(非MM、10例)から得た多クローン性(すなわち非癌)CD138形質細胞においても測定された。発現は、CLLの患者(5例)及び4例の健常者から得たCD19B細胞においても測定された。Gadd45β mRNAレベルはqRT−PCRにより同定され、値はハウスキーピング遺伝子β−アクチンに対して正規化された。結果は図1Aに示されたおり、MM患者から得た細胞は、MGUS、CLL、非MM腫瘍患者及び健常者から得た細胞と比べて有意に高いGadd45βの発現を示すことが判る。t−スチューデント検定にて決定されたように、MM患者からの細胞とMGUS患者からの細胞におけるGadd45β発現の差は、p=0.00018と高い統計的有意性である。
[実施例2]
VMPスケジュールにより治療された患者から分離されたCD138細胞におけるGadd45β mRNA発現:PFS(無増悪生存期間)
Gadd45β mRNAの発現の値が、MMの患者から診断時に得た精製形質細胞において定量的リアルタイムPCRにより測定された。患者は、Gadd45β mRNA発現の値に基づいて2つのグループに分けられた。33パーセンタイル値未満の発現をもつ患者は、低Gadd45β発現であるとして分類された。33パーセンタイル値と66パーセンタイル値の間の発現をもつ患者は、中Gadd45β発現であるとして分類された。66パーセンタイル値を超える発現をもつ患者は、高Gadd45β発現であるとして分類された。3グループの患者の臨床転帰を追跡した。図2から判るように、低発現グループに属する患者と、中発現又は高発現グループに属する患者との間には、無増悪生存率において統計的に有意な差がある。
[実施例3]
Z−DTP誘導死滅に対する異なる感受性をもつ腫瘍細胞株についての基準を決定するために、我々は、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT−PCT)を用いて29個の腫瘍細胞株すなわち異なる原発組織のパネルにおけるGadd45β発現のレベルを測定すると共に、これらのレベルと、Z−DTPの細胞障害活性に対するこれらの細胞株の感受性の程度とを相関付けた。図3に示されるように、これらの分析においては、乳癌及びHEK−293T細胞株は、完全DMEM培地にある75cmフラスコ(5×l0細胞/フラスコ)中で培養したのに対し、他の全ての細胞株は、上述した完全RPMI−1640培地中で5×l0細胞/ウェルにて6−ウェルプレートのウェル中で培養した。全RNAは、Trizolにより抽出され、PureLike RNAミニキット(Inbitorogen)を用いて精製した。GeneAmp RNA PCR Kit(アプライドバイオシステムズ)を用いて行われる逆転写(RT)反応のためにテンプレートとしてRNA1μgを添加した。qRT−PCRは、SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)、Gadd45β特異的プライマー及びABI7900リアルタイムPCR装置を用いて3通りに得られたcDNAにより行った。実験Ct値はβ−アクチンに対して正規化し、相対的mRNA発現を、参照資料(すなわちHEK−293T細胞からのmRNA)に対して計算した。Z−DTP誘導死滅に対する腫瘍細胞株の感受性は、10μMのZ−DTP2により144時間処理後に[H]チミジン取り込みアッセイを行うことにより上述した通り分析された。さらに図3から、Z−DTP2による治療後の細胞生存率に対するGadd45β mRNA発現の相関プロットが示される。2つのパラメータのドメイン間の相関係数の有意性は、ピアソン相関により計算された。これは、GraphPadソフトウェアを用いて2つの変数間の関係を定量化するものである。
[実施例4 Gadd45β阻害剤の例としてのZ−DTP2の合成]
例として、Z−DTP2の合成を報告する。Z−DTP2は、D−チロシン、D−グルタミン、D−アルギニン、D−フェニルアラニンからなり、アミノ結合によりN末端に結合されたベンジルオキシカルボニル(すなわちZ基)とアミノ結合によりC末端に結合されたアミノ基とをもつテトラペプチドのコアを有する。
<材料及び方法>
