JP2014518861A - トランス−シクロオクテンジエノフィル及びジエンを有するイメージング又は治療用プレターゲティングキット - Google Patents
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Abstract
Description
すなわち、異なる式では、これらの文字は、個々に独立して、特に指示がない限り異なる意味を有し得る。
逆ディールス・アルダー反応結合現象は、一般に、不安定な中間体を形成するために結合する反応物質のペアを含んでおり、この中間体は、安定な生成物を形成するための逆ディールス・アルダー反応による単一(唯一)の副産物としての小分子(開始化合物に依存して、これは、例えば、N2、CO2、RCNである。)を取り除く。このペアの反応物質は、一方の反応物質(すなわち、一方の生体直交型の反応基)としてテトラジンの誘導体、例えば、電子欠乏テトラジンのような好適なジエンを有し、他方の反応物質(すなわち、他方の生体直交型の反応基)として式(1)に従う歪みのあるシクロオクテンを有している。
本発明の重要な成果は、ジエノフィル、すなわち、100倍以上にまで生体直交型の結合反応の反応速度の増加の達成を可能にする上記に定義された平らなTCO部分が選択されることである。又は、言い換えると、元の時間のわずか1%である反応時間しか必要とされない。又は、更に言い換えると、或る反応物質の濃度が100倍低くなり得る。
を満たす。
である。
である。
である。E−Gは、上述した8員環の一部であり、P、AがC又はCRaであるようにPQ、QP、QX、XQ、XZ、ZX、ZY、YZ、YA、AYに縮合され得る。
である。
である。
である。
(1)
ここで、同一面に固定された少なくとも2つの環外結合の存在に加えて、各Rは、独立して、H又は、多くても6つの場合で、アルキル、O−アルキル、S−アリール、アルキル、O−アリール、O−アルキル、S−アリール、S−アルキル、S(O)−アリール、S(O)−アルキル、S(O)2−アリール、S(O)2−アルキル、Si−アリール、Si−アルキル、Si−O−アルキル、OCO−アルキル、OCO−アリール、SCO−アルキル、SCO−アリール、OCS−アルキル、OCS−アリール、SCS−アルキル、SCS−アリール、F、Cl、Br、I、SO2、SO3、SO4、OH、SH、NO2、CN、R′及びR″が個々に独立してH、アルキル又はアリールであるNR′R″、C(=O)O−アルキル、C(=O)O−アリール、C(=S)O−アルキル、C(=S)O−アリール、C(=O)S−アルキル、C(=O)S−アリール、C(=S)S−アルキル、C(=S)S−アリール、R′及びR″が個々に独立してH、アルキル又はアリールであるC(=O)NR′R″、R′がH、アルキル又はアリールであるR′CO−アルキル、R′がH、アルキル又はアリールであるNR′CO−アリール、R′がH、アルキル又はアリールであるNR′C(=O)O−アルキル、R′がH、アルキル又はアリールであるNR′C(=O)O−アリール、R′がH、アルキル又はアリールであるOCONR′−アルキル、R′がH、アルキル又はアリールであるOCONR′−アリール、R′及びR″が個々に独立してH、アルキル又はアリールであるNR′CONR″−アルキル、R′及びR″が個々に独立してH、アルキル又はアリールであるNR′CONR″−アリール、R′及びR″が個々に独立してH、アルキル又はアリールであるNR′CSNR″−アルキル並びにR′及びR″が個々に独立してH、アルキル又はアリールであるNR′CSNR″−アリールよりなる群から選択される置換基を示しており、2つのR部分は、オプションでスペーサを介したプレターゲティングプローブ又はエフェクタプローブとのリンカー部分に含まれる少なくとも1つのRを伴って環を共に形成することができ、X及びYは、個々に独立して、H又はアルキル、F、Cl、Br及びIよりなる群から選択される置換基を示している。
から選択される化合物である。
から選択される化合物である。
当業者であれば、逆ディールス・アルダー反応においてよく反応する多くのジエンを知っている。好ましいジエンは、式(2)ないし(5)を参照して以下に与えられる。
(2)
ここで、R1は、R′、R″及びR″′が個々に独立してH、アリール又はアルキルであるアルキル、アリール、CF3、CF2−R′、C(=O)R′、C(=S)R′、C(=O)O−R′、C(=O)S−R′、C(=S)O−R′、C(=S)S−R′、C(=O)NR′R″、C(=S)NR′R″、NR′C(=O)R″、NR′C(=S)R″、NR′C(=O)OR″、NR′C(=S)OR″、NR′C(=O)SR″、NR′C(=S)SR″、NR′C(=O)NR″R″′、NR′C(=S)NR″R″′よりなる群から選択され、A及びBは、A及びBが両方ともに炭素ではないという条件で、個々に独立して、アルキル置換炭素、アリール置換炭素、窒素、N+O−、RがアルキルであるN+Rよりなる群から選択され、Xは、O、N−アルキル及びC=Oよりなる群から選択され、Yは、RがH、アルキル、アリール、C(=O)OR′、C(=O)SR′、C(=S)OR′、C(=S)SR′、C(=O)NR′R″(R′及びR″は、個々に独立して、H、アリール又はアルキルである。)よりなる群から選択されたCRである。
(3)
である。ここで、R1及びR2は、個々に独立して、H、アルキル、アリール、CF3、CF2−R′、NO2、OR′、SR′、C(=O)R′、C(=S)R′、OC(=O)R″′、SC(=O)R″′、OC(=S)R″′、SC(=S)R″′、S(=O)R′、S(=O)2R″′、C(=O)O−R′、C(=O)S−R′、C(=S)O−R′、C(=S)S−R′、C(=O)NR′R″、C(=S)NR′R″、NR′C(=O)R″、NR′C(=S)R″、NR′C(=O)OR″、NR′C(=S)OR″、NR′C(=O)SR″、NR′C(=S)SR″、OC(=O)NR′R″、SC(=O)NR′R″、OC(=S)NR′R″、SC(=S)NR′R″、NR′C(=O)NR′R″、NR′C(=S)NR′R″よりなる群から選択されたものであり、R′及びR″は個々に独立してH、アリール又はアルキルであり、R″′は独立してアリール又はアルキルであって、Aは、N−アルキル、N−アリール、C=O及びCN−アルキルよりなる群から選択されたものであり、BはOであり、Xは、N、CH、C−アルキル、C−アリール、CC(=O)R′、CC(=S)R′、CS(=O)R′、CS(=O)2R″′、CC(=O)O−R′、CC(=O)S−R′、CC(=S)O−R′、CC(=S)S−R′、CC(=O)NR′R″、CC(=S)NR′R″よりなる群から選択されたものであり、R′及びR″は個々に独立してH、アリール又はアルキルであり、R″′は独立してアリール又はアルキルであって、Yは、CH、C−アルキル、C−アリール、N及びN+O−よりなる群から選択されたものである。
(4)
である。ここで、R1及びR2は、個々に独立して、H、アルキル、アリール、CF3、CF2−R′、NO2、OR′、SR′、C(=O)R′、C(=S)R′、OC(=O)R″′、SC(=O)R″′、OC(=S)R″′、SC(=S)R″′、S(=O)R′、S(=O)2R″′、C(=O)O−R′、C(=O)S−R′、C(=S)O−R′、C(=S)S−R′、C(=O)NR′R″、C(=S)NR′R″、NR′R″、NR′C(=O)R″、NR′C(=S)R″、NR′C(=O)OR″、NR′C(=S)OR″、NR′C(=O)SR″、NR′C(=S)SR″、OC(=O)NR′R″、SC(=O)NR′R″、OC(=S)NR′R″、SC(=S)NR′R″、NR′C(=O)NR′R″、NR′C(=S)NR′R″よりなる群から選択されたものであり、R′及びR″は個々に独立してH、アリール又はアルキルであり、R″′は独立してアリール又はアルキルであって、Aは、N、C−アルキル、C−アリール及びN+O−よりなる群から選択されたものであり、BはNであり、Xは、N、CH、C−アルキル、C−アリール、CC(=O)R′、CC(=S)R′、CS(=O)R′、CS(=O)2R″′、CC(=O)O−R′、CC(=O)S−R′、CC(=S)O−R′、CC(=S)S−R′、CC(=O)NR′R″、CC(=S)NR′R″よりなる群から選択されたものであり、R′及びR″は個々に独立してH、アリール又はアルキルであり、R″′は独立してアリール又はアルキルであって、Yは、CH、C−アルキル、C−アリール、N及びN+O−よりなる群から選択されたものである。
(5)
本明細書において用いられる「一次標的」は、診断及び/又はイメージング法において検出される、及び/又は、薬学的活性化合物により調節、結合又はそうでなければ処理される、又は他の治療モダリティである標的に関連している。
プレターゲティングプローブは、関心のある一次標的に結合することができる部分を有している。
