JP2004315501A - Zinc fluorescent probe - Google Patents

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JP2004315501A
JP2004315501A JP2004016836A JP2004016836A JP2004315501A JP 2004315501 A JP2004315501 A JP 2004315501A JP 2004016836 A JP2004016836 A JP 2004016836A JP 2004016836 A JP2004016836 A JP 2004016836A JP 2004315501 A JP2004315501 A JP 2004315501A
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compound
group
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hydrogen atom
methyl
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Kanesuke Komatsu
兼介 小松
Tomoya Hirano
智也 平野
Kazuya Kikuchi
和也 菊地
Tetsuo Nagano
哲雄 長野
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Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
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Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a zinc fluorescent probe capable of catching zinc ion specifically and emitting fluorescent light. <P>SOLUTION: This zinc fluorescent probe is expressed by general formula (IA) or (IB) [wherein, R<SP>1</SP>, R<SP>2</SP>are each H or a group expressed by formula (A) (wherein, X<SP>1</SP>to X<SP>4</SP>are each H, 2-pyridylmethyl, 2-pyridylethyl, 2-methyl-6-pyridylmethyl or 2-methyl-6-pyridylethyl, but at least one of them is a group different from the 2-pyridylmethyl; and (m),(n) are each 0 or 1, but are not 0 at the same time), but the R<SP>1</SP>, R<SP>2</SP>are not H at the same time; R<SP>3</SP>, R<SP>4</SP>are each H or a halogen atom; R<SP>5</SP>, R<SP>6</SP>are each H, an alkylcarbonyl or an alkylcarbonyloxymethyl; and R<SP>7</SP>is H or an alkyl]. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

本発明は、亜鉛イオンを特異的に捕捉して蛍光を発する亜鉛蛍光プローブに関するものである。   The present invention relates to a zinc fluorescent probe that specifically captures zinc ions and emits fluorescence.

亜鉛はヒトの体内において鉄に次いで含量の多い必須金属元素であり、細胞内のほとんどの亜鉛イオンは蛋白質と強固に結合して、蛋白質の構造保持や機能発現に関与している。また、細胞内にごく微量存在するフリーの亜鉛イオン（通常はμＭレベル以下である）の生理的役割についても、種々の報告がある。特に、細胞死の一つであるアポトーシスには亜鉛イオンが深く関わっていると考えられており、アルツハイマー病の老人斑の形成を促進しているなどの報告もある。   Zinc is an essential metal element having the second highest content of iron in the human body, and most zinc ions in cells are tightly bound to proteins and are involved in protein structure retention and function expression. In addition, various reports have been made on the physiological role of free zinc ions (usually at a level of μM or less) present in a very small amount in cells. In particular, it is thought that zinc ion is deeply involved in apoptosis, which is one of cell death, and there are reports that it promotes the formation of senile plaques of Alzheimer's disease.

従来、組織内の亜鉛イオンを測定するために、亜鉛イオンを特異的に捕捉して錯体を形成し、錯体形成に伴って蛍光を発する化合物（亜鉛蛍光プローブ）が用いられている。亜鉛蛍光プローブとして、例えば、ＴＳＱ (Reyes, J.G., et al., Biol. Res., 27, 49, 1994）、Zinquin ethyl ester (Tsuda, M. et al., Neurosci., 17, 6678, 1997)、Dansylaminoethylcyclen (Koike, T. et al., J. Am. Chem. Soc., 118, 12686, 1996)、Newport Green (Molecular Probe社のカタログである"Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals" 6th Edition by Richard P. Haugland pp.531-540)などが実用化されている。   Conventionally, in order to measure zinc ions in a tissue, a compound (zinc fluorescent probe) that specifically captures zinc ions to form a complex and emits fluorescence with the complex formation has been used. As a zinc fluorescent probe, for example, TSQ (Reyes, JG, et al., Biol. Res., 27, 49, 1994), Zinquin ethyl ester (Tsuda, M. et al., Neurosci., 17, 6678, 1997) Dansylaminoethylcyclen (Koike, T. et al., J. Am. Chem. Soc., 118, 12686, 1996), and Newport Green ("Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals" 6th Edition by Richard, a catalog of Molecular Probes). P. Haugland pp.531-540) has been put to practical use.

しかしながら、ＴＳＱ、Zinquin、又はDansylaminoethylcyclenを用いた測定では、短波長領域の励起光を用いる必要があるために（それぞれ、励起波長が367nm、368nm、及び323nmである。）、これらの亜鉛蛍光ブローブを生体系の測定に用いた場合には、短波長による励起が細胞傷害を引き起こす可能性があり（細胞工学, 17, pp.584-595, 1998）、また、測定の際に細胞系自身が有する自家蛍光（NADHやフラビン類が発する蛍光）による影響を受けやすいという問題がある。さらに、Dansylaminoethylcyclenは測定時に試薬が存在する環境の違い、すなわち溶媒の種類、あるいは細胞外、細胞内もしくは細胞膜などにおける水溶性、脂溶性などの環境の違いにより蛍光強度が大きく変化するという欠点を有しており（蛋白質・核酸・酵素、増刊号, 42, pp.171-176, 1997）、ＴＳＱは脂溶性が高いために細胞全体に均一に分布させることが困難であるという問題も有している。Newport Greenは長波長の励起光で測定を行なえるものの、亜鉛イオンとのアフィニティーが低く、実用的な測定感度を有していないという問題がある。従って、細胞障害を引き起こすことなく、高感度に亜鉛イオンを測定できる亜鉛蛍光プローブの開発が求められていた。   However, in measurements using TSQ, Zinquin, or Dansylaminoethylcyclen, it is necessary to use excitation light in a short wavelength region (the excitation wavelengths are 367 nm, 368 nm, and 323 nm, respectively). When used for measurement of biological systems, short-wavelength excitation may cause cell injury (Cell Engineering, 17, pp.584-595, 1998), and the cell system itself has There is a problem that it is susceptible to autofluorescence (fluorescence emitted by NADH and flavins). Furthermore, Dansylaminoethylcyclen has the disadvantage that the fluorescence intensity changes significantly due to differences in the environment in which the reagents are present at the time of measurement, that is, differences in the type of solvent or water-soluble or lipid-soluble environment such as extracellular, intracellular, or cell membrane. (Proteins, nucleic acids, enzymes, special issue, 42, pp.171-176, 1997), and TSQ has a problem that it is difficult to uniformly distribute it throughout the cell due to its high lipid solubility. I have. Newport Green can measure with long-wavelength excitation light, but has a problem in that it has low affinity for zinc ions and has no practical measurement sensitivity. Therefore, development of a zinc fluorescent probe capable of measuring zinc ion with high sensitivity without causing cell damage has been demanded.

本発明者らは高感度な亜鉛蛍光プローブを提供すべく鋭意研究を行った結果、環状アミン又はポリアミンを置換基として有する化合物が亜鉛イオンに対して高い特異性を有しており、亜鉛イオンを捕捉して、長波長領域の励起光で強い蛍光を発する錯体を形成することを見出した（特願平11-40325号）。また、本発明者らはさらに研究を重ね、生体内の亜鉛を極めて正確かつ高感度に測定できるフルオレセイン誘導体を提供することに成功した（国際公開WO 01/62755）。もっとも、このフルオレセイン誘導体は極めて亜鉛イオンに対する親和性が高いことから、低濃度の亜鉛イオンの検出には優れるものの、高濃度の亜鉛イオンを正確に測定することに困難があった。このため、より広い範囲で正確に亜鉛イオン濃度を測定できる手段の提供が求められている。
国際公開WO 01/62755 The present inventors have conducted intensive studies to provide a highly sensitive zinc fluorescent probe, and as a result, compounds having a cyclic amine or polyamine as a substituent have high specificity for zinc ions, They found that they trapped to form a complex that emits strong fluorescence with excitation light in the long wavelength region (Japanese Patent Application No. 11-40325). Further, the present inventors have further studied and succeeded in providing a fluorescein derivative capable of measuring zinc in a living body with high accuracy and high sensitivity (International Publication WO 01/62755). However, since this fluorescein derivative has an extremely high affinity for zinc ions, it is excellent in detecting low-concentration zinc ions, but has difficulty in accurately measuring high-concentration zinc ions. For this reason, there is a need to provide a means for accurately measuring the zinc ion concentration over a wider range.
International Publication WO 01/62755

本発明の課題は、低濃度から高濃度までの広い範囲で亜鉛イオンを正確に測定するための手段を提供することにある。本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、国際公開WO 01/62755に記載されたフルオレセイン誘導体に修飾を加えることによって高濃度の亜鉛イオンを正確に測定できること、及びそのようにして提供された新規フルオレセイン誘導体と国際公開WO 01/62755に記載されたフルオレセイン誘導体とを組み合わせることにより、極めて広範囲な濃度にわたって亜鉛イオン濃度を正確に測定できることを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。   An object of the present invention is to provide a means for accurately measuring zinc ions in a wide range from a low concentration to a high concentration. The present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, as a result of being able to accurately measure high concentrations of zinc ions by modifying the fluorescein derivative described in International Publication WO 01/62755, and By combining the thus provided novel fluorescein derivative with the fluorescein derivative described in International Publication WO 01/62755, it has been found that the zinc ion concentration can be accurately measured over an extremely wide range of concentrations. The present invention has been completed based on the above findings.

すなわち、本発明により、下記の一般式(IA)又は(IB)：

Figure 2004315501
〔式中、R1及びR2はそれぞれ独立に水素原子又は下記の式(A)：
Figure 2004315501
 （式中、X1、X2、X3、及びX4はそれぞれ独立に水素原子、2-ピリジルメチル基、2-ピリジルエチル基、2-メチル-6-ピリジルメチル基、又は2-メチル-6-ピリジルエチル基を示すが、X1、X2、X3、及びX4からなる群から選ばれる基のうち少なくとも１つは2-ピリジルエチル基、2-メチル-6-ピリジルメチル基、及び2-メチル-6-ピリジルエチル基からなる群から選ばれる基を示し；m及びnはそれぞれ独立に0又は1を示すが、m及びnが同時に0となることはない）で表される基を示すが、R1及びR2が同時に水素原子であることはなく；R3及びR4はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子を示し；R5及びR6はそれぞれ独立に水素原子、アルキルカルボニル基、又はアルキルカルボニルオキシメチル基を示し、R7は水素原子又はアルキル基を示す〕で表される化合物又はその塩が提供される。 That is, according to the present invention, the following general formula (IA) or (IB):
Figure 2004315501
 Wherein R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom or the following formula (A):
Figure 2004315501
 (Wherein X 1 , X 2 , X 3 , and X 4 are each independently a hydrogen atom, a 2-pyridylmethyl group, a 2-pyridylethyl group, a 2-methyl-6-pyridylmethyl group, or a 2-methyl- Shows a 6-pyridylethyl group, X 1 , X 2 , X 3 , and at least one of the groups selected from the group consisting of X 4 is a 2-pyridylethyl group, a 2-methyl-6-pyridylmethyl group, And a group selected from the group consisting of 2-methyl-6-pyridylethyl group; m and n each independently represent 0 or 1, but m and n are not simultaneously 0) R 1 and R 2 are not a hydrogen atom at the same time; R 3 and R 4 are each independently a hydrogen atom or a halogen atom; R 5 and R 6 are each independently a hydrogen atom, an alkyl indicates a carbonyl group, or an alkylcarbonyloxymethyl group, represented by R 7 represents a hydrogen atom or an alkyl group] Compound or a salt thereof is provided.

