JP2014236747A - 発光測定方法および発光測定システム - Google Patents

Abstract

【課題】生体試料中に対象物質が所定値以上存在する場合であっても、当該物質の量に応じた発光強度を得ることができ、定量的な測定をすることができる発光測定方法及び発光システムの提供。
【解決手段】生体試料からの発光を測定する発光測定方法に用いるルシフェラーゼであって、ヤエヤマヒメボタルに由来し、特定な配列からなる塩基配列を含むＤＮＡに基づいて生成され、Ｋｍ値が３６４μＭ以上であることを特徴とするルシフェラーゼ。前記生体試料に存在するＡＴＰと反応し得るルシフェラーゼ。
【選択図】図１

Description

本発明は、生体試料（例えば細胞を含む試料）を観察する発光測定方法および発光測定システムに関し、特に、生体試料中に過剰量存在する物質に対して定量的測定を行うための方法および発光測定システムに関するものである。

従来、発光酵素であるルシフェラーゼや、蛍光酵素であるＧＦＰなどが、生体機能解析に用いられており、特に、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応等の発光を利用したアッセイは、蛍光を用いる場合と比較して、（１）Ｓ／Ｎがよい（２）定量性が高い（３）励起光による細胞毒性が無いなどの利点を持つため、実験手法として広く使用されている。

例えば、ルシフェラーゼアッセイは、定常的に発現させたルシフェラーゼによる発光強度を得ることにより生体試料中のＡＴＰ量を定量的に測定することや、レポーター配列と共にルシフェラーゼ遺伝子を細胞に導入して発光強度を得ることにより目的遺伝子の発現レベルを観察すること等に用いられている。

また、その際、ルシフェラーゼアッセイの改良の一環として、発光酵素であるルシフェラーゼそのものを遺伝子工学的に改変することによって、耐熱性や高発光性等の特性を付与する手法が用いられている（非特許文献１参照）。

Ｂｒｕｃｅ Ｒ． Ｂｒａｎｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ，２００３， ４２， １０４２９−１０４３６

しかしながら、従来の発光酵素を用いた測定方法では、生体試料中に基質となる物質が所定値以上存在すると、当該基質の量に応じた発光強度の差異や変化を得ることが難しくなり測定対象を定量的に測定することが困難となるという問題がある。

特に、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を用いたアッセイ系においてＡＴＰを定量的に測定する場合には、ＡＴＰが反応律速である必要があるが、ＡＴＰ量がルシフェラーゼに対して飽和状態に近くなると、ＡＴＰ依存的な発光強度を得ることが困難になるという問題がある。

また、当該物質が発光酵素に対して過剰量存在する場合には、遺伝子発現による発光強度に対して、極端な発光強度差が生じてしまい、同一の微弱光検出装置で同時に（例えば、同一の露光時間において）検出することが難しくなるという問題が発生する。

本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであって、生体試料中に対象物質が所定値以上存在する場合であっても、当該物質の量に応じた発光強度を得ることができ定量的な測定をすることができる発光測定方法および発光測定システムを提供することを目的とする。また、極端な発光強度差を解消し、同一の微弱光検出装置で同時に検出することができる発光測定方法および発光測定システムを提供することを目的とする。

本発明者による鋭意検討の結果、ＡＴＰのように生体試料（例えば、細胞）中に所定量以上存在するような物質に対しては、当該物質に対する親和性が低い発光関連物質を選択することにより良好な測定が可能となることが判明した。特に、ＡＴＰ等の物質を定量的に測定する場合には、当該物質濃度がミカエリス・メンテン式においてＶｍａｘ付近にならないようＫｍ値が高い発光関連物質を選択することにより、当該物質を反応律速にすることができ、当該物質依存的な発光強度を得ることができることが判明した。また、配列に関して、ホタル属（Ｌｕｃｉｏｌａ）には数種のホタルが日本国内で知られているが、既に遺伝子配列が分かっているゲンジボタル（学名：Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａ，ルシフェラーゼ名は、本明細書においてＧｅｎｊｉと称している。）等に対して、実施の形態に示す実験で得られたようなＫｍ値の違いがあることが分かった。このＫｍ値の違いに着目して、目的に応じたルシフェラーゼを発光標識に使用することも本発明の重要な主旨の一つである。

すなわち、上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明にかかる発光測定方法は、生体試料からの発光を測定する発光測定方法であって、前記生体試料中に所定量以上存在する物質と反応し、前記物質に依存して発光強度が定量可能となるようＫｍ値が所定値以上である発光関連タンパク質を含む前記生体試料を作製する作製工程と、前記作製工程で作製した前記生体試料からの発光強度を測定する測定工程と、前記生体試料の領域および／または部位ごとに測定結果（前記測定工程で測定した前記発光強度に関する測定結果）を出力する出力工程と、を含むことを特徴とする。

また、本発明にかかる発光測定方法は、前記に記載の発光測定方法において、前記物質は、ＡＴＰであり、前記発光関連タンパク質は、ルシフェラーゼであり、前記Ｋｍ値は、３６４μＭ以上であることを特徴とする。

また、本発明にかかる発光測定方法は、前記に記載の発光測定方法において、前記ルシフェラーゼは、配列番号１のＤＮＡ配列に基づいて生成されるヤエヤマヒメボタル由来のルシフェラーゼであることを特徴とする。

また、本発明にかかる発光測定方法は、前記に記載の発光測定方法において、前記測定工程が複数の細胞を含む生体試料を生物発光に基づく発光画像を撮像する工程を含むことを特徴とする。

また、本発明にかかる発光測定方法は、前記に記載の発光測定方法において、前記測定工程が、細胞ごとに発光強度を計測する工程を含むことを特徴とする。

また、本発明にかかる発光測定方法は、前記に記載の発光測定方法において、前記作製工程が、Ｋｍ値の異なる複数の発光関連タンパク質を用いて作製されることを特徴とする。換言すると、前記作製工程において、前記生体試料が、Ｋｍ値の異なる複数の発光関連タンパク質を用いて作製されることを特徴とする。

また、本発明にかかる発光測定方法は、前記に記載の発光測定方法において、前記測定工程が、Ｋｍ値に応じた測定を実行することを特徴とする。換言すると、前記測定工程において、Ｋｍ値に応じた測定が実行されることを特徴とする。

また、本発明にかかる発光測定方法は、前記に記載の発光測定方法において、前記出力工程が、Ｋｍ値に応じた出力を実行することを特徴とする。換言すると、前記出力工程において、Ｋｍ値に応じた出力が実行されることを特徴とする。

また、本発明は、前記に記載の発光測定方法を実行する発光測定システムであり、生体試料からの発光画像を取得するための撮像部と、前記撮像部により取得された発光画像を解析するための画像処理を行う画像解析部と、前記画像解析部による画像解析結果を出力する出力装置と、前記生体試料に使用された発光タンパク質のＫｍ値に応じて前記撮像部および前記画像解析部を実行させるためのダイナミックレンジ調整部と、を具備することを特徴とする。

また、本発明にかかる発光測定システムは、前記に記載の発光測定システムにおいて、前記ダイナミックレンジ調整部が、複数の制御モードを有することを特徴とする。

また、本発明にかかる発光測定システムは、前記に記載の発光測定システムにおいて、前記生体試料における所望の領域および／または部位を指定するための入力装置と、前記入力装置により入力された情報を記憶する記憶部とをさらに備え、前記ダイナミックレンジ調整部が、撮像と画像解析を前記記憶部に記憶された情報と対応付けた出力内容を前記出力装置により出力させる（前記ダイナミックレンジ調整部が、前記記憶部に記憶された情報に基づいて、前記撮像部および前記画像解析部を実行させ、当該情報に対応付けた前記画像結果を前記出力装置により出力させる）ことを特徴とする。

本発明によれば、生体試料中に所定量以上存在する物質と反応し、物質に依存して発光強度が定量可能となるようＫｍ値が所定値以上である発光関連タンパク質を含む生体試料を作製し、作製した生体試料からの発光強度を測定し、生体試料の領域および／または部位ごとに測定結果を出力する。これにより、生体試料中に対象物質が所定値以上存在する場合であっても、当該物質の量に応じた定量的な測定をすることができ、また、極端な発光強度差が生じないよう調整することができる結果、同一の微弱光検出装置で多項目の検査を同時に行うことができるという効果を奏する。また、生体試料の複数の領域や同一細胞中の複数の部位を同時に測定することができ、取得した発光画像に関する領域（または部位）ごとの解析が可能となるという効果を奏する。

本発明によれば、物質はＡＴＰであり、発光関連タンパク質はルシフェラーゼであり、Ｋｍ値は３６４μＭ以上であるので、ＡＴＰを律速にすることができ、ＡＴＰに依存して定量的な発光強度を得ることができるという効果を奏する。

本発明によれば、配列番号１のＤＮＡ配列に基づいて生成されるヤエヤマヒメボタル由来のルシフェラーゼを用いるので、他のルシフェラーゼに比べて、ＡＴＰ依存的に大きな発光強度差を得ることができ、また、グロータイプの発光パターンを得ることができるという効果を奏する。特に、細胞内ＡＴＰ濃度が薬剤処理によって１．３５ｍＭから０．６５ｍＭに低下した場合、ヤエヤマヒメボタル由来のルシフェラーゼ（Ｙａｅｙａｍａ）を使用すると、ミカエリス・メンテン式から反応速度は、Ｖｍａｘの約８０％から約６０％に低下すると予想され、反応速度において２０％の差が生じるため、ＧＬ３を使用した場合（約５％の反応速度差）と比較して、Ｙａｅｙａｍａは検出を容易にするという効果を奏する。

本発明によれば、測定工程において、更に複数の細胞を含む生体試料を生物発光に基づく発光画像を撮像する。これにより、複数の細胞の領域および／または同一細胞内の複数の部位を同時に測定することができるという効果を奏する。

本発明によれば、測定工程において、更に細胞ごとに発光強度を計測する。これにより、細胞ごとに領域および／または部位を指定して、同時に複数の領域・部位を定量的に測定することが可能になるという効果を奏する。

