JP2014500036A5 - - Google Patents

Description

本発明は、いくつかの脂質産生微生物がリグノセルロース材料中のポリマー糖から直接的に効率良く脂質を産生するという発見に基づく。驚くべきことに、発酵油脂産生工程において、顕著な量の細胞外酵素が産生された。さらにこれらの細胞外酵素が活性を保ち、そして使用済み培養培地から収集され得ることが発見された。

さらに、本発明は、いくつかの微生物が種々の多糖類への活性を有している細胞外酵素を産生するという発見に基づく。

本発明は、リグノセルロース系材料からのバイオ燃料製造の効率および経済性を改良するための方法を提供する。本発明はまた、細胞外酵素によりポリマー糖を分解する能力を有している、バイオ燃料を産生する微生物を利用することによって、糖ポリマー（sugar polymers）の加水分解のための外部で製造された酵素の投入を減少させるための方法を提供する。さらに、本発明は、酵素の産生とともにバイオ燃料としてまたはバイオ燃料製造のための原料として適切な有用な化合物を製造するための方法を提供する。酵素は好ましくは、少なくとも部分的には、その場で使用されるおよび／または統合工程外で販売される。

本願発明は、バイオ燃料の脂質産生のための効果的なリグノセルロース系材料の利用に関する。本発明は、統合工程における微生物的方法によるセルロースおよび／またはヘミセルロース画分から、例えば脂質、エタノールおよびブタノールなどのバイオ燃料を製造する工程を示す。より具体的には、細胞外酵素によってポリマー糖を利用できる微生物による脂質産生のための原材料としてのヘミセルロースまたはセルロース画分の使用のための方法を提供する。

本発明の一実施態様において、本発明は、細胞外酵素によってポリマー糖を利用できる微生物による脂質産生のための原材料としてのリグノセルロース画分、とりわけヘミセルロースおよび／またはセルロース画分の利用のための方法を提供する。

本発明の好ましい実施態様において、ポリマー糖を含むリグノセルロースからのヘミセルロース画分は、細胞外酵素を産生することによってポリマーヘミセルロースを利用できる油性生物（oleaginous organisms）を使用する脂質産生のために使用される。ヘミセルロースからの脂質産生由来の使用済み培養培地から回収および／または富化された酵素はまた、セルロース分解活性を有しており、そして、別の工程においてセルロース加水分解のために使用することができる。

本発明の別の実施態様は、原材料としてのリグノセルロース画分、とりわけヘミセルロースおよび／またはセルロース画分の利用のための、細胞外酵素によってポリマー糖を利用できるアルコール産生微生物を利用する。ポリマー糖の利用に関与する細胞外酵素は、第一のバイオ燃料産生工程においてまたは第二のバイオ燃料産生工程に先立って、バイオ燃料産生またはバイオ燃料フィードストック産生において再利用される。バイオ燃料（例えば、脂質、エタノール、ブタノール、ＡＢＥすなわちアセトン−ブタノール−エタノール）を第一のバイオプロセス（バイオプロセス１）においてヘミセルロースおよび／またはセルロースから産生する微生物（例えば、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、グルコシダーゼ、キシラナーゼ、アラビナーゼ、ガラクトシダーゼ、マンナーゼ）によって産生されるポリマー糖分解細胞外酵素は、セルロースおよび／またはヘミセルロースからのバイオ燃料またはバイオ燃料フィードストック産生（例えば、エタノール、ブタノール、ＡＢＥ、脂質）において再使用され得る。

本発明の一実施態様において、工程は、どのような場合でも、リグノセルロース材料（セルロースまたはヘミセルロース）からの糖ポリマーおよびこれらの糖ポリマーを利用する能力を有する生物、好ましくは脂質産生生物を使用する、１つのバイオ燃料産生工程、好ましくは脂質産生工程を含む。本発明の別の実施態様は、原料としてのリグノセルロース画分、とりわけヘミセルロースおよび／またはセルロース画分の利用のための、細胞外酵素によってポリマー糖を利用できるアルコール産生微生物を利用する。さらに、糖を加水分解することのできる細胞外酵素は、バイオ燃料産生のための別のバイオプロセスにおいて再使用される。酵素は、例えば、第二のバイオ燃料産生工程に先立って、または第二のバイオ燃料産生工程において（のあいだに）、ポリマー糖を糖化するためなどに再使用され得る。第二のバイオ燃料産生工程は、発酵油脂、エタノール、ブタノールまたはＡＢＥ産生工程であり得る。工程は、好ましくは、統合されている（バイオリファイナリー（biorefinery））であるか、または、第一のバイオ燃料産生工程において産生された酵素がリグノセルロース材料からのバイオ燃料産生において使用されるために収集され、精製され、そして他で販売され得る。

