JP2014506565A - ダイニンのキナゾリノン阻害剤 - Google Patents

Abstract

Ｒ^３が、水素原子、シアノ基、ニトロ基、アセチル基及び−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２から選択され、Ａｒが、場合により置換されていることのある単環式又は二環式アリール基又はヘテロアリール基である式（１）で表される化合物は、抗腫瘍剤として有用である。

Description

関連出願に関する相互参照

本出願は、米国仮出願第６１／４３４５４５号（２０１１年１月２０日出願）の優先権を主張する。前記出願の全開示は参照することにより本明細書に組み込まれる。

《連邦政府による資金提供を受けた研究》
以下の発明は、米国国立がん研究所及び国立衛生研究所によって授与された契約番号Ｒ０１＿ＣＡ１３６５７４、Ｒ０１＿ＧＭ７１７７２、及びＲ０１＿ＧＭ６５９３３の下で、米国政府支援によりなされたものである。米国政府は、この発明において一定の権利を有する。

《発明の分野》
本発明は、ＡＡＡ^＋ＡＴＰａｓｅファミリーのメンバーの選択的阻害剤である４−オキソ−３，４−ジヒドロキナゾリン−２（１Ｈ）−イリデン誘導体に関する。本化合物は、抗腫瘍剤として、そしてダイニンに依存するシステムの機能のプローブとして有用である。

《発明の背景》
ＡＡＡ^＋ファミリー（多様な細胞の活動に関係するＡＴＰａｓｅ）に属する酵素は、ＡＴＰの加水分解によって、原核生物と真核生物の生物学上の多様な側面を調節するための機械的な力を発生させる。これらの複合タンパク質は、一般的にはリングの形状をし、中心孔を有する６量体を形成しており、これらの分子機械を増加させるＡＴＰ依存性配座転移は、ＤＮＡの複製、オルガネラの発生及び小胞輸送の間の膜融合複合体の分解、微小管に沿った細胞内物質の運搬、及びタンパク質分解のためのタンパク質アンフォールディングの促進を行うことができる。ＡＡＡ^＋ＡＴＰａｓｅファミリーのサブクラスの一つは、ダイニン１及びダイニン２を含む。細胞質ダイニン１は、ダイナクチン及び核タンパク質であるＮｕＭＡと複合体を形成し、有糸分裂の紡錘体の内部に微小管のマイナス末端を集中させるという働きを行う。これらの働きが、紡錘状の形状を形成し、γ−チューブリン及び微小管と核の複合体を紡錘体極へ局在させる。抗体のブロック又はドミナントネガティブ構築を原因とする細胞質内ダイニン１の阻害は、有糸分裂を攪乱し、γ−チューブリンの漸増が止まり、微小管末端の規則正しさが失われる結果となる。ダイニン２は、一次繊毛内のタンパク質輸送メカニズムに不可欠であり、一次繊毛において軸糸に沿った高分子の動きに関係している。繊毛内の逆行性輸送に、細胞質ダイニン２とＩＦＴＡ複合体が利用されている。小分子ＡＡＡ^＋ＡＴＰａｓｅ阻害剤は、迅速かつ可逆的に作用することができるものが、ダイニンの機能のプローブとしても、将来的な抗腫瘍剤としても特に必要とされている。

《発明の要約》
或る観点においては、本発明は、式Ｉ：

［式中、
Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ、独立して、水素原子、ハロゲン原子、（Ｃ_１〜Ｃ_１０）炭化水素基、−Ｏ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基、フルオロ（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基、−Ｏ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）フルオロアルキル基、水酸基、メチレンジオキシ基、エチレンジオキシ基、−ＣＮ、ニトロ基、−Ｓ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルコキシカルボニル基、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アシル基、アミノ基、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルアミノ基、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アシルアミノ基、及び−Ａ-Ｒ^１０から選択され；；、ここで、Ａは、（Ｃ_１〜Ｃ_６）炭化水素であり、Ｒ^１０は、−Ｏ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基、フルオロ（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基、−Ｏ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）フルオロアルキル基、水酸基、−ＣＮ、ニトロ基、−Ｓ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルコキシカルボニル基、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アシル基、アミノ基、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルアミノ基及び（Ｃ_１〜Ｃ_６）アシルアミノ基から選択され；；
Ｒ^３は、水素原子、シアノ基、ニトロ基、アセチル基及び−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２から選択され；
Ｒ^４及びＲ^５は、それぞれ、独立して、水素原子及びメチル基から選択され；
Ｙは、Ｏ又はＮＲ^８であり；
Ｒ^８は、水素原子及び（Ｃ_１〜Ｃ_７）炭化水素から選択され、
Ａｒは、場合により置換されていることのある単環式又は二環式アリール基又はヘテロアリール基である］
で表される化合物に関する。

別の観点においては、本発明は固形腫瘍に式（Ｉ）で表される化合物を接触させることを含む、固形腫瘍の成長を阻害する方法に関する。

別の観点においては、本発明はダイニンに式（II）

（式中、
Ｒ^１ａは、水素原子又はハロゲン原子であり；
Ｒ^６及びＲ^７は、ハロゲン原子である）
で表される化合物を接触させることを含むダイニンを阻害する方法に関する。

別の観点においては、繊毛の少なくとも一つを有する細胞に式（II）で表される化合物を接触させることを含む繊毛の逆行性輸送を阻害する方法に関する。

図１は、本発明の２つの実施例に関して、薬剤濃度の関数として、繊毛サイズを表した棒グラフである。

《発明の詳細な説明》
本発明による抗腫瘍性化合物は、２つの主要な種類に分類される：一般式（１）で表される化合物は、ヘッジホッグシグナル伝達を阻害することにより、腫瘍の成長を阻害する。亜属（II）は、ダイニンを選択的に阻害し、腫瘍の成長も阻害するが、異なったメカニズムを有する。ヘッジホッグシグナル伝達の阻害は、インビボにおける固形腫瘍、特に基底細胞癌、悪性腫瘍及び髄芽腫の治療に有効であることが示されてきた。例えば、Ｒｕｄｉｎ ｅｔ ａｌ．［Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ ３６１，１１７３−１１７８（２００９）］が示すところによると、ヘッジホッグ経路の小分子阻害剤であるＧＤＣ−０４４９を患者に投与すると、髄芽腫が退縮する結果となる。同様に、Ｖｏｎ Ｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．［Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ ３６１，１１６４−１１７２（２００９）］は、基底細胞癌を有する３３名のヒト患者にＧＤＣ−０４４９を投与して、臨床的に有意な応答を観察した。

或る観点においては、本発明は式（Ｉ）で表される化合物に関する。

これらの化合物ではＲ^１及びＲ^２は、それぞれ、独立して、水素原子、ハロゲン原子、（Ｃ_１〜Ｃ_１０）炭化水素基、−Ｏ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基、フルオロ（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基、−Ｏ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）フルオロアルキル基、水酸基、メチレンジオキシ基、エチレンジオキシ基、−ＣＮ、ニトロ基、−Ｓ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルコキシカルボニル基、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アシル基、アミノ基、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルアミノ基、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アシルアミノ基、及び−Ａ-Ｒ^１０から選択され；；、ここで、Ａは、（Ｃ_１〜Ｃ_６）炭化水素であり、Ｒ^１０は、−Ｏ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基、フルオロ（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基、−Ｏ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）フルオロアルキル基、水酸基、−ＣＮ、ニトロ基、−Ｓ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルコキシカルボニル基、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アシル基、アミノ基、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルアミノ基及び（Ｃ_１〜Ｃ_６）アシルアミノ基から選択される。いくつかの実施態様においては、Ｒ^２は、Ｈであり、そして、Ｒ^１は、Ｈ、ハロゲン原子、メトキシ基、アミノプロパルギル基及びアセトアミドプロパルギル基から選択される。いくつかの実施態様においては、Ｒ^１は、水素原子又はハロゲン原子である。

属（Ｉ）の化合物では、Ｒ^３は、水素原子、シアノ基、ニトロ基、アセチル基又は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２であることができる。いくつかの実施態様においては、Ｒ^３は、シアノ基である。

属（Ｉ）の化合物では、Ｒ^４及びＲ^５は、水素原子又はメチル基であることができ；そして、多くの実施態様においては、ともに水素原子である。

式（Ｉ）で表される化合物は、Ｙの値により二種類の亜属に分類することができ、一方の亜属では、ＹはＮＲ^８であり；もう一方の亜属においては、ＹはＯである。

属（Ｉ）の化合物［例えば、構造式（Ｉａ）及び（Ｉｂ）］では、Ａｒは、場合により置換されていることのある単環式若しくは二環式アリール基又は単環式若しくは二環式ヘテロアリール基から選択される。場合により置換されていることのあるアリール基やヘテロアリール基の例としては、例えば、フェニル基、ナフチル基、イミダゾール、ピリジン、インドール、チオフェン、ベンゾピラノン、チアゾール、フラン、ベンゾイミダゾール、キノリン、イソキノリン、キノキサリン、ピリミジン、ピラジン、テトラゾール及びピラゾールがある。いくつかの実施態様においては、Ａｒはフェニル基、ナフチル基、チオフェニル基、フラニル基、ピロリル基、ピリジニル基から選択され、それらのうちのいくつかは、場合により、置換基がハロゲン原子、（Ｃ_１〜Ｃ_１０）炭化水素基、フルオロ（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基、−Ｏ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）フルオロアルキル基、−ＣＮ、ニトロ基、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルコキシカルボニル基及び（Ｃ_１〜Ｃ_６）アシル基から独立して選択された置換基１〜３個で置換されたものであることができる。いくつかの実施態様においては、Ａｒは、ハロゲン原子１〜３個で置換されたフェニル基であることができる。いくつかの実施態様においては、Ａｒは、２，４−ジクロロフェニル又は３，４−ジクロロフェニルである。（４）では、いくつかの実施態様においては、Ｒ^８は水素原子又はメチル基である。

いくつかの実施態様においては、Ｒ^３は、ＣＮであり；Ｒ^２、Ｒ^４及びＲ^５は、Ｈであり；Ｒ^１は、Ｈ及びハロゲン原子から選択される。いくつかの実施態様においては、Ｒ^３は、ＣＮであり；Ｒ^２、Ｒ^４及びＲ^５は、Ｈであり；Ｒ^１は、Ｈ及びハロゲン原子から選択され、そして、Ａｒは、ハロゲン原子１〜３個で置換されたフェニル基である。これらの中でも、式（II）

（式中、Ｒ^１ａは、水素原子又はハロゲン原子であり；そしてＲ^６及びＲ^７がハロゲン原子である）
で表される化合物は、ダイニン阻害に関して選択的である。

前述の親属及びその亜属を含む全ての化合物は、ヘッジホッグ経路及び／又はダイニンのモジュレーターとして有用である。しかし、全ての化合物が新規であるわけではない。特に、文献調査によると、Ａｒが、２，４−ジクロロフェニルであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４及びＲ^５が、水素原子である場合は、Ｒ^３が、シアノ基である化合物は、権利を請求することができない［ＰＣＴ ＷＯ２００９／１０２８６４，５３ページ，構造式１８参照］。審査の結果、本明細書で除外されていない追加の種や亜属が、本件発明者に対して特許可能でないことが見出されるかもしれない。この場合において、その結果生じた出願人の特許請求の範囲からの種や亜属の除外は、特許審査手続の人為的結果であり、本件発明者の発明に対する概念や記載を反映したものと見なされるべきではない。本発明は、構成物の態様において、公共の所有物であるものを除き、式（Ｉ）で表される全ての化合物を包含する。

