JP2014207910A - 多価ワクチン - Google Patents

Abstract

【課題】共通のＢおよびＣサブタイプのいずれか、またはグローバルに循環している全ＨＩＶ−１変異体［ＨＩＶ−１主（Ｍ）グループ］について最適化した、Ｔリンパ球応答に注目した多価ワクチン抗原セットの設計の提供。【解決手段】免疫原組成物（たとえばワクチン）、特に多価免疫源組成物、たとえば多価ＨＩＶワクチン、およびそれを使用する方法、さらに、遺伝子アルゴリズムを用いてたとえばワクチン接種療法に使用するのに適切な多価抗原セットを作製する方法。【選択図】なし

Description

本出願は下記の出願の一部継続出願である：Ｕ．Ｓ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．
１１／９９０，２２２，２００８年２月８日出願；これは下記の出願の米国出願である：
国際特許出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０３２９０７，２００６年８月２３日出願；
これは米国を指定し、Ｕ．Ｓ．Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ
．６０／７１０，１５４，２００５年８月２３日出願およびＵ．Ｓ．Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎ
ａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．６０／７３９，４１３，２００５年１１月２５日
出願に基づく優先権を主張する；これらの出願の内容全体を本明細書に援用する。

本発明は一般に、免疫源組成物（たとえばワクチン）、特に多価免疫源組成物、たとえ
ば多価ＨＩＶワクチン、およびそれを使用する方法に関する。本発明はさらに、遺伝子ア
ルゴリズムを用いてたとえばワクチン接種療法に使用するのに適切な多価抗原セットを作
製する方法に関する。

有効なＨＩＶワクチンの設計には多方面の難題がある。ワクチンは、感染を予防するこ
とができる免疫応答、あるいは最小限でも、感染が起きた場合には自然感染に対する免疫
応答が欠損しているにもかかわらずウイルス複製を抑制してウイルスを排除する(Nabel,
Vaccine 20: 1945-1947 (2002))か、または重感染から保護する(Altfeld et al, Nature
420: 434-439 (2002))ことができる免疫応答を、好ましい状態で誘発する。最適化された
ベクター、免疫化プロトコル、およびアジュバント(Nabel, Vaccine 20: 1945-1947 (200
2))をもち、広域の循環ウイルスに対して交差反応性応答を刺激することができる抗原と
組み合わせた、有効なワクチンが求められている(Gaschen et al, Science 296: 2354-23
60 (2002), Korber et al, Br. Med. Bull. 58: 19-42 (2001))。インフルエンザワクチ
ン学者がここ数十年直面している問題は、ＨＩＶ−１が課す難題を際立たせている：ヒト
インフルエンザ株が毎年次第に生じている抗原変異分岐は約１〜２％であるが、それでも
なおワクチン抗原は年毎に交差反応性Ｂ細胞応答を誘発することができない場合がしばし
ばあり、同時期の株を継続的にモニターしてワクチンを数年毎に更新する必要がある(Kor
ber et al, Br. Med. Bull. 58: 19-42 (2001))。これに対し、共循環している個々のＨ
ＩＶ−１株が比較的保存されているタンパク質において互いに２０％以上異なり、エンベ
ロープタンパク質においては最高３５％異なる可能性がある(Gaschen et al, Science 29
6: 2354-2360 (2002), Korber et al, Br. Med. Bull. 58: 19-42 (2001))。

地域的ＨＩＶ−１流行におけるウイルス多様度の相異は、ワクチン設計方法に有用な可
能性のある分類体系を提供する。ある地域ではグローバルな多様性が繰り返され、大部分
の既知のＨＩＶ−１サブタイプまたはクレード（分岐群、ｃｌａｄｅ）が共循環する（た
とえば、コンゴ共和国(Mokili & Korber, J. Neurovirol 11(Suppl. 1): 66-75 (2005)）
；他は２つのサブタイプおよびそれらの組換え体が優性であり(たとえば、ウガンダ(Baru
gahare et al, J. Virol. 79: 4132-4139 (2005))、他は単一サブタイプが優性である（
たとえば、南アフリカ(Williamson et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses 19: 133-144 (
2003)）。主に単一サブタイプを伴う地域ですら、流行疫学は広範なクレード内多様性に
対処しなければならない(Williamson et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses 19: 133-44
(2003))けれども、国外旅行が地理的相異をさらに不明瞭にすると予想できるので、すべ
ての国がグローバルワクチンの利益を受けるであろう。

本発明は、共通のＢおよびＣサブタイプのいずれか、またはグローバルに循環している
全ＨＩＶ−１変異体［ＨＩＶ−１主（Ｍ）グループ］について最適化した、Ｔリンパ球応
答に注目した多価ワクチン抗原セットの設計を提供する。細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ
）は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子が感染細胞表面に提示するウイルスタンパク質フラ
グメント（エピトープ）により、感染したウイルス産生宿主細胞を認識して、それらを直
接殺す。ヘルパーＴ細胞応答は、サイトカインの放出により免疫応答の多様な面を制御す
る。両方ともＨＩＶ−１ワクチンにとって重要であると思われる：ＣＴＬ応答は疾患の進
行速度を低下させることが示唆されており(Oxenius et al, J. Infect. Dis. 189: 1199-
208 (2004))；ヒト以外の霊長類においてワクチンが誘発する細胞性免疫応答は、病原性
ＳＩＶまたはＳＨＩＶを抑制して、攻撃後の疾患の可能性を低下させ(Barouch et al, Sc
ience 290: 486-92 (2000))；ＣＤ８＋ Ｔ細胞を実験的に枯渇させると、ＳＩＶ感染し
たアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ）においてウイルス血症が増大する(Sch
mitz et al, Science 283: 857-60 (1999))。さらに、疾患の進行に伴ってＣＴＬ回避変
異が生じる(Barouch et al, J. Virol. 77: 7367-75 (2003))ので、潜在的回避経路を遮
断するワクチン刺激による記憶応答は有用な可能性がある。

変異性がきわめて高いエンベロープタンパク質は、ＨＩＶに対する抗体を中和するため
の主要なターゲットである；免疫防御にはＢ細胞応答とＴ細胞応答の両方が必要であると
思われる(Moore and Burton, Nat. Med. 10: 769-71 (2004))ので、抗体応答を誘発する
ためにはエンベロープワクチン抗原を個別に最適化することも必要であろう。これに対し
Ｔ細胞指向型ワクチン成分はより保存されたタンパク質をターゲティングすることができ
るけれども、最も保存されたＨＩＶ−１タンパク質ですら変異が問題になるのに十分なほ
ど多様である。人工的な中枢配列ワクチン法（たとえば、あらゆるアミノ酸が複数の配列
中にみられるコンセンサス配列、または祖先配列（ａｎｃｅｓｔｒａｌ ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅ）の最大可能性再構築体(Gaschen et al, Science 296: 2354-60 (2002), Gao et al,
J. Virol. 79: 1154-63 (2005), Doria-Rose et al, J. Virol. 79: 11214-24 (2005), W
eaver et al, J. Virol., in press))が有望である；それにもかかわらず、中枢化した株
ですら提供するＨＩＶ−１変異体適応範囲は限られており、またコンセンサスベースの試
薬は多くのオートロガスＴ細胞応答を検出できない(Altfeld et al, J. Virol. 77: 7330
-40 (2003))。

単一アミノ酸の変化によりエピトープがＴ細胞による監視を回避する可能性がある；多
くのＴ細胞エピトープは１以上の位置においてＨＩＶ−１株間で異なるので、いずれか単
一ワクチン抗原に対する潜在的応答には限界がある。特定の変異の結果として回避が起き
るかどうかは、個々のエピトープ／Ｔ細胞の組合せによるが、ある変化はサブタイプ間の
交差反応性に広範に影響を及ぼす(Norris et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses 20: 315
-25 (2004))。多数の変異体を多価ワクチンに組み込むことによって、より広範な循環変
異体に対する応答が可能になり、共通の回避変異体に対する免疫系を初回抗原刺激するこ
ともできる(Jones et al, J. Exp. Med. 200: 1243-56 (2004))。１つのＴ細胞受容体か
らの回避が、他の受容体に対して感受性である変異体を作り出す可能性があり(Allen et
al, J. Virol. 79: 12952-60 (2005), Feeney et al, J. Immunol. 174: 7524-30 (2005)
)、したがってエピトープ変異体に対するポリクローナル応答を刺激することは有益とな
る可能性がある(Killian et al, Aids 19: 887-96 (2005))。プロセシングを阻害する回
避変異(Milicic et al, J. Immunol. 175: 4618-26 (2005))またはＨＬＡ結合を阻害する
回避変異(Ammaranond et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses 21: 395-7 (2005))は異なる
特異性をもつＴ細胞によって直接対抗することはできないが、オーバーラップするエピト
ープに対する応答がこれらの回避経路のうちあるものすら遮断する可能性がある。

本発明は、幾つかの“モザイク”タンパク質（またはこれらのタンパク質をコードする
遺伝子）を含む多価ワクチンに関する。候補ワクチン抗原は、最大数の潜在的Ｔ細胞エピ
トープを入力ウイルスタンパク質セット中に含むように最適化した、κ個の複合タンパク
質のカクテルであることができる（κはカクテル中の配列変異体の個数である）。これら
のモザイクは天然配列から作製される：それらは天然タンパク質に類似し、最大共通形の
潜在的エピトープを含む。ＣＤ８＋エピトープは連続的であり、一般にアミノ酸９個の長
さであるので、モザイクのセットを天然配列中のノナマー（９−ｍｅｒ）の“適応範囲（
ｃｏｖｅｒａｇｅ）”によりスコアリングすることができる（類似長さのフラグメントも
十分に表示される）。少なくとも３回見いだされない９−Ｍｅｒは除外することができる
。この方法によって、著しく多価であるけれども重要な利点をもつ多重ペプチドワクチン
により達成される多様性適応範囲のレベルが示される：これにより、無傷のタンパク質ま
たは遺伝子としてワクチンを送達することが可能になり、低頻度エピトープまたは循環株
とは無関係な非天然エピトープが除外され、それの無傷タンパク質抗原は自然感染の場合
と同様にプロセシングされやすい。

Nabel, Vaccine 20: 1945-1947 (2002) Altfeld et al, Nature 420: 434-439 (2002) Gaschen et al, Science 296: 2354-2360 (2002) Korber et al, Br. Med. Bull. 58: 19-42 (2001) Mokili & Korber, J. Neurovirol 11(Suppl. 1): 66-75 (2005) Barugahare et al, J. Virol. 79: 4132-4139 (2005) Williamson et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses 19: 133-44 (2003) Oxenius et al, J. Infect. Dis. 189: 1199-208 (2004) Barouch et al, Science 290: 486-92 (2000) Schmitz et al, Science 283: 857-60 (1999) Barouch et al, J. Virol. 77: 7367-75 (2003) Moore and Burton, Nat. Med. 10: 769-71 (2004) Gao et al, J. Virol. 79: 1154-63 (2005) Doria-Rose et al, J. Virol. 79: 11214-24 (2005) Weaver et al, J. Virol., in press) Altfeld et al, J. Virol. 77: 7330-40 (2003) Norris et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses 20: 315-25 (2004) Jones et al, J. Exp. Med. 200: 1243-56 (2004) Allen et al, J. Virol. 79: 12952-60 (2005) Feeney et al, J. Immunol. 174: 7524-30 (2005) Killian et al, Aids 19: 887-96 (2005) Milicic et al, J. Immunol. 175: 4618-26 (2005) Ammaranond et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses 21: 395-7 (2005)

一般に、本発明は免疫源組成物に関する。より具体的には、本発明は多価免疫源組成物
（たとえばＨＩＶワクチン）、およびそれを使用する方法に関する。本発明はさらに、ワ
クチンとして使用するのに適切な多価抗原セットを設計するための遺伝子アルゴリズムの
使用を伴う方法に関する。

