JP5992435B2 - 循環からの生体分子の除去剤 - Google Patents
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Description
他の例は、抗体指向酵素プロドラッグ治療(Antibody Directed Enzyme Prodrug Therapy)(ADEPT)のために使用される抗体抱合体であり、ここで、あらゆる抗体抱合体を、前記プロドラッグ投与の前に循環から除去することが有利であろう。除去アプローチにより有利であり得る他の治療剤は、抗体−薬剤抱合体である。これらの抱合体は、長時間循環するが、高い毒性薬物を含み、高安定性であるために抱合リンカーを必要とする。除去剤の使用は、あらゆる遊離の抗体医薬抱合体を、十分な量が腫瘍に結合した後循環から除去することを可能にする。
従って、上記除去剤への高い要求を満たす新規な除去剤を提供するための強い必要性が存在する。本発明は、とりわけ、ここで説明される除去剤が、例えば腫瘍などの前記ターゲットには迅速に反応することなく、迅速に血液中で反応して、それにより以下で定義されるであろうTCOなどのターゲット結合分子を、前記プレターゲットプローブとの反応のために遊離させる、という認識に基づく。前記の1以上の要求により良好に対処するために、本発明は、1つの側面で、対象体に投与されるべき投与剤と、同じ対象体へ投与されて前記対象体の血液から循環する投与剤を除去するための除去剤との組合せを提供し、ここで前記投与剤が第1の反応性基を含み、かつ前記除去剤が第2の反応性基を含み、該第1及び第2の反応性基が、互いに生体直交反応性(bio−orthogonally reactive)であるように選択された生体直交反応性基であり、前記生体直交反応性基のいずれかがジエノフィルであり、他の基がジエンであり、前記ジエノフィルが式(1)を満たす8員環ジエノフィルであり:
本発明の除去の概念は、以前に投与された投与剤の循環からの除去のために妥当である。前記投与剤は、循環から過剰分が除去されることが望ましいあらゆる剤であり得る。これは特には、対象体、とりわけヒト対象体の体内の腫瘍などの位置に薬物又は造影剤をターゲット輸送するイベントの場合である。本発明においては、前記投与剤がどの機能又は化学的構造を有するということが、いかなる特別の役割を担うものではない。唯一の要件は、生体直交性反応基が提供される、ということである。前記生体直交性反応基の前記投与剤との正確なリンケージは、両方の分子構造に依存するであろうが、留意すべきことは、種々の生体分子について多くの知られた結合部位が存在するので、これは通常当業者にとって特定の課題を表すものではないということである。前記リンケージは、場合により、2から200、特には3から113及び好ましくは5から50の繰り返し単位のポリエチレングリコール(PEG)鎖などのスペーサーを介することも可能である。
除去剤は、その最小成分として、除去目的成分及び結合成分を含む。前記結合成分は、上記で説明した生体直交性反応基である。前記除去目的成分は、前記捕捉された投与剤を排出器官へ指向することで循環からの除去を保証する。
本発明は、一般的に、互いに生体直交性反応性を示す非生物的反応性化学基の全ての対へ適用可能である。生体直交性反応は、生理的条件下で起こり、ここで、前記生体直交性反応性基は互いのみを認識し、一方それらの細胞的/生理学的環境を無視する。
Aは、N−アルキル、N−アリール、C=O及びCN−アルキルからなる群から選択され;BはO又はSであり;Xは、N、CH,C−アルキル、C−アリール、CC(=O)R’、CC(=S)R’、CS(=O)R’、CS(=O)2R’’’、CC(=O)O−R’、CC(=O)S−R’、CC(=S)O−R’、CC(=S)S−R’、CC(=O)NR’R’’、CC(=S)NR’R’’(ここでR’及びR’’はそれぞれ独立してH、アリール又はアルキルであり、R’’’は独立してアリール又はアルキル)からなる群から選択され;Yは、CH、C−アルキル、C−アリール、N及びN+O−からなる群から選択される。
Aは、N、CH、C−アルキル、C−アリール、CC(=O)O−アルキル及びN+O−からなる群から選択され;BはNであり;Xは、CH、C−アルキル、C−アリール、CC(=O)O−アルキル及びN、からなる群から選択され;Yは、CH、CCN、C−アルキル、C−アリール、N及びN+O−からなる群から選択される。
上記の通り、好ましい実施態様では前記投与剤はプレターゲットプローブである。
本発明で使用される「プライマリーターゲット」は、診断及び/又は造影法で検出されるべき、及び/又は医薬活性化合物又は他の治療的手法により変更され、結合され又は対処されるべきターゲットに関連する。
エフェクタープローブは、望ましい診断、造影、及び/又は治療効果を与えることのできるエフェクター部位を含む。前記エフェクタープローブはさらに、セカンダリーターゲット部分を含む。
又は、前記治療プローブ中の前記薬物は、光力学療法のための感光薬から選択される。
全ての試薬及び溶媒は、市販品(試薬はSigma−Aldrich、Acros、Biosolve、ABCR、Invitrogen及びMerckから入手、通常の及び重水素化溶媒はBiosolve、Merck及びCambridge Isotope Laboratoriesから入手)から入手し、特に記載されていない限りさらに精製することなく使用した。ポリスチレンミクロ粒子(ポリビーズ、0.5μm)はPolysciencesから入手した。塩化[111In]インジウム及び[125I]ヨウ化ナトリウム溶液はPerkin Elmerから入手した。水は蒸留して、milli−Q水濾過システム(Millipore)で脱イオン化(18MΩcm)した。前記ラベル緩衝液は、Chelex−100樹脂(BioRad Laboratories)で一晩処理し、次に0.22μmを通してろ過し、4℃で貯蔵した。