JP2014508734A - フルオロカーボン連結ペプチド製剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、薬学的に許容されるフルオロカーボン連結ペプチド製剤の調製における使用に適した水性酸性製剤を提供し、この水性製剤は、第１のフルオロカーボン連結ペプチドを含み、フルオロカーボンに連結されたペプチドは、少なくとも２０アミノ酸残基の長さであり、少なくとも５０％の疎水性アミノ酸残基を含み、７以上の等電点を有し；フルオロカーボン連結ペプチドはミセル中に存在する。

Description

本発明は、フルオロカーボン連結ペプチドを含む薬学的に許容される製剤、このような薬学的に許容される製剤の調製に有用な製剤、このような製剤を調製する方法ならびにワクチンおよび免疫治療薬としてのこのような製剤の使用に関する。

合成ペプチド抗原は、感染病（例えば、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染および真菌感染）を予防するためのワクチンにおける使用において関心が高い。また、合成ペプチド抗原は、免疫治療薬の分野、例えば、感染の処置、癌細胞に対する免疫刺激、ポリペプチドホルモンの下方制御ならびにアナフィラキシーおよびアレルギーなどの不適切な免疫反応の制御において関心が高い。

ペプチドに基づくワクチンおよび免疫治療薬の実用的使用における１つの困難性は、抗原提示細胞へのペプチド抗原の効率的送達によって免疫反応の誘導を確実にすることである。このような標的がない場合、実施不可能な量のペプチドを必要とする場合があり、これは、製造に不経済的であるだけでなく、毒性問題を引き起こすこともあり得る。

ペプチド送達の増強は、持続放出を可能にする微粒子系構造などの特殊化された送達ビヒクルを介して達成され得る。さらに、ペプチド誘導体または送達増強剤に共有結合された対象のペプチドを含む修飾ペプチドは開発中であり、特異的標的細胞および受容体への生物学的利用能およびペプチドの提示を改善する。

抗原提示細胞への送達を改善するために修飾された１つの特定系統のペプチドは、ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端のいずれかまたはその間の任意の位置でフルオロカーボン鎖の共有結合を介して構築され、フルオロカーボン連結ペプチド（ＦＣＰ）を作製する。フルオロカーボン連結ペプチドの例は国際公開第ＷＯ２００５／０９９７５２号および国際公開第ＷＯ２００９／０２７６８８号に与えられ、ペプチドに対する免疫反応の増大におけるフルオロカーボン結合によって提供される利点はそこに示されている。

複数のペプチドがより広い予防効果または免疫治療効果を与えるために必要とされ得ることはワクチン設計者に理解される。このような多成分製品は、適切な免疫反応の発揮により有効である可能性が高いために望まれる。

この類の医薬品を製造するために、フルオロカーボン連結ペプチドが、合成され、精製され、適切な比率で一緒に混和され、滅菌状態にされ、投与に適した均質なフォーマットで示される必要がある。

本発明者らは、フルオロカーボン連結ペプチドが、多くの場合、水性媒体、例えば水またはリン酸緩衝生理食塩水において、連結されていないペプチドが水性媒体に溶解性であるときでさえ、難溶性であることを見出した。さらに、本発明者らは、フルオロカーボン連結ペプチドの長さおよびペプチド成分の疎水性が、フルオロカーボン連結ペプチドの溶解性に影響を及ぼすことを見出した。特に、より良好な免疫原性を示すより長い、より疎水性のペプチドに連結したフルオロカーボンベクターが特に不溶性であることが見出された。

フルオロカーボン連結ペプチドは、両親媒性であり、極性（プロトン性および非プロトン性）溶媒と非極性溶媒の両方において、多分子ミセル型構造を特徴的に形成する。このような構造は、典型的には、天然の非連結ペプチドによって形成されない。しかしながら、本発明者らは、多数のフルオロカーボン連結ペプチド、特に免疫原性を有するペプチドが、水性溶媒および他の溶媒において視認できる大きな凝集体を形成する傾向があることを見出した。このような凝集体の形成は、均質であり、特徴付けることができる製剤の製造を必要とする製薬製造プロセスにおいて受け入れることはできない。

この課題を特定したところ、本発明者らは、それに対処し、フルオロカーボン連結ペプチドの溶解性を支持する超分子構造が維持されるフルオロカーボン連結ペプチド製剤を製造するための方法を考案した。本発明者らによって開発された製剤プロセスは、製剤化に問題があることを見出した免疫原性のフルオロカーボン連結ペプチドを含む安定な製品を製造することを可能にし、その製品は、薬学的に許容される溶液を得るために水性媒体を用いて再溶解することが容易である。

特に、本発明者らは、酸性溶液の使用がミセル形成を促進させ、不溶性凝集体の形成を妨げることを見出した。可溶化されたフルオロカーボン連結ペプチドは、溶液からフルオロカーボン連結ペプチドを喪失させることなしに、濾過によって滅菌することができる。凍結乾燥後、典型的には、抗凍結剤の存在下で、フルオロカーボン連結ペプチドは、安定形態で保存され、水性媒体に溶解し、投与のための薬学的に許容される溶液を得ることができる。

本発明者らは、酢酸が、異なるペプチドの電荷および疎水性の高い変動率にもかかわらず、広範囲のフルオロカーボン連結ペプチドに対して特に適した溶媒であることを見出した。したがって、酢酸はまた、フルオロカーボン連結ペプチドの混合物の可溶化に特に適している。

したがって、本発明は、薬学的に許容されるフルオロカーボン連結ペプチド製剤の調製における使用に適した水性酸性製剤であって、第１のフルオロカーボン連結ペプチドを含み、
（ｉ）フルオロカーボンに連結されたペプチドが、少なくとも２０アミノ酸残基の長さであり、少なくとも５０％の疎水性アミノ酸残基を含み、７以上の等電点を有し；
（ｉｉ）フルオロカーボン連結ペプチドが、０．２２μｍ未満の直径を有するミセル中に存在する、製剤を提供する。

好ましくは、製剤は酢酸を含む。水性製剤は、例えば、５以下のｐＨを有してもよい。

製剤は、０．２２μｍ未満の直径を有するミセル中に存在する１つまたは複数のさらなるフルオロカーボン連結ペプチドを含んでもよい。好ましくは、製剤に存在するフルオロカーボン連結ペプチドミセルの少なくとも８０％が、１００ｎｍ未満の直径を有する。

一実施形態において、本発明に係る製剤は、フルオロカーボンに連結されたペプチドが、（ｉ）７未満の等電点を有し；（ｉｉ）フルオロカーボンから遠位の最後の１５個の連続アミノ酸において正に荷電したアミノ酸を含まず；かつ／または（ｉｉｉ）８０％を超える疎水性アミノ酸残基を含む２０アミノ酸残基の連続配列を含む、フルオロカーボン連結ペプチドを含まない。

フルオロカーボンに連結されたペプチドは、典型的には、病原体、自己タンパク質または腫瘍細胞由来の免疫原性ペプチドである。本発明に係る製剤は、薬学的に許容される担体または賦形剤および／またはアジュバントをさらに含んでもよい。

本発明はまた以下を提供する：
− 薬学的に許容されるフルオロカーボン連結ペプチド製剤を得るための方法であって、
（ｉ）フルオロカーボン連結ペプチドを酢酸中に可溶化するステップ；
（ｉｉ）可溶化されたフルオロカーボン連結ペプチドを濾過滅菌するステップ；および
（ｉｉｉ）濾過滅菌されたフルオロカーボン連結ペプチドを乾燥させるステップ
を含む方法。
− 本発明に係る方法によって得ることができるフルオロカーボン連結ペプチド製剤；
− フルオロカーボンに連結されたペプチドが配列番号１〜６に記載される配列を含む６つのフルオロカーボン連結ペプチドを含み、他のフルオロカーボン連結ペプチドを含まない、薬学的に許容される製剤；
− 治療によってヒトまたは動物体を処置する方法において使用するための、本発明に係る薬学的に許容される製剤；
− 病原体感染、自己免疫疾患または癌を処置または予防する方法において使用するための、本発明に係る薬学的に許容される製剤；
− 病原体感染、自己免疫疾患または癌を処置または予防するための医薬の製造における、本発明に係る薬学的に許容される製剤の使用；および
− 病原体感染、自己免疫疾患または癌を処置または予防する方法であって、有効量の本発明に係る薬学的に許容される製剤をそれを必要とする個体に投与するステップを含む方法。

典型的なフルオロカーボン連結ペプチドの製造プロセスフローの例を示す。 代替のフルオロカーボン連結ペプチドの製造プロセスフローを示す。 様々な溶媒に可溶化された個々のＦＣＰの目視検査の結果を示す表である。ボルテックス後、各溶液を透明性について目視的に検査し、透明な溶液を指示する「＋＋＋」のスコアから非常に混濁した溶液を指示する「−」のスコアまである。発泡の程度および粒子の存在もまた記録され、「＋＋＋」は高いレベルを示し、「−」はそれぞれが存在しないことを示す。「^＊」は、溶媒が粘性になることを示す。 マンニトール溶液を用いて希釈後、様々な溶媒において可溶化された個々のＦＣＰの目視検査の結果を示す表である。各溶液は透明性について視覚的に試験され、透明な溶液を指示する「＋＋＋」のスコアから非常に混濁した溶液を指示する「−」のスコアまである。発泡の程度および粒子の存在もまた記録され、「＋＋＋」は高いレベルを示し、「−」はそれぞれが存在しないことを示す。 動的光散乱（ＤＬＳ）によって評価された、混和および希釈後の溶液中のフルオロカーボン連結ペプチドの粒径を示す。 透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって評価された、混和および希釈後の溶液中のフルオロカーボン連結ペプチドの大きさおよび形状を示す。 ＤＬＳによって評価された、滅菌等級濾過前（Ａ）およびその後（Ｂ）におけるフルオロカーボン連結ペプチド粒子の体積によるサイズ分布を示す。 ＤＬＳによって評価された、Ｔｒｉｓ １０ｍＭ ｐＨ７．８５（Ａ）および水（Ｂ）において再溶解されたフルオロカーボン連結ペプチド粒子の体積によるサイズ分布を示す。 ５０％（ｖ／ｖ）酢酸に２４時間暴露された７つのフルオロカーボン連結ペプチドの混合物のＲＰ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す。 手動で振とうした後、フルオロカーボン連結ペプチドの製剤化および非製剤化の混合物の写真を示す。バイアルＡ：製剤化＋マンニトール／水；バイアルＢ：製剤化＋マンニトール／ヒスチジン；バイアルＣ：非製剤化＋マンニトール／水；バイアルＤ：非製剤化＋マンニトール／ヒスチジン。 ボルテックスおよび超音波処理後、フルオロカーボン連結ペプチドの製剤化および非製剤化の混合物の写真を示す。バイアルＡ：製剤化＋マンニトール／水；バイアルＢ：製剤化＋マンニトール／ヒスチジン；バイアルＣ：非製剤化＋マンニトール／水；バイアルＤ：非製剤化＋マンニトール／ヒスチジン。 ６つのフルオロカーボン連結インフルエンザペプチド（ＦＰ−０１．１）を含む製剤の透過型電子顕微鏡写真を示す。 ｔ_０時（上段パネル）および２４時間後（下段パネル）における濾過後のＦＰ０１．１のＨＰＬＣプロフィールを示す。 水における再溶解後のＦＰ０１．１のＨＰＬＣプロフィールを示す。 水における再溶解された製剤化されたフルオロカーボンペプチド（ＦＰ０１．１）および非製剤化ペプチドの比較を示す。左写真は、２０分の直立後に撮影され、右写真は３分の超音波処理後に撮影された。 ２８ｍＭのＬ−ヒスチジンにおける再溶解された製剤化されたフルオロカーボンペプチド（ＦＰ０１．１）および非製剤化ペプチドの比較を示す。左写真は、２０分の直立後に撮影され、右写真は３分の超音波処理後に撮影された。 ラットにおける体積調整された用量反応を示す。ＦＰ−０１．１は、用量依存的に試験された全ての用量レベルで、陽性ＩＦＮ−γＴ細胞応答を誘導した。 エクスビボＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて観察されたワクチン誘導性Ｔ細胞応答を示す。ＰＢＭＣは、６つの個々のペプチド（ワクチンに含有されるペプチドに対応する）を用いて１８時間刺激された。陽性アッセイ反応は、負の対照ウェルにおけるスポット数の平均＋その平均の２つの標準偏差として定義された。「長鎖ペプチドの総数」を得るために６つのペプチドの各々についてのスポット数を累積し、１００万個の投入ＰＢＭＣあたりのスポット数として表された。

配列表の簡単な説明
配列表は、以下の表に示される実施例に用いられるペプチドに対応する。

発明の詳細な説明
本発明は、ヒトまたは動物に投与するためのフルオロカーボン連結ペプチドを製剤化する方法、および本発明の方法によって得ることができる薬学的に許容されるフルオロカーボン連結ペプチド製剤を提供する。本発明の方法は、酸性溶液、好ましくは酢酸中にフルオロカーボン連結ペプチドを可溶化させるステップを含む。また、本発明は、酸性であり、そのためにヒトまたは動物への投与に適していないが、薬学的に許容される製剤を得るために重要である水性製剤を提供する。

典型的には、製剤化プロセスに使用される、または本発明の水性酸性製剤もしくは薬学的に許容される製剤に存在する少なくとも１つのフルオロカーボン連結ペプチドは、少なくとも２０アミノ酸残基を含み、これは、少なくとも５０％の疎水性アミノ酸残基を有し、７以上の等電点を有する。