本発明の目的および利点は以下の記載から明らかになるであろう。

図１Ａ〜１Ｆは、ＨＩＶ−１ Ｍグループの潜在的エピトープ適応範囲の上限を示す。κ＝１〜８の変異体について、変異体数の増加に対する９−ｍｅｒの集団適応範囲の上限（upper bound）を示す。長さ９のスライディングウインドウを下方へ１位置移動させながら、アラインした配列にわたって適用した。異なる色は異なる配列数についての結果を表わす。各ウインドウにおいて、κ個の最大共通９−ｍｅｒにより与えられる適応範囲をＧａｇ（図１Ａおよび１Ｂ）、Ｎｅｆ（図１Ｃおよび１Ｄ）およびＥｎｖ ｇｐ１２０（図１Ｅおよび１Ｆ）についてプロットする。アラインメントを維持するために挿入したギャップをキャラクターとして処理する。κが増加するのに伴って希有な形態がより多く追加されるので、より多数の変異体を追加すると収穫（return）が低下することは明らかである。図１Ａ、１Ｃおよび１Ｅには、各連続９−ｍｅｒについてのスコアをそれらの自然順位でプロットして、異なるタンパク質領域で多様性がいかに変動するかを示す；Ｇａｇの中央およびＮｅｆの中央領域のｐ２４は共に、特に高度に保存されている。図１Ｂ、１Ｄおよび１Ｆには、各９−ｍｅｒについてのスコアを適応範囲により記録して（図４でも採用する方法）、そのタンパク質の全集団適応範囲のセンスを示す。ｇｐ１２０の適応範囲は、８変異体の９−ｍｅｒですら、特に乏しい（図１Ｅおよび１Ｆ）。 図２Ａ〜２Ｃは、モザイクの立ち上げ、スコアリング、および最適化を示す。図２Ａ）κ個の集団のセットを天然配列のランダム２点組換えにより作製する（それぞれ５０〜５００の配列の１〜６集団を試験した）。モザイクカクテル用として各集団から１配列を選択し（最初はランダムに）、これを続いて最適化する。カクテル配列を適応範 囲（カクテルに含まれる天然配列９−ｍｅｒの平均画分と定義；入力データセット中のすべての天然配列にわたって平均したもの）の計算によりスコアリングする。より多くのエピトープをカバー（cover）する新たな配列はいずれも、カクテル全体のスコアを増大させるであろう。図２Ｂ）いずれか個々の配列のフィットネススコアは、その配列−プラス−他の集団からの現時の代表配列を含むカクテルの適応範囲である。図２Ｃ）最適化：１）２つの“親”を選択する：ランダムに選択した組換え配列対のうちより高いスコアのもの、および第２のランダム対のうちより高いスコアの配列またはランダムに選択した天然配列のいずれか（５０％の確率）。２）２つの親の間の２点組換えを用いて、“子”配列を作製する。子が非天然または希有９−ｍｅｒを含む場合、それを直ちに棄却し、そうでなければスコアリングする(Gaschen et al, Science 296:2354-2360 (2002))。そのスコアがいずれか４つのランダムに選択した集団メンバーのスコアより高い場合、その子をこの４つのうち最も弱いものの代わりに集団に組み入れ、こうして改良された集団を進化させる；４）そのスコアが新たな高いスコアである場合、その集団からの現時カクテルメンバーをこの新たな子に置き換える。次いで、各集団について１０サイクルの子作製を反復し、改良が止むまでこのプロセスを繰り返す。 図３は、すべてのＨＩＶタンパク質についてのモザイク株適応範囲を示す。各ＨＩＶタンパク質について４モザイクタンパク質のセットにより達成される９−ｍｅｒ適応範囲のレベルを示す；ＭグループまたはＣサブタイプのいずれかを用いてモザイクを最適化した。Ｃサブタイプについて最適化したモザイクによりカバーされるＣサブタイプ配列９−ｍｅｒの画分（クレード内最適化）を灰色で示す。サブタイプＣ最適化したモザイクによる非ＣサブタイプＭグループ配列中にみられる９−ｍｅｒの適応範囲（クレード間最適化）を白色で示す。Ｍグループ最適化したモザイクによるサブタイプＣ配列の適応範囲を黒色で示す。Ｂクレード比較は匹敵する結果を与えた（データは示していない）。 図４Ａ−４Ｆは、種々のワクチン候補によるＭグループ配列の適応範囲を９−ｍｅｒ毎に示す。各プロットは、単一３価ワクチン候補によるＭグループ天然配列アラインメントの部位毎の適応範囲（すなわち各９−ｍｅｒについて）を示す。ｘ−軸に沿った棒は、そのアラインメント位置についてワクチン候補が一致した配列の割合を表わす：９／９の一致（赤色）、８／９の一致（黄色）、７／９の一致（青色）。アラインした９−ｍｅｒをｘ−軸に沿って厳密一致適応範囲値（ｅｘａｃｔ−ｍａｔｃｈ ｃｏｖｅｒａｇｅ ｖａｌｕｅ）によりソーティングする。６５６の位置に完全ＧａｇとＮｅｆ中央領域の両方が含まれる。各アラインメント位置について、最大可能一致値（すなわち、その９−ｍｅｒにおいてギャップなしにアラインした配列の割合）を灰色で示す。図４Ａ）ワクチン試験(Kong et al, J. Virol. 77:12764-72 (2003))に用いている株の中から選択した非最適−天然配列；個々のクレードＡ、ＢおよびＣウイルス配列を含む（Ｇａｇ：ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ００４８８５、Ｋ０３４５５およびＵ５２９５３；Ｎｅｆコア：ＡＦ０６９６７０、Ｋ０２０８３、およびＵ５２９５３）。図４Ｂ）最適な天然配列セット［分離体ＵＳ２（サブタイプＢ，米国）、７０１７７（サブタイプＣ，インド）、および９９ＴＨ．Ｒ２３９９（サブタイプＣＲＦ１５＿０１Ｂ，タイ）；寄託番号ＡＹ１７３９５３、ＡＦ５３３１３１および＿ＡＦ５３０５７６］；Ｍグループ適応範囲について選択して、最大適応範囲をもつ単一配列を選び、続いて最初のものと合わせた際に最良適応範囲をもっていた配列（すなわち最良補充配列（complement））を選ぶ（以下同様）により選択したもの。図４Ｃ）コンセンサス配列カクテル（Ｍグループ，ＢおよびＣサブタイプ）。図４Ｄ）３モザイク配列、図４Ｅ）４モザイク配列、図４Ｆ）６モザイク配列。図４Ｄ〜４ＦはすべてＭグループ適応範囲について最適化された。 図４Ａ−４Ｆは、種々のワクチン候補によるＭグループ配列の適応範囲を９−ｍｅｒ毎に示す。各プロットは、単一３価ワクチン候補によるＭグループ天然配列アラインメントの部位毎の適応範囲（すなわち各９−ｍｅｒについて）を示す。ｘ−軸に沿った棒は、そのアラインメント位置についてワクチン候補が一致した配列の割合を表わす：９／９の一致（赤色）、８／９の一致（黄色）、７／９の一致（青色）。アラインした９−ｍｅｒをｘ−軸に沿って厳密一致適応範囲値（ｅｘａｃｔ−ｍａｔｃｈ ｃｏｖｅｒａｇｅ ｖａｌｕｅ）によりソーティングする。６５６の位置に完全ＧａｇとＮｅｆ中央領域の両方が含まれる。各アラインメント位置について、最大可能一致値（すなわち、その９−ｍｅｒにおいてギャップなしにアラインした配列の割合）を灰色で示す。図４Ａ）ワクチン試験(Kong et al, J. Virol. 77:12764-72 (2003))に用いている株の中から選択した非最適−天然配列；個々のクレードＡ、ＢおよびＣウイルス配列を含む（Ｇａｇ：ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ００４８８５、Ｋ０３４５５およびＵ５２９５３；Ｎｅｆコア：ＡＦ０６９６７０、Ｋ０２０８３、およびＵ５２９５３）。図４Ｂ）最適な天然配列セット［分離体ＵＳ２（サブタイプＢ，米国）、７０１７７（サブタイプＣ，インド）、および９９ＴＨ．Ｒ２３９９（サブタイプＣＲＦ１５＿０１Ｂ，タイ）；寄託番号ＡＹ１７３９５３、ＡＦ５３３１３１および＿ＡＦ５３０５７６］；Ｍグループ適応範囲について選択して、最大適応範囲をもつ単一配列を選び、続いて最初のものと合わせた際に最良適応範囲をもっていた配列（すなわち最良補充配列（complement））を選ぶ（以下同様）により選択したもの。図４Ｃ）コンセンサス配列カクテル（Ｍグループ，ＢおよびＣサブタイプ）。図４Ｄ）３モザイク配列、図４Ｅ）４モザイク配列、図４Ｆ）６モザイク配列。図４Ｄ〜４ＦはすべてＭグループ適応範囲について最適化された。 図４Ａ−４Ｆは、種々のワクチン候補によるＭグループ配列の適応範囲を９−ｍｅｒ毎に示す。各プロットは、単一３価ワクチン候補によるＭグループ天然配列アラインメントの部位毎の適応範囲（すなわち各９−ｍｅｒについて）を示す。ｘ−軸に沿った棒は、そのアラインメント位置についてワクチン候補が一致した配列の割合を表わす：９／９の一致（赤色）、８／９の一致（黄色）、７／９の一致（青色）。アラインした９−ｍｅｒをｘ−軸に沿って厳密一致適応範囲値（ｅｘａｃｔ−ｍａｔｃｈ ｃｏｖｅｒａｇｅ ｖａｌｕｅ）によりソーティングする。６５６の位置に完全ＧａｇとＮｅｆ中央領域の両方が含まれる。各アラインメント位置について、最大可能一致値（すなわち、その９−ｍｅｒにおいてギャップなしにアラインした配列の割合）を灰色で示す。図４Ａ）ワクチン試験(Kong et al, J. Virol. 77:12764-72 (2003))に用いている株の中から選択した非最適−天然配列；個々のクレードＡ、ＢおよびＣウイルス配列を含む（Ｇａｇ：ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ００４８８５、Ｋ０３４５５およびＵ５２９５３；Ｎｅｆコア：ＡＦ０６９６７０、Ｋ０２０８３、およびＵ５２９５３）。図４Ｂ）最適な天然配列セット［分離体ＵＳ２（サブタイプＢ，米国）、７０１７７（サブタイプＣ，インド）、および９９ＴＨ．Ｒ２３９９（サブタイプＣＲＦ１５＿０１Ｂ，タイ）；寄託番号ＡＹ１７３９５３、ＡＦ５３３１３１および＿ＡＦ５３０５７６］；Ｍグループ適応範囲について選択して、最大適応範囲をもつ単一配列を選び、続いて最初のものと合わせた際に最良適応範囲をもっていた配列（すなわち最良補充配列（complement））を選ぶ（以下同様）により選択したもの。図４Ｃ）コンセンサス配列カクテル（Ｍグループ，ＢおよびＣサブタイプ）。図４Ｄ）３モザイク配列、図４Ｅ）４モザイク配列、図４Ｆ）６モザイク配列。図４Ｄ〜４ＦはすべてＭグループ適応範囲について最適化された。 図４Ａ−４Ｆは、種々のワクチン候補によるＭグループ配列の適応範囲を９−ｍｅｒ毎に示す。各プロットは、単一３価ワクチン候補によるＭグループ天然配列アラインメントの部位毎の適応範囲（すなわち各９−ｍｅｒについて）を示す。ｘ−軸に沿った棒は、そのアラインメント位置についてワクチン候補が一致した配列の割合を表わす：９／９の一致（赤色）、８／９の一致（黄色）、７／９の一致（青色）。アラインした９−ｍｅｒをｘ−軸に沿って厳密一致適応範囲値（ｅｘａｃｔ−ｍａｔｃｈ ｃｏｖｅｒａｇｅ ｖａｌｕｅ）によりソーティングする。６５６の位置に完全ＧａｇとＮｅｆ中央領域の両方が含まれる。各アラインメント位置について、最大可能一致値（すなわち、その９−ｍｅｒにおいてギャップなしにアラインした配列の割合）を灰色で示す。図４Ａ）ワクチン試験(Kong et al, J. Virol. 77:12764-72 (2003))に用いている株の中から選択した非最適−天然配列；個々のクレードＡ、ＢおよびＣウイルス配列を含む（Ｇａｇ：ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ００４８８５、Ｋ０３４５５およびＵ５２９５３；Ｎｅｆコア：ＡＦ０６９６７０、Ｋ０２０８３、およびＵ５２９５３）。図４Ｂ）最適な天然配列セット［分離体ＵＳ２（サブタイプＢ，米国）、７０１７７（サブタイプＣ，インド）、および９９ＴＨ．Ｒ２３９９（サブタイプＣＲＦ１５＿０１Ｂ，タイ）；寄託番号ＡＹ１７３９５３、ＡＦ５３３１３１および＿ＡＦ５３０５７６］；Ｍグループ適応範囲について選択して、最大適応範囲をもつ単一配列を選び、続いて最初のものと合わせた際に最良適応範囲をもっていた配列（すなわち最良補充配列（complement））を選ぶ（以下同様）により選択したもの。図４Ｃ）コンセンサス配列カクテル（Ｍグループ，ＢおよびＣサブタイプ）。図４Ｄ）３モザイク配列、図４Ｅ）４モザイク配列、図４Ｆ）６モザイク配列。図４Ｄ〜４ＦはすべてＭグループ適応範囲について最適化された。 図４Ａ−４Ｆは、種々のワクチン候補によるＭグループ配列の適応範囲を９−ｍｅｒ毎に示す。各プロットは、単一３価ワクチン候補によるＭグループ天然配列アラインメントの部位毎の適応範囲（すなわち各９−ｍｅｒについて）を示す。ｘ−軸に沿った棒は、そのアラインメント位置についてワクチン候補が一致した配列の割合を表わす：９／９の一致（赤色）、８／９の一致（黄色）、７／９の一致（青色）。アラインした９−ｍｅｒをｘ−軸に沿って厳密一致適応範囲値（ｅｘａｃｔ−ｍａｔｃｈ ｃｏｖｅｒａｇｅ ｖａｌｕｅ）によりソーティングする。６５６の位置に完全ＧａｇとＮｅｆ中央領域の両方が含まれる。各アラインメント位置について、最大可能一致値（すなわち、その９−ｍｅｒにおいてギャップなしにアラインした配列の割合）を灰色で示す。図４Ａ）ワクチン試験(Kong et al, J. Virol. 77:12764-72 (2003))に用いている株の中から選択した非最適−天然配列；個々のクレードＡ、ＢおよびＣウイルス配列を含む（Ｇａｇ：ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ００４８８５、Ｋ０３４５５およびＵ５２９５３；Ｎｅｆコア：ＡＦ０６９６７０、Ｋ０２０８３、およびＵ５２９５３）。図４Ｂ）最適な天然配列セット［分離体ＵＳ２（サブタイプＢ，米国）、７０１７７（サブタイプＣ，インド）、および９９ＴＨ．Ｒ２３９９（サブタイプＣＲＦ１５＿０１Ｂ，タイ）；寄託番号ＡＹ１７３９５３、ＡＦ５３３１３１および＿ＡＦ５３０５７６］；Ｍグループ適応範囲について選択して、最大適応範囲をもつ単一配列を選び、続いて最初のものと合わせた際に最良適応範囲をもっていた配列（すなわち最良補充配列（complement））を選ぶ（以下同様）により選択したもの。図４Ｃ）コンセンサス配列カクテル（Ｍグループ，ＢおよびＣサブタイプ）。図４Ｄ）３モザイク配列、図４Ｅ）４モザイク配列、図４Ｆ）６モザイク配列。図４Ｄ〜４ＦはすべてＭグループ適応範囲について最適化された。 図４Ａ−４Ｆは、種々のワクチン候補によるＭグループ配列の適応範囲を９−ｍｅｒ毎に示す。各プロットは、単一３価ワクチン候補によるＭグループ天然配列アラインメントの部位毎の適応範囲（すなわち各９−ｍｅｒについて）を示す。ｘ−軸に沿った棒は、そのアラインメント位置についてワクチン候補が一致した配列の割合を表わす：９／９の一致（赤色）、８／９の一致（黄色）、７／９の一致（青色）。アラインした９−ｍｅｒをｘ−軸に沿って厳密一致適応範囲値（ｅｘａｃｔ−ｍａｔｃｈ ｃｏｖｅｒａｇｅ ｖａｌｕｅ）によりソーティングする。６５６の位置に完全ＧａｇとＮｅｆ中央領域の両方が含まれる。各アラインメント位置について、最大可能一致値（すなわち、その９−ｍｅｒにおいてギャップなしにアラインした配列の割合）を灰色で示す。図４Ａ）ワクチン試験(Kong et al, J. Virol. 77:12764-72 (2003))に用いている株の中から選択した非最適−天然配列；個々のクレードＡ、ＢおよびＣウイルス配列を含む（Ｇａｇ：ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ００４８８５、Ｋ０３４５５およびＵ５２９５３；Ｎｅｆコア：ＡＦ０６９６７０、Ｋ０２０８３、およびＵ５２９５３）。図４Ｂ）最適な天然配列セット［分離体ＵＳ２（サブタイプＢ，米国）、７０１７７（サブタイプＣ，インド）、および９９ＴＨ．Ｒ２３９９（サブタイプＣＲＦ１５＿０１Ｂ，タイ）；寄託番号ＡＹ１７３９５３、ＡＦ５３３１３１および＿ＡＦ５３０５７６］；Ｍグループ適応範囲について選択して、最大適応範囲をもつ単一配列を選び、続いて最初のものと合わせた際に最良適応範囲をもっていた配列（すなわち最良補充配列（complement））を選ぶ（以下同様）により選択したもの。図４Ｃ）コンセンサス配列カクテル（Ｍグループ，ＢおよびＣサブタイプ）。図４Ｄ）３モザイク配列、図４Ｅ）４モザイク配列、図４Ｆ）６モザイク配列。図４Ｄ〜４ＦはすべてＭグループ適応範囲について最適化された。 図５Ａおよび５Ｂは、ワクチン候補の全適応範囲を示す：Ｃクレード配列の９−ｍｅｒの適応範囲であって、モザイク最適化のために種々の入力データセットを用い、種々の数の抗原が可能であり、種々の候補ワクチンと比較したもの。厳密（青色）、８／９（１−オフ；赤色）、および７／９（２−オフ；黄色）適応範囲を、１価および多価ワクチン候補につき、Ｇａｇ（図５Ａ）およびＮｅｆ（コア）（図５Ｂ）に関して、４つの試験状況で計算した：クレード内（Ｃクレード−最適化候補をＣクレード適応範囲についてスコアリング）、クレード間（Ｂクレード−最適化候補をＣクレード適応範囲についてスコアリング）、グローバル−対−単一−サブタイプ（Ｍグループ−最適化候補をＣクレード適応範囲についてスコアリング）、グローバル−対−グローバル（Ｍグループ−最適化候補をグローバル適応範囲についてスコアリング）。各セットの結果内で、カクテル内の配列数（１〜６）によりワクチン候補を分類する；モザイク配列をより濃色でプロットする。“Ｎｏｎ−ｏｐｔ”は、ワクチン試験(Kong et al, J. Virol. 77:12764-72 (2003))に採用する１セットの配列を表わす;“モザイク”は、遺伝子アルゴリズムにより作製した配列を表わす；“ｏｐｔ．