本発明のある実施態様において、第一のバイオ燃料産生工程（工程１）はポリマー糖を含むフィードストックを利用する。工程１は細胞外酵素によってポリマー糖を利用でき、そして、同じ工程においてバイオ燃料を産生することのできる微生物を使用する。工程１は、エタノール、ブタノール、アセトン−ブタノール−エタノール、または脂質を産生する。工程１は、好ましくは脂質を産生する好気性または嫌気性の工程である。工程１は、好ましくは、細胞外酵素の産生によってヘミセルロースおよびセルロースの両方を利用することのできる微生物を使用する。

工程１において産生される細胞外酵素は、回収され、そして、第二のバイオ燃料産生工程（工程２）のためのポリマー糖の加水分解において、または工程２において再利用される。

本発明のある実施態様において、工程２は、単糖類からのバイオ燃料を産生することができるが、ポリマー糖を利用するための細胞外酵素を産生することはできない微生物を使用する。工程２は、エタノール、ブタノール、アセトン−ブタノール−エタノール、または脂質を産生する。工程２は、好ましくはエタノール、ブタノールまたはアセトン−ブタノール−エタノールを産生する嫌気性工程である。

本発明の好ましいある実施態様において、ポリマー糖を加水分解することのできる酵素であって、バイオ燃料またはバイオ燃料のための出発材料、好ましくは脂質もまた産生する酵素が、好気性または曝気されたバイオプロセスにおいて産生される。好気性バイオプロセスは、効率的な酵素産生を可能にする。

本発明の一実施態様において、工程のための原料は、ヘミセルロースおよびセルロースの両方（任意の混合物）のポリマー糖を含み、そして、ポリマー糖の加水分解のための細胞外酵素およびバイオ燃料を産生する（工程１）ことのできる微生物を利用する。細胞外酵素は使用済み培養培地中に存在し、回収され、そして、ポリマー糖を利用することのできない生物を用いたバイオ燃料を産生する別のバイオプロセス（工程２）の前、またはそのあいだにヘミセルロースおよびセルロースの両方のポリマー糖の糖化に再使用される。例えば、ヘミセルロースおよびセルロースのポリマー糖を含む加水分解生成物が、１つの画分が工程１に使用され、そして、別の画分が工程２に使用される２つの画分に分けられる。

図３は、２つのバイオプロセスの統合による、セルロースからのバイオ燃料産生の例を示す。第一のバイオプロセスは、ポリマーセルロースの分解が可能である細胞外酵素をもまた産生する好気性脂質産生を含む。酵素は、セルロースを使用する別のバイオプロセスであって、例えばエタノール、ブタノールまたはＡＢＥなどのアルコールの嫌気性発酵、好ましくはエタノールまたはブタノールの産生を含むセルロースを用いる別のバイオプロセス中でのセルロース加水分解のために再使用される。図４は、バイオ燃料の生物学的生産のための類似の統合バイオプロセスを示しているが、前記プロセスは原材料としてヘミセルロースを使用する。好ましくは第一のバイオプロセスは脂質産生であり、そして、第二のバイオプロセスはブタノールまたはＡＢＥ産生である。

本発明の一実施態様において、工程のための原料は、ヘミセルロースおよびセルロース両方のポリマー糖を含み、そして、ポリマー糖の加水分解のための細胞外酵素およびバイオ燃料を産生する（工程１）ことのできる微生物を利用する。使用済み培養培地中の細胞外酵素は回収され、そして、ポリマー糖を利用することができないかもしれない生物を用いた、バイオ燃料を産生する別のバイオプロセス（工程２）の前またはそのあいだに、ヘミセルロースおよびセルロース両方のポリマー糖の糖化に再使用される。例えば、ヘミセルロースおよびセルロースのポリマー糖を含む加水分解生成物は２つの画分に分けられ、１つの画分は工程１に、そして、別の画分が工程２に使用される。

