JP2014511866A - ペプデューシンの設計および使用 - Google Patents

Abstract

本明細書において、ＧＰＣＲ領域、例えば第３の細胞内ループおよび隣接領域をベースとする強力で特異的なＧＰＣＲアンタゴニストペプデューシンの合理的設計および使用が開示される。
【選択図】図２

Description

関連出願の相互参照
本出願は、全体の内容が参照により本明細書に組み込まれる、同一標題で２０１１年４月８日に出願された米国仮特許出願第６１／４７３，６７５号明細書の優先権および利益を主張する。

本発明は、概ねＧタンパク質共役型受容体に関し、特にＧタンパク質受容体のアンタゴニストならびにそれを作製および使用する方法に関する。

連邦政府資金による研究および開発に関する記述
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）により資金提供された助成金Ｒ０１ ＨＬ０５７９０５、ＨＬ０６４７０１、ＣＡ１２２９９２、およびＣＡ１０４４０６のもと政府により支援されたものである。政府は、本発明の一定の権利を有する。

種々のホルモン、神経伝達物質および生物活性物質は、細胞膜中に局在する特異的な受容体を介して、生体の機能を制御、調節、または調整する。真核細胞、例として、酵母および哺乳動物において、これらの受容体の多くは、受容体が共役するグアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）の活性化により、細胞内シグナルの伝達を媒介する。このような受容体は、一般にＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）と呼ばれ、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＬＲ）または７回膜貫通ドメイン受容体としても公知である。ＧＰＣＲへの特異的なシグナリング分子、すなわち、リガンドの結合は、受容体の立体構造変化を引き起こし、Ｇタンパク質を結合および活性化させ得る形状をもたらし得、それにより最終的に生物学的応答を導く細胞内イベントのカスケードを誘発する。典型的には、ＧＰＣＲはＧタンパク質と相互作用して細胞内セカンドメッセンジャー、例えば、サイクリックＡＭＰ、イノシトールリン酸、ジアシルグリセロールおよびカルシウムイオンの合成を調節する。

公知および未特性決定ＧＰＣＲは、それらが多くの疾患に関与しているため、薬物作用および開発についての主要な標的である（Ｊａｃｏｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２００６，１：７６０−７８２）。ＧＰＣＲは、通常、３つの細胞内（ＩＬ−１／ｉ１からＩＬ−３／ｉ３）ループおよび３つの細胞外（ＥＬ−１／ｅ１からＥＬ−３／ｅ３）ループにより連結される７回膜貫通ヘリカルドメイン（ＴＭ１からＴＭ７）の共通の構造モチーフを共有する。７回膜貫通へリックスは、細胞膜内にバレル様空洞を形成し、それは、細胞内側でＧタンパク質共役のためのドメインをさらに活性化させるリガンドとの細胞外相互作用により誘発されたこの構造の立体構造変化である。ＧＰＣＲは、細胞代謝、細胞成長および運動性、接着、炎症、神経シグナリング、および血液凝固を制御するシグナリングプロセスにおける重要な役割を担う。

ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質およびエフェクター（Ｇタンパク質によりモジュレートされる細胞内酵素およびチャネル）とともに、細胞内セカンドメッセンジャーの状態を細胞外への入力に連結するモジュール式シグナリング系の構成成分である（Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｍｏｌｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ ２００２，３，６３９−６５０）。ＧＰＣＲのスーパーファミリーは数多く、ヒトゲノムのシーケンシングによりそれらをコードする８５０を超える遺伝子が明らかになった（Ｈｏｐｋｉｎｓ ａｎｄ Ｇｒｏｏｍ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２００２，１，７２７−７３０）。ＧＰＣＲは、配列相同性および機能類似性に基づき６つのクラスに分割することができる（Ｆｏｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ ２００５，５７（２）：２７９−８８）：クラスＡ（または１）（ロドプシン様）、クラスＢ（または２）（セクレチン受容体ファミリー）、クラスＣ（または３）（代謝型グルタミン酸／フェロモン）、クラスＤ（または４）（菌接合フェロモン受容体）、クラスＥ（または５）（サイクリックＡＭＰ受容体）およびクラスＦ（または６）（フリズルド／スムーズンド）。

ロドプシン様ＧＰＣＲには、プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）がある。ＰＡＲファミリーのメンバーは、細胞外プロテアーゼ勾配のセンサーとして作用し、細胞が広範な生理学的活性、例えば組織リモデリングの間にタンパク質分解微小環境に反応することを可能とする。今日まで、４つの異なるＰＡＲが同定されている：ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３およびＰＡＲ４。プロテアーゼ、例えばトリプシン、トロンビン、およびＭＭＰ−１は、個々のＰＡＲメンバーのＮ末端細胞外ドメインを開裂させ、それにより受容体の外表面に結合する繋留リガンドをアンマスクして細胞内Ｇタンパク質への膜貫通シグナリングを活性化させる。ＰＡＲ１は、もともと血小板上で発見され、ＧＰＣＲのこの特殊化クラスについての原型として機能する。ＰＡＲ１は、それがトロンビンにより受容体のＮ末端細胞外ドメイン内に局在する残基Ｒ４１〜Ｓ４２間で開裂された場合に活性化される。ＰＡＲ３およびＰＡＲ４も、トロンビンにより活性化される一方、ＰＡＲ２は、トリプシン／トリプターゼ受容体である。タンパク質分解開裂は、独特の分子内モードで受容体の本体に結合する新たなＮ末端を露出させる。ＰＡＲの新たに開裂されたＮ末端の最初の数アミノ酸に対応する合成ペプチド、例えばＳＦＬＬＲＮ^ＰＡＲ１（配列番号１）、ＴＦＬＬＲＮ^ＰＡＲ１（配列番号２）、ＰＲＳＦＬＬＲＮ^ＰＡＲ１（配列番号３）、ＳＬＩＧＲＬ^ＰＡＲ２（配列番号４）、ＡＹＰＧＫＦ^ＰＡＲ４（配列番号５）も、ＰＡＲに対する選択的分子内アゴニストとして機能し得る。

主要なトロンビン受容体であるＰＡＲ１は、心血管系の広範な生理学的および病理学的プロセス、例として内皮障壁機能、血管反応性、内膜過形成、炎症および止血に影響することが示されている（Ｏｓｓｏｖｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ ２００４，８４：５７９−６２１）。ＰＡＲ１は、インビトロでの内皮細胞の増殖および遊走のメディエーターであり、発育マウスにおける血管新生に不可欠である。ＰＡＲ１欠損マウスは、血管形成不全に起因して妊娠中期胚（Ｅ９．５）の半分の致死率をもたらす。驚くべきことにＰＡＲ１欠損マウスは血小板機能表現型の変化を有さず、そのことがＰＡＲ４の発見に導いた。ヒトとは異なり、ＰＡＲ４はマウス血小板上の主要なトロンビン受容体であり、ＰＡＲ４欠損マウスはトロンビンにシグナリングしない。トリプシン様プロテアーゼについての細胞表面受容体であるＰＡＲ２は、炎症細胞、間質、内皮および腸上皮中で広く発現される。ＰＡＲ２は、関節、肺、脳、胃腸管、および血管系の多数の急性および慢性炎症疾患においてキーとなる役割を担い、肝線維症の進行に関与している。ＰＡＲ３の機能的役割は不明確であり、合成ＰＡＲ３繋留リガンドＴＦＲＧＡＰは、検出可能な下流シグナリングを刺激しない。ＰＡＲは、機能性ヘテロダイマーを形成することも示されている。ＰＡＲ１およびＰＡＲ３は、ＰＡＲ４についての補因子として機能し得、ＰＡＲ１は、ＰＡＲ２をトランス活性化させ得る（Ｋａｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００７，８：１３０３−１２）。

それぞれのＰＡＲは、Ｇタンパク質の異なるサブセットに共役する。例えば、ＰＡＲ１は、異なるプロテアーゼにより異なって活性化されるＧα−サブユニットＧ_ｑ、Ｇ_ｉおよびＧ_{１２／１３}と共役する。トロンビンは、３つ全てのヘテロトリマーサブユニットを同時に活性化させ得る一方、ＭＭＰ−１は、Ｇ_{１２／１３}シグナリングをより選択的に活性化させる。ＰＡＲ１−Ｇ_ｑは、Ｃａ^２＋を動員させるｌｎｓＰ_３およびプロテインキナーゼＣ−α（ＰＫＣα）を活性化させるジアシルグリセロール（ＤＡＧ）のホスホリパーゼＣ−β生成を刺激する。これらは、次いでホスホリパーゼＡ_２およびホスホリパーゼＤを活性化させる。Ｇ_{１２／１３}は、細胞形状変化、遊走およびｒｈｏ依存性腫瘍形成において主要な役割を担う。従来、Ｇ_{１２／１３}からＧ_ｉへのＧタンパク質シグナリングにおけるスイッチは、ＰＡＲ１−ＰＡＲ２ヘテロダイマーとの関連で生じ、内皮障壁機能の維持に関与することが示されている。Ｇ_ｉは、ｒａｃの活性化およびアデニル酸シクラーゼの阻害およびｃＡＭＰの抑制に関与する。ＰＡＲ１がＭＡＰキナーゼカスケードメンバー、例えばＥＲＫ１／２をいかに調節するかは依然として理解されていない。

ＰＡＲは、血管生物学におけるそれらの十分認識された役割に加え、生存、アポトーシスおよび腫瘍成長の調節に関与することも提案されている（例えば、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００９，６９：６２２３−３１）。ＰＡＲ１およびＰＡＲ２は、黒色腫における腫瘍細胞運動性において重要であり（Ｔｅｌｌｅｚ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００３，２２：３１３０−３７）、ＰＡＲ１は、乳癌（Ｈｅｎｒｉｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １９９９，７９：４０１−０６）、卵巣癌（Ａｇａｒｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ２００８，７：２７４６−５７）および膵癌（Ｒｕｄｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ２００２，１９：１８１−８９）の侵襲性および転移性プロセスに関与する。ＰＡＲ１は、ＮＩＨ３Ｔ３マウス繊維芽細胞の形質転換において癌遺伝子としても同定されており、ＰＡＲ１のアトピー性発現（ａｔｏｐｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、ＰＡＲ１ヌル乳癌細胞中で腫瘍原性を付与する（Ｂｏｉｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ２００５，１２０：３０３−１３）。近年の研究は、３０個の腺癌および３０個の扁平上皮癌からなる６０個の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）においてＰＡＲ１、ＰＡＲ４およびＶＥＧＦ発現を計測した（Ｇｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ２００６，７：３９５−００）。大部分の肺腫瘍がＶＥＧＦを発現することおよびＰＡＲ１および／またはＰＡＲ４発現とＶＥＧＦとの有意な相関が存在することが見出された。さらに、ＰＡＲ１陽性肺癌のより短い３年生存率の傾向が存在した。

ＰＡＲ２は、急性および慢性炎症、関節炎、アレルギー性反応、敗血症、炎症疼痛、ならびに癌細胞侵襲および転移に関与する多数の（病理）生理学的経路を媒介する（例えば、Ｋａｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００５，１１：６６１−６６５）。ＰＡＲ２により活性化される多面的な下流経路には、カルシウム動員、イノシトールリン酸およびジアシルグリセロールのホスホリパーゼＣ−ｂ依存性生成、ＲｈｏおよびＲａｃ活性化、ＭＡＰＫシグナリングならびに遺伝子転写が含まれる（Ｏｓｓｏｖｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，２００４，前掲）。

プロテアーゼの細胞表面センサーとして、ＰＡＲ２は、炎症の間に生じる急速に変化するタンパク質分解微小環境に対する応答または過剰応答する能力を細胞に付与する。ＰＡＲ２欠損マウスは、腸炎症、自己免疫、および脳脊髄炎のモデルにおいて顆粒球浸潤および組織損害の低減、ならびに炎症サイトカインの抑制を示す（Ｎｏｏｒｂａｋｈｓｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２００６，２０３：４２５−３５；Ｃｅｎａｃ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ ２００２，１６１：１９０３−１５）。心虚血／再灌流損傷の低減もＰＡＲ２欠損マウスにおいて観察され、炎症メディエーターの低下と相関した（Ａｎｔｏｎｉａｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．２０１０，３０：２１３６−４２）。逆に、ＰＡＲ２の過剰刺激は、重度の浮腫、顆粒球浸潤、組織浸透性の増加、組織損害および低血圧に導き得る（Ｖｅｒｇｎｏｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９９９，１２７：１０８３−９０；Ｃｅｎａｃ ｅｔ ａｌ．，２００２，前掲）。ＰＡＲ２のアゴニスト、例としてトリプシンおよび合成ＳＬＩＧＲＬペプチドも、感覚ニューロンからのカルシトニンおよびサブスタンスＰの放出を誘発し、好中球浸潤、浮腫、痛覚過敏、および癌疼痛を引き起こす（Ｖｅｒｇｎｏｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００１，７：８２１−２６；Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｉｎ ２０１０，１４９：２６３−７２）。ＰＡＲ２は、ＰＡＲ２欠損マウスにおける関節炎症の有意な減少（Ｆｅｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２００３，１１１：３５−４１）ならびに骨関節炎および関節リウマチ滑膜組織における受容体の発現の上方調節（Ｆｅｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ．２０１０，６９：２０５１−２０５４）により証明されるとおり、関節炎に関連している。

主要な炎症誘発性セリンプロテアーゼであるトリプターゼも、ＰＡＲ２を開裂および活性化させ得る。高レベルの肥満細胞由来トリプターゼの局所または全身放出は、生命を脅かす結果、例として急性喘息、全身性肥満細胞症、およびアナフィラキシーを有し得る（Ｃａｕｇｈｅｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２００７，２１７：１４１−５４）。したがって、ＰＡＲ２の特異的および有効な薬理学的阻害剤は、有益な抗炎症効果を提供し、肥満細胞、好中球、および組織損害に寄与する他のＰＡＲ２発現白血球の有害活性を低減させる潜在性を有する。同様に、ＰＡＲ１および他のＰＡＲの上記の広範な腫瘍原性について、ＰＡＲ１および他のＰＡＲの有効な阻害剤は、高度に治療性であり得る。しかしながら、今日まで、アゴニスト活性を欠きまたはミリモル濃度レベル未満において有効である有効なＰＡＲ２またはＰＡＲ１アンタゴニストを同定することは困難であった（例えば、Ｇｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２００９，１５８：１６９５−１７０４）。

ペプデューシンと呼ばれる細胞浸透ペプチドまたはポリペプチドは、膜浸透疎水性部分を野生型ＧＰＣＲに由来するペプチドに付着させ、それにより特異的受容体−Ｇタンパク質シグナリング経路に対する人工アゴニストおよびアンタゴニストを生成することにより考案された（Ｃｏｖｉｃ Ｌ．ｅｔ ａｌ．２００２，ＰＮＡＳ ９９：６４３−４８；米国特許第６，８６４，２２９号明細書、それらの開示は両方とも参照により本明細書に組み込まれる）。これらの脂質化キメラペプチドまたはポリペプチドは、膜を越えて急速にフリップし、高度に特異的な様式で、すなわち、それらのコグネート受容体について高い選択性で受容体−Ｇタンパク質シグナリングを妨げる能力を有する。ＰＡＲ、例えばＰＡＲ１、ＰＡＲ２、およびＰＡＲ４、コレシストキニンＡおよびＢ（ＣＣＫＡ、ＣＣＫＢ）、ソマトスタチン−２（ＳＳＴＲ２）、メラノコルチン−４（ＭＣ４Ｒ）、グルカゴン様ペプチド−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）、ならびにＰ２Ｙ_１２ＡＤＰ受容体についてのペプデューシンが作製されており、それらはそれらが由来する受容体についてのアゴニストおよび／またはアンタゴニストとして作用する。これらの組成物は、広範囲のＧＰＣＲ、例としてタンパク質ファミリーＰＡＲの活性の活性化または阻害に有用である。ヒトＰＡＲには、ＰＡＲ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ０１９６１６）、ＰＡＲ２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＸＭ００３６７１）、ＰＡＲ３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ００４１０１）およびＰＡＲ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ００３９５０．１）が含まれ、それらの配列は全て参照により本明細書に組み込まれる。

ＰＡＲファミリー、より広くは、ロドプシン様ＧＰＣＲ、さらにより広くは、ＧＰＣＲのメンバーについて有意なアゴニスト効果も実質的なアゴニスト効果も有さない有効なアンタゴニストを考案する試みにおけるペプデューシン技術の応用は、今のところ十分な結果をもたらしていない。受容体−Ｇタンパク質共役の機序および受容体とＧタンパク質との選択的接触に対するその関与の両方をさらに研究するため、ならびにＧＰＣＲが関与する種々の疾患または病態についての予防および／または治療として治療法を作出するため、有効なＧＰＣＲアンタゴニストが依然として必要とされている。

本発明は、突然変異型全長ＧＰＣＲまたはそれらの断片をベースとする新世代のペプデューシンを開示する。ＧＰＣＲの立体化学モデルに基づく合理的設計アプローチの生成物であるこれらのペプデューシンは、強力で特異的ということが判明した。特に、それらの一部は、いかなる有意なアゴニスト活性も有さず、完全にアンタゴニスト性であることが判明し、それらのコグネートＧＰＣＲの他では構成的な活性をサイレンシングし得る。ほとんどのＧＰＣＲに対するアンタゴニストを提供することが困難であるため、それらの新たなペプデューシンは、それらのＧＰＣＲにより調節されるシグナル転移イベントならびにその下流疾患および病態を有効に標的化するために切望される候補を提供した。

したがって、本発明は、第１の態様において、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に対して実質的なアンタゴニスト効果を有し、実質的なアゴニスト効果を有さないポリペプチド組成物を提供する。一部の実施形態において、それらのＧＰＣＲは、他では構成的に活性な、例えばＰＡＲ１およびＰＡＲ２である。ポリペプチドは、（ａ）第１の細胞内ループ（ｉ１ループ）、（ｂ）第５の膜貫通へリックス（ＴＭ５）、（ｃ）第３の細胞内ループ（ｉ３ループ）、（ｄ）第６の膜貫通へリックス（ＴＭ６）、（ｅ）ｉ１ループ、ＴＭ５、ｉ３ループおよび／またはＴＭ６中に見出される順序通りの少なくとも３つの連続アミノ酸残基の断片、ならびに（ｆ）（ａ）から（ｅ）の任意の組合せからなる群から選択されるＧＰＣＲ領域中の１つ以上の突然変異を含む突然変異全長ＧＰＣＲまたはその断片を含む。１つの特徴において、ＧＰＣＲは、ロドプシン様Ａ型ＧＰＣＲである。一部の実施形態において、ＧＰＣＲは、好ましくはヒトのプロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）、例えばＰＡＲ１またはＰＡＲ２である。本発明の１つの特徴によれば、ポリペプチド中の突然変異の少なくとも１つは、第６の膜貫通へリックス（ＴＭ６）中のＢａｌｌｅｓｔｅｒｏｓランドマーク残基６．５０のＮ末端側１８残基位置におけるものである。さらなる特徴において、本発明のポリペプチドは、インタクト細胞膜を越えるポリペプチドの流入を可能とする疎水性部分をさらに含む。突然変異は、置換、付加または欠失の１つであり得、付加または欠失は、野生型配列中の突然変異点における５つまでの連続残基の付加または欠失を含む。一部の実施形態において、突然変異は、単一塩基置換である。