ｎａｔｕｒａｌ”は、最大９−ｍｅｒ適応範囲について選択した無傷の天然配列を表わす；“ＭＢＣコンセンサス”は、Ｍグループ、Ｂ−サブタイプ、およびＣ−サブタイプについての３つのコンセンサス配列のカクテルを表わす。比較を容易にするために、破線は４配列セットのＭグループモザイクの適応範囲をマークする（７３．７〜７５．６％）。１５０を超える組合せのモザイク数、ウイルスサブセット、タンパク質領域、および最適化と試験のセットを試験した。この図に示したＣクレード／Ｂクレード／Ｍグループの比較は一般に、クレード内、クレード間、およびＭグループの適応範囲の代表例である。特に、ＢおよびＣクレードについてのモザイク適応範囲のレベルは、Ｇａｇコレクション中にはより多数のＣクレード配列があり、Ｎｅｆコレクション中にはより多数のＢクレード配列があるにもかかわらず、きわめて類似していた（完全なＢおよびＣクレード比較については図６を参照）。これらのアラインメント中にあるＡおよびＧクレード配列は比較的少なく（２４ Ｇａｇ，７５ Ｎｅｆ）、Ｍグループ最適化モザイクによる９−ｍｅｒ適応範囲はＢおよびＣクレードについてのサブタイプに関するものほど高くなかった（ＡおよびＧサブタイプについての４モザイク適応範囲は、Ｇａｇにつき６３％、Ｎｅｆにつき７４％であった）けれども、それは非最適カクテル（Ｇａｇにつき５２％、Ｎｅｆにつき５２％）よりはるかに良好であった。 図５Ａおよび５Ｂは、ワクチン候補の全適応範囲を示す：Ｃクレード配列の９−ｍｅｒの適応範囲であって、モザイク最適化のために種々の入力データセットを用い、種々の数の抗原が可能であり、種々の候補ワクチンと比較したもの。厳密（青色）、８／９（１−オフ；赤色）、および７／９（２−オフ；黄色）適応範囲を、１価および多価ワクチン候補につき、Ｇａｇ（図５Ａ）およびＮｅｆ（コア）（図５Ｂ）に関して、４つの試験状況で計算した：クレード内（Ｃクレード−最適化候補をＣクレード適応範囲についてスコアリング）、クレード間（Ｂクレード−最適化候補をＣクレード適応範囲についてスコアリング）、グローバル−対−単一−サブタイプ（Ｍグループ−最適化候補をＣクレード適応範囲についてスコアリング）、グローバル−対−グローバル（Ｍグループ−最適化候補をグローバル適応範囲についてスコアリング）。各セットの結果内で、カクテル内の配列数（１〜６）によりワクチン候補を分類する；モザイク配列をより濃色でプロットする。“Ｎｏｎ−ｏｐｔ”は、ワクチン試験(Kong et al, J. Virol. 77:12764-72 (2003))に採用する１セットの配列を表わす;“モザイク”は、遺伝子アルゴリズムにより作製した配列を表わす；“ｏｐｔ．ｎａｔｕｒａｌ”は、最大９−ｍｅｒ適応範囲について選択した無傷の天然配列を表わす；“ＭＢＣコンセンサス”は、Ｍグループ、Ｂ−サブタイプ、およびＣ−サブタイプについての３つのコンセンサス配列のカクテルを表わす。比較を容易にするために、破線は４配列セットのＭグループモザイクの適応範囲をマークする（７３．７〜７５．６％）。１５０を超える組合せのモザイク数、ウイルスサブセット、タンパク質領域、および最適化と試験のセットを試験した。この図に示したＣクレード／Ｂクレード／Ｍグループの比較は一般に、クレード内、クレード間、およびＭグループの適応範囲の代表例である。特に、ＢおよびＣクレードについてのモザイク適応範囲のレベルは、Ｇａｇコレクション中にはより多数のＣクレード配列があり、Ｎｅｆコレクション中にはより多数のＢクレード配列があるにもかかわらず、きわめて類似していた（完全なＢおよびＣクレード比較については図６を参照）。これらのアラインメント中にあるＡおよびＧクレード配列は比較的少なく（２４ Ｇａｇ，７５ Ｎｅｆ）、Ｍグループ最適化モザイクによる９−ｍｅｒ適応範囲はＢおよびＣクレードについてのサブタイプに関するものほど高くなかった（ＡおよびＧサブタイプについての４モザイク適応範囲は、Ｇａｇにつき６３％、Ｎｅｆにつき７４％であった）けれども、それは非最適カクテル（Ｇａｇにつき５２％、Ｎｅｆにつき５２％）よりはるかに良好であった。 図６Ａおよび６Ｂは、ワクチン候補の全適応範囲を示す：Ｂクレード、Ｃクレード、およびＭグループ配列の９−ｍｅｒの適応範囲であって、モザイク最適化のために種々の入力データセットを用い、種々の数の抗原が可能であり、種々の候補ワクチンと比較したもの。厳密（青色）、８／９（１−オフ；赤色）、および７／９（２−オフ；黄色）適応範囲を、１価および多価ワクチン候補につき、Ｇａｇ（図６Ａ）およびＮｅｆ（コア）（図６Ｂ）に関して、７つの試験状況で計算した：クレード内（ＢまたはＣクレード最適化候補を同一クレードに対してスコアリング）、クレード間（ＢクレードまたはＣクレード最適化候補を他方のクレードに対してスコアリング）、グローバルワクチン−対−単一サブタイプ（Ｍグループ最適化候補をＢまたはＣクレードに対してスコアリング）、グローバルワクチン−対−グローバルワクチン（Ｍグループ−最適化候補を全Ｍグループ適応範囲に対してスコアリング）。各セットの結果内で、カクテル内の配列数（１〜６）によりワクチン候補を分類する；モザイク配列をより濃色でプロットする。“Ｎｏｎ−ｏｐｔ”は、ワクチンについて先に提唱された特定の天然配列セットを表わす(Kong et al, J. Virol. 77:12764-72 (2003));“モザイク”は、遺伝子アルゴリズムにより作製した配列を表わす；“ｏｐｔ．ｎａｔｕｒａｌ”は、最大９−ｍｅｒ適応範囲について選択した無傷の天然配列を表わす；“ＭＢＣコンセンサス”は、Ｍグループ、Ｂ−サブタイプ、およびＣ−サブタイプについての３つのコンセンサス配列のカクテルを表わす。Ｍグループに最適化した４価モザイクセットについて厳密一致Ｍグループ適応範囲のレベルに破線を示す。 図６Ａおよび６Ｂは、ワクチン候補の全適応範囲を示す：Ｂクレード、Ｃクレード、およびＭグループ配列の９−ｍｅｒの適応範囲であって、モザイク最適化のために種々の入力データセットを用い、種々の数の抗原が可能であり、種々の候補ワクチンと比較したもの。厳密（青色）、８／９（１−オフ；赤色）、および７／９（２−オフ；黄色）適応範囲を、１価および多価ワクチン候補につき、Ｇａｇ（図６Ａ）およびＮｅｆ（コア）（図６Ｂ）に関して、７つの試験状況で計算した：クレード内（ＢまたはＣクレード最適化候補を同一クレードに対してスコアリング）、クレード間（ＢクレードまたはＣクレード最適化候補を他方のクレードに対してスコアリング）、グローバルワクチン−対−単一サブタイプ（Ｍグループ最適化候補をＢまたはＣクレードに対してスコアリング）、グローバルワクチン−対−グローバルワクチン（Ｍグループ−最適化候補を全Ｍグループ適応範囲に対してスコアリング）。各セットの結果内で、カクテル内の配列数（１〜６）によりワクチン候補を分類する；モザイク配列をより濃色でプロットする。“Ｎｏｎ−ｏｐｔ”は、ワクチンについて先に提唱された特定の天然配列セットを表わす(Kong et al, J. Virol. 77:12764-72 (2003));“モザイク”は、遺伝子アルゴリズムにより作製した配列を表わす；“ｏｐｔ．ｎａｔｕｒａｌ”は、最大９−ｍｅｒ適応範囲について選択した無傷の天然配列を表わす；“ＭＢＣコンセンサス”は、Ｍグループ、Ｂ−サブタイプ、およびＣ−サブタイプについての３つのコンセンサス配列のカクテルを表わす。Ｍグループに最適化した４価モザイクセットについて厳密一致Ｍグループ適応範囲のレベルに破線を示す。 図７Ａおよび７Ｂは、天然、コンセンサス、およびモザイク配列中の出現頻度による９−ｍｅｒの分布を示す。幾つかの方法で作成したワクチンカクテルについて種々の９−ｍｅｒ頻度（ｘ−軸）に対する出現数（ｙ−軸）を示す。図７Ａ：頻度０〜６０％（９−ｍｅｒ頻度＞６０％について；分布はすべての方法について同等である）。図７Ｂ：低頻度９−ｍｅｒの詳細。天然配列は多数の希有またはユニークに分離される９−ｍｅｒをもつ（下右，図７Ａおよび７Ｂ）；これらは有用なワクチン応答を誘導しないと思われる。最適天然配列の選択によってより共通の９−ｍｅｒが選択されるのではなく、希有およびユニーク９−ｍｅｒがなお含まれる（上右，図７Ａおよび７Ｂ）。これに対し、コンセンサスカクテルは、非共通９−ｍｅｒ、特に２０％未満の頻度のものを低く表示する（下左，図７Ａおよび７Ｂ）。モザイク配列については、より低頻度の９−ｍｅｒの数は配列数と共に単調に増加する（上左，各パネル）が、ユニークに分離される９−ｍｅｒは完全に除外される（右パネルの上左：^＊は、頻度＜０．００５の９−ｍｅｒが存在しないことを表わす）。 図７Ａおよび７Ｂは、天然、コンセンサス、およびモザイク配列中の出現頻度による９−ｍｅｒの分布を示す。幾つかの方法で作成したワクチンカクテルについて種々の９−ｍｅｒ頻度（ｘ−軸）に対する出現数（ｙ−軸）を示す。図７Ａ：頻度０〜６０％（９−ｍｅｒ頻度＞６０％について；分布はすべての方法について同等である）。図７Ｂ：低頻度９−ｍｅｒの詳細。天然配列は多数の希有またはユニークに分離される９−ｍｅｒをもつ（下右，図７Ａおよび７Ｂ）；これらは有用なワクチン応答を誘導しないと思われる。最適天然配列の選択によってより共通の９−ｍｅｒが選択されるのではなく、希有およびユニーク９−ｍｅｒがなお含まれる（上右，図７Ａおよび７Ｂ）。これに対し、コンセンサスカクテルは、非共通９−ｍｅｒ、特に２０％未満の頻度のものを低く表示する（下左，図７Ａおよび７Ｂ）。モザイク配列については、より低頻度の９−ｍｅｒの数は配列数と共に単調に増加する（上左，各パネル）が、ユニークに分離される９−ｍｅｒは完全に除外される（右パネルの上左：^＊は、頻度＜０．００５の９−ｍｅｒが存在しないことを表わす）。 図８Ａ〜８Ｄは、ワクチン候補のＨＬＡ結合力価を示す。図８Ａおよび８Ｂ）ＨＬＡ結合モチーフ数。図８Ｃおよび８Ｄ）好ましくないアミノ酸の数。すべてのグラフにおいて：天然配列を黒丸（λ）；コンセンサス配列を青三角（σ）；推測祖先配列を緑四角（ν）；およびモザイク配列を赤菱形（◇）でマークする。左パネル（図８Ａおよび８Ｃ）は、個々の配列について計算したＨＬＡ結合モチーフ数（図８Ａ）および好ましくないアミノ酸の数（図８Ｃ）を示す；右パネル（図８Ｂおよび８Ｄ）は、配列カクテルについて計算したＨＬＡ結合モチーフ数（図８Ｂ）および好ましくないアミノ酸の数（図８Ｄ）を示す。各グラフの上部分（ボックスと細線のグラフ）は、それぞれの数（モチーフ数または好ましくないアミノ酸の数）の分布を示す；Ｍグループ配列のアラインメント（個々の配列について，図８Ａおよび８Ｃ）、または各Ａ、ＢおよびＣサブタイプから１つの３配列からランダムに構成した１００のカクテル（配列カクテルについて，図８Ｂおよび８Ｄ）のいずれかに基づく。アラインメントはＬｏｓ Ａｌａｍｏｓ ＨＩＶデータベースからダウンロードされた。ボックスは２５パーセンタイルから７５パーセンタイルまでに及び、線は中央値にある。ボックスの外側へ延びた細線は、最高値および最低値を示す。Ｃ末端アンカー残基としてきわめて稀にみられるアミノ酸は、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、ＥおよびＨであり、小型、極性、または負に荷電している傾向がある (Yusim et al, J. Virol. 76:8757-8768 (2002))。結果をＧａｇについて示すが、Ｎｅｆコアおよび完全Ｎｅｆについても同じ定性結果が当てはまる。同じ操作をサブタイプモチーフについて行なって、ＨＬＡ結合モチーフについての結果と定性的に類似の結果を得た（データを示していない）。 図９は、ＧａｇおよびＮｅｆ中央領域にわたる、サブタイプＢ、サブタイプＣ、およびＭグループについて最適化した、４配列（κ＝４）に限定したモザイクタンパク質セットを示す。 図９は、ＧａｇおよびＮｅｆ中央領域にわたる、サブタイプＢ、サブタイプＣ、およびＭグループについて最適化した、４配列（κ＝４）に限定したモザイクタンパク質セットを示す。 図９は、ＧａｇおよびＮｅｆ中央領域にわたる、サブタイプＢ、サブタイプＣ、およびＭグループについて最適化した、４配列（κ＝４）に限定したモザイクタンパク質セットを示す。 図９は、ＧａｇおよびＮｅｆ中央領域にわたる、サブタイプＢ、サブタイプＣ、およびＭグループについて最適化した、４配列（κ＝４）に限定したモザイクタンパク質セットを示す。 図９は、ＧａｇおよびＮｅｆ中央領域にわたる、サブタイプＢ、サブタイプＣ、およびＭグループについて最適化した、４配列（κ＝４）に限定したモザイクタンパク質セットを示す。 図９は、ＧａｇおよびＮｅｆ中央領域にわたる、サブタイプＢ、サブタイプＣ、およびＭグループについて最適化した、４配列（κ＝４）に限定したモザイクタンパク質セットを示す。 図９は、ＧａｇおよびＮｅｆ中央領域にわたる、サブタイプＢ、サブタイプＣ、およびＭグループについて最適化した、４配列（κ＝４）に限定したモザイクタンパク質セットを示す。 図９は、ＧａｇおよびＮｅｆ中央領域にわたる、サブタイプＢ、サブタイプＣ、およびＭグループについて最適化した、４配列（κ＝４）に限定したモザイクタンパク質セットを示す。 図９は、ＧａｇおよびＮｅｆ中央領域にわたる、サブタイプＢ、サブタイプＣ、およびＭグループについて最適化した、４配列（κ＝４）に限定したモザイクタンパク質セットを示す。 図９は、ＧａｇおよびＮｅｆ中央領域にわたる、サブタイプＢ、サブタイプＣ、およびＭグループについて最適化した、４配列（κ＝４）に限定したモザイクタンパク質セットを示す。 図９は、ＧａｇおよびＮｅｆ中央領域にわたる、サブタイプＢ、サブタイプＣ、およびＭグループについて最適化した、４配列（κ＝４）に限定したモザイクタンパク質セットを示す。 図１０は、ＥｎｖおよびＰｏｌについてのモザイクセットを示す。 図１０は、ＥｎｖおよびＰｏｌについてのモザイクセットを示す。 図１０は、ＥｎｖおよびＰｏｌについてのモザイクセットを示す。 図１０は、ＥｎｖおよびＰｏｌについてのモザイクセットを示す。 図１０は、ＥｎｖおよびＰｏｌについてのモザイクセットを示す。 図１０は、ＥｎｖおよびＰｏｌについてのモザイクセットを示す。 図１０は、ＥｎｖおよびＰｏｌについてのモザイクセットを示す。 図１０は、ＥｎｖおよびＰｏｌについてのモザイクセットを示す。 図１０は、ＥｎｖおよびＰｏｌについてのモザイクセットを示す。 図１０は、ＥｎｖおよびＰｏｌについてのモザイクセットを示す。 図１０は、ＥｎｖおよびＰｏｌについてのモザイクセットを示す。 図１０は、ＥｎｖおよびＰｏｌについてのモザイクセットを示す。 図１０は、ＥｎｖおよびＰｏｌについてのモザイクセットを示す。 図１０は、ＥｎｖおよびＰｏｌについてのモザイクセットを示す。 図１０は、ＥｎｖおよびＰｏｌについてのモザイクセットを示す。 図１０は、ＥｎｖおよびＰｏｌについてのモザイクセットを示す。 図１０は、ＥｎｖおよびＰｏｌについてのモザイクセットを示す。 図１０は、ＥｎｖおよびＰｏｌについてのモザイクセットを示す。 図１０は、ＥｎｖおよびＰｏｌについてのモザイクセットを示す。 図１０は、ＥｎｖおよびＰｏｌについてのモザイクセットを示す。 図１０は、ＥｎｖおよびＰｏｌについてのモザイクセットを示す。 図１０は、ＥｎｖおよびＰｏｌについてのモザイクセットを示す。 図１０は、ＥｎｖおよびＰｏｌについてのモザイクセットを示す。 図１０は、ＥｎｖおよびＰｏｌについてのモザイクセットを示す。 図１０は、ＥｎｖおよびＰｏｌについてのモザイクセットを示す。 図１０は、ＥｎｖおよびＰｏｌについてのモザイクセットを示す。 図１０は、ＥｎｖおよびＰｏｌについてのモザイクセットを示す。 図１０は、ＥｎｖおよびＰｏｌについてのモザイクセットを示す。 図１１のプロットはアラインメント非依存型であり、すべてのＭグループタンパク質（データベースおよびＣＨＡＶＩ；一人につき１配列）を、すべての可能な９−ｍｅｒにそれらの頻度に応じて分断し、次いで各ワクチン抗原またはカクテルにおけるデータベースとの一致および近一致を検索することに基づく。 図１２は、適応範囲の追加のまとめを示す。 図１３は、位置による９−ｍｅｒ適応範囲を示す（Ｍｏｓ．３ワクチンカクテル）。 図１４Ａ〜１４Ｄは、使用のために提唱した各ワクチンについて９−ｍｅｒ一致の頻度により再ソーティングしたプロットを示す。 図１５Ａ〜１５Ｄは、完全データベースアラインメントにおけるあらゆる配列中のあらゆるアミノ酸をマッピングしたプロットを示す。 図１６は、３モザイク、Ｍグループ最適化を示す。 図１７は、ＨＩＶデータベース＋ＣＨＡＶＩ配列（Ｎ＝２０２０）の適応範囲を示す。 図１８は、患者のコンセンサス配列と比較した急性感染症患者の配列における相異を示す。 図１９は、サブタイプ特異的設計と対比したＥｎｖ Ｍグループ特異的設計の適応範囲に関する妥協点と利点を示す。 図２０は、提唱したワクチンモザイクのＧａｇおよびＥｎｖの適応範囲を示す。 図２１は、Ｇａｇ、ＮｅｆおよびＥｎｖ配列を示す。 図２１は、Ｇａｇ、ＮｅｆおよびＥｎｖ配列を示す。 図２１は、Ｇａｇ、ＮｅｆおよびＥｎｖ配列を示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。 図２２は、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子ならびにＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆを示す。

