JP2014132001A - Novel cell penetration type fluorescent dye - Google Patents

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JP2014132001A JP2014005191A JP2014005191A JP2014132001A JP 2014132001 A JP2014132001 A JP 2014132001A JP 2014005191 A JP2014005191 A JP 2014005191A JP 2014005191 A JP2014005191 A JP 2014005191A JP 2014132001 A JP2014132001 A JP 2014132001A
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salt
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hydroxy
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JP2014005191A
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Tatsuro Arai
達郎 新井
Yoshihiro Miwa
佳宏 三輪
Naoko Senda
直子 千田
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University of Tsukuba NUC
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University of Tsukuba NUC
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a fluorescent dye molecule capable of being applied as a skeleton of a cell introduction type probe corresponding to novel multicolor imaging, and to provide a synthesis method and a purification method.SOLUTION: There is provided a compound having 7-hydroxy quinoline skeleton represented by the formula (I), a derivative thereof or a salt thereof. In the formula (I), Ris H, a carbonyl group and the like, Ris null or Calkyl, alkylphenyl, Ris H, Calkyl, carbonyl, alkylcarbonyl or alkylamide, Xand Xare each independently selected from (C)alkyl, aryl(C)alkyl, (C)cycloalkyl, hetero(C)cycloalkyl, heteroaryl(C)alkyl, aryl and heteroaryl, which is each substituted or unsubstituted, n is 0 to 3 and m is 0 to 2.

Description

本発明は、細胞透過型新規蛍光色素に関する。特に、マルチカラーイメージングに対応
した蛍光プロープに関する。
The present invention relates to a novel cell-permeable fluorescent dye. In particular, it relates to a fluorescent probe that supports multi-color imaging.

従来技術では、蛍光色素の多くがストークスシフトの小さい化合物であるため、マルチ
カラーイメージングにおいて併用することが困難であったまた、分子設計を少し変えるこ
とでその蛍光挙動を制御できる色素骨格は稀であった。
In the prior art, most of the fluorescent dyes are compounds with small Stokes shift, so it was difficult to use them together in multicolor imaging. In addition, there are rare dye skeletons that can control the fluorescent behavior by slightly changing the molecular design. there were.

7−ヒドロキシキノリン骨格はストークスシフトが大きいためマルチカラーイメージン
グに適している。また7位の水酸基の構造により蛍光特性が変化するため、リン酸分解酵
素活性の基質として細胞外で用いた例は報告されている。(特許文献1)
Since the 7-hydroxyquinoline skeleton has a large Stokes shift, it is suitable for multicolor imaging. In addition, since the fluorescence characteristics vary depending on the structure of the hydroxyl group at the 7-position, examples of using it extracellularly as a substrate for phosphatase activity have been reported. (Patent Document 1)

ES2246134A1ES2246134A1

Francisco Caturla et al, New fluorescent probes for testing combinatorial catalysts with phosphodiesterase and esterase activities., Tetrahedron, 2004, Vol. 60, No.8, p.1903-1911Francisco Caturla et al, New fluorescent probes for testing combinatorial catalysts with phosphodiesterase and esterase activities., Tetrahedron, 2004, Vol. 60, No. 8, p.1903-1911 In Kyung Rhee et al, Determining Acetylcholinesterase Inhibitory Activity in Plant Extracts Using a Fluorimetric Flow Assay., Phytochem. Anal., 2003, Vol. 14, No. 3, p.145-149In Kyung Rhee et al, Determining Acetylcholinesterase Inhibitory Activity in Plant Extracts Using a Fluorimetric Flow Assay., Phytochem. Anal., 2003, Vol. 14, No. 3, p.145-149

7−ヒドロキシキノリン骨格そのものは細胞膜を透過しないため、細胞導入型の蛍光プ
ローブに応用することは困難であった。
Since the 7-hydroxyquinoline skeleton itself does not penetrate the cell membrane, it was difficult to apply it to a cell-introduced fluorescent probe.

このような状況下、あらたな骨格の蛍光色素分子を開発し、その合成方法、精製方法も
合わせて開発し、細胞導入型プロープの骨格として応用することが求められている。
Under such circumstances, it is required to develop a fluorescent dye molecule having a new skeleton, to develop a synthesis method and a purification method thereof, and to apply it as a skeleton of a cell introduction type probe.

したがって、本発明は、以下の化合物、その誘導体またはそれらの塩、これらを含む(
細胞導入用の)蛍光組成物、これらの化合物等を用いた細胞標識法、これらの化合物等の
製造方法を提供する。
[1]下記式(I)で表される化合物、その誘導体、またはそれらの塩:


(式中、
は、水素原子、カルボニル基、C1−6アルキルカルボニル基、またはアルキルエ
ステル(リン酸など)であり、
は、存在しないか、またはC1−6アルキル、アルキルフェニル、アルキルカルボ
ニル、もしくはアルキルアミドであり、
は、水素原子、置換基で置換されていてもよいC1−6アルキル、カルボニル、ア
ルキルカルボニル、またはアルキルアミドであり、
およびXはそれぞれ独立して、(C1−3)アルキル、アリール(C1−3)ア
ルキル、(C3−12)シクロアルキル、ヘテロ(C3−12)シクロアルキル、ヘテロ
アリール(C1−3)アルキル、アリール及びヘテロアリール(それぞれ置換又は無置換
)からなる群より選ばれ、
nは、0、1、2、または3であり、
mは、0、1、または2である)。
[2]Rが水素原子またはメチルカルボニル基であり、
が存在しないか、またはメチルであり、
がメチルエチルホルマートであり、
がメチルであり、
nが0であり、
mが1である、上記[1]に記載の化合物、その誘導体、またはそれらの塩。
[3]下記式(II)で表される化合物、その誘導体、またはそれらの塩:

(式中、
は、水素原子、カルボニル基、C1−6アルキルカルボニル基、またはアルキルエ
ステル(リン酸など)であり、
は、存在しないか、またはC1−6アルキル、アルキル−フェニル、アルキル−カ
ルボニル、もしくはアルキル−アミドである。)。
[4]エチル2−(7−ヒドロキシ−2−メチルキノリン−4−イル)アセタート(ethy
l 2-(7-hydroxy-2-methylquinolin-4-yl)acetate);
エチル2−(7−アセトキシ−2−メチルキノリン−4−イル)アセタート(ethyl 2-
(7-acetoxy-2-methylquinolin-4-yl)acetate);
7−アセトキシ−4−(2−エトキシ−2−オキソエチル)−1,2−ジメチルキノリ
ニウム(7-acetoxy-4-(2-ethoxy-2-oxoethyl)-1,2-dimethylquinolinium);
7−ヒドロキシ−4−(2−エトキシ−2−オキソエチル)−1,2−ジメチルキノリ
ニウム(7-hydroxy-4-(2-ethoxy-2-oxoethyl)- 1,2-dimethylquinolinium);
これらの誘導体、またはこれらの塩。
[5]7−アセトキシ−4−(2−エトキシ−2−オキソエチル)−1,2−ジメチルキ
ノリニウム(7-acetoxy-4-(2-ethoxy-2-oxoethyl)-1,2-dimethylquinolinium);
7−ヒドロキシ−4−(2−エトキシ−2−オキソエチル)−1,2−ジメチルキノリ
ニウム(7-hydroxy-4-(2-ethoxy-2-oxoethyl)- 1,2-dimethylquinolinium);
これらの誘導体、またはこれらの塩。
[6]上記[1]〜[5]のいずれかに記載の化合物、その誘導体、またはそれらの塩を
含む、蛍光組成物。
[7]下記式(III)で表される化合物、その誘導体、またはそれらの塩を含む、細胞
内導入用蛍光組成物:


(式中、Rは、水素原子、カルボニル基、C1−6アルキルカルボニル基、またはアル
キルエステル(リン酸など))であり、
は、存在しないか、またはC1−6アルキル、アルキルフェニル、アルキルカルボ
ニル、もしくはアルキルアミドである。)。
[8]Rが水素原子またはメチルカルボニル基であり、
が存在しないか、またはメチルである、上記[7]に記載の細胞内導入用蛍光組成
物。
[9]7−アセトキシ−1−メチルキノリニウム(7-acetoxy-1-methylquinolinium);
7−ヒドロキシ−1−メチルキノリニウム(7-hydroxy-1-methylquinolinium);
これらの誘導体、およびこれらの塩からなる群から選択される1つ以上の化合物、その誘
導体、またはそれらの塩を含む、細胞内導入用蛍光組成物。
[10]細胞の標識もしくはイメージングのため、または細胞内酵素活性の検出プローブ
として使用するための、上記[1]〜[5]のいずれかに記載の化合物、その誘導体、も
しくはこれらの塩、または上記[6]〜[9]のいずれかに記載の蛍光組成物。
[11]細胞を標識する方法であって、
細胞と、上記[1]〜[5]のいずれかに記載の化合物、その誘導体、もしくはそれら
の塩、または上記[6]〜[9]のいずれかに記載の細胞内導入用蛍光組成物とを溶液中
で混合し、所定時間インキュベートする工程を含む、方法。
[12]m−アミノフェノールと3−オキソ酪酸エチルエステルとを、BiClの存在
下で混合することを含む、エチル2−(7−ヒドロキシ−2−メチルキノリン−4−イル
)アセタート(ethyl 2-(7-hydroxy-2-methylquinolin-4-yl)acetate)の合成方法。
Accordingly, the present invention includes the following compounds, derivatives thereof or salts thereof (
Provided are fluorescent compositions (for cell introduction), cell labeling methods using these compounds, and methods for producing these compounds.
[1] A compound represented by the following formula (I), a derivative thereof, or a salt thereof:


(Where
R 1 is a hydrogen atom, a carbonyl group, a C 1-6 alkylcarbonyl group, or an alkyl ester (such as phosphoric acid);
R 2 is absent or is C 1-6 alkyl, alkylphenyl, alkylcarbonyl, or alkylamide;
R 3 is a hydrogen atom, C 1-6 alkyl optionally substituted with a substituent, carbonyl, alkylcarbonyl, or alkylamide;
X 1 and X 2 are each independently (C 1-3 ) alkyl, aryl (C 1-3 ) alkyl, (C 3-12 ) cycloalkyl, hetero (C 3-12 ) cycloalkyl, heteroaryl ( C 1-3 ) selected from the group consisting of alkyl, aryl and heteroaryl (each substituted or unsubstituted),
n is 0, 1, 2, or 3;
m is 0, 1, or 2.
[2] R 1 is a hydrogen atom or a methylcarbonyl group,
R 2 is absent or is methyl;
R 3 is methyl ethyl formate;
X 2 is methyl,
n is 0,
The compound according to [1], a derivative thereof, or a salt thereof, wherein m is 1.
[3] A compound represented by the following formula (II), a derivative thereof, or a salt thereof:

(Where
R 1 is a hydrogen atom, a carbonyl group, a C 1-6 alkylcarbonyl group, or an alkyl ester (such as phosphoric acid);
R 2 is absent or is C 1-6 alkyl, alkyl-phenyl, alkyl-carbonyl, or alkyl-amide. ).
[4] Ethyl 2- (7-hydroxy-2-methylquinolin-4-yl) acetate (ethy
l 2- (7-hydroxy-2-methylquinolin-4-yl) acetate);
Ethyl 2- (7-acetoxy-2-methylquinolin-4-yl) acetate (ethyl 2-
(7-acetoxy-2-methylquinolin-4-yl) acetate);
7-acetoxy-4- (2-ethoxy-2-oxoethyl) -1,2-dimethylquinolinium;
7-hydroxy-4- (2-ethoxy-2-oxoethyl) -1,2-dimethylquinolinium;
These derivatives, or salts thereof.
[5] 7-acetoxy-4- (2-ethoxy-2-oxoethyl) -1,2-dimethylquinolinium ;
7-hydroxy-4- (2-ethoxy-2-oxoethyl) -1,2-dimethylquinolinium;
These derivatives, or salts thereof.
[6] A fluorescent composition comprising the compound according to any one of [1] to [5], a derivative thereof, or a salt thereof.
[7] A fluorescent composition for introduction into a cell comprising a compound represented by the following formula (III), a derivative thereof, or a salt thereof:


(Wherein R 1 is a hydrogen atom, a carbonyl group, a C 1-6 alkylcarbonyl group, or an alkyl ester (such as phosphoric acid)),
R 2 is absent or is C 1-6 alkyl, alkylphenyl, alkylcarbonyl, or alkylamide. ).
[8] R 1 is a hydrogen atom or a methylcarbonyl group,
The fluorescent composition for intracellular introduction according to [7] above, wherein R 2 is absent or is methyl.
[9] 7-acetoxy-1-methylquinolinium;
7-hydroxy-1-methylquinolinium;
A fluorescent composition for intracellular introduction, comprising one or more compounds selected from the group consisting of these derivatives and salts thereof, derivatives thereof, or salts thereof.
[10] The compound according to any one of the above [1] to [5], a derivative thereof, or a salt thereof, for labeling or imaging of a cell, or for use as a detection probe for intracellular enzyme activity, The fluorescent composition according to any one of [6] to [9].
[11] A method for labeling cells,
A cell, the compound according to any one of the above [1] to [5], a derivative thereof, or a salt thereof, or the fluorescent composition for intracellular introduction according to any one of the above [6] to [9] Mixing in a solution and incubating for a predetermined time.
[12] Ethyl 2- (7-hydroxy-2-methylquinolin-4-yl) acetate comprising mixing m-aminophenol and 3-oxobutyric acid ethyl ester in the presence of BiCl 3 -(7-hydroxy-2-methylquinolin-4-yl) acetate) synthesis method.

本発明により、7−ヒドロキシキノリン(本明細書中、「HQ」と略す場合がある。)の
新規誘導体が提供される。本発明者らは、本発明の一実施形態として7−ヒドロキシキノ
リンの2,4位およびNを化学修飾した新規誘導体を合成し、この化合物のヒドロキシル基
を任意の構造で保護・脱保護して化学構造を変化させることで、自発的に細胞内に導入さ
れ、蛍光のON/OFFがコントロール可能な蛍光プローブが設計できることを見出した。こ
のプローブは、スト−クスシフトが非常に大きく、マルチカラーイメージングに対応して
おり、また蛍光量子収率も大きいという利点を有する。
According to the present invention, a novel derivative of 7-hydroxyquinoline (hereinafter sometimes abbreviated as “HQ”) is provided. As an embodiment of the present invention, the present inventors synthesized a novel derivative obtained by chemically modifying the 2,4-position and N of 7-hydroxyquinoline, and protecting / deprotecting the hydroxyl group of this compound with an arbitrary structure. It was found that by changing the chemical structure, a fluorescent probe that can be spontaneously introduced into a cell and control ON / OFF of fluorescence can be designed. This probe has the advantage that the stokes shift is very large, is compatible with multi-color imaging, and has a high fluorescence quantum yield.

具体的には、新規誘導体として、例えば、エチル2−(7−ヒドロキシ−2−メチルキ
ノリン−4−イル)アセタート(本明細書中、「meHQ」と略すことがある。)が提供され
る。通常7-ヒドロキシキノリン(HQ)骨格そのままでは細胞に導入できないが、この新規誘
導体のヒドロキシル基をアセチル化して蛍光を発しないように物性を変化させ、またNメ
チル化することで膜透過性を向上させることにより、細胞膜を透過し細胞内のみで黄色い
蛍光を発する色素7−アセトキシ−4−(2−エトキシ−2−オキソエチル)−1,2−
ジメチルキノリニウム(本明細書中、「mmeHQ-Ac」と略すことがある。)が得られる。
Specifically, for example, ethyl 2- (7-hydroxy-2-methylquinolin-4-yl) acetate (may be abbreviated as “meHQ” in the present specification) is provided as a novel derivative. Normally, 7-hydroxyquinoline (HQ) skeleton cannot be introduced into cells as it is, but the membrane properties are improved by acetylating the hydroxyl group of this new derivative to change its properties so that it does not emit fluorescence, and by N-methylation. The dye 7-acetoxy-4- (2-ethoxy-2-oxoethyl) -1,2- which penetrates the cell membrane and emits yellow fluorescence only inside the cell.
Dimethylquinolinium (in this specification, sometimes abbreviated as “mmeHQ-Ac”) is obtained.

本発明により、自発的に細胞内に導入され、蛍光のON/OFFがコントロール可能な蛍光
プローブが提供される。
According to the present invention, there is provided a fluorescent probe that is spontaneously introduced into a cell and can control ON / OFF of fluorescence.

本発明により、マルチカラーイメージングに対応した蛍光プローブ開発を、容易な設計
・合成により可能となる。
According to the present invention, it is possible to develop a fluorescent probe corresponding to multi-color imaging by easy design and synthesis.

