JP2014501536A - カロチノイドに関連する組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

少なくとも２種のカロチノイドを有するペットフード組成物。このカロチノイドは、ケト−カロチノイド及び少なくとも１種の非−ケト−カロチノイドを含み得る。ケト−カロチノイドは、アスタキサンチンを含み得る。ケト−カロチノイドは、アスタキサンチンエステルを含み得る。非−ケト−カロチノイドは、β−カロチン及び／又はルテインを含み得る。

Description

本発明の実施形態は、カロチノイドを使用する組成物及び方法に関する。更に詳しくは、限定するものではないが、本発明の実施形態は、カロチノイドの生物学的利用能を増加させるペットフード組成物及び方法に関する。

食餌からのカロチノイドの生物学的利用能は、種々のカロチノイドの物理化学特性（遊離型対エステル型；炭化水素型対酸化型）；物理状態（結晶性対タンパク質結合性対油中可溶性）；脂肪及び繊維の量や種類などの食餌要素；被験者の栄養学的及び生理学的状態、及び遺伝子型などの多くの要素に影響を受けることがある。更に、腸管レベルでのカロチノイドの相互作用によって、いずれかのカロチノイドの吸収が減少され得る。ミセル取り込み、腸取り込み、リンパ輸送、又は１つを超えるレベルにおいて、吸収に関しての競争が起こり得る。例えば、β−カロチンは、ルテイン吸収を減少させるが、ルテインは、あるヒト被験者においてβ−カロチン吸収を減少させ、他の患者においては上昇させることが報告されている（Ｋｏｓｔｉｃ Ｄ，Ｗｈｉｔｅ ＷＳ，Ｏｌｓｏｎ ＪＡ．Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ，ｓｅｒｕｍ ｃｌｅａｒａｎｃｅ，ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｌｕｔｅｉｎ ａｎｄ β−ｃａｒｏｔｅｎｅ ｗｈｅｎ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｔｏ ｈｕｍａｎ ａｄｕｌｔｓ ｉｎ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｏｒ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｏｒａｌ ｄｏｓｅｓ．Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ．１９９５；６２：６０４〜６１０を参照）。その他の研究では、ルテインはヒト被験者におけるβ−カロチン吸収を削減するが、カイロミクロン中のレチニルエステルの分泌に影響を与えない（ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ Ｈ，ｖａｎ Ｖｌｉｅｔ Ｔ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ，ｓｉｎｇｌｅ ｏｒａｌ ｄｏｓｅｓ ｏｆ β−ｃａｒｏｔｅｎｅ ｗｉｔｈ ｌｕｔｅｉｎ ｏｒ ｌｙｃｏｐｅｎｅ ｏｎ ｔｈｅ β−ｃａｒｏｔｅｎｅ ａｎｄ ｒｅｔｉｎｙｌ ｅｓｔｅｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ−ｒｉｃｈ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｎ．Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ １９９８；６８：８２〜８９を参照）。それとは対照的に、β−カロチン吸収は、これらの被験者におけるリコピンに影響を受けない。ヒト及び動物の血漿における食後の外観に影響する純カロチノイド間の相互作用における、更なる報告が、ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇによってなされている（ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ Ｈ．Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｎｕｔｒ Ｒｅｖ．１９９９；５７：１〜１０を参照）。Ｔｙｓｓａｎｄｉｅｒらは、食品が単独で投与される際、単一の野菜からのβ−カロチン、ルテイン、及びリコピンの吸収は、カロチノイドが豊富な第２の野菜又は第２の野菜において豊富化される精製カロチノイドのいずれかと一緒に投与される際よりも多いことが報告されている（Ｔｙｓｓａｎｄｉｅｒ Ｖ，Ｒｅｂｏｕｌ Ｅ，Ｄｕｍａｓ Ｊ，Ｂｏｕｔｅｌｏｕｐ−Ｄｅｍａｎｇｅ Ｃ，Ａｒｍａｎｄ Ｍ，Ｍａｒｃａｎｄ Ｊ，Ｓａｌｌａｓ Ｍ，Ｂｏｒｅｌ Ｐ．Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｖｅｇｅｔａｂｌｅ−ｂｏｒｎｅ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｔｏｍａｃｈ ａｎｄ ｄｕｏｄｅｎｕｍ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ（Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ）．２００３；２８４：Ｇ９１３〜Ｇ９２２を参照）。

初期の研究では、イヌ科動物及び飼いネコの双方は、食餌からカロチンを吸収することができないことが報告されている（Ｇｏｏｄｗｉｎ Ｔ．Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ．Ｉｎ：Ｇｏｏｄｗｉｎ ＴＷ，ｅｄ．Ｔｈｅ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ Ｌｔｄ．，１９５２；２２９〜２６９）。近年、いくつかの系統的な研究によって、イヌとネコがβ−カロチン及びルテインを吸収することができることが示されている（Ｗｅｎｇ ＢＣ，Ｃｈｅｗ ＢＰ，Ｐａｒｋ ＪＳ，Ｗｏｎｇ ＴＳ，Ｃｏｍｂｓ ＲＬ，Ｈａｙｅｋ ＭＧ，Ｒｅｉｎｈａｒｔ ＧＡ．β−Ｃａｒｏｔｅｎｅ ｕｐｔａｋｅ ｂｙ ｂｌｏｏｄ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｄｏｇｓ．ＦＡＳＥＢ Ｊ １９９７；１１：Ａ１８０．Ｋｉｍ ＨＷ，Ｃｈｅｗ ＢＰ，Ｗｏｎｇ ＴＳ，Ｐａｒｋ ＪＳ，Ｗｅｎｇ ＢＢ，Ｂｙｒｎｅ ＫＭ，Ｈａｙｅｋ ＭＧ，Ｒｅｉｎｈａｒｔ ＧＡ．Ｄｉｅｔａｒｙ ｌｕｔｅｉｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｎｉｎｅ．Ｖｅｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２０００ Ｍａｙ ２３；７４（３〜４）：３１５〜２７．Ｃｈｅｗ ＢＰ，Ｗｅｎｇ ＢＣ，Ｐａｒｋ ＪＳ，Ｗｏｎｇ ＴＳ，Ｃｏｍｂｓ ＲＬ，Ｈａｙｅｋ ＭＧ，Ｒｅｉｎｈａｒｔ ＧＡ．Ｕｐｔａｋｅ ｏｆ β−ｃａｒｏｔｅｎｅ ｂｙ ｂｌｏｏｄ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｃａｔｓ．ＦＡＳＥＢ Ｊ １９９７；１１：Ａ４４７．Ｋｉｍ，Ｈ．Ｗ．，Ｃｈｅｗ，Ｂ．Ｐ．，Ｗｏｎｇ，Ｔ．Ｓ．，Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｓ．，Ｗｅｎｇ，Ｂ．Ｃ．，Ｂｙｒｎｅ，Ｋ．Ｍ．，Ｈａｙｅｋ，Ｍ．Ｇ．＆ Ｒｅｉｎｈａｒｔ，Ｇ．Ａ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍｏｒａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｂｙ ｄｉｅｔａｒｙ ｌｕｔｅｉｎ ｉｎ ｃａｔｓ．Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．２０００，７３：３３１〜３４１）。

しかしながら、イヌとネコにおいて、カロチノイドがどのように相互作用するかは分かっていない。個々のカロチノイドは、イヌとネコの健康に寄与する潜在的な役割を有すると思われるため、コンパニオンアニマルに使用される際に、カロチノイド間に有益な効果があることが望ましい。したがって、製品は、これらのカロチノイドの吸収に良い影響を与える方法で、カロチノイドを組み込むことが望ましい。また、かかる製品は動物においてより有益な効果を示し得る。

１つの実施形態では、少なくとも３種のカロチノイドを含むペットフード組成物が開示されている。カロチノイドは、ケト−カロチノイド、第１の非−ケト−カロチノイド、及び第２の非−ケト−カロチノイドを含み得る。ケト−カロチノイドは、アスタキサンチンを含み得る。ケト−カロチノイドは、アスタキサンチンエステルを含み得る。第１の非−ケト−カロチノイドは、β−カロチンを含み得る。第２の非−ケト−カロチノイドは、ルテインを含み得る。ケト−カロチノイドは、カロチノイドの約０．１重量％〜約２５重量％で存在し、第１の非−ケト−カロチノイドは、カロチノイドの最大で約９９．９重量％で存在し、第２の非−ケト−カロチノイドは、カロチノイドの最大で約９９．９重量％で存在し得る。ペットフード組成物は、栄養的にバランスの取れたキブル、栄養補助食品、ペットスナック、ビスケット、湿潤組成物、並びに及びこれらの組み合わせ及び混合物からなる群から選択され得る。

その他の実施形態では、少なくとも２種のカロチノイドを含み得るペットフード組成物が開示されている。２種のカロチノイドは、アスタキサンチン又はアスタキサンチンエステル、及び非−ケト−カロチノイドのいずれかを含み得る。非−ケト−カロチノイドは、β−カロチン又はルテインを含み得る。非−ケト−カロチノイド対アスタキサンチンの比率は、約２５：７５〜約９０：１０であり得る。ペットフード組成物は、栄養的にバランスの取れたキブル、栄養補助食品、ペットスナック、ビスケット、湿潤組成物、並びに及びこれらの組み合わせ及び混合物からなる群から選択され得る。

他の実施形態では、コンパニオンアニマルにおける非−ケト−カロチノイドの生物学的利用能を上昇させる方法が開示されている。この方法は、コンパニオンアニマルにペットフード組成物を投与する工程を含み、この投与工程は、毎日約２ｍｇ〜約１００ｍｇのカロチノイドをコンパニオンアニマルに送達するように行われる。

用語の定義
本明細書において使用するとき、「ｔｈｅ」、「ａ」及び「ａｎ」を含む冠詞は、特許請求の範囲又は明細書において使用される場合、特許請求されるか又は記載されるものの１つ以上を意味するものとして理解される。

本明細書において使用するとき、「含む（include）」、「含む（includes）」、及び「含んでいる（including）」という用語は、非限定的であることを意味する。