本発明の一実施態様において、第一のバイオプロセス（工程１）のために使用される糖は、主に、ヘミセルロースであるポリマー糖を含むが、また、ポリマーの形状であるセルロース系の糖も含む。例えば、ポリマーヘミセルロース糖を含む供給流は、セルロースのポリマー糖を含む供給流で補充される。第一のバイオプロセスは、ポリマー糖の加水分解のための細胞外酵素およびバイオ燃料を産生することのできる微生物を使用する。第二のバイオプロセス（工程２）は、セルロースを含む原材料、および、セルロース中の糖からバイオ燃料を産生することができるが、ポリマー糖を利用することができることが必要とされているわけではない微生物を使用する。工程１からの使用済み培養培地由来の細胞外酵素が使用され、回収され、第二のバイオプロセス（工程２）の前またはそのあいだに、ヘミセルロースおよびセルロース両方のポリマー糖の糖化に再使用される。図６は、第一のバイオプロセスが好気性の、微生物脂質産生工程であり、そして、第二のバイオプロセスが、嫌気性の、アルコール発酵工程である統合されたバイオプロセスである一例を示す。最も好ましくは、第二のバイオプロセスはエタノールまたはブタノール発酵工程である。

本発明のさらに別の実施態様において、第一のバイオプロセス（工程１）のために使用される糖は、主に、セルロースであるポリマー糖からなるが、また、ポリマーの形状であるヘミセルロース糖も含む。例えば、ポリマーセルロース糖を含む供給流は、ヘミセルロースのポリマー糖を含む供給流で補充される。第一のバイオプロセスは、ポリマー糖の加水分解のための細胞外酵素およびバイオ燃料を産生することのできる微生物を使用する。第二のバイオプロセス（工程２）は、ヘミセルロースを含む原材料、および、ヘミセルロース中の糖からバイオ燃料を産生することができるが、ポリマー糖を利用することができることが必要とされるわけではない微生物を使用する。工程１からの使用済み培養培地由来の細胞外酵素が回収され、第二のバイオプロセス（バイオプロセス２）の前またはそのあいだに、ヘミセルロースおよびセルロース両方のポリマー糖の糖化に再使用される。図７は、第一のバイオプロセスが好気性の、微生物脂質産生工程であり、そして、第二のバイオプロセスが、嫌気性の、アルコール発酵工程である統合されたバイオプロセスである一例を示す。最も好ましくは、第二のバイオプロセスはブタノールおよび／またはＡＢＥ発酵工程である。

より具体的には、本発明の一実施態様において、例えば、ペントース糖を利用することができ、そのためリグノセルロースの利用効率を向上させることのできる、脂質を蓄積できるか、または、例えばエタノール、ブタノールまたはＡＢＥなどのアルコールを産生する微生物のような微生物が使用される。さらに、脂質蓄積生物またはアルコール産生生物などの生物はまた、細胞外酵素により、セルロース中および／またはヘミセルロース中のポリマー糖を利用できる。酵素は使用済みの培養培地から回収され、そして、微生物がポリマー糖を利用することができないバイオ燃料産生工程においてポリマー糖の加水分解のために使用され得る。本発明の具体的な一実施態様において、両方のバイオプロセスは。ポリマー糖を利用することができ、かつ、バイオ燃料またはバイオ燃料のための出発材料を産生することのできる微生物を使用する。

リグノセルロース材料中のポリマー糖を加水分解することのできる細胞外酵素を産生し、かつ例えば脂質などのバイオ燃料を産生する工程へとバイオマスを供給する前に、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニン画分の精製および／または分離は、必要ではないかもしれない。

ポリマー糖を含むヘミセルロースおよび／またはセルロース画分は、リグノセルロース系材料中のポリマー糖を加水分解することのできる細胞外酵素を産生し、そして、任意の形状の、すなわち固体の形状または溶解された形状または部分的に固体でありかつ部分的に溶解された形状の、例えば脂質またはアルコールなどのバイオ燃料を産生するバイオプロセスへと供給され得る。