本発明の一実施形態に係る化合物およびその誘導体を示す図である。It is a figure which shows the compound which concerns on one Embodiment of this invention, and its derivative (s). 本発明の一実施形態に係る誘導体の合成法の一例を示す図である。It is a figure which shows an example of the synthesis method of the derivative | guide_body which concerns on one Embodiment of this invention. 本発明の一実施形態に係る(A)7−アセトキシ−1−メチルキノリニウム(mHQ-Ac)、および(B)7−アセトキシ−4−(2−エトキシ−2−オキソエチル)−1,2−ジメチルキノリニウム(mmeHQ-Ac)の加水分解前および後の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルを示す図である。mHQ-AcもmmeHQ-Acも加水分解されると、吸収波長が長波長シフトし、無蛍光性であったものが500nm付近を極大波長に有する黄色い蛍光を発するようになる。(A) 7-acetoxy-1-methylquinolinium (mHQ-Ac) and (B) 7-acetoxy-4- (2-ethoxy-2-oxoethyl) -1,2 according to one embodiment of the present invention FIG. 2 is a graph showing absorption spectra and fluorescence spectra before and after hydrolysis of dimethylquinolinium (mmeHQ-Ac). When both mHQ-Ac and mmeHQ-Ac are hydrolyzed, the absorption wavelength shifts by a long wavelength, and what is non-fluorescent emits yellow fluorescence having a maximum wavelength around 500 nm. 本発明の一実施形態に係る(A)7−アセトキシ−1−メチルキノリニウム、および(B)7−アセトキシ−4−(2−エトキシ−2−オキソエチル)−1,2−ジメチルキノリニウムをそれぞれ細胞に添加したときの蛍光顕微鏡観察結果を示す図である。(A) 7-acetoxy-1-methylquinolinium and (B) 7-acetoxy-4- (2-ethoxy-2-oxoethyl) -1,2-dimethylquinolinium according to an embodiment of the present invention It is a figure which shows a fluorescence-microscope observation result when each is added to the cell. 本発明の一実施形態に係る(A)7−アセトキシ−1−メチルキノリニウム、および(B)7−アセトキシ−4−(2−エトキシ−2−オキソエチル)−1,2−ジメチルキノリニウムをそれぞれ細胞に添加したときのフローサイトメトリー結果を示す図である。(A) 7-acetoxy-1-methylquinolinium and (B) 7-acetoxy-4- (2-ethoxy-2-oxoethyl) -1,2-dimethylquinolinium according to an embodiment of the present invention It is a figure which shows the flow cytometry result when each is added to the cell. 本発明の一実施形態に係る7−アセトキシ−4−(2−エトキシ−2−オキソエチル)−1,2−ジメチルキノリニウムを細胞に添加し、PI染色したときのフローサイトメトリー結果を示す図である。The figure which shows the flow cytometry result when 7-acetoxy-4- (2-ethoxy-2-oxoethyl) -1,2-dimethylquinolinium which concerns on one Embodiment of this invention is added to a cell, and PI dyeing | staining is carried out. It is.

本発明は、一実施形態において、下記式(I)で表される化合物、その誘導体、または
それらの塩:


(式中、
は、水素原子、カルボニル基、C1−6アルキルカルボニル基、またはアルキルエ
ステルであり、
は、存在しないか、またはC1−6アルキル、アルキルフェニル、アルキルカルボ
ニル、もしくはアルキルアミドであり、
は、水素原子、置換基で置換されていてもよいC1−6アルキル、カルボニル、ア
ルキルカルボニル、またはアルキルアミドであり、
およびXはそれぞれ独立して、C1−3アルキル、アリール(C1−3)アルキ
ル、C3−12シクロアルキル、ヘテロ(C3−12)シクロアルキル、ヘテロアリール
(C1−3)アルキル、アリール及びヘテロアリール(それぞれ置換又は無置換)からな
る群より選ばれ、
nは、0、1、2、または3であり、
mは、0、1、または2である)を提供する。典型的には、上記化合物は、蛍光色素で
ある。
In one embodiment, the present invention provides a compound represented by the following formula (I), a derivative thereof, or a salt thereof:


(Where
R 1 is a hydrogen atom, a carbonyl group, a C 1-6 alkylcarbonyl group, or an alkyl ester;
R 2 is absent or is C 1-6 alkyl, alkylphenyl, alkylcarbonyl, or alkylamide;
R 3 is a hydrogen atom, C 1-6 alkyl optionally substituted with a substituent, carbonyl, alkylcarbonyl, or alkylamide;
X 1 and X 2 are each independently C 1-3 alkyl, aryl (C 1-3 ) alkyl, C 3-12 cycloalkyl, hetero (C 3-12 ) cycloalkyl, heteroaryl (C 1-3 ) Selected from the group consisting of alkyl, aryl and heteroaryl (each substituted or unsubstituted);
n is 0, 1, 2, or 3;
m is 0, 1, or 2. Typically, the compound is a fluorescent dye.

で表されるC1−6アルキルカルボニル基における「C1−6アルキル」としては
、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブ
チル、tert−ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。
Examples of the “C 1-6 alkyl” in the C 1-6 alkylcarbonyl group represented by R 1 include methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, hexyl and the like. Is mentioned.

で表されるアルキルエステルの「アルキル」としては、例えば、C1−6アルキル
が挙げられ、C1−6アルキルとしては、例えば、上記のものと同様のものが挙げられる
。エステルとしては、リン酸エステルなどが挙げられる。
Examples of the “alkyl” of the alkyl ester represented by R 1 include C 1-6 alkyl, and examples of the C 1-6 alkyl include the same as those described above. Examples of esters include phosphate esters.

で表されるC1−6アルキルとしては、Rについて上記のC1−6アルキルの例
と同様のものが挙げられる。
As the C 1-6 alkyl represented by R 2, include those for R 1 in the same manner as the above examples of C 1-6 alkyl.

で表されるアルキルフェニル、アルキルカルボニル、およびアルキルアミドのアル
キルとしては、例えば、C1−6アルキルが挙げられ、C1−6アルキルとしては、例え
ば、Rについて上記したものと同様のものが挙げられる。
As alkyl of alkylphenyl, alkylcarbonyl, and alkylamide represented by R 2 , for example, C 1-6 alkyl can be mentioned, and as C 1-6 alkyl, for example, the same as those described above for R 1 Things.

で表される「置換基で置換されていてもよいC1−6アルキル」における、「C
−6アルキル」としては、例えば、Rについて上記したものと同様のものが挙げられる
“C 1 in the“ C 1-6 alkyl optionally substituted with a substituent ”represented by R 3
Examples of “ -6 alkyl” include the same as those described above for R 1 .

で表される「置換基で置換されていてもよいC1−6アルキル」における「置換基
」としては、例えば、置換基が付加されていてもよいカルボン酸エステル、リン酸エステ
ル、等が含まれる。
Examples of the “substituent” in the “C 1-6 alkyl which may be substituted with a substituent” represented by R 3 include a carboxylic acid ester, a phosphoric ester, etc. to which a substituent may be added. Is included.

で表されるアルキルカルボニル、およびアルキルアミドのアルキルとしては、例え
ば、C1−6アルキルが挙げられ、C1−6アルキルとしては、例えば、Rについて上
記したものと同様のものが挙げられる。
Examples of alkylcarbonyl represented by R 3 and alkyl of alkylamide include C 1-6 alkyl, and examples of C 1-6 alkyl include the same as those described above for R 1. It is done.

上記「置換基が付加されていてもよいカルボン酸エステル」における、付加されていて
もよい置換基の例としては、水素原子、C1−6アルキル(例:メチル、エチル、プロピ
ル等)、フェニル等が含まれる。
Examples of the substituent that may be added in the “carboxylic acid ester to which a substituent may be added” include a hydrogen atom, C 1-6 alkyl (eg, methyl, ethyl, propyl, etc.), phenyl, and the like. Etc. are included.

またはXで表されるC1−3アルキルとしては、例えば、メチル、エチル、プロ
ピル、イソプロピル等が挙げられる。
Examples of C 1-3 alkyl represented by X 1 or X 2 include methyl, ethyl, propyl, isopropyl and the like.

好ましい実施形態では、Rは、水素原子またはメチルカルボニル基であり、Rは存
在しないか、またはメチルであり、Rはメチルエチルホルマートであり、Xはメチル
であり、nが0であり、mが1である。
In a preferred embodiment, R 1 is a hydrogen atom or a methylcarbonyl group, R 2 is absent or is methyl, R 3 is methyl ethyl formate, X 2 is methyl, and n is 0 And m is 1.

本発明のさらに好ましい実施形態によれば、下記式(II)で表される化合物、その誘
導体、またはそれらの塩:

(式中、
は、水素原子、カルボニル基、C1−6アルキルカルボニル基、またはアルキルエ
ステル(例:アルキルリン酸エステル)であり、
は、存在しないか、またはC1−6アルキル、アルキルフェニル、アルキルカルボ
ニル、もしくはアルキルアミドである。)が提供される。
According to a further preferred embodiment of the present invention, a compound represented by the following formula (II), a derivative thereof, or a salt thereof:

(Where
R 1 is a hydrogen atom, a carbonyl group, a C 1-6 alkylcarbonyl group, or an alkyl ester (eg, alkyl phosphate ester);
R 2 is absent or is C 1-6 alkyl, alkylphenyl, alkylcarbonyl, or alkylamide. ) Is provided.