《定義》
この明細書の全体にわたり、用語及び置換基は、その定義を保持する。

アルキル基は、直鎖状、分岐状、又は環状炭化水素構造及びその組み合わせを含むことを意味する。組み合わせは、例えば、シクロプロピルメチル基であろう。全ての炭素が必ずｓｐ^３であり、ｓｐ^２又はｓｐである炭素が一つもない全ての炭化水素基は、アルキル基であるとみなされる。完全に明確にするために述べると、置換基が（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基であるとする場合、これは、直鎖（例えばメチル又はエチル）、分子鎖（例えばｔ−ブチル）、シクロアルキル（例えばシクロプロピル又はシクロブチル）又はこれらの組み合わせ（例えばメチルシクロプロピル）であることを意味する。しかしながら、置換基をより具体的に説明する場合には、以下の定義となる；例えば、シクロアルキル基との記載は、環状アルキル基を示し、直鎖状アルキル基又はこれらの組み合わせを含まない。低級アルキル基との記載は、炭素原子１〜６個のアルキル基を示す。低級アルキル基の例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ブチル基、ｓ−及びｔ−ブチル基、及びシクロブチル基などが挙げられる。好ましいアルキル基は、Ｃ_２０又はそれ未満のアルキル基である。シクロアルキル基はアルキル基の下位集合であり、シクロアルキル基としては炭素原子３〜８個の環状炭化水素基が挙げられる。シクロアルキル基の例としては、ｃ−プロピル基、ｃ−ブチル基、ｃ−ペンチル基、及びノルボルニル基、アダマンチル基などが挙げられる。

アルコキシ基又はアルコキシル基は、親構造に酸素原子を介して結合している炭素原子１〜８個の直鎖状、分岐状、又は環状構造及びその組み合わせのアルキル基を指す。例としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、シクロプロピルオキシ基、及びシクロヘキシルオキシ基などが挙げられる。低級アルコキシ基は、１〜４個の炭素原子を含有する基を指す。

アリール基及びヘテロアリール基は、５若しくは６員の芳香環基又はＯ、Ｎ、若しくはＳから選択されるヘテロ原子を０〜３個含有する５若しくは６員の芳香族複素環基；二環式９若しくは１０員の芳香環系基又はＯ、Ｎ、若しくはＳから選択されるヘテロ原子を０〜３個含有する二環式９若しくは１０員の芳香族複素環系基；あるいは、三環式１３若しくは１４員の芳香環系基又はＯ、Ｎ、若しくはＳから選択されるヘテロ原子を０〜３個含有する三環式１３若しくは１４員の芳香族複素環系基を意味する。芳香族６〜１４員の炭素環式環としては、例えば、ベンゼン、ナフタレン、インダン、テトラリン、及びフルオレンが挙げられ、５〜１０員の芳香族複素環式環としては、例えば、イミダゾール、ピリジン、インドール、チオフェン、ベンゾピラノン、チアゾール、フラン、ベンゾイミダゾール、キノリン、イソキノリン、キノキサリン、ピリミジン、ピラジン、テトラゾール及びピラゾールが挙げられる。本明細書で使用されるアリール基及びヘテロアリール基は、１以上の環が芳香族であるが、全てが芳香族である必要はない残基を指す。

アリールアルキル基は、アルキル残基と結合したアリール環を意味し、親構造体への結合地点がアルキルを介したものである。例としては、ベンジル、フェネチルなどが挙げられる。ヘテロアリールアルキル基は、アルキル残基を介して親構造体に結合したヘテロアリール環を意味する。例としては、例えば、ピリジニルメチル基、ピリジニルエチル基などが挙げられる。

Ｃ_１〜Ｃ_１０炭化水素基は、元素構成としては水素原子及び炭素原子のみからなる直鎖状、分岐状又は環状の残基を意味し、アルキル基、シクロアルキル基、ポリシクロアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基及びその組み合わせが挙げられる。例としては、ベンジル基、フェネチル基、シクロヘキシルメチル基、シクロプロピルメチル基、シクロブチルメチル基、アリール基及びカンホリル基が挙げられる。

特に説明のない限り、用語「炭素環」は、環原子が全て炭素であるが、任意の酸化状態でなる環系を含むことを意味する。このように、（Ｃ_３〜Ｃ_１０）炭素環とは、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、ベンゼン、シクロヘキセン及びシクロヘキサジエンなどの系統を含む非芳香族及び芳香族の両方を意味し；（Ｃ_８〜Ｃ_１２）多炭素環とは、ノルボルナン、デカリン、インダン、アダマンタン及びナフタレンなどの系統を意味する。炭素環は、他の方法で制限されない限りは、単環、二環及び多環を意味する。

複素環基は、１〜３個の炭素原子が、酸素原子、窒素原子若しくは硫黄原子などのヘテロ原子により置き換えられているシクロアルキル又はアリール残基を意味する。ヘテロアリール基は、複素環基の下位集合を形成する。複素環の例としては、ピロリジン、ピラゾール、ピロール、イミダゾール、インドール、キノリン、イソキノリン、テトラヒドロイソキノリン、ベンゾフラン、ベンゾジオキサン、ベンゾジオキソール（置換基として存在するときは、一般にメチレンジオキシフェニル基という）、テトラゾール、モルホリン、チアゾール、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、チオフェン、フラン、オキサゾール、オキサゾリン、イソオキサゾール、ジオキサン、及びテトラヒドロフランなどが挙げられる。

本明細書で用いる用語「場合により置換されていることのある」とは、「置換された又は置換されていない」のどちらででも用いることができる。用語「置換された」は、特定の基の水素原子の１以上が、特定の遊離基に置換されることを意味する。例えば、置換されたアルキル基、アリール基、シクロアルキル基、そして、ヘテロシクリル基などは、アルキル基、アリール基、シクロアルキル基又はヘテロシクリル基の中の各残基中の水素原子の１以上が、ハロゲン原子、ハロアルキル基、アルキル基、アシル基、アルコキシアルキル基、ヒドロキシ低級アルキル基、カルボニル基、フェニル基、ヘテロアリール基、ベンゼンスルホニル基、水酸基、低級アルコキシ基、ハロアルコキシ基、オキサアルキル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基［−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル基］、アルコキシカルボニルアミノ基［ＨＮＣ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル基］、カルボキシアミド基［−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−ＮＨ_２］、アルキルアミノカルボニル基［−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−アルキル基］、シアノ基、アセトキシ基、ニトロ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、（アルキル）（アリール）アミノアルカリ基、アルキルアミノアルキル基（シクロアルキルアミノアルキル基を含む）、ジアルキルアミノアルキル基、ジアルキルアミノアルコキシ基、ヘテロシクリルアルコキシ基、メルカプト基、アルキルチオ基、スルホキシド基、スルホン基、スルホニルアミノ基、アルキルサルフィニル基、アルキルサルフォニル基、アシルアミノアルキル基、アシルアミノアルコキシ基、アシルアミノ基、アミジノ基、アリール基、ベンジル基、ヘテロシクリル基、ヘテロシクリルアルキル基、フェノキシ基、ベンジルオキシ基、ヘテロアリールオキシ基、ヒドロキシイミノ基、アルコキシイミノ基、オキサアルキル基、アミノスルホニル基、トリチル基、アミジノ基、グアニジノ基、ウレイド基、ベンジルオキシフェニル基、そして、ベンジルオキシ基に置換されたものを意味する。「オキソ」はまた、「場合により置換されていることのある」を意味する置換基の中に含まれる；オキソは、２価の遊離基であるので、置換基（例えばフェニル基）としては適切ではない状況があることを当業者は理解するであろう。「場合により置換されていることのある」残基の大抵のケースは、水素原子の１，２又は３個が、特定の遊離基に置き換えられているものであるが、フルオロアルキル残基のケースにおいては、水素原子の３個以上がフッ素に置換されることができ；加えて、全ての利用可能な水素原子が、フッ素に置換されることができる、例えばペルフルオロプロピルである。

本明細書に記載の化合物は、側鎖に１以上の不斉中心を含有し、従って、絶対立体化学の観点から（Ｒ）−又は（Ｓ）−と定義することのできる鏡像異性体、ジアステレオマー、及びその他の立体異性体を生じる可能性がある。本発明は、全てのそのような可能な異性体、並びにそれらのラセミ体及び光学的に純粋な形態を含むことを意味する。光学的に活性な（Ｒ）−、及び（Ｓ）−異性体は、キラルシントン又はキラル試薬を使用して調整することができ、又は従来技術を用いて分割することができる。本明細書に記載する化合物が、オレフィン二重結合又は他の幾何学的不斉中心を含む場合は、特に説明のない限り、その化合物は、Ｅ及びＺの両方の幾何異性体を含むことを意味する。同様に、全ての互変異性体もまた含まれることを意味する。

本明細書で用いている「化合物」の記載は、明示的にさらに限定しない限りは、その化合物の塩を含むことを意味することを、当業者は理解するであろう。特定の実施形態では、用語「式（I）で表される化合物」は、化合物又はその化合物の薬学的に許容される塩を意味する。

本発明の化合物は、放射性同位体で標識された形で存在することができるものと理解されたい。すなわち、本発明の化合物は、通常天然で見出される原子量若しくは原子番号と異なる原子量若しくは原子番号を含む原子を１以上含むことができる。あるいは、単一構造の多くの分子は、天然で見出される同位体比とは異なる同位体比で発生する少なくとも１つの原子を含むことができる。水素、炭素、リン、フッ素、塩素及びヨウ素には、例えば、^２Ｈ、^３Ｈ、^１１Ｃ、^１３Ｃ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^３５Ｓ、^１８Ｆ、^３６Ｃｌ、^１２３Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１３３Ｉが含まれる。これらの放射性同位体及び／又は他の原子の他の同位元素を含む化合物は、本発明の範囲内である。^３Ｈ、^１４Ｃ及びヨウ素の放射性同位体を含む化合物は、それらの調整及び検出の容易さから、特に好ましい。^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ及び^１８Ｆの同位体を含む化合物は、ポジトロン断層法に大変適している。本発明の式（Ｉ）及び式（II）で表される放射標識化合物は、一般的に、当業者にとって周知の方法によって調製することができる。容易に、入手可能な放射標識された試薬を放射標識されていない試薬に代えて使用することで、そのような放射標識化合物は、開示された実施例及びスキームの手順を行うことにより、簡便に調整することができる。

本発明は、多くの異なる形態にある実施態様になり得るが、本発明の好ましい実施態様を説明する。しかしながら、この開示は本発明の原理の例示とみなされるべきであり、説明される実施態様の説明に本発明を限定することを意図していないことは理解されるべきである。