本明細書で使用するとき、「複数」という用語は、１よりも多いことを意味する。

本明細書において使用するところの「動物」又は「ペット」なる用語は、これらに限定されるものではないが、飼いイヌ（イヌ科動物）、ネコ（ネコ科動物）、ウマ、ウシ、フェレット、ウサギ、ブタ、ラット、マウス、ジャービル、ハムスター、ウマなどを含む家畜を意味する。飼いイヌ及び飼いネコは、ペットの特定例であり、本明細書においては「コンパニオンアニマル」と称する。本開示を通して、動物、ペット、又はコンパニオンアニマルという用語が使用されるとき、動物、ペット、又はコンパニオンアニマルは、特に指定のない限り、健常状態であると理解されるべきである。

本明細書で使用するとき、「動物飼料」、「動物飼料組成物」、「動物飼料キブル」、「ペットフード」又は「ペットフード組成物」という用語はいずれも、ペットによって摂取されることを目的とした組成物を意味する。ペットフードとしては、これらに限定されるものではないが、毎日の食餌に適した栄養的にバランスの取れた組成物、並びに栄養的にバランスが取れていてもいなくともよい湿潤食品、栄養補助食品及び／又はペットスナックを挙げることができる。

本明細書で使用するとき、「栄養的にバランスの取れた」という用語は、ペットフードなどの組成物が、更に加える必要のある水を除き、生命を維持するうえで必要とされる既知の栄養素を、ペット栄養分野における、米国食品医薬品局動物薬センター（Unites States Food and Drug Administration’s Center for Veterinarian Medicine）、米国飼料検査官協会（the American Feed Control Officials Incorporated）などの（ただしこれらに限定されない）行政機関を含む広く認識された当局の推奨に基づく適切な量及び割合で有することを意味する。

本明細書で使用するとき、コンパニオンアニマルに対する「経口投与」という用語は、本明細書の１つ以上の組成物を動物が摂取するか、ヒトが動物に与えることを目的としているか、又は動物に与えることを意味する。

本明細書で使用するとき、「吸収」という用語は、例えば、コンパニオンアニマルにおいて、食品からの食餌成分（本明細書に開示されるようなカロチノイドなど）の場合などに、食餌成分が胃腸空間で消化され、拡散のプロセスを通して、腸壁の血管内に入ることを意味する。

本明細書で使用するとき、「生物学的利用能」という用語は、体内で使用又は貯蔵するための食品の食餌成分の吸収を意味する。摂取されるが、消化プロセス中に吸収のために放出はされない食餌成分は、栄養価において制限されない。目的部位に対する摂取された食餌成分及び生理活性代謝産物の送達は、小腸からの吸収に依存する。したがって、生物学的利用能は、食品からの食餌成分の相対的な吸収であるとも見なされ得る。

本明細書で使用するとき、吸収及び生物学的利用能という用語は互換可能であり得る。

本明細書全体にわたって記載されるあらゆる最大数値限定は、それより小さいあらゆる数値限定を、そのような小さい数値限定が本明細書に明示的に記載されたものとして包含すると理解されるべきである。本明細書の全体を通じて与えられる全ての最小数値限定は、それよりも大きい全ての数値限定を、あたかもそれらの大きい数値限定が本明細書に明確に記載されているものと同様にして含むものである。本明細書の全体を通じて与えられる全ての数値範囲は、そのようなより広い数値範囲内に含まれるそれよりも狭い全ての数値範囲を、あたかもそれらのより狭い数値範囲が全て本明細書に明確に記載されているものと同様にして含むものである。

品目の全リスト、例えば、成分のリストは、マーカッシュ群として解釈されることを意図しており、またそのように解釈されるべきである。したがって、全てのリストは、．．．リストの品目．．．「からなる群から選択される」品目「並びにこれらの組み合わせ及び混合物」として読んで解釈することができる。

本明細書では、本発明の実施形態において使用される異なる成分を含む各成分についてはその商品名で参照している。本明細書において特定の商品名の材料により限定されることは、本発明者らの意図するところではない。本明細書の説明文中において、商品名によって参照される材料と同等の材料（例えば、異なる名称又は参照符合で異なる供給源から得られるもの）に置き換えて使用することもできる。

本明細書におけるプロセス、方法、組成物、及び装置は、本明細書に述べられる特徴又は実施形態の任意のものを含むか、これらから基本的になるか、又はこれらからなり得る。

本開示の異なる実施形態の説明において、異なる実施形態又は個々の特徴について開示する。当業者には明らかなように、このような実施形態及び特徴の全ての組み合わせが可能であり、本開示の好ましい実施となり得るものである。本発明の様々な実施形態及び個々の特徴について例示及び説明したが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、他の様々な変更及び改変を行うことが可能である。やはり明らかなことであるが、上記の開示において教示された実施形態及び特徴の全ての組み合わせが可能であり、本発明の好ましい実施となり得るものである。

本発明の実施形態
いくつかの実施形態では、本発明は、食餌性カロチノイドの生物学的利用能を上昇させる組成物及び方法に関する。

本明細書に記載されるように、β−カロチン、ルテイン、及び／又はアスタキサンチンなどの食餌成分の食品からの吸収とは、食餌成分が胃腸空間で消化され、拡散プロセスを通して、腸壁中の血漿に入ることを意味する。本明細書中で、吸収は生物学的利用能と互換可能に使用することができ、一般的には、食品からの食餌成分の吸収を意味する。摂取されるが、消化工程中に吸収のために放出はされない食餌成分には、栄養価において制限されない。目的部位に対する摂取された食餌成分及び生理活性代謝産物の送達は、小腸からの吸収に依存する。したがって、生物学的利用能は、食品からの食餌成分の相対的な吸収であるとも見なされ得る。

カロチノイドは、中央の２つのメチル基が１，６位の関係にあり、残りの非末端メチル基が、１，５位の関係にあるように、中央を除いて分子に対して対称となるように、ヘッドトゥテイル型に結合された８個のイソプレノイド単位からなる炭化水素種である。この構造をもとにして、準系統的番号方式が使用され、カロチノイドは親化合物の誘導体として命名される。ＩＵＰＡＣシステムにおいて、構造の末端基を記載するためにギリシャ文字を使用する。水素添加及び基置換の位置は、接頭及び接尾に示される。カロチノイドの大半は、４０個の炭素ポリエン鎖から得られ、これは、典型的には分枝の主鎖であると見なされる。この鎖は、環状末端基（環）によって終端し、官能基を含有する酸素で補足され得る。全てのカロチノイドは、以下を含む反応によるリコピン（Ｃ４０Ｈ５６）誘導体であると見なされ得る：（１）水素添加反応、（２）脱水素化反応、（３）環化反応、（４）酸素挿入、（５）二重結合移動、（６）メチル移動、（７）鎖伸長、及び（８）鎖短縮。これらの化学構造をもとにして、カロチノイドは、２つの群：炭素及び水素から構成されるカロチンとして一般的に知られている炭化水素；並びに、炭素、水素、及び更に酸素を有するオキシカロチノイド又はキサントフィルに分類される。カロチンの例には、α−カロチン、β−カロチン、γ−カロチン、δ−カロチン、ε−カロチン、ζ−カロチン、リコピン、ノイロスポレン、フィトエン、フィトフルエンがある。酸化カロチノイド又はキサントフィルは、更に、ルテイン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、アンテラキサンチン、ネオキサンチン、及びビオラキサンチンなどの水酸基のみを含有するもの（本明細書ではヒドロキシルキサントフィル類と称される）；及びアスタキサンチン、カンタキサンチン、及びフコキサンチンなどの水酸基を有するか有さないケト基を有するもの（本明細書ではケトキサントフィル類と称される）に分類できる。ケト基を有さないカロチノイドは、本明細書中では非−ケトカロチノイド（β−カロチン及びルテインなど）と呼ばれ、ケト基を有するカロチノイドは、本明細書中ではケト−カロチノイド（アスタキサンチンなど）と呼ばれる。

アスタキサンチンはケトカロチノイドであって、ケト−カントフィルに分類される。多くのカロチノイドは、彩り豊かな脂溶性色素である。アスタキサンチンは、微細藻類、酵母、サケ、マス、オキアミ、エビ、ザリガニ、甲殻類、及び数種の鳥類の羽において見出される。アスタキサンチンの商業生産は、天然源及び合成源の両方から得られる。合成アスタキサンチンは、立体異性体の混合物中で遊離（非エステル化）アスタキサンチンとして生成され、この立体異性体（３Ｒ，３’Ｒ）、（３Ｒ，３’Ｓ）及び（３Ｓ，３’Ｓ）は１：２：１の比率である。一方、天然アスタキサンチンは、通常はエステル化され、大部分は（３Ｓ，３’Ｓ）配置であるか、又は、頻度は少ないが主に（３Ｒ，３’Ｒ）である。現在、アスタキサンチンの主要な天然源は、微細藻類であるヘマトコッカス・プルビアリスである。ヘマトコッカス・プルビアリスにおいて、アスタキサンチンは、３Ｓ，３’Ｓ立体異性体であり、主にモノエステル（＞９０％）として存在し、ジエステルを８％以下含み、遊離分子を１％以下含む（Ｒｅｎｓｔｒｏｍら、１９８１）。その他の天然源は、ファフィア属酵母から得られる。ファフィア属酵母の赤色酵母は、３Ｒ，３’Ｒ及び非−エステル化形態で１００％か１００％に近い遊離アスタキサンチンを示す。遊離アスタキサンチンの１つの好適な源は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｘａｎ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ａｑｕａｓｔａ／ｎａｔｕｒａｌ−ｖｓ−ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ．ｈｔｍｌに記載されている。本明細書で使用するとき、アスタキサンチンという用語は、組成物の一部分として使用され、アスタキサンチンエステルをも意味し得る。

天然に存在する炭化水素カロチノイドであるβ−カロチンは、ニンジン及びヤムなどのオレンジの根野菜、及びほうれん草、ケール、サツマイモの葉などの緑の葉野菜において見出され得る。他の源としては、合成形態又はパーム油、藻類、又は菌類から天然形態で市販されてもいる。ほとんどの哺乳類において、β−カロチンはビタミンＡの前駆体であるため、β−カロチンからビタミンＡへ変換することができることを意味する。ネコは、変換する能力が限られているため、明らかな例外である。β−カロチンは、プロビタミンＡ活性に加えて酸化防止活性もある。β−カロチンはガン及び心臓疾患を予防する栄養補助食品として使用することが可能であり、免疫を増強し、視力を支えることが可能である。β−カロチンは免疫効果やその他の効果を提供するための酸化防止剤としてペットフードにも使用される。