好ましい実施形態は、
エチル2−(7−ヒドロキシ−2−メチルキノリン−4−イル)アセタート、
エチル2−(7−アセトキシ−2−メチルキノリン−4−イル)アセタート、
7−アセトキシ−4−(2−エトキシ−2−オキソエチル)−1,2−ジメチルキノリニ
ウム、
7−ヒドロキシ−4−(2−エトキシ−2−オキソエチル)−1,2−ジメチルキノリニ
ウム
これらの誘導体、またはこれらの塩である。
Preferred embodiments are:
Ethyl 2- (7-hydroxy-2-methylquinolin-4-yl) acetate,
Ethyl 2- (7-acetoxy-2-methylquinolin-4-yl) acetate,
7-acetoxy-4- (2-ethoxy-2-oxoethyl) -1,2-dimethylquinolinium,
7-hydroxy-4- (2-ethoxy-2-oxoethyl) -1,2-dimethylquinolinium derivatives thereof or salts thereof.

さらにより好ましい実施形態は、
7−アセトキシ−4−(2−エトキシ−2−オキソエチル)−1,2−ジメチルキノリニ
ウム、
7−ヒドロキシ−4−(2−エトキシ−2−オキソエチル)−1,2−ジメチルキノリニ
ウム、
これらの誘導体、またはこれらの塩である。
An even more preferred embodiment is
7-acetoxy-4- (2-ethoxy-2-oxoethyl) -1,2-dimethylquinolinium,
7-hydroxy-4- (2-ethoxy-2-oxoethyl) -1,2-dimethylquinolinium,
These derivatives or their salts.

最も好ましい実施形態は、7−アセトキシ−4−(2−エトキシ−2−オキソエチル)
−1,2−ジメチルキノリニウムである。
The most preferred embodiment is 7-acetoxy-4- (2-ethoxy-2-oxoethyl)
-1,2-dimethylquinolinium.

本発明のさらに別の実施形態によれば、上記化合物、その誘導体、またはそれらの塩を
含む、蛍光組成物が提供される。好ましい実施形態では、これらの蛍光組成物は、細胞の
標識もしくはイメージングのため、または細胞内酵素活性の検出プローブとして使用され
る。
According to still another embodiment of the present invention, there is provided a fluorescent composition comprising the above compound, a derivative thereof, or a salt thereof. In preferred embodiments, these fluorescent compositions are used for labeling or imaging of cells or as detection probes for intracellular enzyme activity.

本発明のさらに別の実施形態によれば、下記式(III)で表される化合物、その誘導
体、またはそれらの塩を含む、細胞内導入用蛍光組成物:


(式中、Rは、水素原子、カルボニル基、C1−6アルキルカルボニル基、またはアル
キルエステル(例:アルキルリン酸エステルなど)であり、
は、存在しないか、またはC1−6アルキル、アルキルフェニル、アルキルカルボ
ニル、もしくはアルキルアミドである。)が提供される。
According to still another embodiment of the present invention, a fluorescent composition for intracellular introduction comprising a compound represented by the following formula (III), a derivative thereof, or a salt thereof:


(Wherein R 1 is a hydrogen atom, a carbonyl group, a C 1-6 alkylcarbonyl group, or an alkyl ester (eg, alkyl phosphate ester, etc.);
R 2 is absent or is C 1-6 alkyl, alkylphenyl, alkylcarbonyl, or alkylamide. ) Is provided.

好ましい実施形態では、Rは水素原子またはメチルカルボニル基であり、Rは存在
しないか、またはメチルである。
In a preferred embodiment, R 1 is a hydrogen atom or a methylcarbonyl group and R 2 is absent or is methyl.

より好ましい実施形態では、7−アセトキシ−1−メチルキノリニウム、7−ヒドロキ
シ−1−メチルキノリニウム、これらの誘導体、およびこれらの塩からなる群から選択さ
れる1つ以上の化合物、その誘導体、またはそれらの塩を含む、細胞内導入用の蛍光組成
物が提供される。これらの細胞内導入用の蛍光組成物は、好ましくは、細胞の標識もしく
はイメージングのため、または細胞内酵素活性の検出プローブとして使用される。
In a more preferred embodiment, one or more compounds selected from the group consisting of 7-acetoxy-1-methylquinolinium, 7-hydroxy-1-methylquinolinium, derivatives thereof, and salts thereof, Provided is a fluorescent composition for intracellular introduction comprising a derivative or a salt thereof. These fluorescent compositions for introduction into cells are preferably used for labeling or imaging of cells or as detection probes for intracellular enzyme activity.

本発明の別の実施形態によれば、細胞と、上記化合物、その誘導体もしくはそれらの塩
、または上記の細胞内導入用の蛍光組成物とを溶液中で混合し、所定時間インキュベート
する工程を含む、細胞標識方法が提供される。
According to another embodiment of the present invention, the method includes a step of mixing a cell and the compound, a derivative thereof or a salt thereof, or the fluorescent composition for introduction into the cell in a solution and incubating for a predetermined time. A cell labeling method is provided.

さらに別の実施形態によれば、m−アミノフェノールと3−オキソ酪酸エチルエステル
とを、BiClの存在下で混合することを含む、エチル2−(7−ヒドロキシ−2−メ
チルキノリン−4−イル)アセタート(ethyl 2-(7-hydroxy-2-methylquinolin-4-yl)ace
tate)の合成方法が提供される。
According to yet another embodiment, ethyl 2- (7-hydroxy-2-methylquinoline-4-) comprising mixing m-aminophenol and 3-oxobutyric acid ethyl ester in the presence of BiCl 3. Yl) acetate (ethyl 2- (7-hydroxy-2-methylquinolin-4-yl) ace
tate) is provided.

本発明の典型的な実施形態では、式(I)、(II)、(III)で表される蛍光色素
のRを、水素原子から任意の酵素などによる化学反応により脱保護される置換基(例え
ば、カルボニル基)へ化学修飾することによって細胞透過性にし、細胞内に導入し、細胞
のイメージングに使用する。
In an exemplary embodiment of the present invention, a substituent in which R 1 of the fluorescent dye represented by formula (I), (II), or (III) is deprotected from a hydrogen atom by a chemical reaction with any enzyme or the like. It is rendered cell permeable by chemical modification (for example, carbonyl group), introduced into cells, and used for imaging of cells.

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定
されない。
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, this invention is not limited to these Examples.

図2に示すように、HQおよびmeHQの各種誘導体を合成した。
[参考例1]
As shown in FIG. 2, various derivatives of HQ and meHQ were synthesized.
[Reference Example 1]

キノリン−7−イルアセタート(quinolin-7-yl acetate)(HQ-Ac)の合成


7-hydroxyquinoline 200 mg (1.38 mmol), ジクロロメタン60 ml, トリエチルアミン0.
4 mlを50 mlナスフラスコに入れ、室温で30分撹拌した。反応溶液を氷浴に移した後、ace
tylchloride 0.2 ml (2.46 mmol)を滴下し、そのまま7.5時間撹拌した。反応終了後、水
を加え、ジクロロメタンで抽出した。油層を水、食塩水で洗い、溶媒を留去した。生成物
を酢酸エチルに溶解させ、カラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢エチ=1:1)にて分
離精製し、目的物175 mg (収率68%)を得た。
Synthesis of quinolin-7-yl acetate (HQ-Ac)


7-hydroxyquinoline 200 mg (1.38 mmol), dichloromethane 60 ml, triethylamine
4 ml was placed in a 50 ml eggplant flask and stirred at room temperature for 30 minutes. After transferring the reaction solution to an ice bath, ace
tylchloride 0.2 ml (2.46 mmol) was added dropwise, and the mixture was stirred as it was for 7.5 hours. After completion of the reaction, water was added and extracted with dichloromethane. The oil layer was washed with water and brine, and the solvent was distilled off. The product was dissolved in ethyl acetate and separated and purified by column chromatography (hexane: ethyl acetate = 1: 1) to obtain 175 mg of the desired product (yield 68%).

H NMR (270 MHz, CDCl3)
8.91 (dd, 4.3, 1.6 Hz, 1H), 8.16-8.13 (m, 1H), 7.83-7.81(m, 2H), 7.40-7.31(m, 2H
), 2.38 (s, 3H)
[参考例2]
1 H NMR (270 MHz, CDCl 3 )
8.91 (dd, 4.3, 1.6 Hz, 1H), 8.16-8.13 (m, 1H), 7.83-7.81 (m, 2H), 7.40-7.31 (m, 2H
), 2.38 (s, 3H)
[Reference Example 2]

7−アセトキシ−1−メチルキノリニウム(7-acetoxy-1-methylquinolinium)(mHQ-A
c)の合成

7HQ-Ac 73 mg (0.39 mmol)のジクロロメタン溶液15 mlを50 mlナスフラスコに入れ、ヨ
ウ化メチル1.5 mlを加え、45℃で24時間撹拌した。沈殿が生成したのを確認して反応を止
めた。沈殿を吸引ろ過、ジクロロメタンで洗い、真空乾燥し、目的物を得た。
7-acetoxy-1-methylquinolinium (mHQ-A
c) Synthesis

7HQ-Ac 73 mg (0.39 mmol) in dichloromethane (15 ml) was placed in a 50 ml eggplant flask, methyl iodide (1.5 ml) was added, and the mixture was stirred at 45 ° C. for 24 hours. The reaction was stopped after confirming the formation of a precipitate. The precipitate was filtered with suction, washed with dichloromethane and dried in vacuo to obtain the desired product.