本発明によれば、作製工程において、Ｋｍ値の異なる複数の発光関連タンパク質を用いて生体試料が作製される。これにより、測定対象物質の量に大きな差異がある場合であっても、同時に定量的な測定を行うことができるという効果を奏する。

本発明によれば、測定工程において、Ｋｍ値に応じた測定を実行する。これにより、発光関連タンパク質のＫｍ値に応じて撮像間隔や露光時間等を変更して、定量的な測定を行うことができるという効果を奏する。例えば、ダイナミックレンジが幅広い生理活性物質の動態がどのように変化しているかという動態解析と、その生理活性物質の動態に関連するような特定遺伝子の転写がどのように調節されているかといった特定遺伝子の発現変動の解析を同じ細胞（または細胞群）について迅速ないしリアルタイムに実行することが可能になる。

本発明によれば、出力工程において、Ｋｍ値に応じた出力を実行する。これにより、Ｋｍ値に基づくダイナミックレンジに応じたパラメータ（配色、明暗、寸法、動画表示速度等）に基づく変換処理を施して出力することができるという効果を奏する。

本発明によれば、生体試料に使用された発光タンパク質のＫｍ値に応じて生体試料からの発光画像を取得し、生体試料に使用された発光タンパク質のＫｍ値に応じて発光画像を解析するための画像処理を行い、画像解析結果を出力する。これにより、Ｋｍ値に応じてダイナミックレンジの異なる複数種類の測定対象を同一または異なる解析対象に対して実行することが可能となるという効果を奏する。

本発明によれば、更に複数の制御モードを有するダイナミックレンジの調整を行う。これにより、例えば、ＡＴＰ等のダイナミックレンジが広い測定項目と、特定の遺伝子発現のような比較的ダイナミックレンジが狭い測定項目を同一の解析対象に対して実行し、同一画像上の各領域および／または部位を同時且つリアルタイムに追跡することができるという効果を奏する。

本発明によれば、入力装置を介して生体試料における所望の領域および／または部位を指定させ、入力装置により入力された情報を記憶部において記憶し、ダイナミックレンジ調整部により、記憶部に記憶された情報に基づいて、撮像部および画像解析部を実行させ、当該情報に対応付けた画像結果を出力装置により出力させる。これにより、発光関連タンパク質のＫｍ値に応じてダイナミックレンジを調整し、ダイナミックレンジに応じた、撮像処理、解析処理、および出力処理を実行させることができ、ダイナミックレンジの異なる複数種類の測定対象を同一または異なる解析対象に対して実行することが可能となるという効果を奏する。

図１は、発光観察システム１００の全体構成の一例を示す図である。 図２は、発光観察システム１００の発光画像撮像ユニット１０６の構成の一例を示す図である。 図３は、発光観察システム１００の発光画像撮像ユニット１０６の構成の一例を示す図である。 図４は、発光観察システム１００の画像解析装置１１０の構成の一例を示すブロック図である。 図５は、実施例１により決定された、Ｄ−ルシフェリンおよびＡＴＰに対する各種ルシフェラーゼのＫｍ値を示す図表である。 図６は、Ｄ−ルシフェリンの紫外可視光吸収スペクトルを示す図である。 図７は、ＡＴＰの紫外可視光吸収スペクトルを示す図である。 図８は、ＣＢＧのＤ−ルシフェリン濃度上昇に伴う発光強度変化のグラフを示す図である。 図９は、ＣＢＧのＤ−ルシフェリン濃度に対するＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを示す図である。 図１０は、ＣＢＧのＤ−ルシフェリン濃度に対するＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを示す図である。 図１１は、ＣＢＲのＤ−ルシフェリン濃度上昇に伴う発光強度変化のグラフを示す図である。 図１２は、ＣＢＲのＤ−ルシフェリン濃度に対するＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを示す図である。 図１３は、ＣＢＲのＤ−ルシフェリン濃度に対するＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを示す図である。 図１４は、ＥＬｕｃのＤ−ルシフェリン濃度上昇に伴う発光強度変化のグラフを示す図である。 図１５は、ＥＬｕｃのＤ−ルシフェリン濃度に対するＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを示す図である。 図１６は、ＥＬｕｃのＤ−ルシフェリン濃度に対するＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを示す図である。 図１７は、ＧｅｎｊｉのＤ−ルシフェリン濃度上昇に伴う発光強度変化のグラフを示す図である。 図１８は、ＧｅｎｊｉのＤ−ルシフェリン濃度に対するＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを示す図である。 図１９は、ＧｅｎｊｉのＤ−ルシフェリン濃度に対するＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを示す図である。 図２０は、ＧＬ３のＤ−ルシフェリン濃度上昇に伴う発光強度変化のグラフを示す図である。 図２１は、ＧＬ３のＤ−ルシフェリン濃度に対するＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを示す図である。 図２２は、ＧＬ３のＤ−ルシフェリン濃度に対するＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを示す図である。 図２３は、ＹａｅｙａｍａのＤ−ルシフェリン濃度上昇に伴う発光強度変化のグラフを示す図である。 図２４は、ＹａｅｙａｍａのＤ−ルシフェリン濃度に対するＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを示す図である。 図２５は、ＹａｅｙａｍａのＤ−ルシフェリン濃度に対するＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを示す図である。 図２６は、ＣＢＧのＡＴＰ濃度上昇に伴う発光強度変化のグラフを示す図である。 図２７は、ＣＢＧのＡＴＰ濃度に対するＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを示す図である。 図２８は、ＣＢＧのＡＴＰ濃度に対するＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを示す図である。 図２９は、ＣＢＲのＡＴＰ濃度上昇に伴う発光強度変化のグラフを示す図である。 図３０は、ＣＢＲのＡＴＰ濃度に対するＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを示す図である。 図３１は、ＣＢＲのＡＴＰ濃度に対するＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを示す図である。 図３２は、ＥｌｕｃのＡＴＰ濃度上昇に伴う発光強度変化のグラフを示す図である。 図３３は、ＥｌｕｃのＡＴＰ濃度に対するＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを示す図である。 図３４は、ＥｌｕｃのＡＴＰ濃度に対するＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを示す図である。 図３５は、ＧｅｎｊｉのＡＴＰ濃度上昇に伴う発光強度変化のグラフを示す図である。 図３６は、ＧｅｎｊｉのＡＴＰ濃度に対するＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを示す図である。 図３７は、ＧｅｎｊｉのＡＴＰ濃度に対するＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを示す図である。 図３８は、ＧＬ３のＡＴＰ濃度上昇に伴う発光強度変化のグラフを示す図である。 図３９は、ＧＬ３のＡＴＰ濃度に対するＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを示す図である。 図４０は、ＧＬ３のＡＴＰ濃度に対するＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを示す図である。 図４１は、ＹａｅｙａｍａのＡＴＰ濃度上昇に伴う発光強度変化のグラフを示す図である。 図４２は、ＹａｅｙａｍａのＡＴＰ濃度に対するＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを示す図である。 図４３は、ＹａｅｙａｍａのＡＴＰ濃度に対するＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを示す図である。 図４４は、ルミノメーターで取得したフォトンカウント値よりＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−ＢｕｒｋプロットとＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを作成してＫｍ値を算出した結果をまとめた図表である。 図４５は、ルミノメーター（クロノス）による細胞内ＡＴＰ量測定におけるＥＬｕｃの発光変化量を示す図である。 図４６は、ルミノメーター（クロノス）による細胞内ＡＴＰ量測定におけるＧＬ３の発光変化量を示す図である。 図４７は、ＥＬｕｃ発現ＨｅＬａ細胞における、薬剤刺激直後の発光イメージング画像を示す図である。 図４８は、図４７における矩形で囲った画像（１〜７）から解析された、それぞれの細胞（ＥＬｕｃ発現ＨｅＬａ細胞：１〜７）におけるＳＴＳ刺激後の発光強度変化を示す図である。 図４９は、実施例４の実験手順および実験条件において、刺激前（細胞刺激によるアポトーシス誘導前）に撮像した発光画像を示す一例である。 図５０は、図４９に示した発光画像において、３つの測定領域（ＲＯＩ：region of interest）を指定した場合の画像を示す図である。 図５１は、３つの測定領域における発光輝度値とそのグラフを示す図である。

以下に、本発明にかかる発光測定方法および発光測定システムの実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。

特に以下の実施の形態においては、本発明を発光イメージングに適用した例について説明することがあるが、この場合に限られず、例えばルミノメーターによる測定方法としても同様に適用することができる。

まず、本発明にかかる発光測定方法（具体的には測定工程および出力工程）で用いる発光観察システム（発光測定システム）１００の構成について、図１、図２および図３を参照して説明する。図１は、発光観察システム１００の全体構成の一例を示す図である。

図１に示すように、発光観察システム１００は、生体試料１０２を収納した容器１０３（具体的にはシャーレ、スライドガラス、マイクロプレート、ゲル支持体、微粒子担体など）と、容器１０３を配置するステージ１０４と、発光画像撮像ユニット１０６と、画像解析装置１１０と、で構成されている。ここで、発光観察システム１００は、微弱な発光を測定するための発光画像撮像ユニット１０６をステージ１０４の下側に配置してもよく、これにより、カバー開閉によるサンプル上方からの外乱光を完全に遮断できて発光画像のＳ／Ｎ比を増すことができる。発光画像撮像ユニット１０６は、レーザー走査式の光学系であってもよい。

生体試料１０２は、例えば、発光関連遺伝子を導入することにより得られる、発光関連蛋白質を含む生きた細胞である。この生体試料１０２は、発光関連蛋白質と反応する物質が所定量以上含まれており、発光関連蛋白質には、当該物質に依存して発光強度が定量可能となるようＫｍ値が所定値以上であるものが採用されている。ここで、解析対象としては、細胞を含む生体組織、該生体組織を含む各種臓器または器官であってもよく、それら生体組織、臓器または器官を含むような胚ないし生物個体であってもよい。解析対象を保持するためのまた、ステージ１０４は、解析対象の種類、大きさ、個数等に応じて、所望の解析期間内に対象を発光観察用の視野（好ましくは光軸上）から解析すべき特定の細胞（１以上）が外れないような設計（例えば対象用の固定器具、ステージの追従機構）を設けるようにしてもよい。