キサントフィル（xanthaphyll）の種に属する天然由来のカロチノイドであるルテインは、ほうれん草及びケールなどの緑の葉野菜中で見出される。他の源としては、合成物、又はマリゴールド抽出物、コーングルテンミール、及びコーンカーネルオイルから得られる天然物も市販されている。ルテインは、目の健康に有益であることが知られている。ルテインは、黄斑において濃縮されることが分かっており、目を酸化応力及び高エネルギーの光から保護するのを助ける。ルテインはまた、心臓血管の健康及び皮膚の健康に利益をもたらす。ルテインは、薬剤、栄養補給食品、食品、動物飼料、及び魚飼料に使用されている。免疫効果やその他の効果を提供するための酸化防止剤としてペットフードにも使用される。

本明細書で使用するとき、β−カロチン、ルテイン、アスタキサンチンの量又は比率が記載されている際、量又は比率には、これらの成分の全て異性体及び形態を含む、これらの成分の全量が含まれる。例えば、β−カロチンのシス−及びトランス−形態は、β−カロチンの量に含まれる。

更には、カロチノイドは酸化防止剤の一部であり、一般的にはβ−カロチン、ルテイン、及びアスタキサンチンなどが挙げられる天然由来の植物色素である。ヒトにおいて、果物及び野菜からのカロチノイドを消費することは、冠状動脈性心疾患及びいくつかの種類のガンのリスクの減少と関連していた（Ｖａｎ Ｐｏｐｐｅｌ Ｇ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｂｅｔａ−ｃａｒｏｔｅｎｅ ｉｎ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．１９９６；５０：Ｓ５７〜Ｓ６１を参照）。カロチノイドはまた、ネコ及びイヌなどのコンパニオンアニマルに対して利益があることが見出されている。

イヌにおいて、食餌性β−カロチン及びルテインは、ビーグル犬における細胞性及び体液性免疫反応を向上することが見出されている（Ｃｈｅｗ ＢＰ，Ｐａｒｋ ＪＳ，Ｗｏｎｇ ＴＳ，Ｗｅｎｇ ＢＣ，Ｋｉｍ ＨＷ，Ｂｙｒｎｅ ＫＭ，Ｈａｙｅｋ ＭＧ，Ｒｅｉｎｈａｒｔ ＧＡ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｄｉｅｔａｒｙ ｂｅｔａ−ｃａｒｏｔｅｎｅ ｉｎ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｎｄ ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｄｏｇｓ．ＦＡＳＥＢ Ｊ １２：Ａ９６７，１９９８及びＫｉｍ ＨＷ，Ｃｈｅｗ ＢＰ，Ｗｏｎｇ ＴＳ，Ｐａｒｋ ＪＳ，Ｗｅｎｇ ＢＣ，Ｂｙｒｎｅ ＫＭ，Ｈａｙｅｋ ＭＧ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｂｙ ｄｉｅｔａｒｙ ｌｕｔｅｉｎ ｉｎ ｄｏｇｓ．ＦＡＳＥＢ Ｊ １９９８；１２：Ａ９６６を参照）。アスタキサンチンは、イヌにおいて、細胞性及び体液性免疫反応の向上、ＤＮＡ損傷の削減、及び炎症の減少など、イヌにおける免疫調節効果を示すことが分かっている（米国特許出願公開第２００４／０１５１７６１号を参照）。

ネコにおいて、食餌性ルテインは特定及び非特定の抗原に対するＤＴＨ反応を向上することが分かっている（Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｓ．，Ｃｈｅｗ，Ｂ．Ｐ．，Ｈａｙｅｋ，Ｍ．Ｇ．，Ｍａｓｓｉｍｉｎｏ，Ｓ．＆ Ｒｅｉｎｈａｒｔ，Ｇ．Ａ．（２００４）．Ｄｉｅｔａｒｙ ｂｅｔａ−ｃａｒｏｔｅｎｅ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｎｄ ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｃａｔｓ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．１８：Ａ５３）。更には、アスタキサンチンを与えられたネコは、細胞性及び体液性免疫反応が向上することが分かっている（ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００４０１５１７６１及びＣｈｅｗ ＢＰ，Ｐａｒｋ ＪＳ，Ｈａｙｅｋ ＭＧ，Ｒｅｉｎｈａｒｔ ＧＡ．Ｄｉｅｔａｒｙ ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｎｄ ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｃａｔｓ．ＦＡＳＥＢ Ｊ ２００３を参照）。

本発明の実施形態は、特定量のカロチノイドを含む組成物に関する。特定の実施形態は、カロチノイドであるアスタキサンチン、β−カロチン及びルテインに関する。本明細書に記載されるように、これらの特定のカロチノイドは、コンパニオンアニマルに健康上の利益を提供する。更には、カロチノイドにおける特定の組み合わせによって、カロチノイドの吸収、又は生物学的利用能を増加させ得ることが明らかになっている。

本明細書の組成物は、例えばイヌ及びネコなどのコンパニオンアニマルによる使用に適応され得る。この点において、当業者に周知であるように、本明細書に記載の組成物の主な使用は、コンパニオンアニマルでの使用であるため、組成物はそのように処方されると理解されるべきである。本明細書で使用される組成物は、ペットフード組成物に使用できる。これらは、必要な食餌における要求を満たすことを目的とした食品、並びにペットスナック（例えばビスケット）又は他の栄養補助食品を有利に含む。本明細書の組成物は、乾燥組成物（例えばキブル）、半湿潤組成物、湿潤組成物、又はこれらの任意の混合物でなどのペットフード組成物であり得る。その代わり又はそれに加えて、組成物は、グレービー、飲料水、ヨーグルト、粉末、懸濁液、チュー、ペットスナック（例えばビスケット）、ふりかけ粉末、又は他の任意の送達形態などの栄養補助食品であり得る。一例として、１つの実施形態では、組成物は、栄養的にバランスが取れており、栄養的にバランスの取れたキブルであり得る。

本明細書で記載される組成物は、通常の食餌における要求に対する栄養補助食品として使用され得るか、コンパニオンアニマルにおける主食（及び、栄養的なバランスを取り得る栄養補助食品又は食品など）として供し得る。投与は、必要又は希望に応じて、例えば、月に１回、週に１回、又は毎日（１日に数回も含む）なされ得る。通常の食餌における要求に対する栄養補助食品として使用する際、組成物は、哺乳類に直接投与されてよく、あるいは、毎日の食餌又は食品又は水に入れるか予め混ぜることで投与され得る。毎日の食餌又は食品として使用する際、投与は当業者に周知であろう。

本明細書で使用される組成物は、１つ以上の更なる要素を含み得る。１つの実施形態では、組成物は、乾燥物基準で、組成物の約１０重量％〜約９０重量％の粗タンパク質、あるいは約２０重量％〜約５０重量％の粗タンパク質、あるいは約２０重量％〜約４０重量％の粗タンパク質、あるいは組成物の約２０重量％〜約３５重量％の粗タンパク質を含み得る。粗タンパク質材料には、大豆、穀物（トウモロコシ、小麦など）、綿の実、及びピーナツなどの植物性タンパク質、又はカゼイン、アルブミン、及び肉タンパク質などの動物性タンパク質が含まれ得る。本明細書で有用な肉タンパク質の非限定的な例としては、牛肉、豚肉、羊肉、鶏肉、魚、及びこれらの混合物からなる群から選択されるタンパク質源が挙げられる。

更に、組成物は、乾燥物基準で、組成物の約５重量％〜約４０重量％の脂肪、又は約１０重量％〜約３５重量％の脂肪を含み得る。

本発明の組成物に関する各実施形態は、炭水化物源を更に含み得る。一実施形態では、組成物は、組成物の約３５重量％〜組成物の約５０重量％までの炭水化物源を含み得る。他の実施形態では、組成物は、組成物の約３５重量％〜約４５重量％、又は組成物の約４０重量％〜５０重量％の炭水化物源を含み得る。例示的な炭水化物源としては、米、トウモロコシ、ミロ、ソルガム、大麦、小麦などのグレイン又は穀物がある。

組成物は、これらに限定されるものではないが、乾燥ホエイ及び他の乳製品副産物、ビートパルプ、セルロース、繊維、魚油、亜麻、ビタミン類、ミネラル類、香味料、酸化防止剤、並びにタウリンなどの他の材料も含み得る。

組成物は、他の任意成分を更に含んでもよい。任意成分としては、プロバイオティック成分（ビフィズス菌及び／又は乳酸菌）及びプレバイオティック（フラクトオリゴ糖類）成分が挙げられる。含まれ得るプロバイオティック成分及びプレバイオティック成分の例並びに量については、例えば米国特許出願公開第２００５／０１５８２９４号に開示されている。含まれ得る他の任意成分は、オメガ６及びオメガ３脂肪酸、カルニチン、ヘキサメタリン酸塩、グルコサミン、及びコンドロイチン硫酸塩がある。組成物は、胃腸の健康を増進させるための少なくとも１つ以上の繊維源も含み得る。かかる繊維源には、例えば、少なくとも１つの中度発酵性繊維を含み得る。中度発酵性繊維は、コンパニオンアニマルの免疫系に利益をもたらすことが上述されている。中度発酵性繊維又は、腸内のプロバイオティクス微生物の成長を促進するプロバイオティクス組成物を提供する当業者に既知の他の組成物は、本発明によって動物の免疫系にもたらされる利益を増加させるのに役立たせるために、組成物に組み込まれ得る。更に、ラクトバシラス又はビフィドバクテリウム種などのプロバイオティク微生物は、例えば組成物に添加されてもよい。

他の任意成分としては、緑茶、紅茶、烏龍茶、白茶などの茶；アルファリポ酸及びその塩；ハーブ及びスパイス並びにハーブとスパイスから得られる精油；組成物１ｋｇ当たり約１００ｍｇ〜約２０００ｍｇのビタミンＥ；ビタミンＣ（アスコルビン酸）；セレン；ローズマリーエキス；イソフラボン；クロム；果物；及び野菜が挙げられる。