上記の発明の好ましい態様として、下記の一般式(IIA)又は(IIB)：

Figure 2004315501
（式中、R11及びR12はそれぞれ独立に水素原子、アルキルカルボニル基、又はアルキルカルボニルオキシメチル基を示し；R13及びR14はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子を示し；R15及びR16はそれぞれ独立に水素原子又はメチル基を示し；R17は水素原子又はアルキル基を示し；p及びqはそれぞれ独立に１又は２を示し、rは０又は１を示すが、
rが１である場合には、R15及びR16が同時に水素原子であり、かつp及びqが同時に１であることはなく、
rが０である場合にはqは２である）で表される化合物又はその塩が提供される。この発明の好ましい態様によれば、R11、R12、R13、及びR14が水素原子である上記化合物又はその塩；及びR17が水素原子である上記化合物又はその塩が提供され、さらに好ましい態様によれば、ベンゼン環上の置換アミノ基が-COOR17で表される基に対してメタ位又はパラ位に結合する化合物又はその塩が提供される。 In a preferred embodiment of the above invention, the following general formula (IIA) or (IIB):
Figure 2004315501
 (Wherein, R 11 and R 12 each independently represent a hydrogen atom, an alkylcarbonyl group, or an alkylcarbonyloxymethyl group; R 13 and R 14 each independently represent a hydrogen atom or a halogen atom; R 15 and R 15 16 independently represents a hydrogen atom or a methyl group; R 17 represents a hydrogen atom or an alkyl group; p and q each independently represent 1 or 2, r represents 0 or 1,
When r is 1, R 15 and R 16 are simultaneously hydrogen atoms, and p and q are not simultaneously 1;
and when r is 0, q is 2) or a salt thereof. According to a preferred embodiment of the present invention, there is provided the compound or a salt thereof, wherein R 11 , R 12 , R 13 , and R 14 are a hydrogen atom; and the compound or a salt thereof, wherein R 17 is a hydrogen atom. According to a preferred embodiment, there is provided a compound or a salt thereof in which a substituted amino group on a benzene ring is bonded to the group represented by -COOR 17 at the meta or para position.

別の観点からは、本発明により、上記一般式(IA)、(IB)、(IIA)、若しくは(IIB)で表される化合物又はそれらの塩を含む亜鉛蛍光プローブ；及び上記一般式(IA)、(IB)、(IIA)、若しくは(IIB)で表される化合物又はそれらの塩と亜鉛イオンとから形成される亜鉛錯体が提供される。この亜鉛蛍光プローブは、組織や細胞内の亜鉛イオンを測定するために用いることができる。   In another aspect, the present invention provides a zinc fluorescent probe comprising a compound represented by the general formula (IA), (IB), (IIA), or (IIB) or a salt thereof; ), (IB), (IIA), or (IIB), or a zinc complex formed from a salt thereof and a zinc ion. This zinc fluorescent probe can be used to measure zinc ions in tissues and cells.

また、本発明により、亜鉛イオンの測定方法であって、上記一般式(IA)、(IB)、(IIA)、若しくは(IIB)で表される化合物又はそれらの塩を亜鉛蛍光プローブとして用いる方法；亜鉛イオンの測定方法であって、下記の工程：(a)上記一般式(IA)、(IB)、(IIA)、若しくは(IIB)で表される化合物又はその塩と亜鉛イオンとを反応させる工程、及び(b)上記工程で生成した亜鉛錯体の蛍光強度を測定する工程を含む方法；並びに、上記一般式(IA)、(IB)、(IIA)、若しくは(IIB)で表される化合物又はそれらの塩の亜鉛蛍光プローブとしての使用が提供される。   In addition, according to the present invention, a method for measuring zinc ions, wherein the compound represented by the general formula (IA), (IB), (IIA), or (IIB) or a salt thereof is used as a zinc fluorescent probe. A method for measuring zinc ion, comprising the following steps: (a) reacting a compound represented by the above general formula (IA), (IB), (IIA) or (IIB) or a salt thereof with zinc ion And (b) a method comprising the step of measuring the fluorescence intensity of the zinc complex generated in the above step; and represented by the above general formula (IA), (IB), (IIA), or (IIB) Use of the compounds or their salts as zinc fluorescent probes is provided.

さらに別の観点からは、下記の一般式(IIIA)又は(IIIB)：

Figure 2004315501
（式中、R21及びR22はそれぞれ独立に水素原子、アルキルカルボニル基、又はアルキルカルボニルオキシメチル基を示し；R23及びR24はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子を示し：R25及びR26はそれぞれ独立に水素原子又はメチル基を示し；R27は水素原子又はアルキル基を示し；s及びtはそれぞれ独立に１又は２を示し、uは０又は１を示す）において、下記の(1)から(14)：
(1)s及びtが１であり、uが１であり、R25及びR26が水素原子である化合物又はその塩
(2)s及びtが１であり、uが１であり、R25が水素原子であり、R26がメチル基である化合物又はその塩
(3)s及びtが１であり、uが１であり、R25及びR26がメチル基である化合物又はその塩
(4)sが１であり、tが２であり、uが１であり、R25及びR26が水素原子である化合物又はその塩
(5)sが１であり、tが２であり、uが１であり、R25が水素原子であり、R26がメチル基である化合物又はその塩
(6)sが１であり、tが２であり、uが１であり、R25がメチル基であり、R26が水素原子である化合物又はその塩
(7)sが１であり、tが２であり、uが１であり、R25及びR26がメチル基である化合物又はその塩
(8)s及びtが２であり、uが１であり、R25及びR26が水素原子である化合物又はその塩
(9)s及びtが２であり、uが１であり、R25が水素原子であり、R26がメチル基である化合物又はその塩
(10)s及びtが２であり、uが１であり、R25及びR26がメチル基である化合物又はその塩
(11)tが１であり、uが０であり、R26が水素原子である化合物又はその塩
(12)tが１であり、uが０であり、R26がメチル基である化合物又はその塩
(13)tが２であり、uが０であり、R26が水素原子である化合物又はその塩
(14)tが２であり、uが０であり、R26がメチル基である化合物又はその塩
からなる群から選択される２個以上の化合物又はその塩を用いて亜鉛イオンを測定する工程を含む方法が提供される。 In still another aspect, the following general formula (IIIA) or (IIIB):
Figure 2004315501
 (Wherein, R 21 and R 22 each independently represent a hydrogen atom, an alkylcarbonyl group, or an alkylcarbonyloxymethyl group; R 23 and R 24 each independently represent a hydrogen atom or a halogen atom: R 25 and R 25 26 independently represents a hydrogen atom or a methyl group; R 27 represents a hydrogen atom or an alkyl group; s and t each independently represent 1 or 2; u represents 0 or 1); 1) to (14):
(1) A compound or a salt thereof, wherein s and t are 1, u is 1, and R 25 and R 26 are hydrogen atoms.
(2) A compound or salt thereof, wherein s and t are 1, u is 1, R 25 is a hydrogen atom, and R 26 is a methyl group.
(3) A compound or a salt thereof, wherein s and t are 1, u is 1, and R 25 and R 26 are methyl groups.
(4) A compound or salt thereof in which s is 1, t is 2, u is 1, and R 25 and R 26 are hydrogen atoms.
(5) A compound or salt thereof in which s is 1, t is 2, u is 1, R 25 is a hydrogen atom, and R 26 is a methyl group.
(6) A compound or salt thereof in which s is 1, t is 2, u is 1, R 25 is a methyl group, and R 26 is a hydrogen atom.
(7) A compound or salt thereof wherein s is 1, t is 2, u is 1, and R 25 and R 26 are methyl groups.
(8) A compound or salt thereof wherein s and t are 2, u is 1 and R 25 and R 26 are hydrogen atoms.
(9) A compound or salt thereof wherein s and t are 2, u is 1, R 25 is a hydrogen atom, and R 26 is a methyl group.
(10) A compound or a salt thereof, wherein s and t are 2, u is 1, and R 25 and R 26 are methyl groups.
(11) A compound or salt thereof wherein t is 1, u is 0, and R 26 is a hydrogen atom
(12) A compound or salt thereof wherein t is 1, u is 0, and R 26 is a methyl group
(13) A compound or salt thereof wherein t is 2, u is 0, and R 26 is a hydrogen atom
(14) a step of measuring zinc ion using two or more compounds or salts thereof selected from the group consisting of compounds or salts thereof, wherein t is 2, u is 0, and R 26 is a methyl group; Are provided.

この発明の好ましい態様によれば、R21、R22、R23、R24、及びR27が水素原子である上記の方法が提供される。この方法によれば、選択される２個以上の化合物又はその塩は、それぞれ異なる亜鉛イオン濃度領域において亜鉛錯体を形成することができ、広範囲の濃度で亜鉛イオンを測定することができる。さらに本発明により、上記の(1)から(14)の化合物又はその塩からなる群から選ばれる２個以上の化合物又はその塩を含む亜鉛イオン測定用のキットが提供される。 According to a preferred embodiment of the present invention, there is provided the above method, wherein R 21 , R 22 , R 23 , R 24 , and R 27 are hydrogen atoms. According to this method, two or more selected compounds or salts thereof can form zinc complexes in different zinc ion concentration regions, and can measure zinc ions in a wide range of concentrations. Further, according to the present invention, there is provided a kit for measuring zinc ions, comprising two or more compounds selected from the group consisting of the compounds (1) to (14) or salts thereof, or salts thereof.

本発明の化合物又はその塩は亜鉛イオンの測定のために有用である。本発明の化合物又はその塩は、高濃度の亜鉛イオンが存在する試料中の亜鉛イオン濃度を正確に測定することができ、それらの化合物を適宜組み合わせることにより、極めて広範囲の亜鉛イオン濃度を正確に測定することが可能になる。   The compound of the present invention or a salt thereof is useful for measuring zinc ion. The compound of the present invention or a salt thereof can accurately measure the zinc ion concentration in a sample in which a high concentration of zinc ion is present, and by appropriately combining those compounds, it is possible to accurately measure an extremely wide range of zinc ion concentration. It becomes possible to measure.

本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルキルカルボニル基又はアルキルカルボニルオキシメチル基など）のアルキル部分は、例えば、炭素数１〜12個、好ましくは炭素数１〜6個、好ましくは炭素数１〜４個の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として低級アルキル基（炭素数1〜6個のアルキル基）が好ましい。低級アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基などを挙げることができる。本明細書においてハロゲン原子という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。   In the present specification, the alkyl portion of an “alkyl group” or a substituent containing an alkyl portion (such as an alkylcarbonyl group or an alkylcarbonyloxymethyl group) has, for example, 1 to 12 carbon atoms, preferably 1 to 6 carbon atoms. , Preferably a linear, branched, cyclic, or combination thereof having 1 to 4 carbon atoms. More specifically, a lower alkyl group (an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms) is preferable as the alkyl group. Examples of lower alkyl groups include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, cyclopropyl, n-butyl, sec-butyl, isobutyl, tert-butyl, cyclopropylmethyl, n -Pentyl group, n-hexyl group and the like. In the present specification, a halogen atom may be any of a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom, and is preferably a fluorine atom, a chlorine atom, or a bromine atom.