H NMR (270 MHz, CD3OD)
9.38(d, 5.9 Hz, 1H), 9.21(d, 8.1Hz, 1H), 8.48(d, 8.9 Hz, 1H), 8.36(d, 1.6 Hz, 1H
), 8.06(dd, 5.9, 8.4 Hz, 1H), 7.89(dd, 8.9, 1.9 Hz, 1H), 4.65(s, 3H), 2.43(s, 3H
)
[参考例3]
1 H NMR (270 MHz, CD 3 OD)
9.38 (d, 5.9 Hz, 1H), 9.21 (d, 8.1Hz, 1H), 8.48 (d, 8.9 Hz, 1H), 8.36 (d, 1.6 Hz, 1H
), 8.06 (dd, 5.9, 8.4 Hz, 1H), 7.89 (dd, 8.9, 1.9 Hz, 1H), 4.65 (s, 3H), 2.43 (s, 3H
)
[Reference Example 3]

7−ヒドロキシ−1−メチルキノリニウム(7-hydroxy-1-methylquinolinium)(mHQ)
の合成

7HQ 110 mg (0.76 mmol)とジクロロメタン30 mlを50 mlナスフラスコに入れ、ヨウ化メ
チル8.5 ml(60 mmol)を加え、35℃で43時間撹拌した。沈殿が生成したのを確認して反応
を止め沈殿を吸引ろ過し、粉末を得た。これをカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタ
ン:メタノール= 3:1)にて分離精製し、目的物71 mg (収率33%)を得た。
7-hydroxy-1-methylquinolinium (mHQ)
Synthesis of

7HQ 110 mg (0.76 mmol) and dichloromethane 30 ml were placed in a 50 ml eggplant flask, methyl iodide 8.5 ml (60 mmol) was added, and the mixture was stirred at 35 ° C. for 43 hours. After confirming the formation of a precipitate, the reaction was stopped and the precipitate was suction filtered to obtain a powder. This was separated and purified by column chromatography (dichloromethane: methanol = 3: 1) to obtain 71 mg of the desired product (yield 33%).

H NMR (270 MHz, CD3OD)
8.54(d, 6.2 Hz, 1H), 8.47(d, 7.8 Hz, 1H), 7.85(d, 9.2 Hz, 1H), 7.22-7.11(m, 2H),
6.78(s, 1H), 4.17(s, 1H)
1 H NMR (270 MHz, CD 3 OD)
8.54 (d, 6.2 Hz, 1H), 8.47 (d, 7.8 Hz, 1H), 7.85 (d, 9.2 Hz, 1H), 7.22-7.11 (m, 2H),
6.78 (s, 1H), 4.17 (s, 1H)

エチル2−(7−ヒドロキシ−2−メチルキノリン−4−イル)アセタート(ethyl 2-Ethyl 2- (7-hydroxy-2-methylquinolin-4-yl) acetate (ethyl 2-
(7-hydroxy-2-methylquinolin-4-yl)acetate)(meHQ)の合成Synthesis of (7-hydroxy-2-methylquinolin-4-yl) acetate) (meHQ)

m−アミノフェノール(550mg,5mmol)およびBiClの混合物を、3−
オキソ酪酸エチルエステル(79mg,0.25mmol)中、75℃で1時間攪拌した
。反応混合物を、クロロホルムで抽出し、水で洗浄した。有機層を回収し、MgSO
乾燥した。溶媒を蒸発させ得た後、残渣をフラッシュクロマトグラフィーで精製し(Si
,ヘキサン−AcOEt 1:1)、エチル2−(7−ヒドロキシ−2−メチルキノ
リン−4−イル)アセタート(meHQ)194mgを11%の収率で得た。
A mixture of m-aminophenol (550 mg, 5 mmol) and BiCl 3 was added to 3-
The mixture was stirred in oxobutyric acid ethyl ester (79 mg, 0.25 mmol) at 75 ° C. for 1 hour. The reaction mixture was extracted with chloroform and washed with water. The organic layer was collected and dried over MgSO 4 . After the solvent can be evaporated, the residue is purified by flash chromatography (Si
O 2 , hexane-AcOEt 1: 1), ethyl 2- (7-hydroxy-2-methylquinolin-4-yl) acetate (meHQ) 194 mg was obtained in a yield of 11%.

1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ 7.50 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.15 (d,J = 2.4 Hz, 1H), 6
.99 (s, 1H), 6.57 (dd, J = 8.9, 2.2 Hz,1H), 4.25 (q, J= 7.0 Hz, 2H), 3.97 (s,
2H), 2.60 (s, 3H), 1.31 (t, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (67.5 MHz, CD3Cl): δ 170.
2, 159.6, 157.7, 148.0, 140.9, 124.2, 120.1, 119.5, 119.0, 108.1, 61.6, 38.5, 28
.3, 14.4. MS calcd for C14H15NO3 245.1; (ESI)m/z found 246.4(M+H)+. Anal. Calcd
for C14H15NO3 : C, 68.56; H, 6.16; N; 5.71. Found: C, 68.48; H, 6.22; N, 5.55. m
p 205.
1 H NMR (270 MHz, CDCl 3 ): δ 7.50 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.15 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6
.99 (s, 1H), 6.57 (dd, J = 8.9, 2.2 Hz, 1H), 4.25 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.97 (s,
2H), 2.60 (s, 3H), 1.31 (t, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (67.5 MHz, CD3Cl): δ 170.
2, 159.6, 157.7, 148.0, 140.9, 124.2, 120.1, 119.5, 119.0, 108.1, 61.6, 38.5, 28
.3, 14.4. MS calcd for C14H15NO3 245.1; (ESI) m / z found 246.4 (M + H) +. Anal. Calcd
for C14H15NO3: C, 68.56; H, 6.16; N; 5.71.Found: C, 68.48; H, 6.22; N, 5.55.m
p 205.

エチル2−(7−アセトキシ−2−メチルキノリン−4−イル)アセタート(ethyl 2-Ethyl 2- (7-acetoxy-2-methylquinolin-4-yl) acetate (ethyl 2-
(7-acetoxy-2-methylquinolin-4-yl)acetate)(meHQ-Ac)の合成Synthesis of (7-acetoxy-2-methylquinolin-4-yl) acetate) (meHQ-Ac)

トリエチルアミン(0.27ml,1.95mmol)を、meHQ(200mg,0.7
9mmol)のジクロロメタン溶液(200ml)に添加し、20分間室温で攪拌した。
次いで、この混合物に塩化アセチル(0.11ml,1.56mmol)を0℃で滴下し
て加え、2時間攪拌した。水を加えて反応を止め、ジクロロメタンで抽出した。有機層を
水およびブラインで洗浄した。溶媒を蒸発させた後、残渣をフラッシュクロマトグラフィ
ー(SiO,ヘキサン−AcOEt 1:1)で精製し、207mgのmeHQ-Acを92
%の収率で得た。
Triethylamine (0.27 ml, 1.95 mmol) was added to meHQ (200 mg, 0.7
9 mmol) in dichloromethane (200 ml) and stirred for 20 minutes at room temperature.
Subsequently, acetyl chloride (0.11 ml, 1.56 mmol) was added dropwise to this mixture at 0 ° C., and the mixture was stirred for 2 hours. The reaction was stopped by adding water and extracted with dichloromethane. The organic layer was washed with water and brine. After evaporation of the solvent, the residue was purified by flash chromatography (SiO 2, hexane-AcOEt 1: 1) to give the MEHQ-Ac of 207 mg 92
% Yield.