本発明の方法は、コンパニオンアニマル及び最も好ましくは飼いイヌ又はネコに本発明の組成物を経口投与（すなわち摂食）する工程を含む。組成物をヒトが摂取するように指示された場合には、その指示は、組成物の使用によって、例えば、炎症の軽減又は免疫反応の増強などの利益を提供し得る及び／又は提供するであろうことをヒトに教示及び／又は報告するものであり得る。例えば、かかる指示は、口頭の指示（例えば、医師、獣医、又は他の医療従事者からの口頭の説明による）；又はラジオ若しくはテレビ媒体（すなわち広告）；又は書面の指示（例えば、医師、獣医若しくは他の医療従事者（例えば、手書き）、又は販売員若しくは販売組織（例えば、販売冊子、パンフレット、若しくは他の指示するための道具による）、書記媒体（例えば、インターネット、電子メール、若しくは他のコンピューター関連媒体）からの書面の指示による）；及び／又は組成物に関連する包装（例えば、組成物を保持する容器上に存在するラベル）であってもよい。本明細書で使用されるとき、「書面」は、単語、絵、記号、及び／又は他の目に見える記述によることを意味する。こうした情報は、例えば「軽減する」、「炎症」、「増強する」、「免疫性」、「反応」、などといった、本明細書において使用される実際の単語を利用する必要はなく、むしろそれと同一又は類似の意味を伝達する単語、絵、記号等の使用が本発明の範囲内で想到される。

使用される組成物の量は、コンパニオンアニマルの状態及び／又は年齢、ペットフード組成物又は栄養補助食品の品質（必要に応じて）、及びコンパニオンアニマルの大きさ又は品種（必要に応じて）、などの様々な要素に左右され得る。

したがって、少なくとも３種のカロチノイドを含み、この３種のカロチノイドには、ケト−カロチノイド及び第１の非−ケト−カロチノイド及び第２の非−ケト−カロチノイドが含まれる、ペットフード組成物が本明細書に開示される。ケト−カロチノイドは、アスタキサンチン及びアスタキサンチンエステルなどの任意のケト−カロチノイドを含み得る。第１及び第２の非−ケト−カロチノイドには、β−カロチン及びルテインなどの本明細書に開示される任意の非−ケト−カロチノイドが挙げられる。

１つの実施形態では、ペットフード組成物は、２種のカロチノイドを含み、この２種のカロチノイドは、アスタキサンチン又は１つの非−ケト−カロチノイドを含むアスタキサンチンエステルを含む。

記載されるように、本発明の実施形態は、β−カロチン、ルテイン、及びアスタキサンチンを様々な量、組み合わせ、及び／又は比率で含む組成物を含む。したがって、これらの要素は、組成物全体の重量においてカロチノイドの全量を占め得る。１つの実施形態では、栄養学的にバランスの取れたペットフード組成物におけるカロチノイドの全量は、組成物の約０．００２５重量％である。他の実施形態では、栄養学的にバランスの取れたペットフード組成物におけるカロチノイドの全量は、組成物の約０．０００５重量％〜約０．０２５重量％である。他の実施形態では、栄養学的にバランスの取れたペットフード組成物におけるカロチノイドの全量は、組成物の約０．０００１重量％〜約０．０１重量％である。他の実施形態では、栄養学的にバランスの取れたペットフード組成物におけるカロチノイドの全量は、組成物の約０．００１重量％〜約０．０１重量％である。他の実施形態では、栄養学的にバランスの取れたペットフード組成物におけるカロチノイドの全量は、組成物の約０．００１重量％〜約０．００５重量％である。他の実施形態では、栄養学的にバランスの取れたペットフード組成物におけるカロチノイドの全量は、組成物の約０．００２重量％〜約０．００３重量％である。

他の実施形態では、ビスケットなどの栄養補助食品におけるカロチノイドの全量は、組成物の約０．０５２５重量％である。他の実施形態では、ビスケットなどの栄養補助食品におけるカロチノイドの全量は、組成物の約０．０１重量％〜約０．１重量％である。他の実施形態では、ビスケットなどの栄養補助食品におけるカロチノイドの全量は、組成物の約０．０２重量％〜約０．０８重量％である。他の実施形態では、ビスケットなどの栄養補助食品におけるカロチノイドの全量は、組成物の約０．０４重量％〜約０．０６重量％である。

１つの実施形態では、β−カロチン、ルテイン、及びアスタキサンチンは、３種のカロチノイドの全量に対して、様々な量で組み合わされてよい。１つの実施形態では、β−カロチンは、カロチノイド全量の０重量％〜約９９．９重量％で含まれ得る。１つの実施形態では、ルテインは、カロチノイド全量の０重量％〜約９９．９重量％で含まれ得る。１つの実施形態では、アスタキサンチンは、カロチノイド全量の約０．１重量％〜約２５重量％で含まれ得る。１つの実施形態では、β−カロチン及びルテインのうちの１種のみがアスタキサンチンとともに組成物中に存在している。１つの実施形態では、全３種のカロチノイドが組成物中に存在している。１つの実施形態では、β−カロチンは、カロチノイド全量の約３０重量％〜約８０重量％、又は約４０重量％〜約６０重量％、又は約５０重量％、又は約５５重量％で存在し得る。１つの実施形態では、ルテインは、カロチノイド全量の約１０重量％〜約４０重量％、又は約２０重量％〜約４０重量％、又は約２５重量％、又は約３５重量％、又は約２５重量％、又は約３０重量％で存在し得る。１つの実施形態では、アスタキサンチンは、カロチノイド全量の約６重量％〜約２５重量％、又は約６重量％〜約２５重量％、又は約１０重量％〜約２５重量％、又は約１５重量％、又は約２０重量％、又は約２５重量％で存在し得る。

β−カロチン及びルテインのうち１種のみがアスタキサンチンとともに存在し得る１つの実施形態では、β−カロチン又はルテインとアスタキサンチンとの比率は、約２５：７５〜約９０：１０、又は約４０：６０〜約７０：３０、又は約７５：２５〜約９０：１０、又は約８０：２０〜約９０：１０、又は約５０：５０で存在し得る。

β−カロチン、ルテイン、及びアスタキサンチンである全３種のカロチノイドが存在する１つの実施形態では、アスタキサンチンの量に関わらず、β−カロチンとルテインの比率は、約１：１０〜約１０：１、又は約１：９〜約９：１、又は約１：８〜約８：１、又は約１：７〜約７：１、又は約１：６〜約６：１、又は約１：５〜約５：１、又は約１：４〜約４：１、又は約１：３〜約３：１、又は約１：２〜約２：１、又は約２：１、又は約１：１で存在し得る。

β−カロチン、ルテイン、及びアスタキサンチンである全３種のカロチノイドが存在する１つの実施形態では、β−カロチン対ルテイン対アスタキサンチンの比率は、約１：１：０．６〜約１０：１：３．５、又は約１：１：０．６〜約１：１０：３．５で存在する。β−カロチン、ルテイン、及びアスタキサンチンである全３種のカロチノイドが存在する１つの実施形態では、β−カロチン対ルテイン対アスタキサンチンの比率は、約１：１：０．００２〜約１０：１：０．０１、又は約１：１：０．００２〜約１：１０：０．０１、又は約４：１：１．５、又は約２：１：１又は約２：１：０．５で存在する。

１つの実施形態は、本発明に開示されるカロチノイドの生物学的利用能を向上させる方法には、本明細書に開示される組成物をコンパニオンアニマルに投与する工程を含む。記載されるように、コンパニオンアニマルに投与され、消費される際、カロチノイドの組み合わせによってカロチノイドの生物学的利用能が向上し得る。

１つの実施形態では、コンパニオンアニマルに投与されるカロチノイドの全量は、１日当たり、約２ｍｇ〜約１００ｍｇ、又は約２ｍｇ〜約５０ｍｇ、又は約２ｍｇ〜約２０ｍｇであり得る。１つの実施形態では、コンパニオンアニマルに投与されるカロチノイドの全量は、１日当たり、約２０ｍｇである。もちろん、当該技術分野において既知であるように、これらの量は、組成物が処方されるコンパニオンアニマルの種類及び大きさによって変化し得る。例えば、イヌにおいて、超大型犬に投与される１日当たりのカロチノイドの全量は約２０ｍｇであって、大型犬に投与される１日当たりのカロチノイドの全量は約１２〜１３ｍｇであって、中型犬に投与される１日当たりのカロチノイドの全量は約４〜５ｍｇであって、小型犬に投与される１日当たりのカロチノイドの全量は約２ｍｇであり得る。２０ポンド未満の体重のイヌを小型犬と称し、２０〜５０ポンドの体重のイヌを中型犬と称し、５０〜９０ポンドの体重のイヌを大型犬と称し、９０ポンドを超える体重のイヌを超大型犬と称し得る。カロチノイドの全量において、個々のカロチノイド自体の量を変更して投与することができる。１つの実施形態では、β−カロチンは、１日当たり約１ｍｇ〜約５０ｍｇ、又は１日当たり約１ｍｇ〜約２０ｍｇ、又は１日当たり約１ｍｇ〜約１５ｍｇ、又は１日当たり約２ｍｇ〜約１０ｍｇ、又は１日当たり約１ｍｇ、又は１日当たり約２ｍｇ、又は１日当たり約５ｍｇで投与され得る。１つの実施形態では、ルテインは、１日当たり約１ｍｇ〜約５０ｍｇ、又は１日当たり約１ｍｇ〜約２０ｍｇ、又は１日当たり約１ｍｇ〜約１５ｇ、又は１日当たり約２ｍｇ〜約１０ｍｇ、又は１日当たり約１ｍｇ、又は１日当たり約２ｍｇ、又は１日当たり約５ｍｇで投与され得る。１つの実施形態では、アスタキサンチンは、１日当たり約０．００１ｍｇ〜約２５ｍｇ、又は１日当たり約０．０１ｍｇ〜約２５ｍｇ、又は１日当たり約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇ、又は１日当たり約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ、又は１日当たり約０．５ｍｇ〜約５ｍｇ、又は１日当たり約０．５ｍｇ〜約２．５ｍｇ、又は１日当たり約１ｍｇ〜約２．５ｍｇ、又は１日当たり約１ｍｇ〜約２ｍｇ、又は１日当たり約１ｍｇ、又は１日当たり約２ｍｇ、又は１日当たり約５ｍｇで投与され得る。もちろん、これらの個別のカロチノイドは、コンパニオンアニマルの種類及び血統に基づいて変更されてもよい。