上記一般式(IA)及び(IB)において、ベンゼン環上に置換するR1及びR2の位置は特に限定されない。R2が水素原子である場合には、R1が-COOR7で表される基（ラクトン環を形成する場合には対応するカルボニル基）に対してメタ位又はパラ位に結合することが好ましい。一般式(IIA)及び(IIB)におけるベンゼン環上の置換アミノ基の位置は特に限定されないが、好ましくは、-COOR17で表される基に対してメタ位又はパラ位であり、特に好ましくは-COOR17で表される基に対してパラ位である。 In the above general formulas (IA) and (IB), the positions of R 1 and R 2 substituted on the benzene ring are not particularly limited. When R 2 is a hydrogen atom, R 1 is preferably bonded to the group represented by -COOR 7 (or the corresponding carbonyl group when forming a lactone ring) at the meta or para position. . The position of the substituted amino group on the benzene ring in the general formulas (IIA) and (IIB) is not particularly limited, but is preferably a meta-position or a para-position to a group represented by -COOR 17 , and particularly preferably. -It is para to the group represented by COOR 17 .

上記一般式(IA)及び(IB)で表される化合物において、R1及びR2のいずれか一方が水素原子であり、他方が式(A)で表される基であることが好ましい。式(A)で表される基において、X1、X2、X3、及びX4はそれぞれ独立に水素原子、2-ピリジルメチル基、2-ピリジルエチル基、2-メチル-6-ピリジルメチル基、又は2-メチル-6-ピリジルエチル基を示すが、X1、X2、X3、及びX4からなる群から選ばれる基のうち少なくとも１つは2-ピリジルエチル基、2-メチル-6-ピリジルメチル基、及び2-メチル-6-ピリジルエチル基からなる群から選ばれる基を示す。上記一般式(IA)及び(IB)で表される化合物において、mが0であり、nが1であり、かつX4が水素原子であることが好ましく、この場合にX1及びX2のうちの少なくとも１つが2-ピリジルエチル基、2-メチル-6-ピリジルメチル基、及び2-メチル-6-ピリジルエチル基からなる群から選ばれる基であることが好ましい。また、mが0であり、nが1であり、かつX4が水素原子である場合において、X1が2-ピリジルエチル基、2-メチル-6-ピリジルメチル基、及び2-メチル-6-ピリジルエチル基からなる群から選ばれる基であり、X2が2-ピリジルメチル基、2-ピリジルエチル基、2-メチル-6-ピリジルメチル基、及び2-メチル-6-ピリジルエチル基からなる群から選ばれる基であることが好ましい。 In the compounds represented by the general formulas (IA) and (IB), one of R 1 and R 2 is preferably a hydrogen atom, and the other is preferably a group represented by the formula (A). In the group represented by the formula (A), X 1 , X 2 , X 3 , and X 4 are each independently a hydrogen atom, a 2-pyridylmethyl group, a 2-pyridylethyl group, a 2-methyl-6-pyridylmethyl A group, or a 2-methyl-6-pyridylethyl group, wherein at least one of the groups selected from the group consisting of X 1 , X 2 , X 3 , and X 4 is a 2-pyridylethyl group, 2-methyl And a group selected from the group consisting of a -6-pyridylmethyl group and a 2-methyl-6-pyridylethyl group. In the compounds represented by the above general formulas (IA) and (IB), m is 0, n is 1, and X 4 is preferably a hydrogen atom, in which case X 1 and X 2 At least one of them is preferably a group selected from the group consisting of a 2-pyridylethyl group, a 2-methyl-6-pyridylmethyl group, and a 2-methyl-6-pyridylethyl group. Further, when m is 0, n is 1, and X 4 is a hydrogen atom, X 1 is a 2-pyridylethyl group, a 2-methyl-6-pyridylmethyl group, and a 2-methyl-6 X is a group selected from the group consisting of a pyridylethyl group, wherein X 2 is a 2-pyridylmethyl group, a 2-pyridylethyl group, a 2-methyl-6-pyridylmethyl group, and a 2-methyl-6-pyridylethyl group It is preferably a group selected from the group consisting of:

R5及びR6としては水素原子が好ましく、イメージングの用途ではR5及びR6がアセチル基又はアセトキシメチル基であることが好ましい。R3及びR4がともに水素原子であるか、ともに塩素原子であることが好ましい。R7は水素原子であることが好ましい。 R 5 and R 6 are preferably a hydrogen atom, and for imaging use, R 5 and R 6 are preferably an acetyl group or an acetoxymethyl group. It is preferred that R 3 and R 4 are both hydrogen atoms or both are chlorine atoms. R 7 is preferably a hydrogen atom.

上記一般式(IIA)又は(IIB)で表される化合物において、R11及びR12としては水素原子が好ましく、イメージングの用途ではR11及びR12がアセチル基又はアセトキシメチル基であることが好ましい。R13及びR14がともに水素原子であるか、ともに塩素原子であることが好ましく、R13及びR14がともに水素原子であることがさらに好ましい。R17が水素原子であることが好ましい。一般式(IIA)又は(IIB)で表される化合物において、p及びqが１であり、R15が水素原子であり、R16がメチル基である化合物；p及びqが１であり、R15及びR16がメチル基である化合物；pが１であり、qが２であり、R15及びR16が水素原子である化合物；pが１であり、qが２であり、R15が水素原子であり、R16がメチル基である化合物；pが１であり、qが２であり、R15がメチル基であり、R16が水素原子である化合物；pが１であり、qが２であり、R15及びR16がメチル基である化合物；p及びqが２であり、R15及びR16が水素原子である化合物；p及びqが２であり、R15が水素原子であり、R16がメチル基である化合物；及びp及びqが２であり、R15及びR16がメチル基である化合物が好ましい。 In the compound represented by the general formula (IIA) or (IIB), preferably a hydrogen atom as R 11 and R 12, it is preferably R 11 and R 12 is an acetyl group or an acetoxymethyl group in imaging applications . Preferably, both R 13 and R 14 are hydrogen atoms or both are chlorine atoms, and more preferably, both R 13 and R 14 are hydrogen atoms. Preferably, R 17 is a hydrogen atom. A compound represented by the general formula (IIA) or (IIB), wherein p and q are 1, R 15 is a hydrogen atom, and R 16 is a methyl group; p and q are 1; A compound in which 15 and R 16 are methyl groups; a compound in which p is 1 and q is 2; and a compound in which R 15 and R 16 are hydrogen atoms; p is 1 and q is 2 and R 15 is A compound wherein a hydrogen atom and R 16 is a methyl group; a compound wherein p is 1 and q is 2; R 15 is a methyl group and R 16 is a hydrogen atom; p is 1 and q Is a compound wherein R 15 and R 16 are methyl groups; a compound wherein p and q are 2 and R 15 and R 16 are hydrogen atoms; p and q are 2 and R 15 is a hydrogen atom And a compound wherein R 16 is a methyl group; and a compound wherein p and q are 2 and R 15 and R 16 are a methyl group.

上記一般式(IA)、(IB)、(IIA)、又は(IIB)で表される本発明の化合物は酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。本発明の化合物又はその塩は水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。   The compound of the present invention represented by the general formula (IA), (IB), (IIA) or (IIB) can exist as an acid addition salt or a base addition salt. Examples of the acid addition salt include mineral salts such as hydrochloride, sulfate, and nitrate, and organic acid salts such as methanesulfonate, p-toluenesulfonate, oxalate, citrate, and tartrate. Examples of the base addition salt include metal salts such as sodium salt, potassium salt, calcium salt and magnesium salt, ammonium salts, and organic amine salts such as triethylamine salt. In addition, they may form salts with amino acids such as glycine. Although the compound of the present invention or a salt thereof may exist as a hydrate or a solvate, all of these substances are included in the scope of the present invention.

上記一般式(IA)、(IB)、(IIA)、又は(IIB)で表される本発明の化合物は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、１個又は２個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などは、いずれも本発明の範囲に包含される。また、R7、R17、又はR27が水素原子の場合にはカルボキシル基がラクトンを形成する場合もあるが、本発明の範囲にはこのような構造異性体も包含される。なお、一般式(IA)においてR5が水素原子である化合物と一般式(IB)においてR7が水素原子である化合物は互変異性体に相当しており、一般式(IIA)においてR11が水素原子である化合物と一般式(IIB)においてR17が水素原子である化合物とは互変異性体に相当する。このような互変異性体の存在は当業者に容易に理解され、本発明の範囲にはいずれの互変異性体も包含されることを理解すべきである。 The compound of the present invention represented by the general formula (IA), (IB), (IIA), or (IIB) may have one or more asymmetric carbons depending on the type of the substituent. Are stereoisomers such as optically active isomers based on one or more asymmetric carbons and diastereoisomers based on two or more asymmetric carbons, as well as any mixtures of stereoisomers, racemates, etc. Are all included in the scope of the present invention. When R 7 , R 17 or R 27 is a hydrogen atom, the carboxyl group may form a lactone in some cases, and such structural isomers are included in the scope of the present invention. Note that the compound in which R 5 is a hydrogen atom in the general formula (IA) and the compound in which R 7 is a hydrogen atom in the general formula (IB) correspond to a tautomer, and R 11 in the general formula (IIA) Is a hydrogen atom and a compound in which R 17 is a hydrogen atom in the general formula (IIB) corresponds to a tautomer. It should be understood that the existence of such tautomers is readily understood by those skilled in the art, and that the scope of the present invention includes any tautomers.

本発明の化合物の代表的化合物の製造方法を下記のスキームに示す。また、本明細書の実施例には、このスキームに記載した製造方法がより詳細かつ具体的に示されている。従って、当業者は、これらの説明を基にして反応原料、反応条件、及び反応試薬などを適宜選択し、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることによって、上記一般式で表される本発明の化合物をいずれも製造することができる。国際公開WO 01/62755には亜鉛イオン測定用のフルオレセイン誘導体の製造方法が開示されており、この刊行物を参照することにより、本発明の化合物を容易に製造できる場合もある。国際公開WO 01/62755の開示のすべてを参照として本明細書の開示に含める。   A method for producing a representative compound of the compound of the present invention is shown in the following scheme. Further, in the examples of the present specification, the production method described in this scheme is shown in more detail and concretely. Therefore, those skilled in the art can appropriately select reaction raw materials, reaction conditions, reaction reagents, and the like based on these descriptions, and modify or modify these methods as necessary, whereby the method represented by the above general formula is obtained. Any of the compounds of the present invention can be prepared. International Publication WO 01/62755 discloses a method for producing a fluorescein derivative for measuring zinc ions, and the compound of the present invention may be easily produced in some cases by referring to this publication. The entire disclosure of WO 01/62755 is incorporated herein by reference.

Figure 2004315501
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原料化合物として用いることができる4-アミノフルオレセイン、5-アミノフルオレセイン、及び6-アミノフルオレセインなどの化合物は、例えば、亀谷哲治著、有機合成化学IX、南江堂、215頁(1977年)等に準じて製造できる。反応を行うにあたってアミノ基を保護基する場合には、保護基の種類は特に限定されないが、例えば、p-ニトロベンゼンスルホン酸基、トリフルオロアセチル基、トリアルキルシリル基などを適宜利用できる。アミノ基の保護基については、例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（Protective Groups in Organic Synthesis）、グリーン（T. W. Greene）著、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・インコーポレイテッド（John Wiley & Sons, Inc.）（1981年）などを参照することができる。   Compounds such as 4-aminofluorescein, 5-aminofluorescein, and 6-aminofluorescein that can be used as a starting compound are, for example, according to Tetsuharu Kametani, Synthetic Organic Chemistry IX, Nankodo, p. 215 (1977), etc. Can be manufactured. When a protecting group is used for the amino group in carrying out the reaction, the type of the protecting group is not particularly limited, and for example, a p-nitrobenzenesulfonic acid group, a trifluoroacetyl group, a trialkylsilyl group, or the like can be appropriately used. Regarding the protecting group for the amino group, for example, Protective Groups in Organic Synthesis, written by TW Greene, John Wiley & Sons Inc. , Inc.) (1981).