本発明の製剤は、少なくとも１つのフルオロカーボン連結ペプチドを含んでもよく、または本発明の製剤化法は、少なくとも１つのフルオロカーボン連結ペプチドを用いてもよく、ここで、該ペプチドは、アミノ酸の少なくとも約５０％が疎水性である少なくとも約２０アミノ酸を含む。製剤に存在する他のフルオロカーボン連結ペプチドは、２０アミノ酸よりも短くてもよく、および／または５０％より少ない疎水性残基を有してもよい。

本発明の製剤は、少なくとも７アミノ酸〜最大約１００アミノ酸、例えば、約９〜約５０アミノ酸、好ましくは約１５〜約４５アミノ酸、より好ましくは約２０〜約４０アミノ酸、例えば、約２５〜約３８アミノ酸、例えば、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６または３７アミノ酸の配列を含むフルオロカーボン連結ペプチドを含有してもよい。

本発明の製剤は、少なくとも１つのフルオロカーボン連結ペプチドを含んでもよく、ここで、該ペプチドにおけるアミノ酸の少なくとも５０％は疎水性である。典型的には、約５０％と約８０％の間、例えば約７０％または約７５％の残基が疎水性である。下限は４８％または４９％であり得る。好ましくは、ペプチドは、約５５％〜約６０％または約６５％疎水性残基を含む。製剤がさらなるフルオロカーボン連結ペプチドを含む場合、さらなるフルオロカーボン連結ペプチドは５０％未満の疎水性を有してもよい。例えば、さらなるフルオロカーボン連結ペプチドのペプチド成分は、約３０％〜約７０％の疎水性残基、例えば、約４０％、例えば、約４５％、５０％、５５％、６０％または６５％の疎水性残基を含んでもよい。トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、イソロイシン（Ｉ）、フェニエルアラニン（Ｆ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、メチオニン（Ｍ）、アルギニン（Ａ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）およびシステイン（Ｃ）は疎水性アミノ酸である。好ましい実施形態において、製剤に存在するペプチドは、８０％を超える残基が疎水性である、２０以上のアミノ酸残基の連続配列を含まない。

１つまたは複数のさらなるフルオロカーボン連結ペプチドは、少なくとも２０アミノ酸残基の長さであり；少なくとも５０％の疎水性アミノ酸残基を含み；および／もしくは７以上の等電点を有するペプチドを含んでもよい。第１のフルオロカーボン連結ペプチドおよび／またはさらなるフルオロカーボン連結ペプチドの１つまたは複数は、フルオロカーボンから遠位の最後の１５個の連続アミノ酸において正に荷電したアミノ酸を含み；かつ／または８０％を超える疎水性アミノ酸残基を含む２０アミノ酸残基の連続配列を含まないペプチドを含んでもよい。

一実施形態において、本発明の製剤におけるペプチドで、７未満の等電点を有し、フルオロカーボンから遠位の最後の１５個の連続アミノ酸において正に荷電したアミノ酸を含まず、かつ／または８０％を超える疎水性アミノ酸残基を含む２０アミノ酸残基の連続配列を含むものはない。

本発明の製剤におけるフルオロカーボン連結ペプチドは、典型的には、０．２２μｍ未満の直径を有するミセル中に存在する。ミセルは、典型的には、約１５〜約２００ｎｍ、典型的には約２０ｎｍ〜約１００ｎｍ、例えば約２０ｎｍ〜約３０ｎｍまたは約３０ｎｍ〜約５０ｎｍの直径を有する。しかしながら、いくらかの大きなミセルが存在してもよい。一般に、凝集体の２０％以下、例えば約１０％〜約１５％は、１００ｎｍを超える直径を有する。好ましくは、フルオロカーボン連結ペプチドミセルの少なくとも８０％は、１００ｎｍ未満の直径を有する。ミセルサイズは、任意の適切な方法、例えば動的光散乱（ＤＬＳ）によって、または透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いることによって決定されてもよい。

ミセル形成は、酸性溶液においてフルオロカーボン連結ペプチドを可溶化することによって促進し得る。例えば、フルオロカーボン連結ペプチドは、本明細書に記載されているように酢酸に可溶化されてもよい。薬学的に許容される製剤の製造において使用するための本発明の水性製剤は、酸性であってもよく、例えば５以下のｐＨを有する。

本発明の薬学的に許容される製剤は、乾燥形態、例えば凍結乾燥形態であってもよい。本発明の薬学的に許容される製剤は、例えば、水性媒体に凍結乾燥物または他の乾燥製剤を溶解させることによって形成される、水性溶液であってもよい。水性溶液は、典型的には、中性ｐＨである。

本発明の水性（液体）製剤において、溶液は、典型的には透明であり、視認される凝集体はない。特に、ボルテックスおよび超音波処理による摂動後、溶液中に視認される粒子はない。これは、酸性製剤と薬学的に許容される製剤の両方にあてはまる。

ペプチドは、典型的には、ヒトを包含する動物において免疫反応を誘導することができるペプチド抗原またはアレルゲンであり、即ち、ペプチドは、典型的には、免疫原性ペプチドである。好ましくは、免疫反応は、宿主において有益効果を有する。免疫原性ペプチドは、感染性因子（病原体）、例えばウイルス、細菌、マイコバクテリウム、寄生虫または真菌由来であってもよく、または自己タンパク質、例えば癌抗原（腫瘍細胞由来のタンパク質）であってもよく、またはアレルゲン由来であってもよい。

ウイルスの例としては、以下のウイルスが包含されるが、動物およびヒトのウイルスに限定されず、例えば、インフルエンザ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２）、エボラ、マールブルグ、デング熱、西ナイル熱ウイルスおよび黄熱病ウイルス、ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）が挙げられる。

細菌およびマイコバクテリウムの例には、限定されないが、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、レジオネラ、リケッチア、クラミジアおよびリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）が包含される。

寄生虫の例には、限定されないが、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）および他の種のマラリア原虫ファミリーが包含される。

真菌の例には、限定されないが、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、クリプトコッカス、ロドトルラおよびニューモシスティスが包含される。

自己（autologous）または自己（self）抗原には、限定されないが、癌と関連した次の抗原、Ｐ５３、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＵＲＶＩＶＩＮ、ＷＴ１、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＭＵＣ１、ｈＴＥＲＴ、ＭＡＧＥ−１、ＬＡＧＥ−１、ＰＡＰ、Ｔ２１、ＴＲＰ−２、ＰＳＡ、Ｌｉｖｉｎ、ＨＡＧＥ、ＳＳＸ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＡＳＤ１、ＩＭＰ−３、ＳＳＸ−４、ＣＤＣＡ−１および／またはＢＡＧＥが包含される。

アレルゲンには、限定されないが、ハチに対する重篤な反応と関連したホスホリパーゼＡ_２（ＡＰＩｍ１）、ハウスダストダニのヤケヒョウヒダニ（Dermatophagoides pteronyssinus）に対する反応と関連したＤｅｒｐ−２、Ｄｅｒｐ２、Ｄｅｒｆ、Ｄｅｒｐ５およびＤｅｒｐ７、ゴキブリアレルゲンのＢｌａｇ２および主要なカバノキ花粉アレルゲンのＢｅｔｖ１が包含される。

一実施形態において、ペプチドは、インフルエンザウイルス由来である。インフルエンザペプチド抗原は、Ａ型インフルエンザタンパク質、Ｂ型インフルエンザタンパク質またはＣ型インフルエンザタンパク質由来の１つまたは複数のエピトープを含んでもよい。Ａ型およびＢ型インフルエンザ由来のインフルエンザウイルスタンパク質の例には、血球凝集素、ノイラミニダーゼ、マトリックス（Ｍ１）タンパク質、Ｍ２、核タンパク質（ＮＰ）、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＳ１またはＮＳ２がそれらの任意の組み合わせで包含する。

本明細書で使用する場合、用語「免疫原性」とは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはＢ細胞受容体（ＢＣＲもしくは抗体）などの免疫学的受容体によって認識される能力を有する分子を意味する。免疫原性ペプチドは、少なくとも１つのエピトープ、例えばＴ細胞エピトープおよび／またはＢ細胞エピトープを示すという条件で、天然のものまたは非天然のものであってもよい。ペプチドは１つまたは複数のＴ細胞エピトープ、例えばＴヘルパー細胞エピトープおよび／または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープ、および／または１つまたは複数のＢ細胞エピトープまたはＴおよびＢ細胞エピトープの組み合わせ、例えばＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩエピトープを含有してもよい。エピトープを同定する方法は、当該技術分野において周知である。

ペプチドは、１つまたは複数のエピトープを含んでもよい。ペプチドは、互いに連結された複数のエピトープを含んでもよい。このような例の１つは、雑多なＴヘルパーエピトープが１つもしくは多数のＣＴＬエピトープまたは１つもしくは多数のＢ細胞エピトープに共有結合され得る融合ペプチドの使用である。一例として、雑多なＴヘルパーエピトープは、ＰＡＤＲＥペプチド、破傷風トキソイドペプチド（８３０−８４３）またはインフルエンザ血球凝集素、ＨＡ（３０７−３１９）であり得る。

エピトープは、高密度実装された多特異的エピトープのクラスターを含むように、線状エピトープを重複していてもよい。

フルオロカーボン結合にコンジュゲートされていないペプチドの末端は、ミセル形成を介して、構築物の溶解性を促進するように改変されてもよい。例えば、正に荷電したアミノ酸は、ミセル集合を促進させるために、ペプチドに付加され得る。ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかは、構築物を作製するためのベクターに連結されてもよい。構築物の大規模合成を促進するために、ペプチドのＮ末端またはＣ末端のアミノ酸残基を修飾することができる。所望のペプチドがペプチダーゼによる開裂に特に感受性である場合、通常のペプチドは、非開裂性ペプチド模倣体に置換され得る。このような結合および合成法は当該技術分野において周知である。

また、非標準的な非天然のアミノ酸は、それらが、ＭＨＣ分子と相互作用するペプチドの能力を妨げず、天然配列を認識するＴ細胞と交差反応性を維持するという条件で、ペプチド配列に組み込まれてもよい。非天然アミノ酸を用いて、プロテアーゼに対するペプチド抵抗性または化学的安定性を改善することができる。非天然アミノ酸の例には、Ｄ−アミノ酸およびシステイン修飾が包含される。

ペプチドは、天然タンパク質からの精製によって誘導され、または組換え技術もしくは化学合成によって生産されてもよい。ペプチドの製造法は、当該技術分野において周知である。

複数のペプチドが、幅広い予防効果または免疫治療効果を与えるために必要とされてもよいことは、ワクチン設計者に理解される。このような多成分製品は、それらが適切な免疫反応を引き起こす際により効果的である可能性があるため、望ましい。例えば、インフルエンザワクチンの最適な製剤は、異なるインフルエンザタンパク質由来の多くのペプチドエピトープを含んでもよく、またはＨＩＶ免疫治療薬の最適な製剤は、異なるＨＩＶタンパク質由来の多くのエピトープを含んでもよい。あるいは、複数のエピトープは、様々な範囲の病原体に対する免疫性を付与するために、製剤に組み込まれてもよい。例えば、呼吸器感染ワクチンは、インフルエンザウイルスおよび呼吸器合胞体ウイルス由来のエピトープを含有してもよい。

本発明の製剤は、多数の免疫原性ペプチドを含んでもよい。典型的には、各ペプチドは異なるエピトープを含む。各ペプチドは、共通のフルオロカーボンベクターに連結されてもよい。より特定すれば、フルオロカーボン連結ペプチドの組み合わせは、本発明の製剤に存在していてもよく、この場合、異なるペプチドは、独立して、フルオロカーボン鎖に連結される。フルオロカーボン連結ペプチドの混合物において、各ペプチドは、単一構造のフルオロカーボン鎖に連結されてもよい。あるいは、混合物は、異なる構造を有するフルオロカーボン鎖に連結されているペプチドを含んでもよい。

本発明の製剤は、１つまたは複数のフルオロカーボン連結ペプチド、好ましくは約２〜約２０、好ましくは約３〜約１０のペプチドを含んでもよい。特定の実施形態において、多成分ワクチンは、４、５、６、７、８または９個のフルオロカーボン連結ペプチドを含有してもよい。これは、複数のエピトープ性免疫反応の生成を目的とする。

多成分製品に存在する様々なペプチドは、同じ病原体由来の異なる抗原であってもよく、または異なる病原体由来の抗原であってもよい。あるいは、ペプチドは、様々な腫瘍抗原、または自己タンパク質の異なる部分由来の抗原であってもよい。

免疫原性インフルエンザペプチドを含むフルオロカーボン連結ペプチドを実施例に用いる。本発明は、これらの特定のペプチドに限定されないが、上述される特性を有する任意の免疫原性ペプチドまで及ぶ。しかしながら、本発明の好ましい製剤は、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰおよびＭ１タンパク質の非常に保存されたセグメントから選択される、１つまたは複数の以下の６つの免疫原性インフルエンザペプチド：
HMAIIKKYTSGRQEKNPSLRMKWMMAMKYPITADK（配列番号１）
VAYMLERELVRKTRFLPVAGGTSSVYIEVLHLTQG（配列番号２）
YITRNQPEWFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFE（配列番号３）
APIMFSNKMARLGKGYMFESKRMKLRTQIPAEMLA（配列番号４）
DQVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKS（配列番号５）
DLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSER（配列番号６）
を包含する。