一態様において、本発明は、２つのドメイン：ＧＰＣＲ配列に由来する第１のドメインおよび前記第１のドメインに付着しており、細胞浸透性膜繋留特性を付与する天然または非天然に生じた疎水性部分を含む第２ドメインを含むキメラポリペプチドを提供する。第１のドメインは、好ましくは、少なくとも１３個のアミノ酸を有する。本発明の一部の実施形態において、キメラポリペプチドの第１のドメインは、野生型配列のネイティブ細胞外部分を含まず、キメラポリペプチドは、そのコグネートＧＰＣＲ、例えば、ＰＡＲファミリーのメンバーに結合する。種々の実施形態において、疎水性部分は、脂質、アシル化合物およびアミノ酸からなる群から選択される。

一実施形態において、第１のドメインは、順序通りの３つ以上の連続アミノ酸残基を野生型ＰＡＲ２と、例えばＰＡＲ２のｉ３ループ、ＴＭ６、またはＴＭ５と共有するプロテアーゼ活性化受容体−２（ＰＡＲ２）の突然変異全長または断片を含み、前記ＰＡＲ２の突然変異または断片中の少なくとも１つの突然変異は、２７４または２８４位におけるものである。一実施形態において、ＰＡＲ２は、ヒトＰＡＲ２である。第１のドメインは、一部の実施形態において、２８７位における突然変異をさらに含む。一実施形態において、突然変異は、２７４位におけるメチオニン（Ｍ）の別の残基による置換、２８４位におけるアルギニン（Ｒ）の別の残基による置換、および２８７位におけるリジン（Ｋ）の別の残基による置換からなる群から選択される。

一実施形態において、本発明のキメラポリペプチドの第１のドメインは、順序通りの３つ以上の連続アミノ酸残基を野生型ＰＡＲ２と共有するプロテアーゼ活性化受容体−２（ＰＡＲ２）の突然変異全長または断片を含み、前記ＰＡＲ２の突然変異全長または断片中の少なくとも２つの突然変異は、２８７位ならびに第５の膜貫通へリックス（ＴＭ５）、第３の細胞内ループ（ｉ３ループ）、および第６の膜貫通へリックス（ＴＭ６）をスパニングする領域中の第２の位置におけるものである。例えば、第２の位置は、２７４または２８４におけるものであり得る。

別の実施形態において、本発明のキメラポリペプチドの第１のドメインは、順序通りの３つ以上の連続アミノ酸残基を野生型ＰＡＲ１と共有するプロテアーゼ活性化受容体−１（ＰＡＲ１）の突然変異全長または断片を含み、前記ＰＡＲ１の突然変異全長または断片中の少なくとも１つの突然変異は、３１０位におけるものである。一実施形態において、ＰＡＲ２は、ヒトＰＡＲ１である。

別の実施形態において、本発明のキメラポリペプチドの第１のドメインは、以下からなる群から選択される：
（ｉ）順序通りの３つ以上の連続アミノ酸残基を野生型ＰＡＲと共有するプロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）の突然変異全長または断片（前記ＰＡＲの突然変異全長または断片中の少なくとも１つの突然変異は、第６の膜貫通へリックス（ＴＭ６）中のＢａｌｌｅｓｔｅｒｏｓランドマーク残基６．５０のＮ末端側１８残基位置におけるものであり、またはＰＡＲの第３の細胞内ループ（ｉ３ループ）がウシロドプシンのｉ３ループによりアラインされる場合、ウシロドプシンの２４８に対応する位置におけるものである）；
（ｉｉ）（ｉ）によるＰＡＲの突然変異全長または断片のバリアント（野生型配列のアミノ酸の４０％までが、天然もしくは非天然に生じたアミノ酸により、またはペプチド模倣部分により置き換えられており；および／またはアミノ酸の４０％までが、化学修飾されたそれらの側鎖を有し；および／またはアミノ酸の２０％までが、欠失されており、但し、第３の細胞内ループ（ｉ３ループ）中のアミノ酸の少なくとも５０％が、バリアント中で不変のままである）；
（ｉｉｉ）アミノ酸の少なくとも１つが、対応するＤ−アミノ酸により置き換えられている（ｉ）または（ｉｉ）によるペプチド配列；
（ｉｖ）ペプチド骨格の少なくとも１つが、非天然に生じたペプチド骨格に変化している（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれか１つによるペプチド配列；
（ｖ）逆の順序の（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１つの配列であるペプチド配列；および
（ｖｉ）（ｉ）から（ｖ）のペプチド配列の２つ以上の組合せ。前記ＰＡＲは、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３およびＰＡＲ４からなる群から選択することができる。

第２の態様において、本発明は、本発明のキメラポリペプチドおよび薬学的に許容可能な賦形剤、担体、または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、好ましくは、経口、鼻腔、局所、直腸、膣もしくは非経口投与、または静脈内、皮下もしくは筋肉内注射に好適である。

第３の態様において、本発明は、本発明の組成物を使用して種々の病態を治療する方法を提供する。一実施形態において、第１のドメインがＰＡＲ１の突然変異全長または断片を含むキメラポリペプチドの治療有効量を、肺癌の治療が必要とされる哺乳動物に投与する。別の実施形態において、第１のドメインが順序通りの３つ以上の連続アミノ酸残基を野生型ＰＡＲ２と共有するＰＡＲ２の突然変異全長または断片を含み、前記ＰＡＲ２の突然変異全長または断片中の少なくとも１つの突然変異は、２７４、２８４および２８７からなる群から選択される位置におけるものである本発明のキメラポリペプチドの治療有効量を前記哺乳動物に投与することにより炎症に関連する哺乳動物における疾病状態を治療する方法が提供される。治療可能な疾病状態は、以下のいずれかであり得る：膵炎、喘息、関節リウマチ、骨関節炎、癌、慢性疼痛、内臓疼痛、癌疼痛、多発性硬化症、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、肥満細胞疾患、肥満細胞症、痛風、敗血症、動脈再狭窄、アテローム性動脈硬化症、気道および胃腸管の炎症疾患、痒み、魚鱗癬、掻痒、炎症性皮膚疾患、乾癬、およびアルツハイマー病。本方法により治療することができる癌には、結腸、皮膚、メラニン細胞、乳房、前立腺、中枢神経系、脳、免疫系、膵臓、頭頸部、食道、腎臓、生殖器系、卵巣、子宮内膜、および頸部の癌が含まれる。

本発明の１つ以上の実施形態の詳細を以下の付属の詳細な説明に記載する。本明細書に記載されるものと同様のまたは均等な任意の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を目下記載する。本発明の他の特徴、目的、および利点は、詳細な説明から明らかである。本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形には、文脈が特に明記しない限り複数形も含まれる。特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。不一致の場合、本明細書、例として定義が優先される。さらに、材料、方法、および実施例は、説明にすぎず、限定を意図するものではない。本明細書に引用される全ての特許および刊行物は、適用可能な法律により許容される程度に参照により本明細書に組み込まれる。

図１は、ＰＡＲ２の構成的およびリガンド依存性活性が、第３の細胞内（ｉ３）ループ中に局在する膜近傍残基により調節されることを説明する。（Ａ）ＰＡＲ２突然変異体の局在および本試験において使用される受容体ダイマーのモデル。（Ｂ）ＰＡＲ２（野生型、ＷＴ）、ＰＡＲ２−Ｒ３６Ａ、ＰＡＲ２−ＲＱ、またはＰＡＲ２−Ｒ３６ＡとＰＡＲ２−ＲＱにより一過的に形質移入されたＨＥＫ細胞の、３０ｎＭのトリプシンまたはＤＭＥＭ培地単独の１８時間のトランスウェル装置（８μＭ細孔）中での走化性勾配に対する遊走、ｎ＝２、３回の独立した繰り返し。（Ｃ〜Ｅ）ＰＬＣ−βに対するＰＡＲ２突然変異体の構成的およびＳＬＩＧＲＬ活性化シグナリング。ＰＬＣ−β活性は、３０分間にわたる［^３Ｈ］−ＩｎｓＰ形成により計測し、典型的には、３０〜１００μＭのＳＬＩＧＲＬにより基準より４〜５倍多く刺激された。平均ＰＡＲ２突然変異体表面発現はＦＡＣＳにより評価し、ＣＯＳ細胞およびＨＥＫ細胞において野生型と同等レベルにおけるものであった。データ（ｎ＝２〜８）は、平均±ＳＤを表す。「^＊」について：Ｐ＜０．０５、「^＃」について：Ｐ＝０．０７。（Ｆ）ＣＯＳ７細胞中のＴ７−ＰＡＲ２によるＰＡＲ２−ｍｙｃの同時免疫沈降。ｍｙｃ免疫ブロット（上図）により示されるとおりＴ７−アガロースビーズを使用して会合ＰＡＲ２−ｍｙｃを免疫沈降させた。Ｔ７の免疫ブロットは、Ｔ７−ＰＡＲ２の存在を裏付けた（下図）。 図１Ａの左パネルに示されるアミノ酸配列は、以下のとおり本明細書に参照される（上部から下部へ）：ＰＡＲ２ ＷＴ：配列番号６；Ｒ３６Ａ：配列番号７；ＰＡＲ２ ＷＴ：配列番号８；ＱＲ−−＞ＲＱ：配列番号９；ＰＡＲ２ ＷＴ：配列番号１０；Ｍ２７４Ａ：配列番号１１；Ｒ２８４Ｓ：配列番号１２；Ｋ２８７Ａ：配列番号１３；Ｋ２８７Ｆ：配列番号１４；ＰＡＲ２ ＷＴ：配列番号１５；およびＰＡＲ２_ΔＨ８：配列番号１６。 図２は、アゴニストおよびアンタゴニストペプデューシンの設計およびスクリーニングにおいて使用された構築物および得られたデータを説明する。（Ａ）ＰＡＲ２を内因的に発現するＳＷ６２０結腸腺癌細胞によるカルシウムフラックスアッセイを使用した第３の細胞内（ｉ３）ループＰＡＲ２ペプデューシン（上部に示される構造）のアゴニストおよびアンタゴニスト活性。３つのカルシウムフラックストレースのそれぞれの縦列は、上に示されたｉ３ペプデューシン配列に対応する。上部横列は３〜４μＭのペプデューシンのアゴニスト活性であり、中部横列は１４〜１５μＭのペプデューシンのアゴニスト活性である。下部横列は、６μＭのペプデューシン（黒矢印）による前処理１分後の１００μＭのＳＬＩＧＲＬ（白矢印）のカルシウムシグナルを示す。ＤＭＳＯビヒクルの最終濃度は０．２％であった。（Ｂ）ＰＡＲ２の細胞内表面に結合したＷＴ ＰＡＲ２ｉ３ペプデューシンＰ２ｐａｌ−２１のモデル。ｉ３ペプデューシンの局在は、ＰＡＲ２ダイマーモデルを使用してインタクト受容体上のｉ３ループの候補をｉ３ペプデューシンにより置換することにより誘導した。キーとなるファーマコフォア残基Ｍ２７４、Ｒ２８４およびＫ２８７、ならびにパルミチン酸ドメインを示す。（Ｃ）（Ａ）からのそれぞれのペプデューシンについてのアゴニスト活性を、４μＭのペプデューシン（†）、または１４〜１５μＭのペプデューシン（‡）におけるカルシウムフラックスの初期速度として報告する。１００μＭのＳＬＩＧＲＬ（配列番号４）に対する６μＭのペプデューシンのアンタゴニスト活性は、Ａの下部横列からのカルシウムフラックスの曲線下面積により計測した。実験は、少なくとも２〜３回それぞれ繰り返し、高度に同様の結果を与えた。 図２Ａおよび２Ｃに示されるアミノ酸配列は、以下のとおり本明細書に参照される：ＰＡＲ２配列：配列番号１７；Ｐ２ｐａｌ−２１：配列番号１７；Ｐ２ｐａｌ−２１Ｆ：配列番号１８；Ｐ２ｐａｌ−１８Ｆ：配列番号１９；Ｐ２ｐａｌ−１８Ｓ：配列番号２０；Ｐ２ｐａｌ−１８ＳＦ：配列番号２１；Ｐ２ｐａｌ−１８Ｑ：配列番号２２；Ｐ２ｐａｌ−１４ＧＦ：配列番号２３；およびＰ２ｐａｌ−１４ＧＱ：配列番号２４。 図３は、Ｐ２ｐａｌ−１８ＳペプデューシンがＰＡＲ２−依存性好中球走化性の完全アンタゴニストであることを示すデータを説明する。（Ａ）ヒト好中球（ｎ＝４人の正常の被験者）をヒトＰＡＲ１、ＰＡＲ２、およびＰＡＲ４の表面発現についてＰＡＲ特異的抗体を用いるフローサイトメトリーにより分析した。（Ｂ）Ｐ２ｐａｌ−１８Ｓは、トリプシン（３０ｎＭ）およびＳＬＩＧＲＬ（配列番号４）（１０μＭ）の勾配に対するヒト好中球走化性を０．１４〜０．２μＭのＩＣ_５０値で阻害する。走化性指数は、５μｍ細孔フィルターを介する３０分間にわたる指向性遊走とランダム遊走との比である。（Ｃ）Ｐ２ｐａｌ−１８Ｓは、１００ｎＭのトリプターゼに対するヒト好中球走化性を完全に阻害する。（Ｄ）Ｐ２ｐａｌ−１８Ｓは、３０ｎＭのトリプシンに対するマウス好中球（ｎ＝６）走化性を完全に阻害する。（Ｅ）Ｐ２ｐａｌ−１８Ｓは、１００ｎＭのＩＬ−８（ＣＸＣＲ１／ＣＸＣＲ２）、１０μＭのＴＦＬＬＲＮ（ＰＡＲ１）（配列番号２）、または１００μＭのＡＹＰＧＫＦ（ＰＡＲ４）（配列番号５）の勾配に対するヒト好中球走化性に影響しない。ｎ＝４〜６、平均±ＳＥＭ。^＊、Ｐ＜０．０５。 図４は、ＰＡＲ２についてＰ２ｐａｌ−１８ＳおよびＰ２ｐａｌ−１４ＧＱペプデューシンの特異性を示すが、密接に関連するＰＡＲ１およびＰＡＲ４受容体については示さない。（Ａ）ＰＡＲ２アンタゴニストペプデューシンＰ２ｐａｌ−１８ＳおよびＰ２ｐａｌ−１４ＧＱは、ＰＡＲ２（ＳＬＩＧＲＬ）（配列番号４）により誘導されるカルシウムフラックスを阻害するが、ＰＡＲ１（ＴＦＬＬＲＮ）（配列番号２）アゴニストにより誘導されるカルシウムフラックスを阻害しない。ＳＷ６２０細胞をＰＡＲ１により安定的に形質移入し、種々の濃度のＰ２ｐａｌ−１８ＳまたはＰ２ｐａｌ−１４ＧＱにより１分間前処理し、次いで３０μＭのＰＡＲアゴニストにより刺激した。Ｐ２ｐａｌ−１８ＳのＩＣ_５０は、４．０ｍＭ±０．４ｍＭであり、Ｐ２ｐａｌ１４ＧＱは８．０ｍＭ±１．０ｍＭであった。（Ｂ）Ｐ２ｐａｌ−１８ＳおよびＰ２ｐａｌ−１４ＧＱは、ＣＯＳ７細胞中に一過的に形質移入されたＰＡＲ１からのＩｎｓＰシグナリングもＰＡＲ４からのＩｎｓＰシグナリングも阻害しない。細胞を、１μＭのＴＦＬＬＲＮ（配列番号２）、１μＭのＳＬＩＧＲＬ（配列番号４）または１００μＭのＡＹＰＧＫＦ（配列番号５）により刺激し、［^３Ｈ］−ＩｎｓＰ形成を３０分間にわたり計測した。（Ｃ）ＳＷ６２０細胞を、８μｍ細孔Ｂｏｙｄｅｎチャンバーの上方ウェル中で指定濃度のＰ２ｐａｌ−１８ＳまたはＰ２ｐａｌ−１４ＧＱにより処理し、下方ウェル中の１０μＭのＰＡＲ２特異的アゴニストＳＬＩＧＲＬに対して１８時間遊走させた。ＲＰＭＩ／０．１％のＦＢＳに対する遊走は、ランダムな遊走を表す。（Ｄ）ＰＡＲ２（野生型、ＷＴ）、またはＰＡＲ２−Ｒ３６Ａ／ＰＡＲ２−ＲＱにより一過的に形質移入されたＨＥＫ細胞の、３０ｎＭのトリプシンの走化性勾配に対する、トランスウェル装置（８ｍＭ細孔）中での指定濃度のＰ２ｐａｌ−１８Ｓの不存在下または存在下での１８時間の遊走。データ（ｎ＝２〜４）は、平均±ＳＥＭである。^＊、Ｐ＜０．０５および^＊＊、Ｐ＜０．００５。 図５は：（Ａ）ＰＡＲ１依存性ヒト血小板凝集がＰ２ｐａｌ−１８Ｓにより影響されないことを説明する。ゲル濾過した血小板を２．５μＭのＳＦＬＬＲＮ（配列番号１）とインキュベートしてＰＡＲ１依存性血小板凝集を誘導した。１μＭまたは５μＭのＰ２ｐａｌ−１８Ｓの添加は、血小板の凝集に影響しなかった。小分子ＰＡＲ１阻害剤であるＲＷＪ５８２５０を使用してＰＡＲ１の特異的遮断が血小板の凝集を事実上阻害することを示した。エラーバーは、平均±ＳＤを表す。（Ｂ）Ｐ２ｐａｌ−１８ＳおよびＰ２ｐａｌ−１４ＧＱは、ＳＷ６２０細胞においてアポトーシスを誘導しない。細胞をリフトし、ＰＢＳ／０．４％ＢＳＡ中で２５℃において０．５〜３０μＭのＰ２ｐａｌ−１８ＳまたはＰ２ｐａｌ−１４ＧＱと３０分間インキュベートした。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を細胞に直接添加し、１５分間のインキュベーション後にＰＩ取り込みをフローサイトメトリーにより定量した。ＰＩ取り込みは、ペプデューシンを細胞に添加した場合、未処理および０．２％のＤＭＳＯビヒクル処理細胞と比較して有意に異なることはなかった。エラーバーは、±ＳＥＭを表す。 図６は、ＰＡＲ２アンタゴニストペプデューシンＰ２ｐａｌ−１８Ｓが野生型マウスにおいてマウス足浮腫および炎症を有意に低減させるが、ＰＡＲ２依存性マウスにおいては低減させないことを説明する。（Ａ）λ−カラギーナン／カオリンまたは（Ｂ）ＰＡＲ２特異的アゴニストＳＬＩＧＲＬを、１０ｍｇ／ｋｇのＰ２ｐａｌ−１８Ｓまたはビヒクルの皮下（ｓ．ｃ．）注射により処理したＣ５７ＢＬ／６野生型またはＰＡＲ２^−／−マウスの左後足への胎盤内注射により投与した。足面積を計測し、ベースラインの足面積に対する増加倍率として報告した。（Ｃ）λ−カラギーナン／カオリン注射７時間後の代表的なＨ＆Ｅ−染色足蹠の組織構造および４０×倍率における浸潤炎症細胞の定量。データ（ｎ＝４〜６／群）平均±ＳＥＭ。^＊、Ｐ＜０．０５および^＊＊、Ｐ＜０．００５（Ｄ）Ｐ２ｐａｌ−１８Ｓ（１０ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．、１００μＬ）または２０％のＤＭＳＯビヒクルにより処理したマウスにおけるλ−カラギーナン／カオリン注射７時間後のマウス後足組織におけるミエロペルオキシダーゼ活性の評価。データ（ｎ＝３〜５）は平均±ＳＥＭを示す。^＊、Ｐ＜０．０５および^＃、Ｐ＝０．０５６。 図７は、Ｐ２ｐａｌ−１８Ｓが肥満細胞トリプターゼ依存性好中球遊走およびマウスにおける足浮腫を有意に減衰させることを説明する。（Ａ）肥満細胞を、２ｍｇ／ｍＬの肥満細胞脱顆粒剤４８／８０または２％のｌ−カラギーナン／４％のカオリンにより処理した。馴化培地（ＣＭ）を２４時間において回収し、肥満細胞トリプターゼのウエスタンブロットはトリプターゼの放出を示す。（Ｂ）Ｐ２ｐａｌ−１８Ｓは、肥満細胞培地に対するヒト好中球走化性（ｎ＝６）を阻害する。ヒト好中球を、１ｍＭのＰ２ｐａｌ−１８Ｓまたは１０ｍＭの肥満細胞トリプターゼ阻害剤ＡＰＣ−３６６とインキュベートし、肥満細胞からＣＭに３０分間遊走させた。（Ｃ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）を、トリプターゼ阻害剤ＡＰＣ−３６６（５ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）またはビヒクル（２０％のＤＭＳＯ）により前処理し、次いでｌ−カラギーナン／カオリンの胎盤内注射によりチャレンジした。（Ｄ）肥満細胞馴化培地（３０μＬのλ−カラギーナン／カオリン刺激培地）を、１０ｍｇ／ｋｇのＰ２ｐａｌ−１８Ｓまたはビヒクル（ｎ＝５）により処理したＣ５７ＢＬ／６マウスの後足中に注射した。データは、平均±ＳＥＭを表す。^＃、Ｐ＝０．０７、^＊、Ｐ＜０．０５および^＊＊、Ｐ＜０．００５。（Ｅ）肥満細胞欠損マウスは、リッターメイト対照と比較してｌ−カラギーナン／カオリン誘導性足浮腫の有意な低減（８時間の時点、ｎ＝４〜６）を有する。肥満細胞欠損マウスまたはインタクト肥満細胞を有するリッターメイト対照をＰ２ｐａｌ−１８Ｓ（１０ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）またはビヒクルにより処理し、後足をｌ−カラギーナン／カオリン刺激物質によりチャレンジした。エラーバーは、平均±ＳＥＭを表す。 図８は、膜繋留ＰＡＲ１−ｉ３およびｉ１ペプデューシンがＣａ^２＋フラックスおよび遊走を遮断することを示すデータを説明する。（Ａ）：Ｓｗｉｆｔ ｅｔ ａｌ．，２００６からのロドプシンのＸ線構造に基づくＰＡＲ１のモデル。プロテアーゼ開裂受容体は、新たな繋留リガンドの生成をもたらす。ｉ１からｉ４ループおよびＧタンパク質のトポロジー配置を説明する。パルミトイル化ＰＡＲ１ ｉ３およびｉ１ペプデューシンの概略図およびそれらのアミノ酸配列組成を示す。（Ｂ）：ヒト血小板Ｃａ^２＋フラックスに対するＰＡＲ１ペプデューシンの効果。血小板を指定濃度のペプデューシンとプレインキュベートし、ＳＦＬＬＲＮにより刺激した。遮断の効果は、阻害剤の不存在下でＳＦＬＬＲＮにより生成された完全なＣａ^２＋シグナルの割合として表現する。（Ｃ）：１８時間後の３μｍｏｌ／ＬのＰ１ｐａｌ−７、Ｐ１ｐａｌ−１０Ｓ、またはＰ１ｐａｌ−ｉ１−１１の存在または不存在下での０．３ｎｍｏｌ／Ｌのトロンビンまたは１０μｍｏｌ／ＬのＰＲＳＦＬＬＲＮに対するＡ５４９細胞の遊走。基準遊走（−）、ＰＡＲ１リガンドに対するＡ５４９細胞の遊走（ビヒクル）。細胞遊走は、リガンド媒介遊走を基準遊走により割った遊走倍率として表現する。 図８Ａにおいて示されるアミノ酸配列は、以下のとおり本明細書に参照される：Ｐ１ｐａｌ−７：配列番号２５；Ｐ１ｐａｌ−１０Ｓ：配列番号２６；Ｐ１ｐａｌ−１９ＥＥ：配列番号２７；およびＰ１ｐａｌ−ｉ１−１１：配列番号２８。 図９は、ｉ３およびｉ１由来ＰＡＲ１ペプデューシンによるＰＡＲ１−ＥＲＫ活性化の異なる阻害を説明する。（Ａ〜Ｃ）：未処理、またはトロンビン、ＳＬＩＧＫＶ（配列番号２９）、もしくはＡＹＰＧＫＦ（配列番号５）により処理したＡ５４９細胞からの溶解物のウエスタンブロット。指定試料を種々の濃度（０．１から３μｍｏｌ／Ｌ）のＰ１ｐａｌ−７、Ｐ１ｐａｌ−１０Ｓ、またはＰ１ｐａｌ−ｉ１−１１により前処理してから刺激し、抗ホスホ−ＥＲＫにより免疫ブロットした。（Ｄ〜Ｆ）：（Ａ〜Ｃ）におけるウエスタンブロットの定量を、デンシトメトリーにより実施し、結果をｐＥＲＫの最大（最大倍率）のリン酸化に対して表現する。 図１０は、Ｐ１ｐａｌ−７がＥＲＫリン酸化シグナルを完全に遮断し得ることを説明する：（Ａ）：０．３ｎＭのトロンビンにより２時間にわたり刺激し、抗ホスホ−ＥＲＫにより免疫ブロットしたＡ５４９細胞からの溶解物のウエスタンブロット。（Ｂ）：１０μＭのＰＲＳＦＬＬＲＮにより２時間にわたり刺激したＡ５４９細胞。０．１μＭのＰ１ｐａｌ−７により前処理し、１０μＭのＰＲＳＦＬＬＲＮ（配列番号３０）により５分間刺激したＡ５４９細胞。総ＥＲＫをローディング対照として使用した。 図１１は、肺癌におけるＰＡＲ発現プロファイルを説明する。ＮＣＩ−６０パネルからの肺癌細胞系（ｎ＝７）を、Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６に記載のとおりＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、およびＰＡＲ４の表面発現について特性決定した（Ａ）。（Ｂ）：患者試料におけるＰＡＲｍＲＮＡ発現プロファイル。ＰＡＲ１からＰＡＲ４（内部標準としてアクチン発現について補正）の定量的リアルタイムＰＣＲ分析、非悪性腫瘍肺組織に対する増加倍率として表現する。繊維芽細胞馴化培地に対する肺癌細胞系の遊走を、細胞数±ＳＤとして表現する。（Ｃ）：ｓｈＰＡＲ１またはベクター対照によるＡ５４９およびＨＯＰ６２細胞におけるＰＡＲ１発現のサイレンシング。ＰＡＲ１の表面発現を、ＳＦＬＬＲ−Ａｂを使用するフローサイトメトリーにより測定した。（Ｄ）：ＲＷＪ−５６１１０（１０μｍｏｌ／Ｌ）およびＳＣＨ７９７９（５０μｍｏｌ／Ｌ）またはビヒクル（０．２％のジメチルスルホキシド）を補給したＮＩＨ−３Ｔ３馴化培地に対するＡ５４９およびＨＯＰ６２肺癌細胞の遊走。ｓｈＰＡＲ１処理または適切な対照により処理した肺癌細胞の、ＮＩＨ−３Ｔ３馴化培地に対する遊走。馴化培地に対する基準遊走（ビヒクル処理またはベクター対照）を１００％に正規化した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。 図１２は、ＰＡＲ１が肺癌細胞における遊走促進因子であることを説明する。（Ａ〜Ｆ）：ＰＡＲ１ペプデューシンを使用する腺癌Ａ５４９、ＨＯＰ６２、Ｈ１２９９およびＨ５２２、Ｈ２２６扁平上皮癌、ならびにＨＯＰ９２大細胞癌における肺癌遊走の阻害。３μｍｏｌ／Ｌのペプデューシン（Ｐ１ｐａｌ−７、Ｐ１ｐａｌ−１０Ｓ、Ｐ１ｐａｌ−ｉ１−１１、または陰性対照Ｐ１ｐａｌ−１９ＥＥ）において下方ウェルに添加した。（Ｇ）：原発性肺腫瘍または非悪性腫瘍対照からの細胞をＰＡＲ１ペプデューシンにより前処理し、遊走を測定した（^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１）。 図１３は、ＰＡＲ１−ｉ３ペプデューシンによる単剤療法がＡ５４９ゼノグラフトの腫瘍進行を阻害することを説明する。（Ａ）および（Ｂ）：ビヒクル、Ｐ１ｐａｌ−７、Ｐ１ｐａｌ−ｉ１−１１、Ｐ１ｐａｌ−１０Ｓ、Ｘ１／２−ｉ１、Ｘ１／２−ｉ３、またはＡｖａｓｔｉｎにより処理したＡ５４９マウス。それぞれの時点は、平均±ＳＥを表す。（Ｃ）：実験の完了時における最終腫瘍体積を未処理ビヒクル対照の割合として計算した。（Ｄ）：血清飢餓Ａ５４９腺癌細胞をＰ１ｐａｌ−７、Ｐ１ｐａｌ−１０Ｓ、Ｐ１ｐａｌ−ｉ１−１１、ビヒクル、またはＰＤ９８０５９により前処理し、トロンビンにより刺激した。ＶＥＧＦ生成を、酵素結合免疫吸着アッセイにより評価した。データを平均±ＳＤとして表現する（^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１）。 図１４は、ＰＡＲ１ペプデューシンの薬物動態を説明する。（Ａ）：ＣＦ−１マウスにＰ１ｐａｌ−７（３ｍｇ／ｋｇ、白色丸）、Ｐ１ｐａｌ−７（１０ｍｇ／ｋｇ、黒色丸）、Ｐ１ｐａｌ−１０Ｓ（１０ｍｇ／ｋｇ、灰色丸）、またはＰ１ｐａｌ−ｉ１−１１（１０ｍｇ／ｋｇ、白色四角）を２０％のジメチルスルホキシド中で皮下注射し、血液を指定時点において回収した（ｎ＝３）。血漿中のペプデューシンレベルをＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより定量した。（Ｂ）：１０ｍｇ／ｋｇのＰ１ｐａｌ−７の皮下注射後のＰ１ｐａｌ−７の連日（１日目から６日目）血漿レベルを、１時間（白色丸）および２４時間（白色四角）において計測した。 図１５は、Ｂｅｌｌｅｓｔｅｒｏｓ系を使用してＴＭ５およびＴＭ６ランドマーク残基を使用してｉ３ループ残基をいかに定義することができるかを示す。図１５に示されるアミノ酸配列は、以下のとおり本明細書に参照される：ロドプシン＿ウシ：配列番号３１；ＰＡＲ１＿ヒト：配列番号３２；ＰＡＲ１＿ヒヒ：配列番号３３；ＰＡＲ１＿ラット：配列番号３４；ＰＡＲ１＿マウス：配列番号３５；ＰＡＲ１＿ハムスター：配列番号３６ＰＡＲ１＿ゼノパス：配列番号３７；ＰＡＲ２＿ヒト：配列番号３８；ＰＡＲ２＿マウス：配列番号３９；ＰＡＲ２＿ラット：配列番号４０；ＰＡＲ３＿ヒト：配列番号４１；ＰＡＲ３＿ラット：配列番号４２；ＰＡＲ３＿マウス：配列番号４３；ＰＡＲ４＿ヒト：配列番号４４；ＰＡＲ４＿マウス：配列番号４５；およびＰＡＲ４＿ラット：配列番号４６