エフェクタプローブは、所望の診断、イメージング及び/又は治療効果を与えることができるエフェクタ部分を有している。エフェクタプローブは、更に、二次ターゲティング部分を有している。
本発明は、更に、イメージング剤及びペプチドのようなターゲティング構造体に対する薬剤の結合に関する逆ディールス・アルダー反応の使用に関連している。エフェクタは、有機PET又はSPECT核種で標識された補欠分子族、PET/SPECT/MRIのための金属錯体及び超音波イメージングのための微小気泡、光学イメージングのためのフルオロフォアであり得るが、放射線治療のためのα及びβ−エミッタ及び一般に細胞傷害性抗がん剤でもあり得る。イメージング剤/治療剤は、ペンダントテトラジン又は他の好適なジエン部分及び平らなTCO誘導体を有するターゲティング基により官能基化され、逆の場合も同様である。
材料:全ての試薬及び溶剤は、商業的供給源(試薬に関しては、シグマアルドリッチ社、アクロス社、バイオソルブ社、ABCR社、インビトロゲン社及びメルク社、標準溶剤及び重水素化溶剤に関しては、バイオソルブ社、メルク社及びケンブリッジアイソトープラボラトリーズ社)から得られ、特に明記しない限り、更なる精製を行うことなく用いられた。[177Lu]塩化ルテチウム溶液は、パーキンエルマー社から購入された。水は、ミリQ水濾過システム(ミリポア社)により蒸留され、脱イオン化された(18MΩcm)。標識緩衝剤は、一晩、キレックス−100樹脂(バイオラッド社)で処理され、その後、0.22μmを通して濾過され、4℃で保管された。ジェルコードブルータンパク質染色溶液(Gelcode blue protein staining solution)は、Pierce Protein Research(サーモフィッシャーサイエンティフィック)社から購入された。アミコンウルトラ(Amicon Ultra)−4遠心式フィルタユニット(50kDaの分子質量の分画)は、ミリポア社から購入された。pH7.4のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を調製するタブレットは、Calbiochem(メルク)社から得た。
(E−endo)−2,5−ジオキソピロリジン−1−イルビシクロ[6.1.0]ノナ−4−エン−9−カルボキシレート(6)及び(E−exo)−2,5−ジオキソピロリジン−1−イルビシクロ[6.1.0]ノナ−4−エン−9−カルボキシレート(7)
1,5−シクロオクタジエン(18.5mL、150mmol)及び酢酸ロジウム(II)二量体(陽イオン量)のCH2Cl2(10mL)溶液に、15%ジアゾ酢酸エチル(2.0mL、18.8mmol)のCH2Cl2(20mL)溶液が3.5時間にわたって氷浴中で冷却しながらゆっくり加えられた。加えた後、反応混合物が室温(RT)まで温められた。1.5時間後、NMR解析によると反応は完了しており、混合物はシリカゲルプラグで濾過され、CH2Cl2で洗浄された。濾液は、全てのCH2Cl2が除去されるまで集められ、その後、ヘプタンで希釈された。この溶液は、ヘプタン(500mL)及びMTBE(400mL)を用いてシリカゲルのフィルタを通って溶出された。MTBE部分は生成物を含んでおり、これは、カラムクロマトグラフィ(SiO2、0%ないし4%のヘプタン/EtOAc勾配)により更に精製された。endo/exo異性体の混合物として無色油状体の化合物1が得られた(2.50g、12.9mmol、収率68%)。
ヘプタン/Et2O混合物(1:1、約650mL)で満たされた反応器に、上記化合物1(2.50g、12.9mmol)及び安息香酸メチル(1.6mL、12.7mmol)のヘプタン/Et2O溶液が加えられた。反応混合物は、タングステンランプで照射され、同時に、10%w/wAgNO3含浸シリカゲル(22g)を含有するカラムを通ってポンプでくみ上げられた。照射の16時間後、ほぼ完全な転化が得られ、カラムはMTBE(500mL)で洗浄された。カラムが、10%MeOH/MTBE混合物で洗浄され、これが濃縮され、アンモニアで処理され、CH2Cl2を用いて抽出されて、或る量のE異性体(651mg)を供給した。カラムの材料は、更に、アンモニアで処理され、CH2Cl2で抽出され、より多くのE異性体(498mg)を与えた。
この化合物は、前の実験におけるクロマトグラフ分離後、無色油状体として23%収率で得られた(568mL、2.9mmol)。
上記化合物2(319mg、1.64mmol)のメタノール溶液(3.0mL)に、水酸化リチウム一水和物(275mg、6.6mmol)の水溶液(1.5mL)が加えられた。この混合物が、45℃で2時間加熱され、30℃で一晩攪拌された。反応物は、TLC解析により完全な転化が得られるまで45℃で6時間更に加熱された。混合物は、濃縮され、水及びMTBEで希釈され、クエン酸水溶液で中和された。MTBE(3x)で抽出し、Na2SO4を用いて乾燥させ、溶媒を蒸発させた後、白色固体として化合物4が得られた(269mg、1.62mmol、収率99%)。
上記化合物3(568mL、2.92mmol)のメタノール(6.0mL)溶液に、水酸化リチウム一水和物(487mg、11.61mmol)の水(2.0mL)溶液が加えられた。この混合物が、45℃で2時間加熱され、TLC解析により完全な変換が得られるまで30℃で16時間攪拌された。混合物は、濃縮され、水及びMTBEで希釈され、クエン酸水溶液で中和された。MTBE(3x)で抽出し、Na2SO4を用いて乾燥させ、溶媒を蒸発させた後、帯黄色の結晶性固体として化合物5が得られた(440mL、2.65mmol、収率91%)。
上記化合物4(269mL、1.62mmol)及びN−ヒドロキシスクシンイミド(224mg、1.95mmol)のTHF(10mL)溶液が氷浴中で冷却され、DCC(335mg、1.62mmol)のTHF(2mL)溶液が加えられた。氷浴が取り除かれ、混合物は室温で16時間攪拌された。白色の懸濁液がMTBEで希釈され、ガラスフィルタを通して濾過され、MTBEで洗浄された。濾液は減圧下で濃縮された。カラムクロマトグラフィ(SiO2、10%ないし40%のヘプタン/EtOAc勾配)による精製が白色の結晶性固体として化学物6を与えた(290mL、1.10mmol、収率68%)。この化合物のスペクトルデータは、1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ= 5.77 (m, 1H), 5.25 (m, 1H), 2.82 (s, 4H), 2.41 (m, 1H), 2,34 (m, 1H), 2.11 (m, 1H) , 2.09 (t, 1H, J=8.4Hz), 2.04 (m, 1H) , 1.98 (m, 1H), 1.95 (m, 1H) , 1.6-1.2 (m, 4H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ=169.6 (q), 166.9 (q), 137.5 (t), 132.5 (t), 33.2 (s), 32.9 (s), 25.6 (t), 26.7 (s), 26.8 (s), 25.8 (t), 25.7 (s), 18.0 (t)である。
上記化合物5(440mL、2.65mmol)及びN−ヒドロキシスクシンイミド(366mg、3.18mmol)のTHF(17mL)溶液が氷浴中で冷却され、DCC(546mg、2.65mmol)のTHF(2mL)溶液が加えられた。氷浴が取り除かれ、混合物は室温で16時間攪拌された。白色の懸濁液がMTBEで希釈され、ガラスフィルタを通して濾過され、MTBEで洗浄された。濾液は減圧下で濃縮された。カラムクロマトグラフィ(SiO2、10%ないし60%のヘプタン/EtOAc勾配)による精製が白色の結晶性固体として化学物7を与えた(553mL、2.10mmol、収率79%)。この化合物のスペクトルデータは、1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ= 5.88 (m, 1H), 5.20 (m, 1H), 2.82 (s, 4H), 2.5-2.3 (m, 4H) , 2.00 (m, 2H) , 1.49 (m, 1H) , 1.40 (m, 1H), 1.23 (t, 1H, J=5.7Hz), 0.92 (m, 1H) , 0.70 (m, 1H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ=169.8 (q), 169.4 (q), 137.9 (t), 132.0 (t), 38.0 (s), 33.1 (s), 31.9 (s), 29.2 (t), 28.2 (t), 26.9 (s), 25.5 (s), 23.9 (t) である。
endo−及びexo−E−2,5−ジオキソピロリジン−1−イルビシクロ[6.1.0]ノナ−4−エン−9−カルボキシレート(6及び7)を用いた抗体の修飾