ビシンコニン酸(BCA)アッセイのキット、ゲルコード青色タンパク質染色溶液及びZeba脱塩スピンカラム(7kDa及び40kDa MWCO、0.5−2mL)はPierce ProteinResearch(ThermoFisher Scientific)から入手した。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)pH7.4を調製するための錠剤はCalbiochem(Merck)から入手した。AmiconUltra−4及びUltra−15遠心濾過ユニット(30及び50kDaMWカットオフ)はMilliporeから入手した。マウス血清及びマウス血清アルブミンはInnovative Researchから入手した。テトラジン15の合成及び放射性ラベル化(図7)、及びトランスシクロオクテンの前記mAb(CC49)抱合は、Rossinらの「Angew Chem IntEd 2010、49、3375−8」に記載の方法で実施した。
NMRスペクトルはCDCl3又は[D6]DMSO中で、Bruker DPX300スペクトルメータ又はBruker Avance400スペクトルメータで測定した。13CNMR多重度(q=4級、t=3級、s=2級及びp=1級)はDEPTパルスシーケンスを用いて識別した。赤外線吸収スペクトルは、Perkin Elmer1600FT−IRを用いて測定した。前記MSA−抱合物のMALDI−TOF質量スペクトル(ポジティブ、直線モード)は、α−シアノ−4−ヒドロキシ−ケイ皮酸(CHCA)のマトリクスを用いてVoyager−DE(商標)Pro(PerSeptive Biosystems、PE)により測定した。
ヒト大腸癌細胞株LS174TはATCCから入手し、10%熱不活性化ウシ胎児血清(Gibco)、ペニシリン(100U/mL)、ストレプトマイシン(100μg/mL)及び2mMのGlutamaxを追加したEagleの最小必要培地(Sigma)中に保持した。ヌードメスBalb/Cマウス(20〜25g体重、CharlesRiver Laboratories)に、100μLの滅菌PBS中の5x106細胞を皮下接種した。
前記テトラジン誘導部位を本発明の除去剤対象物を得るために足場へリンクする一例として分子5を製造する。分子5は、N−ヒドロスクシニミジル部位であり、前記分子は、前記足場に、例えばタンパク質に存在するアミノ基とカップリングさせるために使用される。
tert−ブチル 1−アミノ−3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36−ドデカオキサノナトリアコンタノ−39−エート2(123mg、0.182mmol;IRISBiotechGmbH)を、乾燥した反応管へ添加し、トルエンで2回同時蒸発させた(co−evaporated)。前記管を、次いで窒素雰囲気下に置き、極(extra)乾燥DMF(2ml)を添加して無色溶液とした。極乾燥DMF(1mL)中に溶解した、1(100mg、0.274mmol)及び(ベンゾトリアゾール−1−イルオキシ)トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(BOP;267mg、0.603mmol)を順に、窒素雰囲気下で反応溶液に添加し、赤色懸濁物を得た。最後に、DIPEA(0.5mL、2.74mmol)を反応溶液に滴加し、得られた溶液を一晩撹拌した。前記反応混合物を蒸発させて乾燥し、これをDCM(2mL)に溶解し、DCM中で1〜10%MeOHのグラジエントを用いて、シリカゲル上でフラッシュカラムクロマトグラフにより精製した。関連する画分を集めて真空蒸発させて、暗ピンク色固体として3を得た(167mg、0.164mmol、90%)。
1HNMR(300MHz、CDCl3):δ=10.58(s、1H)、9.05(d、J=2.4Hz、1H)、8.93(ddd、J1=0.9Hz、J2=1.7Hz、J3=4.7Hz、1H)、8.62(d、J=8.8Hz、1H)、8.59(d、J=8.6Hz、1H)、8.43(dd、J1=2.4Hz、J2=8.8Hz、1H)、8.15(td、J1=1.8Hz、J2=7.8Hz、1H)、7.93(t、J=5.5Hz、1H)、7.73(ddd、J1=1.1Hz、J2=4.7Hz、J3=7.8Hz、1H)、3.57(t、J=6.2Hz、2H)、3.53−3.47(broads、46H)、3.25−3.16(m、2H)、3.41(t、J=6.2Hz、2H)、2.44(t、J=7.3Hz、2H)、2.17(t、J=7.3Hz、2H)、1.85(q、J=7.3Hz、2H)、1.38(s、9H);13CNMR(75MHz、CDCl3):δ=172.1(q)、171.7(q)、170.4(q)、163.0(q)、162.8(q)、150.6(t)、150.2(q)、143.8(q)、141.3(t)、138.5(q)、137.8(t)、126.5(t)、126.1(t)、124.8(t)、124.2(t)、79.7(q)、69.8(s)、69.7(s)、69.6(s)、69.5(s)、69.1(s)、66.2(s)、38.5(s)、35.8(s)、35.7(s)、34.4(s)27.7(p)、20.9(s)。
撹拌した、3(160mg、0.157mmol)の無水DCM(2mL)溶液中に、窒素雰囲気下でTFA(2mL)を添加した。反応混合液を2時間室温で撹拌し、その後蒸発乾燥させた。残渣を乾燥DCM(2mL)に再溶解して再びTFA(2mL)と2時間処理した。このプロセスをもう一度繰り返した。最後に前記反応混合液を蒸発させて乾燥し、DCMで2回同時蒸発させ、脱保護された生成物4を定量的に得た。1HNMR(300MHz、CDCl3):δ=10.57(s、1H)、9.05(broads、1H)、8.94(broads、1H)、8.63(d、J=8.4Hz、1H)、8.60(d、J=7.2Hz、1H)、8.43(dd、J1=2.4Hz、J2=8.8Hz、1H)、8.16(td、J1=1.7Hz、J2=7.8Hz、1H)、7.93(t、J=5.5Hz、1H)、7.74(dd、J1=4.7Hz、J3=6.8Hz、1H)、3.58(t、J=6.4Hz、2H)、3.53−3.46(broads、46H)、3.41(t、J=6.0Hz、2H)、3.25−3.17(m、2H)、2.44(t、J=7.3Hz、2H)、2.17(t、J=7.3Hz、2H)、1.85(q、J=7.3Hz、2H)。