ペプチドは、好ましくは、各々別々にフルオロカーボンベクターに連結される。本発明の特に好ましい製剤は、上記のフルオロカーボン連結ペプチドの６つ全てを含み、配列番号１３、１４、２３および２４のいずれか１つに示される配列を有するペプチドを含むフルオロカーボン連結ペプチドを包含しない。他のフルオロカーボン連結ペプチドは、本発明の好ましい製剤に包含されてもよい。しかしながら、製剤は、上述される６つのフルオロカーボン連結ペプチドを含み、他のフルオロカーボン連結ペプチドを含まないことが好ましい。

６つのペプチドの１つまたは複数は、１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換を含む変異体ペプチドによって置換されてもよい。変異体ペプチドは、異なるインフルエンザ株由来の配列を含んでもよい。例えば、配列番号１は配列番号７によって置換されてもよく、配列番号２は、配列番号８または９によって置換されてもよく、配列番号３は、配列番号１０によって置換されてもよく、配列番号４は、配列番号１１によって置換されてもよく、および／または配列番号５は配列番号１２によって置換されてもよい。

ペプチドは、後述されるスペーサー部分を介してフルオロカーボンベクターに連結されてもよい。スペーサー部分は、好ましくは、リジン残基である。したがって、本発明の好ましい製剤は、配列番号１７〜２２に示される、１つまたは複数の配列を有するフルオロカーボン連結ペプチドを含んでもよい。ペプチドのＮ末端リジンは、好ましくは、式Ｃ_８Ｆ_１７（ＣＨ_２）_２ＣＯＯＨを有するフルオロカーボンに連結される。フルオロカーボンは、好ましくは、Ｎ末端リジン残基のイプシロン鎖に連結される。

したがって、一実施形態において、本発明は、配列番号１〜６を含む６つのフルオロカーボン連結ペプチドおよび薬学的に許容される担体または賦形剤および場合によりアジュバントからなる、または本質的にそれらからなる薬学的に許容される製剤を提供する。

６つのフルオロカーボン連結ペプチドの各々において、ペプチドは、好ましくは、リジン残基が、リジン残基のイプシロン鎖を介して式Ｃ_８Ｆ_１７（ＣＨ_２）_２ＣＯＯＨを有するフルオロカーボン鎖に連結されている追加されたＮ末端リジン残基を有する配列番号１〜６の１つ（即ち、配列番号１７〜２２の１つ）からなる。

フルオロカーボン連結ペプチドにおけるフルオロカーボン結合は、ペルフルオロカーボンまたは混合されたフルオロカーボン／炭化水素基由来の１つまたは複数の鎖を含んでもよく、飽和または不飽和であってもよく、各鎖は、３〜３０個の炭素原子を有する。

したがって、フルオロカーボン結合における鎖は、典型的には、飽和または不飽和であり、好ましくは飽和である。フルオロカーボン結合における鎖は、直鎖または分岐鎖であってもよいが、好ましくは直鎖である。各鎖は、典型的には、３〜３０個の炭素原子、好ましくは５〜２５個の炭素原子、より好ましくは８〜２０個の炭素原子を有する。

フルオロカーボン結合をペプチドに共有結合させるために、反応基またはリガンド、例えば、−ＣＯ−、−ＮＨ−、Ｓ、Ｏまたは任意の他の適した基が包含される。共有結合を達成させるためのこのようなリガンドの使用は、当該技術分野において周知である。反応基は、フルオロカーボン分子の任意の位置に局在化されてもよい。

ペプチドへのフルオロカーボン部分の連結は、ペプチドの任意の部位で天然に存在するまたは該部位に導入された官能基、例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨおよび−ＮＨ_２を介して達成されてもよい。このような連結の例としては、アミド結合、ヒドラゾン結合、ジスルフィド結合、チオエーテル結合およびオキシム結合が挙げられる。

場合により、スペーサー要素（ペプチド性または非ペプチド性）は、抗原提示細胞内のプロセッシングのフルオロカーボン要素からペプチドの開裂を可能にし、およびペプチドの立体的提示を最適化するために組み込まれてもよい。また、スペーサーは、分子の合成を支援し、その安定性および／または溶解性を改善するために組み込まれてもよい。スペーサーの例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはタンパク質分解酵素によって開裂されてもよいリジンもしくはアルギニンなどのアミノ酸が包含される。

一実施形態において、フルオロカーボン連結ペプチドは、化学構造Ｃ_ｍＦ_ｎ−Ｃ_ｙＨ_ｘ−（Ｓｐ）−Ｒまたはその誘導を有してもよく、ここで、ｍ＝３〜３０、ｎ≦２ｍ＋１、ｙ＝０〜１５、ｘ≦２ｙ、（ｍ＋ｙ）＝３〜３０、およびＳｐは任意の化学的スペーサー部分であり、Ｒはペプチド抗原である。典型的には、ｍおよびｎは、２ｍ−１≦ｎ≦２ｍ＋１、好ましくはｎ＝２ｍ＋１の関係を満たす。典型的には、ｘおよびｙは、２ｙ−２≦ｘ≦２ｙ、好ましくはｘ＝２ｙの関係を満たす。好ましくは、Ｃ_ｍＦ_ｎ−Ｃ_ｙＨ_ｘ部分は線状である。

ｍは５〜１５、より好ましくは８〜１２であることが好ましい。また、ｙは０〜８、より好ましくは０〜６または０〜４であることが好ましい。したがって、Ｃ_ｍＦ_ｎ−Ｃ_ｙＨ_ｘ部分は、飽和（即ち、ｎ＝２ｍ＋１およびｘ＝２ｙ）および線状であり、ｍ＝８〜１２およびｙ＝０〜６または０〜４であることが特に好ましい。

特定の例において、フルオロカーボン結合は、下記式：

の２Ｈ，２Ｈ，３Ｈ，３Ｈ−ペルフッ化ウンデカ酸から誘導される。

したがって、好ましいフルオロカーボン結合は、線状飽和部分Ｃ_８Ｆ_１７（ＣＨ_２）_２−である。

フルオロカーボン結合のさらなる例は、以下の式：Ｃ_６Ｆ_１３（ＣＨ_２）_２ＣＯＯＨ、Ｃ_７Ｆ_１５（ＣＨ_２）_２ＣＯＯＨ、Ｃ_９Ｆ_１９（ＣＨ_２）_２ＣＯＯＨ、Ｃ_１０Ｆ_２１（ＣＨ_２）_２ＣＯＯＨ、Ｃ_５Ｆ_１１（ＣＨ_２）_３ＣＯＯＨ、Ｃ_６Ｆ_１３（ＣＨ_２）_３ＣＯＯＨ、Ｃ_７Ｆ_１５（ＣＨ_２）_３ＣＯＯＨ、Ｃ_８Ｆ_１７（ＣＨ_２）_３ＣＯＯＨおよびＣ_９Ｆ_１９（ＣＨ_２）_３ＣＯＯＨから誘導される、それぞれＣ_６Ｆ_１３（ＣＨ_２）_２−、Ｃ_７Ｆ_１５（ＣＨ_２）_２−、Ｃ_９Ｆ_１９（ＣＨ_２）_２−、Ｃ_１０Ｆ_２１（ＣＨ_２）_２−、Ｃ_５Ｆ_１１（ＣＨ_２）_３−、Ｃ_６Ｆ_１３（ＣＨ_２）_３−、Ｃ_７Ｆ_１５（ＣＨ_２）_３−、Ｃ_８Ｆ_１７（ＣＨ_２）_３−およびＣ_９Ｆ_１９（ＣＨ_２）_３−を有する。

フルオロカーボンベクター−抗原構築物のための適切な構造の好ましい例は、以下：

を有し、ここで、ＳｐおよびＲは上記で定義される通りである。好ましくは、Ｓｐは、リジン残基から誘導され、式−ＣＯＮＨ−（ＣＨ_２）_４−ＣＨ（ＮＨ_２）−ＣＯ−を有する。好ましくは、Ｒは、配列番号１〜６のいずれか１つである。したがって、配列番号１、２、３、４、５または６のＮ末端アミノ酸のアミノ基は、式−ＣＯＮＨ−（ＣＨ_２）_４−ＣＨ（ＮＨ_２）−ＣＯ−のスペーサーのＣ末端カルボキシ基とともにアミド連結を形成する。

本発明に照らして、フルオロカーボン結合は、得られる化合物が、なおも抗原提示細胞にペプチドを送達し得るように修飾されてもよい。したがって、例えば、多くのフッ素原子は、塩素、臭素またはヨウ素などの他のハロゲン原子と置換されてもよい。さらに、多くのフッ素原子をメチル基で置換し、なおも本明細書に記載されている分子の特性を維持することが可能である。

本発明は、１つまたは複数の、例えば２以上のフルオロカーボン連結ペプチドおよび場合により薬学的に許容される担体または添加剤を含む酸性水性製剤と薬学的に許容される製剤の両方を提供する。好ましくは、製剤中の少なくとも１つのフルオロカーボン連結ペプチドは、少なくとも２０アミノ酸残基のペプチドを含み、これは、少なくとも５０％の疎水性アミノ酸残基を有し、７以上の等電点を有する。添加剤は、効果的な凍結乾燥のために必要とされる安定化剤または充填剤であってもよい。例としては、ソルビトール、マンニトール、ポリビニルピロリドンおよびそれらの混合物が挙げられ、好ましくはマンニトールである。存在してもよい他の添加剤には、保存剤、例えば、当該技術分野において周知である抗酸化剤、潤滑剤、凍結保存剤および結合剤が包含される。

本発明は、本発明の製剤を製造するための方法を提供する。

本発明の方法において、少なくとも１つのフルオロカーボン連結ペプチドは、医薬品の製剤化における第１ステップとして酢酸に可溶化される。出発物質として使用されるフルオロカーボン連結ペプチドは、典型的には、乾燥形態である。酢酸に可溶化されたフルオロカーボン連結ペプチド（単数または複数）は、典型的には、少なくとも約５０％のアミノ酸が疎水性である少なくとも約２０アミノ酸の長さであるペプチドを含む。他のフルオロカーボン連結ペプチドは、酢酸または他の溶媒に可溶化されてもよい。特に、２０アミノ酸より短いペプチドを含み、および／または５０％より少ない疎水性残基を有するフルオロカーボン連結ペプチドは、酢酸以外の溶媒に可溶化されてもよい。

用語「可溶化」は、滅菌濾過により材料を喪失しない視覚的に透明な溶液を形成する溶媒におけるフルオロカーボン連結ペプチドの分散を意味するものとして本明細書において使用される。フルオロカーボン連結ペプチドは、多分子ミセル構造に存在してもよい。「分散」とは、ミセル構造の形成を通じて、粒子を分離し、可溶性を達成するために、凍結乾燥されたフルオロカーボン連結ペプチドの分解を意味する。

用語「凝集体」は、高分子のフルオロカーボン連結ペプチド構造を説明するものとして本明細書において使用される。フルオロカーボン連結ペプチドのミセル凝集体は、可溶化を支援してもよい。フルオロカーボン連結ペプチドの巨視的な凝集体は、視認される粒子をもたらす。用語「粒子」は、肉眼で確認できるフルオロカーボン連結ペプチドの凝集体を意味するものとして本明細書において使用される。

酢酸におけるフルオロカーボン連結ペプチドの可溶化は、典型的には、フルオロカーボン連結ペプチドのミセル凝集体を含有する透明な溶液の形成をもたらす。ミセル凝集体は、典型的には、約２０ｎｍ〜約５０ｎｍ、例えば約１７ｎｍ〜約３０ｎｍの直径を有する。しかしながら、約５０ｎｍを超える直径を有するいくらかの大きな凝集体、典型的には、凝集体の２０％以下、例えば約１０〜約１５％は、１００ｎｍを超える直径を有する。好ましくは、凝集体は、肉眼で確認できない。粒径は、任意の適した方法によって、例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）によって、または透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）の使用によって測定されてもよい。例えば、逆染色においてＴＥＭを使用すると、２０μｌのフルオロカーボン連結ペプチド溶液は、Ｆｏｒｍｖａｒ炭素被覆された銅電子顕微鏡グリッド（３００メッシュ）に配置される。次に、２０μｌの酢酸ウラニル（１％水性）を添加する。３０秒後、過剰の溶液をＷｈａｔｍａｎ濾紙により素早く取り除く。その後、分析前の少なくとも２分間、試料を乾燥させる。続いて、透過型電子顕微鏡法は、１２０ｋＶの加速電圧でＰｈｉｌｉｐｓ ＣＭ１２０ ｂｉｏｔｗｉｎにより行われる。画像収集は、５００００倍〜１５００００倍までの範囲の直接拡大により行われる。

溶液中のフルオロカーボン連結ペプチドの濃度は、典型的には、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、例えば、約０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭまたは５ｍＭである。適した濃度の例は、約１０ｍｇ／ｍｌである。

初期の可溶化ステップから開始し最終生産物提示までの典型的な製造プロセスフローの例は、図１および２に与えられる。これらは、溶媒がフルオロカーボン連結ペプチドの溶解性を達成するためだけでなく、溶媒が可能な安定化剤との混和、滅菌濾過および凍結乾燥を包含する下流プロセスと適合するための要件を強調する。フローチャートにおいて、文字ｎは、製剤に包含することができる追加のフルオロカーボン連結ペプチドの変数を示すものとして使用される。