1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ; 7.95(d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.74(d, J = 2.4 Hz, 1H), 7
.29 (dd, J = 8.9, 2.4 Hz, 1H), 7.21(s, 1H), 4.16(q, J = 7.0Hz, 2H), 3.99(s, 2H),
2.71 (s, 3H), 2.36 (s, 3H), 1.23 (t, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (67.5 MHz, CD3Cl)
: δ. 169.7, 168.9, 159.4, 151.0, 148.6, 139.8, 124.4, 123.4, 123.1, 121.0, 120.
1, 61.3, 38.4, 25.2, 21.2, 14.1. Anal. Calcd for C16H17NO4 : C, 66.89; H, 5.96;
N; 4.88. Found: C, 66.71; H, 6.05; N; 4.76.
1 H NMR (270 MHz, CDCl 3 ): δ; 7.95 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.74 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7
.29 (dd, J = 8.9, 2.4 Hz, 1H), 7.21 (s, 1H), 4.16 (q, J = 7.0Hz, 2H), 3.99 (s, 2H),
2.71 (s, 3H), 2.36 (s, 3H), 1.23 (t, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (67.5 MHz, CD3Cl)
: δ. 169.7, 168.9, 159.4, 151.0, 148.6, 139.8, 124.4, 123.4, 123.1, 121.0, 120.
1, 61.3, 38.4, 25.2, 21.2, 14.1. Anal.Calcd for C16H17NO4: C, 66.89; H, 5.96;
N; 4.88. Found: C, 66.71; H, 6.05; N; 4.76.

7−アセトキシ−4−(2−エトキシ−2−オキソエチル)−1,2−ジメチルキノリ7-acetoxy-4- (2-ethoxy-2-oxoethyl) -1,2-dimethylquinori
ニウム(mmeHQ-Ac)の合成Synthesis of Ni (mmeHQ-Ac)

meHQ-Ac(100mg,0.34mmol)とヨウ化メチル(0.5ml,8.03m
mol)との混合物を、密封したチューブ内で70〜80℃で1時間加熱した。生成され
た沈殿をろ過によって回収し、冷AcOEtで十分に洗浄した。粗生成物をエタノール/
ジエチルエステルからの再結晶化により精製し、41mgのmmeHQ-Acを28%の収率で得
た。
meHQ-Ac (100 mg, 0.34 mmol) and methyl iodide (0.5 ml, 8.03 m)
mol) was heated at 70-80 ° C. for 1 hour in a sealed tube. The resulting precipitate was collected by filtration and washed thoroughly with cold AcOEt. The crude product is ethanol /
Purification by recrystallization from diethyl ester gave 41 mg mmeHQ-Ac in 28% yield.

1H NMR (270 MHz, CDCl3): δ; 8.28(d, J = 9.2 Hz, 1H), 8.28(s, 1H), 7.99(s, 1H),
7.71(d, J = 9.2 Hz, 1H), 4.61(s, 3H), 4.31(s, 2H), 4.20(q, J = 7.0Hz, 2H), 3.31(
s, 3H), 2.45(s, 3H), 1.28(t, J= 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (CD3OD, 67.5 MHz): δ. 168.
3, 167.9, 160.5, 155.5, 150.9, 140.7, 128.2, 127.1, 125.5, 124.9, 111.9, 62.4, 4
2.3, 39.1, 25.5, 21.6, 14.3. Anal. Calcd for C17H20NO4+I- : C, 47.57; H, 4.70; N
; 3.26. Found: C, 47.43; H, 4.60; N; 3.10
1 H NMR (270 MHz, CDCl 3 ): δ; 8.28 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 8.28 (s, 1H), 7.99 (s, 1H),
7.71 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 4.61 (s, 3H), 4.31 (s, 2H), 4.20 (q, J = 7.0Hz, 2H), 3.31 (
s, 3H), 2.45 (s, 3H), 1.28 (t, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (CD3OD, 67.5 MHz): δ.168.
3, 167.9, 160.5, 155.5, 150.9, 140.7, 128.2, 127.1, 125.5, 124.9, 111.9, 62.4, 4
2.3, 39.1, 25.5, 21.6, 14.3. Anal.Calcd for C17H20NO4 + I-: C, 47.57; H, 4.70; N
; 3.26. Found: C, 47.43; H, 4.60; N; 3.10

7−ヒドロキシ−4−(2−エトキシ−2−オキソエチル)−1,2−ジメチルキノリ
ニウム(mmeHQ)の合成

meHQ(100mg、0.41mmol)とヨウ化メチル(0.5ml,8.03mmo
l)との混合物を、ジクロロメタン(2ml)中、密封したチューブ中で60℃で19時
間加熱した。精製された沈殿をろ過により回収した。粗生成物をジクロロメタンからの再
結晶化により精製し、64gのmmeHQを40%の収率で得た。
7-Hydroxy-4- (2-ethoxy-2-oxoethyl) -1,2-dimethylquinori
Synthesis of Ni (mmeHQ)

meHQ (100 mg, 0.41 mmol) and methyl iodide (0.5 ml, 8.03 mmo)
The mixture with l) was heated in a sealed tube at 60 ° C. in dichloromethane (2 ml) for 19 hours. The purified precipitate was collected by filtration. The crude product was purified by recrystallization from dichloromethane to give 64 g mmeHQ in 40% yield.

1H NMR (270 MHz, CD3OD): δ; 8.29(d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.70(s, 1H), 7.57(d, J = 2
.2Hz, 1H), 7.48(dd, J = 9.2, 2.2 Hz, 1H), 4.32(s, 3H), 4.19(q, J = 7.0 Hz, 2H),
3.02(s, 3H), 1.25(t, J= 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (CD3OD, 67.5 MHz): δ. 170.1, 165.3
, 159.6, 152.2, 143.8, 130.1, 124.2, 123.3, 122.0, 102.5, 62.9, 40.0, 30.8, 23.3
, 14.5. Anal. Calcd for C15H18NO3+I- : C, 46.53; H, 4.69; N; 3.62. Found: C, 46.
22; H, 4.72; N; 3.35
1 H NMR (270 MHz, CD 3 OD): δ; 8.29 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.70 (s, 1H), 7.57 (d, J = 2
.2Hz, 1H), 7.48 (dd, J = 9.2, 2.2 Hz, 1H), 4.32 (s, 3H), 4.19 (q, J = 7.0 Hz, 2H),
3.02 (s, 3H), 1.25 (t, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (CD3OD, 67.5 MHz): δ. 170.1, 165.3
, 159.6, 152.2, 143.8, 130.1, 124.2, 123.3, 122.0, 102.5, 62.9, 40.0, 30.8, 23.3
Anal.Calcd for C15H18NO3 + I-: C, 46.53; H, 4.69; N; 3.62. Found: C, 46.
22; H, 4.72; N; 3.35

mHQ-Ac、mmeHQ-Ac、およびこれらの加水分解産物の吸収・蛍光特性の測定
測定は全て1%DMSO水溶液中、空気下で行った。測定には下記の機器を用いた。
1)吸収スペクトルの測定には、島津UV-1600型可視紫外分光光度計を用いた。
2)蛍光スペクトルおよび蛍光励起スペクトルの測定には、日立F-4500型蛍光光度計を用
いた。
3)蛍光量子収率の測定には、光源に日立F-4500型蛍光光度計を用い、標準サンプルには
アントラセンのエタノール溶液を使用し、アントラセンの蛍光量子収率(Φ=0.27
)と比較する相対法により算出した。
The measurement and measurement of the absorption and fluorescence properties of mHQ-Ac, mmeHQ-Ac, and their hydrolysates were all carried out in air in a 1% DMSO aqueous solution. The following equipment was used for the measurement.
1) A Shimadzu UV-1600 type visible ultraviolet spectrophotometer was used to measure the absorption spectrum.
2) A Hitachi F-4500 fluorometer was used for the measurement of the fluorescence spectrum and the fluorescence excitation spectrum.
3) For the measurement of the fluorescence quantum yield, a Hitachi F-4500 fluorometer was used as the light source, an ethanol solution of anthracene was used as the standard sample, and the fluorescence quantum yield of anthracene (Φ f = 0.27).
) And the relative method.

(結果)
図3AおよびBは、測定したmeHQ-AcおよびmmeHQ-Acの加水分解前後の吸収・蛍光特性
を示す。図3Aに示すように、mHQ-Acが加水分解されてmHQになると、吸収スペクトルの
ピークが318nmから405nmへシフトするとともに、517nm付近に蛍光ピークが現れた。
さらに図3Bに示すように、mmeHQ-Acが加水分解されて、mmeHQになると、吸収スペク
トルのピークが324nmから405nmにシフトし、503nm付近に蛍光ピークが現れた。
(result)
3A and 3B show the absorption / fluorescence characteristics of meHQ-Ac and mmeHQ-Ac measured before and after hydrolysis. As shown in FIG. 3A, when mHQ-Ac was hydrolyzed to mHQ, the peak of the absorption spectrum shifted from 318 nm to 405 nm, and a fluorescence peak appeared near 517 nm.
Further, as shown in FIG. 3B, when mmeHQ-Ac was hydrolyzed to mmeHQ, the absorption spectrum peak shifted from 324 nm to 405 nm, and a fluorescence peak appeared near 503 nm.