無水DCM(3mL)中の4(150mg,0.155mmol)の撹拌溶液中に、N2雰囲気下で0℃で、順に、ジ−(N−スクシニミジル)カーボネート(47.8mg、0.187mmol)、ピリジン(15μL)及びトリエチルアミン(0.25mL)を添加した。混合物を2時間撹拌し、その間に室温まで加温し、次に蒸発させて乾燥し、DCM(20mL)中で再溶解して、H2Oで洗浄(10mLで3回)した。有機層をMgSO4上で乾燥し、ろ過した後真空蒸発させて、暗ピンク色固体として5を得た(94mg、0.089mmol,57%)。1HNMR(300MHz、CDCl3):δ=9.67(s、1H)、9.01−8.97(m、2H)、8.77−8.71(m、2H)、8.64(dd、J1=2.4Hz、J2=8.8Hz、1H)、8.02(td、J1=1.7Hz、J2=7.7Hz、1H)、7.58(ddd、J1=1.1Hz、J2=4.7Hz、J3=7.5Hz、1H)、6.60(t、J=5.4Hz、1H)、3.84(t、J=6.4Hz、2H)、3.70−3.55(ブロードs、46H)、3.52−3.43(m、2H)、2.90(t、J=6.5Hz、2H)、2.85(s、4H)、2.58(t、J=6.8Hz、2H)、2.37(t、J=6.8Hz、2H)、2.09(q、J=6.8Hz、2H);13CNMR(75MHz、CDCl3):δ=172.9(q)、172.5(q)、168.9(q)、166.7(q)、163.6(q)、163.4(q)、151.0(t)、150.3(q)、144.0(q)、142.0(t)、138.6(q)、137.4(t)、126.5(t)、126.4(t)、125.1(t)、124.3(t)、70.7(s)、70.5(s)、70.2(s)、69.6(s)、65.7(s)39.3(s)、35.9(s)、35.0(s)、32.1(s)25.6(s)、21.3(s)。
図3で概説される除去剤の一例として化合物12(図5参照)を調製する。化合物12は、前記反応相手と反応させるために9から10のテトラジン分子で官能化されたタンパク質状足場(マウス血清アルブミン;MSA)を含み、前記反応相手はこの場合はシクロオクテン誘導体であり、前記レトロ−DA反応を介するプレターゲットプローブ上にあり、かつ肝臓のアシュウェルレセプターと相互作用するための16から18ガラクトース分子を持つ。
無水MeOH溶液中の0.1Mのシアノメチル 2、3、4、6−テトラ−O−アセチル−1−チオ−β−D−ガラクトピラノシド(8)に、無水MeOH中の0.1MのNaOMe溶液の容積の1/10を添加し、前記混合物を一晩反応させた(1000rpmで振盪)。生成物の比率(化合物9の化合物10に対するもの)を1H−NMRで決定し(以下のスペクトルデータを参照)、典型的には、0.7と1の間であった。
ガラクトースカップリング剤2−イミノ−2−メトキシエチル−1−チオ−β−D−ガラクトピラノシド(9)は図5に示されるように、2、3、4、6−テトラ−O−アセチル−α−D−ガラクトピラノシルブロミド(6)から出発して3段階で、中間体2−S−(2、3、4、6−テトラ−O−アセチル−β−D−ガラクトピラノシル)−2−チオウロニウムブロミド(7)及びシアノメチル 2、3、4、6−テトラ−O−アセチル−1−チオ−β−D−ガラクトピラノシド(8)を経て製造された。
2、3、4、6−テトラ−O−アセチル−α−D−ガラクトピラノシルブロミド(6;15.00g、36.48mmol)及びチオ尿素(3.05g、40.07mmol)をアセトン(75ml)に溶解した。前記溶液を加熱して2時間還流し、続いて濾過し、20℃へ冷却した。ペンタン(75mL)を添加して生成物を白色結晶性固体として沈殿させた(16.11g,91%)。1H−NMR(400MHz、[D6]DMSO、):δ=1.95(s、3H、CH3)、2.01(s、3H、CH3)、2.08(s、3H、CH3)、2.14(s、3H、CH3)、4.09(m、2H、H6、H6’)、4.45(t、J=6.4Hz、1H、H5)、5.11(t、J2、3=10Hz、1H、H2)、5.22(dd、J2、3=9.9Hz、J3、4=3.2Hz、1H、H3)、5.39(d、J3.2Hz、1H、H4)、5.71(d、J1、2=10Hz、1H、H1)、9.11(br、2H、NH2)、9.35(br、2H、NH2)。
2−S−(2、3、4、6−テトラ−O−アセチル−β−D−ガラクトピラノシル)−2−チオウロニウムブロミド(7;16.11g、31.07mmol)、メタ重亜硫酸ナトリウム(11.81g、62.14mmol)、炭酸カリウム(4.72g、34.18mmol)及びクロロアセトニトリル(8.21g、108.7mmol)をアセトン/水(50:50体積/体積、200mL)中に溶解し、室温で1時間撹拌した。反応混合物を氷水(300mL)へ投入し、かつさらに2時間撹拌した。白色沈殿を濾過して回収し、熱メタノール(30mL)から再結晶した。生成物を濾過し、白色結晶固体として得た(9.61g、77%)。融点=97℃(文献値:95から97℃)。11H−NMR(400MHz、CDCl3):δ=2.00(s、3H、CH3)、2.07(s、3H、CH3)、2.09(s、3H、CH3)、2.17(s、3H、CH3)、3.35(d、J=17Hz、1H、S−CH)、3.64(d、J=17Hz、1H、S−CH’)、4.01(t、J6.9Hz、1H、H5)、4.16(m、2H、H6、H6’)、4.7(d、J1、2=10Hz、1H、H1)、5.11(dd、J3、4=3.2Hz、J2、3=10Hz、1H、H3)、5.24(t、J=10Hz、1H、H2)、5.47(d、J=2.4Hz、1H、H4)。FT−IR(ATR):ν=2249(CN、w)、1739(C=O、s)。