（実施例１）
カロチノイド栄養補助食品−インビボ
避妊手術／去勢手術がなされた１８頭のロットワイラー犬（５〜６歳）を無作為に３群に分けた。１つの群を対照群とし、β−カロチン、ルテイン、又はアスタキサンチンを含まない対照ビスケットを与え、他の２群には、以下のような酸化防止剤混合物を含有するビスケットを与えた：１群にはβ−カロチン及びルテイン含有ビスケット（ＢＬ）を与え、もう１つの群にはβ−カロチン、ルテイン、及びアスタキサンチン含有ビスケット（ＢＬＡ）を与えた。全てのイヌは、Ｉａｍｓ（登録商標）Ｌａｒｇｅ Ｂｒｅｅｄ Ｄｉｅｔ（ビタミンＥ ＧＡレベル＝１４０ＩＵ）を与えた。カロチノイドの１日用量を送達するためにビスケットを使用した。所望のレベルのカロチノイドを供給するために、１日に４個のビスケットを各イヌに与えた。ビスケットの大きさは、約１０〜１２グラムであった。

対照ビスケットは、Ｅｕｋａｎｕｂａ（登録商標）Ｈｅａｌｔｈｙ Ｅｘｔｒａ Ａｄｕｌｔ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｂｉｓｃｕｉｔｓであった。

β−カロチン及びルテイン含有ビスケットは、Ｅｕｋａｎｕｂａ（登録商標）Ｈｅａｌｔｈｙ Ｅｘｔｒａ Ａｄｕｌｔ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｂｉｓｃｕｉｔｓであった。β−カロチンとルテインとを６３：３７の比率で組み合わせたものを、イヌが１日に２１．３６ｍｇ消費するように、イヌにビスケットを供給した。

β−カロチン、ルテイン、及びアスタキサンチン含有ビスケットは、Ｅｕｋａｎｕｂａ（登録商標）Ｈｅａｌｔｈｙ Ｅｘｔｒａ Ａｄｕｌｔ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｂｉｓｃｕｉｔｓであった。β−カロチン、ルテイン及びアスタキサンチンを６１：１６：２３の比率で組み合わせたものを、イヌが１日に２１．５５ｍｇ消費するように、イヌにビスケットを供給した。

表１は、ＢＬビスケット（ペットスナック１）及びＢＬＡビスケット（ペットスナック２）を消費するロットワイラー犬のまとめを示している。イヌの生理学的測定値を測定及び比較するために、対照ビスケットを使用した。表に示されるように、イヌは、１日にほぼ同量のカロチノイド（２１．３６対２１．５５）を消費したが、ペットスナック１ではβ−カロチン及びルテインのみが提供されており、ペットスナック２ではβ−カロチン、ルテイン、及びアスタキサンチンが提供されている。したがって、個々のカロチノイドの比率も異なるため、表１に示す。本実施例において、アスタキサンチンは、アスタキサンチンとアスタキサンチンエステルの混合物であることに留意すべきである。

表１で示されるように、カロチノイドは、ペットスナック１ビスケット及びペットスナック２ビスケットを消費するロットワイラー犬に吸収され、体循環に到達することが可能であった。血清カロチノイドは、ビスケットの形態でカロチノイドを与えた６週間後にＨＰＬＣによって測定した。血清濃度を表１に示す。

ペットスナック１を消費したイヌには、約１３．５ｍｇ／日のβ−カロチン（Ｂ）及び約７．８ｍｇ／日のルテイン（Ｌ）を含む２１．３６ｍｇ／日の全カロチノイドを与えられた。これらの量によって、β−カロチンとルテインの比率は約６３：３７（現物基準）となった。ペットスナック２を消費したイヌには、約１３．２ｍｇ／日のβ−カロチン（Ｂ）及び約３．４ｍｇ／日のルテイン（Ｌ）、及び約４．９ｍｇ／日のアスタキサンチン（Ａ）を含む２１．５５ｍｇ／日の全カロチノイドを与えた。これらの量によって、β−カロチン対ルテイン対アスタキサンチンの比率は約６１：１６：２３となり、アスタキサンチンは全カロチノイドの約２３％含まれる（現物基準）ものであった。

したがって、ペットスナック１とペットスナック２のカロチノイドの全量をほぼ同じに保ち、ペットスナック２に対してアスタキサンチンを加え、血清濃度を測定してみると、アスタキサンチンを含有しないペットスナック１と比較して、β−カロチン吸収が約１０２％増加し（１．４８対０．７３）、ルテイン吸収が約１４２％増加した２．２５対５．４６）。

更には、ＤＮＡ損傷に対する感受性の指標となる、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）のエクスビボのＨ_２Ｏ_２攻撃に対する感受性が、本実施例におけるイヌにおいて変化した。β−カロチン、ルテイン、及びアスタキサンチン含有ビスケットを消費したイヌにおいて検査したＰＢＬは、イヌがビスケットを消費し始める前の基準と比較して５．２％ ＤＮＡ損傷が減少した。しかしながら、β−カロチン及びルテイン含有ビスケットにおいて、検査したイヌのＰＢＬは、２．４％しかＤＮＡ損傷が減少していなかった。これらは、β−カロチン、ルテイン、又はアスタキサンチンを含有しない対照ビスケットを消費したイヌにおいて検査したＰＢＬと比較して、１０．１％ ＤＮＡ損傷が増加した。したがって、本実施例から明らかなように、β−カロチン及びルテイン含有ビスケットとβ−カロチン、ルテイン、及びアスタキサンチン含有ビスケットの双方は、ＰＢＬをＤＮＡ損傷から守るのを助けるが、β−カロチン、ルテイン、及びアスタキサンチン含有ビスケットの方が、よりＤＮＡ損傷からＰＢＬを守る。本実施例によって、カロチノイド含有ビスケットを消費したイヌにおけるＤＮＡ損傷の疑いの減少に反映されるため、酸化応力が減少する。

インビトロにおいて、Ｃａｃｏ−２細胞モデルのインビトロ消化とともに、カロチノイドの細胞取り込みを、消化した食品からミセル化したカロチノイドの細胞獲得を調べ、それによって、食品／食餌からのカロチノイドの吸収を予測するのに使用した。実施例２、３、及び４にこれらを示す。

（実施例２）
カロチノイド−インビトロ吸収
カロチノイドのインビボ吸収を模倣するために、腸管培養モデルを用いたインビトロ消化を展開させた。インビトロ消化によって測定される吸収は、カロチノイド豊富化野菜を供給されたヒト被験者の小腸管腔内容物から試料を採取することで得られるデータ、及び刊行されているヒトの研究から得られる生物学的利用能データと非常に関連があることに注意することが重要である。

連動した擬似消化／Ｃａｃｏ−２細胞モデルを使用して、β−カロチン（Ｂ）、ルテイン（Ｌ）、及びアスタキサンチン（Ａ）又はアスタキサンチンエステル（ＡＥ）における相互作用反応を試験した。カロチノイド豊富化油の擬似消化中に生成するミセルで４時間インキュベーションした後の細胞カロチノイドが以下の表２で見られる。

ＢＬＡ（Ａは全カロチノイドの２５％）において、Ｂ細胞取り込みは８．５９％であって、ＢのみにおけるＢ取り込みと比較して５０．６％上昇し、Ｌ取り込みは６．３７％であって、ＬのみにおけるＬ取り込みと比較して５．８８％上昇した。ＢＬＡＥ（ＡＥは全カロチノイドの２５％）において、Ｂ細胞取り込みは１２．０９％であって、ＢのみにおけるＢ細胞取り込みと比較して１１２．０５％上昇し、Ｌ細胞取り込みは．１２．１８％であって、ＬのみにおけるＬ細胞取り込みと比較して１０２．３５％上昇した。

カロチノイド細胞取り込み％＝（細胞中のカロチノイド／試験食品に加えられたカロチノイド）×１００％。

擬似消化：１０ｍＬの１２０ｍＭ食塩水で無脂肪ヨーグルト（２．７ｇ）を均質化した。混合物を５０ｍＬのガラス試験管に移した。カロチノイド豊富化油を注意深く各反応物（試験油１つ当たり６個複製）に加え、大豆油を使用して、油の全容量を３００μＬに調整した。この擬似消化の手順は、反応物が脾酵素及び胆汁抽出物を含有している以外、標準的なプロトコルに従った（Ｆａｉｌｌａ ＭＬ．，Ｃｈｉｔｃｈｕｍｒｏｏｎｃｈｏｋｃｈａｉ Ｃ．（２００５）Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｏｄｅｌｓ ａｓ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｖｉｔａｍｉｎ Ａ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ ｉｎ ｆｏｏｄｓ．ＨａｒｖｅｓｔＰｌｕｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ｓｅｒｉｅｓ ３．３２ ｐ．ｗｗｗ．ｈａｒｖｅｓｔｐｌｕｓ．ｏｒｇ／ｐｄｆｓ／ｔｅｃｈ０３．ｐｄｆを参照）。胆汁抽出物を含まない擬似消化も、油から水性分画へのカロチノイドの送達は胆汁に依存することを示すために行った。胃及び小腸消化の終了後、消化物のアリコート（９ｍＬ）を４５分間４℃で１２，０００回転で遠心分離し、ミセルカロチノイドを含有する水性分画を残りの非消化物質と分離した。水性分画をシリンジフィルター（０．２２μｍ）に通し、水相又はミセル相のいずれかに分画されるカロチノイドを測定した。消化物及び水性分画のアリコートは、抽出前に最大でも１週間、−２０℃で保管した。β−カロチン及びルテインをＣｈｉｔｃｈｕｍｒｒｏｎｃｈｏｋｃｈａｉらに従って定量化し、（Ｃｈｉｔｃｈｕｍｒｏｏｎｃｈｏｋｃｈａｉ Ｃ．，Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＳＪ．，Ｆａｉｌｌａ ＭＬ．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｌｕｔｅｉｎ ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ ｆｒｏｍ ｍｅａｌｓ ａｎｄ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｕｓｉｎｇ ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃａｃｏ−２ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｎｕｔｒ．２００４；１３４：２２８０〜２２８６を参照）、アスタキサンチンをＬｉｎ ＷＣらに記載されるように測定した（Ｌｉｎ ＷＣ，Ｃｈｉｅｎ ＪＴ，Ｃｈｅｎ ＢＨ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ ｉｎ ｓｐｅａｒ ｓｈｒｉｍｐ ｓｈｅｌｌｓ（Ｐａｒａｐｅｎａｅｏｐｓｉｓ ｈａｒｄｗｉｃｋｉｉ）ｂｙ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．２００５ Ｊｕｎ ２９；５３（１３）：５１４４〜９）。