発光画像撮像ユニット１０６は、具体的には正立型の発光顕微鏡であり、生体試料１０２の発光画像を撮像する。発光画像撮像ユニット１０６は、図示の如く、対物レンズ１０６ａと、ダイクロイックミラー１０６ｂと、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、結像レンズ１０６ｆと、で構成されている。対物レンズ１０６ａは、具体的には、（開口数／倍率）^２の値が０．０１以上のものである。ダイクロイックミラー１０６ｂは、生体試料１０２から発せられた発光を色別に分離し、２色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合に用いる。ＣＣＤカメラ１０６ｃは、対物レンズ１０６ａ、ダイクロイックミラー１０６ｂおよび結像レンズ１０６ｆを介して当該ＣＣＤカメラ１０６ｃのチップ面に投影された生体試料１０２の発光画像および明視野画像を撮る。また、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、画像解析装置１１０と有線または無線で通信可能に接続される。ここで、生体試料１０２が撮像範囲中に複数存在する場合、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、当該撮像範囲中に含まれる複数の生体試料１０２の発光画像および明視野画像を撮像してもよい。結像レンズ１０６ｆは、対物レンズ１０６ａおよびダイクロイックミラー１０６ｂを介して当該結像レンズ１０６ｆに入射した像（具体的には生体試料１０２を含む像）を結像する。なお、図１では、ダイクロイックミラー１０６ｂで分離した２つの発光に対応する発光画像を２台のＣＣＤカメラ１０６ｃで別々に撮像する場合の一例を示しており、１つの発光を用いる場合には、発光画像撮像ユニット１０６は、対物レンズ１０６ａ、１台のＣＣＤカメラ１０６ｃおよび結像レンズ１０６ｆで構成されてもよい。

ここで、２色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合、発光画像撮像ユニット１０６は、図２に示すように、対物レンズ１０６ａと、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、スプリットイメージユニット１０６ｄと、結像レンズ１０６ｆと、で構成されてもよい。そして、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、スプリットイメージユニット１０６ｄおよび結像レンズ１０６ｆを介して当該ＣＣＤカメラ１０６ｃのチップ面に投影された生体試料１０２の発光画像（スプリットイメージ）および明視野像を撮像してもよい。スプリットイメージユニット１０６ｄは、サンプル１０２から発せられた発光を色別に分離し、ダイクロイックミラー１０６ｂと同様、２色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合に用いる。

また、複数色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合（つまり、多色の発光を用いる場合）、発光画像撮像ユニット１０６は、図３に示すように、対物レンズ１０６ａと、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、フィルターホイール１０６ｅと、結像レンズ１０６ｆと、で構成されてもよい。そして、ＣＣＤカメラ１０６ｃは、フィルターホイール１０６ｅおよび結像レンズ１０６ｆを介して当該ＣＣＤカメラ１０６ｃのチップ面に投影された生体試料１０２の発光画像および明視野画像を撮像してもよい。フィルターホイール１０６ｅは、生体試料１０２から発せられた発光をフィルター交換によって色別に分離し、複数色の発光を用いて発光量や発光強度を色別に測定する場合に用いる。

図１に戻り、画像解析装置１１０は、具体的にはパーソナルコンピュータである。そして、画像解析装置１１０は、図４に示すように、大別して、制御部１１２と、システムの時刻を計時するクロック発生部１１４と、記憶部１１６と、通信インターフェース部１１８と、入出力インターフェース部１２０と、入力装置１２２と、出力装置１２４と、で構成されており、これら各部はバスを介して接続されている。なお、図１ないし図４に示される構成は、本出願人による国際公開特許ＷＯ２００６／１０６８８２（「所定部位発光量測定方法、所定部位発光量測定装置、発現量測定方法、および測定装置」と題する。）を参照することでより詳細に理解されてもよい。この国際公開特許は、同一細胞における２種類の医学的情報を蛍光画像と発光画像の両方を用いて解析する方法が開示されるので、本発明の別態様としてダイナミックレンジが異なる複数種類の蛍光標識用物質（例えばＧＦＰ，ＣＦＰ，ＹＦＰ、ＲＦＰ等の蛍光関連タンパク質）を用いた解析方法への応用を含めることも可能である。また、生物発光と蛍光を組み合わせたＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー移動）であれば、生物発光を主体とする光現象であるため蛍光を励起するためのシステムが不要な利点がある。また、発光関連タンパク質としてはルシフェラーゼ以外にもオベリン等を利用することも可能である。

記憶部１１６は、ストレージ手段であり、具体的には、ＲＡＭやＲＯＭ等のメモリ装置、ハードディスクのような固定ディスク装置、フレキシブルディスク、光ディスク等を用いることができる。そして、記憶部１１６は制御部１１２の各部の処理により得られたデータなどを記憶する。通信インターフェース部１１８は、画像解析装置１１０と、ＣＣＤカメラ１０６ｃと、の間における通信を媒介する。すなわち、通信インターフェース部１１８は他の端末と有線または無線の通信回線を介してデータを通信する機能を有する。入出力インターフェース部１２０は、入力装置１２２や出力装置１２４に接続する。ここで、出力装置１２４には、モニタ（家庭用テレビを含む）の他、スピーカやプリンタを用いることができる（なお、以下で、出力装置１２４をモニターとして記載する場合がある。）。また、入力装置１２２には、キーボードやマウスやマイクの他、マウスと協働してポインティングデバイス機能を実現するモニターを用いることができる。ここにおいて、使用者が、出力装置１２４としてのモニターに表示された発光画像に基づいて、所望の解析期間内に解析すべき１以上の特定の細胞（または細胞群）を含む関心領域または細胞内の関心部位及び測定項目を、入力装置１２２を介して指定することにより、観察視野内に指定された領域（または部位）の位置情報（アドレス）を記憶部１１６に記憶させる。この記憶情報は、複数の領域（または部位）または時系列の時間ごとに特定の細胞（または細胞群）を照合するような画像解析を可能にする。

また、使用者が、入力装置１２２を介して、ステージ１０４に供した対象に使用した発光関連タンパク質の種類（またはＫｍ値そのもの）を入力することにより、入出力インターフェース１２０と制御部１１２の間において、ダイナミックレンジ調整部１０８が、使用される１以上の発光関連タンパク質に関する測定項目ごとのダイナミックレンジをルックアップテーブルのような予め記憶されたメモリ情報から特定し、照合されたダイナミックレンジに応じた制御モードを制御部１１２に対して指示するように構成されている。ここで、発光関連タンパク質の種類が特定されれば、該発光関連タンパク質を発光させる基質の種類は一義的に決まるので基質に対するＫｍ値もルックアップテーブルに予め記憶するようにしてもよい。制御部１１２は、指示された制御モードによる各処理（撮像処理、画像取得処理、解析のための画像処理、解析結果出力処理）を記憶部１１８に記憶された指定領域（または部位）ごとのアドレスと対応付けながら各部（発光画像撮像指示部１１２ａ，発光画像取得部１１２ｂ，画像解析部１１２ｃ，解析結果出力部１１２ｄ）に実行させる。さらに、取得された発光画像および／または解析結果に関する情報は、ダイナミックレンジ調整部１０８を通じて、ダイナミックレンジに応じた出力形式に変換して出力装置１２４の画面上にディスプレイされる。なお、蛍光関連タンパク質を用いた測定項目を組み合わせる場合には、蛍光関連タンパク質の種類（またはＫｍ値そのもの）を入力装置１２２により入力するようにするのが好ましい。なお、発光関連タンパク質および／または蛍光関連タンパク質が改変等により、改変前と異なるＫｍ値を有することが考えられるので、実際に使用するタンパク質のＫｍ値を入力するようにするのが好ましい。

発光画像撮像指示部１１２ａによるダイナミックレンジに応じた撮像指示としては、例えば、撮像間隔（例えば５秒以内のビデオモード、６秒から１０分以内の中程度の間隔からなる動画モード、１１分から１２０分以内の長い撮像間隔からなるタイムラプスモードの何れかまたは組み合わせ）が挙げられる。発光画像取得部１１２ｂによるダイナミックレンジに応じた取得指示としては、例えば、撮像素子（例えばＣＣＤカメラ、ＣＭＯＳカメラ等）の露光時間（１秒以内の短時間露光モード、２秒から１０分以内の中程度の露光時間モード、６分から１２０分以内の長時間露光モード）が挙げられる。画像解析部１１２ｃにおいてはダイナミックレンジに応じた各種測定項目の解析を可能にするような演算アルゴリズムに基づいて、取得した発光画像に関する領域（または部位）ごとの解析が実行される。解析結果出力部１１２ｄにおいても、各種測定項目に応じた出力形式での出力（画像形式、数値形式、グラフ形式等）を行う。最後にダイナミックレンジ調整部１０８が、解析結果出力部１１２ｄより送出された各種解析結果を同一または異なる出力内容（画像、数値、グラフ等）に対して、ダイナミックレンジに応じたパラメータ（配色、色調、階調、明暗、寸法、動画表示速度の群から選ばれる）に基づく変換処理を施した上で出力装置１２４に表示させる。このようなシステムによれば、ダイナミックレンジの異なる、或いは測定項目に対応する被測定物質に対するＫｍ値が異なる複数種類の測定対象を同一または異なる解析対象に対して実行することが可能となる。例えば、ＡＴＰ等のダイナミックレンジが広い測定項目と、特定の遺伝子発現のような比較的ダイナミックレンジが狭い測定項目を同一の解析対象に対して実行し、同一画像上の各領域および／または部位を同時且つリアルタイムに追跡できる利点を有する。なお、この例では、明視野画像も取得して発光画像と重ね合わせることにより、発光画像としての細胞ごとの識別を可能になっているものとするが、撮像素子または発光試薬(ルシフェラーゼ、ルシフェリン、その他添加物)が高感度であるならば、明視野画像の重ね合わせは必須ではない。また、目的に応じて、後述するようなグロータイプやフラッシュタイプの各種発光タンパク質を同一の生体試料に対して同時に標識するように作製しても、上記システムにより撮像および解析可能であることから、組み合わせたマルチアッセイも可能である。