シアノメチル 2、3、4、6−テトラ−O−アセチル−1−チオ−β−D−ガラクトピラノシド(8;2.02g、5.00mmol)を無水MeOH(50mL)に溶解し、ナトリウムメトキシドのメタノール溶液(25重量%、115μL、0.50mmol)を添加した。反応混合物を室温で24時間撹拌し、続いて15mLまで容積を濃縮した。生成物を室温で、さらに−18℃で再結晶化させた(1.11g;83%)。融点=129℃。1H−NMR(400MHz、CD3OD):δ=3.44(dd、J2、3=10Hz、J3、4=4.2Hz、1H、H3)、3.52(dd、J2、3=10Hz、J1、2=9.0Hz、1H、H2)、3.54(m、1H、H5)、3.73(−OCH3)、3.78(m、2H、H6、H6’)、3.87(dd、J3、4=4.0Hz、J4、5=1.5Hz、1H、H4)、4.27(d、J1、2=9.6Hz、1H、H1)。FT−IR(ATR):ν=3287(N−H、s)、1650(C=NH、s)。
PBS pH7.4/0.5Mホウ酸塩緩衝液pH8.5の10:1混合物(900μL)に溶解したMSA(20mg、0.303μmol)の溶液に、同じ緩衝液混合物(200μL)中の新たに調製した2−イミノ−2−メトキシエチル−1−チオ−β−D−ガラクトピラノシド(9)の18.2mg/mlストック溶液を添加し、MSAに関して45倍モル過剰のガラクトースカップリング剤(9)を得た。前記反応混合物を室温で2時間振盪(1000rpm)し、次いで予め水で平衡化させたZeba脱塩スピンカートリッジ(7kDaMWCO、Pierce)を用いて脱塩した。凍結乾燥後、ガラクトース−MSA(化合物11)を白色綿状固体として得た(15.3mg,72%)。ガラクトース変性の程度を、続いてMALDI−TOFにより分析した:MSA:MH+=65941。ガラクトース−MSA:MH+=69823であり、これは平均16.4ガラクトース/MSA(添加ガラクトース断片の質量は236Da)である。異なるバッチ間の変動は、約16から18ガラクトース/MSAである。4℃での水中でガラクトース−MSAの10mg/ml溶液の安定性は、全部で5ヶ月かけて2週間ごとにMALDI−TOF分析を繰り返して評価した。抱合物は安定であることが示された。
PBS中のガラクトース−機能化マウス血清アルブミン(11、ガラクトース−MSA、1mg)の溶液を、DMF中のテトラジン−NHS(5)の10mg/mL溶液(30μL、ガラクトース−MSAに対して20当量)と混合し、1M炭酸塩緩衝液pH9.6(7.5μL)を添加した。溶液(合計250μL)を37℃で30分間インキュベートし、次にこれをUltra−15遠心濾過ユニット(30kDaMWカットオフ)へ移した。生成物12を水で十分に洗浄し、次に一晩凍結乾燥してピンク色綿状粉末を得た。テトラジン変性の程度は、MALDI−TOF分析により決定した。ガラクトース−MSA−テトラジン:MH+=79010であり、これは平均9.7テトラジン/ガラクトース(16.4)−MSAに対応する(添加テトラジン断片の質量は948Da;MH+(ガラクトース(16.4)−MSA)=69823)。ナノドロップでのUV−VIS測定は、分子当たり9から10のテトラジンの存在を確認した(測定値:8.9テトラジン/ガラクトース(16.4)−MSA)。
化合物14は、前記レトロDA反応を介して血液中でプレターゲットプローブと反応し、それを、サイズなどの物理化学的性質により排出器官、例えば肝臓へ運ぶ除去剤の例として合成される。化合物14は、テトラジン官能化タンパク質でコーティングされたポリスチレンビーズを含み、図6で概説されるように合成された。
テトラジン放射線ラベル化:
DOTA抱合テトラジン(15;図7、Rossinらの「Angew Chem IntEd 2010、49、3375」に記載)を、0.2M酢酸アンモニウムpH7.0中に溶解(1mg/mL)し、使用前に−80℃で保存した。15の一定量を塩化[111In]インジウムの適切な量と組み合わせて、ゆっくりと撹拌しつつ37℃で10分間インキュベートした。次に、5μLの10mM DTPAを添加して溶液をさらに5分間インキュベートした。典型的には、定量的ラベル収率及び98%を超える放射化学純度がこの方法で得られた。
50μLのPBS中の[125I]ヨウ化ナトリウム(5〜15MBq)の十分な量に、DMSO中のBolton−Hunter試薬(N−スクシニミジル−3−[4−ヒドロキシフェニル]プロピオネート(SHPP))の1mg/mL溶液の1μL、及び`PBS中のクロラミン−T(N−クロロ−4−メチルベンゼンスルホンアミド、ナトリウム塩)の4mg/mLの25μLを添加した。得られた溶液を10〜20秒混合して、5μLのDMF及び100μLのトルエンを前記管に添加し、及び125I−SHPPを有機層で抽出し、次にこれをガラス管に移した。トルエンをN2のゆっくりとした流れで除去し、その後CC49−TCO溶液(50〜250μLのPBS中の0.1〜0.5mg、Rossinらの「Angew Chem IntEd2010、49、3375−8」に記載)を加え、pHを1M 炭酸塩緩衝液で9に調節し、及び反応混合物を室温で30分間ゆっくりと振盪しながらインキュベートした。インキュベート後、前記ラベル化収率を放射性−ITLCで決定した。粗反応混合物を次に、生理食塩水で予備平衡化させたZebaスピン脱塩カラム(40kDaMWCO、Pierce)に負荷した。前記反応管を20μL生理食塩水でリンスし、リンスされたものも前記カラムに同様に負荷した。Zeba精製後、125I−CC49−TCO溶液の放射化学性純度を放射性−ITLC、放射性−HPLC及びSDS−PAGEで決定し;タンパク質濃度はBCAアッセイで決定した。