細胞取り込みは、個々のカロチノイド又はカロチノイドの混合物が豊富化された油の消化中に発生し：ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）から入手したＣａｃｏ−２細胞（ＨＴＢ３７；２５〜２８継代）を１９継代で６−ウェルのプラスチック皿に維持した。細胞を１５％の熱失活したＦＢＳを加えた完全ＤＭＥＭ中で培養した。コンフルエントにした後、ＦＢＳを７．５％まで減少させ、１日おき及び実験の前日に培地を交換した。１１〜１４ｄｐｃで培養物を実験に使用した。試験培地が細胞を処理できるように、試験体の擬似消化から得られた水性分画を基礎ＤＭＥＭで１：４に希釈した。６−ウェルプラスチック皿の各ウェルに２ｍＬの試験培地を加え、皿を細胞培養インキュベーター（５％ Ｃｏ２、３７℃）に４時間戻した。試験培地を４時間暴露した後、２ｇ／Ｌのアルブミンを加えた１×冷ＰＢＳ及び２×冷ＰＢＳで洗浄して細胞を採取した。１．５ｍＬの冷ＰＢＳ中で細胞をかきだして、１５ｍＬのポリプロピレン試験管に移した。８００×ｇで、１０分間４℃で細胞ペレットを遠心分離して収集した。ＰＢＳを廃棄した後、細胞ペレットを窒素で空試験し、ＨＰＬＣでカロチノイド分析をするために、１週間以内−２０℃で保存した。

（実施例３）
カロチノイド−インビトロ吸収
Ｃａｃｏ−２細胞モデルを使用して、β−カロチン（Ｂ）、ルテイン（Ｌ）、及びアスタキサンチン（Ａ）間の相互作用を調べた。表３に結果を示す。

ＢＬＡ_高（Ａは全カロチノイドの２５％）において、Ｂ吸収は１８．５％であって、ＢのみにおけるＢ吸収と比較して２０．９２％上昇し、Ｌ吸収は３４．１％であって、ＬのみにおけるＬ吸収と比較して５．８８％上昇した。ＢＬＡ_低（Ａは全カロチノイドの１２．５％）において、Ｂ及びＬ吸収は、ＢＬＡ_高と比較して同様の上昇度合を示す。

カロチノイド取り込み％＝（細胞中のカロチノイド＋外側肺底区画中のカロチノイド）×１００％／試験培地中のカロチノイド

Ｆａｉｌｌａ ＭＬ．，Ｃｈｉｔｃｈｕｍｒｏｏｎｃｈｏｋｃｈａｉ Ｃ．（２００５）Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｏｄｅｌｓ ａｓ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｖｉｔａｍｉｎ Ａ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ ｉｎ ｆｏｏｄｓ．ＨａｒｖｅｓｔＰｌｕｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ｓｅｒｉｅｓ ３．３２ ｐ．ｗｗｗ．ｈａｒｖｅｓｔｐｌｕｓ．ｏｒｇ／ｐｄｆｓ／ｔｅｃｈ０３．ｐｄｆ．のプロトコルに従って、トランスウェルインサート（孔：３．０μｍ）上でＣａｃｏ−２ヒト腸細胞を生育し、維持した。培養物は、コンフルエント２１日後（ｄｐｃ）に使用した。

β−カロチン（Ｂ）、ルテイン（Ｌ）、又はアスタキサンチン（Ａ）のいずれかを含有する合成ミセルストック（ＳＭ）を、Ｃｈｉｔｃｈｕｍｒｏｏｎｃｈｏｋｃｈａｉら（２００４）に記載されるように調製した。

アピカルチャンバ（ＡＰ）及び側底培地（ＢＬ）中で使用した培地を収集する前に、９５％空気、５％ＣＯ_２の湿潤環境で、３７℃で１８時間、処理した細胞をインキュベートした。分析まで、全ての試料を窒素下で−８０℃で冷凍した。培地及び細胞におけるカロチノイド分析は、Ｃｈｉｔｃｈｕｍｒｏｏｎｃｈｏｋｃｈａｉ（Ｃｈｉｔｃｈｕｍｒｏｏｎｃｈｏｋｃｈａｉ Ｃ．，Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＳＪ．，Ｆａｉｌｌａ ＭＬ．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｌｕｔｅｉｎ ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ ｆｒｏｍ ｍｅａｌｓ ａｎｄ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｕｓｉｎｇ ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃａｃｏ−２ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｎｕｔｒ．２００４；１３４：２２８０〜２２８６を参照）に記載されるように定量化した。細胞のタンパク質含有量は、ビシンコニン酸分析によって測定した（Ｐｉｅｒｃｅ−ｗｗｗ．ｐｉｅｒｃｅｎｅｔ．ｃｏｍ／ｆｉｌｅｓ／１２９６ａｓ８．ｐｄｆ）。フェノールレッドの傍細胞輸送率を監視して単分子層の一体性を測定した（Ｃｈｉｔｃｈｕｍｒｏｏｎｃｈｏｋｃｈａｉ Ｃ．，Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＳＪ．，Ｆａｉｌｌａ ＭＬ．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｌｕｔｅｉｎ ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ ｆｒｏｍ ｍｅａｌｓ ａｎｄ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｕｓｉｎｇ ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃａｃｏ−２ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｎｕｔｒ．２００４；１３４：２２８０〜２２８６を参照）。

（実施例４）
カロチノイド−インビトロ吸収
実施例２に記載されるような擬似消化及びＣａｃｏ−２細胞モデルを使用してβ−カロチン（Ｂ）、ルテイン（Ｌ）及びアスタキサンチン（Ａ）間の相互作用を試験した。試験媒体におけるカロチノイドの最終濃度は、２００ｎｍｏＬのβ−カロチン若しくは２００ｎｍｏＬのルテイン、並びに１００ｎｍｏＬのβ−カロチン、５０ｎｍｏＬのルテイン及び５０ｎｍｏＬ若しくは８ｎｍｏＬの遊離（非エステル化）アスタキサンチンを含有する混合物、のいずれかであった。Ｃａｃｏ−２細胞の単分子層（１２ｄｐｃ）を試験化合物に暴露し、４時間インキュベートした。ＨＰＬＣで細胞取り込みの分析を行うために、細胞を採取し、抽出した。細胞中のカロチノイド（ｐｍｏｌ）を２ｍＬの試験培地におけるカロチノイド（ｐｍｏｌ）で割ることで、細胞取り込みパーセントを算出した。

表４に結果を示す。ＢＬＡ高（Ａは全カロチノイドの２５％）において、Ｂ吸収は２０．９％であった。Ｌ吸収は４１．２％であった。ＢＬＡ低（Ａは全カロチノイドの５％）において、Ｂ吸収は２５．４％であり、Ｌ吸収は４６．９％であった。

したがって、表１〜４に示されるように、アスタキサンチン（又はアスタキサンチンエステル）がβ−カロチン及び／又はルテインと組み合わされる際、ケト−カロチノイドが比較的少量であったとしてもカロチノイドの吸収に上昇が起こった。この吸収の上昇は、インビトロとインビボの双方において見られた。

利点
本明細書で開示されるカロチノイド含有組成物は、コンパニオンアニマルに健康上の利益を提供し得る。利益としては、学習能力、最適な脳機能、脳の発達、記憶、神経の発達、敏捷性、注意力、認知能力、認知機能障害、神経変性障害、神経伝達障害、脳虚血損傷の減少、加齢に関連した衰えである精神力／認知力／記憶力の低下の防止又は減少、身体持久力及び筋力回復力、持久力及び回復時間の減少、ランニング／ウォーキング／ハンティング時間、階段上昇数、筋肉細胞にエネルギーをもたらす脂肪燃焼、視界がはっきりするといった感覚的な利益、眼の混濁の減少、加齢に関連した網膜変性の減少、疲れ目の減少、聴覚及び嗅覚の改善、ＵＶ保護における皮膚の改善、皮膚の天然の酸化防止剤ネットワーク及びＤＮＡの保護、皮膚、皮膚及び毛並みの抗炎症（皮膚のかゆみ及び耳感染の減少）、酸化応力（核酸損傷など）、免疫反応／生体防御／耐病性、ワクチン反応、移動性、関節／骨の健康、活動活性レベル、生活の質、虚弱指標の実行、炎症の減少、胃腸（ＧＩ）における利益、腸内微生物叢の改善、ＧＩ、下痢における不調の減少、酸化応力の向上（実施例１に開示されるように）、ＡＯＸの組み合わせによるＡＯＸの状態、老齢のペット又は下痢状態におけるＡＯＸの保持、腎臓の健康、腎疾患、健康体重の維持、歯及び歯肉の健康、ガンの予防、心臓保護及び心臓の健康、及び心臓血管疾患の予防が挙げられる。

加えて、本発明の実施形態は、本明細書の実施形態は、本明細書に開示される組成物を投与することによって、コンパニオンアニマルの健康を増進する方法にも関する。知られているように、これらのカロチノイドはコンパニオンアニマルに対して健康上の利益を有し、これらのカロチノイドの生物学的利用能を上昇させることで、結果的に健康上の利益が増加することに繋がる。

よって、本明細書で示され、実証されるように、本明細書で開示されるカロチノイドの組み合わせは、カロチノイドの生物学的利用能を上昇させ、それによってコンパニオンアニマルの健康を増進し得る。特定の実施形態では、イヌの末梢血リンパ球に働く酸化応力に対する保護が向上した。

方法
ＨＰＬＣ分析
Ｌｉｎ ＷＣ，Ｃｈｉｅｎ ＪＴ，Ｃｈｅｎ ＢＨ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ ｉｎ ｓｐｅａｒ ｓｈｒｉｍｐ ｓｈｅｌｌｓ（Ｐａｒａｐｅｎａｅｏｐｓｉｓ ｈａｒｄｗｉｃｋｉｉ）ｂｙ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．２００５ Ｊｕｎ ２９；５３（１３）：５１４４〜９に記載されるようにＨＰＬＣ分析を実行した。５０マイクロリットルの試料をＨＰＬＣシステムに注入した。全ての手順は、薄明かりのもと氷上で実行した。