当業者に知られるように、結果として得られる生産物の同一の特徴を達成するように、プロセスフローの変更を許可する；即ち、流入成分は、所望の比まで均質にともに混和され、いずれの凝集体も分散され、滅菌の状態であり、投与のための適した形態で提示される。このような例は、可溶化を促進するために、混和段階後または希釈段階後にボルテックスおよび／または超音波処理の導入を包含することができる。製造プロセスフローの他の置換は、プロセスの初期段階で行われる滅菌濾過、または液体最終提示を可能にするために凍結乾燥の省略を包含することができる。

あるいは、１セットのフルオロカーボン連結ペプチドは、個別に１つの有機溶媒に可溶化され、次に一緒に混和され、滅菌濾過されてもよく、第２のセットのフルオロカーボン連結ペプチドは、代替溶媒に可溶化され、混和され、滅菌濾過され（図２）、その後、これらの２セットのフルオロカーボン連結ペプチドは、さらなる処理のために一緒に混和される。

フルオロカーボン連結ペプチドの１つまたは複数は、酢酸に可溶化されてもよく、フルオロカーボン連結ペプチドの１つまたは複数は、許容される特性を有する別の溶媒に可溶化されてもよいように、初期溶媒は、各フルオロカーボン連結ペプチドに対して同一または異なっていてもよい。例えば、図１のプロセスフローにおいて、ＢはＡとは異なる溶媒であってもよい。

あるいは、酢酸は、異なるフルオロカーボン連結ペプチドについて初期溶媒として使用されてもよいが、異なるフルオロカーボン連結ペプチドについて、異なる最適化された濃度で使用されてもよい。例えば、図１のプロセスフローにおいて、Ｂは、異なる濃度の、Ａと同じ溶媒であってもよい。

様々なフルオロカーボン連結ペプチドは可溶化前に混合されてもよい。

酢酸は、５〜８０％（ｖ／ｖ）酢酸水溶液の濃度、例えば１０〜７０％（ｖ／ｖ）の濃度、例えば約２０％（ｖ／ｖ）または５０％（ｖ／ｖ）の濃度で使用されてもよい。フルオロカーボン連結ペプチドの混合物を製剤化するための方法において、様々なペプチドは、混和前に、異なる濃度の酢酸に可溶化されてもよい。例えば、１つまたは複数のフルオロカーボン連結ペプチドは、１０％（ｖ／ｖ）酢酸に可溶化されてもよく、１つまたは複数のペプチドは８０％（ｖ／ｖ）酢酸に可溶化されてもよい。

複数の溶媒を製造プロセスに用いる場合、使用される各溶媒は、典型的には：相対的に高い濃度（例えば、最大１０ミリモル濃度、例えば最大２ミリモル濃度）で可溶化するために使用されているフルオロカーボン連結ペプチドを可溶化することができ；凍結乾燥前に水による希釈を促進するために水混和性であり；製造プロセスにおいて使用されてもよい凍結乾燥安定化剤、例えばマンニトールと適合し；医薬品規制機関に許容される安全プロフィールを有し、例えば、ＵＳＰ残留溶媒＜４６７＞（最終生成物において５０ｍｇ／日または５０００ｐｐｍもしくは０．５％未満の残留溶媒制限）によって定義されるＩＣＨ Ｑ３Ｃの要件（不純物：残留溶媒に関するガイダンスについて注記）、およびクラスＩＩＩ溶媒の要件に従い；凍結乾燥に影響を受けやすい、即ち、凍結乾燥時の安全レベルまで除かれるのに十分に揮発性であり；滅菌等級濾過時の収量損失が最小限となるように、再現的におよび均一的にフルオロカーボン連結ペプチド分子を効率的に分散させることができ；フルオロカーボン連結ペプチド分子と反応することができず、およびその分解を促進することができず；および／または医薬品製造に日常的に使用される材料（容器／濾過膜／配管など）と適合する。

混和物に１つまたは複数のフルオロカーボン連結ペプチドを分散させるために使用されてもよい溶媒の例には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、プロパン−２−オール、ｔｅｒｔ−ブタノール、アセトンおよび他の有機溶媒が挙げられる。

異なるフルオロカーボン連結ペプチドが、別々に、例えば、異なる溶媒または異なる濃度の酢酸に可溶化される場合、可溶化されたペプチドを混和し、フルオロカーボン連結ペプチドの混合物を作製する。

また、１つまたは複数の薬学的に許容される添加剤および／またはアジュバントは、可溶化されたフルオロカーボン連結ペプチドまたはフルオロカーボン連結ペプチドの混合物に添加されてもよい。

「添加剤」とは、フルオロカーボン連結ペプチド用の担体として用いられる不活性な物質を意味する。典型的には、可溶化されたフルオロカーボン連結ペプチドは添加剤と混合される。製造プロセスにおいて用いられてもよい潜在的な添加剤は、効果的な凍結乾燥に必要な安定化剤または充填剤を含む。例としては、ソルビトール、マンニトール、ポリビニルピロリドンおよびそれらの混合物が挙げられ、好ましくはマンニトールである。他の添加剤としては、保存剤、例えば、当該技術分野において周知である抗酸化剤、潤滑剤、凍結保存剤および結合剤が挙げられる。

ペプチド抗原に付与されている免疫反応の大きさおよび強度を増大させるために、１つまたは複数のアジュバントおよび／または他の免疫増強剤を製剤に包含してもよい。この文脈における「アジュバント」は、同時に投与された抗原に指向される免疫応答を調節できるが、それだけを投与した場合に任意の直接的作用があるとしてもほとんどない薬剤である。このようなアジュバントは、規模および／またはサイトカインプロフィールの観点において、免疫反応を増強することができる場合がある。

適したアジュバントは、
（１）細菌の天然成分の天然または合成由来の精製物、例えば、フロインドアジュバントおよびその誘導体、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧ、モノホスホリルリピドＡ；
（２）他の既知のアジュバントまたは増強剤、例えば、サポニン、アルミニウム塩およびサイトカイン；
（３）水中油型アジュバント、例えば、１ミクロン未満の水中油型エマルジョンＭＦ−５９、油中水型アジュバント、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、リポソーム、製剤化されたナノ粒子およびマイクロ粒子；
（４）細菌毒素およびトキソイド；ならびに
（５）当業者に周知である他の有用なアジュバント
を包含する。

溶解化および混和後、フルオロカーボン連結ペプチド（単数または複数）の溶液を希釈する。例えば、混和は水において希釈されてもよい。

フルオロカーボン連結ペプチドを含有する溶液は、好ましくは滅菌される。滅菌は、製剤が全身使用を意図する場合に特に好ましい。滅菌の任意の適した手段、例えばＵＶ滅菌または濾過滅菌を用いてもよい。好ましくは濾過滅菌が使用される。滅菌濾過には、０．４５μｍフィルター、続く０．２２μｍ滅菌等級フィルタートレインが包含されてもよい。

滅菌は、任意の添加剤および／またはアジュバントの添加の前またはその後に行われてもよい。

濾過滅菌後、滅菌溶液に存在するフルオロカーボン連結ペプチドの収率は、典型的には、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の、滅菌前に存在するフルオロカーボン連結ペプチドの量である。９５％超の収率、例えば９８％、９９％以上の収率、例えば１００％が達成され得る。

滅菌後、フルオロカーボン連結ペプチドは、典型的には、約２０ｎｍ〜約１００ｎｍ、例えば約３０ｎｍ〜約５０ｎｍの直径を有するミセル構造で溶液に存在する。滅菌前の溶液に存在するより大きな粒子は、典型的には、濾過滅菌によって再形成されてもよい。滅菌溶液を滅菌容器に保存してもよい。

滅菌製剤を乾燥させて、酢酸を除去する。また、製剤を乾燥させることにより長期保存を促進する。任意の適した乾燥法を用いてもよい。凍結乾燥が好ましいが、他の適した乾燥法、例えば、真空乾燥、噴霧乾燥、噴霧凍結乾燥または流動層乾燥を用いてもよい。乾燥処理は、フルオロカーボン連結ペプチドが組み込まれているアモルファスなケーキの形成をもたらすことができる。

長期保存のために、滅菌製剤を凍結乾燥してもよい。凍結乾燥は凍結乾燥法によって達成され得る。凍結乾燥法は、典型的には、凍結、続く乾燥を包含する。例えば、フルオロカーボン連結ペプチド混合物は、２時間、−８０℃にて凍結させ、凍結乾燥機において２４時間凍結乾燥させてもよい。

本発明の薬学的に許容される製剤は固体組成物であってもよい。フルオロカーボン連結ペプチド組成物は、乾燥粉末形態で得ることができる。凍結乾燥から得られるケーキは、粉末形態に製粉され得る。したがって、本発明に係る固体組成物は、自由流粒子の形状になり得る。固体組成物は、典型的には、粉末として密封バイアル、アンプルまたはシリンジに与えられる。吸入の場合、粉末を乾燥粉末吸入器に与えることができる。あるいは、固体マトリックスは、パッチとして与えることができる。粉末は、錠剤形態に圧縮されてもよい。

乾燥された、例えば凍結乾燥された、フルオロカーボン連結ペプチド製剤は、投与前に再溶解されてもよい。用語「再溶解」とは、本明細書で使用する場合、使用前に乾燥されたワクチン生産物の溶解を意味する。乾燥、例えば凍結乾燥後、フルオロカーボン連結ペプチド生産物は、好ましくは、再溶解され、等張の、中性ｐＨである、均質な懸濁液を形成する。製剤は、典型的には、水性相において、例えば、注射用水（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ヒスチジン緩衝溶液（例えば２８ｍＭのＬ−ヒスチジン緩衝液）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を添加することによって再溶解される。再溶解された製剤は、典型的には、貯蔵または投与のために、滅菌容器、例えばバイアル、シリンジまたは任意の他の適したフォーマットに分配される。

本発明は、本発明に係る方法によって得ることができるフルオロカーボン連結ペプチド製剤を提供する。製剤は、医薬品の製造における中間物であってもよい。

本発明は、ヒトまたは動物に投与するためのフルオロカーボン連結ペプチド製剤の製造における中間物としての使用に適した水性製剤を提供し、この水性組成物は酸性であり、上記される１つまたは複数のフルオロカーボン連結ペプチドを含む。酸性溶液は、典型的には、酢酸を含む。フルオロカーボン連結ペプチドのうち少なくとも１つは、長さが少なくとも２０アミノ酸残基であり、少なくとも５０％の疎水性アミノ酸残基を含み、７以上の等電点を有してもよく；かつ／または０．２２μｍ未満の直径を有するミセルに存在してもよい。水性溶液は、好ましくは滅菌である。水性溶液は、薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含んでもよい。

また、本発明は、薬学的に許容されるフルオロカーボン連結ペプチド製剤を提供する。薬学的に許容される製剤は、固体、例えば粉末、ケーキまたは錠剤であってもよい。医薬製剤は水性溶液であってもよい。

製剤は、容器、例えば滅菌バイアルまたはシリンジに保存されてもよい。

したがって、本発明は、一実施形態において、ミセル構造で存在するフルオロカーボン連結ペプチド、および薬学的に許容される量の酢酸を含む製剤を提供する。本発明の他の製剤において、酢酸は、乾燥ステップによって完全に除去される。

ＩＣＨが推奨する酢酸の最大値は５０ｍｇ／日である。典型的には、本発明の製剤における酢酸塩レベルは、ＵＳＰ残留溶媒＜４６７＞によって定義されるクラスＩＩＩ溶媒に関する要件に従って、５０００ｐｐｍまたは０．５％未満である。また、本発明は、酢酸に可溶化されたフルオロカーボン連結ペプチドを含む中間製剤を提供する。

一態様において、本発明は、２以上のフルオロカーボン連結ペプチドを含む製剤を提供し、ここで、フルオロカーボン連結ペプチドはミセル構造で存在する。

別の態様において、本発明は、ミセル構造で存在するフルオロカーボン連結ペプチドを含み、凍結乾燥形態である製剤を提供する。

本発明の製剤において、フルオロカーボン連結ペプチドは、典型的には、多数のミセル構造で存在する。ミセル構造は、典型的には、約２０ｎｍ〜約１００ｎｍ、例えば約５０ｎｍ〜７０ｎｍの直径を有する。製剤に存在するミセル構造の少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％または少なくとも９５％は、１００ｎｍ未満の直径、例えば約２０ｎｍ〜約５０ｎｍの直径を有することが好ましい。

さらなる態様において、本発明の製剤は、薬学的に許容される添加剤および／またはアジュバントをさらに含む。例えば、一実施形態において、製剤は、マンニトールおよび／または他の添加剤をさらに含む。

別の態様において、本発明は、ヒトまたは動物における免疫反応を誘導する医薬の製造における本発明の製剤の使用を提供する。また、本発明は、ヒトまたは動物体の疾患を処置または予防するための医薬の製造における本発明の製剤の使用を提供する。

さらなる態様において、本発明は、治療によって、ヒトまたは動物体を処置する方法に使用するための本発明の製剤を提供する。また、ヒトまたは動物における免疫反応を刺激する方法に使用するための本発明の製剤、およびヒトまたは動物の生体の疾患を処置または予防する方法に使用するための本発明の製剤が提供される。

さらなる態様において、本発明は、免疫反応の誘導を必要とするヒトまたは動物における免疫反応を誘導する方法であって、予防的または治療的な量の本発明の製剤を前記ヒトまたは動物に投与するステップを含む方法を提供する。免疫反応は、疾患の処置または予防に有効であり得る。