インビボにおいて、式（Ｉ）及び式（II）で表される化合物が、抗腫瘍薬として用いられる場合に、それは未加工の化学物質として投与されるが、医薬組成物としてそれらを提供することが好ましい。更なる実施態様においては、本発明は、式（Ｉ）若しくは式（II）で表される化合物、又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物、薬学的に許容可能な担体の１又はそれ以上、及び場合によっては、他の治療成分の１又はそれ以上を含む医薬組成物を提供する。担体は、製剤の他成分と適合し、その受容者にとって有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。組成物は、経口、局所又は非経口投与用に製剤化することができる。例えば、静脈内、動脈内、皮下、そして、直接、中枢神経系−髄腔内若しくは脳室内のどちらかに投与されてもよい。

製剤は、経口又は非経口（皮下、皮内、筋肉内、静脈内及び関節内を含む）に適したもの、直腸又は局所（皮膚頬、舌下及び眼内を含む）投与に適したものを含む。化合物は、好ましくは経口で又は注射（静脈又は皮下）で投与される。患者への正確な投与量は、主治医が権限を有する。しかしながら、用いられる投与量は、患者の年齢及び性別、治療されている正確な疾患及び重症度など多くの要因に依存する。また、投与経路は、その重症度の状態に応じて変わる可能性がある。製剤は、便利なことに単位剤形で提供され、薬学の分野についての当業者にとって周知な方法で調整される。一般的には、活性成分を液体担体又は微粉個体担体と均一かつ十分に混合することにより製剤を製造し、次いで、必要であれば、望ましい製剤に形成する。

本発明の経口投与に適した製剤は、それぞれが活性成分の規定量を含むカプセル剤、カシェ剤、又は錠剤のように分離した単位で、又は水中油型液体エマルジョン若しくは油中水型液体エマルジョンとして提供することができる；粉末又は顆粒として提供でき；水性液体若しくは非水性液体中の液剤又は懸濁液として提供することができる；活性成分は、ボーラス、舐剤又はペーストとしても提供することができる。

錠剤は、場合により、補助成分の１つ以上とともに、圧縮又は成形によって作製することができる。圧縮錠は、場合により、結合剤、潤沢剤、不活性希釈剤、潤滑剤、表面活性剤若しくは分散剤と混合された流動型の粉剤又は顆粒剤を、適切な機械で圧縮することにより調整することができる。成形錠剤は、粉末化した化合物を不活性液体希釈剤で湿らせ、適切な機械において成形することにより調整することができる。錠剤は、場合により、その中の活性成分の放徐又は制御放出のために、コーティングし、又は割線を入れることができる。

非経口投与用製剤は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤及び意図されたレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含むことができる水性及び非水性の滅菌注射剤、並びに、沈殿防止剤や増粘剤を含むことができる水性及び非水性の滅菌懸濁液を含むことができる。製剤は、単位用量又は複数回用量容器、例えば、密封アンプル及びバイアルに入れてもよく、滅菌液体担体、例えば、生理食塩液、リン酸緩衝水溶液（ＰＢＳ）などを使用直前に加えるだけでよいフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存してもよい。即時調合注射溶液及び懸濁液は、前述の種類の無菌の粉末、顆粒及び錠剤から調製してもよい。

直腸投与用製剤には、カカオバター又はポリエチレングリコールのような標準的な担体を含む坐剤を含むことができる。

口内への、例えば口腔内又は舌下への局所投与用製剤には、ショ糖及びアカシア又はトラガカントのような着香基剤に活性成分を含むトローチ剤、並びにゼラチンとグリセリン又はショ糖とアカシアのような基剤に活性成分を含む香錠が含まれる。

好ましい単位投与製剤は、下記に引用するように、活性成分の有効量又はその適当な分画を含む製剤である。

上記で特に言及した成分の他に、本発明の製剤には、当該製剤のタイプに関して当技術分野において通常の他の薬剤が含まれてもよいと理解すべきであり、例えば経口投与に適した製剤は、着香料を含んでもよい。

本明細書中で使用される用語「治療すること」若しくは「治療」、又は「緩和すること」又は「改善すること」は、有益な又は望んだ結果を獲得するためのアプローチを意味しており、治療効果や予防効果に限られるものではない。治療効果によってとは、治療されている基礎疾患の根絶又は改善を意味する。また、改善が患者において観察されるような基礎疾患に関連付けられた生理学的システムのうちの１以上の根絶又は回復で、治療効果が達成される。それにもかかわらず、患者は基礎疾患に苦しむことになる可能性がある。この疾患の診断がなされていない場合でも、予防効果のために、組成物は、特定の疾患を発症するリスクのある患者に、又は疾患の生理学的なシステムの１つ以上を報告する患者に投与することができる。

《略語》

以下の略語及び用語は、全体にわたり指示された意味を有する：
Ａｃ ＝ アセチル
Ｂｏｃ ＝ ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＢＯＰ ＝ ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）
ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
Ｂｕ ＝ ブチル
ＢＳＡ ＝ ウシ血清アルブミン
ｃ− ＝ シクロ
ＤＣＭ ＝ ジクロロメタン＝塩化メチレン＝ＣＨ_２Ｃｌ_２
ＤＩＥＡ ＝ ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＥＭ ＝ ダルベッコ変法イーグル培地
ＤＭＦ ＝ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ＝ ジメチルスルホキシド
ＤＴＴ ＝ ジチオトレイトール
ＥｔＯＨ ＝ エタノール
ＧＣ ＝ ガスクロマトグラフィー
ＨＯＡｃ ＝ 酢酸
Ｍｅ ＝ メチル
ＭＴＢＥ ＝ メチルｔ−ブチルエーテル
ＰＢＳ ＝ リン酸緩衝水溶液
ＰＥＧ ＝ ポリエチレングリコール
ＰＭＳＦ ＝ フッ化フェニルメタンスルホニル
Ｐｈ ＝ フェニル
ＰｈＯＨ ＝ フェノール
ＰＶＤＦ ＝ ポリフッ化ビニリデン
ｒｔ ＝ 室温
ｓａｔ’ｄ ＝ 飽和
ｓ− ＝ 第二級
ＳＤＳ ＝ ドデシル硫酸ナトリウム
ｔ−又はｔｅｒｔ−＝ 第三級
ＴＢＤＭＳ ＝ ｔ−ブチルジメチルシリル
ＴＦＡ ＝ トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ ＝ テトラヒドロフラン
ＴＭＳ ＝ トリメチルシリル
ｔｏｓｙｌ ＝ ｐ−トルエンスルホニル

ＡＡＡ^＋ＡＴＰａｓｅによる、化学ポテンシャルエネルギーの機械的な力への変換は、背景の部分で述べたように、無数の細胞プロセスに不可欠である。このタンパク質ファミリーの動的な機能の調査は、小分子モジュレーターに利するであろうが、これらの複合体、オリゴマーの機械酵素の阻害剤は、とらえどころのないままである。本出願では、ＡＡＡ^＋ＡＴＰａｓｅファミリーの一部の選択的阻害剤として働く４−オキソ−３，４−ジヒドロキナゾリン−２（１Ｈ）−イリデン誘導体について述べる。モータータンパク質である細胞質ダイニンの選択的阻害剤である、発明者が「シリオブレビン（ｃｉｌｉｏｂｒｅｖｉｎｓ）」と呼ぶ亜属についても述べる。シリオブレビンは、一次繊毛内の輸送を攪乱させ、これが繊毛の形成異常とヘッジホッグ経路の調節のような繊毛に依存した機能を抑止させることを、我々は開示する。シリオブレビンはまた、有糸分裂における紡錘体極への微小管の集中や、黒色細胞中のメラノソーム凝集を阻害する。これらの細胞表現型は、細胞質ダイニン１及び２の薬学的阻害と一貫しており、本明細書では、インビトロにおけるダイニンに依存した微小管上滑走運動を選択的に阻害するシリオブレビンの能力について述べる。それらは、インビトロにおける抗腫瘍剤として有用である他、シリオブレビンは、この微小管のマイナス末端方向への分子モーターを用いて細胞プロセスを研究するための有用な試薬であり、そしてそれが、さらなるＡＡＡ^＋ＡＴＰａｓｅファミリー阻害剤の開発につながる可能性がある。

セルベースの小分子の表現型スクリーニングは、複雑な細胞機能の小分子モジュレーターを発見するための効果的なテクニックである。胚発生、幹細胞の自己複製及び腫瘍形成の鍵となる媒介物であるヘッジホッグ経路（Ｈｈ）阻害剤のためのハイスループットスクリーニングは、Ｇタンパク質結合受容体様ＨｈシグナルトランスデューサーであるＳＭｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）の下流で作用する化合物を特定するために設計されており、多くのジヒドロキナゾリノンが、Ｈｈ標的遺伝子発現を誘導するＧｌｉ転写因子の負調節因子であるＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｆｕｓｅｄ（Ｓｕｆｕ）を欠いた細胞内でＨｈ経路活性を遮断することを確認した。

《合成》
実施例２４のベンゾイルジヒドロキナゾリノンは、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅから購入し；他の全ての構造誘導体は、下記の方法によって合成された。有機合成に使用された全ての化学物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ又はＡｃｒｏｓから購入し、さらに精製をせずに使用された。無水条件は、シュレンクライン技術とオーブン乾燥ガラスを用いて、窒素条件下で維持された。^１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｏｖａ ３００、４００及び５００スペクトラメーターを用いて、重溶媒としてＤＭＳＯ−ｄ_６を使用して得られた。化学シフトは、溶媒であるＤＭＳＯのピークのダウンフィールドとして、百万分率（ｐｐｍ）単位で報告された。高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）データは、スタンフォード大学の質量分析施設において、ＭｉｃｒｏｍａｓｓのＱ−ＴＯＦ型ハイブリッド四重極液体クロマトグラフィー質量分析装置により得られた。

実施例１：３−（２，４−ジクロロフェニル）−３−オキソ−２−（４−オキソ−３，４−ジヒドロキナゾリン−２（１Ｈ）−イリデン）プロパンニトリル［シリオブレビンＡ］

２−シアノエタンチオアミド（１．００ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）とブロモエタン（８２１μＬ，１１．０ｍｍｏｌ）に、ナトリウムエトキシドのエタノール溶液（１１．５ｍｍｏｌ，５．３ｍＬ）が添加された。得られた混合物は、６時間撹拌され、２−アミノ安息香酸（１．５０ｇ，１０．９ｍｍｏｌ）を添加され、撹拌しながら一晩還流された。反応混合物の冷却時に混合形成された固体沈殿物は、真空濾過により回収され、エタノール、水、エタノール、及びジエチルエーテルで順次洗浄された。固体は、次いで、２−（４−オキソ−３，４−ジヒドロキナゾリン−２−イル）アセトニトリル（８７２ｍｇ，４７％）を得るために乾燥された。^１ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）σｐｐｍ４．１７（ｓ，２Ｈ）、７．５３（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ）、７．６８（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ）、７．８３（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）、８．１０（ｄｄ，Ｊ_１＝７．９Ｈｚ，Ｊ_２＝１．２Ｈｚ，１Ｈ）。