テトラジンとmAb結合endo−及びexo−E−2,5−ジオキソピロリジン−1−イルビシクロ[6.1.0]ノナ−4−エン−9−カルボキシレート(6及び7)との反応速度の測定
endo−及びexo−E−2,5−ジオキソピロリジン−1−イルビシクロ[6.1.0]ノナ−4−エン−9−カルボキシレート(6及び7)と結合するmAbの生体内安定性
(E−major)−2,5−ジオキソピロリジン−1−イル4−((シクロオクト−4−エニルオキシ)メチル)ベンゾエート(12)の合成
2,5−ジオキソピロリジン−1−イル41,45−ジオキソ−45−((6−(6−(ピリジン−2−イル)−1,2,4,5−テトラジン−3−イル)ピリジン−3−イル)アミノ)−4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37−ドデカオキサ−40−アザペンタテトラコンタン−1−オアート(16)の合成
tert−ブチル1−アミノ−3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36−ドデカオキサノナトリアコンタン−39−オアート13(123mg、0.182mmol;IRIS Biotech社)が、乾燥した反応バイアル瓶に加えられ、トルエンを用いて2度共沸された(co-evaporate)。このバイアル瓶は、その後、窒化下に置かれ、過剰のドライDMF(2ml)が加えられ、無色の溶液9(100mg、0.274mmol)を与え、過剰のドライDMF(1ml)に溶解された(ベンゾトリアゾール−1−イルオキシ)トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェイト(BOD;267mg、0.603mmol)が、窒素雰囲気下で反応混合物に連続的に加えられ、赤色の懸濁物を与えた。最後に、DIPEA(0.5mL、2.74mmol)が反応混合物に液滴状に加えられ、結果として得られた溶液は、一晩攪拌された。この反応混合物は、乾燥状態まで脱水されて、DCM(2ml)に溶解され、DCMの1ないし10%MeOHの勾配を使用してシリカに基づくフラッシュカラムクロマトグラフィにより精製された。関連部分が組み合わされ、減圧下で脱水され、暗いピンク色の固体として化合物14(167mg、0.164mmol)を与えた。
攪拌された化合物14(160mg、0.157mmol)の無水DCM(2mL)溶液に、窒素雰囲気下でTFA(2mL)が加えられた。この反応混合物は、室温で2時間攪拌され、乾燥状態まで脱水された。残渣が、ドライDCM(2mL)中で再溶解され、同様にTFA(2mL)で2時間処理された。このプロセスがもう一度繰り返された。最後に、反応混合物が乾燥状態まで脱水され、DCMを用いて2度共沸され、定量的な収率で脱保護生成物15を与えた。
攪拌された化合物15(150mg、0.155mmol)の無水DCM(3mL)溶液に、N2雰囲気下、0℃でジ−(N−スクシンイミジル)カーボネート(47.8mg、0.187mmols)、ピリジン(15μL)及びトリエチルアミン(0.25mL)が加えられた。この混合物は、室温まで温められながら2時間攪拌され、その後、乾燥状態まで脱水され、DCM(20mL)中で再溶解されて、H2O(3×10mL)で洗浄された。有機層は、MgSO4で乾燥させて濾過され、減圧下で脱水され、暗いピンク色の固体として化合物16(94mg、0.089mmol、57%)を与えた。
TCOで官能基化されたmAb用の除去剤(ガラクトース−アルブミン−テトラジン)の合成
図13に示されているように、ガラクトースカップリング剤の2−イミノ−2−メトキシエチル−1−チオ−β−D−ガラクトピラノシド(20)が、2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−α−D−ガラクトピラノシルブロミド(17)から始まって、中間体2−S−(2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−β−D−ガラクトピラノシル)−2−チオウロニウムブロミド(18)及びシアノメチル2,3,4,6−テトラ−O−アセチル―1−チオ−β−D−ガラクトピラノシド(19)を介して3ステップで調製された。
2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−α−D−ガラクトピラノシルブロミド(17、15.00g、36.48mmol)及びチオ尿素(3.05g、40.07mmol)がアセトン(75mL)に溶解された。この溶液は、2時間還流させるために加熱され、続いて、濾過され、20℃に冷却された。ペンタン(75mL)を加ええることにより、白色の結晶性固体として化合物(16.11g、91%)の沈殿がもたらされた。この化合物のスペクトルデータは、1H-NMR (400MHz, [D6]DMSO,): δ = 1.95 (s, 3H, CH3), 2.01 (s, 3H,CH3), 2.08 (s, 3H, CH3), 2.14 (s, 3H, CH3), 4.09 (m, 2H, H6, H6’), 4.45 (t, J=6.4 Hz, 1H, H5), 5.11 (t, J2,3=10 Hz, 1H, H2), 5.22 (dd, J2,3=9.9 Hz, J3,4=3.2 Hz, 1H, H3), 5.39 (d, J 3.2 Hz, 1H, H4), 5.71 (d, J1,2=10 Hz, 1H, H1), 9.11 (br, 2H, NH2), 9.35 (br, 2H, NH2)である。
2−S−(2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−β−D−ガラクトピラノシル)−2−チオウロニウムブロミド(18;16.11g、31.07mmol)、ピロ亜硫酸ナトリウム(11.81g、62.14mmol)、炭酸カリウム(4.72g、34.18mmol)及びクロロアセトニトリル(8.21g、108.7mmol)がアセトン/水(50:50v/v、200mL)に溶解され、室温で1時間攪拌された。この反応混合物は、氷水(300mL)中に流し込まれ、更に2時間攪拌された。濾過により白色の沈殿物が回収され、高温メタノール(30mL)から再結晶化された。この生成物は、濾過され、白色の結晶性固体(9.61g、77%)とされた。融点は97℃であった(文献:95ないし97℃)。これについてのスペクトルデータは、1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 2.00 (s, 3H, CH3), 2.07 (s, 3H, CH3), 2.09 (s, 3H, CH3), 2.17 (s, 3H, CH3), 3.35 (d, J=17 Hz, 1H, S-CH), 3.64 (d, J=17 Hz, 1H, S-CH’), 4.01 (t, J 6.9 Hz, 1H, H5), 4.16 (m, 2H, H6, H6’), 4.7 (d, J1,2=10 Hz, 1H, H1), 5.11 (dd, J3,4=3.2 Hz, J2,3=10 Hz, 1H, H3), 5.24 (t, J=10 Hz, 1H, H2), 5.47 (d, J=2.4 Hz, 1H, H4). FT-IR (ATR): ν = 2249 (CN, w), 1739 (C=O, s)である。
シアノメチル2,3,4,6−テトラ−O−アセチル―1−チオ−β−D−ガラクトピラノシド(19;2.02g、5.00mmol)が無水MeOH(50mL)に溶解され、ナトリウムメトキシドのメタノール溶液(25wt%、115μL、0.50mmol)が加えられた。反応混合物は、24時間室温で攪拌され、続いて、15mLの体積まで濃縮された。生成物は、室温で結晶化させることが可能であり、その後、−18℃にされた。濾過及び乾燥により、白色の結晶(1.11g;83%)が与えられた。融点は129℃であった。これについてのスペクトルデータは、1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ = 3.44 (dd, J2,3=10 Hz, J3,4=4.2 Hz, 1H, H3), 3.52 (dd, J2,3=10 Hz, J1,2=9.0 Hz, 1H, H2), 3.54 (m, 1H, H5), 3.73 (-OCH3), 3.78 (m, 2H, H6, H6’), 3.87 (dd, J3,4=4.0 Hz, J4,5=1.5 Hz, 1H, H4), 4.27 (d, J1,2=9.6 Hz, 1H, H1). FT-IR (ATR): ν = 3287 (N-H, s), 1650 (C=NH, s)である。