血清カロチノイド
血清カロチノイドの濃度を以下のようにして測定した。各被験者から５ｍＬ非空腹時の静脈血を血清分離チューブ（ＢＤ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）中に採取した。血液試料を４℃で５分間５，０００ｒｐｍ遠心分離し、次に、血清を取り除き、ただちに−７０℃で分析まで保管した。上述で報告したＫｈａｃｈｉｋ Ｆらの方法によって、１００μＬの血清からカロチノイド（脂溶性）を抽出した（Ｋｈａｃｈｉｋ Ｆ，Ｓｐａｎｇｌｅｒ ＣＪ，Ｓｍｉｔｈ ＪＣ Ｊｒ，Ｃａｎｆｉｅｌｄ ＬＭ，Ｓｔｅｃｋ Ａ，Ｐｆａｎｄｅｒ Ｈ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍｉｌｋ ａｎｄ ｓｅｒｕｍ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．１９９７ Ｍａｙ １５；６９（１０）：１８７３〜８１）。簡単にいうと、１００μＬの血清をエタノール中で０．１％のブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）２００μＬに加えてタンパク質を沈殿させ、次に、５００μＬの酢酸エチルを抽出物に加えてカロチノイドを抽出した。試料を４℃で５分間２，０００×ｇで遠心分離し、上清相を収集した。次に、試料を５００μＬの酢酸エチルで２回以上抽出し、５００μＬのヘキサンで１回抽出した。収集した上清を混合し、真空下で乾燥させた。乾燥した試料を１ｍＬの５０％メタノールで溶解し、５００μＬのヘキサンで３回抽出した。次に、収集した上清を乾燥させ、ＨＰＬＣ分析の前に１００μＬの展開溶媒で再溶解した。

食品組成物中のカロチン定性
カロチン：ＨＰＬＣによる食品組成物中のカロチンの測定

手順：
１．Ｓｔｒａｕｂ Ｇｒｉｎｄｉｎｇ Ｍｉｌｌを使用して、約２５０ｇ〜３００ｇの試料を粉砕する。
２．１．０ｇの試料粉末を５０ｍＬのガラス製遠心管に精密に測り入れる。質量を±０．０００１ｇまで記録する。
３．７．５ｍＬの抽出溶媒１を試料に加えて、１分間攪拌する。
４．４ｍＬの４０％メタノールＫＯＨ溶液を試料に加え、１分間攪拌する。
５．試料にフタをして、振盪恒温水槽に６０分間載置する。
６．試料を取り外し、室温まで冷却する。
７．７．５ｍＬの抽出溶媒２を加え、１分間攪拌する。
８．１０ｍＬの１０％硫酸ナトリウム溶液を加え、１分間攪拌する。
９．１７５０ｒｐｍで８分間遠心分離する。
１０．約２ｍＬの有機層を取り外し、０．４５μｍのナイロンフィルターに通す。
１１．１．００ｍＬの濾液をアンバーオートサンプラーバイアルに正確にピペットで移し、窒素下で乾燥する。
１２．１．００ｍＬの移動相をアンバーオートサンプラーバイアルに正確にピペットで移し、１分間攪拌した。

較正：
１．１年に１回又はシステムが変更した際にはいつでも、トランス−β−カロチン標準の較正を行う。
ａ．移動相中に全ての標準を調製する。
ｂ．測定された質量を、分析証明書の調整濃度に補正する。
ｃ．最小二乗法を使用して、０．１〜１．０μｇ／ｍＬにわたる３点標準曲線をもとに較生し、直線回帰はゼロ点に当てはめられる。
ｄ．全てのカロチン異性体に同様の反応曲線を当てはめる。
２．較正中、１００ｐｐｍのエトキシキンを含有する１μｇ／ｍＬのトランス−β−カロチン品質管理基準を調製し、−２０℃で保管する。各試料品質管理基準を各試料に注入し、システムの適合性を確認する。

ルテイン：ＨＰＬＣで食品組成物中のルテインを画定する。

手順：
１．Ｓｔｒａｕｂ Ｍｏｄｅｌ ４Ｅ Ｇｒｉｎｄｉｎｇ Ｍｉｌｌを使用して、約２５０ｇ〜３００ｇの試料を粉砕する。
２．１．０ｇの試料粉末を５０ｍＬのガラス製遠心管に精密に測り入れる。質量を±０．０００１ｇまで記録する。
３．７．５ｍＬの抽出溶媒１を試料に加えて、１分間攪拌する。
４．４ｍＬの４０％メタノールＫＯＨ溶液を試料に加え、１分間攪拌する。
５．試料にフタをして、振盪恒温水槽に６０分間載置する。
６．試料を取り外し、室温まで冷却する。
７．７．５ｍＬの抽出溶媒２を加え、１分間攪拌する。
８．１０ｍＬの１０％硫酸ナトリウム溶液を加え、１分間攪拌する。
９．１７５０ｒｐｍで８分間遠心分離する。
１０．約２ｍＬの有機層を取り外し、０．４５ｍのナイロンフィルターに通す。

較正：
１．１年に１回又はシステムが変更した際にはいつでも、トランスルテイン標準の較正を行う。
ａ．移動相中に全ての標準を調製する。
ｂ．測定された質量を、分析証明書の調整濃度に補正する。
ｃ．最小二乗法を使用して、０．１〜１．０μｇ／ｍＬにわたる３点標準曲線をもとに較生し、直線回帰はゼロ点に当てはめられる。
ｄ．全てのルテイン異性体に同様の反応曲線を当てはめる。
２．較正中、１００ｐｐｍのエトキシキンを含有する１μｇ／ｍＬのトランスルテイン品質管理基準を調製し、−２０℃で保管する。各試料品質管理基準を各試料に注入し、システムの適合性を確認する。

アスタキサンチン：ＨＰＬＣで食品組成物中のアスタキサンチンの測定を行う。

本方法は、「Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｎｄ ＨＰＬＣ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ Ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ＡｓｔａＲＥＡＬ（登録商標）Ｌ１０」という題名で、Ｆｕｊｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．によってｗｗｗ．ａｓｔａｒｅａｌ．ｃｏｍに掲載されている方法をもとにしている。エステル化アスタキサンチンは、まず、全てのアスタキサンチンを遊離化するために酵素手順によって完全に加水分解（脱アセチル化）されなければならない。

試薬及び装置：
０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファ（ｐＨ７．０）
コレステロールエステラーゼ：Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍ．，ｃａｔ＃ ０３７−１１２２１又はＳｉｇｍａ，ｃａｔ＃：Ｃ９２８１
トランス−β−アポ−８’−カロテナール、Ｆｌｕｋａ ｃａｔ＃：１０８２９［ＨＰＬＣ分析における内部標準］
アスタキサンチン：Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍ．，ｃａｔ＃ ０１９−１８６６３又はＳｉｇｍａ，ｃａｔ＃ Ａ９３３５［分析標準］
１％（ｖ／ｖ）リン酸溶液
アセトン、分光光度等級
ヘキサン、ＨＰＬＣ等級
石油エーテル
メタノール、分析等級
ＭＴＢＥ：ｔ−ブチル−メチル−エーテル、分光光度等級
硫酸ナトリウム十水和物
無水硫酸ナトリウム
１０ｍＬ遠心管
２０ｍＬメスフラスコ
５０ｍＬメスフラスコ
１００ｍＬメスフラスコ
２００ｍＬメスフラスコ
１．０ｍＬメスピペット
２．０ｍＬメスピペット
５．０ｍＬメスピペット
１０．０ｍＬメスピペット
０．４５μｍシリンジフィルタ
水浴
化学てんびん
遠心分離機
超音波処理器
分光光度計
ＵＶ／ＶＩＳ検出器を備えたＨＰＬＣ
ＨＰＬＣカラム：ＹＭＣ−Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ（商標）Ｓ５μｍ、長さ２５０ｍｍ×直径４．６ｍｍ。

手順：
アスタキサンチンエステルの加水分解に用いるコレステロールエステラーゼ溶液：
正確に秤量したコレステロールエステラーゼ（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍ．，Ｃａｔ ＃：０３７−１１２２１ ｏｒ Ｓｉｇｍａ，ｃａｔ＃：Ｃ９２８１）を、１ｍＬ当たり４単位の既知の濃度を有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐｈ ７．０）中で溶解する。

内部標準調製：
約７．５ｍｇのトランス−β−アポ−８’−カロテナール（Ｆｌｕｋａ，Ｃａｔ ＃：１０８２９，＞２０％（ＵＶ−ＶＩＳ）Ａｐｏｃａｒｏｔｅｎａｌ）を正確に秤量し、２００ｍＬのメスフラスコに移す。
アセトンで溶解し、アセトンで容量まで希釈し、混合する。

基準調製：
約５ｍｇのアスタキサンチン試薬（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍ．，ｃａｔ＃ ０１９−１８６６３又はＳｉｇｍａ、Ｃａｔ＃：Ａ９３３５）を２００ｍＬのメスフラスコに移し、約１００ｍＬのアセトンで溶解し、湯中で１分間超音波処理を行い、１５分間、周囲温度まで均衡化した。
規定容量までアセトンで希釈し、混合する（標準原液）。
２．０ｍＬの標準原液を２０ｍＬメスフラスコにピペットで移し、規定容量までアセトンで希釈し、混合する（標準原液Ａ）
２．０ｍＬの標準原液及び１０．０ｍＬの内標準溶液を２０ｍＬのメスフラスコにピペットで移し、アセトンで希釈し、混合する（標準原液Ｂ）。

アッセイ調製：
予め温めた水浴中で、５０〜６０℃で３０分間ＡｓｔａＲＥＡＬ（登録商標）Ｌ１０を温める。１０分間隔でよく攪拌する。
約３０ｍｇのＡｓｔａＲＥＡＬ（登録商標）Ｌ１０を１０ｍＬのガラス管に移し、^＊約５ｍＬのアセトンを加えてＡｓｔａＲＥＡＬ（登録商標）Ｌ１０を溶解する。^＊正確な重量を記録する。
そのガラス管からＡｓｔａＲＥＡＬ（登録商標）Ｌ１０溶液を１００ｍＬのメスフラスコにピペットで移す。多量のアセトンでそのガラス管を濯ぎ、残っている全てのオレンジ色を回復させる。濯ぎを増やすごとに、５ｍＬのアセトンをガラス管に加え、穏やかに回転させ、内容物をフラスコにピペットで移す。アセトンを加えて最終容量を１００ｍＬとし、このストックを試料ストックとする。
２．０ｍＬの試料ストックを２０ｍＬのメスフラスコにピペットで移し、規定容量までアセトンで希釈し、混合する（アッセイ溶液Ａ）。
２．０ｍＬのアッセイ溶液を１０ｍＬのガラス製の遠心管に移し、１．０ｍＬのＩ．Ｓ．溶液を加えて混合する。
蓄熱ヒーターを３７℃に設定し、３．０ｍＬのコレステロールエステラーゼ溶液を試験管に加え、穏やかに反転させることで混合する。
３７℃で４５分間にわたって反応させる。反応中、１０分おきに少なくとも２回、穏やかに／ゆっくりと反転させる。
１ｇの硫酸ナトリウム十水和物及び２ｍＬの石油エーテルを加え、３０秒間攪拌し、３，０００ｒｐｍで３分間遠心分離する。
石油エーテル層を１ｇの硫酸ナトリウム無水和物を含んだ１０ｍＬのガラス製遠心管に加える。
石油エーテル層を減圧下又は不活性ガスのストリーム中、室温で蒸発させ、３ｍＬのアセトンを加え、超音波処理を行い、濾過する（アッセイ溶液Ｂ）。