上記一般式(IA)、(IB)、(IIA)、又は(IIB)で表される本発明の化合物又はその塩は、亜鉛蛍光プローブとして有用である。上記一般式(I)又は一般式(II)で表される本発明の化合物又はその塩は、それ自体は強い蛍光を発する性質を有していないが、亜鉛イオンを捕捉して亜鉛錯体を形成すると、強い蛍光を発するようになる。上記化合物又はその塩は亜鉛イオンを特異的に捕捉することができ、極めて錯体形成が速やかであるという特徴を有している。また、形成された亜鉛錯体は、生体組織や細胞に障害を生じない長波長領域の励起光によって強い蛍光を発するという特徴がある。従って、上記一般式(IA)、(IB)、(IIA)、又は(IIB)で表される本発明の化合物又はその塩は、生細胞や生組織中の亜鉛イオンを生理条件下で測定するための亜鉛蛍光プローブとして極めて有用である。また、上記一般式(IA)、(IB)、(IIA)、又は(IIB)で表される本発明の化合物又はその塩は、高い亜鉛イオン濃度の領域において亜鉛イオン濃度依存的に亜鉛錯体を形成できるという特徴があり、高濃度の亜鉛イオンを含む試料の亜鉛イオン濃度を測定するために好適に用いることができる。なお、本明細書において用いられる「測定」という用語については、定量及び定性を含めて最も広義に解釈すべきものである。   The compound of the present invention represented by the above general formula (IA), (IB), (IIA) or (IIB) or a salt thereof is useful as a zinc fluorescent probe. The compound of the present invention represented by the general formula (I) or the general formula (II) or a salt thereof does not itself have a property of emitting strong fluorescence, but forms a zinc complex by capturing zinc ions. Then, strong fluorescence is emitted. The above compound or a salt thereof is capable of specifically capturing zinc ions, and has a feature that complex formation is extremely rapid. Further, the formed zinc complex is characterized in that it emits strong fluorescence by excitation light in a long wavelength region that does not cause any damage to living tissues and cells. Therefore, the compound of the present invention represented by the general formula (IA), (IB), (IIA), or (IIB) or a salt thereof, measures zinc ions in living cells and tissues under physiological conditions. Is extremely useful as a fluorescent probe for zinc. Further, the compound of the present invention represented by the general formula (IA), (IB), (IIA), or (IIB) or a salt thereof forms a zinc complex in a zinc ion concentration-dependent manner in a high zinc ion concentration region. Since it can be formed, it can be suitably used for measuring the zinc ion concentration of a sample containing a high concentration of zinc ions. The term “measurement” used in the present specification should be interpreted in the broadest sense, including quantitative and qualitative.

本発明の亜鉛蛍光プローブの使用方法は特に限定されず、従来公知の亜鉛プローブと同様に用いることが可能である。通常は、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに上記一般式(I)で表される化合物及びその塩からなる群から選ばれる一の物質を溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、蛍光スペクトルを測定すればよい。本発明の亜鉛蛍光プローブを適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、pH調節剤などの添加物と組み合わせることができる。   The method of using the zinc fluorescent probe of the present invention is not particularly limited, and can be used in the same manner as a conventionally known zinc probe. Usually, the above-mentioned general formula (I) in an aqueous medium such as physiological saline or buffer, or a mixture of an aqueous medium and a water-miscible organic solvent such as ethanol, acetone, ethylene glycol, dimethyl sulfoxide, and dimethylformamide. One substance selected from the group consisting of the compounds represented by the above and salts thereof may be dissolved, this solution may be added to an appropriate buffer containing cells and tissues, and the fluorescence spectrum may be measured. The zinc fluorescent probe of the present invention may be used in the form of a composition in combination with a suitable additive. For example, it can be combined with additives such as a buffer, a solubilizer, and a pH adjuster.

本発明により提供される第二の態様の亜鉛イオンの測定方法は、上記の一般式(IIIA)又は(IIIB)において、
(1)s及びtが１であり、ｕが１であり、R25及びR26が水素原子である化合物又はその塩
(2)s及びtが１であり、ｕが１であり、R25が水素原子であり、R26がメチル基である化合物又はその塩
(3)s及びtが１であり、ｕが１であり、R25及びR26がメチル基である化合物又はその塩
(4)sが１であり、tが２であり、ｕが１であり、R25及びR26が水素原子である化合物又はその塩
(5)sが１であり、tが２であり、ｕが１であり、R25が水素原子であり、R26がメチル基である化合物又はその塩
(6)sが１であり、tが２であり、ｕが１であり、R25がメチル基であり、R26が水素原子である化合物又はその塩
(7)sが１であり、tが２であり、ｕが１であり、R25及びR26がメチル基である化合物又はその塩
(8)s及びtが２であり、ｕが１であり、R25及びR26が水素原子である化合物又はその塩
(9)s及びtが２であり、ｕが１であり、R25が水素原子であり、R26がメチル基である化合物又はその塩
(10)s及びtが２であり、ｕが１であり、R25及びR26がメチル基である化合物又はその塩
(11)tが１であり、uが０であり、R26が水素原子である化合物又はその塩
(12)tが１であり、uが０であり、R26がメチル基である化合物又はその塩
(13)tが２であり、uが０であり、R26が水素原子である化合物又はその塩
(14)tが２であり、uが０であり、R26がメチル基である化合物又はその塩
からなる群から選択される２個以上の化合物又はその塩を用いて亜鉛イオンを測定する工程を含む。 The method for measuring zinc ion of the second embodiment provided by the present invention, the general formula (IIIA) or (IIIB),
(1) A compound or salt thereof wherein s and t are 1, u is 1, and R 25 and R 26 are hydrogen atoms.
(2) A compound or a salt thereof, wherein s and t are 1, u is 1, R 25 is a hydrogen atom, and R 26 is a methyl group.
(3) A compound or a salt thereof, wherein s and t are 1, u is 1, and R 25 and R 26 are methyl groups.
(4) A compound or salt thereof wherein s is 1, t is 2, u is 1, and R 25 and R 26 are hydrogen atoms.
(5) A compound or salt thereof in which s is 1, t is 2, u is 1, R 25 is a hydrogen atom, and R 26 is a methyl group.
(6) A compound or salt thereof in which s is 1, t is 2, u is 1, R 25 is a methyl group, and R 26 is a hydrogen atom.
(7) A compound or salt thereof wherein s is 1, t is 2, u is 1, and R 25 and R 26 are methyl groups.
(8) A compound or salt thereof wherein s and t are 2, u is 1 and R 25 and R 26 are hydrogen atoms.
(9) A compound or salt thereof, wherein s and t are 2, u is 1, R 25 is a hydrogen atom, and R 26 is a methyl group.
(10) A compound or salt thereof wherein s and t are 2, u is 1, and R 25 and R 26 are methyl groups.
(11) A compound or salt thereof wherein t is 1, u is 0, and R 26 is a hydrogen atom
(12) A compound or salt thereof wherein t is 1, u is 0, and R 26 is a methyl group
(13) A compound or salt thereof wherein t is 2, u is 0, and R 26 is a hydrogen atom
(14) a step of measuring zinc ion using two or more compounds or salts thereof selected from the group consisting of compounds or salts thereof, wherein t is 2, u is 0, and R 26 is a methyl group; including.

一般式(IIIA)又は(IIIB)において、R21からR27は一般式(IIA)又は(IIB)について説明したR11からR17と同様である。R21及びR22はともに水素原子であることが好ましいく、イメージングの用途ではR21及びR22がアセチル基又はアセトキシメチル基であることが好ましい。R23及びR24がともに水素原子であるか、ともに塩素原子であることが好ましく、R23及びR24がともに水素原子であることがさらに好ましい。R27が水素原子であることが好ましい。上記の(1)から(14)の化合物又はその塩からなる群から選択される２個以上の化合物又はその塩は、それぞれ異なる亜鉛イオン濃度領域において亜鉛錯体を形成することができるので、これらの２個以上の化合物又はその塩を組み合わせて用いることによって広範囲の濃度で亜鉛イオンを正確に測定することができる。例えば、上記の(1)から(14)の化合物又はその塩からなる群から選択される３個以上の化合物又はその塩を用いることが好ましく、より好ましくは４個以上の化合物又はその塩を用いることができる。選択される２個以上の化合物のうち、少なくとも１個は上記の(1)又は(11)以外の化合物から選択される化合物であることが好ましい。 In the general formula (IIIA) or (IIIB), R 21 to R 27 are the same as R 11 to R 17 described for the general formula (IIA) or (IIB). Preferably, R 21 and R 22 are both hydrogen atoms, and for imaging applications, R 21 and R 22 are preferably acetyl or acetoxymethyl. R 23 and R 24 are preferably both hydrogen atoms or both chlorine atoms, and more preferably both R 23 and R 24 are hydrogen atoms. Preferably, R 27 is a hydrogen atom. Since two or more compounds or salts thereof selected from the group consisting of the compounds (1) to (14) or salts thereof described above can form zinc complexes in different zinc ion concentration regions, these By using two or more compounds or salts thereof in combination, zinc ions can be accurately measured in a wide range of concentrations. For example, it is preferable to use three or more compounds or salts thereof selected from the group consisting of the compounds (1) to (14) or salts thereof, and more preferably to use four or more compounds or salts thereof. be able to. At least one of the two or more compounds selected is preferably a compound selected from compounds other than the above (1) or (11).

この方法を行うにあたり、化合物又はその塩の選択は測定対象となる亜鉛イオンの濃度に応じて適宜行うことができるが、例えば、本明細書の実施例に具体的に示された方法に従って、図１のグラフを参照しつつ２個以上の化合物又はその塩を選択できる。図１のグラフに示された化合物８、化合物１３、化合物１７、及び化合物２２は、それぞれ上記の(11)、（4）、(8)、及び(2)においてR21、R22、R23、R24、及びR27が水素原子の化合物であり、これらの４種類の化合物により10-8から10-3 mol/Lの亜鉛イオンを正確に測定できる。このように、化合物の選択は、各化合物について亜鉛イオンの濃度変化に対する蛍光強度変化を求め、蛍光強度変化比（ある亜鉛イオン濃度における蛍光強度／最大蛍光強度）が０．５となる亜鉛イオン濃度が２つの化合物間で10倍以上となるように選択するのがよい。 In carrying out this method, the selection of a compound or a salt thereof can be appropriately performed depending on the concentration of zinc ion to be measured.For example, according to the method specifically shown in Examples of the present specification, FIG. Two or more compounds or salts thereof can be selected with reference to one graph. Compound 8, compound 13, compound 17, and compound 22 shown in the graph of FIG. 1 correspond to R 21 , R 22 , and R 23 in (11), (4), (8), and (2), respectively. , R 24 , and R 27 are compounds having a hydrogen atom, and these four compounds can accurately measure zinc ions at 10 −8 to 10 −3 mol / L. As described above, the selection of the compound is performed by determining the change in the fluorescence intensity with respect to the change in the concentration of zinc ion for each compound, and determining the ratio of the change in the fluorescence intensity (fluorescence intensity at a certain zinc ion concentration / maximum fluorescence intensity) to 0.5. Is preferably 10 times or more between the two compounds.