本発明の除去剤目的物を使用する方法の一例として、除去剤12及び14の注入の有無での125I−CC49−TCOの血中動態を示す。
本発明の除去剤対象物を使用する方法の例示として、プレターゲットプローブ(125I−CC49−TCO)を注射し、続いて異なる量の除去剤(12)の投与を含む前記エフェクタープローブ(111In−15)を注射する場合に得られる腫瘍取り込み及び腫瘍対血液(T/B)比率が示される。
本発明の除去剤対象物の使用の方法の例として、前記プレターゲットプローブ(125I−CC49−TCO)を注射し、その後除去剤12の単一投与量及び繰り返し投与量の投与によるエフェクタープローブ(111In−15)の注射の際の、選択された組織での生体内分布及び腫瘍対器官(T/B)比率が示される。
追加のトランス−シクロオクテン構成物及びその対応する抗体抱合物の化学合成
前記TCOと抗体への抱合は、R.Rossin、P.RenartVerkerk、SandraM.vandenBosch、R.C.M.Vulders、l.Verel、J.Lub、M.S.Robillardの「Angew Chem IntEd2010、49、3375−78」の記載されたとおりに行った。
図13が参照される。
合成経路の詳細は図14を参照。
本発明の除去剤対象物を使用する方法の例示として、プレターゲットプローブ(125I−CC49−TCO)を注射し、続いて1又は2の投与量の除去剤(12)の投与による前記111Lu−ラベルされたテトラジン15を注射する場合に得られる、選択された器官の生体分布及び腫瘍対血液(T/器官)比率が示される。この実施例で使用されたガラクトース−MSA−テトラジン12は、図5で示される手順2により合成され、ここで合成中間体11は、5との反応の前にサイズ排除クロマトグラフで精製してアルブミン凝固物を除去した。
CC49−TCO 20でプレターゲットされた腫瘍を有するマウスでの177Lu−テトラジン 15の生体分布
腫瘍を有するマウス(約100mm3の腫瘍サイズ;n=4)は、7.5 TCO−20グループ(100μg/マウス、約0.2MBq)で機能化された125I−CC49を注射された。mAb注射後30及び48時間で、マウスは一回の除去剤(ガラクトース−MSA−テトラジン、160μg/投与)を投与され、続いて2時間後に177Lu−テトラジン 15(前記mAbに対して10当量、約0.5MBq)を投与された。テトラジン投与後3時間で、マウスは麻酔され頸椎脱臼で屠殺し、心臓穿刺で血液を取り出し、関心のある組織及び器官を採取してブロット乾燥した。全ての集めたサンプルは秤量され、1mLのPBSを添加された。前記サンプルの放射性は、二重同位体プロトコルにより(125Iでは10から80keV窓、177Luについては155から380keV窓)、1グラムの組織当たりの注入投与量パーセント(%ID/g)を決定するために標準物質に沿ってガンマーカウンターで測定された。
抗体DOTA抱合及び177Lu−放射性ラベル化:
2mgのCC49(PBS中の5mg/mL溶液)を、4当量のDOTA−NHS(10mg/mLのDMSO;Macrocyclics)を全容積500μLのPBS中で変性した。pHを1M炭酸ナトリウム緩衝液pH9.6で9に調節した。反応は、室温で30分間暗所で撹拌することで行った。続いて、前記DOTA−CC49をPBSで、AmiconUltra−15遠心分離デバイスで十分に洗浄し、最終溶液中のmAb濃度をNanodropにて測定した。mAb分子当たりのDOTA基の数は、既定量のDOTA−CC49を既定の過剰量のLuCl3(放射性177Luがスパイクされたもの)と2時間37℃で反応させることにより、及び放射性−ITLC(nDOTA=nLux反応収率/100)により%結合Luを測定することにより計算された。この手順で、抱合後、CC49分子当たり、平均3DOTA基が検出された。
直接ラベルされた177Lu−DOTA−CC49の及びCC49−TCO−18プレターゲットされた177Lu−テトラジンの比較生体分布
LS174T異種移植(70から100mm3)された4マウスの群に、直接ラベルされた177Lu−DOTA−CC49(マウス当たり100μg/100μl、約0.5MBq)又はCC49−TCO−18でプレターゲットされた177Lu−テトラジン 15(100μg/100μl CC49−TCO−18、続いて2回の160μg/100μl投与量のガラクトース−MSA−テトラジン 12を30及び48時間で、及びマウス当たり8.52μg/80μl 177Lu−テトラジン 15、0.8から1.2MBq、100μgゲンチシン酸を含む)を注射した。177Lu−DOTA−CC49を注射されたマウスの1群及びプレターゲットされた177Lu−テトラジンを注射されたマウスの1群を使用して、選択された時点で、伏在静脈から血液サンプルを取り出され、2つのトレーサーの初期血液分布を評価した(177Lu−DOTA−CC49については、2、30及び60分、及びプレターゲットされた177Lu−テトラジンについては2、5、10、20、30及び45分後)(図15)。これらの2つの群のマウスを次に、177Lu−DOTA−CC49及び177Lu−テトラジンの注射後それぞれ3時間及び1時間後に屠殺した。全ての他のマウス群は、トレーサー注射後7日まで種々の時点で屠殺された。屠殺後、血液を心臓穿刺により取り出し、選択された器官及び組織が採取されブロット乾燥された。血液サンプル及び組織サンプルは秤量されて、1mLのPBSを加え、放射活性を、標準物質に沿ってガンマカウンターで測定して%ID/g及び%IDを決定した(表7、8)。腫瘍を有するマウスの2つの追加の群は、排泄プロフィルのために使用された(図16)。177Lu−DOTA−CC49を注射されたマウスは、濾過カゴユニット内に置かれて種々の時点で床を標準物質に沿ってガンマカウンターで測定した。マウスの他の群はより高い比放射能で177Lu−テトラジン(マウス当たり約12MBq/8.52μgテトラジン)を注射され、全身除去を種々の時点で線量計装器(dose calibrator)で動物を測定することでモニターした。