PH7.4のPBS/pH8.5の0.5Mホウ酸塩緩衝液(900μL)の10:1混合物に溶解しているMSA(20mg、0.303mmol)の溶液に、同じ緩衝液(200μL)中の2−イミノ−2−メトキシエチル−1−チオ−β−D−ガラクトピラノシド(20)の新たに調製された18.2mg/mlの保存溶液が加えられ、MSAに対して45倍モル過剰のガラクトースカップリング剤(20)をもたらした。この反応混合物は、室温で2時間振動(1000rpm)を与えられ、その後、予め水と平衡にされたZeba脱塩スピンカートリッジ(7kDaの分子質量の分画、Pierce社)を用いて脱塩された。凍結乾燥後、ガラクトース−アルブミン(化合物21)が白色のふわふわした(fluffy)固体(15.3mg、72%)として得られた。続いて、MALDI−TOF解析によりガラクトース修飾のグレードが決定された。MSA:NH+=65941であった。ガラクトース−MSA:NH+=69823であり、これは、ガラクトース/MSAの16.4の平均に対応している(加えられたガラクトース断片の質量は236Daである。)。種々のバッチ(batch)間のばらつきは、約16ないし18(ガラクトース/MSA)である。4℃における水中のガラクトース−アルブミンの10mg/ml溶液の安定性は、MALDI−TOF解析を2週間毎に5か月間繰り返すことにより評価された。結合は、安定であることが分かった。
PBS中のガラクトースにより官能基化されたマウス血清アルブミン(21、1mg)が、DMS(30μL、ガラクトース−アルブミンに対して20当量)中でテトラジン−NHS(16)の10mg/mL溶液と混合され、pH9.6の1M炭酸塩緩衝剤(7.5μL)が加えられた。この溶液(全体で250μL)が、37℃で30分間培養され、その後、ウルトラ−15遠心式フィルタユニット(30kDaの分子質量の分画)に移された。生成物22は、水で十分に洗浄され、その後、一晩凍結乾燥され、ピンク色のふわふわした粉末を与えた。MALDI−TOF解析によりテトラジン修飾のグレードが決定された。ガラクトース−アルブミン−テトラジン:NH+=79010であり、これは、テトラジン/ガラクトース(16.4)−MSAの9.7の平均に対応している(加えられたテトラジン断片の質量は948Daであり、NH+(ガラクトース(16.4)−MSA)=69823である。)。ナノドロップ(nanodrop)での紫外線−可視光線の測定により、分子当たり9ないし10のテトラジンの存在が確認された(測定値:8.9テトラジン/ガラクトース(16.4)−MSA)。
(E)−2,5−ジオキソピロリジン−1−イル2−(10−オキソ−9−アザビシクロ[6.2.0])デカ−4−エン−9−イル)アセテート(26)の合成
この化合物は、文献(Tanaka, M.; Oba, M.; Ichiki, T.; Suemune, H. Chem. Pharm. Bull. 2001, 49, 1178-1181)の方法によって調製された。シクロオクタジエン(108mL、879nmol)のトルエン(200mL)溶液に、クロロスルホニルイソシアネート(18g、127mmol、14%)が加えられた。この溶液が室温で一晩攪拌された。NMRによる解析は転化を示さなかった。この反応が、30℃で一晩及び60℃で一晩続けられた。混合物は、ジエチルエーテル(150mL)で希釈された。硫酸ナトリウム(50g)の水(300mL)溶液が、激しい攪拌の下でゆっくりと加えられた。混合物は、5%含水KOHによりpH8にされ、一晩攪拌された。層が分離され、TBME(2×150mL)及びジクロロメタン(2×150mL)を用いて水溶性の層が抽出された。混合性の有機層は、硫酸ナトリウムで乾燥され、濾過され、減圧下で脱水されて、7.79gの黄色の油状体を与えた。粗生成物は、カラムクロマトグラフィ(シリカ、メタノール5%に対してジクロロメタン/酢酸エチル50%)により精製され、白色固体としてラクタム23(2.68g、17.7mmol、2%)を与えた。
上記ラクタム23(2.68g、17.7mmol)及び安息香酸メチル(2.41g、17.7mmol、1.0当量)のジエチルエーテル(200mL)溶液が、反応容器内で6日間照射され、同時に、この混合物を硝酸銀/シリカカラム(30.0g、0.59mmol/g)を通して流した。カラムは、TBME(400mL)及び9/1のTBME/メタノール(500mL)で洗浄された。カラムはアンモニアで処理され、ジクロロメタン(3×150mL)を用いて抽出された。結合ジクロロメタン層は、硫酸ナトリウムで乾燥され、濾過され、45℃において減圧下で脱水されて、灰色の固体としてトランス−シクロオクテン24(2つの異性体、1.72g、11.4mmol、64.3%)を与えた。
水素化ナトリウム(油分中60%の分散度、330mg、8.27mmol、2.5当量)の17mLドライTHF懸濁液が氷で冷却された。ラクタム24(500mg、3・31mmol、1.0当量)及びブロモ酢酸(551mg、3・97mmol、1.2当量)のドライTHF(11mL)溶液が上記懸濁液に加えられた。反応混合物が、20分間攪拌された。DMF(1.2mL、ドライ)が液滴状に加えられた。この混合物は、室温で週末にかけて撹拌された。この混合物は、40℃において減圧下で濃縮された。TBME(25mL)、氷及び氷水(約25mL)が加えられた。層が分離され、水溶性の層がTBME(15mL)で洗浄された。混合性のTBME層が水(15mL)で抽出された。混合性の水溶性層は氷の中で冷却され、クエン酸(1.41g)でpH1ないし2まで酸性にされ、TBME(3×25mL)で抽出された。混合性の有機層が硫酸ナトリウムで乾燥され、濾過され、40℃において減圧下で脱水されて、白色固体として酸25(2つの異性体、360mg、1.72mmol、52.0%)を与えた。
上記酸25(215mg、1.1mmol)、N−ヒドロキシスクシンイミド(0.14g、1.2mmol、2.25当量)及びEDCI(215mg、1.1mmol、1.1当量)のジクロロメタン(10mL)溶液が、アルミニウム箔で覆われたフラスコ内において室温で一晩攪拌された。この溶液は、別の容器に移され(decant)、ジクロロメタン(10mL)で希釈された。溶液は、水(2×5mL)及び塩水(2×5mL)で洗浄され、硫酸ナトリウムで乾燥され、濾過され、脱水されて、褐色の油状体(0.24g)を与えた。油状体は、ジクロロメタン(1mL)に溶解され、ペンタン(20mL)中に沈殿した。残渣がペンタンで洗浄され、減圧下で乾燥され、オフホワイトの固体として上記26(2つの異性体、0.16g、0.52mmol、52%)を与えた。
(E)−1,2,3,4,4a,5,6,9,10,10a−デカヒドロ−1,4−メタノベンゾ[8]アヌレン−11−オール(32)の合成
(Tetrahedron 1981, 37, 4479-4494を参照されたい。)5,5−ジメトキシ−1,2,3,4−テトラクロロシクロペンタジエン27(6.7mL、10g、37.9mmol)及び1,5シクロオクタジエン(37.3mL、32.8g、303mmol、8.0当量)の混合物が、10時間還流温度に加熱された。50℃に冷却した後、白色の沈殿物が形成された。混合物は、減圧下で濃縮された。固体は、濾過されて離れ、ペンタンで洗浄された。混合性の濾液は、減圧下で濃縮され、トルエンを用いて(2回)相互に蒸留され(codistill)、黄色の粘性油状体として付加物28(11.4g、30.6mmol、80.7%)を与えた。
ドライテトラヒドロフラン(130mL)中のリチウム(4.16g、0.60mmol、28.7当量)の混合物が、窒素雰囲気下において還流温度で攪拌された。上記付加物28(7.78g、20.9mmol、1.0当量)及びtert−ブタノール(22mL、17g、0.23mol、11当量)のテトラヒドロフラン(13mL)溶液が液滴状に加えられた。加えられている間、気体が発生し、反応混合物は黒色に変化した。混合物は、週末にわたって還流温度で攪拌された。固体は、セライトで濾過されて離れ、テトラヒドロフランで洗浄された。混合性の濾液は、濃縮され、褐色の固体を与えた。この固体は、氷(25mL)と混合され、TBME(4×100mL)で抽出された。混合性の有機層は、硫酸ナトリウムで乾燥され、濾過され、減圧下で脱水されて、褐色の油状体として未精製物29(4.23g)を与えた。ISCOによる精製は、わずかに黄色がかった油状体として化合物29(1.21g、5.12mmol、24.5%)を与えた。
上記化合物29(1.21g、5.12mmol)のジエチルエーテル(3mL)溶液が、含水硫酸(2M、12mL)と混合された。混合物は、5日間激しく攪拌され、ジエチルエーテル(2×20mL)で抽出された。混合性の有機層は、硫酸ナトリウムで乾燥され、濾過され、減圧下で脱水されて、黄色がかった油状体としてケトン30(731mg、3.84mmol、75.0%)を与えた。
上記ケトン30(598mg、3.14mmol)のドライジエチルエーテル(18mL)溶液に、水素化アルミニウムリチウムが加えられた。混合物は、窒素雰囲気下で3日間攪拌され、続いて、水(5mL)を液滴状に加えることによりクエンチされた。層が分離され、ジエチルエーテル(20mL)を用いて水溶性の層が抽出された。混合性の有機層は、硫酸ナトリウムで乾燥され、濾過され、減圧下で脱水されて、無色の油状体としてアルコール31(499mg、2.59mmol、82.6%、12ないし85の異性体の混合)を与えた。