細胞内へのmHQ-AcおよびmmeHQ-Acの導入
(手順)
10%仔牛血清を含むMEM培地にて、5%CO2下37度で培養しているヒト上皮系
のHEp-2細胞に、DMSOに1mMになるように溶解させたmHQ-AcおよびmmeHQ-Ac を、終
濃度10μMになるように添加した。その後、オリンパスIX70蛍光顕微鏡を用いて、励起
フィルター 460-490nm、吸収フィルター 500nmリングパスフィルターの
条件下で連続撮影を行った。50分経過後、MEM培地にて細胞を2回洗浄した後ふたた
びMEM培地を加えて、同条件にて蛍光撮影を行った。
Introduction of mHQ-Ac and mmeHQ-Ac into cells (procedure)
MHQ-Ac and mmeHQ-Ac dissolved in DMSO to 1 mM in human epithelial HEp-2 cells cultured at 37 ° C. with 5% CO 2 in MEM medium containing 10% calf serum. The final concentration was 10 μM. Thereafter, continuous photographing was performed using an Olympus IX70 fluorescence microscope under conditions of an excitation filter of 460-490 nm and an absorption filter of 500 nm. After 50 minutes, the cells were washed twice with MEM medium, MEM medium was added again, and fluorescence imaging was performed under the same conditions.

(結果)
図4左に示すように、meHQ-Acを添加後細胞内外にあまり変化が見られず、50分後に
細胞外液を緩衝溶液で洗うと、細胞内が光っていた。
他方、図4右に示すように、mmeHQ-Acを添加すると直後から細胞内が明るく光っている
様子が観測された。なお、図4の最下段は倍率を上げて、色素の局在を見た写真である。
meHQ-Acは核膜・小胞体・核小体などに色素が局在したのに対し、mmeHQ-Acは細胞内全体
に分布していた。
(result)
As shown in the left of FIG. 4, there was not much change inside and outside the cells after the addition of meHQ-Ac, and when the extracellular fluid was washed with a buffer solution after 50 minutes, the inside of the cells was shining.
On the other hand, as shown in the right side of FIG. 4, it was observed that the inside of the cell was brightly shined immediately after the addition of mmeHQ-Ac. The bottom row in FIG. 4 is a photograph showing the localization of the dye with the magnification increased.
While meHQ-Ac was localized in the nuclear membrane, endoplasmic reticulum, nucleolus, etc., mmeHQ-Ac was distributed throughout the cell.

meHQ-AcとmmeHQ-Acを細胞に添加したときのフローサイトメトリー
(手順)
10%仔牛血清を含むMEM培地にて、5%CO2下37度で培養しているヒト上皮系
のHEp-2細胞に、DMSOに1mMになるように溶解させたmHQ、mHQ-AcおよびmmeHQ-Ac
を、終濃度30μMになるように添加した。2時間後に細胞をトリプシン処理によって浮
遊させ、フローサイトメーターFlicyme(三井造船)によって解析した。
Flow cytometry when meHQ-Ac and mmeHQ-Ac are added to cells (procedure)
MHQ, mHQ-Ac and mmeHQ- dissolved in DMSO at 1 mM in human epithelial HEp-2 cells cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 in MEM medium containing 10% calf serum Ac
Was added to a final concentration of 30 μM. Two hours later, the cells were suspended by trypsin treatment and analyzed by a flow cytometer Flicyme (Mitsui Engineering & Shipbuilding).

(結果)
図5上欄に示すように、mHQ-Acは細胞の60%、mmeHQ-Acは細胞の75%を染色していた。
図5下欄に示したように、色素を添加していない細胞やその他の誘導体を添加した細胞に
おいては染色が見られなかった。
(result)
As shown in the upper column of FIG. 5, mHQ-Ac stained 60% of the cells, and mmeHQ-Ac stained 75% of the cells.
As shown in the lower column of FIG. 5, staining was not observed in cells to which no dye was added or cells to which other derivatives were added.

mmeHQ-Acを細胞に添加し、PI染色したときのフローサイトメトリー
(手順)
10%仔牛血清を含むMEM培地にて、5%CO2下37度で培養しているヒト上皮系
のHEp-2細胞に、DMSOに1mMになるように溶解させたmmeHQ-Ac を、終濃度10μM
になるように添加した。12時間後に細胞をトリプシン処理によって浮遊させ、終濃度2
0μg/mLになるようにPIを添加し、フローサイトメーターFACSCalibur(BD)によ
って解析した。死細胞との比較として、70%エタノール中にて浮遊細胞を固定した後に
、PIを添加した解析も行った。
Flow cytometry when adding mmeHQ-Ac to cells and staining with PI (Procedure)
In a MEM medium containing 10% calf serum, mmeHQ-Ac dissolved at 1 mM in DMSO was dissolved in human epithelial HEp-2 cells cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 at a final concentration of 10 μM.
It added so that it might become. After 12 hours, the cells are suspended by trypsin treatment to give a final concentration of 2
PI was added so that it might become 0 microgram / mL, and it analyzed by the flow cytometer FACSCalibur (BD). As a comparison with dead cells, analysis was also performed in which PI was added after floating cells were fixed in 70% ethanol.

(結果)
図6に示すように、mmeHQ-Ac処理によって死細胞に見られるようなFSC/SSCのパターン
に大きな変化は見られないことから、細胞の形状も生細胞と変化していないことが示され
た。また死細胞では90%以上の細胞がPIによって染色されるのに対して、mmeHQ-Ac処理
した細胞ではほとんどの細胞がPIによって染色されなかったことから、mmeHQ-Acは細胞毒
性が低いことが示された。また、同様の実験によりすべてのHQおよびmeHQ誘導体は同条件
下で毒性がないことが示された。
(result)
As shown in FIG. 6, no significant change was observed in the pattern of FSC / SSC as seen in dead cells by mmeHQ-Ac treatment, indicating that the shape of the cells was not changed from that of living cells. . In addition, more than 90% of dead cells were stained with PI, whereas most cells were not stained with PI in mmeHQ-Ac-treated cells. Therefore, mmeHQ-Ac has low cytotoxicity. Indicated. Similar experiments also showed that all HQ and meHQ derivatives were not toxic under the same conditions.

(まとめ)
本発明の代表的実施形態としての色素mmeHQ-Acは、特に以下の4つの点で蛍光色素とし
て優れている。
1)吸収、蛍光特性
そのままの構造では吸収帯が紫外光にあり無蛍光性であるのに対し、加水分解された構
造(7−ヒドロキシ−4−(2−エトキシ−2−オキソエチル)−1,2−ジメチルキノ
リニウム(本明細書中、「mmeHQ」と略すことがある。))では400 nm付近に吸収帯があり
黄色い蛍光を発する。また、蛍光量子収率を比較すると、meHQ骨格色素の方が、HQ色素よ
りも明るい色素であり、プローブにより適している。
2)蛍光のON/OFFスイッチング
mmeHQ-Acの10μM溶液に細胞を接触させると、添加直後から細胞内のみが明るく蛍光を
発した。(mHQ-Acの場合、この濃度においては細胞内外の明るさの違いがはっきりしなか
った。その他の誘導体では、ほとんど蛍光が観測されなかった。)
色素の細胞内での局在は、mmeHQ-Acでは細胞全体に分布していた。(mHQ-Acでは細胞の
一部の組織に局在化がみられた。)
3)細胞膜透過性
mmeHQ-Acの30μM溶液を2時間細胞に添加すると、75%の細胞が染色された。(mHQ-Acで
は60%の細胞が染色された。mHQでは30%の細胞が染色された。その他の誘導体は全く染
色されなかった。)
4)細胞毒性
mmeHQ-Acの10μM溶液を12時間細胞に添加した場合、その細胞はPI染色されず、また細
胞の形状も生細胞と同様であり、この条件では細胞毒性がないことが示された。(その他
のすべての誘導体でも同様の条件で細胞毒性がないことが示された。)
(Summary)
The dye mmeHQ-Ac as a typical embodiment of the present invention is particularly excellent as a fluorescent dye in the following four points.
1) Absorption and fluorescence characteristics In the structure as it is, the absorption band is in ultraviolet light and non-fluorescence, whereas the hydrolyzed structure (7-hydroxy-4- (2-ethoxy-2-oxoethyl) -1, 2-Dimethylquinolinium (may be abbreviated as “mmeHQ” in this specification)) has an absorption band near 400 nm and emits yellow fluorescence. Further, when the fluorescence quantum yield is compared, the meHQ skeleton dye is a brighter dye than the HQ dye and is more suitable for the probe.
2) Fluorescence ON / OFF switching
When cells were brought into contact with a 10 μM solution of mmeHQ-Ac, only the cells were brightly fluorescent immediately after the addition. (In the case of mHQ-Ac, the difference in brightness inside and outside the cells was not clear at this concentration. Almost no fluorescence was observed with other derivatives.)
The intracellular localization of the dye was distributed throughout the cell in mmeHQ-Ac. (In mHQ-Ac, localization was observed in some tissues of cells.)
3) Cell membrane permeability
When a 30 μM solution of mmeHQ-Ac was added to the cells for 2 hours, 75% of the cells were stained. (60% of cells were stained with mHQ-Ac. 30% of cells were stained with mHQ. No other derivatives were stained.)
4) Cytotoxicity
When a 10 μM solution of mmeHQ-Ac was added to the cells for 12 hours, the cells were not PI-stained and the cell shape was similar to that of living cells, indicating that there was no cytotoxicity under these conditions. (All other derivatives were shown to be non-cytotoxic under similar conditions.)