Z−DTP2は、Fmoc/tBu固相法(非特許文献11、12)に従って手作業で調製した。500μM(1000mg)のRinkアミドポリスチレン樹脂(Fmoc−RINK−AM−resin,GL Biochem社,上海,中国,カタログ番号49001)から開始し、0.50mMes/gを置換した。樹脂を20μmポリテトラフルオロエチレン隔膜、ポリプロピレン上部キャップと下部ルアーロックポリプロピレンキャップを設けた30mLのポリプロピレン容器に入れた。樹脂は、10.0mLの50:50のジクロロメタン(DCM):ジメチルホルムアミド(DMF)混合物(共にLabScan,スティローガン,アイルランド;DCMはカタログ番号H6508L;DMFはカタログ番号H33H11X)で20分間膨潤させた。その後、減圧下で溶媒を除去した後、5.0mLの8:2のDMF:ピペリジン混合物(Piperidine、Pip、カタログ番号80641;Sigma−Aldrich、ミラン、イタリア)を用いて室温(RT)で20分間処理することによりFmoc基を解裂した。反応物を減圧下で取り出し、樹脂を5.0mLのDMFで3回洗浄した。
次に、2.5mMのFmoc−D−Phe−OH(GL Biochem、上海、カタログ番号35702)0.97gを、5.0mLのDMFに溶解した(最終濃度0.5M)。そしてDCM中で、0.5Mのベンゾトリアゾール−1−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート溶液(PyBOP、Novabiochem、カタログ番号01−62−0016)5.0mLと、ジ−イソ−プロピル−エチルアミン(5.0mM;DIEA、Sigma−Aldrich、カタログ番号D−3887)0.90mLとを用いて活性化させた。
活性化したアミノ酸の溶液を樹脂上に注ぎ、激しく撹拌しつつ30分間放置した。減圧下で溶液をドレンし、樹脂を5.0mLのDMFで3回洗浄した。α−NHのFmoc基を、上述した8:2のDMF:ピペリジン混合物(5.0mL)で20分間処理して除去し、さらに5.0mLのDMFで(3回)十分に洗浄した。
Fmoc−D−Arg(Pbf)−OH溶液(5.0mLのDMF中で2.5mM、1.6グラム;GL Biochem、上海、カタログ番号36404)を、上述した2.5mMのPyBOP及び5.0mMの純粋なDIEAを用いて活性化させた。溶液を樹脂上に移し、30分間撹拌放置した。
Fmoc基を5.0mLの8:2DMF−Pip溶液で解裂し、DMFで洗浄(3回,5.0mL)した後、上述したPyBOPとDIEAで予め活性化させたDMF中の0.5MのFmoc−(D)−Glu(tBU)−OH溶液(5.0mLのDMF中で2.5mM、1.1グラム;GL Biochem、上海、カタログ番号36605)を樹脂に加え、室温で30分間反応させた。
アミノ酸溶液のドレンに続いて、Fmoc基を上述した通り(8:2のDMF:Pip5.0mLによる20分間の処理)除去し、樹脂を5.0mLのDMFで3回洗浄した。5.0mLのDMFに溶解した2.5molのFmoc−(D)−Tyr(tBU)−OH(1.2g、GL Biochem、上海、カタログ番号36906)を上述したPyBOPとDIEAで予め活性化させてから、樹脂上に移し、45分間撹拌放置した。
減圧ドレンによりアミノ酸溶液を除去した後、樹脂を5.0mLのDMFで5回洗浄した。5mMのZ−OSu(ベンジルオキシカルボニル−N−ヒドロキシスクシンイミド、GL Biochem、上海、カタログ番号10502)を10mLのDMFに溶解し、樹脂に加えた。2.4mLのDIEAを加え、攪拌しつつ一晩反応させた。
溶液をドレンした後、樹脂をDMF、DCM、メチルアルコール(MeOH、LabScan、カタログ番号C2517)、及びエチルエーテル(ETO、LabScan、カタログ番号A3509E)で十分に洗浄し、減圧下で乾燥させ、加重した。重量は1.1gとした。ペプチドを解裂するために、体積比90:5:5のTFA:HO:TISからなる10.0mLの混合物(TFA、トリフルオロ酢酸、Sigma−Aldrich、イタリア、カタログ番号91700;TIS、トリイソプロピルシラン、Sigma−Aldrich、カタログ番号23,378−1)により樹脂を室温で3時間処理した。
樹脂を濾過により除去し、20mLの冷ETOをトリフルオロ酢酸溶液に加えることにより、白色沈殿物を形成させた。遠心分離により溶媒を除去した後、沈降物を10.0mLの冷ETOで洗浄し、10.0mLの体積比50:50のHO:CHCNに溶解し、凍結乾燥した。