特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。以下の定義は、本出願の開示および特許請求の範囲の解釈を支援するために提供される。本セクションの定義が他箇所の定義と一致しないイベントにおいては、本セクションに記載の定義が優先される。

本明細書において使用される用語「約」または「およそ」は、数字とともに使用される場合、参照される数字の１、３、５、１０または１５％以内の任意の数字を指す。

本明細書において使用される「膜近傍」は、膜に近接していることを意味する。

本明細書において使用される用語「ペプチド」または「ポリペプチド」は、アミド結合（ペプチド結合としても公知）により直鎖結合しているモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の任意の１つまたは複数の鎖を指し、規定の長さの生成物を指さない。本明細書において使用される「ペプチド」または「ポリペプチド」は、天然生物源に由来し得、または組換え技術により生成することができるが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されない。これは、任意の様式、例として化学合成により生成することができる。本発明のポリペプチド中のアミノ酸の１つ以上は、例えば化学実体、例えば炭水化物基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、アシル基（例えば、アセチル基）、コンジュゲーション、官能基化用リンカー、または他の公知の保護もしくは遮断基の付加により修飾することができる。好ましい実施形態において、ペプチドの修飾は、より安定なペプチド（例えば、より長いインビボ半減期）に導く。

本明細書において使用される用語「投与」、「投与する」などは、医薬組成物を対象に提供する文脈において使用される場合、一般に、対象に薬剤を適切な送達ビヒクルとの組合せにおいて含む１つ以上の医薬組成物を、任意の手段により投与される化合物が意図される生物学的効果の１つ以上を達成するように提供することを指す。非限定的な例として、組成物は、非経口、皮下、静脈内、結腸内、直腸、筋肉内、腹腔内、経皮、またはバッカルの送達経路で投与することができる。

本明細書において使用される「アゴニスト」は、標準的なバイオアッセイにおいて、またはインビボで、または治療有効用量で使用される場合、生物学的活性を少なくともまたは少なくとも約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約７倍、約１０倍、約２０倍、約５０倍または約１００倍以上だけ増加させる任意の天然もしくは合成分子または分子の組合せを指す。

「アンタゴニスト」または「阻害剤」は、本明細書において互換的に使用することができ、標準的なバイオアッセイにおいて、またはインビボで、または治療有効用量で使用される場合、状況に応じて少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、または約１００％だけ標的の生物学的活性を妨げる任意の天然もしくは合成分子または分子の組合せを指す。

本明細書において使用される「モジュレートする」ことは、アンタゴニストとして作用する、すなわち、部分的にまたは完全に阻害し、低減させ、緩和させ、遮断し、または防止すること；または増加させ、もしくは刺激する、すなわち、アゴニストとして作用することを意味する。モジュレーションは、直接でも間接でもよい。

ヒトＰＡＲファミリーには、ＰＡＲ−１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ０１９６１６）；ＰＡＲ２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＸＭ−−００３６７１）；ＰＡＲ３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ−−００４１１０１）；およびＰＡＲ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ−−００３９５０．１）が含まれ、それらの配列は、参照により本明細書に組み込まれる。

ＰＡＲ−１またはプロテアーゼ活性化受容体１（別名：ＣＦ２Ｒ、ＨＴＲ２、ＰＡＲ１またはＴＲ）は、当分野においてトロンビン受容体または凝固因子ＩＩ（トロンビン）受容体（ＨＧＮＣ：３５３７１；Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：２１４９２；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ２５１１６３；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１８１１０４７）としても公知である。ヒトＰＡＲ−１ポリペプチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１９８３を有し、それも参照により本明細書に組み込まれ、図９Ｂにも再現される。

本開示において、ＰＡＲファミリーメンバー全般またはＰＡＲファミリーメンバーの任意の個々のメンバー、例えばＰＡＲ−１への参照は、全てのスプライスバリアント、突然変異体（例として、限定されるものではないが、欠失、挿入または多型またはアミノ酸置換）、それらのアイソフォームおよびホモログを指すと理解される。

本明細書において使用される用語「患者」は、任意の個々の生物体を指す。例えば、生物体は、哺乳動物、例えば霊長類（すなわち、例えばヒト）であり得る。さらに、生物体は、家庭動物（すなわち、例えば、ネコ、イヌなど）、家畜（すなわち、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、または実験動物（すなわち、例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモットなど）であり得る。

語句「薬学的に許容可能な」は、本明細書において、適切な医学判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答も他の問題、合併症も示さず、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に好適な妥当な、ベネフィット／リスク比に相応する化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために用いられる。

本明細書において使用される「ペプデューシン」および「リポペプチド」は、受容体からＧタンパク質へのシグナル移動の細胞内阻害剤として作用する細胞浸透ペプチドである。ペプデューシンリポペプチドは、細胞内Ｇタンパク質共役型受容体ループの脂質化断片を利用して標的化細胞シグナリング経路におけるＧＰＣＲ作用をモジュレートする。ペプデューシンリポペプチド分子は、疎水性部分に繋留したＧＰＣＲ細胞内ループに由来する短いペプチドを含む。この構造は、ペプデューシンリポペプチドが細胞膜脂質二重層中で定着し、特有の細胞内アロステリック機序を介してＧＰＣＲ／Ｇタンパク質界面を標的化することを可能とする。ペプデューシンリポペプチドの例は、内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００７／０１７９０９０号明細書に記載されている。

本明細書において使用される用語「治療有効量」は、研究者、獣医師、医師または他の臨床家により求められる、組織、系、動物またはヒトにおいて生物学的または医学的応答を誘発する活性化合物または薬学的「薬剤」の量を意味する。

本明細書において使用される「治療する」または「治療」は、哺乳動物、特にヒトにおける血栓症疾患状態の治療を包含し、それには、限定されるものではないが：（ａ）特に哺乳動物が疾患状態に罹患しやすいが、依然としてそれを有さないと診断される場合、哺乳動物において疾患状態が生じるのを予防すること；（ｂ）疾患状態を阻害する、すなわち、その発現を停止させること；および／または（ｃ）疾患状態を緩和させる、すなわち、疾患状態の退縮を引き起こすことが含まれる。

本発明の主題である新世代ペプデューシンの設計は、ＧＰＣＲ、例えば、ＰＡＲ２ダイマーの３Ｄ構造モデルに基づき、受容体の領域および類似のペプデューシン中のキーとなるファーマコフォアに寄与する１つ以上のアミノ酸残基を例えば細胞内ループおよび隣接ドメイン中で突然変異させることによる。構成的なアゴニストおよびアンタゴニスト活性を調節する個々のファーマコフォアを同定した。次いでこれらのファーマコフォアの破壊に由来する新規ペプデューシンを構築し、それらは特異的で、一部の実施形態において、それらのコグネートＧＰＣＲに対して完全なアンタゴニスト効果を示した。換言すると、これらの位置における突然変異は、元々は野生型ＧＰＣＲ（またはＧＰＣＲの断片）の配列をベースとするアゴニストペプデューシンを、好ましくは、実質的なアゴニスト機能を有さないアンタゴニストに変換させ得る。候補ペプデューシンを標的ＧＰＣＲに対して実質的なアゴニスト効果を有さないとみなすことができるレベルは、異なるＧＰＣＲにより変動し、一部の実施形態において、完全に機能的なアゴニスト相当物に対して計測されるとおり、そのレベルは、野生型アゴニスト効果が生理学的に重要でないレベル、例えばアゴニスト効果の計測可能な可変指標、例えば細胞膜を介するカルシウムフラックス速度の２０％、１５％、１０％または５％未満に低減した場合に達せられる。このように生成された新規ペプデューシンアンタゴニストについて、本発明者らのデータは、それらがＧＰＣＲにより調節される多くの疾患および疾病状態の有効な治療を提供する証拠をさらに提供する。