疾患は、典型的には、感染病、自己免疫疾患、アレルギー、ホルモン病または癌である。製剤におけるフルオロカーボン連結ペプチドは、感染病を引き起こす病原体由来の１つまたは複数のエピトープ、自己免疫疾患またはホルモン病に関係する自己タンパク質、アレルギーに関与するアレルゲンまたは癌細胞に発現される腫瘍抗原を包含するように選択される。

本発明のフルオロカーボン連結ペプチド製剤を用いて処置または予防され得る感染病の例には、限定されないが、以下のウイルス、細菌、マイコバクテリア、寄生虫および真菌によって引き起こされる感染が包含される：インフルエンザ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２）、エボラ、マールブルグ、デング熱、西ナイル熱ウイルスおよび黄熱病ウイルス、ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、レジオネラ、リケッチア、クラミジアおよびリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）および他の種のマラリア原虫ファミリー、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、クリプトコッカス、破傷風菌、ロドトルラおよびニューモシスティス。

本発明のフルオロカーボン連結ペプチド製剤を用いて処置または予防され得る癌の例には、乳癌、メラノーマ、結腸直腸癌、鼻咽頭癌、バーキットリンパ腫および他のヒト癌が包含される。

好ましい実施形態において、本発明の製剤は、インフルエンザを処置しまたはインフルエンザの予防接種をするために使用される。この実施形態のさらなる態様において、インフルエンザワクチン製剤は、アマニジン（amanidine）、リマンチジン、ザナミビルまたはオセルタミビルなどのノイラミニダーゼ阻害剤処置を包含する、抗ウイルス治療組成物を併用して投与されてもよい。なおさらなる態様において、インフルエンザワクチン製剤は、インフルエンザワクチンを生じる従来の抗体などの他のインフルエンザワクチンを併用して投与されてもよい。他のインフルエンザワクチンは、好ましくは季節性インフルエンザワクチンである。

投与は、同時であってもよく、または時間で分けてもよい。本発明の薬学的に許容される製剤は、抗ウイルス治療組成物および／または他のインフルエンザワクチンの前、それと一緒にまたはその後に投与されてもよい。

インフルエンザペプチド、特に、配列番号１〜６に示される配列を有する６つのインフルエンザペプチドを含む製剤は、インフルエンザの予防接種する方法において使用するために提供される。したがって、このようなペプチドを含む本発明の薬学的に許容される製剤は、インフルエンザを処置または予防するための医薬を製造するために使用されてもよい。また、本発明は、インフルエンザを処置または予防する方法であって、治療的有効量の本発明のフルオロカーボン連結インフルエンザペプチド製剤をそれを必要とする対象に投与するステップを含む方法を提供する。

本発明の製剤は、様々な既知の経路および技術を用いて、インビボにおいてヒトまたは動物の対象に投与されてもよい。例えば、製剤は、注射可能な溶液、懸濁液またはエマルジョンとして提供され、非経口、皮下、経口、表皮、皮内、筋内、冠状間、腹腔内、静脈内注射を介して、従来の針およびシリンジを用いて、または液体ジェット式注射システムを用いて投与されてもよい。製剤は、皮膚または粘膜組織に局所的に、例えば鼻腔内に（nasally）、気管内に、腸内に、舌下に、直腸内にまたは経膣的に投与されてもよく、または呼吸器もしくは肺投与に適した細かく分割した噴霧として提供されてもよい。

一実施形態において、本発明の方法は、液体注射として投与に適した製剤に混合物を処理するステップをさらに含む。好ましくは、方法は、摂取を介したまたは肺経路を介した投与に適した製剤に混合物を処理するステップをさらに含む。

製剤は、投薬製剤に適合し、予防的および／または治療的に有効である量で対象に投与される。本発明の製剤の投与は、「予防」または「治療」目的のいずれであってもよい。本明細書で使用する場合、用語「治療的」または「処置」には、以下：感染または再感染の予防；症状の減少または排除；および病原体の減少または完全な除去、の任意の１つまたは複数を包含する。処置は、予防的（感染前）にまたは治療的（感染後）にもたらされてもよい。

担体の選択は、必要に応じて、しばしば、組成物の送達経路の関数である。本発明において、組成物は、投与の任意の適した経路および手段について製剤化されてもよい。薬学的に許容される担体または賦形剤は、経口、眼、直腸、鼻、局所（口腔および舌下を含む）、膣または非経口（皮下、筋内、静脈内、皮内、経皮を含む）投与に適した製剤に使用されるものを包含する。

製剤は、任意の適した形態で、例えば、液体、固体、エアロゾルまたは気体として投与されてもよい。例えば、経口製剤は、エマルジョン、シロップもしくは液体、または胃において分解から活性成分を保護するために経腸的に被覆されてもよい錠剤もしくはカプセルの形態を採用してもよい。鼻腔製剤は、噴霧または溶液であってもよい。経皮製剤は、それらの特定の送達システムに適合されてもよく、およびパッチを含んでもよい。注射用製剤は、蒸留水または別の薬学的に許容される溶媒もしくは懸濁化剤中の溶液または懸濁液であってもよい。

患者に投与されるべきワクチンまたは免疫治療薬の適切な用量はクリニックにおいて決定されることになる。しかしながら、参考のために、適したヒト用量は、好ましい投与経路に依存してもよく、１〜１０００μｇ、例えば約１００μｇ、２００μｇまたは５００μｇであってもよい。複数回投与は、免疫学的または臨床的効果を達成するために必要とされ、必要に応じて、典型的には２〜１２週の間の間隔で局所的に投与される。長期間の免疫反応の増大が必要とされる場合、１カ月〜５年隔てた反復投薬が適用されてもよい。

以下の実施例は本発明を例証する。

ペプチド合成
配列番号１〜６、１０、１１および１３〜１６に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを合成した。各ペプチドの合成は、標準的なＦｍｏｃ／ｔ−ブチル戦略およびＴｅｎｔａＧｅｌ ＨＬ ＮＨ２レジンを用いて固相上で行われた。各配列のＮ末端にリジン残基を付加した。付加されたＮ末端リジン残基を有する配列は、配列番号１７〜２８に示されている。Ｎ末端リジン残基の付加後、レジンブロックを二つの部分に分けた。１つの部分は、Ｎ末端リジンのイプシロン鎖上のフルオロカーボン鎖（Ｃ_８Ｆ_１７（ＣＨ_２）_２ＣＯＯＨ）を組み込むために使用され、フルオロカーボン連結ペプチド（ＦＣＰ）を誘導した。第２の部分を用いて、Ｎ末端リジンのイプシロン鎖のアセチル化を行い、比較試験において使用するための天然ペプチドを誘導した。精製されたフルオロカーボン連結ペプチド（ＦＣＰ）および天然ペプチドは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の存在下で開裂させ、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって最終精製を通じて得られた。以下に記載されているＦＣＰと天然ペプチドの両方は、Ｃ末端でアミド基を有する。全ての調製物は、純度が９５％以上で、乾燥した凍結乾燥粉末であった。正味のペプチド量は、窒素含有量分析に基づいて計算された。

以下のペプチドＰ１〜Ｐ１２をフルオロカーボン鎖に連結させてＦＣＰを作製し、またはアセチル化して天然ペプチドを作製した（アミノ酸の標準的な一文字コード表記を用いている；Ｘ＝フルオロカーボンベクター（フルオロカーボン連結ペプチド）；Ｚ＝アセチル（天然ペプチド））：
P1:NH2-K(XまたはZ)HMAIIKKYTSGRQEKNPSLRMKWMMAMKYPITADK-CONH2
P2:NH2-K(XまたはZ)APIMFSNKMARLGKGYMFESKRMKLRTQIPAEMLA-CONH2
P3:NH2-K(XまたはZ)APIMFSNKMARLGKGYMFESKSMKLRTQIPAEMLA-CONH2
P4:NH2-K(XまたはZ)DQVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKS-CONH2
P5:NH2-K(XまたはZ)DLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSER-CONH2
P6:NH2-K(XまたはZ)SPGMMMGMFNMLSTVLGVSILNLGQKKYTKTTY-CONH2
P7:NH2-K(XまたはZ)KKKSYINKTGTFEFTSFFYRYGFVANFSMELPSFG-CONH2
P8:NH2-K(XまたはZ)VAYMLERELVRKTRFLPVAGGTSSVYIEVLHLTQG-CONH2
P9:NH2-K(XまたはZ)YITRNQPEWFRNVLSIAPIMFSNKMARLGKGYMFE-CONH2
P10:NH2-K(XまたはZ)YITKNQPEWFRNILSIAPIMFSNKMARLGKGYMFE-CONH2
P11:NH2-K(XまたはZ)QSRMQFSSLTVNVRGSGMRILVRGNSPVFNYNK-CONH2
P12:NH2-K(XまたはZ)PDLYDYKENRFIEIGVTRREVHIYYLEKANKIKSE-CONH2

天然ペプチドの生化学的性質を以下の表１に記載する。疎水性であると考えられる残基はＷ、Ｙ、Ｉ、Ｆ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｐ、ＧおよびＣである。荷電残基は、（＋）Ｋ、Ｒ、Ｈ、（−）Ｄ、Ｅである。

水における天然ペプチドおよびＦＣＰの溶解性
水における各ＦＣＰの溶解性を評価した。最終濃度が１．３３３ｍＭとなるように各ＦＣＰを３００μｌの水に分散し、ボルテックスし、超音波処理した。典型的な分散条件は、４回連続の、３０秒ボルテックスを散在させた３分の浴槽超音波処理であった。検査後、得られた溶液をマンニトール溶液（候補凍結乾燥媒体、ペプチドの最終濃度０．１６７ｍＭ、１．３３％（ｗ／ｖ）マンニトール）で希釈した。溶解性は、得られた分散液の混濁度の目視観察（尺度：透明／混濁−／混濁／混濁＋）および粒子の存在によって評価された。結果を表２に示す。

水における初期の分散後の個々のフルオロカーボン連結ペプチド溶液の目視検査は、Ｐ４およびＰ１１だけが水において十分に溶解性であることを示した；これらの溶液の各々は透明であり、粒子は存在しなかった。全ての残りの溶液は、混濁し、粒子を含み、これは、これらのＦＣＰが十分に溶解性でないことを指示した。マンニトール溶液による続く希釈の結果、Ｐ２、Ｐ４およびＰ１１は十分に溶解性であり、透明な溶液であり、視認できる粒子は存在しなかった。また、溶液Ｐ１、Ｐ３、Ｐ６、Ｐ９およびＰ１０は透明であったが、粒子が観察され、これは、それらの溶液が、マンニトール／水溶液において部分的に可溶性であることを指示した。Ｐ５、Ｐ７、Ｐ８およびＰ１２は、マンニトール／水溶液に不溶性であり、粒子を含有する混濁溶液を示した。ペプチド配列の疎水性率ならびに正電荷および負電荷はいずれも溶解性と相関することは見出されなかった。

比較のために、天然ペプチドの溶解性もまた、同じ分子濃度で水において評価された；Ｐ８を除く全ての天然ペプチドについて、溶液は透明であり、粒子は視覚的に検出されなかった。

結果として、各フルオロカーボン連結ペプチドの溶解性は、その凝集性に依存している；大多数のＦＣＰは、水またはマンニトール溶液に十分に溶解性ではなかった。各ＦＣＰの溶解性は、その生化学的性質から予期することができなかった。同等の天然ペプチドは、同濃度のＦＣＰよりも水において溶解性であった。

また、フルオロカーボン連結ペプチドの混合物の溶解性を評価した。８価の製剤（各ペプチドの最終濃度０．１６７ｍＭ、１．３３％（ｗ／ｖ）マンニトール、表３に示されるＦＣＰ組成物）を調製した。滅菌濾過（０．２２μｍのＭｉｌｌｅｘ ２５ｍｍ ＰＶＤＦフィルター）後の各ペプチドの回収率は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって決定された。

目視観察はＨＰＬＣ濾過回収率結果によって確認された。全ＲＰ−ＨＰＬＣ濾過回収収率は、ＭＩＸ１およびＭＩＸ２についてそれぞれ約５０％および５７％であり、これは、ＦＣＰの大部分の粒子が濾過により除かれたことを指示する。したがって、ＦＣＰの混合物もまた水において難溶性である。

添加剤および分散剤におけるＦＣＰの溶解性
水におけるフルオロカーボン連結ペプチドの溶解性を改善するために、医薬品製造において従前には恩恵を与えていた添加剤および分散剤の範囲を評価した。これらには、ポリエチレングリコール、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ界面活性剤、レシチン、グリセリン、大豆油、ベニバナ油、グリコフロール、ジパルミトイルホスファチジルコリン、Ｌａｂｒａｆａｃ ＣＣ（中鎖グリセリド）、ヒドロキシルプロピルベータシクロデキストリン（ＨＰＢＣＤ）およびスルホブチルエーテルベータシクロデキストリンならびにそれらの組み合わせが挙げられる。フルオロカーボン連結ペプチドの７価の等質量（equimassic）混合物の溶解性は、顕微鏡検査によって決定された（最終濃度２．５ｍｇ／ｍｌ）。

試験された条件のいずれもフルオロカーボン連結ペプチドの良好な分散を達成することができなかった。ＨＰＢＣＤは、可溶化を改善することが見出されたが、７０〜８０％の溶解性を達成させるために、室温にて１日のインキュベーションを必要とした。結果として、フルオロカーボン連結ペプチドは、シクロデキストリン、界面活性剤またはブロックコポリマーなどの分散剤の作用に抵抗性であった。