ペプチドは、内径50×2mmの狭口径ONYX C18カラム(Phenomenex、トーランス、カリフォルニア、USA)を用いて、600μL/分の5%CHCN、0.05%TFAで平衡化し、LC−MSにより特性評価を行った。この分析は、CHCN、0.05%TFAに3分で5%から70%の濃度勾配を適用して行った。ペプチドは、10×1cmのC18 ONYXカラム(Phenomenex、トーランス、カリフォルニア、USA)を用いたセミ分取RP−HPLCにより精製し、毎分20mLで平衡化し、各実施ごとに20mgを注入した。ペプチドを溶出するために8分で5%から65%の濃度勾配を適用した。
純粋な画分をプールし、LC−MSで特性評価を行った。ペプチドAの決定されたMWは、746.8amu(理論値746.83amu)であり、生成物は95%以上の純度であった(HPLC)。全ての粗生成物の精製後に約60%の収率が得られた。
[実施例5]
Gadd45β/MKK7阻害剤に反応する初代培養細胞におけるGadd45β発現と細胞障害活性の相関関係
Gadd45β mRNAの発現が、健常者から得たPBMCと、多発性骨髄腫(MM)である9例の各被験者及びワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症(WM)である2例の各被験者から得たCD138細胞において上述の他の実施例において上述した通り測定された。ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症(WM)は、単クローン性免疫グロブリン血症の存在などMMといくつかの特徴を共有しているB細胞悪性腫瘍であるリンパ形質細胞性リンパ腫としても知られている。
図4(A)は、Gadd45β mRNAは、全てのMMの被験者において高いが、健常者又はWMの被験者においては非常に低いレベルであることを示している。さらに各被験者から得た細胞を、mDTP3の細胞殺傷能力を評価するために、Gadd45β活性の強力な阻害剤である化合物mDTP3(Ac−Tyr−Arg−Phe−NH)に暴露した。図4Bは、初代培養細胞中、50%(IC50)の細胞死滅を誘導するmDTP3の平均濃度を示している。形質細胞(すなわちCD138)は抗CD138磁性マイクロビーズ(Miltenyi Biotech GmbH、ドイツ)を用いて精製し、フローサイトメトリーにより細胞純度を確認した。死滅アッセイにおいて、CD138形質細胞は、mDTP3の濃度を増加させて(すなわち0.0001、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3及び10μM)48時間処理した。PNMCは、100μMのmDTP3により144時間処理した。IC50値は、細胞生存率アッセイにより決定した。Gadd45β発現値は、エンドゲン対照(すなわち18sリボソームRNA)に対して正規化した。値は、平均±標準偏差を示す。
図4(B)は、mDTP3によるIC50値に対するGadd45β発現の相関プロットを示す。図示のように、非癌細胞におけるmDTP3細胞障害の欠如は、これらの細胞中の低いGadd45β発現と統計的に有意の相関性がある。2つのパラメータのドメイン間の相関係数の有意性は高く(p=0.017)、初代MM細胞におけるmDTP3の高い標的特異性を確認した。同様の結果は、Z−DTP2(カルボキシベンジル−Tyr−Glu−Arg−Phe−NH)及びZ−DTP1(カルボキシベンジル−Tyr−Asp−His−Phe−NH)を含む更なるGadd45β阻害剤を用いて得られた。

Claims (23)

  1. 血液悪性腫瘍であると判っているか又は疑われる被験者から得た細胞の試料中のGadd45β発現レベルを測定するステップを有する
    Gadd45β発現を測定する方法。
  2. 前記被験者が多発性骨髄腫であると疑われる者である、請求項1に記載の方法。
  3. 前記被験者がびまん性大細胞型B細胞リンパ腫であると疑われる者である、請求項1に記載の方法。
  4. 前記細胞の試料が、物質番号CD138陽性細胞であるか又は誘導されたものである、請求項1又は2の方法。
  5. 前記細胞の試料が、被験者から得た後にCD138陽性細胞を増加させられたものである、請求項4に記載の方法。