本発明は、その配列が循環ウイルス配列の希有ではない短い領域の最大適応範囲を提供
する合成ウイルスタンパク質を含む多価抗原セットが、良好なワクチン候補を構成すると
いう認識から得られた。本発明は、そのような多価抗原セットを、入力として供給した天
然タンパク質配列の任意セットのフラグメントのモザイクブレンドとして作製するための
“遺伝子アルゴリズム”方法を提供する。ＨＩＶに関しては、タンパク質ＧａｇおよびＮ
ｅｆがそのような抗原の理想的な候補である。適応範囲を拡大するために、Ｐｏｌおよび
／またはＥｎｖも使用できる。本発明はさらに、これらのタンパク質について最適化した
セットを提供する。

本発明の遺伝子アルゴリズム方法は、一般集団からのアラインしていないタンパク質配
列を入力データセットとして使用し、したがって“アラインメント非依存型”であるとい
う長所をもつ。これにより、自然界で見出されるタンパク質に類似する人工的モザイクタ
ンパク質を作製する−小動物モデルにおけるコンセンサス抗原の成功は、これが良好に作
動することを示唆する。９ｍｅｒは本明細書に記載する試験の焦点であるが、意図するタ
ーゲットに応じて種々の長さのペプチドを選択できる。本発明方法によれば、自然界に存
在しないかまたはきわめて希有な９ｍｅｒ（たとえば）は除外することができる−これは
、コンセンサス配列と対比した［後者は自然界に見出されていないある９ｍｅｒ（たとえ
ば）を含む可能性があるので］、またその株にユニークなある９ｍｅｒ（たとえば）をほ
ぼ常に含む天然株と対比した、改良点である。遺伝子アルゴリズムに使用するフィットネ
スの定義は、最大“フィット”多価カクテルはその集団内のすべての９ｍｅｒの最良適応
範囲（最高の完全一致画分）を与えるモザイク株の組合せであり、かつその集団内に存在
しないかまたは希有である９ｍｅｒは無いという拘束を受けることである。

本発明のモザイクタンパク質セットは、種々の入力データセットに関して最適化するこ
とができる−これにより、Ｔ細胞からみたサブタイプ特異的または領域特異的ワクチンの
長所を評価するために現時データを利用できる。たとえば、比較したオプションには下記
のものが含まれる：
１）Ｍグループ、ＢクレードおよびＣクレードに基づく最適多価モザイクセット。提示
した質問は、クレード内適応範囲がクレード間またはグローバルよりどのくらい良好であ
るかということであった；
２）種々の抗原数：１、３、４、６；
３）“典型的な”株を単に例示するために、ワクチンプロトコルに現在用いられている
天然株（Ｍｅｒｃｋ，ＶＲＣ）；
４）集団内の９ｍｅｒの最良適応範囲を与えるように選択した天然株；
５）コンセンサスのセット：Ａ＋Ｂ＋Ｃ；
６）多価抗原中の１つの“特定”株、１つの祖先＋３つのモザイク株、１つのコンセン
サス＋３つのモザイク株を含む、最適化されたカクテル；
７）完全に一致した９ｍｅｒの適応範囲を８／９、７／９および６／９、またはそれ未
満一致するものと比較した。

１つの９ｍｅｒをカバーするための最良セットが、オーバーラップする９ｍｅｒ類をカ
バーするための最良セットではない可能性があるので、これはコンピューター処理にとっ
て難しい問題である。

本明細書に記載する方法はＨＩＶ免疫応答を試験するペプチド試薬を設計するために使
用でき、かつ他の変異性病原体にも適用できることは、本明細書の開示内容を読むことに
より認識されるであろう。たとえば、本発明方法は高度に変異性のウイルスであるＣ型肝
炎にも適用できる。

本発明のタンパク質／ポリペプチド／ペプチド（“免疫原”）に、当技術分野で周知の
技術により医薬的に許容できるキャリヤーおよび／またはアジュバントを配合して、組成
物にすることができる。適切な投与経路には、全身（たとえば筋肉内または皮下）、経口
、膣内、直腸内および鼻内が含まれる。

本発明の免疫原は、当業者に周知の方法を用いて化学合成および精製することができる
。これらの免疫原は、周知の組換えＤＮＡ技術により合成することもできる。
本発明の免疫原をコードする核酸を、たとえばコード配列が裸のＤＮＡとして投与され
るＤＮＡワクチンの成分として使用でき、あるいは、たとえば免疫原をコードするミニ遺
伝子がウイルスベクター中に存在してもよい。コード配列を、たとえばマイコバクテリウ
ム属（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，）中、組換えキメラアデノウイルス中、または組換
え弱毒水疱性口内炎ウイルス中で発現させることができる。コード配列は、たとえば下記
の中に存在してもよい：複製型もしくは非複製型アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウ
イルスベクター、弱毒化した結核菌（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏ
ｓｉｓ）ベクター、カルメット−ゲラン杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇ
ｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ））ベクター、ワクシニアまたは改良ワクシニア・アンカラ（Ｍｏｄ
ｉｆｉｅｄ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ａｎｋａｒａ（ＭＶＡ））ベクター、他のポックスウイ
ルスベクター、組換えポリオその他の腸内ウイルスベクター、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏ
ｎｅｌｌａ）種の細菌ベクター、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種の細菌ベクター、ベネ
ズエラウマ脳炎ウイルス（Ｖｅｎｅｚｕｅｌｅａｎ Ｅｑｕｉｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉ
ｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ（ＶＥＥ））ベクター、セムリキ森林ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆ
ｏｒｅｓｔ Ｖｉｒｕｓ）ベクター、またはタバコモザイクウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ
Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）ベクター。コード配列は、たとえばＣＭＶプロモーターなど
の活性プロモーターを含むＤＮＡプラスミドとして発現させることもできる。他の生存ベ
クターを用いて本発明の配列を発現させることもできる。本発明の免疫原は、患者自身の
細胞において、好ましくはヒト細胞における発現を最適化するコドンおよびプロモーター
を用いて、これらの細胞に免疫原をコードする核酸を導入することにより誘導できる。Ｄ
ＮＡワクチンを製造および使用する方法の例は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５８０，８
５９、５，５８９，４６６、および５，７０３，０５５に開示されている。コドン最適化
の方法の例は、Haas et al, Current Biology 6:315-324 (1996)およびAndre et al, J.
Virol. 72(2):1497-1503 (1998)に記載されている。

アジュバントを本発明組成物に含有させる（あるいは、免疫原効果を増強するために別
個に投与する）ことができるのは認識されるであろう。適切なアジュバントの例には、Ｔ
ＲＬ−９アゴニスト、ＴＲＬ−４アゴニスト、ならびにＴＲＬ−７、８および９アゴニス
トの組合せ（およびミョウバン）が含まれる。アジュバントは油性および水性エマルジョ
ンの形をとることができる。スクアレンアジュバントも使用できる。