ヒト及びマウス線量:従来の放射免疫治療とディールスアルダー反応でのプレターゲット方法との比較:
放射線線量の見積もりは、男性ヒトモデル(73kgの一般成人)及びボクセル化(voxelized)マウスモデルについて、MIRD手法により前記のマウス生体分布データ(実施例12、表7及び8)を計算した。これらの器官の活性濃度は、注射量パーセント投与量(%ID)に変換され、崩壊については注射時に補正された。血液、筋肉及び骨についての%IDは、組織の%ID/g及び体重の6%、42%及び11%と仮定して見積もられた。可能な場合には、時間活性曲線は、2相指数的除去関数でフィッティングさせた。フィッティング関数は次に積分して分析し、器官滞留時間を得た(表9)。曲線フィッティングができない場合には、積分は、最後に測定された生体分布時点を過ぎた活性は放射線崩壊によってのみ減少する、と仮定して台形方法で実行した。腫瘍での時間活性曲線は、F(t)=a0(1−exp(−a1t))として定められる単一の指数的取り込み関数によりフィッティングさせた。
・血液滞留時間の10%は、心臓内容物に、及び90%は身体の残部に帰属する;
・小腸及び大腸で測定された活性は、器官内容物に帰属する放射線投与量は器官自体に帰属する;
・大腸の活性は上部及び下部大腸に均等に帰属する;
・骨の活性は、骨梁及び海綿状骨成分に均等に帰属する。
OLINDA/EXMにおいて膀胱排尿モデルが使用された。赤色骨髄への滞留時間は、血液滞留時間の画分として計算した(τ骨髄=0.08τ血液)。
PPI−G1−(ガラクトース)2−(テトラジン)2(23)の合成;合成経路の詳細は図17を参照:
PPI−G1−(ガラクトース)2−(NH2)2(22)
PPI−G1−(NH2)4(21;35.86mg;1.13*10−4mol)を水(1.5mL)に溶解し、酢酸(30mg;5.09*10−4mol)を添加した。2−イミノ−2−メトキシエチル−β−D−チオガラクトピラノシド(9;60.56mg;2.27*10−4mol)を添加し、反応混合物を2時間室温で撹拌した。続いて反応混合物を凍結乾燥して生成物22を白色固体として得た(86.0mg;97%)。
1H−NMR(D2O):δ=4.52(d、J=10Hz、2H、ガラクトースH1)、3.96(d、J=2.8Hz、2H、ガラクトースH2)、3.75−3.5(m、14H、ガラクトースH3+H4+H5+H6+H6’+CH2S)、3.45(br.m、4H、CH2NH(C=NH))、3.02(m、J=6.8Hz、4H、CH2NH2)、3.0−2.8(br.m、12H、CH2N)、1.97(br.m、8H、CH2CH2N)、1.62(br.m、4H、NCH2CH2CH2CH2N)ppm。ESI−MS:m/z=316.3、551.4、786.5、1021.6Da(計算値:787.1Da)。
PPI−G1−(ガラクトース)2−(NH2)2(22;7.47mg;9.36*10−6mol)を水(0.5mL)に溶解した。一水素リン酸二ナトリウム(6.00mg;4.21*10−5mol)を添加して、混合物のpHを9に調節した。次に、NHS−活性化テトラジン(5;19.9mg;1.87*10−5mol)を添加した。反応混合物を室温で1時間撹拌し、透明ピンク色溶液を得た。続いて反応混合物を凍結乾燥して、生成物23をピンク色固体として得た(30.5mg;122%)。
1H−NMR(D2O):δ=8.9−7.4(br.m、12H、テトラジン)、4.56(d、2H、ガラクトースH1)、3.99(s、2H、ガラクトースH2)、3.8−3.6(m、102H、PEGCH2O+ガラクトースH3+H4+H5+H6+H6’+CH2S)、3.43(m、4H、CH2NHCO)、3.36(m、4H、CH2NH(C=NH))、3.21(m、4H、CH2NHCO)、2.9−2.6(br.m、12H、CH2N)、2.51(m、4H、CH2CO)、2.4−2.2(br.m、8H、CH2CO)、2.0−1.65(br.m、12H、CH2CH2N)、1.57(br.m、4H、NCH2CH2CH2CH2N)ppm。ESI−MS:m/z=1971.6、2684.4、3394.4Da(計算値:2679.8Da)。
合成経路の詳細は図18を参照。
PPI−G3−(NH2)16(24;33.8mg;2.00*10−5mol)を水(0.6mL)に溶解し、酢酸(10mg;1.67*10−4mol)を添加した。2−イミノ−2−メトキシエチル−β−D−チオガラクトピラノシド(9;64.3mg;2.40*10−4mol)を添加して、反応混合物を2時間室温で撹拌した。続いて反応混合物を水(2mL)に希釈し、凍結乾燥して白色固体として生成物を得た(89mg;99%)。
1H−NMR(D2O):δ=4.53(d、J=9.2Hz、12H、ガラクトースH1)、3.99(d、J=2.8Hz、12H、ガラクトースH2)、3.8−3.6(m、60H、ガラクトースH3+H4+H5+H6+H6’)、3.29(br.m、24H、CH2NH(C=NH))、2.72(br.m、8H、CH2NH2)、2.65−2.4(br.m、84H、CH2N)、1.83(br.m、24H、CH2CH2NH(C=NH))、1.66(br.m、32H、CH2CH2N)、1.46(br.m、4H、NCH2CH2CH2CH2N)ppm。ESI−MS:m/z=3807.3、4043.4、4278.8、4514.4、4750.0、4984.1Da(計算値:4510.1Da)。
PPI−G3−(ガラクトース)12−(NH2)2(25;10.0mg;2.34*10−6mol)を水(0.6mL)に溶解し、NHS−活性化テトラジン(5;12.4mg;1.17*10−5mol)を添加した。反応混合物を室温で1時間撹拌し、透明なピンク色溶液を得た。続いて、反応混合物を水(3mL)で希釈し、凍結乾燥して、生成物をピンク色固体として得た(21.1mg;100%)。