ＰＡＲ２において、このアプローチは、好中球および結腸癌細胞におけるＰＡＲ２を介するトリプシンおよび肥満細胞トリプターゼシグナリングを完全に抑制するＰ２ｐａｌ−１８Ｓペプデューシン（配列番号２０）の同定をもたらした。突然変異型のＰＡＲ２の第３（ｉ３）ループおよび隣接する第６の膜貫通へリックス（ＴＭ６）をベースとするこのＰＡＲ２ペプデューシンは、ＰＡＲ２依存性炎症応答（例えば、浮腫）の遮断において高度に有効であった。これらの効果は、ＰＡＲ２欠損および肥満細胞欠損動物モデルにおいて損失し、それにより、ペプデューシンのインビボ特異性を評価した。まとめると、新たなＰＡＲ２ペプデューシンアンタゴニストは、トリプシン、トリプターゼおよびＰＡＲ２の他のプロテアーゼアゴニストが関与する消耗性炎症疾患および病態を治療および／または予防するための医薬組成物についての基盤を提供する。

ＰＡＲファミリーの別のメンバーであるＰＡＲ１において、ＰＡＲ１の第３（ｉ３）ループのキーとなるファーマコフォア寄与位置における突然変異は、実質的なアゴニスト効果を示さず、ｓｈＲＮＡによるＰＡＲ１発現のサイレンシングと同様に、原発性肺癌および樹立細胞系の両方において細胞遊走の有意な阻害を示し、ＰＡＲ１媒介性ＥＲＫ活性化および腫瘍成長の有効な阻害剤として作用する同様の有意なペプデューシンアンタゴニストを生成した。Ａｖａｓｔｉｎと効力が同等で、新規ＰＡＲ１ペプデューシンによる単剤療法は、ヌードマウスにおいて肺腫瘍成長に対して有意な７５％の阻害を与えた。肺癌治療において有効な標的として同定されたＰＡＲ１−ＥＲＫ１／２経路について、突然変異ＰＡＲ１またはその断片をベースとする新規ペプデューシンは、肺癌および他の疾患に対する薬学的用途のための新たな組成物を提供する。

クリティカルなファーマコフォアの構造モデルおよび同定
ペプデューシンは、脂質二重層の内表面上でＧＰＣＲを阻害するために開発された細胞浸透ペプチドまたはポリペプチドである。第１世代ペプデューシンは、それらの標的受容体の野生型配列またはその断片に由来し、膜会合または浸透疎水性部分に結合している。一実施形態において、第１世代ペプデューシンは、ＧＰＣＲの細胞内ループのペプチド部分にコンジュゲートされた脂質繋留部を含む、米国特許第６，８６４，２２９号明細書参照。しかしながら、既存のペプデューシンをベースとする有効なアンタゴニストを構築することは極端に困難である一方、それらの標的受容体の多くは構成的に活性のままである傾向がある。１０年にわたり、構成的に活性な受容体の一部に対する有効なペプデューシンアンタゴニストの考案を試みる種々の分子生物学技術が開発されてきたが、成果は見られない。例えば、ＰＡＲ由来ペプデューシンのｉ１、ｉ２、ｉ３およびｉ４ループにおけるランダム突然変異は、突然変異位置および長さ変動について可変部が多すぎるため、十分な結果を生成しなかった。

しかしながら、高分解能モデリング技術およびプログラムの進歩に伴い、本発明は、それらの会合リガンドおよび／またはＧタンパク質を用いるまたは用いない受容体のインビボ立体構造の構造モデリングを介して同定されたファーマコフォアの破壊または変化を取り込む新世代の合理的設計ペプデューシンの組成物および方法を提供することができる。本明細書において使用されるファーマコフォアは、生物学的巨大分子、例えば受容体によるリガンドの分子認識に必要な分子構造を記載する。ファーマコフォアは、特異的な生物学的標的との最適な超分子相互作用を確保するために、およびその生物学的応答を誘発（または遮断）するために必要な立体および電子構造の群であり得、それには、例えば、分子が疎水性、芳香族、水素結合受容体、水素結合ドナー、カチオン、またはアニオンであるかどうかが含まれる。

これらのファーマコフォアを破壊する突然変異により、従来世代のペプデューシンにおけるアゴニスト能が大幅に低減され、さらには排除された一方、アンタゴニスト能が向上された新世代のペプデューシンを生成した。手短に述べると、一実施形態において、有力な受容体−Ｇタンパク質相互作用の有力な３Ｄモデルに基づくモデルを最初に構築する。次いで、界面領域を試験し、界面を越えてパートナーに対して横向きに突き出るキー残基を同定する。候補ペプデューシンは、疎水性の第２のドメインを、界面相互作用を担う可能性の高いＧＰＣＲセグメントを事実上含む第１のドメインに付着することにより構築し、ＰＡＲ２の場合、例えば、ダイマー界面はＰＡＲ２のｉ３ループを大部分で、およびより少ない程度でＴＭ６およびＴＭ５を含むその隣接領域を含むと考えられる。突然変異、例えば単一塩基置換は、標準的な生化学および分子生物学プロトコルを使用して同定されたキー残基位置の１つ以上またはその周囲においてエンジニアリングする。次いで、候補ペプデューシンのアンタゴニストおよびアゴニスト能を、さらなる最適化、例えばＮおよび／またはＣ末端におけるトランケーションを用いてまたは用いずに試験することができる。

したがって、ＰＡＲファミリー中の数残基の位置を、本発明を介して受容体機能に顕著に寄与するために重要であると同定および確認した。ヒトＰＡＲ２において、これらの位置は、２７４位におけるメチオニン（Ｍ）、２８４位におけるアルギニン（Ｒ）および２８７位におけるリジン（Ｋ）を含む。ヒトＰＡＲ２中のＲ２８４における突然変異（例えば、単一塩基置換）を介する破壊は、最も優秀なＰＡＲ２アンタゴニストをもたらした。あるランドマーク残基を参照することによりＧＰＣＲファミリー中の等価位置の比較を可能とするＢａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ ａｎｄ Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２５：３６６−４２８（１９９５）に元々記載されているＢａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ番号付与系によれば、ヒトＰＡＲ２中のＲ２８４およびＰＡＲファミリーのメンバーにわたるその等価物は、第６の膜貫通へリックス（ＴＭ６）中のランドマーク残基６．５０のＮ末端側第１８残基（または１８残基）である（図１５）。別の表現では、同一残基位置（ヒトＰＡＲ２中のＲ２８４およびＰＡＲにわたるその等価物）は、ＰＡＲの第３の細胞内ループ（ｉ３ループ）がウシロドプシンのｉ３ループとアラインされる場合、ウシロドプシンの２４８に対応する位置にある。ヒトＰＡＲ１において、本発明を介して発見されたキー位置は、３０９位におけるセリン（Ｓ）、３１０位におけるアルギニン（Ｒ）および３１１位におけるアラニン（Ａ）を含む。

実施例Ｉ
細胞浸透ペプデューシンによるＰＡＲ２誘発性炎症の阻止
プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）は、７回膜貫通ＧＰＣＲのサブファミリーであり、それらの細胞外ドメインの一部の開裂を介して活性化され、細胞外プロテアーゼ勾配のセンサーとして作用し、細胞が癌および多数の他のプロセス、例えば急性および慢性炎症に関与するものにおける組織リモデリングの間にタンパク質分解微小環境に反応することを可能とする。ＰＡＲ１からＰＡＲ４は、公知のＰＡＲの４つである。これらは、ヒト体内全体にわたり発現される。

多くのＧＰＣＲについて示されるとおり、ＰＡＲが互いに相互作用し、ホモおよびヘテロダイマーを形成し得るかなりの証拠が存在し、ペプデューシンは、それらのダイマー相互作用を脂質二重層の細胞内表面上で模倣することが仮定される（Ｌｅｇｅｒ Ａ Ｊ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１３：１２４４−１２５４）。目下図１Ａを参照すると、ＰＡＲ２ペプデューシンアンタゴニストの設計を開始するため、ＰＡＲ２ダイマーの分子モデル（右パネル）を構築した。

最初に、ＰＡＲ２モノマーのモデルを、テンプレートとしてのｘ線ウシロドプシン（ＰＤＢコード１ＨＺＸ）の構造に基づきコンピュータプログラムＭｏｄｅｌｌｅｒを使用して構築した（Ｔｅｌｌｅｒ Ｄ Ｃ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０：７７６１−７７７２）。ウシロドプシンの構造は、ヒトＰＡＲ２と４５％の同一性を共有する。ヒトＰＡＲ２の残基５１〜３９７を、ウシロドプシンの残基１〜３４６に代えて置換した。次いでモデルの化学形状を、ＣｏｏｔおよびＲｅｆｍａｃ５を使用してリファインした。

次いで、受容体ダイマーのモデルを構築するため、最初に初期モデルをＰＡＲ２とインタクトヘテロトリマーＧタンパク質との複合体から、Ｇ−アルファサブユニット（ＰＤＢコード３ＤＱＢ）のＣ末端断片との複合体のオプシンの構造およびヘテロトリマーＧタンパク質トランスデューシン（ＰＤＢコード１ＧＯＴ）の構造に基づき構築した。立体化学的に妥当な位置を、後に分子ダイナミクスおよびエネルギー最小化に供される側鎖に使用した。次いで、一連の２倍対称ＰＡＲ２ダイマーモデルを、手作業で構築した一方、隣接受容体間の表面積を最大化した。具体的には、モデルを、受容体モノマー間の好ましい接触を許容するように、および受容体と相互作用することが公知のＧ−βγの領域が第２のＰＡＲ２分子に近接するようにＧタンパク質を位置させるように構築した。Ｃｏｏｔを使用してモデルをリファインし、ＰＹＭＯＬを使用して分子グラフィックス図を作成した。これらのうち、受容体ペアとＧタンパク質との相互作用に関する利用可能なデータと最も一致するモデルを選択した。

Ｎ−パルミトイル化ペプチドならびにＰＡＲ１、ＰＡＲ２、およびＰＡＲ４ペプチドアゴニストを、Ｔｕｆｔｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙにより既に記載（Ｃｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００２，８：１１６１−１１６５）のとおり標準的なｆｍｏｃ固相法によりＣ末端アミドを用いて合成した。ペプデューシンは、Ｃ４またはＣ１８逆相液体クロマトグラフィーにより精製した。トリプターゼ、ウシ膵臓およびヒト肥満細胞トリプターゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）組換えＩＬ−８（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、トロンビン（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）、ｍｙｏ−［^３Ｈ］−イノシトール（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、ｆｕｒａ−２、ＡＭおよびフルオレセインヤギ抗ウサギ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｌ−カラギーナン、カオリンおよび４８／８０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、肥満細胞由来トリプターゼに対するマウスモノクローナル（ＡＡ１）（ａｂｃａｍ，ａｂ２３７８）、ＡＰＣ−３６６（ＴｏＣｒｉｓ）。

１つのＰＡＲ２受容体が隣接ＰＡＲ２受容体と相互作用し得る機能的証拠を提供するため、クリティカルな「ＤＲＹ」ＴＭ３モチーフ中に局在するＱ１７２およびＲ１７３における残基を入れ替えることによりシグナリング破壊ＰＡＲ２−ＲＱ突然変異体を構築した（図１Ａ、「ＱＲ→ＲＱ」として標識された配列の第２の組）。ＰＡＲ２−ＲＱ突然変異体は、インタクトプロテアーゼ開裂部位および繋留リガンドを有するが、Ｇタンパク質にシグナリングし得ない。ＳＬＩＧＲＬリガンドに完全にシグナリングする能力を保持するが、トリプシンによりタンパク質分解も直接活性化もされ得ない非開裂性ＰＡＲ２−Ｒ３６Ａ突然変異体も構築した。ＰＡＲ２−Ｒ３６ＡまたはＰＡＲ２−ＲＱを単独で発現する細胞は、トリプシンの勾配に遊走し得ず、Ｇｑ−ＰＬＣ−βシグナリングも活性化し得なかった。しかしながら、２つの突然変異体受容体を同時形質移入した場合、走化性遊走およびシグナリングが報告され（図１Ｂ）、ＰＡＲ２−ＲＱがそのテザーリガンドを提供してＰＡＲ２−Ｒ３６Ａをトランス活性化し得る機序と一致した。ＰＡＲ２がホモダイマーまたはオリゴマーを形成し得る直接的な証拠を提供するため、本発明者らは、ｍｙｃタグ付ＰＡＲ２がＴ７タグ付ＰＡＲ２と安定的に会合し得ることを同時免疫沈降により示した（図１Ｆ）。これらのデータは、ＰＡＲ２がそれ自体とホモダイマーまたはオリゴマー複合体中で会合する能力を有することを示す。

興味深いことに、本発明者らのデータは、野生型ＰＡＲ２がリガンドの不存在下で構成的活性を有することを示す（図１Ｃ）。構成的シグナリングは、ＧＰＣＲにおいて観察され、ｉ３ループのＣ末端膜近傍領域中に局在するクリティカルな残基に依存することが多い（Ｋｊｅｌｓｂｅｒｇ Ｍ Ａ ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６７：１４３０−１４３３）。図１Ａに示される本発明者らのホモダイマーモデルに基づき、ＧＰＣＲの膜近傍領域中にあることが多いダイマー界面におけるあるキー残基が、他の残基よりもＧＰＣＲファーマコフォアに寄与する可能性が高いことが予期された。本発明の実施形態によれば、具体的には、ＰＡＲ２の場合、ｉ３ループおよびＴＭ５およびＴＭ６ドメインを含むその隣接ドメインが、構成的およびリガンド誘発活性の両方にクリティカルである可能性が高いことがさらに予期された。それというのも、これらのドメインは、特にＰＡＲ２ダイマー界面を越えて隣接ｉ４ドメインからの第８のへリックス領域と潜在的に相互作用し得るためである。別の手法で説明すると、ＰＡＲ２の３Ｄホモダイマーモデルに基づき、ダイマー界面を越えて横方向に突出し（図１Ａ、右パネル）、受容体から離れたキー残基は、そのファーマコフォアおよび構成的活性にクリティカルであることが同様に予期された。ヒトＰＡＲ２中のｉ３ループおよびその隣接ドメイン中の種々の残基のうち、本発明のアプローチによれば、ＰＡＲ２活性に役立つ少なくとも３つの残基が存在することが予期された：２７４位におけるメチオニン（Ｍ）、２８４位におけるアルギニン（Ｒ）、および２８７位におけるリジン（Ｋ）。

次に、これらの位置における残基の重要性を試験した。Ｍ２７４のアラニンへの突然変異（「Ｍ２７４Ａ」と標識）は、構成的シグナルを除去した一方、Ｋ２８７のアラニンへの突然変異（「Ｋ２８７Ａ」と標識）は、効果を有さなかった（図１Ｃ）。際立つことに、Ｋ２８７のフェニルアラニンへの突然変異（「Ｋ２８７Ｆ」と標識）は、よりも構成的シグナルの２倍大きい増加を与えた（同様に図１Ｃ）。Ｍ２７４Ａは、その構成的活性の損失にかかわらず、アゴニストの存在下で完全にシグナリングし得た（図１Ｄ）。同様に、Ｋ２８７ＡおよびＫ２８７Ｆも、アゴニストに対して完全にシグナリングし得た（図１Ｅ）。逆に、２８４位におけるアルギニンをセリンに突然変異させた場合（「Ｒ２８４Ｓ」と標識）、突然変異体は、構成的シグナルの損失を示し、さらに高濃度のペプチドリガンドにより活性化され得た。同様に、ｉ４ドメイン中の第８のへリックスを欠くＰＡＲ２ΔＨ８突然変異体（図１Ａ）は、リガンドに対して完全にシグナリング破壊を示した（図１Ｄ）。まとめると、これらのデータは、ＰＡＲ２中のｉ３ループおよびその隣接ドメインの膜近傍残基が構成的およびリガンド依存性活性の両方においてクリティカルな役割を担うことを示す。

ＰＡＲ２のシグナリングに重要な残基を同定すると、次にｉ３ループおよびその隣接ドメインをベースとする一連のペプデューシンを合成してＧＰＣＲ活性がクリティカルなＭ２７４、Ｒ２８４またはＫ２８７残基および／またはその周囲における突然変異のエンジニアリングによりモジュレートされるかどうかを確認した（図２ＡおよびＢ）。図２Ｃに最も良く示されるとおり、本発明の一態様によれば、ペプデューシンとして公知の７つのキメラポリペプチドを構築した。それぞれのペプデューシンは、２つのドメインを有した：ＰＡＲ２の突然変異断片からなる第１のドメイン、およびポリペプチドに細胞膜の脂質層を浸透する能力を与える天然または非天然に生じた疎水性部分からなる第２の付着ドメイン。図２Ｃに示される例において、それぞれのペプデューシンの第１のドメインは、本発明者らがＰＡＲ２の構成的およびリガンド依存性活性の両方においてクリティカルな役割を担うことを見出した領域であるＴＭ５、ｉ３およびＴＭ６領域の１つ以上をスパニングする野生型ＰＡＲ２の断片（Ｐ２ｐａｌ−２１）の配列に由来する。具体的には、Ｐ２ｐａｌ−２１Ｆの第１のドメインは、２１アミノ酸長であり、他の６つのペプデューシンの第１のドメインは、１４から１８アミノ酸の範囲である。これらのドメインは、クリティカルなＰＡＲ２領域の少なくとも２つ、すなわち、ｉ３およびＴＭ６に対応する配列を含む。

さらに図２Ｃを参照すると、本発明の一実施形態において、突然変異、例えば単一塩基置換は、それらのクリティカルな位置の１つにおいてエンジニアリングする。例えば、Ｐ２ｐａｌ−２１ＦおよびＰ２ｐａｌ−１８Ｆの両方において、Ｋ２８７をフェニルアラニン（Ｆ）により置き換え；Ｐ２ｐａｌ−１８ＳおよびＰ２ｐａｌ−１８Ｑにおいて、Ｒ２８４をセリン（Ｓ）およびグルタミン（Ｑ）によりそれぞれ置き換える。本発明の別の実施形態において、突然変異、例えば単一アミノ酸置換を、それらのクリティカルな位置の２つ以上においてエンジニアリングする。例えば、Ｐ２ｐａｌ−１８ＳＦにおいて、Ｋ２８７およびＲ２８４をフェニルアラニン（Ｆ）およびセリン（Ｓ）によりそれぞれ置き換え；Ｐ２ｐａｌ−１４ＧＦにおいて、Ｋ２８７およびＭ２７４をフェニルアラニン（Ｆ）およびグリシン（Ｇ）によりそれぞれ置き換え；Ｐ２ｐａｌ−１４ＧＱにおいて、Ｒ２８４およびＭ２７４をグルタミン（Ｑ）およびグリシン（Ｇ）によりそれぞれ置き換える。次いで、これらのおよび他のペプデューシンを使用してそれらのＰＡＲ２機能に影響する能力を試験した。

ＰＡＲ２ペプデューシンアゴニストおよびアンタゴニスト活性についての最初のスクリーニングは、ＰＡＲ２発現ヒト結腸直腸腺癌細胞系ＳＷ６２０を使用して実施し、得られたデータを以下のとおり図２に提示する：野生型全長ｉ３ループペプデューシン、Ｐ２ｐａｌ−２１（図２Ａ）は、公知のＰＡＲ２アゴニストペプチドＳＬＩＧＲＬに対して試験した場合、カルシウムフラックスにより評価されるとおり、弱いアゴニストシグナルを与え、有意なアンタゴニスト活性を欠いた（約３％の阻害）（図２Ｃ）。ＰＡＲ２−Ｋ２８７Ｆ突然変異体（上記）において観察される構成的活性の獲得と一致するとおり、類似のＰ２ｐａｌ−２１Ｆペプデューシン（Ｃｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．２００２，ＰＮＡＳ ９９：６４３−４８）は、ＳＷ６２０細胞において完全アゴニスト活性を与えたが、アンタゴニスト活性を与えなかった（図２ＡおよびＣ）。ｉ３ループドメイン中の最初の３つの残基（Ｒ２６７、Ｍ２６８およびＬ２６９）の欠失は、ペプデューシンＰ２ｐａｌ−１８Ｆ（図２Ａ）を生成し、それは低濃度においてアゴニスト活性のわずかな減少を与えたが、依然としてアンタゴニスト活性を欠いた。