本発明の組成物は、免疫学的有効量の本発明の免疫原、またはそれらをコードする核酸
配列を、医薬的に許容できる送達システム中に含む。これらの組成物をウイルス感染症（
たとえばＨＩＶ感染症）の予防および／または治療のために使用できる。前記に指摘した
ように、本発明の組成物はアジュバント、乳化剤、医薬的に許容できるキャリヤー、また
はワクチン組成物中に日常的に供給される他の成分を用いて配合できる。最適配合物は当
業者が容易に設計でき、即時放出および／または持続放出のための配合物、ならびに全身
性免疫の誘導および／または局所粘膜免疫の誘導のための配合物を含むことができる（た
とえば、鼻内、膣内、または直腸内投与のための配合物を設計できる）。前記のように本
発明組成物は、皮下、鼻内、経口、筋肉内、または他の非経口もしくは腸内経路を含めた
いずれか好都合な経路で投与できる。免疫原を１回量または多数回量で投与できる。最適
免疫化計画は当業者が容易に決定でき、患者、組成物、および目的とする効果に伴って異
なる可能性がある。

本発明は、本発明の免疫原および／またはそれらをコードする核酸および／または前記
に従って発現させた免疫原の直接使用を共に考慮する。たとえば、免疫原をコードするミ
ニ遺伝子を初回抗原刺激および／または追加抗原刺激として使用できる。

本発明は、本明細書に開示するアミノ酸配列およびそれらをコードする核酸配列（およ
びそれらのコード配列に相補的な核酸）のいずれかおよびすべてを含む。
本明細書に詳細に記載するのは、地域流行をターゲティングした単一ＢまたはＣサブタ
イプ、およびグローバルに循環しているすべてのＨＩＶ−１変異体［ＨＩＶ−１主（Ｍ）
グループ］について最適化したワクチン抗原セットである。後記の実施例１に記載する試
験において、目標は特にＴ細胞応答のための多価ワクチンの設計にある。ＨＩＶ−１特異
的Ｔ細胞は、ＨＩＶ−１特異的ワクチン応答に重要であると思われる：ＣＴＬ応答はヒト
における疾患進行速度の低下と相関し(Oxenius et al, J. Infect. Dis. 189:1199-1208
(2004))、ヒト以外の霊長類ワクチン接種モデルにおけるＣＴＬ応答の重要性は十分に確
立されている。ワクチンにより誘発された細胞性免疫応答は、病原性ＳＩＶまたはＳＨＩ
Ｖの抑制を補助し、病原性ウイルスによる攻撃後の疾患の可能性を低下させる(Barouch e
t al, Science 290:486-492 (2000))。ＣＤ８＋ Ｔ細胞を一時的に枯渇させると、ＳＩ
Ｖ感染したアカゲザルにおいてウイルス血症が増大する(Schmitz et al, Science 283: 8
57-60 (1999))。さらに、疾患の進行に伴ってＣＴＬ回避変異が生じ、これはＣＴＬ応答
がインビボでのウイルス複製の束縛を補助することを指摘する(Barouch et al, J. Virol
. 77: 7367-75 (2003))ので、潜在的回避経路を遮断するワクチン刺激による記憶応答は
有用な可能性がある。変異性が高いエンベロープ（Ｅｎｖ）はＨＩＶに対する抗体を中和
するための主要なターゲットであり、ワクチン抗原はこれらの抗体応答の誘発にも適合さ
せる必要がある(Moore and Burton, Nat. Med. 10: 769-71 (2004))が、Ｔ細胞ワクチン
成分は、より保存されたタンパク質をターゲティングして、交差反応する可能性がより大
きい応答を始動させることができる。しかし、最も保存されたＨＩＶ−１タンパク質です
ら変異が問題になるのに十分なほど多様である。本質的に株間の“相異を断ち切る”人工
的な中枢配列ワクチン法であるコンセンサス配列および祖先配列(Gaschen et al, Scienc
e 296: 2354-60 (2002), Gao et al, J. Virol. 79: 1154-63 (2005), Doria-Rose et al
, J. Virol. 79: 11214-24 (2005))は有望性を示し、天然株ワクチンと比較して増強され
た交差反応性をもつ応答を刺激する(Gao et al, J. Virol. 79:1154-1163 (2005)) (Liao
et al. and Weaver et al., 提出済み)。それにもかかわらず、中枢株ですらＨＩＶ多様
性スペクトルをカバーするのはごく限られた程度であり、コンセンサスベースのペプチド
試薬は多くのオートロガスＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を検出できない(Altfeld et al, J. Vir
ol. 77: 7330-40 (2003))。

単一アミノ酸置換がＴ細胞回避を仲介する可能性があり、多くのＴ細胞エピトープにお
いて１以上のアミノ酸がＨＩＶ−１株間で異なるので、いずれか１つのワクチン抗原に対
する応答の潜在的有効性には限界がある。特定の変異がＴ細胞の交差反応性を低下させる
かどうかはエピトープおよびＴ細胞によるけれども、ある変化がクレード間の交差反応性
に広範に影響を及ぼす可能性がある(Norris et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses 20: 3
15-25 (2004))。より多くの変異体を多価ワクチンに組み込むことによって、より広域の
循環変異体に対する応答が可能になる。それは共通の回避変異体に対する免疫系を初回抗
原刺激することもできる(Jones et al, J. Exp. Med. 200: 1243-56 (2004))；１つのＴ
細胞受容体からの回避が他の受容体に対して感受性である変異体を形成する可能性があり
(Lee et al, J. Exp. Med. 200:1455-1466 (2004))、したがってエピトープ変異体に対す
るポリクローナル応答を刺激することは有益となる可能性がある(Killian et al, Aids 1
9: 887-96 (2005))。プロセシングを阻害する手段(Milicic et al, J. Immunol. 175: 46
18-26 (2005))またはＨＬＡ結合を阻害する手段(Ammaranond et al, AIDS Res. Hum. Ret
roviruses 21: 395-7 (2005))を伴う免疫回避はエピトープ提示を妨げ、そのような場合
、異なる特異性をもつＴ細胞によってその回避変異体に対抗することはできない。しかし
、オーバーラップするエピトープを認識するＴ細胞の存在は、場合によりこれらの回避経
路ですら遮断する可能性がある。

本発明の特定の観点を、限定ではない以下の実施例においてより詳細に記載することが
できる。
実施例１
実験の詳細
ＨＩＶ−１配列データ。一人当たり１つの配列を含む２００５のＨＩＶ配列データベー
ス(http://hiv.lanl.gov)からの基準アラインメントを用い、これに南アフリカ、ダーバ
ンから最近入手できる追加のＣサブタイプＧａｇおよびＮｅｆ配列（ＧｅｎＢａｎｋ ａ
ｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ ＡＹ８５６９５６−ＡＹ８５７１８６）(Kiepiela
et al, Nature 432:769-75 (2004))を補足した。このセットは、全世界からの５５１のＧ
ａｇおよび１，１３１のＮｅｆ Ｍグループ配列を含んでいた；Ｍグループの多様性を調
べるために、純粋なサブタイプ配列と共に組換え配列を含めた。１８Ａ、１０２Ｂ、２２
８Ｃおよび６Ｇサブタイプ配列（Ｇａｇ）、ならびに６２Ａ、４５４Ｂ、２８４Ｃおよび
１３Ｇサブタイプ配列（Ｎｅｆ）を含むこれらのアラインメントのサブセットを、単一ク
レード内および単一クレード間の最適化および比較のために用いた。

遺伝子アルゴリズム。ＧＡは、分析により回折するのが困難な問題に対する解を見出す
ために用いられる、生物学的方法（進化、集団、選択、組換え）のコンピューター類似法
である(Holland, Adaptation in Natural and Artificial Systems: An Introductory An
alysis with Applicatins to Biology, Control, and Artificial Intelligence, (M.I.T
. Press, Cambridge, MA (1992)))。特定の入力に対する解を、“フィットネス”（最適
性）基準に従ったランダムな改変および選択のプロセスにより“進化”させる。ＧＡには
多くの種類がある；“定常状態−共進化的多集団（ｓｔｅａｄｙ−ｓｔａｔｅ ｃｏ−ｅ
ｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｍｕｌｔｉ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）”ＧＡを実行した。“定
常状態”は、新たな全集団を一度にではなく、一度に１つの新たな候補解を作製すること
を表わす；“共進化的”は、一緒に作業する幾つかの別個の集団を同時に進化させて完全
解を作成することを表わす。入力はアラインしていない天然配列のセットである；候補解
はκ個の擬似天然“モザイク”配列のセットであり、それらのそれぞれが天然配列の鎖状
セクション（ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｉｎｇ ｓｅｃｔｉｏｎ）により形成されている。フ
ィットネス基準は集団適応範囲（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｃｏｖｅｒａｇｅ）であり、こ
れはカクテル中にある入力配列中のすべての９−アミノ酸配列フラグメント（潜在的エピ
トープ）の集団と定義される。

ＧＡ（図２）を立ち上げるために、ｎ個の初期候補配列の集団κ個を、ランダムに選択
した天然配列間での２点組換えにより作製する。入力する天然配列はアラインしていない
ので、“相同”クロスオーバーを用いる：両配列中の短い一致ストリング（ｍａｔｃｈｉ
ｎｇ ｓｔｒｉｎｇ）を探索することにより各配列のクロスオーバー点を選択する；典型
的なエピトープ長さがｃ＝９である場合、ｃ−１＝８のストリングを用いた。これにより
、組換え配列は天然タンパク質に確実に類似する：異なる株に由来する配列のセクション
間の境界は継ぎ目がなく、境界にまたがる局部配列は常に自然界で見出されるものであり
、モザイクが大きな挿入／欠失または自然界に無い組合せのアミノ酸を取り込むのは阻止
される。モザイク構築の結果、モザイク配列長さは天然配列長さの分布内にある：組換え
は同一領域においてのみ許容され、反復領域の再重複を阻止するために過剰な長さに対す
るエクスプリシット・ソフトウェア（ｅｘｐｌｉｃｉｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ）禁止によっ
て強化される（そのような再重複エピトープの“枠内”挿入は、自然界に無い９−ｍｅｒ
を生成することなく適応範囲を拡大するための他の方法を提供することができるが、それ
らを組み込むと“自然界に無い”タンパク質が作製されるであろう）。最初は、カクテル
は各集団からランダムに選択した１つの“ウイナー（ｗｉｎｎｅｒ）”を含む。集団内の
いずれかの個々の配列についてのフィットネススコアは、その配列−プラス−他の集団か
らの現時ウイナーからなるカクテルについての適応範囲値である。したがって、ある集団
内のいずれかの配列の個々のフィットネスは、他の集団内に見出される最良配列に動的に
依存する。

最適化は一度に１つの集団について進行する。それぞれの繰返しについて、２つの“親
”配列を選択する。第１の親は、“２トーナメント（２−ｔｏｕｒｎａｍｅｎｔ）”選択
を用いて選択される：現時集団から２配列をランダムに抜き出し、スコアリングし、より
良いものを選択する。これにより、その集団内でのそれらのフィットネスランクに反比例
する確率をもつ親が、すべての個々のフィットネスを実際に計算する必要なしに選択され
る。第２の親は、同じ方法で選択される（５０％の時間）か、あるいは天然配列セットか
らランダムに選択される。次いで、親間の２点相同クロスオーバーを用いて“子”配列を
作製する。その天然集団内できわめて稀であった９−ｍｅｒ（見出されたのが３回未満）
を含む子はいずれも直ちに棄却される。棄却されなければ、この新たな配列をスコアリン
グし、そのフィットネスを同じ集団からランダムに選択した４配列と比較する。ランダム
に選択した４配列のいずれかがこの新たな配列のものより低いスコアをもつ場合、それを
この集団においてこの新たな配列で置き換える。現時集団の“ウイナー”より良いスコア
を与える配列に遭遇した場合は常に、その配列が現時集団のためのウイナーとなり、した
がって以後はこのカクテル内で他の集団内の配列を評価するために用いられる。次いでそ
のような最適化サイクルを数回（一般に１０回）各集団に適用し、このプロセスは進化が
止む（すなわち、特定数の世代について改良がなされなくなる）までその集団全体に循環
し続ける。この時点で、新たに作製したランダム出発集団を用いて操作全体を再開し、そ
れ以上の改良が見られなくなるまでこの再開を続ける。ＧＡをｎ＝５０または５００の各
データセットについて実施した；それ以上の改良が生じなくなるまで１２〜２４時間、２
ＧＨｚ Ｐｅｎｔｉｕｍプロセッサーで各操作を続けた。κ＝１、３、４または６のモ
ザイク配列を含むカクテルを作製した。

ＧＡは、関心のある１以上の固定配列（たとえばコンセンサス）を任意にカクテルに組
み込むことも可能であり、その固定株を最適に補充するためにカクテルの他のエレメント
を進化させるであろう。これらの解は最適以下であったので、それらは本明細書に含まれ
ていない。追加プログラムは、入力ファイルから、組み合わせると最良の集団適応範囲を
提供するκ個の最良天然株を選択する。

他の多価ワクチン候補との比較。可能性のある他の１価または多価ワクチンについて集
団適応範囲スコアを計算し、モザイク配列ワクチンとの直接比較を行なって、集団９−ｍ
ｅｒとの同一性、ならびに８／９および７／９アミノ酸の類似性を追跡した。天然株に基
づいた、可能性のあるワクチン候補には、単一株（たとえば、南アフリカのためのワクチ
ンに関する単一Ｃ株(Williamson et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses 19:133-44 (2003
)))、または天然株の組合せ（たとえば、サブタイプＡ、ＢおよびＣのそれぞれ１つ(Kong
et al, J. Virol. 77:12764-72 (2003))が含まれる。現在まで、潜在的Ｔ細胞エピトー
プ適応範囲を最大にするために天然株ワクチン候補を系統的に選択することはなされてい
ない；未選択ワクチン候補から期待できるものの代表例となるワクチン候補を文献より抜
き出した。無傷の天然株のみを用いて適応範囲の上限も決定した：データセットのうち最
良適応範囲をもつ単一配列を選択することによって最適天然配列カクテルを作製し、次い
で一定のκになるまで最大補充配列を連続的に追加した。この比較には、中枢合成ワクチ
ンの概念を表わすために、種々のサイズの最適天然配列カクテルおよびコンセンサス配列
が単独でまたは組み合わせて含まれていた(Gaschen et al, Science 296:2354-60 (2002)
)。最後に、固定配列オプションをＧＡに使用し、コンセンサス−プラス−モザイクと組
合せて比較；これらのスコアは、一定のκについて含まれる全モザイク組合せと本質的に
同等であった（データは示していない）。これらの分析を実施するために用いたコードは
、ftp://ftp-t10/pub/btk/mosaicsにおいて入手できる。