ジオキサン（８ｍＬ）中に２−（４−オキソ−１，４−ジヒドロキナゾリン−２−イル）アセトニトリル（２０２ｍｇ，１．０９ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１６７μＬ，１．２０ｍｍｏｌ）を含む溶液に、塩化２．４−ジクロロベンゾイル（１５２μＬ，１．０９ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を、撹拌しながら一晩還流した。反応混合物の冷却時に形成された固体沈殿物は、真空濾過により回収され、メタノール、水、メタノール、及びジクロロメタンで順次洗浄された。固体を次いで、シリオブレビンＡ（１）（２１３ｍｇ，５３％）を得るために乾燥させた。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）σｐｐｍ７．４６−７．５０（ｍ，１Ｈ）、７．５２（ｄ.１＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．５６（ｄｄ，Ｊ_１＝８．２，Ｊ_２＝１．９Ｈｚ，１Ｈ）、７．７７（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．８３−７．８８（ｍ，２Ｈ）、８．０７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）．^１３Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）σｐｐｍ７１．７４、１１７．４３、１１７．５４、１１８．７１、１２５．９２、１２６．６８、１２７．６６、１２９．２１，１２９．６６、１３０．４９、１３４．８５、１３５．８５、１３８．１５、１３９．２５、１５５．０１、１５８．３、１８８．７５．ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋理論値Ｃ_１７Ｈ_９Ｎ_３Ｏ_２Ｃｌ_２Ｎａ，３７９．９９７０；実測値３７９．９９６７。

実施例２：３−（４−クロロフェニル）−３−オキソ−２−（４−オキソ−３，４−ジヒドロキナゾリン−２（１Ｈ）−イリデン）プロパンニトリル

ジオキサン（７ｍＬ）中に２−（４−オキソ−１，４−ジヒドロキナゾリン−２−イル）アセトニトリル（５４．２ｍｇ，２９３μｍｏｌ）及びトリエチルアミン（４９．０μＬ，３５１μｍｏｌ）を含む溶液に、塩化４−クロロベンゾイル（４５．１μＬ，３５１ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を撹拌しながら一晩還流した。反応混合物の冷却時に形成された固体沈殿物は、真空濾過により回収され、メタノール、水、メタノール、及びジクロロメタンで順次洗浄された。固体を次いで、類似体（８）（５９．９ｍｇ，６３％）を得るために乾燥させた。^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）σｐｐｍ７．４７（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ.１１−１）、７．５７−７．６０（ｍ，２Ｈ）、７．７２−７．７５（ｍ，２Ｈ）、７．８４（ｔ．Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．８９（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）８．０６（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）．^１３Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）σｐｐｍ６９．４４、１１７．３１、１１８．６８、１１８．７３、１２５．７３、１２６．６５、１２８．２９、１２９．５４，１３５．７９、１３５．８８、１３７．９６、１５６．０２、１５８．３７、１８９．７６．ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｎａ］^＋理論値Ｃ_１７Ｈ_１０Ｎ_３Ｏ_２ＣｌＮａ，３４６．０３５９；実測値３４６．０３５９。

実施例１０：３−（２−クロロフェニル）−３−オキソ−２−（４−オキソ−３，４−ジヒドロキナゾリン−２（１Ｈ）−イリデン）プロパンニトリル

ジオキサン（３ｍＬ）中に２−（４−オキソ−１，４−ジヒドロキナゾリン−２−イル）アセトニトリル（２２．０ｍｇ，１１９μｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１８．２μＬ，１３１μｍｏｌ）を含む溶液に、塩化２−クロロベンゾイル（２０．８μＬ，１６４ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を撹拌しながら一晩還流した。反応混合物の冷却時に形成された固体沈殿物を真空濾過により回収し、メタノール、水、メタノール、及びジクロロメタンで順次洗浄した。固体を次いで、類似体（６）（１２．５ｍｇ，３３％）を得るために乾燥させた。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）σｐｐｍ７．４３−７．５２（ｍ，４Ｈ）、７．５２−７．５７（ｍ，１Ｈ）、７．８１−７．８７（ｍ，２Ｈ）、８．０６（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）．^１３Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）σｐｐｍ７１．７、１１７．４１、１１７．６２、１１８．７３、１２５．８１、１２６．６８、１２７．３３、１２８．２２，１２９．１８、１２９．５７、１３１．１、１３５．８１、１３９．３３、１５５．１２、１５８．３６、１８９．８９．ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｎａ］^＋理論値Ｃ_１７Ｈ_１０Ｎ_３Ｏ_２ＣｌＮａ，３４６．０３５９；実測値３４６．０３７３。

実施例１６：３−オキソ−２−（４−オキソ−３，４−ジヒドロキナゾリン−２（１Ｈ）−イリデン）−３−フェニルプロパンニトリル

ジオキサン（４ｍＬ）中に２−（４−オキソ−１，４−ジヒドロキナゾリン−２−イル）アセトニトリル（４２．８ｍｇ，２３１μｍｏｌ）及びトリエチルアミン（３８．７μＬ，２７７μｍｏｌ）を含む溶液に、塩化ベンゾイル（３２．２μＬ，２７７μｍｏｌ）を加え、得られた混合物を撹拌しながら一晩還流した。反応混合物の冷却時に形成された固体沈殿物を真空濾過により回収し、メタノール、水、メタノール、及びジクロロメタンで順次洗浄した。固体を次いで、類似体（２）（３６．４ｍｇ，５４％）を得るために乾燥させた。^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）σｐｐｍ７．４７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ）、７．４９−７．５３（ｍ，２Ｈ）、７．５４−７．５８（ｍ，１Ｈ）、７．７０−７．７３（ｍ，２Ｈ）、７．８４（ｔｄ，Ｊ_１＝７．７Ｈｚ，Ｊ_２＝１．５Ｈｚ，１Ｈ）、７．８９（ｂｒ．ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）、８．０６（ｄｄ，Ｊ_１＝８．１，Ｊ_２＝１．５Ｈｚ，１Ｈ）．^１３Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）σｐｐｍ６９．３、１１７．２６、１１８．５７、１１８．８１、１２５．６５、１２６．６５、１２７．５９、１２８．１４、１３１．２２、１３５．７７、１３９．２６、１３９．３３、１５６．１２、１５８．３９、１９１．１８．ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｎａ］^＋理論値Ｃ_１７Ｈ_１１Ｎ_３Ｏ_２Ｎａ，３１２．０７４９；実測値３１２．０７３５。

実施例１７：３−（３−クロロフェニル）−３−オキソ−２−（４−オキソ−３，４−ジヒドロキナゾリン−２（１Ｈ）−イリデン）プロパンニトリル

ジオキサン（１０ｍＬ）中に２−（４−オキソ−１，４−ジヒドロキナゾリン−２−イル）アセトニトリル（１５２ｍｇ，０．８２０ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１２６μＬ，０．９０４ｍｍｏｌ）を含む溶液に、塩化３−クロロベンゾイル（１１６．３μＬ，０．９０４ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を撹拌しながら一晩還流した。反応混合物の冷却時に形成された固体沈殿物を真空濾過により回収し、メタノール、水、メタノール、及びジクロロメタンで順次洗浄した。固体を次いで、類似体（７）（１７２ｍｇ，６５％）を得るために乾燥させた。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）σｐｐｍ７．４８（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ）、７．５５（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．６１−７．８７（ｍ，３Ｈ）、７．８５（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ）、７．９０（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）、８．０７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）．^１３Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）σｐｐｍ６９．６２，１１７．３４，１１８．６２，１１８．７３，２５．７８，１２６．２３，２６．６５，１２７．２８，１３０．２２，１３０．９，１３２．８８，１３５．８１，１４１．１５，１５５．９６，１５８．３６，１８９．３．ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｎａ］^＋理論値Ｃ_１７Ｈ_１０Ｎ_３Ｏ_２ＣｌＮａ，３４６．０３５９；実測値３４６．０３６８。

実施例２５：２−（５−クロロ−４−オキソ−３，４−ジヒドロキナゾリン−２（１Ｈ）−イリデン）−３−（２，４−ジクロロフェニル）−３−オキソ−プロパンニトリル［シリオブレビンＢ］

２−シアノエタンチオアミド（３００ｍｇ，３．００ｍｍｏｌ）とブロモエタン（２６１μＬ，３．５０ｍｍｏｌ）を、ナトリウムエトキシドのエタノール溶液（３．５０ｍｍｏｌ，２．５ｍＬ）に添加した。得られた混合物を６時間撹拌し、６−クロロアントラニル酸（５００ｍｇ，２．９１ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を撹拌しながら一晩還流した。反応混合物の冷却時に混合形成された固体沈殿物を真空濾過により回収し、エタノール、水、エタノール、及びジエチルエーテルで順次洗浄した。固体を次いで、２−（５−クロロ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキナゾリン−２−イル）アセトニトリル（１４８ｍｇ，２２％）を得るために乾燥させた。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）σｐｐｍ４．１５（ｓ，２Ｈ）、７．５４（ｄｄ，Ｊ_１＝７．８Ｈｚ，Ｊ_２＝１．１Ｈｚ，１Ｈ）、７．６１（ｄｄ，Ｊ_１＝８．２Ｈｚ，Ｊ_２＝１．１Ｈｚ，１Ｈ）、７．７４（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）。

ジオキサン（４ｍＬ）中に２−（５−クロロ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキナゾリン−２−イル）アセトニトリル（２６．４ｍｇ，１２０μｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１８．４μＬ，１３２μｍｏｌ）を含む溶液に、塩化２，４−ジクロロベンゾイル（１１６．３μＬ，０．９０４ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を撹拌しながら一晩還流した。反応混合物の冷却時に形成された固体沈殿物を真空濾過により回収し、メタノール、水、メタノール、及びジクロロメタンで順次洗浄した。固体を次いで、シクロブレビンＢ（３）（１２．８ｍｇ，２７％）を得るために乾燥させた。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）σｐｐｍ７．４６（ｄｄ，Ｊ_１＝７．５Ｈｚ，Ｊ_２＝１．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．５０（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．５５（ｄｄ．Ｊ_１＝８．２Ｈｚ，Ｊ_２＝１．９Ｈｚ，１Ｈ）７．６８−７．７９（ｍ，３Ｈ）．^１３Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）σｐｐｍ７１．６９、１１４．６、１１７．６３、１１８．４５、１２７．６５、１２８．１、１２９．２、１２９．６５、１３０．４９、１３３．３５、１３４．８、１３５．４７、１３８．２、１５４．８１、１５６．４８、１８８．７１．ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｎａ］^＋理論値Ｃ_１７Ｈ_８Ｎ_３Ｏ_２Ｃｌ_３Ｎａ，４１３．９５８０；実測値４１３．９５８２。

実施例２７：２−（６−クロロ−４−オキソ−３，４−ジヒドロキナゾリン−２（１Ｈ）−イリデン）−３−（２，４−ジクロロフェニル）−３−オキソプロパンニトリル［シリオブレビンＣ］

２−シアノエタンチオアミド（５０１ｍｇ，５．００ｍｍｏｌ）とブロモエタン（４４８μＬ，６．００ｍｍｏｌ）に、ナトリウムエトキシドのエタノール溶液（６．００ｍｍｏｌ，３．０ｍＬ）を添加した。得られた混合物を６時間撹拌し、５−クロロアントラニル酸（８５８ｍｇ，５．００ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を撹拌しながら一晩還流した。反応混合物の冷却時に混合形成された固体沈殿物を真空濾過により回収し、エタノール、水、エタノール、及びジエチルエーテルで順次洗浄した。固体を次いで、２−（６−クロロ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキナゾリン−２−イル）アセトニトリル（３１４ｍｇ，２９％）を得るために乾燥させた。^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）σｐｐｍ４．１８（ｓ，２Ｈ）、７．７０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．８５（ｄｄ，Ｊ_１＝８．７Ｈｚ，Ｊ_２＝２．０Ｈｚ，１Ｈ）８．０３（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）。