図２Ａおよび２Ｃをさらに参照すると、好ましい実施形態においてクリティカルなＲ２８４ファーマコフォア残基をセリン（Ｓ）により置き換えるＰ２ｐａｌ−１８Ｓペプデューシンは、ＰＡＲ２の高度に有効なアンタゴニスト（７７％の阻害）であり、カルシウムフラックスアッセイにおいて検出可能またはそうでなければ有意なアゴニスト活性を有さないことが判明した。それというのも、ビヒクル単独がわずか３％の読取りを与えるためである。Ｐ２ｐａｌ−１８ＳのＣ末端Ｋ２８７をフェニルアラニン（Ｆ）により置換してＰ２ｐａｌ−１８ＳＦを作製すると、ペプデューシンのアゴニスト活性が回復した。Ｒ２８４をグルタミンにより置き換えてＰ２ｐａｌ−１８Ｑを作製すると、ほとんどアゴニスト活性がもたらされないが、部分アンタゴニスト活性（２９％の阻害）を有した。Ｍ２７４のグリシン（Ｇ）への突然変異およびＫ２８７のフェニルアラニン（Ｆ）への突然変異の両方を含むＮ末端でトランケートされたＰ２ｐａｌ−１４ＧＦは、有意なアゴニストもいかなる検出可能なアンタゴニスト活性も有さなかった。しかしながら、Ｒ２８４がグルタミン（Ｑ）により置換され、Ｍ２７４がＧにより置換された同様にＮ末端でトランケートされたペプデューシンＰ２ｐａｌ−１４ＧＱにおいて、５３％のアンタゴニスト活性の獲得が観察され、アゴニスト活性はわずかまたはほとんどないままであった。

これらのデータに基づくと、ｉ３ループにおいて、Ｒ２８４残基は、候補ペプデューシン構築物のアンタゴニスト活性を有意に増強し得る強力な位置を保持すると考えられる（全て２９から７７％の範囲のＰＡＲ２活性の有意な量の阻害を示したＰ２ｐａｌ−１８Ｓ、Ｐ２ｐａｌ−１８ＳＦ、Ｐ２ｐａｌ−１８Ｑ、Ｐ２ｐａｌ−１４ＧＱに関するデータ参照）。アンタゴニスト効果は、正に帯電した比較的長い側鎖を有するアルギニン残基をより短い側鎖を有する残基、例えばセリン（Ｓ）により置換した場合に特に顕著であった。他方、Ｋ２８７残基のフェニルアラニン（Ｆ）への突然変異は、アンタゴニスト活性を抑制する一方、アゴニスト活性を向上させると考えられる（Ｐ２ｐａｌ−２１Ｆ、Ｐ２ｐａｌ−１８Ｆ、Ｐ２ｐａｌ−１８ＳＦおよびＰ２ｐａｌ−１４ＧＦに関するデータ参照）。Ｒ２８４のＳへの突然変異およびＫ２８７のＦへの突然変異の両方が存在する場合、Ｐ２ｐａｌ−１８ＳＦの場合と同様に、有意な量の両方のアゴニストおよびアンタゴニスト活性が保持される。Ｍ２７４およびその周囲における点突然変異も、調節効果を示し：Ｍ２７４からＧへの突然変異（Ｎ末端トランケーションとともに）は、Ｐ２ｐａｌ−１４ＧＦ構築物において両方見られる場合、Ｋ２８７のＦへの突然変異のアゴニスト増強能力の一部を相殺すると考えられる。

この最初のカルシウムフラックススクリーンから、本発明の一部のペプデューシンの実施形態、例えばＰ２ｐａｌ−１８ＳおよびＰ２ｐａｌ−１４ＧＱアンタゴニストペプデューシンの特性を、それらの他のＰＡＲ２機能を遮断する能力についてさらに分析した。

ａ．好中球におけるＰＡＲ２活性の特異的アンタゴニストとして
本発明の一部のペプデューシンの実施形態の、ヒト好中球のＰＡＲ２依存性活性をアンタゴナイズする能力を試験した。好中球を健常ヒト被験者の末梢血から単離し、高レベルの表面ＰＡＲ２およびＰＡＲ４ならびにより低い見かけレベルのＰＡＲ１を発現することをフローサイトメトリーにより見出した（図３Ａ）。好中球は、ＰＡＲ２アゴニストトリプシンおよびＳＬＩＧＲＬの勾配に対して堅牢に遊走し、それはＰ２ｐａｌ−１８Ｓにより０．１４〜０．２μＭのＩＣ_５０値で完全に遮断された（図３Ｂ）。同様に、０．３μＭのＰ２ｐａｌ−１８Ｓは、１００ｎＭのトリプターゼに対するヒト好中球の走化性遊走を完全に遮断した（図３Ｃ）。ヒトＰＡＲ２は、マウスＰＡＲ２と８５％の同一性を共有し、マウスｉ３ループは、ヒトＰＡＲ２ｉ３ループ中で同定されたクリティカルなファーマコフォアの全てを保持するため、マウス細胞を用いた異種間の阻害を試験した。実際、Ｐ２ｐａｌ−１８Ｓも、３０ｎＭのトリプシンに対するマウス好中球の遊走を完全に阻害した（図３Ｄ）。

ＰＡＲ２についてのＰ２ｐａｌ−１８Ｓ特異性は明白であった。それというのも、それは好中球走化性アッセイにおいて、密接に関連するＰＡＲ１、ＰＡＲ４、またはＣＸＣＲ１／２ＩＬ−８受容体に対するアンタゴニスト活性を有さなかったためである（図３Ｅ）。Ｐ２ｐａｌ−１８Ｓは、ＰＡＲ２リガンドＳＬＩＧＲＬへの有効な阻害を提供するにもかかわらず、ＳＷ６２０細胞においてもＣＯＳ７細胞のイノシトールリン酸シグナリングにおいてもカルシウムフラックスアッセイによりＰＡＲ１もＰＡＲ４も阻害しなかった（図４Ａおよび４Ｂ）。Ｐ２ｐａｌ−１４ＧＱペプデューシンは、ＰＡＲ２についても選択的であり、ＰＡＲ１については選択的でなかったが、Ｐ２ｐａｌ−１８Ｓと比較してＳＬＩＧＲＬに対するＳＷ６２０細胞の遊走の抑制において有効でなかった（図４Ａ〜４Ｃ）。Ｐ２ｐａｌ−１８Ｓは、ＰＡＲ１依存性血小板凝集に対する効果を有さなかった（図５Ａ）。Ｐ２ｐａｌ−１８ＳもＰ２ｐａｌ−１４ＧＱも、３０μＭまでの濃度のペプデューシンを用いるＳＷ６２０細胞中でのヨウ化プロピジウム取り込みにより評価されるとおり、膜破壊もアポトーシスも引き起こさなかった（図５Ｂ）。

Ｐ２ｐａｌ−１８Ｓは、ＰＡＲ２−Ｒ３６ＡおよびＰＡＲ２−ＲＱ突然変異体を同時発現するＨＥＫ細胞の走化性遊走の完全な抑制により示されるとおり、ＰＡＲ２−ホモダイマーのトランス活性化を遮断することも見出された（図４Ｄ）。さらに、Ｐ２ｐａｌ−１８ＳペプチドがＰＡＲ２と直接相互作用する証拠として、ＰＡＲ２は、ビーズ単独と比較してＰＡＲ２ｉ３ループ１８Ｓペプチドとカップリングしているアビジンビーズへの結合を向上させた。さらに、本発明者らは、Ｐ２ｐａｌ−１８ＳがＰＡＲ２のタンパク質分解開裂またはエンドサイトーシスを阻害するかどうか試験した（ＤｅＦｅａ Ｋ Ａ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４８：１２６７−８１；Ｒｏｏｓｔｅｒｍａｎ Ｄ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２８４：Ｃ１３１９−２９；Ｓｔａｌｈｅｉｍ Ｌ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ６７：７８−８７）。Ｐ２ｐａｌ−１８Ｓは、ＰＡＲ２のトリプシン開裂に対する効果を有さず、ＰＡＲ２についてもＰＡＲ１についてもリガンド依存性エンドサイトーシスを阻害しなかった。したがって、Ｐ２ｐａｌ−１８Ｓ ｉ３ループペプデューシンは、ＰＡＲ２依存性カルシウムシグナリング、ＰＬＣ−ｂイノシトールリン酸形成、および細胞遊走を阻害し得るが、タンパク質分解開裂もエンドサイトーシスも阻害し得ない。

ｂ．炎症足浮腫のマウスモデルにおける効力
Ｐ２ｐａｌ−１８Ｓのインビボ効力および特異性を評価するため、本発明のペプデューシンの炎症後足浮腫に対して保護する能力を野生型（ＷＴ）およびＰＡＲ２欠損マウス系統において試験した（Ｄａｍｉａｎｏ Ｂ Ｐ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ２８８：６７１−７８）。急性炎症浮腫は、莫大な白血球増加および充血応答を引き起こし、局在膨張に導くλ−カラギーナンおよびカオリン刺激物質の胎盤内注射により誘導した。本発明のポリペプチドＰ２ｐａｌ−１８Ｓの実施形態のＰＡＲ２欠損活性を、ＷＴＣ５７ＢＬ／６マウスの後足蹠中に注射した場合のＰＡＲ２特異的アゴニストＳＬＩＧＲＬに対するその阻害効果を定量することにより直接評価した。λ−カラギーナン／カオリンにより誘導された急性炎症は、ビヒクル処理ＷＴマウスについて足浮腫のほぼ２倍の増加をもたらし、注射後８時間がピークであった（図６Ａ）。ＰＡＲ２アゴニストペプチドＳＬＩＧＲＬも、ＷＴマウスの浮腫の増加を誘導し、注射後４時間がピークであった（図６Ｂ）。Ｐ２ｐａｌ−１８Ｓの全身投与は、λ−カラギーナン／カオリン誘導性浮腫の有意な５０％の減少およびＳＬＩＧＲＬ誘導性浮腫の８５％の減少を引き起こした（図６Ａおよび６Ｂ）。ＰＡＲ２欠損は、λ−カラギーナン／カオリン注射後にＷＴマウスに対して５０％の保護効果を付与し、Ｐ２ｐａｌ−１８Ｓにより処理したＷＴマウスにおいて観察された保護効果とほぼ同一であった。とりわけ、Ｐ２ｐａｌ−１８ＳによるＰＡＲ２欠損（ＰＡＲ２^−／−）マウスの処理は膨張をさらに低減させず、ＰＡＲ２ペプデューシンの抗炎症効果がそのコグネート受容体の存在を要求することを裏付けた。

λ−カラギーナン／カオリン注射７時間後に回収された炎症化足蹠の組織学分析により、Ｐ２ｐａｌ−１８Ｓが足蹠の真皮中の白血球浸潤に対する有意な６０％の保護（Ｐ＜０．００５）を提供することが明らかになり、ＷＴマウスに対してＰＡＲ２^−／−マウスにおいて観察された保護と同一であった（図６Ｃ）。λ−カラギーナン／カオリンチャレンジは、ＷＴマウスにおけるミエロペルオキシダーゼ活性の２倍の増加を引き起こし、それはＰ２ｐａｌ−１８Ｓにより遮断された（図６Ｄ）。まとめると、これらのデータは、ＰＡＲ２ペプデューシンＰ２ｐａｌ−１８Ｓが急性白血病炎症および浮腫に対する有意な保護効果を提供し、それらの保護効果はＰＡＲ２の存在に依存することを実証する。

ｃ．肥満細胞トリプターゼ誘導性炎症に対する保護
従来の研究は、ヒト内皮およびケラチノサイトならびに関節炎のマウスモデルにおいて肥満細胞トリプターゼが開裂し、ＰＡＲ２シグナリングを活性化させることを立証した（Ｋｅｌｓｏ Ｅ Ｂ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ３１６：１０１７−２４；Ｐａｌｍｅｒ Ｈ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ５６：３５３２−４０）。肥満細胞および肥満細胞トリプターゼが足炎症マウスモデルにおいて観察されたＰＡＲ２依存性効果に寄与するかどうかを決定するため、肥満細胞を脱顆粒剤４８／８０、またはλ−カラギーナン／カオリンにより刺激し、馴化培地を回収した。図７Ａに示されるとおり、刺激した肥満細胞はトリプターゼを分泌し、次いでそれを好中球走化性アッセイにおける化学誘引物質源として使用した。刺激した肥満細胞からの馴化培地は、１００ｎＭのトリプターゼと同等の走化性遊走を与えた（図７Ｂ）。トリプターゼ阻害剤ＡＰＣ−３６６、またはＰＡＲ２ペプデューシンＰ２ｐａｌ−１８Ｓによるヒト好中球の処理は、トリプターゼ含有肥満細胞培地に対する走化性遊走を完全に阻害した（図７Ｂ）。

肥満細胞および肥満細胞トリプターゼが足浮腫モデルにおいてインビボでＰＡＲ２を活性化させるかどうかを試験するため、マウスから化合物４８／８０による前処理を介して肥満細胞を枯渇させた（Ｃａｒｖａｌｈｏ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（２００５），５２５：１６１−１６９）。４８／８０枯渇動物におけるλ−カラギーナン／カオリン誘導性浮腫の減少が、未処理対照と比較して観察された。同様に、トリプターゼ阻害剤ＡＰＣ−３６６により処理したマウスは、λ−カラギーナン／カオリン誘導性足浮腫の有意な４０％の保護を与えた（図７Ｃ）。トリプターゼ含有肥満細胞培地の胎盤内注射は、選択的ＰＡＲ２アゴニストＳＬＩＧＲＬ（図６Ｂ）により誘導されるのと同様の足浮腫のピーク増加をもたらした（図７Ｄ）。Ｐ２ｐａｌ−１８Ｓによる全身処理は、４時間における浮腫のピーク発達の５０％の減少を与え、８時間以降における完全な保護を提供した（図７Ｄ）。肥満細胞由来トリプターゼが観察されたＰＡＲ２依存性炎症応答を媒介するさらなる証拠を提供するため、本発明者らは次いで肥満細胞欠損マウスをλ−カラギーナン／カオリンによりチャレンジし、これらのマウスがインタクト肥満細胞を有するＰ２ｐａｌ−１８Ｓ処理リッターメイト対照マウスと同一の低減された足浮腫応答を有することを観察した（図７Ｅ）。さらに、肥満細胞欠損マウスにおいて観察された足浮腫は、Ｐ２ｐａｌ−１８Ｓによる処理によりさらに低減させることができなかった（図７Ｅ）。まとめると、これらのデータは、Ｐ２ｐａｌ−１８Ｓペプデューシンが肥満細胞由来トリプターゼにより誘発される炎症浮腫に対する有意な保護を提供することを示唆する。

上記実施例は、画期的医薬品であるＰＡＲ２のリポペプチドペプデューシン完全アンタゴニストの開発を記載する。ペプデューシンは、扱いが困難な膜貫通受容体、例えばＰＡＲ２を標的化するために現れた新技術である。これらの高度に安定的な脂質化ペプチドは、それらのコグネートＧＰＣＲの細胞内表面に標的化され、受容体を活性または不活性立体構造のいずれかで安定化させ、シグナル伝達のモジュレーションをもたらす。ペプデューシンは、典型的には、２つの構成成分を含む：標的ＧＰＣＲのｉ１〜ｉ４細胞内ループに由来する短ペプチド配列、およびアシル鎖脂肪酸（例えば、パルミテート）またはペプチドにコンジュゲートしている他の脂質。ｉ３ループアゴニストおよびアンタゴニストペプデューシンの合理的設計は、ＰＡＲ２ダイマーの構造モデルに基づき、構成的アゴニストおよびアンタゴニスト活性を制御する個々のファーマコフォアを同定した後に受容体ループおよび類似のペプデューシン中のキー残基を操作することによる。最も強力なペプデューシンアンタゴニストＰ２ｐａｌ−１８Ｓは、ＰＡＲ２シグナリングを完全に排除したが、密接に関連するＰＡＲ１、ＰＡＲ４受容体も、他の試験ＧＰＣＲも阻害しなかった。

ＰＡＲ２ペプデューシンアンタゴニストは、マウス足炎症モデルにおいてλ−カラギーナン／カオリンまたはＰＡＲ２選択的アゴニストにより誘導された白血球浸潤および浮腫の抑制における有意なインビボ効力を有した。Ｐ２ｐａｌ−１８Ｓペプデューシンの抗炎症効果は、ＰＡＲ２欠損マウスにおいて損失し、ペプデューシンがインビボでＰＡＲ２に高度に特異的であることを実証した。さらに、野生型に対してＰＡＲ２欠損マウスにおいて観察された抗炎症効果は、Ｐ２ｐａｌ−１８Ｓにより処理した野生型マウスにおいて観察されたものとほぼ同一であった。まとめると、これらのデータは、Ｐ２ｐａｌ−１８Ｓが急性炎症のモデルにおいてＰＡＲ２の有効な薬理学的遮断を提供することおよびこれらの効果がＰＡＲ２の存在を要求することを示す。

多くの研究は、ＰＡＲ２が広範な疾患、例として喘息（Ｓｃｈｍｉｄｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００２，１６９：５３１５−５３２１）、関節炎（Ｆｅｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、痛覚過敏（Ｖｅｒｇｎｏｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００１）、神経原性および癌疼痛（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、および癌侵襲（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４，２：３９５−４０２）においてクリティカルな役割を担うと関係づけた。マウス足蹠モデルにおいて観察される炎症応答が肥満細胞およびＰＡＲ２誘発性炎症の重要なアゴニストである肥満細胞由来トリプターゼに大きく依存しているいくつかの一連の証拠が本明細書に提供される。本発明者らは、ＰＡＲ２ペプデューシンがＰＡＲ２を介するトリプターゼシグナリングを完全に抑制し得ることを見出した。さらに、肥満細胞欠損マウスは、インタクト肥満細胞を有するＰ２ｐａｌ−１８Ｓ処理リッターメイト対照と同一の低減された足浮腫応答を有した。さらに、肥満細胞欠損マウスにおける足浮腫は、Ｐ２ｐａｌ−１８Ｓによる処理によりさらに低減させることができず、肥満細胞由来トリプターゼがこの急性炎症モデルにおけるＰＡＲ２依存性炎症応答を媒介する概念についてのさらなる支持を提供した。ＰＡＲ２ペプデューシンは、トリプターゼの他に炎症環境中に存在する他のＰＡＲ２プロテアーゼアゴニストにより誘導されるシグナリングを阻害し得ることが考えられる。