有機溶媒におけるＦＣＰの溶解性
フルオロカーボン連結ペプチドの溶解性は、様々な有機溶媒において評価された。８０％（ｖ／ｖ）プロパン−２−オール、ｔｅｒｔ−ブタノール、ＤＭＳＯおよびアセトンについて、１．３３ｍＭのフルオロカーボン連結ペプチドの同じ最終濃度に溶液を調製した。８０％（ｖ／ｖ）酢酸について、フルオロカーボン連結ペプチドの最終濃度は２．０ｍＭであった。結果を図３に示す。

結果として、全てのフルオロカーボン連結ペプチドは、８０％ｖ／ｖ酢酸に溶解性であり、泡および粒子は観察されなかった。８０％（ｖ／ｖ）プロパン−２−オール、ｔｅｒｔ−ブタノール、ＤＭＳＯおよびアセトン溶液は、評価されたＦＣＰについて完全な溶解性を与えることができなかった。

可溶化におけるマンニトールの効果
種々の溶媒における可溶化に対する希釈およびマンニトールの添加の効果を調べた。各フルオロカーボン連結ペプチドは、図４に従って、水中の８０％ｖ／ｖにおいて分散させ、ボルテックスされ、続いて、マンニトール溶液で７倍に希釈された。８０％ｖ／ｖのプロパン−２−オール、ｔｅｒｔ−ブタノール、ＤＭＳＯおよびアセトン溶液について、０．１６７ｍＭのフルオロカーボン連結ペプチドの同じ最終濃度、および１．３３％（ｗ／ｖ）の最終マンニトール濃度に溶液を調製した。８０％ｖ／ｖ酢酸について、フルオロカーボン連結ペプチドの最終濃度は０．２５ｍＭであった。結果を図４に示す。

また、フルオロカーボン連結ペプチドの等質量混合物を上記のように調製し、各溶媒には以下のペプチド：
Ｍｉｘ１：ＦＣＰ１、ＦＣＰ３、ＦＣＰ４、ＦＣＰ５、ＦＣＰ６、ＦＣＰ７、ＦＣＰ９、ＦＣＰ１２
Ｍｉｘ２：ＦＣＰ２、ＦＣＰ４、ＦＣＰ５、ＦＣＰ６、ＦＣＰ７、ＦＣＰ８、ＦＣＰ１０、ＦＣＰ１１
を含有させた。

個々のＦＣＰならびにＭｉｘ１および２の有効な溶解性は、図４に示されるように、８０％（ｖ／ｖ）酢酸を用いて達成されただけであった。

ＦＣＰ溶液の滅菌濾過後のＦＣＰの回収率
実施例４に示された混合物における各フルオロカーボン連結ペプチドの滅菌濾過（０．２２μｍ、 Ｍｉｌｌｅｘ ２５ｍｍ ＰＶＤＦフィルター）後の回収率をＲＰ−ＨＰＬＣによって決定した。結果を以下の表４および５に示す。

８０％（ｖ／ｖ）酢酸を用いて調製された混合物についての滅菌濾過後、フルオロカーボン連結ペプチドの喪失は検出されなかった。酢酸、続く水性希釈は、フルオロカーボン連結ペプチドの溶解および濾過について好ましい溶媒であるが、最終生成物における残余の酢酸レベルを最小にするために、用いられた濃度を下げることが必要であると結論付けられる。

ＦＣＰの溶解性における酢酸濃度の効果
製剤プロセスの下流および最終生成物において酢酸濃度を制限するために、効率的な分散を達成し、可視的な溶解性を維持するための、水における酢酸の最低濃度は、各フルオロカーボン連結ペプチドについて決定された。抗凍結剤（cryprotectant）としてマンニトールを用いた場合、安定なアモルファスな凍結乾燥製品を達成するために、凍結乾燥段階で酢酸濃度を最低限にすることが重要である。個々のフルオロカーボン連結ペプチドの許容される分散性および溶解性を達成するための最低の酢酸濃度を決定した。初期の酢酸分散後のフルオロカーボン連結ペプチドの最終濃度は２μｍｏｌ／ｍｌであり、マンニトールによる希釈後は０．２５０μｍｏｌ／ｍｌであった。

１０％ｖ／ｖ程度の酢酸濃度は、フルオロカーボン連結ペプチドのいくつかについて十分な分散を与えることが見出された。しかしながら、いくつかのフルオロカーボン連結ペプチドは十分な溶解を達成するために８０％（ｖ／ｖ）未満の酢酸を必要とする一方で、得られた製剤は、経時的に物理的に不安定であることが分かり、ゲルまたは可溶性粒子が形成された（例えば、ＦＣＰ６、ＦＣＰ８およびＦＣＰ９）。これらの３つのペプチドについて、８０％（ｖ／ｖ）酢酸は、物理的状態でいずれかの変化を抑えながら、完全な分散を達成することが見出された。

濾過回収率は、滅菌濾過の前後で、Ｍｉｘ３混合物内の各フルオロカーボン連結ペプチドのピーク領域を比較するＲＰ−ＨＰＬＣによって測定された。回収率パーセンテージは、各ＦＣＰについて測定され、平均回収率は、各個々のＦＣＰの回収率のパーセンテージの平均として計算された。混和および希釈後に測定された濾過回収率（０．２２μｍフィルターに基づく）の全体は、典型的には９５％を超えていた。

フルオロカーボン連結ペプチドによって形成される構造の特徴付け
自己集合した多分子ミセル型構造の形成は、フルオロカーボン連結ペプチドの可溶化プロセスにおいて中心的な役割を果たす場合がある。したがって、フルオロカーボン連結ペプチドの溶解性は、分散後、およびその後の製剤プロセスの全体、特に凍結乾燥製品の再溶解において維持され得る。分散中に集合した多分子構造の物理的特徴付けは、動的光散乱（ＤＬＳ）および透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて行われた。

Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓ（０．６ｎｍ〜６ミクロンの粒子の測定を可能にする）を用いて、ＤＬＳに基づくフルオロカーボン連結ペプチドの混合物の粒径を監視した。Ｍｉｘ１（ＦＣＰ１、ＦＣＰ３、ＦＣＰ４、ＦＣＰ５、ＦＣＰ６、ＦＣＰ７、ＦＣＰ９およびＦＣＰ１２）は、マンニトール賦形剤を用いて実施例１（表３）に記載される通りに調製された。

各混合物の平均粒径（ｎｍ）は、Ｎａｎｏｓｉｚｅｒ（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓｅｒｉｅｓ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＫ）を用いて、２５℃にて測定された。２５０μｌの溶液を用い、プラスチック製マイクロキュベットに送り込んだ。相関時間は１実施あたり１０ｓに基づき、１測定あたり全５実施がなされた。Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＫ）を用いて結果を分析した。容積および強度におけるサイズ分布をＭｉｘ１について観察した。容積測定に基づく平均サイズは、Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅによって計算された。

溶液中のフルオロカーボン連結ペプチドのＤＬＳは、約２０〜５０ｎｍ（容積で９５％を超える）を中心とした直径の多分子構造の存在を実証し、１００ｎｍを超えるサイズを有する集団は約１２〜１６％（強度による）であった（図５）。

ＴＥＭは、ＤＬＳと一致した寸法の球体構造の均質な集団の存在を示した（図６）。

多分子ＦＣＰ構造における滅菌等級の濾過の影響
多分子構造における滅菌等級の濾過の影響を調べた。実施例７からのＭｉｘ１は、滅菌０．２２μｍ Ｍｉｌｌｅｘ ２５ｍｍ ＰＶＤＦフィルターを介して濾過し、次に、実施例７に記載されるように、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓを用いたＤＬＳによって分析した。

ＤＬＳ分析は、形成された構造が非常に動的であり、１セットの分析内でさえ、変動的な再現性を有する。５回と７回の間の測定値を回収し、平均粒径を計算した（図７における様々なプロフィールによって表されている）。

驚くべきことに、０．２２μｍの濾過は、酢酸に初期に溶解されたフルオロカーボン連結ペプチドによって形成された多分子構造を再形成する場合があることを見出した。ＤＬＳは、大きな粒子が、濾過後により小さな粒子に再形成され、Ｋｃｏｕｎｔ（溶液中の粒子数と相関するパラメータ）もまた濾過後に劇的に減少する（濾過前、２００Ｋｃｏｕｎｔ；濾過後、１２０Ｋｃｏｕｎｔ）ことを示す。さらに、０．２２μｍフィルターの前に０．４５μｍの導入は、濾過回収率を減少させなかった。したがって、滅菌等級の濾過は、製剤から大きな粒子を除き、製造プロセスの下流でそれらの通過を制限すること（収量の同時減少を伴う）によってだけでなく、フィルターを通過させ得るように変形によって構造を再形成させることによって、集合した構造の得られたサイズに影響を及ぼすことができる。ＤＬＳデータによれば、２２０ｎｍを超えるサイズを有する粒子は、混合物中の粒子の約１２〜１６％（強度による）を示す。これらは、ＨＰＬＣによって決定された濾過回収率が９７％を超えるため、溶液から除かれないようである。

ＭＩＸ１製剤粒径分布はまた、凍結乾燥、続くＴｒｉｓ−ＨＣｌ １０ｍＭまたは水における試料の再溶解後に評価された（図８）。ＭＩＸ１製剤は容易に再溶解され、水またはＴｒｉｓ−ＨＣｌ １０ｍＭを用いてそれぞれ透明または僅かに乳白色の溶液を得た。粒径は、中心的に２０〜５０ｎＭであり、製剤化中（凍結乾燥前）に観察されたものと大まかに類似したプロフィールであった。これは、再溶解後、ＦＣＰ多分子構造が、視認される大きな凝集体を形成せずに維持されることを実証している。

ＦＣＰの化学的安定性
フルオロカーボン連結ペプチドの化学的安定性は、７つのフルオロカーボン連結ペプチドの凍結乾燥製剤を５０％（ｖ／ｖ）酢酸に２４時間暴露させることによって評価された。Ｍｉｘ３は、酢酸にＦＣＰを初期に可溶化（実施例６に示されるように各ＦＣＰについての溶媒の濃縮）、続く希釈およびマンニトール溶液との混和によって調製された。次に、混合物は、５０％（ｖ／ｖ）酢酸において再溶解する前に凍結乾燥させた。

分解は、未処理の対照と比較して、ＲＰ−ＨＰＬＣによって観察されなかった（図９参照）。これは、選択されたフルオロカーボン連結ペプチドが、薬学的な製造プロセス中の典型的な混和段階の期間、５０％ｖ／ｖ酢酸において化学的に安定であることを実証した。

最終提示における残余の酢酸塩濃度
製剤の下流における酢酸濃度を最小にすることは重要である。これは、凍結乾燥中の安定なケーキの形成を可能にし、所望の中性に近い調製物のｐＨを生じさせる。酢酸は揮発性であり、それによって酢酸含有量は凍結乾燥プロセス中に減少する。

凍結乾燥について、実施例９に記載されように調製されたＭｉｘ３の製剤（１．４ｍｌ体積で満たされた３ｍｌの凍結乾燥バイアル）を最初に２時間、−８０℃フリーザーにおいて凍結させ、次に２４時間凍結乾燥させた（卓上のＣｈｒｉｓｔ Ａｌｐｈａ２−４ＬＳＣ）。この手法は、安定な構造および均質な稠度を有する凍結乾燥されたケーキの製造を可能にした。製剤中の酢酸塩の凍結乾燥前濃度は計算により８．８％ｖ／ｖであった。

３種のバッチについて、バイアル中の凍結乾燥後の残余の酢酸塩濃度（酢酸塩対イオン＋酢酸）は、実験的に、それぞれ０．３〜０．４、０．７および０．５％（ｗ／ｗ）であると決定された。この分析の標準偏差は、酢酸塩について±０．０７％（ｗ／ｗ）として有効であった；定量限界は０．１％（ｗ／ｗ）であった。残余の酢酸塩の平均値は、ヒト用量あたり約０．３５ｍｇの許容されるレベルに等しく、これは、ＩＣＨ推奨（最大５０ｍｇ／日）を十分に下回っている。

凍結乾燥されたＦＣＰ調製物の再溶解
製剤化されたフルオロカーボン連結ペプチド（７価、Ｍｉｘ３）の再溶解は、未製剤化の同等調製物と比較された。実施例９に記載されるように個々のＦＣＰを酢酸に可溶化し、混和し、マンニトール溶液で希釈し、凍結乾燥した（最終濃度０．３５ｍｇ／ＦＣＰ）。製剤化された混合物の１バイアルは、０．７ｍｌの注射用水（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を用いて再溶解され、さらなるバイアルは、０．７ｍｌの２８ｍＭヒスチジン緩衝溶液を用いて再溶解された。未製剤化の混合物について、各々０．３５ｍｇの未処理ＦＣＰは、さらに処理せずにバイアルに分注させた。未製剤化の混合物の１バイアルは、０．７ｍｌの４．５％マンニトール溶液を用いて再溶解され、製剤化のバイアルと同一の添加剤濃度を与えた。未製剤化の混合物のさらなるバイアルは、４．５％マンニトール溶液中の２８ｍＭヒスチジンの０．７ｍｌを用いて再溶解された。