結果
タンパク質の変異。保存されたＨＩＶ−１タンパク質において、大部分の位置は本質的
に非変異性であり、最も変異性である位置はかなりの頻度で生じる２〜３個のアミノ酸を
もつにすぎず、かつ変異性の位置は保存された位置の間に一般に十分に分散している。し
たがって、ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ（８〜１２個のアミノ酸、一般に９個）の境界内
で、集団多様性の大部分はごく少数の変異体でカバーできる。図１は、Ｇａｇ、Ｎｅｆお
よびＥｎｖを変異体数の増加について比較し、最良適応範囲を提供する変異体を逐次追加
した、９−ｍｅｒ（９個の連続アミノ酸の長さ）の集団適応範囲の上限を示す。保存領域
では、２〜４の変異体で高度の集団適応範囲が達成される。これに対し、Ｅｎｖのような
変異性領域では、８つの変異体を用いてすら限られた集団適応範囲が可能であるにすぎな
い。新たな各追加はより希有なものであるので、各追加の相対的有益性は変異体数が増加
するのに伴って漸減する。

ワクチン設計の最適化方法。図１は、理想化したレベルの９−ｍｅｒ適応範囲を示す。
実際には、高頻度９−ｍｅｒにはしばしば矛盾がある：局部共変異のため、１つの９−ｍ
ｅｒに対する最適アミノ酸はオーバーラップする９−ｍｅｒに対するものと異なる可能性
がある。集団適応範囲を最適化するモザイクタンパク質セットを設計するためには、各ア
ミノ酸の相対的有益性は近接する変異体との組合せにおいて評価されなければならない。
たとえば、アラニン（Ａｌａ）とグルタミン酸（Ｇｌｕ）がそれぞれ隣接位置に頻繁に生
じる場合があるかもしれないが、Ａｌａ−Ｇｌｕ組合せが自然界では決して見られなけれ
ば、それをワクチンから除外すべきである。幾つかの最適化方法を調べた：欲張りアルゴ
リズム（ｇｒｅｅｄｙ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）、半自動化した適合性９ｍｅｒアセンブリ
ー方法、アラインメントベースの遺伝子アルゴリズム（ＧＡ）、およびアラインメント非
依存型ＧＡ。

アラインメント非依存型ＧＡは、最良の集団適応範囲をもつモザイクを作製した。この
ＧＡは、アラインしていないタンパク質配列のセットから、ワクチン抗原特異的な非防御
応答を誘導する可能性のある希有または自然界に無いエピトープ長さのフラグメント（組
換え破断点に導入される可能性がある）を確実に除外して、ユーザーが特定した数のモザ
イク配列を作製する。これらの候補ワクチン配列は、天然配列に類似するが、相同破断点
で組換えたデータベース配列の頻度重み付きフラグメントから組み立てられる（図２）；
それらは入力集団について９−ｍｅｒの最大適応範囲に近づく。

初期モザイクワクチンのためのＨＩＶタンパク質領域の選択。特定の基準に適合するタ
ンパク質領域に注目した初期設計：ｉ）比較的低い変異性、ｉｉ）自然感染における高レ
ベルの認識、ｉｉｉ）高密度の既知エピトープ、およびｉｖ）感染に際しての早期応答、
または感染患者における良好な転帰と関連するＣＤ８＋ Ｔ細胞応答のいずれか。最初に
、種々のＨＩＶタンパク質について、モザイクにより達成される９−ｍｅｒ適応範囲レベ
ルの評価を行なった（図３）。各タンパク質について、Ｍグループ、またはＢおよびＣサ
ブタイプ単独のいずれかを用いて４モザイクのセットを作製した；適応範囲をＣサブタイ
プについてスコアリングした。幾つかの結果が注目される：ｉ）サブタイプ内での最適化
はサブタイプ内−最良適応範囲を提供するが、サブタイプ間適応範囲より実質的に貧弱で
ある-それにもかかわらず、Ｂサブタイプ最適化したモザイクは、単一天然Ｂサブタイプ
タンパク質より良好なＣサブタイプ適応範囲を提供する（Kong et al, J. Virol. 77:127
64-72 (2003)）；ｉｉ）ＰｏｌおよびＧａｇは広域の交差反応性応答を誘発するための最
大力価をもち、これに対しＲｅｖ、Ｔａｔ、およびＶｐｕは高度に変異性であるＥｎｖタ
ンパク質よりさらに少ない保存９−ｍｅｒをもつ；ｉｉｉ）Ｍグループ最適化したモザイ
クセットのサブタイプ内適応範囲は、特に、より保存されたタンパク質について、サブタ
イプ内最適化したセットの適応範囲に近づいた。

ＧａｇおよびＮｅｆ中央領域は前記の４つの基準に適合する。ＮｅｆはＴ細胞により認
識される頻度が最も高いＨＩＶタンパク質であり(Frahm et al, J. Virol. 78:2187-200
(2004))、自然感染に際して最も早く応答するためのターゲットである(Lichterfeld et a
l, Aids 18:1383-92 (2004))。全体としてそれは変異性である（図３）が、それの中央領
域はＧａｇと同程度に保存されている（図１）。ワクチンに組み込むのに最適なタンパク
質が何であるかはまだ明らかでなく、モザイクは最も変異性のタンパク質ですら潜在的適
応範囲を最大化するように設計できる（図３）けれども、グローバルな適応範囲が得られ
る見込みは保存タンパク質についての方が良好である。Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖを含
むワクチンにＲｅｖ、ＴａｔおよびＮｅｆを追加することによりアンゲザルにおけるワク
チン防御が改良されることは立証された(Hel et al, J. Immunol. 176:85-96 (2006))が
、これは同種攻撃に関してであり、この場合は変異性は問題でなかった。循環ウイルス集
団における調節タンパク質の著しい変異性は、交差反応性応答を排除する可能性がある；
保存性という点で、Ｐｏｌ、Ｇａｇ（特にｐ２４）およびＮｅｆ中央領域（ＨＸＢ２の位
置６５−１４９）は有望な潜在免疫原である（図１，３）。しかし、Ｐｏｌは自然感染に
際して認識される頻度が低い(Frahm et al, J. Virol. 78:2187-200 (2004))ので、それ
は初期の免疫原設計に際して組み込まなかった。組み込んだＮｅｆの保存部分はＨＩＶ−
１中で最も高度に認識されたペプチドを含む(Frahm et al, J. Virol. 78:2187-200 (200
4))が、タンパク質フラグメントであるので、Ｎｅｆの免疫阻害機能は行なえないであろ
う（たとえば、ＨＬＡクラスＩのダウンレギュレーション(Blagoveshchenskaya, Cell 11
1:853-66 (2002)))。ＧａｇおよびＮｅｆは両方とも、十分に解明されたオーバーラップ
ＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープと共に密に充填されており、多様なＨＬＡ分
子により提示され(http://www.hiv.lanl.gov//content/immunology/maps/maps.html)、Ｇ
ａｇ特異的ＣＤ８＋(Masemola et al, J. Virol. 78:3233-43 (2004))およびＣＤ４＋(Ox
enius et al, J. Infect. Dis. 189:1199-208 (2004))Ｔ細胞応答は、感染個体における
低いウイルス設定値に関連があるとされている(Masemola et al, J. Virol. 78:3233-43
(2004))。

地理的変動および入力サンプルサイズの潜在的な影響を調べために、公開されているサ
ブタイプＣ配列を用いて限定した試験を行なった。サブタイプＣのＧａｇデータを同規模
サイズの３セットに分けた−２つの南アフリカセット(Kiepiela et al, Nature 432:769-
75 (2004))、および南アフリカ以外の１つのサブタイプＣセット。各セットについて独立
してモザイクを最適化し、得られたモザイクを３セットすべてに対して試験した。９−ｍ
ｅｒの適応範囲は同等のトレーニングセットおよび試験セットについてわずかに良好であ
った（７７〜７９％の９／９適応範囲）が、トレーニングセットおよび試験セットが２つ
の異なる南アフリカデータセットである場合（７３〜７５％）、またはいずれか一方の南
アフリカデータセットおよび南アフリカ以外のＣサブタイプ配列である場合（７４〜７６
％）には、本質的に同等であった。したがって、国間および国内の適応範囲はクレード内
適応範囲とほぼ等しく、この例では国特異的Ｃサブタイプモザイク設計に利点はみられな
かった。

ＧａｇおよびＮｅｆについてのモザイクの設計ならびにワクチン設計方法の比較。種々
のワクチン設計方法についてサブタイプ内およびサブタイプ間の交差反応性を評価するた
めに、それらが天然Ｍグループ配列について備えている適応範囲の計算を行なった。ワク
チン抗原内の９−ｍｅｒが完全に一致した天然配列内の全９−ｍｅｒの画分を計算し、エ
ピトープ内の単一（時には二重）置換が交差反応性を保持する可能性があるので、同様に
８／９または７／９の一致アミノ酸をもつものを計算した。図４は、種々の方法で設計し
たカクテルについて、ＧａｇおよびＮｅｆ中央領域の９−ｍｅｒ当たりのＭグループ適応
範囲を示す：ａ）ワクチン抗原として用いられているＡ、ＢおよびＣサブタイプからの３
つの非最適天然株(Kong et al, J. Virol. 77:12764-72 (2003))；ｂ）最良Ｍグループ適
応範囲を与えるようにコンピューターで選択した３つの天然株；ｃ）Ｍグループ、Ｂサブ
タイプおよびＣサブタイプコンセンサス配列；ならびにｄ、ｅ、ｆ）３、４および６モザ
イクタンパク質。多重株のカクテル、すなわちκ＝３、κ＝４、およびκ＝６のセットに
ついて、モザイクは明らかに最良の性能を示し、適応範囲はκ個の株の上限に近づく。そ
れらに続くのは、最適選択した天然株、コンセンサスタンパク質カクテル、最後に非最適
−天然株であった。より多数の抗原が可能であればより大きい適応範囲が得られるが、各
追加についての利得はκが増加するのに伴って低下する（図１および４）。

図５に、単一タンパク質からモザイクタンパク質の組合せまで種々のワクチン設計方法
について全適応範囲をまとめ、サブタイプ内最適化をＭグループ最適化と比較する。単一
モザイクの性能は、最良単一天然株またはコンセンサス配列に匹敵する。単一コンセンサ
ス配列は最良単一天然株より性能が劣るが、最適化した天然配列カクテルはコンセンサス
カクテルより良好な性能をもつ：コンセンサス配列は相互に天然株の場合より類似するの
で、若干リダンダントである。しかし、２モザイク変異体を組み込んだだけで、適応範囲
が顕著に拡大し、４および６モザイクタンパク質は天然株またはコンセンサス株の多価カ
クテルより漸次良好な適応範囲を与える。サブタイプ内最適化したモザイクは最良の性能
を示す−４モザイク抗原は８０〜８５％の９−ｍｅｒが完全に一致する−しかし、これら
のセットのサブタイプ間適応範囲は５０〜６０％に劇的に低下する。これに対し、全Ｍグ
ループを用いて最適化したモザイクタンパク質は、個々のサブタイプについて約７５〜８
０％の適応範囲を与え、これはＭグループ全体の適応範囲に匹敵する（図５および６）。
不完全な８／９一致を許容すれば、Ｍグループ最適化モザイクおよびサブタイプ内最適化
モザイクは両方とも９０％の適応範囲に近づく。

適応範囲は、より希有な９−ｍｅｒを追加するほど拡大し、希有エピトープは問題が多
い（たとえばワクチン特異的免疫優性応答を誘導することにより）ので、ワクチン構築体
中の９−ｍｅｒの頻度分布を、それらが作製された天然配列と比較して調べた。κ＝６の
カクテル中の大部分の追加エピトープは、κ＝４のカクテルと比較して低頻度である（＜
０．１，図７）。これらのエピトープは、適応範囲を拡大するけれども、比較的希有であ
り、したがってそれらが誘導する応答はより共通の、したがってより有用なエピトープに
対するワクチン応答から遠ざかる可能性がある。天然配列カクテルは実際には、中等度に
低い頻度のエピトープの発生率がモザイクより少ない；モザイクは適応範囲の最適化に伴
って若干のより低頻度の９−ｍｅｒを付け加えている。他方、モザイクはユニークまたは
きわめて希有な９−ｍｅｒを除外し、これに対し天然株は一般に他の配列中に存在しない
９−ｍｅｒを含む。たとえば天然ＭグループＧａｇ配列は、配列当たり中央値３５（０〜
１４８の範囲）のユニーク９−ｍｅｒをもっていた。ＨＬＡ−アンカーモチーフの保持率
も調べ、アンカーモチーフの頻度は４モザイクと３つの天然株との間で同等であることが
見出された。天然抗原は実際に抗原当たりのモチーフ数の増加を示した；これはおそらく
株特異的モチーフを含むことによるものであろう（図８）。

κの増加に伴っていっそう希有なエピトープ（ｅｖｅｒ−ｒａｒｅｒ ｅｐｉｔｏｐｅ
）が増加することと合わせて、ワクチン接種点希釈（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ−ｐｏｉｎ
ｔ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）および試薬開発費についての関心から、最初は、ＧａｇおよびＮ
ｅｆ中央領域にわたる、サブタイプＢ、サブタイプＣおよびＭグループについて最適化し
た４配列（κ＝４）に限定したモザイクたんぱく質を作製することになった（これらの配
列は図９に含まれる；ＥｎｖおよびＰｏｌについてのモザイクセットを図１０に示す）。
種々の４配列Ｇａｇ−Ｎｅｆモザイクの合成および初期の抗原性試験が現在行なわれてい
る。最初のモザイクワクチンにおいてターゲティングしたのはＧａｇおよびＮｅｆタンパ
ク質中央領域だけである；これらは卓越したグローバル集団適応範囲を提供するのに十分
なほど保存されており、自然応答に関して前記の望ましい特性をもつ(Bansal et al, Aid
s 19:241-50 (2005))。さらに、感染に対する自然ＣＴＬ応答を検出するためにＢサブタ
イプｐ２４変異体をＥｌｉｓｐｏｔペプチド混合物に含有させると、検出される応答の回
数および大きさが共に増大し、これは最も保存されたタンパク質ですらその変異体を組み
込むのは有用であろうという考えを支持する。最後に、アカゲザルに与えた多価ＨＩＶ−
１ワクチンにおけるタンパク質カクテルは、各抗原に対する強い応答の発生を妨げず(Sea
man et al, J. Virol. 79:2956-63 (2005))、抗原カクテルはネズミモデルにおいてアン
タゴニスト応答を生じなかった(Singh et al, J. Immunol. 169:6779-86 (2002))；これ
は、これらの抗原混合物がＴ細胞ワクチンに適切であることを指摘する。