２つの他のグループが、繋留ペプチドリガンドをベースとするＰＡＲ２アンタゴニストを開示している（Ｋｅｌｓｏ ｅｔ ａｌ，２００６；Ｋａｎｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２００９，１５８：３６１−３７１）。Ｋｅｌｓｏ ｅｔ ａｌ．において、ＰＡＲ２小分子阻害剤ＥＮＭＤ−１０６８が関節炎症のモデルにおいて試験された。ＥＮＭＤ−１０６８は、インビトロでその保護効果を観察するためにミリモル濃度を要求し、インビボではかなりより高い用量を要求する。ペプチドアンタゴニストＫ−１４５８５は、ＰＡＲ２依存性ＩＬ−８生成、ＮＦ−κＢリン酸化、およびｐ３８シグナリングを阻害することが示された（Ｇｏｈ ｅｔ ａｌ．，２００９）。しかしながら、Ｋ−１４５８５化合物は、野生型ＰＡＲ２ペプデューシンＰ２ｐａｌ−２１（Ｃｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，２００２）についても観察されるとおり、部分アゴニスト活性を有する（Ｇｏｈ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｋａｎｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００９）。これに関して、本発明者らは、野生型ＰＡＲ２が構成的活性を有することを発見し、ある細胞外または細胞内ＰＡＲ２リガンドが潜在的なオン状態を安定化させ得ることを示した。構成的活性をインタクト受容体中のクリティカルなｉ３ループファーマコフォアの突然変異により排除または向上させることができる認識は、残留アゴニスト活性を損失した合理的設計ＰＡＲ２ペプデューシンアンタゴニストに本発明者らを導いた。困難なＧＰＣＲ標的、例えばＰＡＲ２に対してこうして設計および構築されたペプデューシンアンタゴニストは、ＰＡＲ２シグナリングが関与する広範な疾患、例として多くの付随炎症反応における新規薬理学的薬剤を提供した。

実施例ＩＩ
新たなペプデューシンによるＰＡＲ１−Ｇタンパク質シグナリングおよび疾患の標的化
肺癌は、米国および世界における癌死亡の主原因であり、全体で２番目に高頻度な癌である。患者の大多数は、相当な罹患率および死亡率に導く遠隔転移を最終的に発現する。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療のための現在利用可能な化学療法レジメンには、シスプラチンまたはカルボプラチン、およびエトポシド、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、ビノレルビンおよびイリノテカンの組合せが含まれる。これらのレジメンは、一般に治癒性でなく、軽度な延命および症状の緩和を付与し得る。さらに近年、肺癌の治療のための標的療法が利用可能になっている。これらには、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）および血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）を標的化する小分子および抗体が含まれる。しかしながら、現在利用可能な分子療法は、依然として平均および全生存の比較的軽度な延長をもたらし、ＮＳＣＬＣが進行した患者のためのより有効な治療モダリティーの開発の必要性が指摘される。

ＰＡＲ１を有望な標的として同定して種々の癌、例として乳癌、卵巣癌、黒色腫、前立腺癌および結腸癌における腫瘍進行、転移および血管新生に影響を与える証拠が現れている（例えば、Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００６，６６：２６５８−６５）。しかしながら、肺癌におけるＰＡＲ１および他のＰＡＲファミリーメンバーの役割は、概して未開拓である。

本発明において、ＰＡＲ１は、ＰＡＲ１の第１の（ｉ１）細胞内および第３の（ｉ３）細胞内ループから生成された細胞浸透ペプデューシンを用いることにより肺癌における治療剤として同定された。ペプデューシン技術は、細胞膜の界面における受容体Ｇタンパク質相互作用を標的化するために開発された。パルミトイル化またはペプチドに付着される他の脂質部分の使用は、細胞膜を越えてリポペプチドを区画化し、二重層を越えるフリップによりペプデューシンを細胞内表面に急速送達する。ペプデューシンのそれらのコグネート受容体に対する特異性を決定するための複数の研究が実施されてきた。本発明において、ｉ１およびｉ３ループをベースとするＰＡＲ１ペプデューシンは、遊走およびＣａ^＋＋シグナリングの阻害において同等の効力を有した。対照的に、ｉ３標的化ペプデューシンがＰＡＲ１依存性ＥＲＫ１／２活性およびＶＥＧＦ分泌を遮断することも見出された。ｉ３ベースのペプデューシンによる単剤療法は、ｉ１ベースのペプデューシンよりも有効であり、ｉ３ペプデューシンにより阻害されるＰＡＲ１は、ゼノグラフトモデルにおいて７５％まで肺腫瘍成長を有意に阻害し、Ａｖａｓｔｉｎと同様の効力であった。これらのデータは、肺癌におけるＰＡＲ１を新たな治療標的として同定し、ＰＡＲ１のｉ１およびｉ３細胞内ループをベースとするペプデューシンが異なるシグナリング経路を遮断し得ることを示す。

ｉ１およびｉ３ペプデューシンの設計においてガイドするため、図８Ａに示されるとおりロドプシンのｘ線構造に基づくＰＡＲ１のモデルを作成した（Ｓｗｉｆｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００６，２８１：４１０９−１６）。異なるＰＡＲ１細胞内ループがヘテロトリマーＧ_ｑ、Ｇ_ｉおよびＧ_{１２／１３}タンパク質の異なる領域と相互作用することが予期されたため、ｉ１とｉ３ループの細胞内遮断が異なるシグナリング経路に優先的に影響するかどうかを３Ｄモデルに基づき試験した。

ＰＡＲ１由来の第１のドメインがキーアミノ酸位置における突然変異を含有するペプデューシンも、試験のために構築した。モデリングを介してＧタンパク質活性化にクリティカルである可能性が高いと同定されたキーアミノ酸の１つは、ｉ３ループ上の３１０位におけるアルギニン（Ｒ）である。Ｐ１ｐａｌ−１０Ｓにおいて、Ｒ３１０は、セリン（Ｓ）により置換されている（図８Ａ）。例えば、Ｒ３１０をセリン（Ｓ）またはグルタミン酸（Ｅ）により置換することによるＲ３１０の破壊により、ＰＡＲ１受容体がＧタンパク質を活性化させるそのアゴニスト能力の実質的に全てを損失し（データ示さず）、したがって、本明細書において用いる。３Ｄモデリングは、残基３０９の側鎖がパートナーＰＡＲ１に直接向き、残基３１１の側鎖は膜環境中に存在することも示す。これらの２つの位置における残基を、荷電アミノ酸グルタミン酸により突然変異させることは、任意のアゴニスト機能性を破壊する可能性が高いことが企図された。したがって、別の突然変異体ペプデューシンＰ１ｐａｌ−１９ＥＥをその１９残基のＰＡＲ１由来の第１のドメイン中の点突然変異：Ｓ３０９のグルタミン酸（Ｅ）およびＡ３１１のＥによる置換により構築した（図８Ａ）。Ｐ１ｐａｌ−１９ＥＥを種々の試験において陰性対照として使用した。ＰＡＲ１由来の第１のドメイン中に１０アミノ酸を有するＰ１ｐａｌ−１０Ｓを、候補として他のペプデューシン候補、例としてＰＡＲ１中の野生型ｉ３ループの断片と同一の順序通りの７つのアミノ酸を含有するＰ１ｐａｌ−７とともに試験した。具体的には、本発明者らは、ｉ３−ループＰ１ｐａｌ−７、ｉ３−ループＰ１ｐａｌ−１０Ｓ、およびｉ１−ループＰ１ｐａｌ−ｉ１−１１の効力を、それらのＰＡＲ１媒介性Ｃａ^＋＋シグナリング、細胞遊走およびＭＡＰキナーゼシグナリングを遮断する能力について試験した。それというのも、それらは異なるシグナリング経路により調節されるためである。

第一に、ＰＡＲ１はＣａ^＋＋シグナリングにより評価されるとおりヒト血小板中のＧ_ｑに強く共役することが従来示されている。ＰＡＲ１媒介性Ｇ_ｑ−ＰＬＣβ−ｌｎｓＰ_３シグナリングに対するｉ１およびｉ３ペプデューシンの効果を測定するため、ヒト血小板をＰＡＲ１ペプデューシンにより前処理し、ＳＦＬＬＲＮにより刺激してからＣａ^＋＋フラックスの速度を計測した。図８Ｂに示されるとおり、Ｐ１ｐａｌ−７、Ｐ１ｐａｌ−１０ＳおよびＰ１ｐａｌ−ｉ１−１１は、ＳＦＬＬＲＮによるＰＡＲ１依存性Ｃａ^＋＋動員をそれぞれ０．５５±０．０４，０．７０±０．１７、および１．３±０．１μＭのＩＣ_５０値で有効に阻害した。しかしながら、カルシウム動員を完全に阻害し得たｉ３由来ペプデューシンとは異なり、ｉ１由来Ｐ１ｐａｌ−ｉ１−１１は、Ｇ_ｑ媒介性カルシウムシグナルの阻害においてそれほど有効でなかった。

第二に、Ｂｏｙｄｅｎチャンバー遊走アッセイを介して、トロンビンおよびＭＭＰ−１繋留ＰＡＲ１リガンドペプチドＰＲＳＦＬＬＲＮ（配列番号３０）の両方がＡ５４９肺癌細胞（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／ＮＩＨから）の遊走を同様の尺度で誘導することが示された（図８Ｃ）。次に、本発明のＰＡＲ１アンタゴニストペプデューシンがＡ５４９肺腺癌細胞の遊走を遮断し得るかどうかを試験した。図８Ｃにおいて実証されるとおり、ｉ１およびｉ３由来ペプデューシンによるＡ５４９細胞の遊走は完全に遮断された。

最後に、ＭＡＰキナーゼカスケードのＰＡＲ１媒介性活性化およびＰＡＲ１依存性細胞成長および分化、増殖ならびに遺伝子転写の機序の理解に多くの関心が寄せられている。ＥＲＫ１／２活性化は、Ｇ_ｉ（βγ）−ＰＩ３−キナーゼおよびＧ_ｑ経路の両方を介して活性化されることが示されている。ＥＲＫ１／２活性化に対するｉ１とｉ３ＰＡＲ１ペプデューシンの効果を、Ａ５４９肺腺癌細胞系において試験した。Ａ５４９細胞をトロンビンにより処理することにより、刺激１５〜３０分後においてピークを示す急速で堅牢なＥＲＫ１／２リン酸化をもたらした。一連のペプデューシン濃度（０．１〜３μＭ）による阻害実験を実施した。トロンビン誘導性ＥＲＫ１／２リン酸化は、ｉ３由来ペプデューシンＰ１ｐａｌ−７およびＰ１ｐａｌ−１０Ｓにより０．２±０．１および０．８±０．２μＭのＩＣ_５０値で完全に阻害された一方、ｉ１由来Ｐ１ｐａｌ−ｉ１−１１は、ＥＲＫ１／２のリン酸化に対する効果を有さなかった（図９Ａおよび９Ｄ）。ＰＲＳＦＬＬＲＮ（配列番号３０）ペプチドは、刺激５〜１５分後においてピークを示す急速で一過性のＥＲＫ１／２リン酸化シグナルを与えた。トロンビンと同様に、０．１μＭのＰ１ｐａｌ−７は、ＰＲＳＦＬＬＲＮ誘導性ホスホ−ＥＲＫシグナルを完全に遮断し得た（図１０）。このことは、ｉ１ペプデューシンとは異なり、ｉ３ループペプデューシンは、ＰＡＲ１媒介性ＥＲＫ活性化の有効な阻害剤であることを示す。ＰＡＲ１ペプデューシン阻害剤の特異性を測定するため、密接に関連するＰＡＲ２およびＰＡＲ４受容体に対するそれらの効果も試験した。３つ全てのＰＡＲ１ペプデューシンは、ＰＡＲ１について選択性であり、１〜３μＭ濃度においてＰＡＲ２もＰＡＲ４も交差阻害しなかった（図９Ｂ、９Ｃ、９Ｅ、および９Ｆ）。

ＰＡＲ１発現は、非常に侵襲性の強い肺癌細胞系中で増加される
従来の組織学的分析は、プロテアーゼ活性化受容体ＰＡＲ１およびＰＡＲ４が、３０例の腺癌および３０例の扁平上皮癌を含む６０人のＮＳＣＬＣ患者の試験からのアウトカムに対して負の予後予測値を有し得ることを示唆した（Ｇｈｉｏ ｅｔ ａｌ．２００６）。したがって、４つ全てのＰＡＲメンバーの表面発現を、５つの腺癌、１つの扁平上皮癌、および１つの大細胞癌から構成される７つの異なる国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＮＣＩ）肺癌細胞系中でフローサイトメトリーを使用して測定した。４つのＰＡＲファミリーメンバーのうち、ＰＡＲ１発現は、大多数の肺癌において３倍から９倍増加され、最大発現は腺癌において検出された。対照的に、他の３つのＰＡＲ、例としてＰＡＲ４は軽度に増加したにすぎなかった（図１１Ａ）。高ＰＡＲ１発現細胞は、２つの低発現ＰＡＲ１細胞系（ＥＫＶＸおよびＮＣＩ−Ｈ２３）よりも馴化培地に対する遊走の７から１８倍高い速度を示した。

原発性腫瘍検体におけるＰＡＲの発現を立証するため、開胸を受けた患者から単離された５つの肺検体において定量ＰＣＲを使用してｍＲＮＡレベルを計測した。組織学に基づき、原発性腫瘍は、２つの腺癌、１つの低分化ＮＳＣＬＣ、１つの扁平上皮癌、および１つの良性肺検体を含んだ。図１１Ｂに示されるとおり、患者肺癌は、高レベルのＰＡＲ１ｍＲＮＡならびに低レベルのＰＡＲ２、ＰＡＲ３、およびＰＡＲ４ｍＲＮＡを有した。ＮＣＩ肺癌について観察されたとおり、患者腫瘍における高ＰＡＲ１発現は、正常肺組織と比較して４つ全ての原発性肺腫瘍細胞の遊走の大きい１０から４０倍の増加も伴った。

肺癌細胞運動性におけるＰＡＲ１の役割をさらに立証するため、２つの高ＰＡＲ１発現腺癌Ａ５４９およびＨＯＰ６２においてＰＡＲ１ショートヘアピンＲＮＡを使用してＰＡＲ１遺伝子発現のサイレンシングの効果を試験した。ＰＡＲ１ショートヘアピンＲＮＡは、両方の細胞系において大多数のＰＡＲ１発現をサイレンシングした（８０％±５％および９０％±５％）（図１１Ｃ）。次に、Ｂｏｙｄｅｎチャンバー遊走アッセイを使用して細胞遊走に対するＰＡＲ１損失の効果を試験した。ＰＡＲ１ノックダウンは、ｓｈＰＡＲ１およびベクター対照処理細胞の長期ピューロマイシン選択後にＮＩＨ−３Ｔ３馴化培地に対するＡ５４９細胞における遊走を５５％±５％だけ、ＨＯＰ６２細胞における遊走を８０％±５％だけ抑制することが見出された（図１１Ｄ）。

Ａ５４９細胞はさらに全ての後続のインビトロおよびインビボ実験において特性決定された細胞系であるため、細胞外リガンドＲＷＪ−５６１１０（１０μｍｏｌ／Ｌ）およびＳＣＨ７９７９（５０μｍｏｌ／Ｌ）に対するＰＡＲ１アンタゴニストの効果も試験し、遊走の４０％から５０％の阻害が見出された（図１１Ｄ）。これらのデータは、乳癌細胞におけるＰＡＲ１のサイレンシングに遊走の減少が伴うという本発明者らの従来の知見（Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ａｇａｒｗａｌ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ，２００９）と一致する。

ＰＡＲ１ｉ１およびｉ３ペプデューシンは、肺癌の遊走を阻害する
ＰＡＲ１発現のサイレンシングは遊走を減少させたことから、ｉ１およびｉ３ＰＡＲ１アンタゴニストペプデューシンが４つのＮＣＩ肺細胞腺癌（Ａ５４９、ＨＯＰ６２、Ｈ５２２、およびＨ１２９９）、１つの大細胞癌（ＨＯＰ９２）、１つの扁平上皮癌（Ｈ２２６）の遊走に対して同様の効果を有するかどうかを、２つの腺癌、１つの低分化ＮＳＣＬＣ、および１つの正常肺上皮から構成される３つの原発性患者腫瘍とともにさらに試験した。ＰＡＲ１発現腺癌の遊走は、３つ全てのペプデューシンにより６０％から８０％だけ抑制され（図１２Ａ〜Ｃ）、そのことはＰＡＲ１ショートヘアピンＲＮＡ処理により早期に見られた効果と高度に類似した。陰性対照ＰＡＲ１ｉ３ペプデューシンＰ１ｐａｌ−１９ＥＥは、遊走に対して効果を有さなかった。Ｐ１ｐａｌ−７は、Ｈ２２６扁平上皮癌、ＨＯＰ９２大細胞癌、およびＨ５２２腺癌（図１２Ｄ〜Ｆ）について４０％から９０％の阻害を提供し、そのことはＰＡＲ１シグナリングが肺癌細胞遊走において重要な役割を担うさらなる支持を提供した。

ＰＡＲ１アンタゴニストペプデューシンが細胞毒性を肺癌細胞に付与し得るかどうかを、ＭＴＴアッセイを使用してさらに試験し、Ｇｉを不活性化させる百日咳毒素によるＡ５４９、Ｈ１２９９、またはＨＯＰ６２の前処理がＰＡＲ１遮断と同様の遊走の阻害をもたらすことが見出された。細胞遊走の５時間の時間にわたる３μｍｏｌ／ＬのペプデューシンへのＡ５４９、ＨＯＰ６２、およびＨＯＰ９２肺癌細胞系の曝露は、細胞生存率に対して有意な効果を有さなかった。しかしながら、３日間の時間にわたり、Ａ５４９細胞はｉ３由来Ｐ１ｐａｌ−１０ＳおよびＰ１ｐａｌ−７ペプデューシンに最も感受性であり、ｉ１由来Ｐ１ｐａｌ−ｉ１−１１にそれほど感受性でなかった。

肺腫瘍から単離された原発性癌細胞系の遊走をＰＡＲ１ペプデューシンにより阻害することができるかどうかを決定するさらなる実験を実施した（図１２Ｇ）。ＰＡＲ１ペプデューシンは、原発性肺腫瘍の遊走を有意に阻害し（４０％から８０％）、Ｐ１ｐａｌ−７（ｉ３）−またはＰ１ｐａｌ−ｉ１−１１のいずれかを使用した効力と同等であった。同様に、ＰＡＲ１の小分子アンタゴニストであるＲＷＪ−５６１１０（Ａｎｄｒａｄｅ−Ｇｏｒｄｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９６（１９９９），ｐｐ．１２２５７−１２２６２）は、ＮＩＨ−３Ｔ３馴化培地に対する原発性肺腫瘍細胞の遊走の５５％までを抑制した。ＰＡＲ１アンタゴニストペプデューシンＰ１ｐａｌ−７およびＰ１ｐａｌ−ｉ１−１１は、不十分に遊走する良性肺組織に由来する低発現ＰＡＲ１細胞系に対して効果を有さなかった（図１２Ｇ）。まとめると、これらの結果は、ＰＡＲ１が肺癌細胞における遊走の重要な誘因であり、ペプデューシンアンタゴニストが樹立細胞系および原発性患者肺癌の両方においてＰＡＲ１媒介性遊走の遮断において有効であることを示唆する。