ジオキサン（４ｍＬ）中に２−（６−クロロ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキナゾリン−２−イル）アセトニトリル（５２．０ｍｇ，２３７μｍｏｌ）及びトリエチルアミン（３６．３μＬ，２６０μｍｏｌ）を含む溶液に、塩化２，４−ジクロロベンゾイル（３３．１μＬ，２３７μｍｏｌ）を加え、得られた混合物を撹拌しながら一晩還流した。反応混合物の冷却時に形成された固体沈殿物を真空濾過により回収し、メタノール、水、メタノール、及びジクロロメタンで順次洗浄した。固体を次いで、シクロブレビンＣ（４）（６．４ｍｇ，７％）を得るために乾燥させた。^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）σｐｐｍ７．５０（ｄ，Ｊ_１＝８．３Ｈｚ，１Ｈ）、７．５６（ｄｄ，Ｊ_１＝８．３Ｈｚ，Ｊ_２＝１．９Ｈｚ，１Ｈ）、７．７７（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ）、７．８３（ｄ，Ｊ，＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．８８（ｄｄ，Ｊ_１＝８．９Ｈｚ，Ｊ_２＝２．３Ｈｚ，１Ｈ）、８．００（ｄ，Ｊ_２＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）．^１３Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）σｐｐｍ７２．１，１１７．５２，１１８．９８，１２１．２２，１２５．６１，１２７．６７，１２９．２２，１２９．６６，１２９．９９，１３０．４９，１３４．８８，１３５．６４，３８．１１，１３８．５８，１５５．０５，１５７．５２，１８８．７６．ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｎａ］^＋理論値Ｃ_１７Ｈ_８Ｎ_３Ｏ_２Ｃｌ_３Ｎａ，４１３．９５８０；実測値４１３．９５８３。

実施例３１：２−（７−クロロ−４−オキソ−３，４−ジヒドロキナゾリン−２（１Ｈ）−イリデン）−３−（２，４−ジクロロフェニル）−３−オキソ−プロパンニトリル［シリオブレビンＤ］

２−シアノエタンチオアミド（３００ｍｇ，３．００ｍｍｏｌ）とブロモエタン（２９９μＬ，４．００ｍｍｏｌ）に、ナトリウムエトキシドのエタノール溶液（４．００ｍｍｏｌ，３ｍＬ）を添加した。得られた混合物を６時間撹拌し、４−クロロアントラニル酸（５００ｍｇ，２．９１ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を撹拌しながら一晩還流した。反応混合物の冷却時に混合形成された固体沈殿物を真空濾過により回収し、エタノール、水、エタノール、及びジエチルエーテルで順次洗浄した。固体を次いで、２−（７−クロロ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキナゾリン−２−イル）アセトニトリル（１１８ｍｇ，１８％）を得るために乾燥させた。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）σｐｐｍ４．１９（ｓ，２Ｈ）、７．５７（ｄｄ，Ｊ_１＝８．５Ｈｚ，Ｊ_２＝２．１Ｈｚ，１Ｈ）、７．７４（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ）、８．０９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）。

ジオキサン（４ｍＬ）中に２−（７−クロロ−４−オキソ−１，４−ジヒドロキナゾリン−２−イル）アセトニトリル（２４．９ｍｇ，１１３μｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１７．４μＬ，１２５μｍｏｌ）を含む溶液に、塩化２，４−ジクロロベンゾイル（１５．９μＬ，１１３μｍｏｌ）を加え、得られた混合物を撹拌しながら一晩還流した。反応混合物の冷却時に形成された固体沈殿物を真空濾過により回収し、メタノール、水、メタノール、及びジクロロメタンで順次洗浄した。固体を次いで、シクロブレビンＤ（５）（１１．４ｍｇ，２６％）を得るために乾燥させた。^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）σｐｐｍ７．４７−７．５２（ｍ，２Ｈ）、７．５６（ｄｄ，Ｊ_１＝８．２Ｈｚ，Ｊ_２＝１．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．７７（ｄ，Ｊ_１＝１．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．９０（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、８．０４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ）．^１３Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）σｐｐｍ７２．４４，１１６．５６，１１８．７９，１１８．８５，１２５．７４，１２７．６５，１２８.６６，１２９．２，１２９．６５，１３０．４９，１３４．８１，１３８．２１，１４０．０３，１５５．６２，１５７．９８，１８８．６．ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｎａ］^＋理論値Ｃ_１７Ｈ_８Ｎ_３Ｏ_２Ｃｌ_３Ｎａ，４１３．９５８０；実測値，４１３．９５８３。

同様に下記の表１記載の他の化合物が合成された。

アッセイ

Ｈｈ経路活性のＳｈｈ−ＬＩＧＨＴ２アッセイ

Ｓｈｈ−Ｎ−馴化培地が、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，１４０７１（２００２）に示された方法で調整された。Ｓｈｈ−ＬＩＧＨＴ２細胞［Ｊ．Ｔａｉｐａｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０６，１００５（２０００）］は、Ｇｌｉ応答性ホタルルシフェラーゼレポーター及び構成的なチミジンキナーゼプロモーターにより活性化されるＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ発現コンストラクト（ｐＲＬＴＫ，Ｐｒｏｍｅｇａ）を安定的に組み込まれたＮＩＨ−３Ｔ３を基にした細胞株であり、１０％コウシ血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ内で培養された。細胞は、３００００細胞／ウエルの濃度になるよう９６穴ウエルプレートに注入され、翌日に、０．５％コウシ血清、１０％Ｓｈｈ馴化培地及び上記の抗体を含むＤＭＥＭとともに、それぞれの化合物又はＤＭＳＯを処理された。さらに２４時間の培養の後、細胞は溶解され、それらのホタル及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性は、デュアルルシフェラーゼレポーターキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びマイクロプレートルミノメーター（Ｖｅｒｉｔａｓ）によって測定された。３サンプルからのホタルルシフェラーゼ活性とＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性の比を表す平均値が、各化合物の用量反応図を構築するために用いられた。３つの別々の実験からの用量反応データは、独立して、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、可変勾配、シグモイド曲線、用量反応アルゴリズムとして描かれ、得られたＩＣ５０値は、各化合物のＩＣ５０平均値を測定するために使用された。

繊毛形成の定量的評価

Ｓｈｈ−ＥＧＦＰ細胞［Ｊ．Ｈｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，（２００９）］は、Ｇｌｉ応答性ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎレポーターを安定的に組み込まれたＮＩＨ−３Ｔ３を基にした細胞株であり、１０％コウシ血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ内で維持された。細胞は、３００００細胞／ウエルの濃度になるようポリ−Ｄ−リジンでコーティングされた１２ｍｍのカバーガラスを含む２４穴ウエルプレートに注入され、３６時間培養された。細胞は、０．５％コウシ血清及び上記抗体を含むＤＭＥＭ内に、それぞれの化合物が、３０μＭ又は０．３％ＤＭＳＯとなるように移された。さらに２４時間の培養の後、細胞は、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳを用いて室温で１０分間固定され、ＰＢＳを用いて５分間３回洗浄され、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を含むＰＢＳに５分間浸漬され、５％正常ヤギ血清、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００及び０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳを用いて、４℃で一晩ブロックされた。カバーガラスは、次いで、ウサギポリクローナル抗Ａｒｌ１３ｂ抗体（１：３０００希釈）を含むブロッキング緩衝液とともに、室温で９０分間インキュベートされ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を含むＰＢＳを用いて５分間４回洗浄され、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識されたヤギポリクローナル抗ウサギＩｇＧ抗体（１：３００希釈；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ−１１０３４）を含むブロッキングバッファとともに、室温で６０分間インキュベートされた。二次抗体のインキュベーションの後、核は、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００及び０．５１Ａｇ／ｍＬ ４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）を含むＰＢＳとともに、１０分間２回インキュベーションされた後に、ＰＢＳを用いて５分間２回洗浄することによって染色された。その後、カバーガラスは、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したスライドに固定され、Ｐｈｏｔｍｅｒｉｃ Ｃｏｏｌ ＳＮＡＰ ＨＱ ＣＣＤカメラ及びＭｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアを搭載したライカＤＭＩ６０００Ｂ複合顕微鏡ＨＣ Ｐｌａｎ Ａｐｏｃｈｌｏｍａｔ ＣＳ ２０ｘ／０．７０ ＮＡ油浸対物レンズを用いて画像化された。ＤＭＳＯ処理されたＡｒｌ１３ｂの画像を、繊毛染色強度の最小閾値を確立するために手動で検討した。次いでＩｍａｇｅＪソフトウェアが、個々の画像内の閾値以上の信号強度を有する２以上の隣接する画素から構成されるオブジェクトを定義するために使用され、それぞれの画像内の総被写体領域が、一次繊毛の全画素面積を推定するために使用された。ＤＡＰＩ染色の対応する画像は、各画像あたりの核の数を確認するためのＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒソフトウェアを使用して、並行して処理された。各画像内の細胞あたりの平均繊毛サイズは、次いで、核の数で合計繊毛画素領域を割ることによって決定された。約１５０の細胞を含む１０の各画像が、それぞれの実験条件での平均繊毛サイズを決定するために使用された。

これらの研究の代表的な結果を表１において概説する。

Ｈｈシグナル伝達は主に、転写因子であるＧｌｉ２及びＧｌｉ３により媒介され、基本条件の下で、これらのタンパク質は、プロテアソーム及び繊毛依存的にＮ末端リプレッサー（Ｇｌｉ２／３Ｒ）を発生させるために、部分的に分解される。Ｈｈリガンドと膜結合型受容体であるＰａｔｃｈｅｄｌ（Ｐｔｃｈｌ）との結合は、Ｓｍｏの活性化及びＧｌｉのタンパク質分解過程阻害へと導く；次いで全長Ｇｌｉ２及びＧｌｉ３（Ｇｌｉ２／３ＦＬ）は、Ｓｕｆｕから分離し、転写活性因子（Ｇｌｉ２／３Ａ）へと変換される。Ｇｌｉ２／３処理のように、Ｇｌｉ２／３Ａ形成は一次繊毛を必要とする。