制御部１１２は、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）等の制御プログラムや各種の処理手順等を規定したプログラムや所要データを格納するための内部メモリを有し、これらのプログラムに基づいて種々の処理を実行する。そして、制御部１１２は、大別して、発光画像撮像指示部１１２ａと、発光画像取得部１１２ｂと、画像解析部１１２ｃと、解析結果出力部１１２ｄと、で構成されている。

発光画像撮像指示部１１２ａは、通信インターフェース部１１８を介して、ＣＣＤカメラ１０６ｃへ発光画像および明視野画像の撮像を指示する。発光画像取得部１１２ｂは、ＣＣＤカメラ１０６ｃで撮像した発光画像および明視野画像を、通信インターフェース部１１８を介して取得する。制御部１１２は、発光画像撮像指示部１１２ａを制御して、生体試料１０２の発光画像および明視野画像を繰り返し撮像する。

ここで、ＣＣＤカメラ１０６ｃで生体試料１０２の発光画像を撮像するにあたっては、発光関連タンパク質間で（例えば、一方をＡＴＰ定量用のルシフェラーゼとし、他方を遺伝子発現解析用のルシフェラーゼとした場合）、極端な発光強度差が生じないよう適切なＫｍ値を有する発光関連タンパク質が選択（例えば、ＡＴＰ定量用ルシフェラーゼとして、遺伝子発現解析用ルシフェラーゼのＫｍ値と比較して高いもの（Ｋｍ＝３６４（μＭ）以上のもの）が選択）されていることにより同時に同一の露光時間で撮像することができる。

画像解析部１１２ｃは、発光画像取得部１１２ｂで取得した発光画像に基づいて、各々の発光色の発光強度を定量的に測定する。画像解析部１１２ｃは、発光画像取得部１１２ｂで取得した複数の発光画像に基づいて、各々の発光色の発光強度の経時変化を定量的に測定する。解析結果出力部１１２ｄは、画像解析部１１２ｃでの解析結果を出力装置１２４に出力する。ここで、解析結果出力部１１２ｄは、画像解析部１１２ｃで得られた、各々の発光色の発光強度に関する時系列データを、グラフ化して出力装置１２４に表示してもよい。

以上が、本発明の発光測定方法で用いる発光観察システム（発光測定システム）の構成の一例である。なお、出力装置１２４は、数値データのグラフ以外にも、時系列の数値データの少なくとも一部に対応する複数の発光画像を動画または並列表示の形式でモニターに出力してもよい。このように、本発明によれば、ダイナミックレンジが幅広い生理活性物質の動態がどのように変化しているかという動態解析と、その生理活性物質の動態に関連するような特定遺伝子の転写がどのように調節されているかといった特定遺伝子の発現変動の解析を同じ細胞（または細胞群）について迅速ないしリアルタイムに実行することが可能になるので、医学的研究ならびに臨床上の用途（例えば治療、診断、予防医学のための薬剤に対する応答試験）において迅速且つ正確な情報を提供する。なお、本発明の方法を実行する解析システムとして蛍光撮像ユニットを組み合わせた場合には、蛍光撮像ユニットと発光画像ユニットとが同一のステージに対して互いに異なる光軸上に配置されていたり、互いに異なるステージ上に配置された別体の装置（例えば蛍光顕微鏡と発光顕微鏡）であったりしてもよく、同一または異なるステージ上に対して解析したい複数の対象を順次移動させながら撮像および解析を行うようにしてもよい。また、解析システムとしては、少なくとも図４に示されるような画像解析装置を具備していれば、上述した顕微鏡ベースのシステム以外の画像化システム（各種ファイバスコープ（例えば内視鏡）、画像解析型の分光測定装置（例えばルミノメータ））への適用も可能である。また、対象が生体から単離され培養または人為加工された生体試料（細胞、生体組織、臓器（または器官）等）である場合には、所望の解析期間中、生体活性が維持されるように適宜の培養装置と組み合わせたシステムとするのが好ましいが、個体である場合には培養装置の代わりに酸素および栄養等を適宜供給したり摂食させながら断続的に撮像することで同様の解析が可能である。

［実施例１］
［各種ルシフェラーゼの酵素学的性質と発光測定への応用］
実施例１として、本発明を適用することができる好適なＫｍ値を持つルシフェラーゼを見出すため、市販のルシフェラーゼ（ＣＢＧ，ＣＢＲ，ＥＬｕｃ，Ｇｅｎｊｉ，ＧＬ３）の酵素学的性質（Ｄ−ルシフェリンおよびＡＴＰに対するＫｍ値）決定を行った。

［実験方法１：Ｄ−ルシフェリンに対する各種ルシフェラーゼのＫｍ値算出］
０．１Ｍ ＡＴＰ溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０））に、Ｄ−ルシフェリンを終濃度が５，１０，２０，４０，８０，１６０，３２０，６４０μＭとなるように各々添加し、計８本のＤ−ルシフェリン濃度の異なる溶液を作成した。次に、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）中で１００μｇ／ｍｌルシフェラーゼ溶液を調製した。

そして、各濃度のＤ−ルシフェリン溶液をそれぞれ９６穴のウェルに５０μｌずつ分注した。次に、ルシフェラーゼ溶液をルミノメーターの標準ポンプに接続し、ルシフェラーゼ溶液をウェルに５０μｌ添加すると同時に測定を開始するようなプログラムを準備した。

そして、プログラムを開始し、各Ｄ−ルシフェリン濃度におけるフォトンカウント値を測定した。得られた結果に基づいて、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−ＢｕｒｋプロットおよびＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを作成し、Ｄ−ルシフェリンに対する各ルシフェラーゼのＫｍ値を決定した。ここで、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットは、下記の式（１），Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットは、下記の式（２）で表される。

［実験方法２：ＡＴＰに対する各種ルシフェラーゼのＫｍ値算出］
１ｍＭ Ｄ−ルシフェリン溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０））に、ＡＴＰを終濃度が１０，２０，４０，８０，１６０，３２０，６４０，１２８０μＭとなるように各々添加し、計８本のＡＴＰ濃度の異なる溶液を作成した。

次に、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）中で１００μｇ／ｍｌルシフェラーゼ溶液を調製した。各濃度のＡＴＰ溶液をそれぞれ９６穴のウェルに５０μｌずつ分注した。

そして、ルシフェラーゼ溶液をルミノメーターの標準ポンプに接続し、ルシフェラーゼ溶液をウェルに５０μｌ添加すると同時に測定を開始するようなプログラムを準備した。

プログラムを開始し、各ＡＴＰ濃度におけるフォトンカウント値を測定し、得られた結果に基づいて、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−ＢｕｒｋプロットおよびＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを作成し、ＡＴＰに対する各種ルシフェラーゼのＫｍ値を決定した。

［考察］
以上の実験結果から決定されたＫｍ値を図５に示す。図５は、実施例１により決定された、Ｄ−ルシフェリンおよびＡＴＰに対する各種ルシフェラーゼのＫｍ値を示す図表である。なお、図５において、括弧内はＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを使用して算出したＫｍ値であり、括弧外はＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを使用して算出したＫｍ値である。

各ルシフェラーゼのＫｍ値はＫｄと同様に扱うのが一般的であるため、値が小さいほどＤ−ルシフェリンまたはＡＴＰに対する親和性が高いと考えられる。図５に示すように、Ｄ−ルシフェリンに対する親和性の序列は、ＣＢＧ＞ＥＬｕｃ＞ＧＬ３＞ＣＢＲ＞Ｇｅｎｊｉということが確認された。

ＣＢＧ，ＣＢＲ，およびＥＬｕｃはヒカリコメツキ由来、ＧＬ３，およびＧｅｎｊｉがホタル由来であることを考慮すると、Ｄ−ルシフェリンに対する親和性はヒカリコメツキ由来のルシフェラーゼの方が高い傾向が見られる。

また、ルミノメーターで計測した発光パターンもヒカリコメツキ由来のものとホタル由来のもので異なる結果が得られた。すなわち、ヒカリコメツキ由来のルシフェラーゼが、ルシフェリン添加後５−６秒後に発光ピーク強度を持つのに対して、ホタル由来のルシフェラーゼはルシフェリン添加後０．５−１秒後に発光ピークを持つことを確認した。

このように、ルシフェラーゼの由来となる生物種によりフラッシュタイプ（短時間発光）とグロータイプ（長時間発光）に分かれる傾向があるので、測定や観察の目的に応じて所望のタイプのルシフェラーゼを選ぶことができる。

また、このような発光パターンの差は、Ｐ． ｐｙｒａｌｉｓのポイントミューテーションによって、Ｄ−ルシフェリンまたはＡＴＰ結合部位近辺のルシフェラーゼのアミノ酸残基の違い（Ｒ２１８，Ｆ２５０，Ｇ３１５，Ｔ３４３等）によって生じることが報告されている（Ｂｒｕｃｅ Ｒ． Ｂｒａｎｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ，２００３， ４２， １０４２９−１０４３６参照）。

上記のアミノ酸残基は、減衰速度（ｄｅｃａｙ ｒａｔｅ）にも寄与することがわかっているため、各種ルシフェラーゼにおける当該アミノ酸残基を考慮することにより、遺伝子工学的手法を用いてフラッシュタイプやグロータイプなどの異なる発光パターンを示すルシフェラーゼを作成することができることが判明した。

一方、ＡＴＰに対する親和性の序列は、ＣＢＲ＞ＣＢＧ，ＧＬ３＞ＥＬｕｃ＞Ｇｅｎｊｉということが確認された。すなわち、ＥＬｕｃおよびＧｅｎｊｉは、他のルシフェラーゼと比較してＡＴＰに対する親和性が低いという結果が得られた。

ここで、感受性が高いＧＬ３などではわずかなＡＴＰ量の変化を発光量に反映できず、ＡＴＰ量が大幅に減衰するまで一定の発光強度を保つ可能性がある。すなわち、本願発明者による他の実験では、ＨｅＬａ細胞にｐＧＬ３をトランスフェクションし、常時ＧＬ３を発現させた状態で、脱共役剤であるＦＣＣＰ（ｃａｒｂｏｎｙｌ ｃｙａｎｉｄｅ ｐ−（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｏｘｙ） ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｏｎｅ）を用いて、ミトコンドリアにおけるＡＴＰ産生を停止させた際の発光強度を、ＬＵＭＩＮＯＶＩＥＷ（ＬＶ１００）（商品名）で経時的に測定したが、刺激後測定を続けても発光強度は減衰しなかった。