上記Z−アルケン31(530mg、2.76mmol)及び安息香酸メチル(0.347mL、375mg、2.76mmol、1.0当量)のジエチルエーテル/ヘプタン(1/2、600mL)溶液が、36時間照射され、同時に、シリカ/硝酸銀/(9/1、5g、約1当量)、シリカ(0.5cm)及び砂(0.5cm)で満たされたカラムを通して連続的に流された。カラムは、照射中、暗所に置かれた。シリカがジクロロメタン(40mL)で洗浄され、粗生成物が、ジクロロメタン/水/25%アンモニア水(2/1/1、3×40mL)を用いてカラムから抽出された。混合性の水溶性層は、ジクロロメタン(30mL)で抽出された。混合性の有機層は、硫酸ナトリウムで乾燥され、濾過され、減圧下で脱水されて、0.32gの黄色の油状体を与えた。粗生成物は、カラムクロマトグラフィ(50mLシリカ、酢酸エチル/ヘプタンが1/9)により部分的に精製され、オフホワイトの固体として生成物及び脂肪族不純物の混合物(38mg、最大0.198mmol、7.2%)を与えた。この生成物は、場合によっては、2つのE−異性体の混合物である。
(E)−3,3a,4,5,9,9a−ヘキサヒドロ−1H−シクロオクタ[d]イミダゾール−2(8H)−オン(40)の合成
酢酸及びジクロロメタン中における1,5−シクロオクタジエンと過ホウ酸ナトリウムとの反応(Gunes, Y.; Senocak, E.; Tosun, C.; Taskesenligil, Y., Org. Commun. 2009, 2:3, 79-83参照)により、エポキシシクロオクテンが調製された。粗生成物は、そのようなものが用いられた。エポキシシクロオクテン(80.0g、0.645mmol)の140mLアセトン溶液が、45分間にわたってアジ化ナトリウム(80g、1.23mmol)の200mL水溶液に加えられた。更に20mLのアセトンが漏斗を用いて流され、混合物が76時間還流下で加熱された。アセトンのほとんどは回転蒸発により除去された。100mLの水が残渣に加えられ、混合物が3×250mLのTBMEで抽出された。有機層は、100mLの水で洗浄され、その後、乾燥及び回転蒸発し、(エポキシドと混合された)未精製アジドアルコール33を与え、これ自体は次のステップに用いられた。これについてのスペクトルデータは、1H-NMR (CDCl3, product signals): δ 1.6 - 2.6 (m, 8H), 3.65 - 3.8 (m, 2H), 5.5 - 5.65 (m, 2H)である。
上記残渣にトルエンが加えられ、約150mLの溶媒が回転蒸発により除去された。300mLのトルエンが残留物(アジドアルコール33と開始エポキシドとの約1/1の混合物)に加えられ、この溶液が氷中で冷却された。トリエチルアミン(86.1g、0.852mmol)が加えられ、その後、100mLトルエン中のメタンスルホニルクロリド(93.8g、0.819mmol)が、1時間にわたって機械的に攪拌されながら加えられた。懸濁液が2日間攪拌され、その後、200mLの水が加えられた。層が分離され、有機層は2×50mLの水で洗浄された。連続する水溶性層は、250mLのトルエンで抽出された。乾燥及び回転蒸発が、メシル酸アジドと開始エポキシドとの混合物である残渣をもたらした。
上記のように得られた未精製ジアジド34が、150mLのTHFに溶解され、200mLTHF中の水素化アルミニウムリチウム(12.0g、0.315mmol)に90分間にわたって加えられ、冷水で冷却が行われた。反応混合物は、還流下で8時間加熱された後、冷却され、6mLの水及び12mLの30%水酸化ナトリウム溶液でゆっくりとクエンチされた。濾過、THFでの洗浄及び回転蒸発が、150mLのジクロロメタンに溶解され、その後、氷中で冷却された残渣をもたらした。トリフルオロ酢酸無水物(69.0g、0.328mol)が30分間にわたって加えられた。溶液は、4時間攪拌され、その後、回転蒸発した。残渣が250gシリカゲルカラムのクロマトグラフィにかけられ、増加した酢酸エチルを含むヘプタンを用いて溶出が行われた。第1の分画は、シクロオクト−2−エン−1−オールのトリフルオロ酢酸塩であった。所望の(Z)N,N′−(シクロオクト−5−エン−1,2−ジイル)ビス(2,2,2、−トリフルオロアセトアミド)を有する分画が結合され、TBME及びヘプタンの混合物から再結晶化されて、18.85gの生成物36(56.47mmolm、エポキシシクロオクテンを基にして18%)を与えた。
3.50g(25.0mmol)(Z)−シクロオクト−エン−1,2−ジアミンからの反応生成物の脱水後に、粗トリフルオロアセトアミド36が得られ、4.0gの安息香酸メチルと混合され、及びトリフルオロ酢酸無水物(12.3g、58.6mmol)が、4.0gの安息香酸メチル及び約500mLのヘプタン−エーテル(約2/1)と混合された。混合物は42時間照射され、同時に、溶液は、41g硝酸銀を含浸させた(約4.1gの硝酸銀を含む)シリカゲルカラムを通って連続的に流された。カラムは150mLのTBMEで流され、その後、幾らかのメタノールを含む150mLのTBMEで流された。各部分が、100mLの15%アンモニアで洗浄され、乾燥及び回転蒸発した。第1の部分はZアルケン及びEアルケンの1/2の混合物をもたらし、第2の部分は少量のEアルケンをもたらした。カラムは、TBME及びアンモニアを用いて攪拌された後、濾過され、層が分離された。固体は、水溶性層及びTBMEでもう一度処理された後、濾過され、層が分離された。有機層は乾燥及び回転蒸発し、3.07gのEアルケン37(9.25mmol、アミンを基にして37%)をもたらした。
上述のように得られたアミド37が、40mLのメタノール、5.0gの水酸化ナトリウム及び10mLの水と混合された。混合物は、還流温度付近で90分間温められ、回転蒸発し、残渣が30mLの水で希釈された。3×50mLのジクロロメタンによる抽出及び回転蒸発が、少量の溶媒を含む所望のジアミン38(1.38g、約100%)をもたらした。
ジフェニルカーボネート(500mg、2.33mmol)が、ジアミン38(300mg、2.14mmol)の10mLジクロロメタン溶液に加えられ、この溶液が室温で4日間攪拌された。溶液は、25gシリカのクロマトグラフィにかけられ、増加したメタノールを有するジクロロメタンを用いて溶出した。生成物の部分は、混合性であり、15mLのTBMEを用いて2時間攪拌された。15mLのヘプタンが加えられ、混合物が濾過された。固体は15mLのTBMEを用いて攪拌された後、濾過された。混合性の濾液は回転蒸発し、残渣はヘプタンを伴って一晩攪拌され、固体を与えた。濾過が所望の生成物39をもたらした。
カルバメート39が、DMSOに溶解され、24時間暗所において40℃で攪拌され、その後、尿素40への分子内環化が完了した。生成物は、そのようなものとして用いられた。これについてのスペクトルデータは、1H NMR (DMSO-d6): δ 1.4 - 2.3 (m, 8H), 3.38 (m, 1H), 3.62 (m, 1H), 5.51 (m, 2H), 6.07 (s, 1H), 6.12 (s, 1H). LCMS: m/z = 167.1 (M+H+)である。
2,2′,2″−(10−(2−オキソ−2−(6−オキソ−6−(6−(6−(ピリジン−2−イル)−1,2,4,5−テトラジン−3−イル)ピリジン−3−イルアミノ)ヘキシルアミノ)エチル)−1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1,4,7−トリイル)トリ酢酸(47)及び2,2′,2″−(10−(2−オキソ−2−(11−オキソ−11−(6−(6−(ピリジン−2−イル)−1,2,4,5−テトラジン−3−イル)ピリジン−3−イルアミノ)ウンデシルアミノ)エチル)−1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1,4,7−トリイル)トリ酢酸(48)の合成
5−アミノ−2−シアノピリジン41(1.02g;8.60mmol)、N−Boc―6−アミノ−ヘキサン酸42(0.99g;4.30mmol)、DCC(1.77g;8.60mmol)、DMAP(1.05g;8.60mmol)及びPPTS(0.37g;1.47mmol)がクロロフォルム(15mL)中に懸濁された。混合物は、室温で18時間攪拌され、その後、乾燥するまで脱水され、アセトニトリル(20mL)中で攪拌された。沈殿物が濾過により除去され、濾液は乾燥するまで脱水され、クロロフォルム(20mL)中で溶解され、クエン酸水溶液(15mL、0.5M)、炭酸水素カリウム水溶液(15mL、1M)及び水(15mL)でそれぞれ洗浄された。有機層は、硫酸ナトリウムで乾燥され、乾燥するまで脱水された。粗生成物がカラムクロマトグラフィ(シリカ、ヘキサン/酢酸エチル=1:1)により精製され、白色固体として生成物43(0.95g;61%)を与えた。質量分析のデータは、MS (ESI, m/z): Calcd for C17H25N4O3 +([M+H]+): 333.19, Found: 333.17である。