モザイクは天然株と比較して適応範囲を改良するが、モザイクですら、Ｅｎｖのような
変異性タンパク質がもつ９−ｍｅｒの適応範囲は限られる。たとえば、Ａ、ＢおよびＣク
レードからそれぞれ１つ選択した３つのＭグループ天然タンパク質であって、ワクチン設
計について現在試験中のもの(Seaman et al, J. Virol. 79:2956-63 (2005))は、Ｍグル
ープタンパク質中の９−ｍｅｒのわずか３９％が完全に一致し、６５％が少なくとも８／
９一致する。これに対し、３つのＭグループＥｎｖのモザイクは、４７％の９−ｍｅｒが
完全に一致し、７０％は少なくとも８／９一致する。多価モザイク抗原を設計するために
書かれたコードが入手可能であり、これをいずれかの変異性タンパク質の入力セットに容
易に適用していずれかの目的数の抗原につき最適化することができる。このコードは、κ
個の天然株の最適組合せを選択することもでき、多価ワクチンのための天然抗原の妥当な
選択が可能になる。表１に含まれるのは、現時データベースアラインメントのＧａｇおよ
びＮｅｆ集団適応範囲のついての最良天然株である。

表１
種々の遺伝子、サブタイプセット、および配列数について得られる最良９−ｍｅｒ適応範
囲をもつ天然配列カクテル

subtype：サブタイプ
natural sequence：天然配列
group：グループ
central regeon：中央領域。

要約すると、以上に記載した試験は、感染時点でＨＩＶの多様性に対抗し、ウイルスの
回避経路を遮断し、これにより感染個体における疾患の進行を最小限に抑えるための、Ｔ
細胞ワクチン成分の設計に注目する。ＨＩＶ−１ワクチン設計のために本発明において開
発した多価モザイクタンパク質方法は、いずれかの変異性タンパク質、他の病原体、およ
び他の免疫学的問題に適用できる。たとえば、最少数の変異ペプチドをＴ細胞応答アッセ
イに装入すると、著しい経費をかけずに感受性を顕著に高めることができる：κ個のモザ
イクタンパク質のセットは、κ個の抗原について可能な最大適応範囲を提供する。

ＨＩＶの多様性に対抗するために、中枢化した（コンセンサスまたは祖先）遺伝子およ
びタンパク質方法が先に提唱された(Gaschen et al, Science 296:2354-2360 (2002))。
免疫原として人工遺伝子を使用することについての概念証明（ｐｒｏｏｆ−ｏｆ−ｃｏｎ
ｃｅｐｔ）が、野生型ＨＩＶ−１株に対するＴおよびＢ細胞応答の両方をグループＭコン
センサス免疫原で誘導することにより立証された(Gaschen et al, Science 296:2354-236
0 (2002), Gao et al, J. Virol. 79:1154-63 (2005), Doria-Rose et al, J. Virol. 79
:11214-24 (2005), Weaver et al, J. Virol., in press))。モザイクタンパク質設計は
、ポリクローナルワクチンのための試薬を共最適化し、希有ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープ
を排除し、そして集団レベルでのそれらの頻度に基づいて回避経路に関与する可能性のあ
る変異体を組み込むことにより、コンセンサスまたは天然免疫原設計を改良する。

モザイク抗原は、小規模の実用的な数のワクチン抗原中に存在するエピトープ長変異体
の数を最大化する。鎖状エピトープ（ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅ）のセ
ットをポリエピトープ擬似タンパク質状に連結する(Hanke et al, Vaccine 16:426-35 (1
998))のではなく、天然タンパク質に類似する多数の抗原を使用するという決定を行なっ
た；それは、天然類似ワクチン抗原のインビボプロセシングは自然感染に際してのプロセ
シングにいっそう近似し、オーバーラップするエピトープの適応範囲の拡大も可能にする
であろうという理由からであった。Ｔ細胞モザイク抗原の使用は、強い多価免疫応答に関
して最良であろう；ワクチン設計の他の領域における改良、および多様性をカバーするた
めにモザイク抗原を組み込む最良な方法の組合せは、最終的に、ＨＩＶ−１に対して有効
な交差反応性ワクチン誘導型の免疫応答を可能にすることができる。

実施例２
グループＭコンセンサスエンベロープおよび３価モザイクエンベロープ（両方ともｉｎ
ｓｉｌｉｃｏモデリングにより設計され、野生型エンベロープより優れていると推定さ
れる）を、４アーム免疫原性臨床試験において、１価野生型エンベロープおよび３価野生
型伝播エンベロープと比較する。モザイク抗原は、現時Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓデータベー
スに基づいて設計された；これは、２０００を超える個体からグローバルにサンプリング
された、主としてＣＨＡＶＩデータベースからの伝播ウイルスの配列の大きなセットをも
つ、より多くの全長エンベロープを含むセットである。

比較のために用いる天然株の選択は、下記の基準に基づく：１価天然抗原については、
潜在Ｔ細胞エピトープの適応範囲提供に関してグローバルデータベース中の最良選択であ
る単一の伝播ウイルスを使用する。データベースをＢクレードエンベロープの方へバイア
スさせ、したがってこの単一の最良急性ＥｎｖはＢクレード代表である。サンプリングに
際してのグローバル配列収集に固有なバイアスを補償しかつ循環パンデミック株をより良
く反映させるために、１つのＡ、１つのＢおよび１つのＣサブタイプの伝播ウイルス配列
を３価セットに組み込むものとして提案する。ＡおよびＣ天然配列は、データベースの潜
在的エピトープ適応範囲を提供する最良Ｂクレード配列を最適状態に補充するものである
。ワクチン抗原は、入手可能なＳＧＡ配列決定された急性サンプルから選択され、それぞ
れ伝播ウイルスを代表する。したがって、この試験は主としてＴ細胞試験ではあるが、伝
播エンベロープワクチンが中和抗体を誘発する能力に関しても重要な追加データを提供す
る。

モザイク／コンセンサス−ヒト試験のために、グループ当たり２０人、陰性対照付きの
下記の４アーム試験を提案する：
１）Ｃｏｎ Ｓ（各クレードのコンセンサスの十分に研究されたコンセンサス、２００
２のデータベースに基づく；Ｃｏｎ Ｓは動物モデルにおいて徹底的に試験されており、
ほぼ単一モザイクに匹敵する理論的適応範囲をもつ）；
２）合わせてデータベース中の９アミノ酸長さの配列の最適グローバル適応範囲を提供
するように設計した、３モザイクＭグループ抗原セット。そのような９−ｍｅｒは、その
データベースの潜在的エピトープ適応範囲を表わす。非天然９−ｍｅｒはモザイク中に除
外され、希有変異体は最小限に抑えられる；
３）ＳＧＡ配列を入手できる急性感染患者からサンプリングされた配列から選択した最
適単一最良天然タンパク質；これらの配列は生存可能な伝播配列に相当するはずである。
（２）の場合と同様に、この配列はデータベースの最適９−ｍｅｒ適応範囲を提供するも
のとなるように選択されるであろう。Ｂクレードは配列データベースについてのサンプリ
ングにおいて現時優性であるので、最良データベース適応範囲をもつ配列はＢクレード配
列であろう；
４）合わせて最良グローバル適応範囲を提供する急性感染症ＳＧＡ配列からの最良天然
株（注釈：ＢおよびＣはＭグループサンプリングより優性であるので、コードはそれぞれ
のうちの１つを２つの最良として自然に選択する。したがって、このバイアスに対抗しか
つグローバルな流行をより良く反映させるために、第３の補充配列を急性ＳＧＡ Ａクレ
ードセットから強制的に選択されるようにした）；
５）陰性対照緩衝液／生理食塩水。

ＨＩＶデータベースにおける現時Ｍグループアラインメントをより新しいＣＨＡＶＩ配
列すべてと組み合わせた−これには合計２０２０の配列が含まれる：
７２８ Ｂクレード
５９９ Ｃクレード
６９３ 他のすべてのクレード、循環組換え形、およびユニーク組換え配列。これをＭ
グループワクチン設計に用いた。

このサンプリングは明らかにＢおよびＣクレードの方へ傾いている。後に示すように、
他のクレードの“潜在的エピトープ”（９−ｍｅｒ）の適応範囲がやはり優れている。
配列
Ｍコンセンサス

４ワクチン抗原の適応範囲の比較
モザイクおよび天然配列を各ワクチンにつき左の最初の赤い棒について最適化した（全
体）。この“全体（ｔｏｔａｌ）”は、全配列、すなわちデータベース＋ＣＨＡＶＩを表
わす。“Ｂ”はＢクレードであるサブセット、“Ｃ”はＣクレードであるサブセット、“
Ｎ”はＢまたはＣではない残りのＭグループ配列（他のすべてのクレードおよび組換え配
列）である。Ｂは最大共通であるので、単一最良天然配列はもちろんＢであり、したがっ
てＢはＮａｔ．１について最良適応範囲をもつ。Ｃｏｎ Ｓは、予想通りすべてのクレー
ドについてはるかに均一な適応範囲を提供し、Ｂクレード以外のすべてのグループについ
てより良好な適応範囲を提供する（注釈：Ｃｏｎ Ｓアカゲザル試験において、天然Ｂは
最適化となるように選択されず、Ｃｏｎ ＳはＢクレード内ですら、使用されているＢワ
クチン株より良好な適応範囲をもっていた；これは、不均一Ｂに対して検出された応答の
数に反映されていた。この相異は、最適適応範囲を提供する急性感染症からの天然Ｂクレ
ード配列となるように天然Ｂを選択したことである）。Ｎａｔ．３は、良好な広域適応範
囲を与え、Ｍｏｓ．３はより良好である（図１１を参照）。

モザイクは希有９−ｍｅｒを最小限に抑えるであろうが、Ｅｎｖにおいてそれらを除外
することはできず、あるいは特定の実際に変異性である領域を補って無傷タンパク質を作
製することは不可能である。試験した他のすべてのＨＩＶタンパク質について、３回未満
見られた９−ｍｅｒを除外することが可能であった。それでもなお、３つの最良天然Ｅｎ
ｖは、３Ｅｎｖモザイクと比較して２倍を超える数の希有９−ｍｅｒ変異体を含む。

図１２は、適応範囲の追加のまとめを含む；ＣｏｎＳ ｇｐ１６０は、予想通り、ｇｐ
１４０ＤＣＦＩ中に含まれないごく少数の保存９−ｍｅｒを含む。ＣｏｎＳは単一モザイ
クよりわずかに低い適応範囲を提供するが、ＣｏｎＳはアカゲザルにおいてきわめて良好
に作動することが既に知られているので、良い陽性対照として用いられる。１、２および
３モザイクは漸次、より良好な適応範囲を与え、Ｎａｔ．３はＭｏｓ．３ほど良好ではな
い。

図１３は、アラインメント依存型であり、データベースアラインメントに基づく（これ
の上方の２プロットはアラインメント非依存型である）。各位置は、１つがタンパク質上
を移動するのに伴ってそれが開始する９−ｍｅｒを表わす。上方境界（黒い破線）は、各
位置から出発する３つの最大共通９−ｍｅｒの頻度の和である；それは３つのタンパク質
による適応範囲について達成できる最大限界を表わす；オーバーラップする９−ｍｅｒに
ついての特定位置に矛盾のある可能性があるので、これは実際にはかなり達成不可能であ
るが、３モザイク組合せはそれをきわめて近接して達成する。灰色で示した“全９−ｍｅ
ｒ”が変動する理由は、アラインメントに際しての挿入および欠失のためである。

Ｍｏｓ．３ワクチンカクテルのみを図１３に示す。しかし、図１４には適応範囲により
再ソーティングした４配列すべてを示す；この場合、そのワクチンによって最も良好にカ
バーされる９−ｍｅｒを出発させる位置を左へ移動させる。厳密一致の線は、４プロット
すべてにおいて基準点に対して左にある。Ｍｏｓ．３（赤色）が最大に近づくだけでなく
、交差反応性の潜在性をもつ橙色および黄色の近一致も、他と比較してこのワクチンカク
テルにおいて改良される。

図１５に示すプロットは、全データベースアラインメントにおけるあらゆる配列のあら
ゆるアミノ酸をマッピングする。ピクセルの列は配列であり、カラムはアラインメント位
置である。白色パッチはアラインメントを維持するための挿入である。あるアミノ酸を含
むすべての９−ｍｅｒを考慮する。そのアミノ酸を含むあらゆる９−ｍｅｒがワクチンカ
クテルにおいて完全に一致する場合、そのピクセルは黄色であり、したがって黄色は良で
ある。１つがオフである場合は淡橙色、２つがオフである場合はより濃い橙色．．．．９
−ｍｅｒ一致を含まないものは黒色で表わされる。注釈：３モザイクについては他のワク
チンと比較して多数の黄色。単一最良天然配列はＢクレードであるので、Ｎａｔ．１のＢ
クレードについては最も黄色い大きなパッチがある。すべての濃いビットに注目：これら
の領域において、データベース中の配列はワクチン中のいずれの９−ｍｅｒとも異なるの
で、交差反応性は幾らか限定されるであろう。

９−ｍｅｒを使用する最適化
９−ｍｅｒを選択したのは、それが最適ＣＤ８＋ Ｔ細胞エピトープの最大共通のサイ
ズだからである。それらは８〜１２の範囲にわたり、最適ＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープは
これより大きいかまたは小さい可能性すらある。分かるように、９−ｍｅｒの適応範囲は
９−ｍｅｒ適応範囲について最適化した際に最良であるが、異なるサイズに対して最適化
した場合には９−ｍｅｒについての適応範囲はごくわずかに低下する。すべての長さ８〜
１２について同じことが当てはまり、ピーク適応範囲は選択したサイズについてであるが
、その適応範囲は解に関する限り他の長さについても優れている。９−ｍｅｒと１２−ｍ
ｅｒの対比を図１６に示す；１２は妥当と考えられる最大極限値である。適応範囲は、９
もしくは１２について最適化した９−ｍｅｒ、または９もしくは１２について最適化した
１２−ｍｅｒについて、ほぼ同一である；それは最適化のために選択した長さについて他
より１〜２％高い。当然、１２−ｍｅｒは一般に９−ｍｅｒより少ない同一性をもつ；そ
れらはより長いので完全一致を見出すのがより困難だからである。これにつきＨＩＶタン
パク質に関してより包括的な試験を行なって、１２−ｍｅｒについては９−ｍｅｒにおい
て最適化した場合に逆の場合より損失が一貫して大きく、他のタンパク質においてはこの
差は最高４〜５％となる可能性があることが示された。したがって、Ｅｎｖについては９
−ｍｅｒの選択は問題がより少ない。以上のすべてを考慮して、９−ｍｅｒを選択した；
これは最大共通の最適ＣＴＬエピトープ長さであり、かつ９−ｍｅｒの最適適応範囲は他
の長さについて近接する最適適応範囲を提供するからである。