定常状態のＨｅＬａ細胞の細胞質ＡＴＰ濃度は、１．３ｍＭと見積もられており（ＭＶ Ｚａｍａｒａｅｖａ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，２００５， １２， １３９０−１３９７参照）、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応がミカエリス・メンテン式に従うと仮定すると、このＡＴＰ濃度におけるＧＬ３の反応速度はＶｍａｘの約８５％に達している。一方、ＦＣＣＰ処理後３０分経過時点で、細胞質ＡＴＰ濃度は定常状態の約５０％になることが報告されているが（Ｔａｋｅｓｈｉ Ｋｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， ２００５， １７４４， １９−２８）、ＧＬ３の０．６５ｍＭ ＡＴＰでの反応速度はＶｍａｘの約８０％と予想される。すなわち、ルシフェラーゼの発現量が変化する細胞での測定系において、５％の反応速度差による発光変化を、ＡＴＰ量の変化としてＣＣＤカメラで検出することは困難だと考えられる。

これに対して、より親和性が低いルシフェラーゼを使用した場合、ミカエリス・メンテン式から予想される反応速度が遅くなって、薬剤処理によっても同様の速度差が生じるため、ＧＬ３を使用した場合と比較して検出が容易になると結論付けられる。

すなわち、ＡＴＰのように生体試料中に所定値以上存在する物質を定量的に測定する場合には、当該物質濃度がミカエリス・メンテン式においてＶｍａｘ付近にならないようＫｍ値が高い発光関連物質を選択することにより、比較的大きな反応速度差を得られる結果、発光強度の差を観察することが容易になることが判明した。好適には、細胞内ＡＴＰ濃度を測定する際には、その細胞のＡＴＰ量を見積もった上で、適切なＫｍ値をもつルシフェラーゼを選択してもよい。このように、ＡＴＰに対する低い親和性（高いＫｍ値）は、細胞内ＡＴＰ濃度をルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を用いて定量する際に有利な特性である。

また、ここで、ＡＴＰに対する親和性は、ＡＴＰ結合部位近傍のポイントミューテーションによって変化させることができる（Ｂｒｕｃｅ Ｒ． Ｂｒａｎｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ，２００３， ４２， １０４２９−１０４３６参照）。すなわち、中程度から非常に低いＡＴＰ親和性（中程度から非常に高いＫｍ値）を持つルシフェラーゼ系列を作成することにより、多種類の細胞に対応した細胞内ＡＴＰ測定系を構築してもよい。なお、ルシフェラーゼに変異を導入してＡＴＰ親和性を調節する際には、発光強度が減少しないよう考慮してもよい。

また、上述した方法は、過剰量存在し得る生体関連物質の場合に当該物質に対する親和性が低いルシフェラーゼを使用して長期間測定ないし観察する検査方法を例にしたが、換言すれば、微小量しか存在し得ない生体関連物質の場合には当該物質に対する親和性が高いルシフェラーゼを選択してもよい。このように、多様な存在量を呈する各種生体関連物質に対して、各々の親和性を予め求めた上で、所望の検査項目に適当なルシフェラーゼを選択的に使用して、常に検査効率が高い測定ないし観察を行うことができる。

以上のように、本発明者による鋭意検討の結果、ＡＴＰのように生体、特に細胞中に過剰量存在するような物質に対しては、当該物質に対する親和性が低いルシフェラーゼを選択すると良好な測定が可能となることが判明した。特に、ＡＴＰに対する親和性について検討したところ、Ｋｍ値が３６４μＭ以上、好ましくは５００μＭ以上であるようなルシフェラーゼを選択することにより、生体中の定量的変化を正確に測定できることが判明した。また、遺伝子改変によって、Ｋｍ値を調節することにより改変前のＫｍ値が上記範囲外であるようなルシフェラーゼも利用可能性となる。かかるＫｍ値を有するルシフェラーゼを用いて複数の細胞を含む生体試料を発光標識した場合には、生物発光に基づく発光画像を撮像することによって細胞ごとに発光強度を計測することが可能となる。さらに、発光画像に基づいて細胞ごとの形態変化も合わせた解析が可能になることから、例えば薬剤による刺激等に応じてアポトーシス等が誘起され形態的な収縮等の変化を細胞ごとに正確に特定することができるという有用な応用もまた、本発明の測定方法として提案できるようになる。ここで解析対象に対する刺激等は、薬物のような化学物質の添加や服用以外にも、電気・光・磁気・超音波等の物理エネルギーの付与が挙げられる。

すなわち、ルシフェラーゼを用いる生体関連物質の測定には、対象物質に対する親和性および発光基質に対する親和性を適切に組合せることによって、過剰量存在し得る物質であっても適切な測定条件で正確に定量測定（特に濃度変化の測定）できる。このことは、ごく微量な変化を検出する任意の検査、もしくは一細胞のように微弱光を発する物質の強度変化に基づく任意の検査に適用可能であることを示している。

［実施例２］
［ヤエヤマヒメボタル由来ルシフェラーゼと各種ルシフェラーゼとの酵素学的性質の比較］
本願発明者により新規に発見され抽出された、ヤエヤマヒメボタル（学名：Ｌｕｃｉｏｌａ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ ｙａｙｅｙａｍａｎａ）由来ルシフェラーゼと、上記各種ルシフェラーゼとの酵素学的性質とその応用について以下に説明する。

この実施例における背景として、現在市販のルシフェラーゼは既に遺伝子工学的な改変を施されており、技術的な進歩が困難な可能性があるという問題があった。このような状況を打開すべく、本発明者により新規ルシフェラーゼのスクリーニングが行われ、その結果、ヤエヤマヒメボタル由来のルシフェラーゼ遺伝子（配列番号１）が得られたので、このヤエヤマヒメボタルルシフェラーゼの酵素学的性質の決定を行った。すなわち、本実施例では、新規に取得したヤエヤマヒメボタル由来のルシフェラーゼの酵素学的性質（Ｄ−ルシフェリンおよびＡＴＰに対するＫｍ値）の決定を行った。また、比較のために各社から販売されているルシフェラーゼ（ＣＢＧ，ＣＢＲ，ＥＬｕｃ，Ｇｅｎｊｉ，ＧＬ３）の酵素学的性質の決定も同時に行った。

ここで、配列に関して、ホタル属（Ｌｕｃｉｏｌａ）には数種のホタルが日本国内で知られているが、既に遺伝子配列が分かっているゲンジボタル（学名：Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａ，ルシフェラーゼ名は、本明細書においてＧｅｎｊｉと称している。）等に対して、以下に示す実験で得られたようなＫｍ値の違いがあることが分かった。このＫｍ値の違いに着目して、目的に応じたルシフェラーゼを発光標識に使用することが本発明の重要な主旨の一つである。

［実験方法１：Ｄ−ルシフェリンおよびＡＴＰ原液の濃度算出］
まず、Ｄ−ルシフェリンの濃度算出のため、Ｄ−ルシフェリンの紫外可視光吸収スペクトルを測定した。ここでは、Ｄ−ルシフェリン（ｐｒｏｍｅｇａ社製）原液（約１００ｍＭ）の４０００倍希釈溶液（ｉｎ ０．１Ｍ Ｃｉｔｒａｔｅ／０．２Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４バッファー，ｐＨ ５．０）を用いて測定した。ブランクは、上記バッファーを使用した。ここで、図６は、Ｄ−ルシフェリンの紫外可視光吸収スペクトルを示す図である。

図６のスペクトルより得られた吸光度（３２８ｎｍ， ０．４６７±０．００６， ｎ＝１０）を用いてＤ−ルシフェリン原液濃度を算出し（Ｄ−ルシフェリン：λ_ｍａｘ ３２８ｎｍ，ε１８２００，ｐＨ ５．０）、算出の結果、Ｄ−ルシフェリン原液は１０２．６ｍＭと算出された。

次に、ＡＴＰの濃度算出のため、ＡＴＰの紫外可視光吸収スペクトルを測定した。ここでは、ＡＴＰ原液（約１００ｍＭ）の２０００倍希釈溶液（ｉｎ ０．１Ｍ Ｃｉｔｒａｔｅ／０．２Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４バッファー，ｐＨ ７．０）を用いて測定した。ブランクは、上記バッファーを使用した。ここで、図７は、ＡＴＰの紫外可視光吸収スペクトルを示す図である。

図７のスペクトルより得られた吸光度（２５９ｎｍ， ０．３５９±０．００４， ｎ＝１０）を用いてＤ−ルシフェリン原液濃度を算出し（ＡＴＰ：λ_ｍａｘ ２５９ ｎｍ， ε１５４００， ｐＨ ７．０）、算出の結果ＡＴＰ原液は４６．６ｍＭと算出された。

［実験方法２：各種ルシフェラーゼの精製］
ルシフェラーゼの精製は、アフィニティクロマトグラフィによるルシフェラーゼ精製系を確立して、以下の手順で行った。

（大腸菌へのルシフェラーゼ発現ベクターのトランスフェクションの手順）
まず、ルシフェラーゼ発現ベクター０．５μｌを大腸菌（ＪＭ１０９（ＤＥ３））５０μｌに導入した。そして、氷冷で１０分間、４２℃で１分間、氷冷で２分間の恒温処理後、大腸菌溶液２μｌをＳＯＣ培地１ｍｌに加えた。

そして、大腸菌／ＳＯＣ培地混合溶液を３７℃で２０分間振とうインキュベートした後、１００μｌをＬＢ培地プレート（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ １００μｇ／ｍｌ＋）にストリークして、３７℃オーバーナイトでインキュベートした。