アスタキサンチン内容物における逆相ＨＰＬＣ分析方法
ブランクとしてアセトンを使用して、４７４ｎｍで、標準溶液Ａの吸光度を測定する。 試料分析の前に、移動相をＨＰＬＣ表１で指定されるＨＰＬＣ条件に通過させる。
以下の条件のもと、ＨＰＬＣによって標準溶液Ｂ及びアッセイ溶液Ｂのアリコートを分析する。
ＨＰＬＣ表：
検出器：ＵＶ／ＶＩＳ検出器、４７４ｎｍ
カラム：ＹＭＣ−Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ（商標）Ｓ５μ、４．６×２５０ｍｍ
カラム温度：２５℃
流速：１．０ｍＬ／分
注入容量：２０μＬ
移動相：メタノール、ｔ−ブチルメチルエーテル、１％リン酸水溶液
移動相の処方（％）は以下の通りである：

式：ＡＳａ／２１０によって、ｍｇ／ｍＬで、標準溶液Ａ中のアスタキサンチンの濃度を算出し：
式中、ＡＳａは、標準溶液の吸光度であり、２１０は、４７４ｎｍで１ｃｍキュベット中、１（ｍｇ／ｍＬ）のアスタキサンチンのアセトン溶液の吸光度である。標準溶液Ａの予想吸光度は０．５２５であり、これは、２０００ｍＬの希釈体積中５ｍｇのアスタキサンチン標準試薬と等価である。

全アスタキサンチンのピーク反応とアッセイ溶液Ｂ及び標準溶液Ｂからから得られたＩ．Ｓ．のピーク反応との比率を、式：（１．３Ｐ_{１３−シス}＋Ｐ_トランス＋１．１Ｐ_９−シス）／Ｐ_ＩＳから算出する：
式中、Ｐ_{１３−シス}、Ｐ_トランス、Ｐ_９−シス、及びＰ_ＩＳは、１３−シス−、トランス−、９−シス−アスタキサンチン異性体のピーク応答及びＩＳのピーク応答であり、１．３及び１．１は、１３−シス−アスタキサンチン及び９−シス−アスタキサンチンとトランスアスタキサンチンとの比較応答係数である。

ＡｓｔａＲＥＡＬ（登録商標）Ｌ１０中のアスタキサンチン含有量（％ ｗ／ｗ）を以下の式から算出する：
Ｃ_ＳＡ（Ｒ_ＡＢ／Ｒ_ＳＢ）×１０００／Ｗ×１００
式中、Ｃ_ＳＡは、標準溶液Ａにおける、ｍｇ／ｍＬで表すアスタキサンチンの濃度であり、１０００はアッセイ調製における希釈体積であり、Ｗは、ｍｇで表される、アッセイ調製に供されるＡｓｔａＲＥＡＬ（登録商標）Ｌ１０試料の重量であり、Ｒ_ＡＢ及びＲ_ＳＢは、全アスタキサンチンのピーク反応とアッセイ溶液Ｂ及び標準溶液Ｂからから得られたＩ．Ｓ．のピーク反応との比率である。

ＤＮＡ損傷
Ｓｈｅｎ Ｓら（Ｓｈｅｎ Ｓ，Ｃｏｏｌｅｙ ＤＭ，Ｇｌｉｃｋｍａｎ ＬＴ，Ｇｌｉｃｋｍａｎ Ｎ，Ｗａｔｅｒｓ ＤＪ．Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｂｒａｉｎ ａｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｏｆ ｅｌｄｅｒｌｙ ｄｏｇｓ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｄｅｈｙｄｒｏｅｐｉａｎｄｒｏｓｔｅｒｏｎｅ（ＤＨＥＡ）．Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ．２００１ Ｓｅｐ １；４８０〜４８１：１５３〜６２）の方法をもとにして、細胞ゲル電気泳動（コメットアッセイ）でＤＮＡ損傷を検出した。基礎的なＤＮＡ損傷の範囲を検出するのに、３７℃でＰＢＳ中の低融点アガロース中にＰＢＬを懸濁させ、標準融点アガロースで予め被覆されたガラス製の顕微鏡スライド上にピペットで移した。最終層は、８０μＬの低融点アガロースのみで構成した。アガロースの凝固後、スライドを冷溶解液（２．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｎａ_２−ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ及び３００ｍＭ ＮａＯＨをｐＨを１０になるように調整し、１０％ ＤＭＳＯ及び１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を新たに加えた）中に浸し、４℃でオーバーナイトで暗所に保管した。次に、スライドを溶解液から取り除き、新たに調製したアルカリ性緩衝剤バッファ（（３００ｍＭ ＮａＯＨ及び１ｍＭ Ｎａ_２−ＥＤＴＡ、ｐＨ＞１３）を含む水平ゲル電気泳動タンク（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｆａｉｒ Ｌａｗｎ，ＮＪ）中に載置した。２５Ｖ及び３００ｍＡで３０分間の電気泳動にかける前に、２０分間、スライドをバッファ中に浸漬したままにしておいた。次に、スライドをｐＨ ７．５で０．４ＭのＴｉｒｓで３回洗浄（各５分）した。最後の洗浄後、スライドの水を切って、冷１００％エタノールにさらして乾燥させた。細胞溶解から中和の終了までの全工程を、暗所か黄色灯のもとで実行した。分析前に、１５０μＬのＳＹＢＲグリーン１（ｐＨ ７．５でＴＥバッファ中１：１０，０００希釈）で染色した。酸化防止剤でイヌを処置することによって、酸化応力に対するイヌのＰＢＬの感受性に影響を与えるかどうかを判定するために、アガロース中に懸濁して電気泳動にかける前に、各イヌから新に分離したＰＢＬを２５μＭのＨ_２Ｏ_２に４℃で５分間暴露した。各セルを以下のように０〜４スケールで視覚的にスコア化した：
・損傷なし（タイプ０）；
・軽度から中程度の損傷（タイプ１ ＆ ２）、
・重篤なＤＮＡ損傷（タイプ３ ＆ ４）

相互参照されるか又は関連する全ての特許又は特許出願を含む、本願に引用される全ての文書を、特に除外すること又は限定することを明言しない限りにおいて、その全容にわたって本願に援用するものである。いずれの文献の引用も、こうした文献が本願で開示又は特許請求される全ての発明に対する先行技術であることを容認するものではなく、また、こうした文献が、単独で、あるいは他の全ての参照文献とのあらゆる組み合わせにおいて、こうした発明のいずれかを参照、教示、示唆又は開示していることを容認するものでもない。更に、本文書において、用語の任意の意味又は定義の範囲が、参考として組み込まれた文書中の同様の用語の任意の意味又は定義と矛盾する場合には、本文書中で用語に割り当てられる意味又は定義に準拠するものとする。

本発明の特定の実施形態が例示され記載されてきたが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく他の様々な変更及び修正を実施できることが、当業者には自明であろう。したがって、本発明の範囲内にあるそのような全ての変更及び修正を添付の特許請求の範囲で扱うものとする。

Claims (15)

1. 少なくとも３種のカロチノイドを含むペットフード組成物であって、前記少なくとも３種のカロチノイドが、ケト−カロチノイド、第１の非−ケト−カロチノイド、及び第２の非−ケト−カロチノイドを含む、ペットフード組成物。
2. 前記ケト−カロチノイドが、アスタキサンチンを含む、請求項１に記載のペットフード組成物。
3. 前記ケト−カロチノイドが、アスタキサンチンエステルを含む、請求項１に記載のペットフード組成物。
4. 前記第１の非−ケト−カロチノイドがβ−カロチンを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペットフード組成物。
5. 前記第２の非−ケト−カロチノイドがルテインを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペットフード組成物。
6. 前記ケト−カロチノイドが、カロチノイドの約０．１重量％〜約２５重量％で存在し、前記第１の非−ケトーカロチノイドが、カロチノイドの最大で約９９．９重量％で存在し、前記第２の非−ケト−カロチノイドが、カロチノイドの最大で約９９．９重量％で存在する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペットフード組成物。
7. 前記ペットフード組成物が、栄養的にバランスの取れたキブル、栄養補助食品、ペットスナック、ビスケット、湿潤組成物、並びにこれらの組み合わせ及び混合物からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のペットフード組成物。
8. β−カロチン、ルテイン、及びアスタキサンチンを含み、前記β−カロチン対ルテイン対アスタキサンチンの比率が、約１：１：０．６〜約１０：１：３．５である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のペットフード組成物。
9. β−カロチン、ルテイン、及びアスタキサンチンを含み、前記β−カロチン対ルテイン対アスタキサンチンの比率が、約１：１：０．６〜約１：１０：３．５である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のペットフード組成物。
10. β−カロチン、ルテイン、及びアスタキサンチンを含み、前記β−カロチン対ルテイン対アスタキサンチンの比率が、約１：１：０．００２〜約１０：１：０．０１である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のペットフード組成物。
11. β−カロチン、ルテイン、及びアスタキサンチンを含み、前記β−カロチン対ルテイン対アスタキサンチンの比率が、約１：１：０．００２〜約１：１０：０．０１である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のペットフード組成物。
12. 少なくとも２種のカロチノイドを含むペットフード組成物であって、前記２種のカロチノイドは、アスタキサンチン、アスタキサンチンエステル、又はこれらの組み合わせのいずれか、及び非−ケト−カロチノイドを含む、ペットフード組成物。
13. 前記非−ケト−カロチノイドがβ−カロチンを含む、請求項１２に記載のペットフード。
14. 前記非−ケト−カロチノイドがルテインを含む、請求項１２又は１３に記載のペットフード。
15. 前記非−ケト−カロチノイドとアスタキサンチンとの比率が、約２５：７５〜約９０：１０である、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のペットフード組成物。