tert−ブチル6−(6−シアノピリジン−3−イルアミノ)−6−オキソヘキシルカルバメート43(0.70g;2.1mmol)、2−シアノピリジン(0.87g;8.4mmol)、ヒドラジン水和物(1.25g;20mmol)がエタノール(2mL)中で溶解され、硫黄(0.22g;7mmol)が加えられた。混合物は、アルゴン不活性雰囲気下において70℃で2時間攪拌され、その後、50℃で16時間攪拌された。オレンジ色の懸濁物がクロロフォルム(10mL)で希釈され、得られた溶液は水(15mLで2回)で洗浄された。有機層は、硫酸ナトリウムで乾燥され、乾燥するまで脱水された。粗生成物がカラムクロマトグラフィ(シリカ、クロロホルム/アセトン=4:1)により精製され、オレンジ色の固体として生成物44(0.65g;66%)を与えた。質量分析のデータは、MS (ESI, m/z): Calcd for C23H31N8O3 +([M+H]+): 467.25, Found: 467.33である。
tert−ブチル6−オキソ−6−(6−(6−(ピリジン−2−イル)−1,2−ジヒドロ−1,2,4,5−テトラジン−3−イル)ピリジン−3−イルアミノ)ヘキシルカルバメート44(0.30g;0.64mmol)がTHF(1.5mL)中で溶解され、酢酸(2mL)が加えられた。亜硝酸ナトリウム(0.25g;3.62mmol)が水(1mL)中で溶解され、液滴状に加えられた。赤色の溶液が炭酸水素カリウム水溶液(50mL;1M)中に流し込まれ、クロロフォルム(50mL)で生成物が抽出された。有機層は、水(50mL)で洗浄され、硫酸ナトリウムで乾燥され、乾燥するまで脱水され、紫色の固体として生成物45(0.25g;83%)を与えた。質量分析のデータは、MS (ESI, m/z): Calcd for C23H29N8O3 +([M+H]+): 465.23, Found: 465.42である。
tert−ブチル6−オキソ−6−(6−(6−(ピリジン−2−イル)−1,2,4,5−テトラジン−3−イル)ピリジン−3−イルアミノ)ヘキシルカルバメート45(66mg;0.14mmol)がクロロホルム(6mL)中で溶解され、TFA(6mL)が加えられた。溶液は、室温で2時間攪拌され、続いて、乾燥するまで脱水され、TFA塩として生成物46(52mg;100%)を与えた。質量分析のデータは、MS (ESI, m/z): Calcd for C18H21N8O+([M+H]+): 365.19, Found: 365.33である。
6−アミノ−N−(6−(6−(ピリジン−2−イル)−1,2,4,5−テトラジン−3−イル)ピリジン−3−イル)ヘキサンアミド46(52mg;0.14mmol)がTHF(2.5mL)中で溶解され、DIPEA(320mg;2.0mmol)が加えられた。N−ヒドロキシスクシンイミドで活性化されたDOTA(161mg、0.2mmol)が加えられ、混合物は室温で5時間攪拌された。溶液は乾燥するまで脱水され、粗組成物がアセトニトリル及び水の混合物に溶解され、分取RP−HPLCにより精製された。凍結乾燥後、ピンク色のふわふわした固体として純生成物47(80mg;収率76%)が得られた。この化合物のスペクトルデータは、1H-NMR (30% acetonitrile-d3in D2O): δ = 8.90 (m, 2H, ArH), 8.68 (d, 1H, ArH), 8.60 (dd, 1H, ArH), 8.31 (m, 1H, ArH), 8.24 (t, 1H, ArH), 7.82 (t, 1H, ArH), 3.80 (br s, 6H, NCH2COOH), 3.72 (br s, 2H, NCH2CONH), 3.34-3.23 (br m, 18H, NCH2CH2N, CH2NHCO), 2.49 (t, 2H, NHCOCH2), 1.70 (m, 2H, NHCOCH2CH2), 1.59 (m, 2H, CH2CH2NHCO), 1.41 (m, 2H, CH2CH2CH2NHCO) ppm. 13C-NMR (30% acetonitrile-d3 in D2O): δ = 175.5, 171.5 (br), 162.6, 162.5, 150.1, 148.1, 142.9, 141.6, 139.6, 138.4, 128.0, 127.9, 125.4, 124.8, 55.4, 54.3 (br), 49.4 (br), 39.4, 36.5, 28.2, 25.9, 24.6 ppm. ESI-MS: m/z for C34H47N12O8 +([M+H]+): 751.37; Obs. [M+H]+ 751.58, [M+Na]+773.50, [M+2H]2+ 376.42, [M+3H]3+ 251.33. FT-IR (ATR): υ = 3263, 3094, 2941, 2862, 1667, 1637, 1582, 1540, 1460, 1431, 1395, 1324, 1296, 1272, 1251, 1226, 1198, 1128, 1087, 1060, 1020, 992, 977, 920, 860, 831, 798, 782, 742, 718, 679, 663 cm-1である。
2,2′,2″−(10−(2−オキソ−2−(6−オキソ−6−(6−(6−(ピリジン−2−イル)−1,2,4,5−テトラジン−3−イル)ピリジン−3−イルアミノ)ヘキシルアミノ)エチル)−1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1,4,7−トリイル)トリ酢酸47の合成に説明されている手順に匹敵する手順が用いられた。
テトラジンモデル化合物の安定性及び反応性
特定のテトラジンのDMSO(25mM)溶液10μLがPBS緩衝液(3mL)(又は、水溶解度が非常に低い場合はPBS及びアセトニトリルの混合物)で希釈された。この溶液が濾過され、UV分光法を用いて、225nmにおける吸収バンドの減少が観測された。このデータから、加水分解の速度及び半減期が決定された。
トランス−シクロオクト−4−エン−1−オール(マイナー異性体)との逆電子要請型ディールス・アルダー反応における特定のテトラジン及び(基準テトラジンとして選択された)3−(5−アセトアミド−2−ピリジル)−6−(2−ピリジル)−1,2,4,5、−テトラジンの反応性比を決定するために、競合実験が行われた。
この値は、PBS及びアセトニトリルの50/50の混合物中で決定されたものである。
TCOモデル化合物の安定性及び反応性
特定のトランス−シクロオクテン誘導体の溶液10μLがPBS緩衝液(3mL)で希釈され、この溶液が暗所に20℃で保管された。TCO化合物のフェイス(faith)がHPLC−MS解析により観測され、半減期の推定が行われた。
ビス(2−ピリジル)−1,2,4,5−テトラジンとの逆電子要請型ディールス・アルダー反応における特定のトランス−シクロオクテン誘導体及び(基準トランス−シクロオクテンとして選択された)トランス−シクロオクト−4−エン−1−オール(マイナー異性体)の反応性比を決定するために、競合実験が行われた。
上記技術の広い適用性を示すために、トランス−シクロオクテンβ−ラクタム誘導体25が種々の1,2,4,5−テトラジンと反応した。
3−(5−アセトアミド−2−ピリジル)−6−(2−ピリジル)−1,2,4,5−テトラジン(6.25×10−8mol)の水(1mL)溶液に、トランス−シクロオクテンβ−ラクタム誘導体25(6.25×10−8mol)が加えられた。(ピンク色から無色への)テトラジン溶液の直後の変色が、TCOとの定量的な反応を示した。これ(テトラジン信号の完全な変色及び逆ディールス・アルダー反応付加物の形成)が、HPLC−MS解析により確かめられた(m/z=475.33(M+H+))。
3−(5−ブチルアミド−2−ピリジル)−6−(2−ピリジル)−1,2,4,5−テトラジン(6.25×10−8mol)の水(1mL)溶液に、トランス−シクロオクテンβ−ラクタム誘導体25(6.25×10−8mol)が加えられた。(ピンク色から無色への)テトラジン溶液の直後の変色が、TCOとの定量的な反応を示した。これ(テトラジン信号の完全な変色及び逆ディールス・アルダー反応付加物の形成)が、HPLC−MS解析により確かめられた(m/z=504.42(M+H+))。
(4−(1,2,4,5−テトラジン−3−イル)フェニル)メタンアミン(6.25×10−8mol)の水(1mL)溶液に、トランス−シクロオクテンβ−ラクタム誘導体25(6.25×10−8mol)が加えられた。(ピンク色から無色への)テトラジン溶液の直後の変色が、TCOとの定量的な反応を示した。これ(テトラジン信号の完全な変色及び逆ディールス・アルダー反応付加物の形成)が、HPLC−MS解析により確かめられた(m/z=369.17(M+H+))。