（アフィニティクロマトグラフィによるルシフェラーゼの精製）
つぎに、大腸菌を破砕し、得られた粗抽出液からアフィニティクロマトグラフィでルシフェラーゼを精製した。

すなわち、まず、大腸菌懸濁液を１５０００ｒｐｍ，５分間遠心し、回収した大腸菌ペレットを４℃冷却したＴＢＳ１０ｍｌに懸濁した。そして、ＦｒｅｎｃｈＰｒｅｓｓｕｒｅＣｅｌｌを用いて菌体破砕し、その菌体破砕液を遠心（１５０００ｒｐｍ，１０分間）して沈査を除去した上清を回収した。

そして、ベッドボリューム２ｍｌのカラムにＴＢＳ２ｍｌを加え、フィルターを通した。カラムにＮｉ−Ａｇａｒ懸濁液５００μｌとＴＢＳ２ｍｌを加え、ＴＢＳを自然落下させた（カラム平衡化）。回収した上清をカラムに添加し、自然落下させた。なお、上清が落ち切るまでの操作は冷蔵庫内にて４℃条件で行った。

次に、５０ｍＭイミダゾール／ＴＢＳ溶液１ｍｌでカラムを洗浄し、５００ｍＭイミダゾール／ＴＢＳ溶液２ｍｌをカラムに添加し、ルシフェラーゼを溶出させた。溶出液は１０ｍｌのチューブに回収し、すぐに氷冷した後、限外濾過による濃縮を行った。

そして、遠心濃縮チューブ（ＴａＫａＲａ製ＳＵＰＲＥＣ^ＴＭ−０２ （排除限界分子量３０，０００））に溶出液を４００μｌずつ移して遠心（５０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎ）し、約１００μｌまで濃縮して、プレートリーダーで吸光度を測定し、ＢＳＡを用いて作成した検量線からルシフェラーゼ濃度を算出した。濃度算出後のルシフェラーゼ溶液は５０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ溶液にして−２０℃で保存した。

［実験方法３：Ｄ−ルシフェリンに対する各種ルシフェラーゼのＫｍ値算出］
まず、４ｍＭ ＡＴＰ，８ｍＭ ＭｇＳＯ_４溶液（ｉｎ ０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０））を調製した。つぎに、上記のＡＴＰ溶液にＤ−ルシフェリンを終濃度が５，１０，２０，４０，８０，１６０，３２０，６４０μＭとなるように各々添加し、計８本のＤ−ルシフェリン濃度の異なる溶液を作成した。

そして、１００μｇ／ｍｌルシフェラーゼ溶液（ｉｎ ０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０））を調製し、各濃度のＤ−ルシフェリン溶液をそれぞれ９６穴のウェルに５０μｌずつ分注した。

そして、ルシフェラーゼ溶液をルミノメーターの標準ポンプに接続し、ルシフェラーゼ溶液をウェルに５０μｌ添加すると同時に測定を開始するプログラムを準備した。

その後、プログラムを開始し、各Ｄ−ルシフェリン濃度におけるフォトンカウント値を測定した。なお、各Ｄ−ルシフェリン濃度において、同様の測定を５回ずつ行った。

得られた結果に基づいて、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−ＢｕｒｋプロットおよびＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを作成した。ここで、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットは、下記の式（３），Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットは、下記の式（４）で表される。なお、ここでは酵素液添加直後のフォトンカウント測定値を初速度として各プロットを作成した。

（Ｖ：反応速度、Ｖｍａｘ：最大速度、［Ｓ］：基質濃度、Ｋｍ：ミカエリス定数）
以下に、各ルシフェラーゼのＤ−ルシフェリン濃度上昇に伴う発光強度変化のグラフ、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロット、および、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットの結果を図８〜図２５を参照して示す。

すなわち、図８は、ＣＢＧのＤ−ルシフェリン濃度上昇に伴う発光強度変化のグラフ、図９は、ＣＢＧのＤ−ルシフェリン濃度に対するＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロット、図１０は、ＣＢＧのＤ−ルシフェリン濃度に対するＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを示す図である。

その結果、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットから算出したＤ−ルシフェリンに対するＣＢＧのＫｍ値は１０．５μＭ、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットから算出したＤ−ルシフェリンに対するＣＢＧのＫｍ値は１０．５μＭであった。

また、ＣＢＲに関して、図１１は、ＣＢＲのＤ−ルシフェリン濃度上昇に伴う発光強度変化のグラフ、図１２は、ＣＢＲのＤ−ルシフェリン濃度に対するＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロット、図１３は、ＣＢＲのＤ−ルシフェリン濃度に対するＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを示す図である。

その結果、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットから算出したＤ−ルシフェリンに対するＣＢＲのＫｍ値は３６．４μＭ、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットから算出したＤ−ルシフェリンに対するＣＢＲのＫｍ値は６３．８μＭであった。

また、ＥＬｕｃに関して、図１４は、ＥＬｕｃのＤ−ルシフェリン濃度上昇に伴う発光強度変化のグラフ、図１５は、ＥＬｕｃのＤ−ルシフェリン濃度に対するＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロット、図１６は、ＥＬｕｃのＤ−ルシフェリン濃度に対するＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを示す図である。

その結果、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットから算出したＤ−ルシフェリンに対するＥＬｕｃのＫｍ値は１５．０μＭ、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットから算出したＤ−ルシフェリンに対するＥＬｕｃのＫｍ値は１５．０μＭであった。

また、Ｇｅｎｊｉに関して、図１７は、ＧｅｎｊｉのＤ−ルシフェリン濃度上昇に伴う発光強度変化のグラフ、図１８は、ＧｅｎｊｉのＤ−ルシフェリン濃度に対するＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロット、図１９は、ＧｅｎｊｉのＤ−ルシフェリン濃度に対するＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを示す図である。

その結果、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットから算出したＤ−ルシフェリンに対するＧｅｎｊｉのＫｍ値は７５．０μＭ、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットから算出したＤ−ルシフェリンに対するＧｅｎｊｉのＫｍ値は７５．０μＭであった。

また、ＧＬ３に関して、図２０は、ＧＬ３のＤ−ルシフェリン濃度上昇に伴う発光強度変化のグラフ、図２１は、ＧＬ３のＤ−ルシフェリン濃度に対するＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロット、図２２は、ＧＬ３のＤ−ルシフェリン濃度に対するＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを示す図である。

その結果、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットから算出したＤ−ルシフェリンに対するＧＬ３のＫｍ値は３３．３μＭ、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットから算出したＤ−ルシフェリンに対するＧＬ３のＫｍ値は２５．０μＭであった。

また、Ｙａｅｙａｍａ（ヤエヤマヒメボタル由来ルシフェラーゼ）に関して、図２３は、ＹａｅｙａｍａのＤ−ルシフェリン濃度上昇に伴う発光強度変化のグラフ、図２４は、ＹａｅｙａｍａのＤ−ルシフェリン濃度に対するＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロット、図２５は、ＹａｅｙａｍａのＤ−ルシフェリン濃度に対するＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを示す図である。

その結果、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットから算出したＤ−ルシフェリンに対するＹａｅｙａｍａのＫｍ値は１００μＭ、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットから算出したＤ−ルシフェリンに対するＹａｅｙａｍａのＫｍ値は１００μＭであった。

［実験方法４：ＡＴＰに対する各種ルシフェラーゼのＫｍ値算出］
ＡＴＰに対する各種ルシフェラーゼのＫｍ値算出を行うために、まず、１ｍＭ Ｄ−ルシフェリンの８ｍＭ ＭｇＳＯ_４，０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）溶液を調製した。

つぎに、上記ルシフェリン溶液に、ＡＴＰを終濃度が１０，２０，４０，８０，１６０，３２０，６４０，１２８０μＭとなるように各々添加し、計８本のＡＴＰ濃度の異なる溶液を作成した。そして、１００μｇ／ｍｌルシフェラーゼの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）溶液を調製した。そして、各濃度のＡＴＰ溶液をそれぞれ９６穴のウェルに５０μｌずつ分注した。

ルシフェラーゼ溶液をルミノメーターの標準ポンプに接続し、ルシフェラーゼ溶液をウェルに５０μｌ添加すると同時に測定を開始するプログラムを作成した。

そして、プログラムを開始し、各ＡＴＰ濃度におけるフォトンカウント値を測定した。なお、各ＡＴＰ濃度において、測定を５回ずつ行った。

そして、得られた結果に基づいて、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロット、およびＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを作成した。以下に、各ルシフェラーゼのＡＴＰ濃度上昇に伴う発光強度変化のグラフ、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−ＢｕｒｋプロットおよびＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットの結果を、図２６〜４３を参照して示す。

すなわち、図２６は、ＣＢＧのＡＴＰ濃度上昇に伴う発光強度変化のグラフ、図２７は、ＣＢＧのＡＴＰ濃度に対するＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロット、図２８は、ＣＢＧのＡＴＰ濃度に対するＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを示す図である。

その結果、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットから算出したＡＴＰに対するＣＢＧのＫｍ値は２００μＭ、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットから算出したＡＴＰに対するＣＢＧのＫｍ値は２９０μＭであった。

また、ＣＢＲに関して、図２９は、ＣＢＲのＡＴＰ濃度上昇に伴う発光強度変化のグラフ、図３０は、ＣＢＲのＡＴＰ濃度に対するＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロット、図３１は、ＣＢＲのＡＴＰ濃度に対するＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを示す図である。

その結果、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットから算出したＡＴＰに対するＣＢＲのＫｍ値は１１０μＭ、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットから算出したＡＴＰに対するＣＢＲのＫｍ値は１３０μＭであった。

また、Ｅｌｕｃに関して、図３２は、ＥｌｕｃのＡＴＰ濃度上昇に伴う発光強度変化のグラフ、図３３は、ＥｌｕｃのＡＴＰ濃度に対するＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロット、図３４は、ＥｌｕｃのＡＴＰ濃度に対するＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを示す図である。

その結果、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットから算出したＡＴＰに対するＥｌｕｃのＫｍ値は３６４μＭ、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットから算出したＡＴＰに対するＥｌｕｃのＫｍ値は２５０μＭであった。