ＰＡＲ１ ｉ３ペプデューシンは、ゼノグラフトモデルにおける肺癌の腫瘍成長を阻害する
ＰＡＲ１発現レベルは、ＮＳＣＬＣ患者の生存率の低減と相関する。肺腫瘍進行におけるＰＡＲ１の相対的重要性を定義するため、インビボマウスモデルを使用した。さらに、ｉ３ペプデューシンによるＰＡＲ１シグナリングの遮断は複数のシグナリング経路、例としてカルシウムシグナリングおよびＥＲＫ１／２経路を遮断する一方、ｉ１ペプデューシンは遊走のみを阻害し、カルシウムを部分的に阻害することが同定されたため、それらのペプデューシンのインビボ効力を比較することを対象とした。ヌードマウスにおけるＡ５４９肺腺癌ゼノグラフトモデルを使用してＰ１ｐａｌ−７、Ｐ１ｐａｌ−１０Ｓ、Ｐ１ｐａｌ−ｉ１−１１、またはＶＥＧＦアンタゴニストＡｖａｓｔｉｎによる単剤療法を評価した。比較のため、本発明者らは、炎症（Ｋａｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ，１１（２００５），ｐｐ．６６１−６６）および卵巣癌におけるＣＸＣＲ１／２誘発性血管新生（Ａｇａｒｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，７０（２０１０），ｐｐ．５８８０−５８９０）を阻害することが既に示されているＣＸＣＲ１／２ペプデューシンＸ１／２ｐａｌ−ｉ１およびＸ１／２ｐａｌ−ｉ３も試験した。

ｉ３由来Ｐ１ｐａｌ−７およびＡｖａｓｔｉｎは、腫瘍進行の同等の有意な低減（Ｐ＜０．０１）を７５％の阻害で与えることが見出された（図１３Ａ〜Ｃ）。ｉ３由来Ｐ１ｐａｌ−１０Ｓを使用する腫瘍成長の有意な低減（Ｐ＜０．０５）も４０％の阻害で存在したが、ｉ１由来Ｐ１ｐａｌ−ｉ１−１１は、Ａ５４９腫瘍の長期成長を阻害しなかった。興味深いことに、ｉ１由来Ｐ１ｐａｌ−ｉ１−１１は、最初の３週間当初有効であり、２０日目（Ｐ＜０．０１）まで腫瘍成長の有意な遮断を達成した。しかしながら、この早期保護段階後、ｉ１由来ペプデューシンについて腫瘍成長の急速なエスケープが存在した。ｉ３由来ペプデューシン処理による腫瘍成長低減に、壊死が伴った。ＣＸＣＲ１／２由来Ｘ１／２ｐａｌ−ｉ３およびＸ１／２ｐａｌ−ｉ１ペプデューシンは、腫瘍成長に対して見かけの効果を有さなかった。これらの結果は、ｉ３由来ＰＡＲ１ペプデューシンによる単剤療法がマウスにおける肺癌腫瘍成長の有意な阻害を提供し得ることを示唆し、ＰＡＲ１を肺癌患者における新規治療標的として同定する。

ＰＡＲ１は、いくつかの細胞タイプにおいてＶＥＧＦ生成を調節することが示されており（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ，８６（２００１），ｐｐ．１０９４−１０９８）、ＶＥＧＦは、原発性肺腫瘍において高度に発現される（Ｇｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ｉ３ベースのＰ１ｐａｌ−７ペプデューシンはＡ５４９ゼノグラフトの肺腫瘍成長の抑制においてＡｖａｓｔｉｎと同様の効力を有したため、ＶＥＧＦ−Ａ生成をＡ５４９腫瘍細胞においてトロンビン処理１８時間後に計測した。ｉ３ベースのＰ１ｐａｌ−７により完全に遮断し、Ｐ１ｐａｌ−１０Ｓにより部分的に遮断ことができるＶＥＧＦ−Ａのトロンビン依存性生成の有意な２倍の平均増加が存在した（図１３Ｄ）。対照的に、ｉ１ベースのＰ１ｐａｌ−ｉ１−１１は、トロンビン依存性ＶＥＧＦ−Ａ生成を阻害しなかった。とりわけ、ＥＲＫ阻害剤ＰＤ９８０５９も、トロンビン媒介性ＶＥＧＦ生成を抑制し得た。卵巣癌とは異なり、Ａ５４９細胞においてＰＡＲ１媒介性ＩＬ−８生成の増加は見出されず、そのことはＡ５４９ゼノグラフトモデルにおいて観察されたＣＸＣＲ１／２ペプデューシンの効力の欠落と一致した。これらのゼノグラフトデータは、Ａ５４９腺癌肺癌モデルにおける有効な治療標的である新規ＰＡＲ１−ＥＲＫ１／２−ＶＥＧＦパラクリン経路の役割についての支持を提供する。

ＰＡＲ１ペプデューシンの薬物動態
Ｐ１ｐａｌ−７、Ｐ１ｐａｌ−１０Ｓ、およびＰ１ｐａｌ−ｉ１−１１の３０分、ならびに１、２、４、６、８、および１６時間における血漿レベルの薬物動態をＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより計測して定常状態ペプデューシン薬物レベルおよびマウスからの消失速度を決定した。野生型ＣＦ−１マウス（２５から３０ｇ）中へのＰ１ｐａｌ−７（３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ）の皮下注射に続いて種々の時点において大静脈から血液を回収した。図１４Ａに示されるとおり、Ｐ１ｐａｌ−７（１０ｍｇ／ｋｇ）のピーク血漿レベルは１．１μｍｏｌ／Ｌに達し、それは４時間持続し、次いで６時間の時点において０．２μｍｏｌ／Ｌに消失した。残留Ｐ１ｐａｌ−７レベルは、１６時間の時点において１０ｎｍｏｌ／Ｌであった。４時間のプラトー後、消失速度は４から１６時間で線形であった。３ｍｇ／ｋｇのＰ１ｐａｌ−７のピーク血漿レベルは、２時間において０．６μｍｏｌ／Ｌに達し、消失は２時間と１６時間との間で線形であった。Ｐ１ｐａｌ−１０Ｓ（１０ｍｇ／ｋｇ）は、１時間においてＰ１ｐａｌ−７（１０ｍｇ／ｋｇ）と同様の１．０μｍｏｌ／Ｌのピーク血漿レベルを与えた。しかしながら、１時間後に急速なクリアランスが存在した。Ｐ１ｐａｌ−１０Ｓとは対照的に、Ｐ１ｐａｌ−ｉ１−１１（１０ｍｇ／ｋｇ）は、０．５と８時間との間で５．０μｍｏｌ／Ｌのピーク血漿レベルで維持される血漿半減期を有した。

最後に、Ｐ１ｐａｌ−７（１０ｍｇ／ｋｇ）のピーク血漿レベルを６日間にわたる１日１回の皮下注射前およびその１時間後に計測してピーク血漿レベルが連日投与に対して一貫しているかどうかを決定した。図１４Ｂに示されるとおり、６日間にわたる連日投与１時間後に約１から２μｍｏｌ／ＬのＰ１ｐａｌ−７の相対的に一貫したピーク血漿濃度が存在した。これらの結果は、連日皮下投与後にＰ１ｐａｌ−７がマウスの血漿中に蓄積しないことも示す。

組織病理学的証拠の出現は、Ｇタンパク質共役型ＰＡＲ１受容体の高発現にＮＳＣＬＣ患者における侵襲表現型および不良アウトカムが伴うことを示唆する（Ｇｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００６）。これらの臨床病理学的知見と一致して、本明細書に提示されるデータは、正常肺上皮と比較してＮＣＩ癌のパネルおよび原発性肺検体において機能性ＰＡＲ１タンパク質、ｍＲＮＡ発現、およびＰＡＲ１依存性運動性の増加を提示した。ＰＡＲ１のサイレンシングまたはＰＡＲ１の薬理学的遮断は、肺癌細胞の運動性の有意な減少を引き起こした。対照的に、ＮＣＩ肺腺癌および原発性肺腺癌は、関連するＰＡＲ２受容体、ＰＡＲ３受容体についてもＰＡＲ４受容体についても増加レベルを有さなかった。

ＰＡＲ１の細胞内ループに指向されるペプデューシン技術を使用することにより、多様なシグナリング経路が肺腺癌細胞系においてｉ１とｉ３ループに応じて詳述された。ペプデューシンは、それらのコグネートＧＰＣＲの細胞内表面に特異的に標的化され、シグナル伝達のモジュレーションをもたらす脂質化ペプチドである。ＰＡＲ１ｉ３ループを標的化するペプデューシンは、細胞運動性、カルシウム動員、およびＥＲＫ１／２活性化を完全に阻害した一方、３Ｄモデリングを介してＧタンパク質相互作用にクリティカルと同定されたループ中のキーアミノ酸残基の破壊はアゴニスト能を低減させた。対照的に、ｉ１標的化ＰＡＲ１ペプデューシンは、細胞運動性を阻害したが、ＥＲＫ１／２活性化に対するいかなる効果も有さず、カルシウム動員を部分的にのみ抑制した。これらのインビトロ阻害データは、肺腫瘍モデルにおいて観察されたｉ３とｉ１ペプデューシンの多様な薬理学的効果と高度に一致した。

ｉ３およびｉ１標的化ＰＡＲ１ペプデューシンを、ヌードマウスにおけるＡ５４９肺腺癌のゼノグラフトにおける効力についてさらに比較した。ｉ３ループペプデューシンは、肺腫瘍成長の有意な遮断における単剤療法として有効であった一方、ｉ１ペプデューシンは有効でなかった。これらのインビトロおよびインビボデータから、ｉ３ループ機能、例としてＥＲＫ１／２活性化および潜在的にはカルシウムシグナリングの遮断が、肺腺癌モデルにおいてｉ１指向ペプデューシンを用いた場合に生じる単独で影響を与える細胞運動性よりも重要であり得ることが結論づけられた。これに関して、ラット星状細胞においてＰＡＲ１がＧ_ｉおよびＧ_ｑタンパク質の両方を介してＥＲＫ１／２にシグナリングすることおよびＧ_ｑ−ＥＲＫ１／２経路がカルシウムによりモジュレートされることが既に示された。ｉ３標的化ペプデューシンは、ｉ１標的化ペプデューシンと比較してＰＡＲ１依存性カルシウム動員およびＥＲＫ１／２リン酸化の両方の遮断において高度に有効であったため、ＰＡＲ１ｉ３ループはｉ１ループよりもＧ_ｑ機能に重要であると考えられる。逆に、ｉ１およびｉ３標的化ペプデューシンの両方は、Ｇ_ｉシグナリングに大きく依存する細胞運動性の抑制において等しく有効であり、ｉ１およびｉ３の両方がＧ_ｉへの共役に重要である証拠を提供した。

Ｇｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００６による６０個のＮＳＣＬＣ患者試料における組織病理学研究は、ヒト肺腫瘍の大多数（７０％）が血管新生因子ＶＥＧＦを発現することも見出し、ＰＡＲ−１とＶＥＧＦ発現との有意な正の相関（Ｐ＜０．０１）を明らかにした。興味深いことに、そこでＶＥＧＦ抗体Ａｖａｓｔｉｎがヌードマウスにおけるヒト肺腫瘍成長の阻害においてＰＡＲ１ｉ３ループペプデューシンと同等の効力を有することが見出された。ＡｖａｓｔｉｎはヒトＶＥＧＦを特異的に遮断するが、マウス由来ＶＥＧＦに対しては有効でないため、Ａｖａｓｔｉｎの観察される効果はマウスゼノグラフトにおけるヒト肺腺癌由来ＶＥＧＦの阻害に起因する可能性が高かった。実際、本発明者らは、ＰＡＲ１が肺癌細胞においてＥＲＫ１／２依存性経路を介してＶＥＧＦ生成を刺激することを示した。さらに、ＶＥＧＦのＰＡＲ１依存性生成は、ｉ３ループペプデューシンにより有効に遮断されたが、ｉ１標的化ペプデューシンによっては遮断されず、ＰＡＲ１−ＥＲＫ１／２シグナリングをヒト肺腺癌におけるＶＥＧＦ生成の潜在的に重要な調節因子と同定した。これらのデータは、マウスにおける侵襲乳腫瘍および卵巣腫瘍のゼノグラフトモデルにおいてＰＡＲ１ｉ３ペプデューシンＰ１ｐａｌ−７の観察される抗血管新生効果とも一致する（Ｂｏｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ａｇａｒｗａｌ ｅｔ ａｌ．，２００８）。

総じて、本明細書に提示されるデータは、ｉ１またはｉ３（好ましくは、ｉ３）のいずれかを標的化する有効なアンタゴニストペプデューシンを含有する医薬組成物を癌、例えば肺癌のための治療として使用することができることを示す。

実施例ＩＩＩ
薬学的用途
ＧＰＣＲの合理的設計アンタゴニストペプデューシンは、治療が必要とされる哺乳動物、例としてヒトに単独でまたは薬学的に許容可能な担体、賦形剤もしくは希釈剤との組合せで医薬組成物中で標準的な薬務に従って投与することができる。化合物は、経口または非経口、例として静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、直腸および局所の投与経路で投与することができる。

化合物または「薬剤」は、１つ以上の他の公知の抗血栓剤または医薬剤、例として、例えばＴＰアンタゴニスト、トロンボキサンアンタゴニスト、ＡＤＰ受容体アンタゴニスト、またはＸａ因子アンタゴニストとの組合せで使用することができる。組合せで使用される場合、組合せ抗血栓剤の１つ以上のより低い投与量を利用して所望の効果を達成することができることが理解される。それというのも、２つ以上の抗血栓剤は追加的または相乗的に作用し得るためである。したがって、１つ以上の組合せ抗血栓剤の治療有効投与量は、抗血栓「剤」を単独で投与する場合の治療有効投与量の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満または２０％未満に対応し得る。２つ以上の抗血栓剤は、同時にまたは異なる時間において、同一の投与経路によりまたは異なる投与経路により投与することができる。例えば、投与スケジュールを調節するため、抗血栓剤を別個に個々の投与量単位で同時または協調された異なる時間において投与することができる。それぞれの物質は、別個の単位剤形中で上記のものと同様の様式で個々に配合することができる。しかしながら、抗血栓剤の固定された組合せは、特に経口投与のための錠剤またはカプセル形態においてより簡便であり、好ましい。したがって、本発明は、２つ以上の抗血栓剤を含む単位用量配合物において、それぞれの血栓「剤」は組合せで投与される場合の治療有効量で存在する配合物も提供する。

活性成分を含有する医薬組成物は、例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性または油性懸濁液、分散性散剤または顆粒剤、乳濁液、硬もしくは軟カプセル剤、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤としての経口使用に好適な形態であり得る。経口使用が意図される組成物は、医薬組成物を製造するための当分野において公知の任意の方法に従って調製することができ、そのような組成物は、薬学的に上品で口当たりの良い製剤を提供するため、甘味剤、香味剤、着色剤および保存剤からなる群から選択される１つ以上の薬剤を含有し得る。錠剤は、錠剤の製造に好適な非毒性の薬学的に許容可能な賦形剤と混合した活性成分を含有する。これらの賦形剤は、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム；造粒剤および崩壊剤、例えば微結晶性セルロース、クロスカルメロースナトリウム、トウモロコシデンプン、またはアルギン酸；結合剤、例えばデンプン、ゼラチン、ポリビニル−ピロリドンまたはアカシアゴム；および滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクであり得る。錠剤は、コーティングされてなくてよく、または公知の技術によりコーティングして薬物の不快な味をマスクし、または消化管中での分解および吸収を遅延させ、それにより長期にわたる作用の持続を提供することができる。例えば、水溶性の矯味材料、例えばヒドロキシプロピルメチル−セルロースもしくはヒドロキシプロピルセルロース、または時間遅延材料、例えばエチルセルロース、酢酸酪酸セルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｒｙｒａｔｅ）を用いることができる。

経口使用のための配合物は、活性成分が不活性固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムもしくはカオリンと混合された、硬ゼラチンカプセル剤として提供することもでき、または活性成分が水溶性担体、例えばポリエチレングリコールまたは油媒体、例えばピーナッツ油、流動パラフィン、もしくはオリーブ油と混合された、軟ゼラチンカプセル剤として提供することもできる。

水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に好適な賦形剤と混合された活性材料を含有する。そのような賦形剤は、懸濁化剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、およびアカシアゴであり；分散または湿潤剤は、天然に生じたホスファチド、例えばレシチン、またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えばヘプタデカエチレン−オキシセタノール、またはエチレンオキシドと脂肪酸に由来する部分エステルおよびヘキシトールとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、またはエチレンオキシドと脂肪酸に由来する部分エステルおよびヘキシトール無水物との縮合生成物、例えばポリエチレンソルビタンモノオレエートであり得る。水性懸濁液は、１つ以上の保存剤、例えば、エチル、またはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート、１つ以上の着色剤、１つ以上の香味剤、および１つ以上の甘味剤、例えばスクロース、サッカリン、またはアスパルテームも含有し得る。

油性懸濁液は、植物油、例えばラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油またはヤシ油中にまたは鉱油、例えば流動パラフィン中に活性成分を懸濁させることにより配合することができる。油性懸濁液は、増粘剤、例えば蜜蝋、固形パラフィン、またはセチルアルコールを含有し得る。甘味剤、例えば上記のもの、および香味剤を添加して口当たりの良い経口製剤を提供することができる。これらの組成物は、酸化防止剤、例えばブチル化ヒドロキシアニソールまたはアルファ−トコフェロールの添加により保存することができる。

水の添加による水性懸濁液の調製に好適な分散性散剤および顆粒剤は、分散または湿潤剤、懸濁化「剤」および１つ以上の保存剤と混合された活性成分を提供する。好適な分散または湿潤剤および懸濁化剤は既に上記されたものにより例示される。さらなる賦形剤、例えば甘味剤、香味剤、および着色剤も存在し得る。これらの組成物は、酸化防止剤、例えばアスコルビン酸の添加により保存することができる。

本発明の医薬組成物は、水中油型乳濁液の形態でもあり得る。油相は、植物油、例えばオリーブオイルもしくはラッカセイ油、または鉱油、例えば流動パラフィンまたはそれらの混合物であり得る。好適な乳化剤は、天然に生じたホスファチド、例えばダイズレシチン、ならびに脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来するエステルまたは部分エステル、例えばソルビタンモノオレエート、ならびに前記部分エステルとエチレンオキシドの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであり得る。乳濁液は、甘味剤、香味剤、保存剤、および酸化防止剤も含有し得る。

シロップ剤およびエリキシル剤は、甘味剤、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールまたはスクロースと配合することができる。そのような配合物は、粘滑剤、保存剤、香味剤および着色剤ならびに酸化防止剤も含有し得る。

医薬組成物は、無菌の注射可能な水溶液剤の形態であり得る。用いることができる許容可能なビヒクルおよび溶媒には、水、リンガー液および等張塩化ナトリウム溶液が含まれる。

無菌注射製剤は、活性成分が油相中で溶解された無菌の注射可能な水中油型マイクロ乳濁液でもあり得る。例えば、活性成分は最初にダイズ油およびレシチンの混合物中で溶解させることができる。次いで、油性溶液を水およびグリセロールの混合物に中に導入し、処理することによりマイクロ乳濁液を形成する。

注射可能な溶液またはマイクロ乳濁液は、局所ボーラス注射により患者の血流中に導入することができる。あるいは、本発明化合物の一定の循環濃度を維持するように溶液またはマイクロ乳濁液を投与することが有利であり得る。そのような一定濃度を維持するため、連続静脈内送達デバイスを利用することができる。そのようなデバイスの例には、Ｄｅｌｔｅｃ ＣＡＤＤ−ＰＬＵＳ（商標）モデル５４００静脈内ポンプが含まれる。