  6. 前記細胞が健常者の細胞に比べて高いGadd45β発現レベルを示した場合に、前記被験者を特定の血液悪性腫瘍と診断するステップをさらに含む請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
  7. 前記被験者が特定の血液悪性腫瘍であると判っており、測定された前記Gadd45β発現レベルが、少なくとも一人の対照被験者の群から得た細胞において予め測定された対応するGadd45β発現レベルを有するデータセットと比較される、請求項1、2、4又は5に記載の方法。
  8. 前記対照被験者が健常者である、請求項7に記載の方法。
  9. 前記対照被験者が特定の血液悪性腫瘍であると判っている被験者である、請求項7に記載の方法。
  10. 前記被験者から得た細胞において測定されたGadd45β発現レベルを、相対的に高い又は相対的に低いとして分類するステップを含む、請求項8又は9に記載の方法。
  11. i)前記被験者が特定の血液悪性腫瘍であると判っており、
    ii)測定された前記Gadd45β発現レベルが、適切な特定の血液悪性腫瘍及び適切な細胞型におけるGadd45β発現の基準値と比較することにより、相対的に高い又は相対的に低いとして分類される、請求項1、2、4又は5に記載の方法。
  12. 前記被験者から得た細胞において測定された前記Gadd45β発現レベルにおける相対的に高い又は相対的に低いとの分類が、前記被験者の予後を予測するために用いられる、請求項10又は11に記載の方法。
  13. 相対的に高いGadd45β発現レベルは相対的に不良の予後を予測し、かつ、相対的に低いGadd45β発現レベルは相対的に良好な予後を予測するために用いられる、請求項12に記載の方法。
  14. 前記被験者から得た細胞において測定された前記Gadd45β発現レベルにおける相対的に高い又は相対的に低いとの分類が、前記被験者の適切な治療を選択するために用いられる、請求項10又は11に記載の方法。
  15. 相対的に高いGadd45β発現レベルがGadd45βの阻害剤、Gadd45βシグナル伝達の阻害剤又はNF−κBシグナル伝達の阻害剤を(必要に応じて別の治療と組み合わせて)用いた特定の前記血液悪性腫瘍の治療を示すとともに、必要に応じて、相対的に低いGadd45β発現レベルが前記血液悪性腫瘍の別の治療を示す、請求項14に記載の方法。
  16. 示された前記治療を行うステップをさらに有する、請求項15に記載の方法。
  17. 特定の前記血液悪性腫瘍が多発性骨髄腫であり、かつ、前記細胞の試料が物質番号CD138陽性細胞又はCD138陽性細胞から誘導された物質を含む、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
  18. 前記細胞の試料が、血液試料から得られるか、又は、骨髄吸引、リンパ節、腎臓、脾臓若しくは骨から得られる、請求項17に記載の方法。
  19. 特定の血液悪性腫瘍と疑われるか又は判っている多数の被験者の群から得た細胞において測定されたGadd45β発現レベルのデータセット。
  20. 前記細胞がCD138陽性細胞であり、かつ、特定の前記血液悪性腫瘍が多発性骨髄腫である、請求項19に記載のデータセット。
  21. 前記Gadd45β発現レベルが、RT−PCRにより、他の核酸増幅技術により、定量的若しくは半定量的ハイブリダイゼーション技術により、又は別のmRNA測定技術により測定されたmRNAレベルである、請求項1〜17のいずれかに記載の方法又は請求項19若しくは20に記載のデータセット。
  22. 前記Gadd45β発現レベルが、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、タンパク質アレイ、RIA、ELISA若しくは他のイムノアッセイにより、又は他のタンパク質測定技術により測定されたタンパク質レベルである、請求項1〜17のいずれかに記載の方法又は請求項19若しくは20に記載のデータセット。
  23. 前記Gadd45β発現レベルが、機能アッセイにより測定されたGadd45β活性レベルである、請求項1〜17のいずれかに記載の方法又は請求項19若しくは20に記載のデータセット。
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