また、Ｇｅｎｊｉに関して、図３５は、ＧｅｎｊｉのＡＴＰ濃度上昇に伴う発光強度変化のグラフ、図３６は、ＧｅｎｊｉのＡＴＰ濃度に対するＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロット、図３７は、ＧｅｎｊｉのＡＴＰ濃度に対するＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを示す図である。

その結果、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットから算出したＡＴＰに対するＧｅｎｊｉのＫｍ値は５００μＭ、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットから算出したＡＴＰに対するＧｅｎｊｉのＫｍ値は５００μＭであった。

また、ＧＬ３に関して、図３８は、ＧＬ３のＡＴＰ濃度上昇に伴う発光強度変化のグラフ、図３９は、ＧＬ３のＡＴＰ濃度に対するＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロット、図４０は、ＧＬ３のＡＴＰ濃度に対するＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを示す図である。

その結果、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットから算出したＡＴＰに対するＧＬ３のＫｍ値は２００μＭ、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットから算出したＡＴＰに対するＧＬ３のＫｍ値は２００μＭであった。

また、Ｙａｅｙａｍａに関して、図４１は、ＹａｅｙａｍａのＡＴＰ濃度上昇に伴う発光強度変化のグラフ、図４２は、ＹａｅｙａｍａのＡＴＰ濃度に対するＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロット、図４３は、ＹａｅｙａｍａのＡＴＰ濃度に対するＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを示す図である。

その結果、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットから算出したＡＴＰに対するＹａｅｙａｍａのＫｍ値は４００μＭ、Ｈａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットから算出したＡＴＰに対するＹａｅｙａｍａのＫｍ値は４００μＭであった。

［考察］
以上の結果、すなわち、ルミノメーターで取得したフォトンカウント値よりＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−ＢｕｒｋプロットとＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを作成し、このプロットからＫｍ値を算出した結果をまとめた表を、図４４に示す。なお、図４４において、括弧内はＨａｎｅｓ−Ｗｏｏｌｆプロットを使用して算出したＫｍ値である。

各ルシフェラーゼのＫｍ値は、Ｋｄと同様に扱うのが一般的であるため、値が小さいほどＤ−ルシフェリンまたはＡＴＰに対する親和性が高いと考えられる。すなわち、Ｄ−ルシフェリンに対する親和性の序列は、ＣＢＧ＞ＥＬｕｃ＞ＧＬ３＞ＣＢＲ＞Ｇｅｎｊｉ＞Ｙａｅｙａｍａとなる。

ＣＢＧ，ＣＢＲ，ＥＬｕｃはヒカリコメツキ由来、ＧＬ３，Ｇｅｎｊｉ，Ｙａｅｙａｍａがホタル由来であることを考慮すると、Ｄ−ルシフェリンに対する親和性はヒカリコメツキ由来のルシフェラーゼの方が高い傾向が見られる。

また、データを示してはいないが、ルミノメーターで計測した発光パターンもヒカリコメツキ由来のものとホタル由来のもので異なる結果が得られた。すなわち、ヒカリコメツキ由来のルシフェラーゼがルシフェリン添加後５−６秒後に発光ピーク強度を持つ、いわゆるグロータイプの発光を示したのに対して、ホタル由来のルシフェラーゼはルシフェリン添加後０．５−１秒後に発光ピークを持つ、いわゆるフラッシュタイプの発光を示した。今回発明者らが取得出来たＹａｅｙａｍａ由来のルシフェラーゼもルシフェリン添加後０．５−１秒後に発光ピークを持ったことから、フラッシュタイプであると判明した。

このような発光パターンの差は、Ｐ． ｐｙｒａｌｉｓのポイントミューテーションによって、Ｄ−ルシフェリンまたはＡＴＰ結合部位近辺のルシフェラーゼのアミノ酸残基の違い（Ｒ２１８，Ｆ２５０，Ｇ３１５，Ｔ３４３等）によって生じることが報告されている（Ｂｒｕｃｅ Ｒ． Ｂｒａｎｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ，２００３， ４２， １０４２９−１０４３６参照）。

上記のアミノ酸残基は減衰速度（ｄｅｃａｙ ｒａｔｅ）にも寄与することがわかっているため、各種ルシフェラーゼにおける当該アミノ酸残基を考慮することにより、遺伝子工学的手法を用いてフラッシュタイプやグロータイプなどの異なる発光パターンを示すルシフェラーゼを作成することができることが判明した。

一方、ＡＴＰに対する親和性では序列は、ＣＢＲ＞ＣＢＧ，ＧＬ３＞ＥＬｕｃ＞Ｙａｅｙａｍａ＞Ｇｅｎｊｉということが確認された。Ｇｅｎｊｉには及ばないものの、Ｙａｅｙａｍａは他のルシフェラーゼと比較してＡＴＰに対する親和性が低いという結果が得られた。このＡＴＰに対する低い親和性は、細胞内ＡＴＰ濃度をルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を用いて定量する際に有利な特性である。

ここで、感受性が高いＧＬ３などではわずかなＡＴＰ量の変化を発光量に反映できず、ＡＴＰ量が大幅に減衰するまで一定の発光強度を保つ可能性がある。すなわち、本願発明者によって行われた他の実験では、ＨｅＬａ細胞にｐＧＬ３をトランスフェクションし、常時ＧＬ３を発現させた状態で、脱共役剤ＦＣＣＰを用いて、ミトコンドリアにおけるＡＴＰ産生を停止させた際の発光強度をＬＵＭＩＮＯＶＩＥＷ（ＬＶ１００）（商品名）で経時的に測定したが、刺激後測定を続けても発光強度は減衰しなかった。

定常状態のＨｅＬａ細胞の細胞質ＡＴＰ濃度は１．３ｍＭと見積もられており（ＭＶ Ｚａｍａｒａｅｖａ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，２００５， １２， １３９０−１３９７参照）、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応がミカエリス・メンテン式に従うと仮定すると、このＡＴＰ濃度におけるＧＬ３の反応速度はＶｍａｘの約８５％に達している。一方、ＦＣＣＰ処理後３０分経過時点で、細胞質ＡＴＰ濃度は定常状態の約５０％になることが報告されているが（Ｔａｋｅｓｈｉ Ｋｕｂｏｔａ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， ２００５， １７４４， １９−２８参照）、ＧＬ３の０．６５ｍＭ ＡＴＰでの反応速度はＶｍａｘの約８０％と予想されるので、ルシフェラーゼの発現量が変化する細胞での測定系において、５％の反応速度差による発光変化を、ＡＴＰ量の変化としてＣＣＤカメラで検出することは困難だと考えられる。

一方、Ｙａｅｙａｍａを使用した場合、１．３５ｍＭ ＡＴＰではＶｍａｘの約８０％、０．６５ｍＭ ＡＴＰではＶｍａｘの約６０％の反応速度を有することがミカエリス・メンテン式から予想されるので、薬剤処理（ＦＣＣＰ処理）によって２０％の差が生じることとなり、ＧＬ３を使用した場合と比較して検出が容易となることが判明した。すなわち、Ｙａｅｙａｍａは、ＡＴＰの発光イメージング方法にとって、最も有利なＫｍ値を示すことが判明した。また、上記したＧＬ３とＹａｅｙａｍａの例を考慮すると、好適には、細胞内ＡＴＰ濃度を測定する際には、その細胞のＡＴＰ量を見積もった上でルシフェラーゼを選択するとよいことが判明した。

また、ここで、ＡＴＰに対する親和性はＡＴＰ結合部位近傍のポイントミューテーションによって変化させることが出来る（Ｂｒｕｃｅ Ｒ． Ｂｒａｎｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ，２００３， ４２， １０４２９−１０４３６参照）。すなわち、中程度から非常に低いＡＴＰ親和性（中程度から非常に高いＫｍ値）を持つルシフェラーゼ系列を作成すれば、多種類の細胞に対応した細胞内ＡＴＰ測定系を構築することが可能となる。なお、変異を導入したルシフェラーゼでは発光強度が減少することが知られているため、高い発光強度を保たせることを考慮して、Ｙａｅｙａｍａを改変しＡＴＰ親和性を調節してもよい。

［実施例３］
実施例３では、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した複数のＨｅＬａ細胞を対象として、ルミノメーター（クロノス、ＡＴＴＯ社）を用いて、薬剤刺激によって引き起こされるＨｅＬａ細胞の発光を経時的に追跡し、ルシフェラーゼ遺伝子による発光変化量を比較した。

薬剤Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ（ＳＴＳ）はＰＫＣを阻害し、アポトーシスを誘導することが知られている。また、ＳＴＳによってアポトーシスが誘導された際には、アポトーシスの初期段階において細胞内ＡＴＰ濃度が上昇することが報告されている（ＭＶ Ｚａｍａｒａｅｖａ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（２００５）， １２， １３９０−１３９７参照）。本実施例ではＳＴＳによってＨｅＬａ細胞にアポトーシスを誘導した際の細胞内ＡＴＰ量の上昇をＥＬｕｃおよびＧＬ３による発光量上昇によって検出し、その変化量を比較した。

［実験手順］
（１）ＳＶ４０プロモーター／Ｅｍｅｒａｌｄ Ｌｕｃ発現ベクター（東洋紡（会社名））およびＳＶ４０プロモーター／ＧＬ３発現ベクターを、ガラスボトムディッシュに播種したＨｅＬａ細胞にそれぞれ導入し、ルシフェラーゼを恒常的に発現するＨｅＬａ細胞を作成した。

（２）上記サンプルにＤ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎを最終濃度０．５ｍＭとなるように添加し，インキュベータ内で１時間静置した。

（３）サンプルをルミノメーターにセットし、Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ（ＳＴＳ）を最終濃度４μＭとなるように添加した。

（４）薬剤添加後ルミノメーターによる測定を開始し、薬剤刺激後の発光量変化を経時的に追跡した。

その結果、図４５および図４６に示すようなＳＴＳ刺激後の発光強度変化が得られた。ここで、図４５および図４６は、ルミノメーター（クロノス）による細胞内ＡＴＰ量測定におけるＥＬｕｃとＧＬ３の発光変化量を示す図である。ここで、実験条件は、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ、０．５ｍＭ Ｄ−ルシフェリンを用いて、クロノス（ＡＴＴＯ）により測定を行った（３６℃、１０秒積算データ）。４μＭ Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ（ＳＴＳ）で刺激後、測定開始を開始した。