以下の写真（図１０および１１）は、手動による振とう、続く３０秒間のボルテックス、および１時間の浴槽超音波処理によって、初期分散後のＦＣＰの溶解性を例証する。

マンニトール／水およびヒスチジン緩衝溶液の両方を用いた再溶解後の未製剤化の試料の目視検査は、これらの溶液が十分に分散および可溶化させないことを示した。各溶液は混濁し、大きな粒子を観察することができ、特に、ガラスバイアルの側面に付着し、これは経時的に分散しなかった。対照的に、水およびヒスチジン緩衝溶液の両方に分散された製剤化されたワクチンの溶液は透明であり、粒子は存在しなかった。

これらの結果は、初期の可溶化法が、最終の再溶解された製剤の凝集性に影響を及ぼすことを実証している。製剤化プロセスの初期において酢酸へのＦＣＰの分散は、ミセル構造の形成に向かわせ、このミセル構造は、続く混和、濾過および凍結乾燥プロセスを通じて維持される。これは、非粒子形態の水性相における最終の凍結乾燥した調製物の再溶解を促進する。

結論
酢酸は、評価された全ての個々のフルオロカーボン連結ペプチドについて良好な溶媒となることが実証された。完全な可溶化は、高いＦＣＰ濃度（最大２０００ｎｍｏｌ／ｍｌ；約１０ｍｇ／ｍｌ）で達成可能であり、ボルテックスおよび超音波処理による摂動後に粒子は観察されなかった。動的光散乱および透過型電子顕微鏡によって観察されるように、自発的に自己集合した巨大分子構造の形成へと向けられるフルオロカーボン連結ペプチドの両親媒性に起因して、さらに下流の処理中に可溶性を維持した。したがって、溶媒は二重の役割に貢献している；第一に、大きく不規則な粒子構造が破壊されていることを確認するのに十分な破壊能力があることを確認すること、第二に、環境を支持し、それにより、多分子の規則的なミセル構造が作られ、支持されることである。これらの構造は、滅菌濾過により材料の喪失が生じないように、ＦＣＰの可溶性を可能にするのに十分に小さい。また、ミセル構造は、凍結乾燥中に保持され、ヒトへの投与前に水性媒体における凍結乾燥物の再可溶化を促進するために必須である。従来に酢酸に溶解しなかったＦＣＰは、水またはヒスチジン緩衝液において凍結乾燥状態から満足のいくように再溶解することができなかった（実施例１２）。

８０％（ｖ／ｖ）酢酸は全てのＦＣＰを可溶化することが見出された。しかしながら、過剰な酢酸は、凍結乾燥後の許容される凍結乾燥物ケーキの形成を妨げ得る。さらに、医薬品中の酢酸塩のレベルに課せられる規定の制限がある。したがって、低濃度の酢酸を試験した；１０％（ｖ／ｖ）は７つのＦＣＰのうち４つについて安定であることが分かり、一方、８０％（ｖ／ｖ）は、残りの３つのＦＣＰに対して実施可能な最低濃度であった。処理中に、７つのＦＣＰのこの混和は、ヒト用量あたりの酢酸塩の適合したレベルを有する、許容される凍結乾燥物ケーキを生成させた。

調査された全ての他の溶媒は、全てのＦＣＰの完全な可溶化を達成することができなかった。酢酸の成功は、（例えば、実施例１におけるＦＣＰおよび同等な天然ペプチドの溶解性と比較して）フルオロカーボン鎖が分子に独自の生化学的性質を与えるので、予期することができなかった。さらに、ＦＣＰの可溶化における１０％（ｖ／ｖ）酢酸の成功とペプチドの疎水性または荷電残基量との間には相関性がなかった。

要約すると、酢酸は以下の利点を有する：
− 個々のＦＣＰだけでなく、それらの混合物に対しても十分な溶解性を与えることができる；
− 評価された全てのＦＣＰに適している；
− 一貫した均質な製品を生じさせる；
− 使用に意図された濃度（１０〜８０％（ｖ／ｖ）で水混和性である；
− 相対的に高い濃度（少なくとも１０ミリモル濃度）でＦＣＰを可溶化することができる；
− ヒト使用に適したＩＣＨクラスＩＩＩ溶媒として列挙される；
− 凍結乾燥に影響を受けやすい（典型的な凍結乾燥段階後にレベルが減少する）；
− 続く混和および希釈後、滅菌等級の濾過に供され得る溶液をもたらし、収率の損失は最小である；
− 凍結乾燥後、等張であり、中性ｐＨであり、均質な懸濁液を形成するために容易に再溶解され得る製品をもたらす；
− フルオロカーボン連結ペプチドと反応せず、およびその分解を促進しない；および
− 医薬品製造に通常使用される材料と適合する。

フルオロカーボン連結ペプチドインフルエンザワクチンの調製
本研究の目的は、配列番号１〜６に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む、６つのフルオロペプチドを含有する薬学的に許容されるユニバーサルインフルエンザ−Ａワクチン（ＦＰ０１．１）の製造管理および品質管理に関する基準（ＧＭＰ）の調製用に設計された製剤プロセスの恩恵を実証することである。具体的な目標は以下の通りである：
１． ＦＰ−０１．１を製造するための主要な製剤パラメータを評価すること。
ａ．酢酸溶液におけるフルオロペプチドの可溶化の容易性；
ｂ．濾過時点でのミセルサイズの決定；
ｃ．濾過回収率；
ｄ．フルオロペプチドの化学的および物理的安定性。
２．再溶解されたＦＰ−０１．１ワクチン（製剤化されたフルオロペプチド）の品質と非製剤化のフルオロペプチドを含有する同等の調製物を比較すること。

本発明者らは、製剤化プロセスを開発し、配列番号１〜６を含むそれぞれ６つのフルオロカーボン連結ペプチドから構成されるユニバーサルインフルエンザ−ＡワクチンＦＰ−０１．１の製造に該製剤化プロセスを適用した。配列番号１〜６に示される配列を有する６つのペプチドは、Ｎ末端のリジンスペーサーのイプシロン鎖を介してフルオロカーボン鎖Ｃ_８Ｆ_１７（ＣＨ_２）_２ＣＯＯＨにカップリングされる。したがって、６つのフルオロカーボン連結ペプチドは、先行する実施例に記載されるＦＣＰ１、ＦＣＰ８、ＦＣＰ９、ＦＣＰ２、ＦＣＰ４およびＦＣＰ５に対応する。製剤化プロセスは、酢酸の使用に基づき、酢酸は、本発明者らが、プロセス中にフルオロペプチドの物理的および化学的安定性を維持しながら、フルオロペプチドの良好な分散性を確実にすることを見出した酸性溶媒である。酢酸は、非常に揮発性であり、凍結乾燥中に昇華させることができ、再溶解された生成物のｐＨにほとんど影響を与えない残余レベルに一貫して減少することを本発明者らは見出した。

以下に記載されている製剤化プロセスは、緩衝溶液（２８ｍＭのＬ−ヒスチジン）を用いて再溶解され、中性ｐＨ（６〜７．５）であり、許容される浸透圧（２８０〜３２０ｍＯｓｍ）を有する安定であり均質な溶液（視認できる凝集体はない）を生成する凍結乾燥させたＦＰ−０１．１ワクチン（長期間安定であることを確認している）の製造を達成する。いくつかのＧＭＰ臨床用バッチを有用に製造し、本発明者らは、その製品がヒトにおいて安全であり、免疫原性であることを実証した。

材料および機器
− Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐａｎｙによって製造されたフルオロペプチド（ＦＰ−０１．１に含有される）
− 氷酢酸（Ｓｉｇｍａ ＃２７２２５）、Ｄ−マンニトール（Ｍｅｒｃｋ Ｅｍｐｒｏｖｅ）
− Ｈｙｃｌｏｎｅ水（Ｆｉｓｈｅｒ ＃ＨＹＣ−００１−１８９Ｇ）
− Ｍｉｌｌｅｘ、ＰＶＤＦ Ｄｕｒａｐｏｒｅ、０．２μｍ（φ３３ｍｍ）Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
− ３０のオートクレーブ処理（凍結乾燥バイアル（Ａｄｅｌｐｈｉ ＃ＶＣ００２−１３Ｃ）＋ストッパー（Ａｄｅｌｐｈｉ ＃ＦＤＷ１３））
− Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｃｏｌｕｍｎ Ｃ１８，２５０×２．１ｍｍ，５μｍを備えたＨＰＬＣ
− Ｃｏｍｂｉｔｉｐｓピペットチップ１０ｍｌ（Ｆｉｓｈｅｒ ＃ＰＭＰ−１１７−５２３Ｎ）＋Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｓｔｅｐｐｅｒ
− 凍結乾燥機２−４−ＬＳＣ（Ｃｈｒｉｓｔ）
− 浸透圧計：Ｏｓｍｏｍａｔ ０３０（Ｇｏｎｏｔｅｃ）
− マイクロＩｎｌａｂ（登録商標）電極を備えたｐＨメーター（Ｍｅｔｔｌｅｒ）

方法
溶液調製物
１．５０ｍｌの水中の３．３％ｗ／ｗマンニトール（２００ｍｌ水中６．６ｇ）、４℃に冷却。
２．滅菌水中の１０％（ｖ／ｖ）の酢酸溶液５ｍｌ。
３．滅菌水中の８０％（ｖ／ｖ）の酢酸溶液５ｍｌ。

フルオロカーボン連結ペプチドの計量

ＦＰ−０１．１についての製剤調製
１．２ｍｌガラスバイアル中の各ペプチド（正味１０ｍｇのペプチドを対象とする）を計量する
２．水中の１０％または８０％酢酸溶液の約１．０ｍｌ（正確に正味１０ｍｇ／ｍｌとなるように計量の関数において体積を調整する）において正味１０ｍｇ／ｍｌで各フルオロペプチドを分散する
３．ボルテックスおよび超音波処理を行い、視覚的側面を記録する
４．完全に溶解するまでステップ３を繰り返す。
５．４０ｍｌガラス容器内で分散させた６つのフルオロペプチドの各々９５０μｌを一緒に混和する。次に、８０％の酢酸９５０μｌ（全体積６．６５ｍｌ）を添加する。各ペプチドは、４０％酢酸中に１．４２８ｍｇ／ｍｌの濃度である。
６．混和された溶液の視覚的側面を記録する
７．３．３％のマンニトール２５．９３ｍｌを用いて混和されたフルオロペプチドを希釈する（各ペプチドの０．２９１５ｍｇ／ｍｌの溶液）、全酢酸８．１６％。
８．希釈溶液の視覚的側面を記録する
９．Ｍｉｌｌｅｘ ＰＶＤＦ ３３ｍｍ、０．２μｍを用いて約３２ｍｌの溶液を濾過する（濾過回収率については０．３ｍｌの濾過していない溶液を保持する）。

充填
１０ｍｌのコンビチップを用いて、表９に従って標識された２ｍｌの凍結物を等分する（濾過体積：各製剤について１．２ｍｌ）。

凍結乾燥
１．−８０℃にて１時間、バイアルを凍結する。
２．４０時間凍結乾燥する。
３．凍結乾燥通気は窒素下で行い、バイアルの密栓は４００と６００ｍｂａｒの間の圧力で行われる。

非製剤化のフルオロペプチドを用いたＦＰ−０１．１同等物の調製
６つのフルオロペプチド：ＦＣＰ１、ＦＣＰ８、ＦＣＰ９、ＦＣＰ２、ＦＣＰ４およびＦＣＰ５の各々を０．３５ｍｇを含有する２つのバイアルを調製した。

透過型電子顕微鏡法
逆染色におけるＴＥＭ、２０μｌのフルオロカーボン連結ペプチド溶液は、Ｆｏｒｍｖａｒ炭素被覆された銅電子顕微鏡グリッド（３００メッシュ）に配置される。次に、２０μｌの酢酸ウラニル（１％水性）を添加する。３０秒後、過剰の溶液をＷｈａｔｍａｎ濾紙により素早く取り除く。その後、分析前の少なくとも２分間、試料を乾燥させる。続いて、透過型電子顕微鏡法は、１２０ｋＶの加速電圧でＰｈｉｌｉｐｓ ＣＭ１２０ ｂｉｏｔｗｉｎにより行われる。画像収集は、５００００倍〜１５００００倍までの範囲の直接拡大により行われる。

ＲＰ−ＨＰＬＣ分析
ＨＰＬＣ法：ＦＰ−０１．１
・カラム：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｃ１８：２．１×２５ｍｍ、５μｍ、流速０．３ｍｌ／分。
・溶媒Ａ：９０％水／１０％アセトニトリル／０．０４％ＴＦＡ
・溶媒Ｂ：９０％アセトニトリル １０％水 ０．０４％ＴＦＡ）。
・勾配

結果
製剤化ステップ（凍結乾燥前）
ペプチド分散

ペプチドは容易に溶解し、超音波処理を必要とせず、一方、酢酸８０％に溶解性である２つのペプチドは少なくとも１サイクルの超音波処理を必要とした。

混和／希釈
混和された６つのペプチドの溶液は透明であった（目に見える凝集体はない）。３．３％のマンニトールで希釈しても、溶液は透明のままであった（目に見える凝集体はない）。

濾過回収率
非常に良好な濾過回収率が達成された（各ペプチドについて９９％超）。

透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像
濾過前に形成されたミセルのＴＥＭ分析は、１７〜３０ｎｍの範囲の大きさを有する小さな球状ミセルの均質な集団の存在を示す（図１２）。