Ｈｈリガンドに依存したＧｌｉ３処理の量的評価

Ｓｈｈ−ＥＧＦＰ細胞は、１０％コウシ血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭを含む１２穴ウエルプレートに、３００００細胞／ウエルの濃度になるよう注入された。２４時間の培養の後、細胞は、０．５％コウシ血清、１０％Ｓｈｈ条件培地、上記抗体、及び各化合物又はＤＭＳＯを含むＤＭＥＭに移された。細胞は、さらに１６時間培養され、ＰＢＳで洗浄され、８％グリセロール、２０ｍ ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８ ２％ＳＤＳ、１００ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、２０ｍＭフッ化ナトリウム、２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム及びＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）からなるＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液と氷上でインキュベートすることによって溶解させた。溶解させたサンプルは、１００℃で７分間加熱され、３−８％Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ＸＴ Ｔｒｉｓアセテートポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にロードされ、ＸＴトリシン緩衝液内で電気泳動され、ＰＶＤＥメンブレン上に移された。メンブレンは、メタノールで脱水され、４％無脂肪粉乳及び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（イムノブロットブロッキング緩衝液）を含むＰＢＳにおいて、４℃でヤギポリクローナル抗Ｇｌｉ３抗体（０．４μｇ／ｍＬ：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＡＦ３６９０）をプローブとして反応させ、次いで、ブロットをＰＢＳで１分間４回洗浄され、イムノブロットブロッキング緩衝液内で、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ウシポリクローナル抗ヤギＩｇＧ抗体（０．０４μｇ／ｍＬ，Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，８０５−０３５−１８０）とともに、室温で１時間インキュベートされた。メンブレンは、次いで、ＰＢＳで１分間４回洗浄され、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて可視化された。Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて定量化したＧｌｉ３ＦＬ及びＧｌｉ３Ｒバンド強度、及び５回の独立した実験が、各化合物のＧｌｉ３ＦＬ／Ｇｌｉ３Ｒ率の平均を決定するために用いられた。シリオブレビン（実施例１，２５，２７及び３１の化合物）は、Ｓｍｏ阻害剤であるシクロパミンと同様に、Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｓｈｈ−Ｎ）のＮ末端ドメインで刺激された細胞内のＧｌｉ３ＦＬ／Ｇｌｉ３Ｒ率を変化させた。Ｓｈｈ−Ｎ依存性Ｇｌｉ３ＦＬのリン酸化もまたこれらの化合物によって減少するか、あるいは、Ｇｌｉ３Ａの損失を反映している。試験された他の類似体はＧｌｉ３ＦＬ／Ｇｌｉ３Ｒ率又はＧｌｉ３ＦＬのリン酸化状態に有意な影響を示さなかった。

Ｈｈリガンド依存性Ｇｌｉ２輸送の定量的評価

上述の薬学的な結果は、一次繊毛の機能、Ｇｌｉプロセシング及びＧｌｉ活性をつなぎ合わせて確認された遺伝学的な結果と一致する。Ｈｈ経路活性化は、一次繊毛の遠端におけるＧｌｉ２局在化と一致しているので、我々は，シリオブレビンが、どのようにして繊毛を攪乱するのかについての理解をさらに深めるため、試験化合物のＧｌｉ２局在化の影響を調査した。

Ｓｈｈ−ＥＧＦＰ細胞は、ポリ−Ｄ−リジンでコーティングされた１２ｍｍのカバーガラスを含む２４穴ウエルプレートに、６５０００細胞／ウエルの濃度になるよう注入され、１０％コウシ血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ内で２４時間培養された。次いで、細胞は、一次繊毛形成を促進するために、０．５％コウシ血清及び上記抗体を含むＤＭＥＭ内に移され、１６時間保持された。次いで、２４時間の培養の後、細胞は、０．５％コウシ血清、抗体、及び３０μＭ濃度の各化合物又は０．３％ＤＭＳＯを含むＤＭＥＭに移された。各化合物又はコントロールの処理は、それぞれ、１０％Ｓｈｈ−Ｎ−馴化培地が存在又は欠乏している状態で行われ、これらの条件で細胞は、４時間培養された。次いで、細胞は、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳを用いて室温で１０分間固定され、５０ｍＭグリシンを含むＰＢＳを用いて５分間３回洗浄され、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を含むＰＢＳに５分間浸漬され、次いで、５％正常ロバ血清、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００及び０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳを用いて、４℃で一晩ブロックされた。ブロッキングが完了した後、次いで、ウサギポリクローナル抗Ａｒｌ１３ｂ抗体（１：３０００希釈）、ヤギポリクローナル抗Ｇｌｉ２抗体（１：５０希釈：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＡＦ３６３５）及びマウスモノクローナル抗γチューブリン（１：２００希釈；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔ５３２６）を含むブロッキング緩衝液内で、カバーガラスは、室温で９０分間インキュベートされた。次いで、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を含むＰＢＳで、細胞は、５分間４回洗浄され、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８標識ロバポリクローナル抗ヤギＩｇＧ抗体（３μｇ／ｍＬ；ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，７０５−４８５−１４７）、ＤｙＬｉｇｈｔ５９４標識ロバポリクローナル抗マウスＩｇＧ抗体（３μｇ／ｍＬ；ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，７１５−５１５−１５１）及びＤｙ、ｉｇｈｔ６４９標識ロバポリクローナル抗マウスＩｇＧ抗体（３μｇ／ｍＬ；ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，７１１−４９５−１５２）を含むブロッキング緩衝液とともに、６０分間インキュベートされた。二次抗体のインキュベーションの後、核は、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００及び０．５μｇ／ｍＬ ＤＡＰＩを含むＰＢＳとともに１０分間２回インキュベーションされた後に、ＰＢＳを用いて５分間２回洗浄することによって染色された。次いで、カバーガラスは、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したスライドに固定され、ＬＳＭ７００共焦点レーザー走査ヘッドを搭載したＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｌｍａｇｅｒ Ｚ１正立顕微鏡Ｐｌａｎ Ａｐｏｃｈｌｏｍａｔ ６３ｘ／１．４ＮＡ油浸対物レンズを用いて画像化された。軸糸の遠端においての直径０．６９μｍの範囲内で総画素強度を決定し、同等の大きさの隣接領域での背景の蛍光を差し引くことによって、繊毛のＧｌｉ２レベルを定量化した。少なくとも２５の繊毛を、各実験条件での繊毛の平均Ｇｌｉ２レベルを決定するために分析した。基底培地及びＳｈｈ−Ｎ−誘導培地において、繊毛形成を有意に攪乱しない誘導体（１６及び２）によっては、繊毛のＧｌｉ２レベルの変化はなかった。一方、化合物１及び３１は、Ｓｈｈ−Ｎによって誘導されたものと比較して、シグナリング細胞小器官における基本培地のＧｌｉ２濃度が上昇した。

ＩＦＴ８８輸送の定量的評価

シリオブレビンがＨｈリガンド非依存的に繊毛のＧｌｉ２レベルを増加させる能力は、これらの化合物が一次繊毛内タンパク質輸送メカニズムを標的にする可能性があることを示唆している。微小管依存性コンパートメントとして、繊毛は、その軸糸に沿って高分子を移動させるために、特定のモータータンパク質を活用している。貨物の繊毛内輸送（ＩＦＴ）は、プラス末端方向へのキネシン２モーター及びＩＦＴＢマルチサブユニット複合体を必要とする順行性輸送、そして、マイナス末端方向への細胞質ダイニン２モーター及びＩＦＴＡを活用する逆行性輸送として説明できる。キネシン２、細胞質ダイニン２、又はＩＦＴ複合体サブユニットのそれぞれの遺伝子を破壊した場合には、繊毛が欠失し、Ｈｈシグナル伝達の攪乱が誘導されることが見出された。例えば、マウス胚発生において、一次繊毛特有のｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｄｙｎｅｉｎ ２ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ（Ｄｙｎｃ２ｈｌ）の欠失が、繊毛の形態を変化させ、Ｈｈ標的遺伝子発現を減少させることが示されている。また、Ｄｙｎｃ２ｈｌの機能を失っている細胞は、Ｈｈ経路活性化の非存在下において、繊毛Ｇｌｉ２レベルの増加を示す。シリオブレビンがＨｈ経路特有のプロセスよりもむしろ一般的な繊毛輸送を標的とすることを確かめるために、ＩＦＴＢの構成要素であり、繊毛の基底小体に戻るための細胞性ダイニン２に依存した逆行性輸送に必要となるＩＦＴ８８の、細胞レベル下においての局在に対するシリオブレビンの影響を検証した。

Ｓｈｈ−ＥＧＦＰ細胞は、ポリ−Ｄ−リジンでコーティングされた１２ｍｍのカバーガラスを含む２４穴ウエルプレートに、３００００細胞／ウエルの濃度になるよう注入され、１０％コウシ血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ内で２４時間培養された。次いで、細胞は、一次繊毛形成を促進するために、０．５％ウシ血清及び上記抗体を含むＤＭＥＭ内に移され、１６時間保持された。細胞は、次に、０．５％コウシ血清、抗体、及び５０μＭ濃度の各化合物又は０．２５％ＤＭＳＯを含むＤＭＥＭに移され、１時間保持された。各化合物又はコントロールの処理は、それぞれ、１０％Ｓｈｈ−Ｎ−馴化培地が存在又は欠乏している状態で行い、これらの条件で細胞を４時間培養した。次いで、細胞は、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳを用いて室温で１０分間固定され、５０ｍＭグリシンを含むＰＢＳを用いて５分間３回洗浄され、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を含むＰＢＳに５分間浸漬され、次いで、５％正常ヤギ血清、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００及び０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳを用いて、４℃で一晩ブロックされた。ブロッキングが完了した後、細胞は、次いで、マウスモノクローナル抗アセチル化チューブリン（１：４０００希釈；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔ６７９３）、ウサギポリクローナル抗ＩＦＴ８８抗体（１：７０希釈：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈ Ｇｒｏｕｐ，１３９６７−１−ＡＰ）及びマウスモノクローナル抗γチューブリン（１：２００希釈；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔ５３２６）を含むブロッキング緩衝液内で、カバーガラスを室温で９０分間インキュベートされた。次いで、細胞は、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を含むＰＢＳで、５分間４回洗浄され、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識ヤギポリクローナル抗ウサギＩｇＧ抗体（１：３００希釈；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ−１１０３４）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ヤギポリクローナル抗マウスＩｇＧ抗体（１：３００希釈；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ−２１２３５）を含むブロッキング緩衝液でインキュベートされた。二次抗体のインキュベーションの後、核は、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００及び０．５μｇ／ｍＬ ＤＡＰＩを含むＰＢＳとともに１０分間２回インキュベーションされた後に、ＰＢＳを用いて５分間２回洗浄することによって染色された。次いで、カバーガラスは、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したスライドに固定され、ＬＳＭ７００共焦点レーザー走査ヘッドを搭載したＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｌｍａｇｅｒ Ｚ１正立顕微鏡Ｐｌａｎ Ａｐｏｃｈｌｏｍａｔ ６３ｘ／１．４ＮＡ油浸対物レンズを用いて画像化された。背景を差し引かなかったものの、Ｇｌｉ２で記載したように繊毛のＩＦＴレベルは、本質的に定量化された。少なくとも２５の繊毛を、各実験条件での繊毛の平均ＩＦＴ８８レベルを決定するために分析した。シクロブラビンＤ（実施例３１）を用いて細胞を１時間処理することにより、ＤＭＳＯ又は化合物１６を用いた場合と比較して、一次繊毛の遠端においてＩＦＴ８８レベルの有意な増加が生じた。これは、シリオブレビンが細胞質ダイニン２の機能を阻害することのさらなる証拠となる。