また、この方法を行うにあたり、亜鉛イオン濃度の測定のために用いられる他の試薬を１又は２個以上組み合わせて用いてもよい。例えば、図１のグラフにおいて、上記の４種類の化合物に公知化合物であるZnAF-2（国際公開WO 01/62755の化合物12）を組み合わせることによって、10-9から10-3 mol/Lの亜鉛イオンを正確に測定できる。なお、上記の(1)から(14)の化合物又はその塩からなる群から選ばれる２個以上の化合物又はその塩を組み合わせた亜鉛イオン測定用のキットも本発明の範囲に包含されるが、このキットにおいて、亜鉛イオン濃度の測定のために用いられる他の試薬を１又は２個以上組み合わせて用いてもよい。 In carrying out this method, one or more other reagents used for measuring the zinc ion concentration may be used in combination. For example, in the graph of FIG. 1, by combining a known compound ZnAF-2 (compound 12 of International Publication WO 01/62755) with the above four compounds, zinc of 10 -9 to 10 -3 mol / L is obtained. Ions can be measured accurately. Note that a kit for measuring zinc ions in which two or more compounds selected from the group consisting of the compounds (1) to (14) or salts thereof or a salt thereof are also included in the scope of the present invention, In this kit, one or more other reagents used for measuring the zinc ion concentration may be used in combination.

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。実施例中の化合物番号は、上記のスキーム中の化合物番号に対応している。
例１：化合物８の合成
5-アミノフルオレセイン（１）4.0 g（12 mmol）を80 mlのジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、炭酸セシウム7.9 g（24 mmol）を加えた。続いて、この溶液に無水ピバル酸4.9 ml（24 mmol）を加え、室温で1時間撹拌した。反応液を桐山漏斗で濾過し、ジメチルホルムアミドを減圧下留去した後、シリカゲルカラムで精製し、化合物２（5.9 g）を得た。白色固体。収率100％。
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) :
7.77 (d, 1H, J=8.3), 7.01 (d, 2H, J=2.2), 6.95 (d, 2H, J=8.6), 6.80-6.75 (m, 3H), 6.22 (d, 1H, J=1.8), 4.21 (s, 2H), 1.36 (s, 18H)
MASS (FAB) : 516 (M++1) Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples, but the scope of the present invention is not limited to the following Examples. The compound numbers in the examples correspond to the compound numbers in the above scheme.
Example 1: Synthesis of compound 8
To a solution of 4.0 g (12 mmol) of 5-aminofluorescein (1) in 80 ml of dimethylformamide was added 7.9 g (24 mmol) of cesium carbonate. Subsequently, 4.9 ml (24 mmol) of pivalic anhydride was added to the solution, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The reaction solution was filtered with a Kiriyama funnel, and dimethylformamide was distilled off under reduced pressure, and then purified with a silica gel column to obtain Compound 2 (5.9 g). White solid. 100% yield.
1 H-NMR (CDCl 3 , 300 MHz):
7.77 (d, 1H, J = 8.3), 7.01 (d, 2H, J = 2.2), 6.95 (d, 2H, J = 8.6), 6.80-6.75 (m, 3H), 6.22 (d, 1H, J = 1.8), 4.21 (s, 2H), 1.36 (s, 18H)
MASS (FAB): 516 (M + +1)

化合物２（5.9 g, 12 mmol）を塩化メチレン100 mlに溶かし、ピリジン3.5 ml（46 mmol）を加えた。続いて4-ニトロベンゼンスルホニルクロリド7.7 g（35 mmol）を加えた後、室温で６時間撹拌した。塩化メチレンを300 ml加えた後、水、飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。塩化メチレンを減圧下留去した後、シリカゲルカラムにより精製し、化合物３（5.5 g）を得た。白色固体。収率69％。
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) :
8.20 (d, 2H, J = 9.0), 7.88 (d, 1H, J = 8.2), 7.81 (d, 2H, J = 9.0), 7.29-7.26 (m, 1H), 7.05 (d, 2H, J = 2.0), 6.83 (d, 1H, J = 1.5), 6.74 (dd, 2H, J = 8.7, 2.1), 6.68 (d, 2H, J = 8.7), 1.38 (s, 18H)
MASS (FAB) : 701 (M++1) Compound 2 (5.9 g, 12 mmol) was dissolved in 100 ml of methylene chloride, and 3.5 ml (46 mmol) of pyridine was added. Subsequently, 7.7 g (35 mmol) of 4-nitrobenzenesulfonyl chloride was added, and the mixture was stirred at room temperature for 6 hours. After adding 300 ml of methylene chloride, the mixture was washed with water and saturated saline, and dried over sodium sulfate. After methylene chloride was distilled off under reduced pressure, the residue was purified by a silica gel column to obtain Compound 3 (5.5 g). White solid. Yield 69%.
1 H-NMR (CDCl 3 , 300 MHz):
8.20 (d, 2H, J = 9.0), 7.88 (d, 1H, J = 8.2), 7.81 (d, 2H, J = 9.0), 7.29-7.26 (m, 1H), 7.05 (d, 2H, J = 2.0), 6.83 (d, 1H, J = 1.5), 6.74 (dd, 2H, J = 8.7, 2.1), 6.68 (d, 2H, J = 8.7), 1.38 (s, 18H)
MASS (FAB): 701 (M + +1)

化合物３（3.0 g, 4.3 mmol）を300 mlのアセトニトリルに溶かした溶液に、炭酸カリウム3.0 g（21 mmol）、1,2-ジブロモエタン15 ml（0.17 mol）を加え、100度で20時間撹拌した。アセトニトリルを減圧下留去し、水500 mlに懸濁させた。この懸濁液を塩化メチレンで抽出した後、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。塩化メチレンを減圧下留去した後、シリカゲルカラムにより精製し、化合物４（2.9 g）を得た。白色固体。収率84％。
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) :
8.12-8.09 (m, 3H), 7.71 (dd, 1H, J = 8.2, 1.8), 7.56 (d, 2H, J = 9.0), 7.02 (d, 2H, J = 2.2), 6.86 (dd, 2H, J = 8.6, 2.2), 6.43 (d, 1H, J = 1.8), 3.85 (t, 2H, J = 6.6), 3.40 (t, 2H, J = 6.6), 1.38 (s, 18H)
MASS (FAB) : 807, 809 (M++1) To a solution of compound 3 (3.0 g, 4.3 mmol) in 300 ml of acetonitrile was added 3.0 g (21 mmol) of potassium carbonate and 15 ml (0.17 mol) of 1,2-dibromoethane, and the mixture was stirred at 100 ° C for 20 hours. did. Acetonitrile was distilled off under reduced pressure and suspended in 500 ml of water. The suspension was extracted with methylene chloride, washed with brine, and dried over sodium sulfate. After methylene chloride was distilled off under reduced pressure, the residue was purified by a silica gel column to obtain Compound 4 (2.9 g). White solid. Yield 84%.
1 H-NMR (CDCl 3 , 300 MHz):
8.12-8.09 (m, 3H), 7.71 (dd, 1H, J = 8.2, 1.8), 7.56 (d, 2H, J = 9.0), 7.02 (d, 2H, J = 2.2), 6.86 (dd, 2H, J = 8.6, 2.2), 6.43 (d, 1H, J = 1.8), 3.85 (t, 2H, J = 6.6), 3.40 (t, 2H, J = 6.6), 1.38 (s, 18H)
MASS (FAB): 807, 809 (M + +1)

2-アミノメチルピリジン（５）3 ml（29 mmol）とピリジン 6 ml（74 mmol）を60 mlの塩化メチレンに溶かした溶液に、4-ニトロベンゼンスルホニルクロリド7.2 g（33 mmol）を40 mlの塩化メチレンに溶かした溶液を30分かけて滴下した。滴下後室温で1時間撹拌した後、反応溶液を2 M炭酸ナトリウム水溶液で洗った。飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。塩化メチレンを減圧下留去した後、シリカゲルカラムにより精製し、化合物６（5.4 g）を得た。白色固体。収率64％。
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) :
8.44-8.42 (m, 1H), 8.27 (d, 2H, J=8.7), 8.03 (d, 2H, J=8.7), 7.65-7.59 (m, 1H), 7.19-7.13 (m, 2H), 6.25 (s, 1H), 4.34 (s, 2H)
MASS (EI) : 293 (M+) In a solution of 3 ml (29 mmol) of 2-aminomethylpyridine (5) and 6 ml (74 mmol) of pyridine in 60 ml of methylene chloride, 7.2 g (33 mmol) of 4-nitrobenzenesulfonyl chloride was added to 40 ml of chloride. A solution in methylene was added dropwise over 30 minutes. After the addition, the mixture was stirred at room temperature for 1 hour, and then the reaction solution was washed with a 2 M aqueous sodium carbonate solution. After washing with saturated saline, it was dried over sodium sulfate. After methylene chloride was distilled off under reduced pressure, the residue was purified by a silica gel column to obtain Compound 6 (5.4 g). White solid. Yield 64%.
1 H-NMR (CDCl 3 , 300 MHz):
8.44-8.42 (m, 1H), 8.27 (d, 2H, J = 8.7), 8.03 (d, 2H, J = 8.7), 7.65-7.59 (m, 1H), 7.19-7.13 (m, 2H), 6.25 (s, 1H), 4.34 (s, 2H)
MASS (EI): 293 (M + )

化合物４（0.30 g, 0.37 mmol）を20 mlのアセトニトリルに溶かした溶液に化合物６（0.15 g, 0.51 mmol）と炭酸カリウム70 mg（0.51 mmol）を加え、100度で2時間撹拌した。アセトニトリルを減圧下留去した後、2 M炭酸ナトリウム水溶液に溶かし、塩化メチレンで抽出した。飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。塩化メチレンを減圧下留去した後、シリカゲルカラムにより精製し、化合物7（0.12 g）を得た。黄色固体。収率31％。
1H-NMR (CDCl3, 300M Hz) :
8.24 (d, 2H, J=8.8), 8.10 (d, 2H, J=8.8), 8.07 (d, 1H, J=8.4), 8.03-8.01 (m, 1H), 7.80 (d, 2H, J=8.8), 7.65-7.57 (m, 2H), 7.50 (d, 2H, J=8.8), 7.24 (d, 1H, J=7.7), 7.13-7.08 (m, 1H), 6.97 (d, 2H, J=1.5), 6.82-6.80 (m, 4H), 6.63 (d, 1H, J=1.5), 4.36 (s, 2H), 3.66 (t, 2H, J=7.1), 3.43 (t, 2H, J=7.1), 1.38 (s, 18H)
MASS (FAB) : 1020 (M++1) Compound 6 (0.15 g, 0.51 mmol) and 70 mg (0.51 mmol) of potassium carbonate were added to a solution of compound 4 (0.30 g, 0.37 mmol) dissolved in 20 ml of acetonitrile, and the mixture was stirred at 100 ° C for 2 hours. After acetonitrile was distilled off under reduced pressure, the residue was dissolved in a 2 M aqueous solution of sodium carbonate and extracted with methylene chloride. After washing with saturated saline, it was dried over sodium sulfate. After methylene chloride was distilled off under reduced pressure, the residue was purified by a silica gel column to obtain Compound 7 (0.12 g). Yellow solid. Yield 31%.
1 H-NMR (CDCl 3 , 300 MHz):
8.24 (d, 2H, J = 8.8), 8.10 (d, 2H, J = 8.8), 8.07 (d, 1H, J = 8.4), 8.03-8.01 (m, 1H), 7.80 (d, 2H, J = 8.8), 7.65-7.57 (m, 2H), 7.50 (d, 2H, J = 8.8), 7.24 (d, 1H, J = 7.7), 7.13-7.08 (m, 1H), 6.97 (d, 2H, J = 1.5), 6.82-6.80 (m, 4H), 6.63 (d, 1H, J = 1.5), 4.36 (s, 2H), 3.66 (t, 2H, J = 7.1), 3.43 (t, 2H, J = 7.1), 1.38 (s, 18H)
MASS (FAB): 1020 (M + +1)