３つの最良天然株についてのオプション：急性伝播症例、ＳＧＡ配列
ワクチンカクテル用の天然株源としてすべてのデータベース配列の使用をまず探索し、
次いでそれと、本質的に伝播ウイルスである急性ＳＧＡ配列だけの限定したグループから
の選択との比較を行なった。急性感染症配列に限定することにより、本質的に全データベ
ースに匹敵する適応範囲を得ることができた。これらは他の明らかな利点をもつので、そ
れらを天然配列として使用する。

最初に、全データベースを天然カクテル源として用いて適応範囲を探索した。前記のよ
うに、現時のＭグループＥｎｖ 一人当たり１配列のデータセットはＢクレード感染症が
優性であり、Ｃクレードがこれに近接して続く。したがって、（データベース＋ＣＨＡＶ
Ｉ）データセットにおいて９−ｍｅｒをカバーするワクチン設計プログラムにより選択さ
れる単一最良最適天然配列はＢである。もしデータベース中のいずれかの配列から１つを
抜き出すと、ＹＵ−２が最良単一配列として現れる。他のクレードをより良好に提示する
ために、最良のＢを固定し、次いでＹＵ−２に補充するために次の最良配列を追加した：
これは（理論的に）Ｃクレード配列ＤＵ４６７である。次いでこれら２つを固定し、第３
の補充抗原を選択した（最初の２つを固定せずにプログラムに第３を選択させると、理論
的にＢ／Ｃ組換え配列を見出すので、Ａを選択するように強制しなければならない。ＡＢ
Ｃセットの強制はグローバル適応範囲を改良し、かつ配列間のＢ＆Ｃクレードサンプリン
グのバイアスに部分的に対抗すると考えられる）。

データベースからの最適天然配列は、より古い配列へ逆戻りする傾向がある；より古い
配列ほど系統樹の中央にあり、したがって他の循環株にいっそう類似する傾向があるので
、これは意外ではない。しかし、この試験には、急性感染に際してサンプリングしてＳＧ
Ａにより配列決定した、より同時代のエンベロープタンパク質を用いるのが好ましい；こ
れらの配列は伝播ウイルスを厳密に反映するからである。この拘束を考えると、天然配列
のカクテルにモザイクとの比較に際して成功する最良の機会が与えられるように、９−ｍ
ｅｒ適応範囲について最適化するのがやはり望ましい。これを行なうと、急性ＳＧＡ配列
のうちから選択した３価カクテルを全データベースから選択した３価抗原と比較した際、
適応範囲の損失がきわめて小さいことが分かった（両方の場合とも、全データベースの適
応範囲について最適化する）。したがって、抗原カクテルを伝播ウイルスに限定すること
により適応範囲が損なわれることはない。この代替法は幾つかの利点をもつ。最も重要な
ことは、これにより、Ｔ細胞応答適応範囲の幅の比較に注目した一次エンドポイントを損
なうことなく、二次的な目的エンドポイントとして、天然カクテルに用いた急性感染症ウ
イルスから産生された抗体の交差反応力価をコンセンサスまたはモザイクに関して決定で
きることである。ＣＨＡＶＩ試験から配列決定したＢ（１１３）およびＣ（４０）クレー
ド急性サンプルの大きなセットを入手でき、最適組合せを選択するための大きなデータセ
ットが得られる。Ａクレードから補充配列を選択してＢおよびＣを３価ワクチンに完成す
るために、幾つかの急性配列が得られた。

８サブタイプのＡ ｇｐ１６０を含むｇｐ１６０の分析を行ない、Ｖ１−Ｖ４中の１５
すべてについての下位領域分析も行なって、より多くの配列決定が必要かどうかの指標を
得た。幸い、入手可能な全長配列のひとつが、ＢおよびＣ急性配列に対する優れた補充配
列となった；これは、本質的に他のいずかと同様に良好である。この比較により、この時
点でより多くの配列決定をする特別な必要はないことが示された。これはそのような限定
したＡベースラインで選択するのに適切であると考えられる；Ａ配列は選択したＢおよび
Ｃクレード株に補充することが必要であるにすぎず、選択する多くのＢおよびＣがあった
からである。Ｎａｔ．３カクテルが由来する２人の患者は下記のものである。Ｎａｔ．１
は最初の人そのものである。

Ｂ患者１０５９
患者の性別＝Ｍ
リスク因子＝ＰＰＤ
サンプルの国籍＝米国
サンプルの市＝カリフォルニア州ロングビーチ
患者のコホート＝ＣＡ−ＵＣＳＦ
患者の健康状態＝急性
ウイルス負荷＝２，８００，０００
感染国＝米国
サンプルの日付＝０３／２６／９８
Ｃ患者０３９３
Ｆｉｅｂｉｇ病期＝４
感染国＝マラウイ
サンプルの日付＝１７−Ｊｕｌ−２００３
ウイルス負荷＝１２，０４８，４８５
患者の性別＝Ｆ
ＣＤ４カウント＝６１８（サンプルの配列決定後、１３日目に測定）
患者の年齢＝２３
ＳＴＤ＝ＧＵＤ、ＰＩＤ
図１７および１８は、急性ＳＧＡ配列から選択する際の適応範囲の最小損失、および３
患者のエンベロープ配列それぞれのハイライタープロットを示す；これは、各患者のコン
センサスが最大共通株と同等であり、したがって急性伝播ウイルスの優れた推定値である
ことを示す。

なぜＭグループ特異的適応範囲であってクレード特異的適応範囲ではないか？
多くの国に多重クレードの流行があり、かつ人々は旅行するので、もし可能であれば、
これらのような探索方法でグローバルＨＩＶワクチンを得ることを試みるのが重要である
と考えられる。クレード内（ｉｎｔｒａ−ｃｌａｄｅ）適応範囲はクレード内で（ｗｉｔ
ｈｉｎ−ｃｌａｄｅ）最適化したワクチンによって確実に取得できるが、そのような方法
の結果としてクレード間適応範囲の著しい損失が生じるであろう。多価モザイクは実質的
にいかなるクレードまたは組換え体のウイルスにも対抗するのに十分な幅を提供できるで
あろうと期待する。サブタイプ特異的設計と対比したＥｎｖ Ｍグループ特異的設計の適
応範囲に関する妥協点と利点を図１９に示す。

なぜＥｎｖか？
この概念証明試験は、Ｅｎｖを試験抗原として用いた応答の幅の相異を調べるために十
分に確立されている。その理由は、一部は本明細書に記載した理論的考察によるものであ
り（ＥＮＶは最良天然株と比較してモザイク中に２倍多い保存９ｍｅｒをもち、希有変異
体は半数にすぎない）、一部はこれまでの動物試験によるものである。アカゲザルにおい
て天然と対比したコンセンサスについてのＥｎｖ試験は、応答幅において著しく有意な増
大を示した：Ｅｎｖタンパク質当たり３〜４倍多いエピトープが認められた(Santra et a
l, in press, PNAS)。Ｅｎｖモザイクは、マウス試験ではよりいっそう顕著な利点を示し
た（同等数の天然抗原より最高１０倍；ＶＲＣと共同で原稿を作成中）。先行するこの研
究に基づいて、Ｅｎｖに対する応答の幅を試験する小規模なヒト試験から開始するのは理
にかなっている。最終的に、Ｅｎｖについて得た概念証明をより保存されたタンパク質、
たとえば最大幅の保護を提供できる可能性があるＧａｇに適用することを期待する。Ｇａ
ｇは優れた全Ｍグループ適応範囲を与える。４モザイクワクチンカクテル法を用いて、Ｇ
ａｇおよびＮｅｆの試験がアカゲザルにおいて進行中である（実施例３を参照）。現時デ
ータベースに対比したアカゲザル４モザイクＧａｇワクチンおよび提唱したヒトＥｎｖ
３モザイクワクチンの適応範囲比較は、図２０にある。Ｇａｇワクチンの方に交差反応性
について大きな理論的力価があるが、Ｅｎｖの方が動物モデルで現在まで多くの進歩がな
されているので、Ｅｎｖは前進を正当化するための最良の根拠をもつ。前記の３モザイク
Ｅｎｖ配列および実施例３に用いた配列を図２１に示す。

ＤＮＡ
使用するＤＮＡは全ｇｐ１６０ Ｅｎｖの形であろう。ｇｐ１６０はＰＣＭＶＲプラス
ミド（Ｇａｒｙ Ｎａｂｅｌ）中にあり、すべてのＶＲＣ ＤＮＡ免疫化試験に用いる同
一プラスミドであろう。用量は４ｍｇと予想される。下記のＤＮＡ構築体を使用する：
・ＤＮＡ最適野生型Ｅｎｖ伝播／創始ｅｎｖ（ＷＴ Ｅｎｖ）
・ＤＮＡグループＭコンセンサスＥｎｖ（ＣｏｎＳ Ｅｎｖ）
・ＤＮＡ３価最適野生型伝播／創始Ｅｎｖ（ＷＴ Ｔｒｉ Ｅｎｖ）
・ＤＮＡ３価モザイクＥｎｖ
ＮＹＶＡＣ
ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）は組換えポックスウイルスベクターであり、これは野生型ウ
イルスと対比して１８の遺伝子欠失をもつ。ＮＹＶＡＣベクターはＳａｎｏｆｉ−Ｐａｓ
ｔｅｕｒからライセンスを受け、第三契約者が製造し、ＣＥＦ支持細胞上で増殖させる。
ＮＹＶＡＣ中で発現したＥｎｖ構築体は、ｇｐ１４０Ｃ（Ｅｎｖ全体において、膜貫通ド
メインおよび細胞質ドメインを欠失し、ｇｐ４１／ｇｐ１２０開裂部位が変異したもの）
であるか、または完全ｇｐ１６０であろう。構築体設計の選択は、ｇｐ１４０と対比して
ｇｐ１６０形を含むＮＹＶＡＣを作成する能力に依存するであろう。ＮＹＶＡＣの用量は
約１ｘ１０ ^７ ＴＣＩＤ５０と予想される。下記のＮＹＶＡＣ構築体を使用する：
・ＮＹＶＡＣ ＷＴ Ｅｎｖ
・ＮＹＶＡＣ ＣｏｎＳ Ｅｎｖ
・ＮＹＶＡＣ３価天然Ｅｎｖ
・ＮＹＶＡＣ３価モザイクＥｎｖ
ワクチン接種は筋肉内注射により行なわれるであろう。

WT: 野生型 Placebo: プラセボ ConS: コンセンサス Trivalent: ３価 Native:
天然配列 Mosaic: モザイク
参加者：
健康、ＨＩＶ−１非感染ボランティア、年齢１８〜５０歳：
８０人のワクチン被接種者
１６人の対照レシピエント
９６人の合計参加者
設計：
ランダム化、プラセボ対照付き、二重盲検試験
参加者当たりの期間：
約１２か月
推定全試験期間：
約１８か月。

実施例３
プラスミドＤＮＡワクチンおよび組換えワクシニア（ｒＶＶ）の構築。ＧａｇおよびＮ
ｅｆ、グループＭコンセンサスＧａｇおよびＮｅｆ ＣＯＮ−Ｓのアミノ酸配列を、最適
遺伝子発現のための方法を用いてヌクレオチド配列に変換することにより、モザイクｇａ
ｇおよびｎｅｆ遺伝子、グループＭコンセンサスｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子を作製した。
ＤＮＡワクチンとして使用するために、モザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子、グループＭ
コンセンサスｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子を、ＷＬＶ０００１−ＡＭ ＤＮＡワクチンベク
ター内へサブクローニングした。アカゲザルの免疫化のために、内毒素を含まないプラス
ミドＤＮＡ調製物をＰｕｒｅｓｙｎ，Ｉｎｃ．（ペンシルベニア州モールバーン）が製造
した。追加免疫化のために、個々のモザイクｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子、グループＭコン
センサスｇａｇおよびｎｅｆ遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスを作製した。使
用した方法は先に記載されている(Liao et al, Virology 353:268-282 (2006); Earl, Bi
oTechniques 23:1094-1097 (1997))。

実験グループおよびワクチン接種計画。３グループのアカゲザルを、１０ｍｇの空のＤ
ＮＡベクタープラスミド（グループ１、６匹のサル）、または各５ｍｇのグループＭ ｇ
ａｇおよびｎｅｆプラスミドＤＮＡ（グループ２、１２匹のサル）、または各１．２５ｍ
ｇの４モザイクｇａｇおよび４ ｎｅｆプラスミドＤＮＡ（グループ３、１２匹のサル）
のいずれかで、０および３０日目に筋肉内免疫化した。初回免疫化免疫原を発現する対応
するｒＶＶ（１０^９ｐｆｕ／サル）で、２回目のＤＮＡ免疫化による免疫化の５か月後に
、サルを追加免疫化する。

ＧａｇおよびＮｅｆのミリストイル化は免疫応答に対して潜在的ダウンレギュレーショ
ン作用をもつので、この試験に用いた配列においてはＧａｇおよびＮｅｆのミリストイル
化を変異させた。

前記に引用したすべての文書その他の情報の全体を本明細書に援用する。

Claims (9)

1. 図２１または図２２に示す少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、ポリペプチドまたは
   タンパク質。
2. 請求項１に記載のポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸。
3. 図２２に示す少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む核酸。
4. 請求項２または３に記載の核酸を含むベクター。
5. ベクターがウイルスベクターである、請求項３に記載のベクター。
6. 請求項１に記載の少なくとも１つのポリペプチドまたはタンパク質およびキャリヤーを
   含む組成物。
7. 請求項２または３に記載の少なくとも１つの核酸およびキャリヤーを含む組成物。
8. 哺乳動物において免疫応答を誘導する方法であって、哺乳動物にその誘導を生じるのに
   十分な量の請求項１に記載の少なくとも１つのポリペプチドまたはタンパク質を投与する
   ことを含む方法。
9. 哺乳動物において免疫応答を誘導する方法であって、その誘導を生じるのに十分な量の
   請求項２または３に記載の少なくとも１つの核酸をその哺乳動物に投与することを含む方
   法。

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