本発明の一実施態様において、リグノセルロース系バイオマスは、リグノセルロース系材料中のポリマー糖を加水分解することのできる細胞外酵素を産生するバイオプロセス中に固体の形状として添加され、例えば脂質などのバイオ燃料を産生する。本発明の一実施態様において、固体のリグノセルロースは、より小さい粒子サイズを得るために、例えば摩砕または粉砕などの機械的に処理されてもよいが、発酵に先立ってセルロース、ヘミセルロースまたはリグニン画分を分離するために前処理されていなくてもよい。本発明のさらに別の実施態様において、リグノセルロースの固体画分は、粒子サイズを減少させるための機械的処理に加えて、ポリマー糖を分解することのできる細胞外酵素およびバイオ燃料を産生するバイオプロセスへと供給される前に、リグノセルロースの構造を開く、または解く方法を用いて処理される（工程１）。このようなリグノセルロースの固体画分は、ポリマーの形状のセルロースおよび／またはヘミセルロースおよびリグニンを含んでいてもよい。

本発明の利点は、本方法が、記載される工程中において使用される株によって産生されない他の酵素の添加の必要性なしに、または減少された必要性で、それ自身により（その場で）で必要とされる細胞外酵素を産生することである。脂質をセルロースおよび／またはヘミセルロースから産生する１つの工程において産生される細胞外酵素は、培養培地から回収され、そしてポリマー糖を利用することのできない生物を用いたバイオ燃料またはバイオ燃料フィードストックを産生するための統合工程において使用される。本発明の別の実施態様において、ポリマー糖を分解することのできる細胞外酵素を含む、ポリマー糖からの脂質産生由来の細胞回収後の培養培地が、酵素について濃縮されるか、または、富化されることなく、ポリマー糖を使用することのできない生物によるポリマー糖からのバイオ燃料またはバイオ燃料フィードストック産生のための培養培地として使用される。

１４．酵素が細胞外酵素、好ましくはヘミセルロースおよび／またはセルロース加水分解と関連する酵素である項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。

Claims (12)

1. 発酵油脂産生およびアルコール産生のための統合された方法であって、リグノセルロース系材料またはその画分を発酵油脂およびアルコール産生のための原材料として使用し、そして、前記アルコール産生工程が、発酵油脂および酵素を産生することのできる微生物を使用する発酵油脂産生工程からの、ポリマー糖を加水分解することのできる酵素と、アルコール産生微生物と、を使用する方法。
2. 前記アルコール産生工程が、エタノール、ブタノール、イソプロパノール−ブタノール−エタノールおよび／またはアセトン−ブタノール−エタノールを含む請求項１記載の方法。
3. 発酵油脂および酵素を産生することのできる微生物を使用する発酵油脂産生工程、および
   アルコール産生工程
   を含む請求項１または２記載の方法であって、
   発酵油脂および酵素を産生する微生物を培養する工程、
   アルコール産生微生物を培養し、そして、アルコールを微生物培養物から分離する工程、
   発酵油脂を微生物細胞から分離する工程、および
   発酵油脂産生工程からの微生物培養物、上澄みまたは上澄みのタンパク質が富化された画分または触媒的に活性な酵素を含む上澄みの希釈物を、アルコール産生工程へと導入するか、または、アルコール産生工程のためのフィードストックを処理する工程
   を含む方法。
4. 前記発酵油脂および酵素を産生する微生物を培養する工程が、上澄みおよび微生物細胞を微生物培養物から分離する工程をさらに含む請求項３記載の方法。
5. 前記発酵油脂産生工程の生成物が、酵素の触媒的活性を保持する方法を用いて回収される請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記原材料がまた、でんぷんも含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記発酵油脂および酵素の両方を産生することが可能である微生物が、真菌、酵母またはバクテリアである請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記発酵油脂および酵素の両方を産生することが可能である微生物が、アスペルギルス、フミコーラ、クモノスカビおよびトリコデルマの群より選択される属に属しているか、または、クリプトコッカス属に属する酵母、またはストレプトマイセスに属するバクテリアである請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記酵素が細胞外酵素を含む請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記細胞外酵素が、ヘミセルロースおよび／またはセルロース加水分解と関連する酵素である請求項９記載の方法。
11. 前記酵素が、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、キシロシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ、エステラーゼ、セルラーゼ、エンド−セルラーゼ、エキソ−セルラーゼ、セロビアーゼまたはベータ−グルコシダーゼ、酸化セルラーゼ、またはセルロースホスホリラーゼまたはそれらの任意の混合物を含む請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記酵素の一部が発酵油脂産生工程へリサイクルされる請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。