化合物７（0.11 g, 0.11 mmol）を10 mlのジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、炭酸カリウム80 mg（0.58 mmol）、チオフェノール0.1 ml（1.0 mmol）を加え、室温で5時間撹拌した。水酸化カリウム200 mg（3.4 mmol）を、1 mlのMeOHと1 ml の水に溶かした溶液を加え、室温で2時間撹拌した。溶媒を減圧下留去した後、2 M塩酸に溶かした。ジエチルエーテルで洗浄後、2 M塩酸を減圧下留去した。残渣をODSカラム及び逆相HPLCで精製し、化合物８（44 mg）を3TFA塩として得た。褐色固体。収率48％。
1H-NMR (CDCl3, 300M Hz) :
8.39-8.37 (m, 1H), 7.74 (d, 1H, J=8.6), 7.74-7.68 (m, 1H), 7.29-7.24 (m, 2H), 6.86-6.79 (m, 3H), 6.74 (d, 2H, J=2.2), 6.60 (dd, 2H, J=8.8, 2.2), 6.28 (d, 1H, J=2.0), 4.25 (s, 2H), 3.45 (t, 2H, J=6.2), 3.14 (t, 2H, J=6.2)
MASS (FAB) : 482 (M++1) 80 mg (0.58 mmol) of potassium carbonate and 0.1 ml (1.0 mmol) of thiophenol were added to a solution of compound 7 (0.11 g, 0.11 mmol) dissolved in 10 ml of dimethylformamide, and the mixture was stirred at room temperature for 5 hours. A solution of 200 mg (3.4 mmol) of potassium hydroxide in 1 ml of MeOH and 1 ml of water was added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. After evaporating the solvent under reduced pressure, the residue was dissolved in 2 M hydrochloric acid. After washing with diethyl ether, 2 M hydrochloric acid was distilled off under reduced pressure. The residue was purified by ODS column and reverse phase HPLC to give Compound 8 (44 mg) as a 3TFA salt. Brown solid. 48% yield.
1 H-NMR (CDCl 3 , 300 MHz):
8.39-8.37 (m, 1H), 7.74 (d, 1H, J = 8.6), 7.74-7.68 (m, 1H), 7.29-7.24 (m, 2H), 6.86-6.79 (m, 3H), 6.74 (d , 2H, J = 2.2), 6.60 (dd, 2H, J = 8.8, 2.2), 6.28 (d, 1H, J = 2.0), 4.25 (s, 2H), 3.45 (t, 2H, J = 6.2), 3.14 (t, 2H, J = 6.2)
MASS (FAB): 482 (M + +1)

例２：化合物１３の合成
化合物６（1 g, 3.4 mmol）を80 ml のベンゼンに溶かした溶液に、2-ピリジンエタノール（９）0.5 ml（4.4 mol）、アゾジカルボン酸エステル（40%トルエン溶液）2.5 ml（5.2 mmol）、トリフェニルホスフィン1.25 g（4.8 mmol）を加え、室温で3時間撹拌した。ベンゼンを減圧下留去した後、2 M炭酸ナトリウム水溶液に溶かし、塩化メチレンで抽出した。飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。塩化メチレンを減圧下留去した後、シリカゲルカラムにより精製し、化合物１０（0.95 g）を得た。黄色オイル。収率70％。
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) :
8.43-8.40 (m, 2H, J=8.6), 8.26 (d, 2H, J=8.6), 7.68-7.62 (m, 1H), 7.57-7.51 (m, 1H), 7.38 (d, 1H, J=7.9), 7.20-7.16 (m, 1H), 7.11-7.09 (m, 1H), 7.06 (d, 1H, J=7.7), 4.58 (s, 2H), 3.74 (t, 2H, J=7.3), 3.00 (t, 2H, J=7.3)
MASS (FAB) : 399 (M++1) Example 2: Synthesis of compound 13 In a solution of compound 6 (1 g, 3.4 mmol) in 80 ml of benzene, 0.5 ml (4.4 mol) of 2-pyridineethanol (9) and azodicarboxylic acid ester (40% toluene solution) ) 2.5 ml (5.2 mmol) and 1.25 g (4.8 mmol) of triphenylphosphine were added, and the mixture was stirred at room temperature for 3 hours. After benzene was distilled off under reduced pressure, the residue was dissolved in a 2 M aqueous solution of sodium carbonate and extracted with methylene chloride. After washing with saturated saline, it was dried over sodium sulfate. After methylene chloride was distilled off under reduced pressure, the residue was purified by a silica gel column to obtain Compound 10 (0.95 g). Yellow oil. 70% yield.
1 H-NMR (CDCl 3 , 300 MHz):
8.43-8.40 (m, 2H, J = 8.6), 8.26 (d, 2H, J = 8.6), 7.68-7.62 (m, 1H), 7.57-7.51 (m, 1H), 7.38 (d, 1H, J = 7.9), 7.20-7.16 (m, 1H), 7.11-7.09 (m, 1H), 7.06 (d, 1H, J = 7.7), 4.58 (s, 2H), 3.74 (t, 2H, J = 7.3), 3.00 (t, 2H, J = 7.3)
MASS (FAB): 399 (M + +1)

化合物１０（0.95 g, 2.4 mmol）を50 mlのジメチルホルムアミドに溶かした溶液に、炭酸カリウム0.99 g（7.2 mmol）、チオフェノール0.49 ml（4.8 mmol）を加え、室温で10時間撹拌した。ジメチルホルムアミドを減圧下留去した後、2 M炭酸ナトリウム水溶液に溶かし、塩化メチレンで抽出した。飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。塩化メチレンを減圧下留去した後、シリカゲルカラムにより精製し、化合物１１（0.37 g）を得た。黄色オイル。収率73％。
1H-NMR (CDCl3, 300MHz) :
8.54-8.53 (m, 2H), 7.65-7.56 (m, 2H), 7.30 (d, 1H, J=7.7), 7.20-7.09 (m, 3H), 3.96 (s, 2H), 3.12-3.00 (m, 4H), 2.07 (br, 1H)
MASS (FAB) : 214 (M++1) To a solution of compound 10 (0.95 g, 2.4 mmol) in 50 ml of dimethylformamide was added 0.99 g (7.2 mmol) of potassium carbonate and 0.49 ml (4.8 mmol) of thiophenol, and the mixture was stirred at room temperature for 10 hours. After dimethylformamide was distilled off under reduced pressure, the residue was dissolved in a 2 M aqueous sodium carbonate solution and extracted with methylene chloride. After washing with saturated saline, it was dried over sodium sulfate. After methylene chloride was distilled off under reduced pressure, the residue was purified by a silica gel column to obtain Compound 11 (0.37 g). Yellow oil. 73% yield.
1 H-NMR (CDCl 3 , 300MHz):
8.54-8.53 (m, 2H), 7.65-7.56 (m, 2H), 7.30 (d, 1H, J = 7.7), 7.20-7.09 (m, 3H), 3.96 (s, 2H), 3.12-3.00 (m , 4H), 2.07 (br, 1H)
MASS (FAB): 214 (M + +1)

化合物４（0.20 g, 0.25 mmol）をアセトニトリル50 mlに懸濁させて、ヨウ化カリウム0.10 g（0.60 mmol）、炭酸カリウム0.10 g（0.72 mmol）、化合物１１（0.20 g, 0.94 mmol）を加えて１４時間還流した。アセトニトリルを減圧下留去した後、2 N炭酸ナトリウム水溶液に溶かし、塩化メチレンで抽出した。塩化メチレン層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。塩化メチレンを減圧下留去し、シリカゲルカラムにより精製して、化合物１２（38 mg）を得た。黄色固体。収率16％。
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) :
8.41-8.40 (m, 1H), 8.36-8.34 (m, 1H), 8.08 (d, 2H, J=8.6), 8.00 (d, 1H, J=8.2), 7.58-7.50 (m, 5H), 7.14-7.03 (m, 4H), 6.96 (d, 2H, J=2.2), 6.68 (d, 2H, J=8.6), 6.58 (d, 1H, J=1.5), 3.67 (s, 2H), 3.57 (t, 2H, J=6.6), 2.83-2.76 (m, 4H), 2.66 (t, 2H, J=6.6), 1.31 (s, 18H)
MASS (FAB) : 940 (M++1) Compound 4 (0.20 g, 0.25 mmol) was suspended in 50 ml of acetonitrile, and 0.10 g (0.60 mmol) of potassium iodide, 0.10 g (0.72 mmol) of potassium carbonate, and compound 11 (0.20 g, 0.94 mmol) were added. Refluxed for 14 hours. After acetonitrile was distilled off under reduced pressure, the residue was dissolved in a 2N aqueous sodium carbonate solution and extracted with methylene chloride. The methylene chloride layer was washed with saturated saline and dried over sodium sulfate. Methylene chloride was distilled off under reduced pressure, and the residue was purified by a silica gel column to obtain Compound 12 (38 mg). Yellow solid. Yield 16%.
1 H-NMR (CDCl 3 , 300 MHz):
8.41-8.40 (m, 1H), 8.36-8.34 (m, 1H), 8.08 (d, 2H, J = 8.6), 8.00 (d, 1H, J = 8.2), 7.58-7.50 (m, 5H), 7.14 -7.03 (m, 4H), 6.96 (d, 2H, J = 2.2), 6.68 (d, 2H, J = 8.6), 6.58 (d, 1H, J = 1.5), 3.67 (s, 2H), 3.57 ( (t, 2H, J = 6.6), 2.83-2.76 (m, 4H), 2.66 (t, 2H, J = 6.6), 1.31 (s, 18H)
MASS (FAB): 940 (M + +1)

化合物１２（38 mg, 40 μmol）から化合物８の合成法と同様にして化合物１３（18 mg）を4TFA塩として得た。褐色固体。収率43%。
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) :
8.33-8.30 (m, 2H), 7.95-7.89 (m, 1H), 7.86-7.80 (m, 1H), 7.65 (d, 1H, J=8.6), 7.43-7.32 (m, 4H), 6.77 (dd, 1H, J=8.6, 2.0), 6.68-6.65 (m, 4H), 6.53 (dd, 2H, J=8.8, 2.4), 6.16 (d, 1H, J=2.4), 4.41 (s, 2H), 3.45-3.41 (m, 4H), 3.24-3.12 (m, 4H)
MASS (FAB) : 587 (M++1) Compound 13 (18 mg) was obtained as a 4TFA salt from compound 12 (38 mg, 40 μmol) in the same manner as in the synthesis of compound 8. Brown solid. Yield 43%.
1 H-NMR (CDCl 3 , 300 MHz):
8.33-8.30 (m, 2H), 7.95-7.89 (m, 1H), 7.86-7.80 (m, 1H), 7.65 (d, 1H, J = 8.6), 7.43-7.32 (m, 4H), 6.77 (dd , 1H, J = 8.6, 2.0), 6.68-6.65 (m, 4H), 6.53 (dd, 2H, J = 8.8, 2.4), 6.16 (d, 1H, J = 2.4), 4.41 (s, 2H), 3.45-3.41 (m, 4H), 3.24-3.12 (m, 4H)
MASS (FAB): 587 (M + +1)