医薬組成物は、筋肉内投与および皮下投与のための無菌の注射可能な水性または油性懸濁液の形態であり得る。この懸濁液は、上記の好適な分散または湿潤剤および懸濁化剤を使用して公知の技術に従って配合することができる。無菌注射製剤は、例えば１，３−ブタンジオール中溶液のように、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の無菌注射液または懸濁液でもあり得る。さらに、無菌の不揮発性油が溶媒または懸濁化媒体として慣用的に用いられている。この目的のため、任意の無味の不揮発性油、例として合成モノまたはジグリセリドを用いることができる。さらに、脂肪酸、例えばオレイン酸が注射剤の調製において使用される。

本発明のための化合物は、好適な鼻腔内用ビヒクルおよび送達デバイスの局所使用を介して鼻腔内用形態で投与することができ、または当業者に周知の経皮皮膚パッチの形態を使用して経皮経路で投与することができる。経皮送達系の形態で投与するため、投与量の投与は当然ながら、投与量レジメンにわたり間欠的ではなく連続的である。本発明の化合物は基剤、例えばカカオバター、グリセリンゼラチン、水素化植物油、種々の分子量のポリエチレングリコールの混合物およびポリエチレングリコールの脂肪酸エステルを用いる坐剤として送達することもできる。本発明の化合物は、リポソーム送達系、例えば小さな一枚膜ベシクル、大きな一枚膜ベシクルおよび多重膜ベシクルの形態で投与することもできる。リポソームは、種々のリン脂質、例えばコレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンから形成することができる。本発明の化合物は、化合物分子がカップリングしている個々の担体としてモノクローナル抗体の使用により送達することもできる。本発明の化合物は、標的化可能な薬物担体としての可溶性ポリマーともカップリングすることもできる。そのようなポリマーには、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシ−エチルアスパルトアミド−フェノール、またはパルミトイル残基により置換されているポリエチレンオキシド−ポリリジンが含まれ得る。さらに、本発明の化合物は、薬物の放出制御の達成に有用なクラスの生分解性ポリマー、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸（ｐｏｌｙａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）とポリグリコール酸のコポリマー、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、およびハイドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマーに結合させることができる。

本発明による組成物をヒト対象に投与する場合、処方する医師は通常、個々の患者の年齢、体重、および応答、ならびに患者の症状の重症度に従って一般に投与量を変えて、１日投与量を決定する。一実施形態において、血栓症についての治療を受けている哺乳動物に、「薬剤」の好適量が投与される。投与は、１日当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ体重から約６０ｍｇ／ｋｇ体重または１日当たり０．５ｍｇ／ｋｇ体重から約４０ｍｇ／ｋｇ体重の「薬剤」の量で行われる。本発明の組成物を含む別の治療投与量は、約０．０１ｍｇから約１０００ｍｇの薬剤を含む。別の実施形態において、投与量は、約１ｍｇから約５０００ｍｇの薬剤を含む。

実施例ＩＶ
組合せ療法
本明細書に記載のアンタゴニストの１つの使用目的は、ＧＰＣＲシグナリング経路が関与する本明細書に記載の疾患または病態、例えば肺癌のリスクがある患者の予防的治療である。危険因子喫煙習慣を示す患者に、医師により処方された連日レジメンに従って治療有効用量の薬剤を与えることができる。処置がいかなる不所望な副作用も招かないことを確保するために患者は密なモニタリングを要求する。適切な投与量は、任意の危険因子の重症度および患者の年齢、性別、ならびに患者が血栓性疾患状態の家族歴または血栓性疾患状態に対する他の遺伝的素因を有するかどうかに依存する。一実施形態において、本明細書に記載の薬剤は、血栓症のリスクが増加した患者に、例えば術後にまたは医療デバイス、例えばステントもしくは人工臓器、例えば人工心臓の移植の後に、予防的に投与することができる。

本出願はさらに、本明細書に記載の「薬剤」と、血栓疾患状態の１つ以上の危険因子を治療することが公知の１つ以上の薬物との組合せ療法も企図する。

一実施形態において、薬物は、基礎となるシグナリング経路、病態または疾患およびそれらの組合せの他の公知の阻害剤であり得る。

一例において、本明細書に記載の「薬剤」との組合せ療法は、他の公知の抗炎症剤および抗癌剤を含み得る。

実施例Ｖ
他の治療用途
本明細書に記載のＰＡＲ−１に対するアンタゴニストは、ＰＡＲ−１活性化に伴う他の医学的病態の診断および治療に使用することもできる。例えば、本明細書に記載の組成物から恩恵を受け得る医学的病態には、限定されるものではないが、以下が含まれる：慢性炎症性腸疾患、例として炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）および潰瘍性大腸炎ならびに線維症、例として肝線維症および肺線維症（例えば、Ｖｅｒｇｎｏｌｌｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ（２００４）．１１４（１０）：１４４４；Ｙｏｓｈｉｄａ，ｅｔ ａｌ，Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ（２００６）．２４（Ｓｕｐｐｌ ４）：２４９；Ｍｅｒｃｅｒ，ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（２００７）．１０９６：８６−８８；Ｓｏｋｏｌｏｖａ ａｎｄ Ｒｅｉｓｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ（２００７）．ＰＭＩＤ：１７５３２４７２参照）、虚血再灌流損傷、例として心筋、腎臓、脳および腸の虚血再灌流損傷（例えば、Ｓｔｒａｎｄｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓ．Ｃａｒｄｉｒｏｌ（２００７）．１０２（４）：３５０−８；Ｓｅｖａｓｔｏｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２００７）．１０９（２）：５７７−５８３；Ｊｕｎｇｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．（２００３）．１００（２２）：１３０１９−２４；およびＴｓｕｂｏｉ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ（２００７）．２９２（２）：Ｇ６７８−８３参照。ＰＡＲ１細胞内シグナリングの阻害は、細胞の単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１およびＨＳＶ２）感染（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ（２００７）．５（５）：１０５５−６１参照）を阻害するためならびに神経変性疾患、例としてアルツハイマー病（ＡＤ）およびパーキンソン病（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１１６，Ｉｓｓｕｅ ５，６７１−６８２，（２００４）；Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．２００６．Ｊａｎ；６５（１）：６６−７７；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（２００９）．Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８，２０５−２１６参照）、敗血症（Ｋａｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８，１３０３−１３１２（２００７））または子宮内膜症（Ｈｉｒｏｔａ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２００５，９０（６）：３６７３−３６７９）、癌および脈管形成（Ｔｓｏｐａｎｏｇｌｏｕ ＮＥ ａｎｄ Ｍａｒａｇｏｕｄａｋｉｓ ＭＥ．Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ．２００７，Ｏｃｔ，３３（７）：６８０−７に概説）の発病において使用することもできる。

種々の組織、細胞、および種におけるＰＡＲ活性化の生物学および病理生理学は、Ｓｔｅｉｎｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００５，２６（１）：１−４３に最近概説された。

本明細書において特定される任意の特許、特許出願、刊行物、または他の開示内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。参照により本明細書に組み込まれると述べたが、既存の定義、記述、または他の開示内容と矛盾する任意の内容またはその一部は、組み込まれた内容と本開示の内容との間で矛盾が生じない程度に組み込まれる。

Claims (34)

1. （ａ）順序通りの３つ以上の連続アミノ酸残基を野生型ＰＡＲ２と共有するプロテアーゼ活性化受容体−２（ＰＡＲ２）の突然変異全長または断片を含む第１のドメインであって、前記ＰＡＲ２の突然変異全長または断片中の少なくとも１つの突然変異は、２７４または２８４位におけるものであるドメイン、および
   （ｂ）前記第１のドメインに付着している第２のドメインであって、天然または非天然に生じた疎水性部分を含むドメイン
   を含むことを特徴とするキメラポリペプチド。
2. 請求項１に記載のキメラポリペプチドにおいて、前記突然変異断片のＰＡＲ２は、順序通りの３つ以上の連続アミノ酸残基を野生型ＰＡＲ２の第３の細胞内ループ（ｉ３ループ）と共有することを特徴とするキメラポリペプチド。
3. 請求項１に記載のキメラポリペプチドにおいて、前記突然変異断片のＰＡＲ２は、順序通りの３つ以上の連続アミノ酸残基を野生型ＰＡＲ２の第６の膜貫通へリックス（ＴＭ６）と共有することを特徴とするキメラポリペプチド。
4. 請求項１に記載のキメラポリペプチドにおいて、前記突然変異断片のＰＡＲ２は、順序通りの２つ以上の連続アミノ酸残基を野生型ＰＡＲ２の第５の膜貫通へリックス（ＴＭ５）と共有することを特徴とするキメラポリペプチド。
5. 請求項１に記載のキメラポリペプチドにおいて、前記ＰＡＲ２の突然変異全長または断片は、２８７位における突然変異をさらに含むことを特徴とするキメラポリペプチド。
6. 請求項１に記載のキメラポリペプチドにおいて、前記突然変異は、置換、付加または欠失の１つであることを特徴とするキメラポリペプチド。
7. 請求項６に記載のキメラポリペプチドにおいて、前記付加または欠失は、野生型配列中の突然変異点における５つまでの連続残基の付加または欠失を含むことを特徴とするキメラポリペプチド。
8. 請求項６に記載のキメラポリペプチドにおいて、前記突然変異は、２７４位におけるメチオニン（Ｍ）の別の残基による置換、２８４位におけるアルギニン（Ｒ）の別の残基による置換、および２８７位におけるリジン（Ｋ）の別の残基による置換からなる群から選択されることを特徴とするキメラポリペプチド。
9. 請求項１に記載のキメラポリペプチドにおいて、前記第１のドメインは、配列番号２０、２１、２４および２６からなる群から選択される配列を含むことを特徴とするキメラポリペプチド。
10. 請求項１に記載のキメラポリペプチドにおいて、前記ＰＡＲ２は、ヒトＰＡＲ２であることを特徴とするキメラポリペプチド。
11. 請求項１に記載のキメラポリペプチドにおいて、前記疎水性部分は、脂質、アシル化合物およびアミノ酸からなる群から選択されることを特徴とするキメラポリペプチド。
12. （ａ）順序通りの３つ以上の連続アミノ酸残基を野生型ＰＡＲ２と共有するプロテアーゼ活性化受容体−２（ＰＡＲ２）の突然変異全長または断片を含む第１のドメインであって、前記ＰＡＲ２の突然変異全長または断片中の少なくとも２つの突然変異は、２８７位ならびに第５の膜貫通へリックス（ＴＭ５）、第３の細胞内ループ（ｉ３ループ）および第６の膜貫通へリックス（ＴＭ６）をスパニングする領域中の第２の位置におけるものであるドメイン、および
    （ｂ）前記第１のドメインに付着している第２のドメインであって、天然または非天然に生じた疎水性部分を含むドメイン
    を含むことを特徴とするキメラポリペプチド。
13. 請求項１２のキメラポリペプチドにおいて、前記第２の位置は、２７４であることを特徴とするキメラポリペプチド。
14. 請求項１２に記載のキメラポリペプチドにおいて、前記第２の位置は、２８４であることを特徴とするキメラポリペプチド。
15. （ａ）順序通りの３つ以上の連続アミノ酸残基を野生型ＰＡＲ１と共有するプロテアーゼ活性化受容体−１（ＰＡＲ１）の突然変異全長または断片を含む第１のドメインであって、前記ＰＡＲ１の突然変異全長または断片中の少なくとも１つの突然変異は、３１０位におけるものであるドメイン、および
    （ｂ）前記第１のドメインに付着している第２のドメインであって、天然または非天然に生じた疎水性部分を含むドメイン
    を含むことを特徴とするキメラポリペプチド。
16. （ａ）第１のドメインであって、
    （ｉ）順序通りの３つ以上の連続アミノ酸残基を野生型ＰＡＲと共有するプロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）の突然変異全長または断片であって、前記ＰＡＲの突然変異全長または断片中の少なくとも１つの突然変異は、第６の膜貫通へリックス（ＴＭ６）中のＢａｌｌｅｓｔｅｒｏｓランドマーク残基６．５０のＮ末端側１８残基位置におけるものである突然変異全長または断片；
    （ｉｉ）（ｉ）によるＰＡＲの突然変異全長または断片のバリアントであって、野生型配列のアミノ酸の４０％までが、天然もしくは非天然に生じたアミノ酸により、またはペプチド模倣部分により置き換えられており；および／またはアミノ酸の４０％までが、化学修飾されたそれらの側鎖を有し；および／またはアミノ酸の２０％までが、欠失されており、但し、第３の細胞内ループ（ｉ３ループ）中のアミノ酸の少なくとも５０％が、バリアント中で不変のままであるバリアント；
    （ｉｉｉ）アミノ酸の少なくとも１つが、対応するＤ−アミノ酸により置き換えられている（ｉ）または（ｉｉ）によるペプチド配列；
    （ｉｖ）ペプチド骨格の少なくとも１つが、非天然に生じたペプチド骨格に変化している（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれか１つによるペプチド配列；
    （ｖ）逆の順序の（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１つの配列であるペプチド配列；および
    （ｖｉ）（ｉ）から（ｖ）のペプチド配列の２つ以上の組合せ
    からなる群から選択されるドメイン、ならびに
    （ｂ）前記第１のドメインに付着している第２のドメインであって、天然または非天然に生じた疎水性部分を含むドメイン
    を含むことを特徴とするキメラポリペプチド。
17. 請求項１６に記載のキメラポリペプチドにおいて、前記ＰＡＲは、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３およびＰＡＲ４からなる群から選択されることを特徴とするキメラポリペプチド。
18. 請求項１６に記載のキメラポリペプチドにおいて、前記ＰＡＲは、ＰＡＲ１またはＰＡＲ２であることを特徴とするキメラポリペプチド。
19. （ａ）第１のドメインであって、
    （ｉ）順序通りの３つ以上の連続アミノ酸残基を野生型ＰＡＲと共有するプロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）の突然変異全長または断片であって、前記ＰＡＲの突然変異全長または断片中の少なくとも１つの突然変異は、前記ＰＡＲの第３の細胞内ループ（ｉ３ループ）がウシロドプシンのｉ３ループによりアラインされる場合、ウシロドプシンの２４８に対応する位置におけるものである突然変異全長または断片；
    （ｉｉ）（ｉ）によるＰＡＲの突然変異全長または断片のバリアントであって、野生型配列のアミノ酸の４０％までが、天然もしくは非天然に生じたアミノ酸により、またはペプチド模倣部分により置き換えられており；および／またはアミノ酸の４０％までが、化学修飾されたそれらの側鎖を有し；および／またはアミノ酸の２０％までが、欠失されており、但し、第３の細胞内ループ（ｉ３ループ）中のアミノ酸の少なくとも５０％が、バリアント中で不変のままであるバリアント；
    （ｉｉｉ）アミノ酸の少なくとも１つが、対応するＤ−アミノ酸により置き換えられている（ｉ）または（ｉｉ）によるペプチド配列；
    （ｉｖ）ペプチド骨格の少なくとも１つが、非天然に生じたペプチド骨格に変化している（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれか１つによるペプチド配列；
    （ｖ）逆の順序の（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１つの配列であるペプチド配列；および
    （ｖｉ）（ｉ）から（ｖ）のペプチド配列の２つ以上の組合せ
    からなる群から選択されるドメイン、ならびに
    （ｂ）前記第１のドメインに付着している第２のドメインであって、天然または非天然に生じた疎水性部分を含むドメイン
    を含むことを特徴とするキメラポリペプチド。
20. 請求項１９に記載のキメラポリペプチドにおいて、前記ＰＡＲは、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３およびＰＡＲ４からなる群から選択されることを特徴とするキメラポリペプチド。
21. 請求項１９に記載のキメラポリペプチドにおいて、前記ＰＡＲは、ＰＡＲ１またはＰＡＲ２であることを特徴とするキメラポリペプチド。
22. Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に対して実質的なアンタゴニスト効果を有し、実質的なアゴニスト効果を有さないポリペプチドにおいて、（ａ）第１の細胞内ループ（ｉ１ループ）、（ｂ）第５の膜貫通へリックス（ＴＭ５）、（ｃ）第３の細胞内ループ（ｉ３ループ）、（ｄ）第６の膜貫通へリックス（ＴＭ６）、（ｅ）ｉ１ループ、ＴＭ５、ｉ３ループおよび／またはＴＭ６中に見出される順序通りの少なくとも３つの連続アミノ酸残基の断片、ならびに（ｆ）（ａ）から（ｅ）の任意の組合せからなる群から選択される、ＧＰＣＲ領域中の１つ以上の突然変異を含む突然変異全長ＧＰＣＲまたはその断片を含むことを特徴とするポリペプチド。
23. 請求項２２に記載のポリペプチドにおいて、前記ＧＰＣＲは、ロドプシン様Ａ型ＧＰＣＲであることを特徴とするポリペプチド。
24. 請求項２２に記載のポリペプチドにおいて、前記ＧＰＣＲは、プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）であることを特徴とするポリペプチド。
25. 請求項２４に記載のポリペプチドにおいて、前記プロテアーゼ活性化受容体はＰＡＲ１またはＰＡＲ２であることを特徴とするポリペプチド。
26. 請求項２２に記載のポリペプチドにおいて、前記突然変異の少なくとも１つは、第６の膜貫通へリックス（ＴＭ６）中のＢａｌｌｅｓｔｅｒｏｓランドマーク残基６．５０のＮ末端側１８残基であることを特徴とするポリペプチド。
27. 請求項２２に記載のポリペプチドにおいて、少なくとも１３個のアミノ酸を含むことを特徴とするポリペプチド。
28. 請求項２２に記載のポリペプチドにおいて、インタクト細胞膜を越える流入を可能とする疎水性部分をさらに含むことを特徴とするポリペプチド。
29. 請求項１、１２または１５のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド；および
    薬学的に許容可能な賦形剤、担体、または希釈剤
    を含むことを特徴とする医薬組成物。
30. 請求項２９に記載の医薬組成物において、経口、鼻腔、局所、直腸、膣もしくは非経口投与、または静脈内、皮下もしくは筋肉内注射に好適であることを特徴とする医薬組成物。
31. 肺癌の治療が必要とされる哺乳動物における肺癌を治療する方法において、前記哺乳動物に請求項１５に記載のキメラポリペプチドの治療有効量を投与するステップを含むことを特徴とする方法。
32. 炎症に関連する哺乳動物における疾病状態を治療する方法において、前記哺乳動物に、
    （ａ）順序通りの３つ以上の連続アミノ酸残基を野生型ＰＡＲ２と共有するプロテアーゼ活性化受容体−２（ＰＡＲ２）の突然変異全長または断片を含む第１のドメインであって、前記ＰＡＲ２の突然変異全長または断片中の少なくとも１つの突然変異は、２７４、２８４および２８７からなる群から選択される位置におけるものであるドメイン、および
    （ｂ）前記第１のドメインに付着している第２のドメインであって、天然または非天然に生じた疎水性部分を含むドメイン
    を含むキメラポリペプチドの治療有効量を投与するステップを含むことを特徴とする方法。
33. 請求項３２に記載の方法において、前記疾病状態は、膵炎、喘息、関節リウマチ、骨関節炎、癌、慢性疼痛、内臓疼痛、癌疼痛、多発性硬化症、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、肥満細胞疾患、肥満細胞症、痛風、敗血症、動脈再狭窄、アテローム性動脈硬化症、気道および胃腸管の炎症疾患、痒み、魚鱗癬、掻痒、炎症性皮膚疾患、乾癬、およびアルツハイマー病からなる群から選択されることを特徴とする方法。
34. 請求項３３に記載の方法において、前記癌は、結腸、皮膚、メラニン細胞、乳房、前立腺、中枢神経系、脳、免疫系、膵臓、頭頸部、食道、腎臓、生殖器系、卵巣、子宮内膜、および頸部の癌からなる群から選択されることを特徴とする方法。

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