405nmレーザー励起に対応した蛍光色素、タンパク質のラベル色素、特定の生理活性物
質の活性を検知する蛍光プローブ等として有用である。
本発明のプローブは任意の細胞内酵素活性の検出プローブとしての応用が可能であり、
またストークスシフトが大きいためマルチカラーイメージングに有用である。
It is useful as a fluorescent dye corresponding to 405 nm laser excitation, a protein label dye, a fluorescent probe for detecting the activity of a specific physiologically active substance, and the like.
The probe of the present invention can be applied as a probe for detecting any intracellular enzyme activity,
In addition, since the Stokes shift is large, it is useful for multicolor imaging.

Claims (12)

下記式(I)で表される化合物、その誘導体、またはそれらの塩:


(式中、
は、水素原子、カルボニル基、C1−6アルキルカルボニル基、またはアルキルエ
ステルであり、
は、存在しないか、またはC1−6アルキル、アルキルフェニル、アルキルカリボ
ニル、もしくはアルキルアミドであり、
は、水素原子、置換基で置換されていてもよいC1−6アルキル、カルボニル、ア
ルキルカルボニル、またはアルキルアミドであり、
およびXはそれぞれ独立して、(C1−3)アルキル、アリール(C1−3)ア
ルキル、(C3−12)シクロアルキル、ヘテロ(C3−12)シクロアルキル、ヘテロ
アリール(C1−3)アルキル、アリール及びヘテロアリール(それぞれ置換又は無置換
)からなる群より選ばれ、
nは、0、1、2、または3であり、
mは、0、1、または2である)。
A compound represented by the following formula (I), a derivative thereof, or a salt thereof:


(Where
R 1 is a hydrogen atom, a carbonyl group, a C 1-6 alkylcarbonyl group, or an alkyl ester;
R 2 is absent or is C 1-6 alkyl, alkylphenyl, alkylcaribonyl, or alkylamide;
R 3 is a hydrogen atom, C 1-6 alkyl optionally substituted with a substituent, carbonyl, alkylcarbonyl, or alkylamide;
X 1 and X 2 are each independently (C 1-3 ) alkyl, aryl (C 1-3 ) alkyl, (C 3-12 ) cycloalkyl, hetero (C 3-12 ) cycloalkyl, heteroaryl ( C 1-3 ) selected from the group consisting of alkyl, aryl and heteroaryl (each substituted or unsubstituted),
n is 0, 1, 2, or 3;
m is 0, 1, or 2.
が水素原子またはメチルカルボニル基であり、
が存在しないか、またはメチルであり、
がメチルエチルホルマートであり、
がメチルであり、
nが0であり、
mが1である、請求項1に記載の化合物、その誘導体、またはそれらの塩。
R 1 is a hydrogen atom or a methylcarbonyl group,
R 2 is absent or is methyl;
R 3 is methyl ethyl formate;
X 2 is methyl,
n is 0,
The compound according to claim 1, a derivative thereof, or a salt thereof, wherein m is 1.
下記式(II)で表される化合物、その誘導体、またはそれらの塩:

(式中、
は、水素原子、カルボニル基、C1−6アルキルカルボニル基、またはアルキルエ
ステルであり、
は、存在しないか、またはC1−6アルキル、アルキルフェニル、アルキルカルボ
ニル、もしくはアルキルアミドである。)。
A compound represented by the following formula (II), a derivative thereof, or a salt thereof:

(Where
R 1 is a hydrogen atom, a carbonyl group, a C 1-6 alkylcarbonyl group, or an alkyl ester;
R 2 is absent or is C 1-6 alkyl, alkylphenyl, alkylcarbonyl, or alkylamide. ).
エチル2−(7−ヒドロキシ−2−メチルキノリン−4−イル)アセタート;
エチル2−(7−アセトキシ−2−メチルキノリン−4−イル)アセタート;
7−アセトキシ−4−(2−エトキシ−2−オキソエチル)−1,2−ジメチルキノリ
ニウム;
7−ヒドロキシ−4−(2−エトキシ−2−オキソエチル)−1,2−ジメチルキノリ
ニウム;
これらの誘導体、またはこれらの塩。
Ethyl 2- (7-hydroxy-2-methylquinolin-4-yl) acetate;
Ethyl 2- (7-acetoxy-2-methylquinolin-4-yl) acetate;
7-acetoxy-4- (2-ethoxy-2-oxoethyl) -1,2-dimethylquinolinium;
7-hydroxy-4- (2-ethoxy-2-oxoethyl) -1,2-dimethylquinolinium;
These derivatives, or salts thereof.
7−アセトキシ−4−(2−エトキシ−2−オキソエチル)−1,2−ジメチルキノリ
ニウム;
7−ヒドロキシ−4−(2−エトキシ−2−オキソエチル)−1,2−ジメチルキノリ
ニウム;
これらの誘導体、またはこれらの塩。
7-acetoxy-4- (2-ethoxy-2-oxoethyl) -1,2-dimethylquinolinium;
7-hydroxy-4- (2-ethoxy-2-oxoethyl) -1,2-dimethylquinolinium;
These derivatives, or salts thereof.
請求項1〜5のいずれかに記載の化合物、その誘導体、またはそれらの塩を含む、蛍光
組成物。
The fluorescent composition containing the compound in any one of Claims 1-5, its derivative (s), or those salts.
下記式(III)で表される化合物、その誘導体、またはそれらの塩を含む、細胞内導
入用蛍光組成物:


(式中、Rは、水素原子、カルボニル基、C1−6アルキルカルボニル基、またはアル
キルエステルであり、
は、存在しないか、またはC1−6アルキル、アルキルフェニル、アルキルカルボ
ニル、もしくはアルキルアミドである。)。
A fluorescent composition for intracellular introduction, comprising a compound represented by the following formula (III), a derivative thereof, or a salt thereof:


(Wherein R 1 is a hydrogen atom, a carbonyl group, a C 1-6 alkylcarbonyl group, or an alkyl ester;
R 2 is absent or is C 1-6 alkyl, alkylphenyl, alkylcarbonyl, or alkylamide. ).
が水素原子またはメチルカルボニル基であり、
が存在しないか、またはメチルである、請求項7に記載の細胞内導入用蛍光組成物
R 1 is a hydrogen atom or a methylcarbonyl group,
Or R 2 is absent or is methyl, intracellular introduction fluorescent composition according to claim 7.
7−アセトキシ−1−メチルキノリニウム;
7−ヒドロキシ−1−メチルキノリニウム;
これらの誘導体、およびこれらの塩からなる群から選択される1つ以上の化合物、その誘
導体、またはそれらの塩を含む、細胞内導入用蛍光組成物。
7-acetoxy-1-methylquinolinium;
7-hydroxy-1-methylquinolinium;
A fluorescent composition for intracellular introduction, comprising one or more compounds selected from the group consisting of these derivatives and salts thereof, derivatives thereof, or salts thereof.
細胞の標識もしくはイメージングのため、または細胞内酵素活性の検出プローブとして
使用するための、請求項1〜5のいずれかに記載の化合物、その誘導体、もしくはそれら
の塩、または請求項6〜9のいずれかに記載の蛍光組成物。
The compound according to any one of claims 1 to 5, a derivative thereof, or a salt thereof, or a salt according to claims 6 to 9 for labeling or imaging of a cell, or for use as a detection probe for intracellular enzyme activity. The fluorescent composition according to any one of the above.
細胞を標識する方法であって、
細胞と、請求項1〜5のいずれかに記載の化合物、その誘導体、もしくはそれらの塩、
または請求項6〜9のいずれかに記載の細胞内導入用蛍光組成物とを溶液中で混合し、所
定時間インキュベートする工程を含む、方法。
A method of labeling cells,
A cell, the compound according to any one of claims 1 to 5, a derivative thereof, or a salt thereof,
Alternatively, a method comprising mixing the fluorescent composition for intracellular introduction according to any one of claims 6 to 9 in a solution and incubating for a predetermined time.
m−アミノフェノールと3−オキソ酪酸エチルエステルとを、BiClの存在下で混
合することを含む、エチル2−(7−ヒドロキシ−2−メチルキノリン−4−イル)アセ
タートの合成方法。
A method for synthesizing ethyl 2- (7-hydroxy-2-methylquinolin-4-yl) acetate comprising mixing m-aminophenol and 3-oxobutyric acid ethyl ester in the presence of BiCl 3 .
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