3−メチル−6−(2−ピリジル)−1,2,4,5−テトラジン(6.25×10−8mol)の水(1mL)溶液に、トランス−シクロオクテンβ−ラクタム誘導体25(6.25×10−8mol)が加えられた。(ピンク色から無色への)テトラジン溶液の直後の変色が、TCOとの定量的な反応を示した。これ(テトラジン信号の完全な変色及び逆ディールス・アルダー反応付加物の形成)が、HPLC−MS解析により確かめられた(m/z=355.33(M+H+))。
3,6−ジフェニル−1,2,4,5−テトラジン(6.25×10−8mol)の水(1mL)溶液に、トランス−シクロオクテンβ−ラクタム誘導体25(6.25×10−8mol)が加えられた。(ピンク色から無色への)テトラジン溶液の直後の変色が、TCOとの定量的な反応を示した。これ(テトラジン信号の完全な変色及び逆ディールス・アルダー反応付加物の形成)が、HPLC−MS解析により確かめられた(m/z=416.42(M+H+))。
(E−major)−2,5−ジオキソピロリジン−1−イル4−((シクロオクト−4−エニルオキシ)メチル)ベンゾエート(12)及び(E)−2,5−ジオキソピロリジン−1−イル2−(10−オキソ−9−アザビシクロ[6.2.0])デカ−4−エン−9−イル)アセテート(26)による抗体修飾
テトラジンとmAb結合(E−major)−2,5−ジオキソピロリジン−1−イル4−((シクロオクト−4−エニルオキシ)メチル)ベンゾエート(12)及び(E)−2,5−ジオキソピロリジン−1−イル2−(10−オキソ−9−アザビシクロ[6.2.0])デカ−4−エン−9−イル)アセテート(26)との反応速度の測定
(E−major)−2,5−ジオキソピロリジン−1−イル4−((シクロオクト−4−エニルオキシ)メチル)ベンゾエート(12)と結合したmAbの生体内安定性
(E−exo)−2,5−ジオキソピロリジン−1−イルビシクロ[6.1.0]ノナ−4−エン−9−カルボキシレート(7)及び(E−major)−2,5−ジオキソピロリジン−1−イル4−((シクロオクト−4−エニルオキシ)メチル)ベンゾエート(12)と結合したCC49を用いた腫瘍プレターゲティング
同一面に固定される2つの環外結合の存在の結果としてのTCO環の部分的平坦化の分子モデリング
以下の実施例は、TCO環の部分的平坦化が、同一面に固定される2つの環外結合の存在の本質的な結果であることを示すものであり、少なくとも、環外二重結合の対向する部分、すなわち、炭素原子5及び6について言及している。これは、2つの環外結合が位置する場所に関わらず適用できる。
Claims (23)
- 少なくとも1つのプレターゲティングプローブと少なくとも1つのエフェクタプローブとを有する標的医療イメージング及び/又は治療用のキットであって、前記プレターゲティングプローブは、一次ターゲティング部分及び第1の生体直交型の反応基を有し、前記エフェクタプローブは、標識又は薬学的活性化合物のようなエフェクタ部分及び第2の生体直交型の反応基を有し、前記第1及び第2の生体直交型の反応基の何れか一方がジエノフィルであり、前記第1及び第2の生体直交型の反応基の他方がジエンであり、前記ジエノフィルは、同一面に固定された少なくとも2つの環外結合を有するトランス−シクロオクテン部分であり、オプションでスペーサを介して前記プレターゲティングプローブ又は前記エフェクタプローブとの少なくとも1つの結合部を有する、
当該キット。 - 前記少なくとも2つの環外結合が、実質的な平坦な縮合環構造の一部である、請求項1記載のキット。
- 前記少なくとも2つの環外結合が、前記トランス−シクロオクテン環における単一のsp2炭素に付着する、請求項1記載のキット。
- 前記少なくとも2つの環外結合が、炭素−ヘテロ原子二重結合の一部である、請求項3記載のキット。
- 前記少なくとも2つの環外結合が、縮合芳香族環の一部である、請求項2又は3記載のキット。
- 前記トランス−シクロオクテン部分が式(1)
(1)
を満たし、式中、前記同一面に固定された少なくとも2つの環外結合の存在に加えて、各Rは、独立して、H又は、多くても6つの場合で、アルキル、O−アルキル、S−アリール、アリール、O−アリール、S−アルキル、S(O)−アリール、S(O)−アルキル、S(O)2−アリール、S(O)2−アルキル、Si−アリール、Si−アルキル、Si−O−アルキル、OCO−アルキル、OCO−アリール、SCO−アルキル、SCO−アリール、OCS−アルキル、OCS−アリール、SCS−アルキル、SCS−アリール、F、Cl、Br、I、SO2、SO3、SO4、OH、SH、NO2、CN、R′及びR″が個々に独立してH、アルキル又はアリールであるNR′R″、C(=O)O−アルキル、C(=O)O−アリール、C(=S)O−アルキル、C(=S)O−アリール、C(=O)S−アルキル、C(=O)S−アリール、C(=S)S−アルキル、C(=S)S−アリール、R′及びR″が個々に独立してH、アリール又はアルキルであるC(=O)NR′R″、R′がH、アルキル又はアリールであるR′CO−アルキル、R′がH、アルキル又はアリールであるNR′CO−アリール、R′がH、アルキル又はアリールであるNR′C(=O)O−アルキル、R′がH、アルキル又はアリールであるNR′C(=O)O−アリール、R′がH、アルキル又はアリールであるOCONR′−アルキル、R′がH、アルキル又はアリールであるOCONR′−アリール、R′及びR″が個々に独立してH、アルキル又はアリールであるNR′CONR″−アルキル、R′及びR″が個々に独立してH、アルキル又はアリールであるNR′CONR″−アリール、R′及びR″が個々に独立してH、アルキル又はアリールであるNR′CSNR″−アルキル並びにR′及びR″が個々に独立してH、アルキル又はアリールであるNR′CSNR″−アリールよりなる群から選択される置換基を示しており、2つのR部分は、オプションでスペーサを介した前記プレターゲティングプローブ又は前記エフェクタプローブとのリンカー部分に含まれる少なくとも1つのRを伴って環を共に形成することができ、X及びYは、個々に独立して、H又はアルキル、O−アルキル、S−アルキル、F、Cl、Br、I、SO2、NO2及びR及びR′が個々に独立してH又はアルキルNRR′よりなる群から選択される置換基を示しているか、又は、2つのR部分は結合を共に形成する、請求項1ないし5のいずれか一項に記載のキット。 - 前記同一面に固定された少なくとも2つの環外結合が、(a)縮合シクロプロピル環の単結合、(b)縮合シクロブチル環の単結合、(c)縮合芳香族環の混成結合、(d)酸素との環外二重結合及び(e)炭素との環外二重結合よりなる群から選択された、請求項6記載のキット。
- 前記ジエノフィルが、以下の構造、すなわち、
から選択された化合物であり、この化合物は、オプションでスペーサを介して前記プレターゲティングプローブ又は前記エフェクタプローブとの少なくとも1つの結合部を更に有する、請求項1ないし5のいずれか一項に記載のキット。 - 前記ジエンが、以下に定義される式(2)、(3)、(4)及び(5)、すなわち、
(2)、
式中、R1は、R′、R″及びR″′が個々に独立してH、アリール又はアルキルであるアルキル、アリール、CF3、CF2−R′、C(=O)R′、C(=S)R′、C(=O)O−R′、C(=O)S−R′、C(=S)O−R′、C(=S)S−R′、C(=O)NR′R″、C(=S)NR′R″、NR′C(=O)R″、NR′C(=S)R″、NR′C(=O)OR″、NR′C(=S)OR″、NR′C(=O)SR″、NR′C(=S)SR″、NR′C(=O)NR″R″′、NR′C(=S)NR″R″′よりなる群から選択され、A及びBは、A及びBが両方ともに炭素ではないという条件で、個々に独立して、アルキル置換炭素、アリール置換炭素、窒素、N+O−、RがアルキルであるN+Rよりなる群から選択され、Xは、O、N−アルキル及びC=Oよりなる群から選択され、Yは、RがH、アルキル、アリール、C(=O)OR′、C(=O)SR′、C(=S)OR′、C(=S)SR′、C(=O)NR′R″(R′及びR″は、個々に独立して、H、アリール又はアルキルである。)よりなる群から選択されたCRである。
(3)、