例３：化合物１７の合成
2-ビニルピリジン（１４）0.5 ml（4.6 mmol）を50 mlのメタノールに加えた溶液に2-アミノエチルピリジン0.56 ml（4.6 mmol）、氷酢酸0.27 ml（4.6 mmol）加えてアルゴン下で24時間還流した。室温まで冷却後、氷水に注いで、2 M水酸化ナトリウム水溶液で中和した。塩化メチレンで抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥した。塩化メチレンを減圧下留去し、シリカゲルカラムにより精製して化合物１５（0.27 g）を得た。黄色オイル。収率25%。
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) :
8.50 (d, 2H, J=4.0), 7.57 (td, 2H, J=7.7, 1.8), 7.16-7.08 (m, 4H), 3.08-3.03 (m, 4H), 2.99-2.94 (m, 4H), 1.96 (br, 1H)
MASS (EI) : 227 (M+) Example 3: Synthesis of compound 17
To a solution of 0.5 ml (4.6 mmol) of 2-vinylpyridine (14) in 50 ml of methanol was added 0.56 ml (4.6 mmol) of 2-aminoethylpyridine and 0.27 ml (4.6 mmol) of glacial acetic acid under argon for 24 hours. Refluxed. After cooling to room temperature, the mixture was poured into ice water and neutralized with a 2 M aqueous sodium hydroxide solution. Extracted with methylene chloride and dried over magnesium sulfate. Methylene chloride was distilled off under reduced pressure, and the residue was purified by a silica gel column to obtain Compound 15 (0.27 g). Yellow oil. Yield 25%.
1 H-NMR (CDCl 3 , 300 MHz):
8.50 (d, 2H, J = 4.0), 7.57 (td, 2H, J = 7.7, 1.8), 7.16-7.08 (m, 4H), 3.08-3.03 (m, 4H), 2.99-2.94 (m, 4H) , 1.96 (br, 1H)
MASS (EI): 227 (M + )

化合物４（0.10 g, 0.12 mmol）および化合物１５（60 mg, 0.26 mmol）から化合物１２の合成法と同様にして化合物１６（25 mg）を得た。黄色固体。収率21%。
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) :
8.36-8.34 (m, 2H), 8.09 (d, 2H, J=8.6), 8.01 (d, 1H, J=8.2), 7.55-7.50 (m,4H), 7.09-7.05 (m, 2H), 7.01-6.98 (m, 2H), 6.94 (d, 2H, J=1.1), 6.76-6.75 (m, 4H), 6.64 (d, 1H, J=1.5), 3.45 (t, 2H, J=7.0), 2.80-2.76 (m, 4H), 2.69-2.64 (m, 4H), 2.60 (t, 2H, J=7.0)
MASS (FAB) : 954 (M++1) Compound 16 (25 mg) was obtained from compound 4 (0.10 g, 0.12 mmol) and compound 15 (60 mg, 0.26 mmol) in the same manner as in the synthesis of compound 12. Yellow solid. Yield 21%.
1 H-NMR (CDCl 3 , 300 MHz):
8.36-8.34 (m, 2H), 8.09 (d, 2H, J = 8.6), 8.01 (d, 1H, J = 8.2), 7.55-7.50 (m, 4H), 7.09-7.05 (m, 2H), 7.01 -6.98 (m, 2H), 6.94 (d, 2H, J = 1.1), 6.76-6.75 (m, 4H), 6.64 (d, 1H, J = 1.5), 3.45 (t, 2H, J = 7.0), 2.80-2.76 (m, 4H), 2.69-2.64 (m, 4H), 2.60 (t, 2H, J = 7.0)
MASS (FAB): 954 (M + +1)

化合物１６（25 mg, 26 μmol）から化合物８の合成法と同様にして化合物１７（12 mg）を4TFA塩として得た。褐色固体。収率21%。
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) :
8.09-8.07 (m, 2H), 7.87-7.81 (m,2H), 7.76 (d, 1H, J=8.6), 7.38 (d, 2H, J=7.9), 7.31-7.27 (m, 2H), 6.88 (dd, 1H, J=8.6, 2.2), 6.75 (d, 2H, J=8.8), 6.73 (d, 2H, J=2.4), 6.61 (dd, 2H, J=8.8, 2.4), 3.71-3.62 (m, 6H), 3.48 (t, 2H, J=5.7), 3.23 (t, 4H, J=6.4)
MASS (FAB) : 601 (M++1) Compound 17 (12 mg) was obtained as a 4TFA salt from compound 16 (25 mg, 26 μmol) in the same manner as in the synthesis of compound 8. Brown solid. Yield 21%.
1 H-NMR (CDCl 3 , 300 MHz):
8.09-8.07 (m, 2H), 7.87-7.81 (m, 2H), 7.76 (d, 1H, J = 8.6), 7.38 (d, 2H, J = 7.9), 7.31-7.27 (m, 2H), 6.88 (dd, 1H, J = 8.6, 2.2), 6.75 (d, 2H, J = 8.8), 6.73 (d, 2H, J = 2.4), 6.61 (dd, 2H, J = 8.8, 2.4), 3.71-3.62 (m, 6H), 3.48 (t, 2H, J = 5.7), 3.23 (t, 4H, J = 6.4)
MASS (FAB): 601 (M + +1)

例４：化合物２２の合成
化合物６（2.0 g, 6.8 mmol）および6-メチル-2-ピリジンメタノール（１８）1.1 g（8.8 mmol）から化合物１０の合成法と同様にして化合物１９（2.4 g）を得た。黄色オイル。収率88%。
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) :
8.39-8.38 (m, 1H), 8.23 (d, 2H, J=8.8), 7.98 (d, 2H, J=8.8), 7.67-7.61 (m, 1H), 7.51-7.45 (m, 1H), 7.39 (d, 1H, J=7.7), 7.17-7.13 (m, 1H), 7.09-7.07 (m, 1H), 6.98-6.95 (m, 1H), 4.68 (s, 2H), 4.63 (s, 2H), 2.30 (s, 3H)
MASS (EI) : 398 (M+) Example 4: Synthesis of compound 22 Compound 19 (2.4 g) from compound 6 (2.0 g, 6.8 mmol) and 1.1 g (8.8 mmol) of 6-methyl-2-pyridinemethanol (18) in the same manner as compound 10 was synthesized. Got. Yellow oil. Yield 88%.
1 H-NMR (CDCl 3 , 300 MHz):
8.39-8.38 (m, 1H), 8.23 (d, 2H, J = 8.8), 7.98 (d, 2H, J = 8.8), 7.67-7.61 (m, 1H), 7.51-7.45 (m, 1H), 7.39 (d, 1H, J = 7.7), 7.17-7.13 (m, 1H), 7.09-7.07 (m, 1H), 6.98-6.95 (m, 1H), 4.68 (s, 2H), 4.63 (s, 2H) , 2.30 (s, 3H)
MASS (EI): 398 (M + )

化合物１９（2.4 g, 6.0 mmol）から化合物１１の合成法と同様にして化合物２０（0.78 g）を得た。黄色オイル。収率61%。
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) :
8.55 (m, 1H), 7.64 (td, 1H, J=7.5, 1.9), 7.53 (t, 1H, J=7.7), 7.37 (d, 1H, J=7.5), 7.15 (d, 1H, J=7.7), 7.15-7.14 (m, 1H), 7.01 (d, 1H, J=7.7), 3.99 (s, 2H), 3.94 (s, 2H), 2.54 (s, 3H)
MASS (FAB) : 214 (M++1) Compound 20 (0.78 g) was obtained from compound 19 (2.4 g, 6.0 mmol) in the same manner as in the synthesis of compound 11. Yellow oil. Yield 61%.
1 H-NMR (CDCl 3 , 300 MHz):
8.55 (m, 1H), 7.64 (td, 1H, J = 7.5, 1.9), 7.53 (t, 1H, J = 7.7), 7.37 (d, 1H, J = 7.5), 7.15 (d, 1H, J = 7.7), 7.15-7.14 (m, 1H), 7.01 (d, 1H, J = 7.7), 3.99 (s, 2H), 3.94 (s, 2H), 2.54 (s, 3H)
MASS (FAB): 214 (M + +1)

化合物４（0.45 g, 0.56 mmol）および化合物２０（0.24 g, 1.1 mmol）から化合物１２の合成法と同様にして化合物２１（0.18 g）を得た。黄色固体。収率35%。
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) :
8.43-8.41 (m, 1H), 8.06 (d, 2H, J=8.8), 7.96 (d, 1H, J=8.6), 7.64-7.58 (m, 1H), 7.53-7.48 (m, 2H), 7.51 (d, 2H, J=8.8), 7.35-7.32 (m, 1H), 7.16-7.12 (m, 2H), 7.03-6.99 (m, 1H), 7.00 (d, 2H, J=2.2), 6.76 (dd, 2H, J=8.6, 2.2), 6.62 (d, 2H, J=8.6), 6.46 (d, 1H, J=1.3), 3.69-3.65 (m, 6H,), 2.67 (t, 2H, J=6.2), 2.48 (s, 3H), 1.37 (s, 18H)
MASS (FAB) : 940 (M++1) Compound 21 (0.18 g) was obtained from compound 4 (0.45 g, 0.56 mmol) and compound 20 (0.24 g, 1.1 mmol) in the same manner as in the synthesis of compound 12. Yellow solid. Yield 35%.
1 H-NMR (CDCl 3 , 300 MHz):
8.43-8.41 (m, 1H), 8.06 (d, 2H, J = 8.8), 7.96 (d, 1H, J = 8.6), 7.64-7.58 (m, 1H), 7.53-7.48 (m, 2H), 7.51 (d, 2H, J = 8.8), 7.35-7.32 (m, 1H), 7.16-7.12 (m, 2H), 7.03-6.99 (m, 1H), 7.00 (d, 2H, J = 2.2), 6.76 ( dd, 2H, J = 8.6, 2.2), 6.62 (d, 2H, J = 8.6), 6.46 (d, 1H, J = 1.3), 3.69-3.65 (m, 6H,), 2.67 (t, 2H, J = 6.2), 2.48 (s, 3H), 1.37 (s, 18H)
MASS (FAB): 940 (M + +1)

化合物２１（0.18 g, 0.19 mmol）から化合物８の合成法と同様にして化合物２２（76 mg）を4TFA塩として得た。褐色固体。収率38%。
1H-NMR (CD3OD, 300 MHz) :
8.47-8.45 (m, 1H), 7.95-7.84 (m, 2H), 7.65 (d, 1H, J=8.6), 7.46-7.38 (m, 4H), 6.74 (dd, 1H, J=8.6, 2.0), 6.68 (d, 2H, J=2.4,), 6.65 (d, 2H, J=8.8), 6.56 (dd, 2H, J=8.8, 2.4), 6.07 (d, 1H, J=2.0), 4.32 (s, 2H), 4.28 (s, 2H), 3.30-3.25 (m, 2H), 3.08 (t, 2H, J=5.9), 2.55 (s, 3H)
MASS (FAB) : 587 (M++1) Compound 22 (76 mg) was obtained as a 4TFA salt from compound 21 (0.18 g, 0.19 mmol) in the same manner as in the synthesis of compound 8. Brown solid. Yield 38%.
1 H-NMR (CD 3 OD, 300 MHz):
8.47-8.45 (m, 1H), 7.95-7.84 (m, 2H), 7.65 (d, 1H, J = 8.6), 7.46-7.38 (m, 4H), 6.74 (dd, 1H, J = 8.6, 2.0) , 6.68 (d, 2H, J = 2.4,), 6.65 (d, 2H, J = 8.8), 6.56 (dd, 2H, J = 8.8, 2.4), 6.07 (d, 1H, J = 2.0), 4.32 ( s, 2H), 4.28 (s, 2H), 3.30-3.25 (m, 2H), 3.08 (t, 2H, J = 5.9), 2.55 (s, 3H)
MASS (FAB): 587 (M + +1)