1H−NMR(D2O):δ=8.7−7.3(br.m、40H、テトラジン)、4.54(d、J=9.2Hz、12H、ガラクトースH1)、3.99(br.m、12H、ガラクトースH2)、3.9−3.6(m、355H、PEGCH2O+ガラクトースH3+H4+H5+H6+H6’)、3.42(br.m、10H)、3.35(br.m、24H、CH2NH(C=NH))、3.12(br.m、10H)、3.0−2.6(br.m、84H、CH2N)、2.52(br.m、10H)、2.26(br.m、20H)、2.0−1.6(br.m、60H、CH2CH2N)ppm。FT−IR:ν=3298、2871、1671、1643、1583、1538、1394、1200、1124、1082cm−1。
合成経路の詳細は図19を参照。
PPI−G5−(NH2)64(27;20.9mg;2.92*10−6mol)を水(0.6mL)に溶解し、酢酸(17.5mg;2.92*10−4mol)を添加した。2−イミノ−2−メトキシエチル−β−D−チオガラクトピラノシド(9;46.8mg;1.75*10−4mol)を添加し、反応混合物を4時間室温で撹拌した。続いて、反応混合物を水(2mL)で希釈し凍結乾燥して、生成物を白色固体として得た(74.4mg;120%)。
1H−NMR(D2O):δ=4.61(d、J=9.2Hz、50H、ガラクトースH1)、4.04(d、J=2.8Hz、50H、ガラクトースH2)、3.8−3.6(m、350H、ガラクトースH3+H4+H5+H6+H6’+CH2S)、3.41(br.m、100H、CH2NH(C=NH))、3.1−2.6(br.m、380H、CH2N)、1.95(br.m、252H、CH2CH2N)、1.98(s、270H、CH3COOH)ppm。
PPI−G5−(ガラクトース)50−(NH2)14(28;28.3mg;1.25*10−6mol)を水(0.6mL)に溶解した。一水素リン酸二ナトリウム(17.7mg;1.25*10−4mol)を添加して混合物のpHを9に調節した。次に、NHS−活性化テトラジン(5;19.9mg;1.88*10−5mol)を添加した。反応混合物を室温で90分間撹拌し、透明ピンク色溶液を得た。続いて反応混合物を、低MW副生成物とPD−10カラムを通して溶出させて精製した。高MW分画を集めて凍結乾燥して、生成物をピンク色固体として得た(10.9mg;27%)。
1H−NMR(D2O):δ=8.9−7.6(br.m、105H、テトラジン)、4.59(d、J=8.4Hz、50H、ガラクトースH1)、4.02(s、50H、ガラクトースH2)、3.9−3.5(m、1070H、PEGCH2O+ガラクトースH3+H4+H5+H6+H6’+CH2S)、3.41(br.m、158H)、3.0−2.6(br.m、380H、CH2N)、2.47(br.m、40H)、2.35(br.m、80H)、2.1−1.7(br.m、252H、CH2CH2N)ppm。
[1] 対象体へ投与される投与剤と、同じ対象体へ投与して、前記対象体の血液から循環する投与剤を除去するための除去剤との組合せであり、ここで前記投与剤が第1の反応性基を含み、かつ前記除去剤が第2の反応性基を含み、該第1及び第2の反応性基が、互いに生体直交反応性であるように選択され生体直交反応性基であり、前記生体直交反応性基のいずれかがジエノフィルであり、他方の基がジエンであり、前記ジエノフィルが式(1)を満たす8員環ジエノフィルであり:
[2] 請求項1に記載の組合せであり、前記ジエノフィルが、式(1a)を満たす8員環ジエノフィルであり:
[3] 実施態様[2]に記載の組合せであり、前記式(1a)の前記ジエノフィルが次の要件の1以上を満たす:
a)Xはメチルであり;
b)Yはメチルであり;
c)置換基R2 a、R3 a、R4 a、R5 aの1以上がO−アルキルであり;
d)置換基R2 a、R3 a、R4 a、R5 aの1以上がO−アリールである、
組合せ。
[4] 実施態様[2]又は[3]の組合せであり、Xがメチル又は水素であり、Yがメチル又は水素であり、及びR3 a又はR4 aがO−アルキル又はO−アリールである、組合せ。
[5] 実施態様[1]乃至[4」のいずれか1つに記載の組合せであり、前記ジエンが以下で定義される式(2)、(3)、(4)、(5)、(6)及び(7)の化合物からなる群から選択され:
組合せ。
[6] 実施態様[1]乃至[5]のいずれか1つに記載の組合せであり、前記投与剤がプレターゲットプローブであり、好ましくはプライマリーターゲット部位として抗体を含む、組合せ。
[7] 実施態様[1]乃至[5]のいずれか1つに記載の組合せであり、前記投与剤がターゲット造影又は治療のための剤である、組合せ。
[8] 生体直交性反応基及び1以上のヘキソース系部位を含む除去剤であり、前記生体直交性反応基が、実施態様[1]乃至[5]のいずれか1つに定義されたジエン又はジエノフィルである、除去剤。
[9] 実施態様[8]の除去剤であり、前記ヘキソース系部位がガラクトース部位である、除去剤。
[10] 実施態様[6]に定義されたプレターゲットプローブである投与剤を対象体に投与し、前記剤を、対象体のシステム内で、前記プライマリーターゲット部位のプライマリーターゲットへの結合が達成されるために効果的な時間の間循環させ、次に非結合剤を身体から、実施態様[8]又は[9]による除去剤を投与することで除去することを含む、プレターゲット方法。
[11] 動物又はヒト対象体で循環から生体分子を除去するための方法であり、前記方法が、投与剤及び除去剤を投与することを含み、前記投与剤が第1の反応性基を含み、前記除去剤が第2の反応性基を含み、該第1の反応性基及び第2の反応性基が互いに生体直交的反応性であるように選択され、前記反応性基が実施態様[1]乃至[5]のいずれか1つに定義されたとおりである、方法。