式中、R1及びR2は、個々に独立して、H、アルキル、アリール、CF3、CF2−R′、NO2、OR′、SR′、C(=O)R′、C(=S)R′、OC(=O)R″′、SC(=O)R″′、OC(=S)R″′、SC(=S)R″′、S(=O)R′、S(=O)2R″′、C(=O)O−R′、C(=O)S−R′、C(=S)O−R′、C(=S)S−R′、C(=O)NR′R″、C(=S)NR′R″、NR′C(=O)R″、NR′C(=S)R″、NR′C(=O)OR″、NR′C(=S)OR″、NR′C(=O)SR″、NR′C(=S)SR″、OC(=O)NR′R″、SC(=O)NR′R″、OC(=S)NR′R″、SC(=S)NR′R″、NR′C(=O)NR′R″、NR′C(=S)NR′R″よりなる群から選択されたものであり、R′及びR″は個々に独立してH、アリール又はアルキルであり、R″′は独立してアリール又はアルキルであって、Aは、N−アルキル、N−アリール、C=O及びCN−アルキルよりなる群から選択されたものであり、BはOであり、Xは、N、CH、C−アルキル、C−アリール、CC(=O)R′、CC(=S)R′、CS(=O)R′、CS(=O)2R″′、CC(=O)O−R′、CC(=O)S−R′、CC(=S)O−R′、CC(=S)S−R′、CC(=O)NR′R″、CC(=S)NR′R″よりなる群から選択されたものであり、R′及びR″は個々に独立してH、アリール又はアルキルであり、R″′は独立してアリール又はアルキルであって、Yは、CH、C−アルキル、C−アリール、N及びN+O−よりなる群から選択されたものである。
(4)、
式中、R1及びR2は、個々に独立して、H、アルキル、アリール、CF3、CF2−R′、NO2、OR′、SR′、C(=O)R′、C(=S)R′、OC(=O)R″′、SC(=O)R″′、OC(=S)R″′、SC(=S)R″′、S(=O)R′、S(=O)2R″′、C(=O)O−R′、C(=O)S−R′、C(=S)O−R′、C(=S)S−R′、C(=O)NR′R″、C(=S)NR′R″、NR′R″、NR′C(=O)R″、NR′C(=S)R″、NR′C(=O)OR″、NR′C(=S)OR″、NR′C(=O)SR″、NR′C(=S)SR″、OC(=O)NR′R″、SC(=O)NR′R″、OC(=S)NR′R″、SC(=S)NR′R″、NR′C(=O)NR′R″、NR′C(=S)NR′R″よりなる群から選択されたものであり、R′及びR″は個々に独立してH、アリール又はアルキルであり、R″′は独立してアリール又はアルキルであって、Aは、N、C−アルキル、C−アリール及びN+O−よりなる群から選択されたものであり、BはNであり、Xは、N、CH、C−アルキル、C−アリール、CC(=O)R′、CC(=S)R′、CS(=O)R′、CS(=O)2R″′、CC(=O)O−R′、CC(=O)S−R′、CC(=S)O−R′、CC(=S)S−R′、CC(=O)NR′R″、CC(=S)NR′R″よりなる群から選択されたものであり、R′及びR″は個々に独立してH、アリール又はアルキルであり、R″′は独立してアリール又はアルキルであって、Yは、CH、C−アルキル、C−アリール、N及びN+O−よりなる群から選択されたものである。
(5)
式中、R1及びR2は、個々に独立して、2−ピリジル、3−ピリジル、4−ピリジル、2,6−ピリミジル、3,5−ピリミジル、2,4−ピリミジル、又は、オプションで、NO2、F、Cl、CF3、CN、COOH、COOR、CONH2、CONHR、CONR2、CHO、COR、SO2R、SO2OR、NO、Arのような1つ以上の電子求引基で置換されたフェニルよりなる群から選択される置換基を示しており、RはC1ないしC6のアルキルであり、Arは芳香族基、特に、フェニル基、ピリジル基又はナフチル基を表している。
の化合物よりなる群から選択され、前記ジエンが、オプションでスペーサを介して前記プレターゲティングプローブ又は前記エフェクタプローブとの少なくとも1つの結合部を有する、請求項1ないし8のいずれか一項に記載のキット。 - 前記プレターゲティングプローブが、一次ターゲティング部分として抗体を有する、請求項1ないし9のいずれか一項に記載のキット。
- 前記エフェクタプローブが、エフェクタ部分として検出可能な標識を有し、好ましくは、MRIにより画像形成可能な薬剤、スピン標識、光学的標識、超音波に反応する薬剤、X線に反応する薬剤、放射性核種、FRETタイプの色素、(生物)発光若しくは蛍光分子又はタグ、ビオチン、常磁性イメージング剤及び超常磁性イメージング剤よりなる群から選択されるイメージングシステムに用いる造影剤を有する、請求項1ないし10のいずれか一項に記載のキット。
- 前記エフェクタプローブが、エフェクタ部分として薬学的活性化合物を有する、請求項1ないし11のいずれか一項に記載のキット。
- 前記薬学的活性化合物が、24Na、32P、33P、47Sc、59Fe、67Cu、76As、77As、80Br、82Br、89Sr、90Nb、90Y、103Ru、105Rh、109Pd、111Ag、121Sn、127Te、131I、140La、141Ce、142Pr、143Pr、144Pr、149Pm、149Tb、151Pm、153Sm、159Gd、161Tb、165Dy、166Dy、166Ho、169Er、172Tm、175Yb、177Lu、186Re、188Re、198Au、199Au、211At、211Bi、212Bi、212Pb、213Bi、214Bi、223Ra及び225Acよりなる群から選択された同位体である、請求項12記載のキット。
- 以下の構造、すなわち、
から選択される化合物。 - 一次ターゲティング部分及び生体直交型の反応基を有し、前記生体直交型の反応基は、請求項9に記載の式(2)ないし(5)のいずれか1つに従うジエンと、請求項1ないし8のいずれか1項に記載のジエノフィルとの[4+2]逆ディールス・アルダー反応に対する反応相手である、プレターゲティング剤。
- 検出可能な標識、好ましくは、3H、11C、13N、15O、18F、19F、51Cr、52Fe、52Mn、55Co、60Cu、61Cu、62Zn、62Cu、63Zn、64Cu、66Ga、67Ga、68Ga、70As、71As、72As、74As、75Se、75Br、76Br、77Br、80Br、82Br、82Rb、86Y、88Y、89Sr、89Zr、97Ru、99Tc、110In、111In、113In、114In、117Sn、120I、122Xe、123I、124I、125I、166Ho、167Tm、169Yb、193Pt、195Pt、201Tl及び203Pbよりなる群から選択された同位体と、生体直交型の反応基とを有し、前記生体直交型の反応基は、請求項9に記載の式(2)ないし(5)のいずれか1つに従うジエンと、請求項1ないし8のいずれか1項に記載のジエノフィルとの[4+2]逆ディールス・アルダー反応に対する反応相手である、イメージングプローブ。
- 薬学的活性化合物、好ましくは、24Na、32P、33P、47Sc、59Fe、67Cu、76As、77As、80Br、82Br、89Sr、90Nb、90Y、103Ru、105Rh、109Pd、111Ag、121Sn、127Te、131I、140La、141Ce、142Pr、143Pr、144Pr、149Pm、149Tb、151Pm、153Sm、159Gd、161Tb、165Dy、166Dy、166Ho、169Er、172Tm、175Yb、177Lu、186Re、188Re、198Au、199Au、211At、211Bi、212Bi、212Pb、213Bi、214Bi、223Ra及び225Acよりなる群から選択される同位体と、生体直交型の反応基とを有し、前記生体直交型の反応基は、請求項9に記載の式(2)ないし(5)のいずれか1つに従うジエンと、請求項1ないし8のいずれか1項に記載のジエノフィルとの[4+2]逆ディールス・アルダー反応に対する反応相手である、治療プローブ。
- 請求項15記載のプレターゲティング剤を被験体に投与することと、一次標的との一次ターゲティング部分の結合を達成するのに効率的な期間、前記プレターゲティング剤が前記被験体の系において循環することを可能にすることと、その後、体内から結合していないプレターゲティング剤を排除することとを有する、プレターゲティング方法。
- 請求項18記載のプレターゲティング方法を行うことと、その後、請求項16記載のイメージングプローブを投与することとを有し、プレターゲティング剤及び前記イメージングプローブの生体直交型の反応基が、前記[4+2]逆ディールス・アルダー反応に対する反応相手をともに形成する、イメージング方法。
- 請求項18記載のプレターゲティング方法を行うことと、その後、請求項17記載の治療プローブを投与することとを有し、プレターゲティング剤及び前記治療プローブの生体直交型の反応基が、前記[4+2]逆ディールス・アルダー反応に対する反応相手をともに形成する、被験体における標的医療処置の方法。
- 請求項18ないし20のいずれか1項に記載の方法に用いる請求項15記載のプレターゲティング剤。
- 動物又は人間におけるプレターゲティング方法に用いる請求項1ないし8のいずれか1項に記載の又は請求項14に記載の化合物。
- 逆ディールス・アルダー反応に基づくプレターゲティング方法におけるジエノフィル反応物質としての請求項1ないし8のいずれか1項に記載の又は請求項14に記載のトランスシクロオクテンの使用。
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