紡錘体形成の画像化

一次繊毛外への小分子輸送に加えて、細胞質ダイニン複合体は、異なった細胞機能を有している。例えば、細胞質ダイニン１は、ダイナクチン及び核タンパク質であるＮｕＭＡと複合体を形成し、有糸分裂の紡錘体の内部に微小管のマイナス末端を集中させるという働きを行う。これらの働きが紡錘状の形状を形成し、γ−チューブリン及び微小管と核の複合体を紡錘体極へ局在させる。抗体のブロック又はドミナントネガティブ構築を原因とする細胞質内ダイニン１の阻害は、有糸分裂を攪乱し、γ−チューブリンの漸増が止まり、微小管末端の規則正しさが失われる結果となる。シクロブレビンがこれらの表現型を再現することができるかどうかを決定するために、有糸分裂中期の細胞を多く含むＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、実施例３１又は実施例２で５０μＭ濃度で一時間処理し、有糸分裂の構造を共焦点免疫蛍光顕微鏡によって検証した。

Ｓｈｈ−ＥＧＦＰ細胞は、密集度約７０％に至るまで培養され、ポリ−Ｄ−リジンでコーティングされた１２ｍｍのカバーガラスを含む２４穴ウエルプレートに１：５となるよう分割され、１０％コウシ血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ内で２４時間培養された。これらの条件で一晩培養された後、細胞は、１５μＭ ＭＧ１３２を含む増殖培地で９０分間培養され、続いて、０．５％コウシ血清、１５μＭ ＭＧ１３２、及び５０μＭのそれぞれの化合物又は同量のＤＭＳＯ溶媒のいずれかを含むＤＭＥＭとともに、６０分間インキュベートされた。細胞は、−２０℃に冷やされたメタノールとともに、氷上でインキュベーションされることにより固定され、ＰＢＳで５分間３回洗浄され、次いで、５％正常ヤギ血清、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００及び０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳを用いて室温で、一晩ブロックされた。ブロッキング完了後、カバーグラスは、マウスモノクローナル抗α−チューブリン抗体（１：２０００希釈；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔ６１９９）、ウサギポリクローナル抗γ−チューブリン抗体（１：５００希釈：；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔ３５５９）を含むブロッキング緩衝液内で、室温で９０分間インキュベートされた。細胞は、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を含むＰＢＳで５分間４回洗浄され、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識ヤギポリクローナル抗ウサギＩｇＧ抗体（１：３００希釈；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ−１１０３４）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４標識ヤギポリクローナル抗マウスＩｇＧ抗体（１：３００希釈；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ−１１０３２）を含むブロッキング緩衝液で６０分間インキュベートされた。

二次抗体のインキュベーションの後、核は、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００及び０．５μｇ／ｍＬ ＤＡＰＩを含むＰＢＳとともに１０分間２回インキュベーションされた後に、ＰＢＳを用いて５分間２回洗浄することによって染色された。次いで、カバーガラスは、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したスライドに固定され、ＬＳＭ７００共焦点レーザー走査ヘッドを搭載したＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｌｍａｇｅｒ Ｚ１正立顕微鏡Ｐｌａｎ Ａｐｏｃｈｌｏｍａｔ ６３ｘ／１．４ＮＡ油浸対物レンズを用いて画像化された。細胞質ダイニン１の薬理学的な阻害と一致して、実施例３１で処理された細胞は、γ−チューブリン−陽性極と紡錘体を形成することができなかった。実施例１６又は溶媒のみで処理された細胞は、通常の紡錘体形成を示した。

メラノソーム凝集アッセイ

もう一つの細胞質ダイニン１に依存したプロセスは、色素細胞内のメラニンを含む小胞の凝集である。そのメカニズムは、特定の生物が環境的な合図に応答して、配色を適応させるものである。例えば、細胞質ダイニン１は、小分子メラトニンで刺激したＸｅｎｏｐｕｓの黒色素胞の中心に向けてメラノソームを輸送する。これは、キネシン−２及びミオシン−５によって活性化されるメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）に応答しての細胞の周縁部に対する色素顆粒の分散と平衡する。メラノソーム輸送がシリオブレビンに対して敏感であるかどうかを決定する目的で、我々は、メラノソームを均等に分散させるために、Ｘｅｎｏｐｕｓ黒色素胞をＭＳＨとともに培養し、次いで、それらをメラトニン及び様々な濃度の試験化合物で処理した。

不死化したＸｅｎｏｐｕｓ黒色素胞は、１０％ウシ胎児血清、３０ｍｇ／Ｌ Ｌ−グルタミン、及び５ｍｇ／Ｌインスリンを追加した０．７Ｘ Ｌ１５培地で培養された。メラノソーム凝集アッセイの前に、細胞は、ポリ−Ｄ−リジンでコーティングされた１２ｍｍのカバーガラスを含む１２穴ウエルプレートで、１２時間から２４時間培養された。実験の日に、黒色素胞は、３０分間無血清培地で培養され、メラノソームを均等に分散させるため、１００ｎＭ ＭＳＨで刺激され、次いで、それぞれの化合物又はＤＭＳＯのいずれかを含む培地とともに、１０分間インキュベートされた。メラノソーム凝集は、次いで、試験化合物存在下において、１０ｎＭメラトニンで細胞を処理することにより誘導された。黒色素胞は、経時的顕微鏡検査法又は４％パラホルムアルデヒドを含む０．７Ｘ ＰＢＳによる３０分間処理のいずれかにより、直ちに画像化された。

シリオブレビンの可逆性を実証するため、黒色素胞は、３０分間無血清培地で培養され、メラノソームを均等に分散させるため、１００ｎＭメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）で刺激され、次いで、それぞれの化合物及び１０ｎＭメラトニンを含む培地とともに、３０分間インキュベートされた。細胞は、次いで、メラトニンのみを含む培地で数回洗浄され、画像化された。実施例３１が、１０ｎＭ濃度で、有意にメラノソーム凝集を阻害する一方、繊毛を攪乱しなかった実施例１６は、４０μＭを超えても効果を認識することができなかった。シリオブレビンＤ（実施例３１）の効果は、黒色素胞が、最初に実施例３１及びメラトニンで処理され、次いで、メラトニンのみを含む培地で培養されたウオッシュアウト実験によって実証され、完全に可逆的であった。全てをまとめると、これらの結果は、シクロブレビンは、繊毛形成、繊毛輸送、紡錘体形成、及びメラノソームの輸送を含む異種の細胞質ダイニンの依存するプロセス特異的な可逆的阻害剤であることを示している。

微小管表面滑走アッセイ

シクロブレビンが作用する多様な細胞コンテキストは、このマルチサブユニットモータータンパク質を収束するための上流のシグナル伝達よりもむしろ、標的の細胞質ダイニンそれ自体を標的とすることを強く示唆している。細胞質ダイニンがシクロブレビンの直接の標的であるかどうかを、より直接的に調べるために、我々は、インビトロにおけるダイニン依存性微小管滑走へのそれらの影響を評価した。細胞質ダイニンは、ウシの脳組織から精製され、スライドグラス上に吸着され、蛍光標識された微小管及びＡＴＰとともに、これらの化合物の存在下又は非存在下のいずれかの条件においてインキュベートされた。我々は、次いで、落射蛍光顕微鏡を用いて微小管滑走速度の結果を画像化し、定量化した。

細胞質ダイニンは、Ｂｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２９８，１７１（１９９８）］により示された方法で、ウシの脳組織から精製された。Ｃ末端Ｈｉｓタグを有するヒトキネシン（ｋｉｎｅｓｉｎ−１）の５６０アミノ酸残基からなるＮ末端断片であるＫ５６０は細菌内で発現され、Ｗｏｅｈｌｋｅ ｅｔ ａｌ，［Ｃｅｌｌ ９０，２０７（１９９７）］で示されたように精製された。運動性アッセイは、Ｚｅｉｓｓ １００ｘ／１．４５ ＮＡ α−Ｐｌａｎ−Ｆｌｕａｒ対物レンズを搭載したＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ広視野顕微鏡上で行われた。データは、０．３秒の露光時間及び０．５／秒のフレームレートで、ＥＭ−ＣＣＤカメラ（ｉＸｏｎ ＤＵ−８９７，Ａｎｄｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に捉えられた。微小管表面滑走アッセイは、Ｋａｐｏｏｒ ａｎｄ Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６，９１０６（１９９９）］により示された方法に、修正をいくつか加えて行われた。約６μＬのフローチャンバーは、モータータンパク質（１００μｇ／ｍＬダイニン又は５０μｇ／ｍＬ Ｋ５６０）を含むモーター希釈緩衝液（８０ｍＭ Ｐｉｐｅｓ，１ｍＭ ＥＧＴＡ，２ｍＭ ＭｇＣｌ_２，２ｍＭ ＤＴＴ，５０μＭ ＡＴＰ，水酸化カリウムでｐＨ６．８に調整）で満たされた。２分間のインキュベーションの後、余分なタンパク質は、２０μＬ ＰＥＭ８０緩衝液（８０ｍＭ Ｐｉｐｅｓ，１ｍＭ ＥＧＴＡ，２ｍＭ ＭｇＣｌ_２，水酸化カリウムでｐＨ６．８に調整）で洗い落とされ、チャンバーをブロッキングタンパク質（０．５ｍｇ／ｍＬダイニン実験用α−カゼイン及び１ｍｇ／ｍＬ Ｋ５６０実験用ＢＳＡ）を含むモーター希釈タンパク質で満たすことによって、表面は非特異的な微小管結合に対してブロックされた。チャンバーは、２分後に１８μＬの反応混合物［ＰＥＭ８０，４０ｍＭ ＫＣｌ，ブロッキングタンパク質（１ｍｇ／ｍＬダイニン実験用α−カゼイン；１ｍｇ／ｍＬ Ｋ５６０実験用ＢＳＡ），２ｍＭ ＭｇＡＴＰ，２０μＭタキソール，０．１μＭローダミン標識微小管，酸素欠乏システム（４ｍＭ ＤＴＴ，２ｍＭグルコース，４０μｇ／ｍＬグルコースオキシダーゼ，３５μｇ／ｍＬカタラーゼ），２．５％ＤＭＳＯ，適切な試験化合物］で灌流された。フローチャンバーは、次いで、バラップ（ｖａｌａｐ）により密閉された。微小管を表面に５分間結合させた後、滑走微小管は経時的顕微鏡法によって可視化された。速度は、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いたキモグラフィによって計測され、それぞれの微小管の速度は観測時間中における合計距離から決定された。

ウオッシュアウト実験のために、阻害剤を含む最初の反応混合物が加えられた後、チャンバーは、密封ではない状態にされた。微小管を表面に５分間結合させた後、次いで、微速度撮影動画が得られた。阻害剤は、次いで、追加の微小管又は阻害剤なしの新しい反応混合物（ＰＥＭ８０，４０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍｇ／ｍＬ α−カゼイン，２ｍＭ ＭｇＡＴＰ，２０μＭタキソール，酸素欠乏システム，２．５％ＤＭＳＯ）を流し込むことにより、チャンバー外へ洗い落とされた。チャンバーは密封され、追加の微速度撮影動画が得られた。