[12] 動物又はヒト対象体の循環から生体分子を除去するための、実施態様[1]乃至[5]のいずれか1つに定義されたとおりの投与剤及び除去剤の使用であり、前記投与剤が前記生体分子と結合することができる部位を含む、使用。
[実施態様1] 対象体へ投与される投与剤と、同じ対象体へ投与して、前記対象体の血液から循環する投与剤を除去するための除去剤との組合せであり、
前記投与剤が第1の反応性基を含み、前記除去剤が第2の反応性基を含み、該第1及び第2の反応性基が互いに生体直交性反応性であるように選択された生体直交反応性基である、組合せ。
[実施態様2]
実施態様[1]による組合せであり、前記生体直交性反応基のいずれかが、ジエノフィルであり、他がジエンであり、ここで前記ジエノフィルが、式(1)を満たす8員環ジエノフィルであり:
[実施態様3] 「実施態様2]による組合せであり、前記ジエノフィルが、式(1a)を満たす8員環ジエノフィルであり:
[実施態様4] [実施態様3]による組合せであり、前記式(1a)のジエノフィルが次の要件の1以上を満たす:
a)Xはメチルであり;
b)Yはメチルであり;
c)置換基R2 a、R3 a、R4 a、R5 aの1以上がO−アルキルであり;
d)置換基R2 a、R3 a、R4 a、R5 aの1以上がO−アリールである、
組合せ。
[実施態様5] [実施態様3]又は[実施態様4]に記載の組合せであり、Xがメチル又は水素であり、Yがメチル又は水素であり、及びR3 a又はR4 aがO−アルキル又はO−アリールである、組合せ。
[実施態様6] [実施態様2]乃至[実施態様5]のいずれかに1つに記載の組合せであり、前記ジエンが以下で定義される式(2)、(3)、(4)、(5)、(6)及び(7)の化合物からなる群から選択され:
[実施態様7] [実施態様1]乃至[実施態様6]のいずれか1つに記載の組合せであり、前記投与剤がプレターゲットプローブであり、好ましくはプライマリーターゲット部位として抗体を含む、組合せ。
[実施態様8] [実施態様1]乃至[実施態様6]のいずれか一項に記載の組合せであり、前記投与剤がターゲット造影又は治療のための剤である、組合せ。
[実施態様9] 生体直交性反応性基及び1以上のヘキソース、好ましくはガラクトース部位を含む、除去剤。
[実施態様10」 [実施態様9]による除去剤であり、前記生体直交性反応性基が、[実施態様2]乃至[実施態様5]のいずれか1つに記載のジエン又はジエノフィルである、除去剤。
[実施態様11] [実施態様7]に定義されたプレターゲットプローブである投与剤を対象体に投与し、前記剤を、対象体のシステム内で、前記プライマリーターゲット部位のプライマリーターゲットへの結合が達成されるために効果的な時間の間循環させ、次に非結合剤を身体から、[実施態様1]乃至[実施態様6]のいずれか1つによる除去剤を、好ましくは[実施態様9]又は[実施態様10]に記載の除去剤を投与することで除去することを含む、プレターゲット方法。
[実施態様12] 動物又はヒト対象体で循環から生体分子を除去するための方法であり、前記方法が、投与剤及び除去剤を投与することを含み、前記投与剤が第1の反応性基を含み、前記除去剤が第2の反応性基を含み、前記第1の反応性基及び第2の反応性基が互いに生体直交的反応性であるように選択される、方法。
[実施態様13] [実施態様12]に記載の方法であり、前記反応性基が、[実施態様2]乃至[実施態様6]のいずれか1つに定められたとおりである、方法。
[実施態様14] 動物又はヒト対象体の循環から生体分子を除去するための、[実施態様1]乃至[実施態様6]のいずれか1つに定義されたとおりの投与剤及び除去剤の使用であり、前記投与剤が前記生体分子と結合することができる部位を含む、使用。
Claims (9)
- 対象体へ投与される投与剤と、同じ対象体へ投与して、前記対象体の血液から循環する投与剤を除去するための除去剤との組合せであり、ここで前記投与剤が第1の反応性基を含み、かつ前記除去剤が第2の反応性基を含み、該第1及び第2の反応性基が、互いに生体直交反応性であるように選択された生体直交反応性基であり、前記生体直交反応性基の一方がジエノフィルであり、他方がジエンであり、前記ジエノフィルが式(1)を満たす8員環ジエノフィルであり:
- 請求項1に記載の組合せであり、前記ジエノフィルが、式(1a)を満たす8員環ジエノフィルであり:
- 請求項2に記載の組合せであり、前記式(1a)のジエノフィルが次の要件の1以上を満たす:
a)Xはメチルであり;
b)Yはメチルであり;
c)置換基R2 a、R3 a、R4 a、R5 aの1以上がO−アルキルであり;
d)置換基R2 a、R3 a、R4 a、R5 aの1以上がO−アリールであり;
e)置換基R2 a、R3 a、R4 a、R5 aの1以上がアリールであり;
f)置換基R2 a、R3 a、R4 a、R5 aの1以上がアルキルである、
組合せ。 - 請求項2又は3に記載の組合せであり、Xはメチル又は水素であり、Yはメチル又は水素であり、及びR3 a又はR4 aがO−アルキル又はO−アリールである、組合せ。
- 請求項1乃至4のいずれか一項に記載の組合せであり、前記ジエンが、以下で定義される式(2)、(3)、(4)、(5)、(6)及び(7)の化合物からなる群から選択され:
- 請求項1乃至5のいずれか一項に記載の組合せであり、前記投与剤がプレターゲットプローブであり、プライマリーターゲット部位として抗体を含む、組合せ。
- 請求項1乃至6のいずれか一項に記載の組合せであり、前記投与剤が、ターゲット造影又は治療のための剤である、組合せ。
- 生体直交反応性基及び1以上のヘキソースを含む、請求項1乃至5のいずれか一項に定義されたとおりの投与剤を除去するための除去剤であり、前記生体直交反応性基が、請求項1乃至5のいずれか一項に定義されたとおりのジエン又はジエノフィルである、除去剤。
- 請求項8に記載の除去剤であり、前記ヘキソースがガラクトース部位である、除去剤。
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