化学的安定性（濾過後）
化学的安定性は、Ｔ_０におけるＲＰ−ＨＰＬＣによって、濾過後の２４時間後に決定された。結果を図１３および表１３に示す。

終了したＦＰ−０１．１生成物について行われる分析（凍結乾燥後）
凍結乾燥後のケーキの側面

凍結乾燥生成物は見事な固体の均一なケーキを形成する。

凍結乾燥したＦＰ−０１．１生成物の純度分析
試料を０．７０ｍｌの水において再溶解し、０．５ｍｇ／ペプチドの濃度を得た。凍結乾燥中に分解は起こらず、純度は９７％であった。

凍結乾燥したＦＰ−０１．１の再溶解−非製剤化フルオロペプチドとの比較
ＦＰ−０１．１の生成に適用された製剤化プロセスの恩恵を実証するために、再溶解されたＦＰ−０１．１ワクチン（製剤化されたフルオロペプチド）の質は、非製剤化フルオロペプチドを含有する同等な調製物と比較された。

非製剤化フルオロペプチドに基づくＦＰ−０１．１同等物は、単一バイアルにおいて６つのフルオロペプチドを計量することによって調製された（各ペプチドは０．３５ｍｇである）。非製剤化ＦＰ−０１．１同等物は、０．７ｍｌの水（ＦＰ−０１．１と同等になるように４．５％マンニトールを含有する）または２８ｍＭ Ｌ−ヒスチジン（４．５％マンニトールを含有する）のいずれかを用いて再溶解され、製剤化されたＦＰ−０１．１（上記される製剤化プロセスを通じて得られた）と比較され、同条件下で再溶解された。再溶解された製剤化されたＦＰ−０１．１をＲＰ−ＨＰＬＣによって分析し、分析の結果を図１４に示す。

製剤化されたＦＰ−０１．１生成物は、水において容易に再溶解され、一方、非製剤化ＦＰ−０１．１同等物は不溶性であり、懸濁液中に大きな凝集体を有し、ガラス壁に付着している（図１５参照）。水において再溶解されたＦＰ−０１．１は、非常に僅かに乳白色の均質な溶液をもたらし、目に見える凝集体はない。非製剤化フルオロペプチドは、経時的に、ならびに超音波処理およびボルテックス後でさえ溶解性を達成しない。

同様に、製剤化されたＦＰ−０１．１生成物は、２８ｍＭのＬ−ヒスチジン（臨床生成物が中性ｐＨに到達するよう設計された緩衝液）において容易に再溶解され、一方、非製剤化ペプチドは不溶性である（大きな凝集体の形成）（図１６参照）。水において再溶解されたＦＰ−０１．１は、僅かに乳白色の均質な溶液をもたらし、目に見える凝集体はない。非製剤化フルオロペプチドは、経時的に、ならびに超音波処理およびボルテックス後でさえ溶解性を達成しない。

これらの結果に基づくと、非製剤化フルオロペプチドに基づく生成物は、その乏しい分散性および調製物の均質の欠如に起因して薬学的に許容されるものとは考えられない。

Ｌ−ヒスチジンにおける製剤の浸透圧およびＰＨ

結論
− 全てのフルオロペプチドは分散時点で完全な溶解性を達成した。
− ミセルが形成され、滅菌濾過（２２０ｎｍカットオフ）に適合性がある１７〜３０ｎｍの範囲の大きさを有する。
− 滅菌濾過回収率は全てのフルオロペプチドについて９９％を超えた。
− ＦＰ−０１．１は、その専用の２８ｍＭのＬ−ヒスチジン緩衝システムを用いて容易に再溶解され、中性ｐＨに近く、許容される浸透圧（約３００ｍＯｓｍ）を有する均質な僅かに乳白色の溶液をもたらした。
− 非製剤化フルオロペプチドから得られたＦＰ−０１．１同等調製物は、再溶解が困難であることが実証され、フルオロペプチドは大きな不溶性凝集体を形成し、大部分はガラス壁に付着した。これは、製剤化されたＦＰ−０１．１の再溶解と対比をなし、薬学的に許容される生成物の生成における製剤化プロセスの恩恵を実証する。

ラットにおけるＦＰ０１．１の免疫原性
ＦＰ−０１．１製剤によって生成され得る免疫反応は、ＧＤ ＲＤ００４に従って、ＣＢＳ，Ｓｔ Ｍａｒｙ’ｓ Ｃａｍｐｕｓ，Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅのスタッフメンバーによって、左脇腹下部の筋内に免役されたラットにおいて評価された。

脾細胞の調製
ラットは、本社規定およびＧＤ ＲＤ００４に従って屠殺された。脾臓を回収し（任意の異常な脾臓を撮影した）、単一の細胞懸濁液をＧＤ ＲＤ００７に従って調製し、細胞数をＧＤ ＲＤ００１（ＴｒｕＣｏｕｎｔ Ｍｅｔｈｏｄ）に記載されるように決定した。脾細胞は、完全培地中に１×１０^７個／ｍＬになるように再懸濁させ、ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔおよびＣＢＡ用に播種された。

ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ
刺激のための抗原は、保存から４倍濃度で新鮮に調製し、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ用に２点測定のウェルに播種された。細胞を０．５×１０^６脾細胞／ウェル（５０μＬの細胞懸濁液）で播種し、５０μＬの４倍抗原調製物（即ち、刺激のための個々の長鎖ペプチドおよびＬＰＭＩＸ６）および１００μＬの完全培地を含む（全量＝２００μＬ）。ＥＬＩＳｐｏｔプレートは、加湿環境において、１８時間３７℃にて、５％ＣＯ_２でインキュベートされた。

ペプチドあたり５００μｇ／ｍｌの一定のＦＣＰ濃度を維持する体積によって、３つの用量のＦＰ−０１．１を調整した。１２．５、５０または１００μｇ／ペプチドのＦＰ−０１．１を０日および１４日にＳＤラットにＩＭ注射し、ＦＰ−０１．１からの個々の天然ペプチドとともに１８時間インキュベーション後、ＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴ分析について２４日目にそれらの脾臓を回収した。１２．５μｇ／ペプチドおよび５０μｇ／ペプチド用量は、それぞれ２５μｌおよび１００μｌの体積で単一部位に注射され、一方、１００μｇ／ペプチド用量は、２×１００μｌの体積で２種の部位に注射された。

ＦＰ−０１．１誘導した陽性ＩＦＮ−γ Ｔ細胞応答は、全ての用量レベルで、用量依存的に試験された（図１７）。

ＦＰ０１．１についての臨床試験データ
１日目および２９日目に与えた３つの漸増用量のＦＰ−０１．１（５０、１５０、５００μｇ／ペプチド）およびプラセボは、全４８人の健常個体において、第１相臨床試験における安全性、忍容性および免疫原性について評価された。

ＦＰ−０１．１は、２回の筋内注射後、３つ全てのコホートによって十分に寛容された。ＴＥＡＥ、実験パラメータまたは注射部位反応において、用量依存的関係の明らかな証拠はなかった。対象は、３つのコホートのいずれかにおける第１または第２の暴露のいずれかにおいて、ワクチン接種に対して、いずれかの顕著な局所反応または全身反応を示さなかった。

ワクチン誘導のＴ細胞応答は、エクスビボのＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて評価された。６つの個々のペプチド（ワクチンに含有されるペプチドに対応する）を用いてＰＭＢＣを１８時間刺激した。陽性アッセイ反応は、負の対照ウェルにおけるスポット数の平均＋該平均の２つの標準偏差として定義された。「長鎖ペプチドの合計」を得るために６つのペプチドの各々についてのスポット数を累積し、１００万個の投入ＰＢＭＣあたりのスポット数として表された。

ＦＰ−０１．１は免疫原性であることが実証された。１５０μｇのＦＰ−０１．１用量群は、図１８において観察されるように、２つの他のワクチン用量およびプラセボ群と比較して、高い反応を示す。この用量群において、追加免疫効果は、ペプチドワクチンの頻回注射による追加免疫増幅の概念を支持する第２の注射後に観察される。

Claims (27)

1. 薬学的に許容されるフルオロカーボン連結ペプチド製剤の調製における使用に適した水性酸性製剤であって、第１のフルオロカーボン連結ペプチドを含み、
   （ｉ）フルオロカーボンに連結されたペプチドが、少なくとも２０アミノ酸残基の長さであり、少なくとも５０％の疎水性アミノ酸残基を含み、７以上の等電点を有し；
   （ｉｉ）フルオロカーボン連結ペプチドが、０．２２μｍ未満の直径を有するミセル中に存在する、製剤。
2. 酢酸を含む、請求項１に記載の製剤。
3. ５以下のｐＨを有する、請求項１または２に記載の製剤。
4. ０．２２μｍ未満の直径を有するミセル中に存在する１つまたは複数のさらなるフルオロカーボン連結ペプチドをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の製剤。
5. フルオロカーボン連結ペプチドミセルの少なくとも８０％が、１００ｎｍ未満の直径を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の製剤。
6. さらなるフルオロカーボン連結ペプチドの１つまたは複数が、
   （ｉ）少なくとも２０アミノ酸残基の長さであり；
   （ｉｉ）少なくとも５０％の疎水性アミノ酸残基を含み；および／もしくは
   （ｉｉｉ）７以上の等電点を有する
   ペプチドを含み、ならびに／または
   第１のフルオロカーボン連結ペプチドおよび／もしくはさらなるフルオロカーボン連結ペプチドの１つもしくは複数が、
   （ｉｖ）フルオロカーボンから遠位の少なくとも１５個の連続アミノ酸において正に荷電したアミノ酸を含み；かつ／または
   （ｖ）８０％を超える疎水性アミノ酸残基を含む２０アミノ酸残基の連続配列を含まない
   ペプチドを含む、請求項４または５に記載の製剤。
7. フルオロカーボンに連結されたペプチドが、
   （ｉ）７未満の等電点を有し；
   （ｉｉ）フルオロカーボンから遠位の少なくとも１５個の連続アミノ酸において正に荷電したアミノ酸を含まず；かつ／または
   （ｉｉｉ）８０％を超える疎水性アミノ酸残基を含む２０アミノ酸残基の連続配列を含む
   フルオロカーボン連結ペプチドを含まない、請求項１から６のいずれか一項に記載の製剤。
8. フルオロカーボンに連結されたペプチドが、病原体、自己タンパク質または腫瘍細胞由来の免疫原性ペプチドである、請求項１から７のいずれか一項に記載の製剤。
9. フルオロカーボンに連結されたペプチドが配列番号１〜６に記載される配列を有する６つのフルオロカーボン連結ペプチドを含み、他のフルオロカーボン連結ペプチドを含まない、請求項１から８のいずれか一項に記載の製剤。
10. 薬学的に許容されるフルオロカーボン連結ペプチド製剤を得るための方法であって、
    （ｉ）フルオロカーボン連結ペプチドを酢酸中に可溶化するステップ；
    （ｉｉ）可溶化されたフルオロカーボン連結ペプチドを濾過滅菌するステップ；および
    （ｉｉｉ）濾過滅菌されたフルオロカーボン連結ペプチドを乾燥させるステップ
    を含む方法。
11. フルオロカーボンに連結されたペプチドが、少なくとも２０アミノ酸残基の長さであり、少なくとも５０％の疎水性アミノ酸残基を含み、かつ７以上の等電点を有する、請求項１０に記載の方法。
12. （ｉ）フルオロカーボン連結ペプチドと１つまたは複数のさらなるフルオロカーボン連結ペプチドとの混合物が酢酸中に可溶化され；かつ／または
    （ｉｉ）可溶化されたフルオロカーボン連結ペプチドと１つまたは複数のさらなる可溶化されたフルオロカーボン連結ペプチドとを混和するステップをさらに含む、
    請求項１０または１１に記載の方法。
13. 酢酸が５〜８０％（ｖ／ｖ）の酢酸水溶液である、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 可溶化されたフルオロカーボン連結ペプチドが凍結乾燥によって乾燥される、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 乾燥されたフルオロカーボン連結ペプチドを水性相において再溶解するステップをさらに含む、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 薬学的に許容される担体、賦形剤および／またはアジュバントがステップ（ｉｉ）の前に添加される、請求項１０から１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 乾燥または再溶解されたフルオロカーボン連結ペプチドを滅菌容器中に保存するステップをさらに含む、請求項１０から１６のいずれか一項に記載の方法。
18. フルオロカーボンに連結されたペプチドが、病原体、自己タンパク質または腫瘍細胞由来の免疫原性ペプチドである、請求項１０から１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 請求項１０から１８のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる製剤。
20. フルオロカーボンに連結されたペプチドが配列番号１〜６に記載される配列を有する６つのフルオロカーボン連結ペプチドを含み、他のフルオロカーボン連結ペプチドを含まない、薬学的に許容される製剤。
21. 薬学的に許容される担体または賦形剤および／またはアジュバントをさらに含む、請求項２０に記載の製剤。
22. 治療によってヒトまたは動物体を処置する方法において使用するための、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の製剤。
23. 病原体感染、自己免疫疾患または癌を処置または予防する方法において使用するための、請求項１９に記載の製剤。
24. インフルエンザを処置または予防する方法において使用するための、請求項２０または２１に記載の製剤。
25. 前記方法が、季節性インフルエンザワクチンと併用して前記製剤を投与するステップを含む、請求項２４に記載の使用するための製剤。
26. 病原体感染、自己免疫疾患または癌を処置または予防する方法において使用するための医薬の製造における、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の製剤の使用。
27. 病原体感染、自己免疫疾患または癌を処置または予防する方法であって、有効量の請求項１９から２１のいずれか一項に記載の製剤をそれを必要とする個体に投与するステップを含む方法。