全ての化合物は、最初に、このアッセイにおいて微小管の動きを妨害する濃度の少なくとも５倍の濃度のシクロブレビンＡ及びシクロブレビンＤ（実施例１及び３１）とともに１００μＭで調査された；我々のセルベースアッセイにおいて、細胞質ダイニン依存的なプロセスを阻害しなかった類似体（実施例２及び１６）では、この濃度でも、極小の影響しか及ぼさなかった。Ｘｅｎｏｐｕｓ小胞細胞におけるメラノソーム凝集と同様に、シリオブレビンによる微小管滑走阻害は、３０μＭ及び４０μＭのＩＣ５０値を示す２つの化合物のそれぞれにおいて、可逆的であり、用量依存的であった。いずれのシリオブレビンも、インビトロにおいて、１００μＭ濃度でＫ５６０／キネシン−１依存的微小管滑走に対して有意な影響を及ぼさなかった。このように、これらのジヒドロキナゾリノンは、特異的に細胞質ダイニンを標的とし、ＡＴＰ依存性微小管運動の包括的な拮抗物質ではなかった。

繊毛形成の定量的評価

Ｓｈｈ−ＥＧＦＰ細胞は、Ｇｌｉ応答性ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎレポーターを安定的に組み込まれたＮＩＨ−３Ｔ３を基にした細胞株であり、１０％（ｖ／ｖ）コウシ血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ内で維持された。細胞は、３００００細胞／ウエルの濃度になるようポリ−Ｄ−リジンでコーティングされた１２ｍｍのカバーガラスを含む２４穴ウエルプレートに注入され、３６時間培養された。細胞は、０．５％（ｖ／ｖ）コウシ血清及び上記抗体を含むＤＭＥＭ内に、それぞれのジヒドロキナゾリノンが３０μＭ又は等量のＤＭＳＯ溶媒（０．３％，ｖ／ｖ）となるように移された。さらに２４時間の培養の後、細胞は、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳを用いて室温で１０分間固定され、ＰＢＳを用いて５分間３回洗浄され、０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を含むＰＢＳに５分間浸漬され、５％（ｖ／ｖ）正常ヤギ血清、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００及び０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含むＰＢＳを用いて、４℃で一晩ブロックされた。カバーガラスは、次いで、ウサギポリクローナルａｎｔｉ−Ａｒｌ１３ｂ抗体（１：３０００希釈）を含むブロッキング緩衝液とともに、室温で９０分間インキュベートされ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（ｖ／ｖ）Ｘ−１００を含むＰＢＳを用いて５分間４回洗浄され、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識ヤギポリクローナル抗ウサギＩｇＧ抗体（１：３００希釈；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ−１１０３４）を含むブロッキングバッファとともに、室温で６０分間インキュベートされた。二次抗体のインキュベーションの後、核は、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００及び０．５μＭ／ｍＬ ４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）を含むＰＢＳとともに、１０分間２回インキュベーションされた後に、ＰＢＳを用いて５分間２回洗浄することによって染色された。その後、カバーガラスは、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したスライドに固定され、Ｐｈｏｔｍｅｒｉｃ Ｃｏｏｌ ＳＮＡＰ ＨＱ ＣＣＤカメラ及びＭｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を搭載したライカＤＭＩ６０００Ｂ複合顕微鏡ＨＣ Ｐｌａｎ Ａｐｏｃｈｌｏｍａｔ ＣＳ ２０ｘ／０．７０ ＮＡ油浸対物レンズを用いて画像化された。ＤＭＳＯ処理されたＡｒｌ１３ｂの画像は、繊毛染色強度の最小閾値を確立するために手動で検討された。次いで、ＩｍａｇｅＪソフトウェアが、個々の画像内の閾値以上の信号強度を有する２以上の隣接する画素から構成されるオブジェクトを定義するために使用され、それぞれの画像内の総被写体領域が、一次繊毛の全画素面積を推定するために使用された。ＤＡＰＩ染色の対応する画像が、各画像あたりの核の数を確認するためのＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒソフトウェアを使用して、並行して処理された。各画像内の細胞あたりの平均繊毛サイズは、次いで、核の数で合計繊毛画素領域を割ることによって決定された。約１５０の細胞を含む１０の各画像が、それぞれの実験条件での平均繊毛サイズを決定するために使用された。結果は、図１に示されている。繊毛サイズには、実施例１の化合物の濃度上昇に反応して、用量依存的な減少が見られ、ヘッジホッグシグナル伝達を阻害するがダイニンの阻害剤ではない実施例１６の化合物では、濃度上昇に反応した繊毛サイズの用量依存的な減少は見られなかった。

本明細書により開示される化合物は、インビトロ及び生細胞における細胞質ダイニンの特異的な阻害剤である最初の小分子である。ＡＴＰの類似体であるエリトロ−９［−３−（２−ヒドロキシノニル）］アデニン及び抗酸化ノルジヒドログアイヤレチン酸は、以前からダイニンの機能を抑制すると報告されており、これらの化合物は、様々な酵素の拮抗物質である。天然産物プレアリン（ｐｕｒｅａｌｉｎ）は、インビトロでダイニンモータードメインのＡＴＰａｓｅ活性を部分的に阻害することができるが、細胞質ダイニン依存的細胞プロセスをブロックする能力が実証されていない。上述の調査は、シクロブレビンが細胞質ダイニン１及び２の両方を阻害することができることを示し、従って、本化合物がＥｇ５の抑制剤であるモナストロール（ｍｏｎａｓｔｒｏｌ）、及びミオシンIIの拮抗物質であるブレビスタチン（ｂｌｅｂｂｉｓｔａｔｉｎ）のようなモータータンパク質の他の小分子モジュレーターを補完し、ダイニン依存的プロセスに広く応用できるプローブになるであろう。

Claims (17)

1. 式：
   

   

   ［式中、
   Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ、独立して、水素原子、ハロゲン原子、（Ｃ_１〜Ｃ_１０）炭化水素基、−Ｏ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基、フルオロ（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基、−Ｏ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）フルオロアルキル基、水酸基、メチレンジオキシ基、エチレンジオキシ基、−ＣＮ、ニトロ基、−Ｓ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルコキシカルボニル基、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アシル基、アミノ基、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルアミノ基、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アシルアミノ基、及び−Ａ-Ｒ^１０から選択され、ここで、Ａは、（Ｃ_１〜Ｃ_６）炭化水素基であり、Ｒ^１０は、−Ｏ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基、フルオロ（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基、−Ｏ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）フルオロアルキル基、水酸基、−ＣＮ、ニトロ基、−Ｓ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルコキシカルボニル基、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アシル基、アミノ基、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルアミノ基及び（Ｃ_１〜Ｃ_６）アシルアミノ基から選択され；；
   Ｒ^３は、水素原子、シアノ基、ニトロ基、アセチル基及び−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２から選択され；
   Ｒ^４及びＲ^５は、それぞれ、独立して、水素原子及びメチル基から選択され；
   Ｙは、Ｏ又はＮＲ^８であり；
   Ｒ^８は、水素原子及び（Ｃ_１〜Ｃ_７）炭化水素基から選択され、
   Ａｒは、場合により置換されていることのある単環式又は二環式アリール基又はヘテロアリール基であり；
   ＹがＯである場合には、Ａｒは、２，４−ジクロロフェニルであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４及びＲ^５が水素原子であり、Ｒ^３がシアノ基ではないものとする］
   で表される化合物。
2. 式：
   

   

   で表される請求項１記載の化合物。
3. 式：
   

   

   で表される請求項１記載の化合物。
4. Ａｒが、フェニル基、ナフチル基、チオフェニル基、フラニル基、ピロリル基及びピリジニル基から選択され、それらのうちのいくつかは場合により置換基がハロゲン原子、（Ｃ_１〜Ｃ_１０）炭化水素基、フルオロ（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基、−Ｏ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）フルオロアルキル基、−ＣＮ、ニトロ基、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルコキシカルボニル基及び（Ｃ_１〜Ｃ_６）アシル基から独立して選択された置換基１〜３個で置換されていることができる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
5. Ａｒが、ハロゲン原子１〜３個で置換されたフェニル基である、請求項４に記載の化合物。
6. Ａｒが、２，４−ジクロロフェニル又は３，４−ジクロロフェニルである、請求項５に記載の化合物。
7. Ｒ^４及びＲ^５が、水素原子である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
8. Ｒ^３が、Ｈ又はＣＮである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
9. Ｒ^２が、Ｈであり、Ｒ^１が、Ｈ、ハロゲン原子、メトキシ基、アミノプロパルギル基及びアセトアミドプロパルギル基から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
10. Ｒ^１が、Ｈ又はハロゲン原子である請求項９に記載の化合物。
11. Ｒ^３が、ＣＮであり；Ｒ^２、Ｒ^４及びＲが、Ｈであり；Ｒ^１が、Ｈ及びハロゲン原子から選択される、請求項６に記載の化合物。
12. 式：
    

    

    （式中、
    Ｒ^１ａは、水素又はハロゲン原子であり；
    Ｒ^６及びＲ^７は、ハロゲン原子である）
    で表される化合物をダイニンに接触させることを含むダイニンを阻害する方法。
13. 式：
    

    

    （式中、
    Ｒ^１ａは、水素又はハロゲン原子であり；
    Ｒ^６及びＲ^７は、ハロゲン原子である）
    で表される化合物を、繊毛の少なくとも一つを有する細胞に接触させることを含む繊毛の逆行性輸送を阻害する方法。
14. 前記阻害方法が、インビトロにおける方法である、請求項１２又は１３のいずれか一項に記載の化合物。
15. 前記阻害方法が、インビボにおける方法である、請求項１２又は１３のいずれか一項に記載の化合物。
16. 式：
    

    

    ［式中、
    Ｒ^１及びＲ^２は、それぞれ、独立して、水素原子、ハロゲン原子、（Ｃ_１〜Ｃ_１０）炭化水素基、−Ｏ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基、フルオロ（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基、−Ｏ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）フルオロアルキル基、水酸基、メチレンジオキシ基、エチレンジオキシ基、−ＣＮ、ニトロ基、−Ｓ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルコキシカルボニル基、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アシル基、アミノ基、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルアミノ基、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アシルアミノ基、及び−Ａ-Ｒ^１０から選択され、ここで、Ａは（Ｃ_１〜Ｃ_６）炭化水素基であり、Ｒ^１０は−Ｏ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基、フルオロ（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基、−Ｏ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）フルオロアルキル基、水酸基、−ＣＮ、ニトロ基、−Ｓ−（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル基、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルコキシカルボニル基、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アシル基、アミノ基、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルアミノ基、ジ（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルアミノ基及び（Ｃ_１〜Ｃ_６）アシルアミノ基から選択され；
    Ｒ^３は、水素原子、シアノ基、ニトロ基、アセチル基及び−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２から選択され；
    Ｒ^４及びＲ^５は、それぞれ、独立して、水素原子及びメチル基から選択され；
    Ｙは、Ｏ又はＮＲ^８であり；
    Ｒ^８は、水素原子及び（Ｃ_１〜Ｃ_７）炭化水素から選択され、
    Ａｒは、場合により置換されていることのある単環式又は二環式アリール基又はヘテロアリール基であり；
    ＹがＯである場合には、Ａｒが２，４−ジクロロフェニルであり、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^４及びＲ^５が水素原子であり、Ｒ^３がシアノ基ではないものとする］
    で表される化合物を固形腫瘍に接触させることを含む、固形腫瘍の成長を阻害する方法。
17. 前記固形腫瘍が、基底細胞癌、悪性腫瘍及び髄芽腫から選択される、請求項１６に記載の方法。

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