図４５および図４６に示すように、ＥＬｕｃおよびＧＬ３の発光変化量を比較すると、ＥＬｕｃの方が変化量が大きく、ルミノメーターによる検出が容易である。これより、ＡＴＰに対する親和性の低いルシフェラーゼを使用した際のＡＴＰ変化量測定における優位性が示された。

［実施例４］
実施例４では、蛍光透過画像と発光（化学発光および／または生物発光）画像と透過明視野画像の３種類の撮像・観察が可能な発光イメージングシステムであるＬＶ２００（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した複数のＨｅＬａ細胞を対象として、薬剤刺激によって引き起こされる特定のＨｅＬａ細胞の発光を経時的に画像で観察し、その発光強度を追跡した。この発光イメージングシステムは、細胞を含む試料の培養が可能な構成を具備し、さらに、共通の撮像部分（対物レンズ、結像レンズおよびＣＣＤカメラ）と、蛍光を励起するための照射と明視野照明を行う照明系とを具備し、使用者の指示に応じて上記３種類の画像を選択的に取得したり、各種画像を個別に表示したり、画像解析することが可能な構成を有している。したがって、使用者は、システムのインターフェースを通じて適宜指示を与えることにより、上述したような画像解析結果を出力させることが可能となるものである。

［実験手順］
（１）ＳＶ４０プロモーター／Ｅｍｅｒａｌｄ Ｌｕｃ発現ベクター（東洋紡（会社名））をガラスボトムディッシュに播種したＨｅＬａ細胞にそれぞれ導入し、ルシフェラーゼを恒常的に発現するＨｅＬａ細胞を作成した。

（２）上記サンプルにＤ−ルシフェリンを最終濃度０．５ｍＭとなるように添加し，インキュベータ内で１時間静置した。

（３）サンプルを発光イメージング装置にセットし、Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ（ＳＴＳ）を最終濃度４μＭとなるように添加した。

（４）薬剤添加後、発光イメージング装置による測定を開始し、薬剤刺激後の発光量変化を経時的に追跡した。

その結果、図４７および図４８に示すような発光イメージおよび発光強度変化が観察された。ここで、図４７は、ＥＬｕｃ発現ＨｅＬａ細胞における、薬剤刺激直後の発光イメージング画像を示す図である。実験条件は、ＥＬｕｃコントロールベクター導入ＨｅＬａ細胞（ガラスボトムディッシュに播種）に、０．５ｍＭ Ｄ−ルシフェリン／ＯＰＴＩ−ＭＥＭにおいて、ＬＶ２００（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）で測定した。ＣＣＤ Ｃａｍｅｒａは、ＩｍａｇＥＭを用い、ＥＭ−Ｇａｉｎ ２００、ｂｉｎｎｉｎｇ １ｘ１、１０ｓｅｃ露出、ｉｎｔｅｒｖａｌ １５ｓｅｃ、４０ｘ対物レンズの条件で撮影した。また、４μＭ Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ（ＳＴＳ）で刺激後、撮像開始した。図４８は、図４７における矩形で囲った画像（１〜７）から解析された、それぞれの細胞（ＥＬｕｃ発現ＨｅＬａ細胞：１〜７）におけるＳＴＳ刺激後の発光強度変化を示す図である。

図４８に示すように、ＡＴＰに対する親和性の低いルシフェラーゼを使用し、発光イメージングによって特定のＨｅＬａ細胞の発光を経時的に追跡可能であることが示された。また、ここで、図４９は、上述した実験手順および実験条件において、刺激前（細胞刺激によるアポトーシス誘導前）に撮像した発光画像を示す一例である。また、図５０は、図４９に示した発光画像において、３つの測定領域（ＲＯＩ：region of interest）を指定した場合の画像を示す図である。

図４９に示すように、上述した実験手順および実験条件により、単一細胞に関する発光画像が得られた（倍率１００倍）。この発光画像では、３つの細胞が撮像されており、このうち中央の細胞では、上側が最も明るく、下側が次に明るく、中間が暗く発光している。そこで、図５０に示すように、図４９の発光画像から、３つの測定領域（ＲＯＩ）を指定し、３つの測定領域における各ピクセル群（４９ピクセル）についての発光輝度値を測定した。ここで、図５１は、３つの測定領域における発光輝度値とそのグラフを示す図である。なお、発光輝度値の数値は任意の単位であり、図５１の下表において、「１」〜「３」は、指定した３つの測定領域を表し、「４」は、バックグラウンド（画像中で細胞がない任意の指定領域）を示している。また、「Ｔｏｔａｌ」は、４９ピクセルにおける発光輝度値の総数であり、「Ａｖｅｒａｇｅ」は、ピクセル単位の発光輝度値の平均を表している。図５０のグラフは、３つの領域（「１」〜「３」）において、発光輝度値の平均をバックグラウンドの発光輝度値の平均（＝１９．６９３９）で補正した結果を示している。

細胞が生きた状態でＡＴＰが消費されている場合では暗い発光となるため、同一細胞内での生物学的代謝活性が弱い領域ではＡＴＰが消費されにくく明るい発光となる。図５０に示すように、高濃度から低濃度までの対象物質（ＡＴＰ）の分布を１回の撮像（または１枚の画像）で定量的に比較解析できることが示された。この後、同じ細胞について刺激後の追跡実験を行ったところ、いずれの指令領域でも次第に輝度が高まり、生物学的代謝活性が低下していることが示された。また、暗い指定領域ほど、高輝度への変化が速いことも確認できた。このように、本実施例４によれば、複数の細胞間や、同一の細胞内の各領域において、対象物質の分布を定量化することができ、経時的に追跡することができることが示された。これらの結果により、本発明の発光測定方法は、観察視野内に位置する解析対象（例えば、生体組織または培養された細胞群（または各種臓器切片））についてダイナミックレンジが幅広い、発光部位ごとの発光解析を実現する。これにより、単一の解析対象内の複数部位および／または複数の解析対象ごとに多様なダイナミックレンジを持つような生物学的活性物質（例えばＡＴＰ、カルシウムイオン、ｃＡＭＰ）に関して、生体へのダメージが最小限で定量的な動態解析を実行できる。また、Ｋｍ値に応じてダイナミックレンジを変更するので、物質の量に応じた定量的な測定をすることができ、極端な発光強度差が生じないよう調整することができる結果、同一の微弱光検出装置で多項目の検査を同時に行うことができる。

以上のように、本発明にかかる発光測定方法および発光測定システムは、バイオ、製薬、医療など様々な分野で好適に用いることができる。

１００ 発光観察システム
１０３ 容器（シャーレ）
１０４ ステージ
１０６ 発光画像撮像ユニット
１０６ａ 対物レンズ（発光観察用）
１０６ｂ ダイクロイックミラー
１０６ｃ ＣＣＤカメラ
１０６ｄ スプリットイメージユニット
１０６ｅ フィルターホイール
１０６ｆ 結像レンズ
１０８ ダイナミックレンジ調整部
１１０ 画像解析装置
１１２ 制御部
１１２ａ 発光画像撮像指示部
１１２ｂ 発光画像取得部
１１２ｃ 画像解析部
１１２ｄ 解析結果出力部
１１４ クロック発生部
１１６ 記憶部
１１８ 通信インターフェース部
１２０ 入出力インターフェース部
１２２ 入力装置
１２４ 出力装置

Claims (11)

1. 生体試料からの発光を測定する発光測定方法であって、
   前記生体試料中に所定量以上存在する物質と反応し、前記物質に依存して発光強度が定量可能となるようＫｍ値が所定値以上である発光関連タンパク質を含む前記生体試料を作製する作製工程と、
   前記作製工程で作製した前記生体試料からの発光強度を測定する測定工程と、
   前記生体試料の領域および／または部位ごとに測定結果を出力する出力工程と、
   を含むことを特徴とする発光測定方法。
2. 前記物質は、ＡＴＰであり、
   前記発光関連タンパク質は、ルシフェラーゼであり、
   前記Ｋｍ値は、３６４μＭ以上であること
   を特徴とする請求項１に記載の発光測定方法。
3. 前記ルシフェラーゼは、配列番号１のＤＮＡ配列に基づいて生成されるヤエヤマヒメボタル由来のルシフェラーゼであること
   を特徴とする請求項２に記載の発光測定方法。
4. 前記測定工程が複数の細胞を含む生体試料を生物発光に基づく発光画像を撮像する工程を含むことを特徴とする請求項１から３のいずれか一つに記載の発光測定方法。
5. 前記測定工程が、細胞ごとに発光強度を計測する工程を含むことを特徴とする請求項４に記載の発光測定方法。
6. 前記作製工程が、Ｋｍ値の異なる複数の発光関連タンパク質を用いて作製されること
   を特徴とする請求項１または４に記載の発光測定方法。
7. 前記測定工程が、Ｋｍ値に応じた測定を実行すること
   を特徴とする請求項６に記載の発光測定方法。
8. 前記出力工程が、Ｋｍ値に応じた出力を実行すること
   を特徴とする請求項７に記載の発光測定方法。
9. 請求項１から７のいずれか一つに記載の発光測定方法を実行する発光測定システムであり、
   生体試料からの発光画像を取得するための撮像部と、
   前記撮像部により取得された発光画像を解析するための画像処理を行う画像解析部と、
   前記画像解析部による画像解析結果を出力する出力装置と、
   前記生体試料に使用された発光タンパク質のＫｍ値に応じて前記撮像部および前記画像解析部を実行させるためのダイナミックレンジ調整部と、
   を具備することを特徴とする発光測定システム。
10. 前記ダイナミックレンジ調整部が、複数の制御モードを有すること
    を特徴とする請求項９に記載の発光測定システム。
11. 前記生体試料における所望の領域および／または部位を指定するための入力装置と、
    前記入力装置により入力された情報を記憶する記憶部と
    をさらに備え、
    前記ダイナミックレンジ調整部が、撮像と画像解析を前記記憶部に記憶された情報と対応付けた出力内容を前記出力装置により出力させること
    を特徴とする請求項９に記載の発光測定システム。