例５：化合物２７の合成
6-メチル-2-ピリジンメタノール（１８）4.0 g（33 mmol）を150 mlの塩化メチレンに溶かした溶液に塩化チオニル12 ml（0.17mol）を滴下した。滴下後45度で1時間還流した。塩化メチレンを減圧下留去した後、2 M炭酸ナトリウム水溶液に溶かし、塩化メチレンで抽出した。塩化メチレン層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸カリウムで乾燥した。塩化メチレンを減圧下留去し化合物２３（4.5 g）を得た。無色オイル。収率97％。
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) :
7.60 (t, 1H, J=7.7), 7.28 (d, 1H, J=7.7), 7.09 (d, 1H, J=7.7), 4.64 (s, 2H), 2.56 (s, 3H)
MASS (EI) : 141 (M+) Example 5: Synthesis of compound 27
12 ml (0.17 mol) of thionyl chloride was added dropwise to a solution of 4.0 g (33 mmol) of 6-methyl-2-pyridinemethanol (18) in 150 ml of methylene chloride. After the dropwise addition, the mixture was refluxed at 45 degrees for 1 hour. After methylene chloride was distilled off under reduced pressure, the residue was dissolved in a 2 M aqueous sodium carbonate solution and extracted with methylene chloride. The methylene chloride layer was washed with saturated saline and dried over potassium sulfate. The methylene chloride was distilled off under reduced pressure to obtain Compound 23 (4.5 g). Colorless oil. 97% yield.
1 H-NMR (CDCl 3 , 300 MHz):
7.60 (t, 1H, J = 7.7), 7.28 (d, 1H, J = 7.7), 7.09 (d, 1H, J = 7.7), 4.64 (s, 2H), 2.56 (s, 3H)
MASS (EI): 141 (M + )

化合物２３（2.0 g, 14 mmol）を200 mlのアセトニトリルに溶かした溶液にp-トルエンスルホンアミド1.2 g（7.1 mmol）を加えて90度で18時間還流した。アセトニトリルを減圧下留去し、水200 mlに懸濁させた。この懸濁液を塩化メチレンで抽出した後、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。塩化メチレンを減圧下留去して化合物２４（2.8 g）を得た。黄色固体。収率100％。
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) :
7.70 (d, 2H, J=8.2), 7.42 (t, 2H, J=7.7), 7.23 (d, 2H, J=8.2), 7.13 (d, 2H, J=7.7), 6.91 (d, 2H, J=7.7), 4.55 (s, 4H), 2.41 (s, 3H), 2.36 (s, 6H)
MASS (FAB) : 382 (M++1) To a solution of compound 23 (2.0 g, 14 mmol) in 200 ml of acetonitrile was added 1.2 g (7.1 mmol) of p-toluenesulfonamide, and the mixture was refluxed at 90 degrees for 18 hours. Acetonitrile was distilled off under reduced pressure and suspended in 200 ml of water. The suspension was extracted with methylene chloride, washed with brine, and dried over sodium sulfate. The methylene chloride was distilled off under reduced pressure to obtain Compound 24 (2.8 g). Yellow solid. 100% yield.
1 H-NMR (CDCl 3 , 300 MHz):
7.70 (d, 2H, J = 8.2), 7.42 (t, 2H, J = 7.7), 7.23 (d, 2H, J = 8.2), 7.13 (d, 2H, J = 7.7), 6.91 (d, 2H, J = 7.7), 4.55 (s, 4H), 2.41 (s, 3H), 2.36 (s, 6H)
MASS (FAB): 382 (M + +1)

化合物２４（2.8 g, 7.3 mmol）を50 mlの硫酸に溶かした後、120度で2時間撹拌した。冷却後、氷水に注ぎ、2 M水酸化ナトリウム水溶液で中和した。塩化メチレンで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥した。塩化メチレンを減圧下留去し、シリカゲルカラムにより精製して化合物２５（0.64 g）を得た。黄色固体。収率39%。
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) :
7.53 (t, 2H, J=7.5), 7.17 (d, 2H, J=7.5), 7.02 (d, 2H, J=7.5), 3.97 (s, 4H), 2.54 (s, 6H)
MASS (EI) : 227 (M+) Compound 24 (2.8 g, 7.3 mmol) was dissolved in 50 ml of sulfuric acid, and the mixture was stirred at 120 degrees for 2 hours. After cooling, the mixture was poured into ice water and neutralized with a 2 M aqueous sodium hydroxide solution. Extracted with methylene chloride and dried over sodium sulfate. Methylene chloride was distilled off under reduced pressure, and the residue was purified by a silica gel column to obtain Compound 25 (0.64 g). Yellow solid. Yield 39%.
1 H-NMR (CDCl 3 , 300 MHz):
7.53 (t, 2H, J = 7.5), 7.17 (d, 2H, J = 7.5), 7.02 (d, 2H, J = 7.5), 3.97 (s, 4H), 2.54 (s, 6H)
MASS (EI): 227 (M + )

化合物４（0.10 g, 0.12 mmol）および化合物２５（0.13 g, 0.57 mmol）から化合物１２の合成法と同様にして化合物２６（65mg）を得た。黄色固体。収率55%。
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) :
8.06 (d, 2H, J=9.0), 7.96 (d, 2H, J=8.3), 7.54-7.47 (m, 5H), 7.14 (d, 2H, J=7.7), 7.02-7.00 (d, 2H, J=2.2), 7.00 (d, 2H, J=2.2), 6.75 (dd, 2H, J=8.6, 2.2), 6.61 (d, 2H, J=8.6), 6.46 (d, 1H), 3.68-3.65 (m, 6H), 2.68 (t, 2H, J=6.2), 2.47 (s, 6H), 1.37 (s, 18H)
MASS (FAB) : 954 (M++1) Compound 26 (65 mg) was obtained from compound 4 (0.10 g, 0.12 mmol) and compound 25 (0.13 g, 0.57 mmol) in the same manner as in the synthesis of compound 12. Yellow solid. 55% yield.
1 H-NMR (CDCl 3 , 300 MHz):
8.06 (d, 2H, J = 9.0), 7.96 (d, 2H, J = 8.3), 7.54-7.47 (m, 5H), 7.14 (d, 2H, J = 7.7), 7.02-7.00 (d, 2H, J = 2.2), 7.00 (d, 2H, J = 2.2), 6.75 (dd, 2H, J = 8.6, 2.2), 6.61 (d, 2H, J = 8.6), 6.46 (d, 1H), 3.68-3.65 (m, 6H), 2.68 (t, 2H, J = 6.2), 2.47 (s, 6H), 1.37 (s, 18H)
MASS (FAB): 954 (M + +1)

化合物２６（65 mg, 0.068 mmol）から化合物８の合成法と同様にして化合物２７（31 mg）を4TFA塩として得た。褐色固体。収率43%。
1H-NMR (CD3OD, 300 MHz) :
7.98-7.93 (m, 2H), 7.61 (d, 1H, J=8.8), 7.57 (d, 2H, J=7.9), 7.44 (d, 2H, J=7.7), 6.69 (dd, 1H, J=8.8, 1.8), 6.66-6.63 (m, 4H), 6.53 (dd, 2H, J=8.8, 2.2), 5.98 (d, 1H, J=1.8), 4.13 (s, 4H), 3.16-3.13 (m, 2H), 2.87-2.83 (m, 2H), 2.52 (s, 6H)
MASS (FAB) : 601 (M++1) Compound 27 (31 mg) was obtained as a 4TFA salt from compound 26 (65 mg, 0.068 mmol) in the same manner as in the synthesis of compound 8. Brown solid. Yield 43%.
1 H-NMR (CD 3 OD, 300 MHz):
7.98-7.93 (m, 2H), 7.61 (d, 1H, J = 8.8), 7.57 (d, 2H, J = 7.9), 7.44 (d, 2H, J = 7.7), 6.69 (dd, 1H, J = 8.8, 1.8), 6.66-6.63 (m, 4H), 6.53 (dd, 2H, J = 8.8, 2.2), 5.98 (d, 1H, J = 1.8), 4.13 (s, 4H), 3.16-3.13 (m , 2H), 2.87-2.83 (m, 2H), 2.52 (s, 6H)
MASS (FAB): 601 (M + +1)

例６：化合物２８の合成
化合物１３（11.4 mg, 0.011 mmol）をアセトニトリル10 mlに懸濁し、炭酸セシウム（14.0 mg, 43 μM）加えた後、無水酢酸2.2 mlを少しずつ加えた。室温で一時間撹拌した後、反応液を減圧留去した。シリカゲルカラムで精製して化合物２８（5.8 mg）を得た。白色固体。収率４７%。
1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) :
8.41-8.36 (m, 2H), 7.72 (d, 1H, J=8.4), 7.47-7.41 (m, 1H), 7.39-7.33 (m, 1H), 7.06 (d, 2H, J=2.2), 7.04-6.98 (m, 3H), 6.99 (d, 2H, J=2.2), 6.85-6.83 (m, 1H), 6.82 (dd, 2H, J=8.6, 2.2), 6.67 (dd, 1H, J=8.4, 1.8), 6.10 (br, 1H), 5.99 (d, 1H, J=1.8), 3.74 (s, 2H), 2.99 (m, 2H), 2.92 (m, 4H), 2.77 (t, 2H, J=4.8), 2.31 (s, 6H)
MASS (FAB) : 671 (M++1) Example 6: Synthesis of compound 28 Compound 13 (11.4 mg, 0.011 mmol) was suspended in 10 ml of acetonitrile, cesium carbonate (14.0 mg, 43 μM) was added, and then 2.2 ml of acetic anhydride was added little by little. After stirring at room temperature for 1 hour, the reaction solution was distilled off under reduced pressure. Purification by a silica gel column gave Compound 28 (5.8 mg). White solid. Yield 47%.
1 H-NMR (CDCl 3 , 300 MHz):
8.41-8.36 (m, 2H), 7.72 (d, 1H, J = 8.4), 7.47-7.41 (m, 1H), 7.39-7.33 (m, 1H), 7.06 (d, 2H, J = 2.2), 7.04 -6.98 (m, 3H), 6.99 (d, 2H, J = 2.2), 6.85-6.83 (m, 1H), 6.82 (dd, 2H, J = 8.6, 2.2), 6.67 (dd, 1H, J = 8.4 , 1.8), 6.10 (br, 1H), 5.99 (d, 1H, J = 1.8), 3.74 (s, 2H), 2.99 (m, 2H), 2.92 (m, 4H), 2.77 (t, 2H, J = 4.8), 2.31 (s, 6H)
MASS (FAB): 671 (M + +1)

例７
上記例１から４で得た化合物８，化合物１３、化合物１７、及び化合物２２を用いて、亜鉛イオンによる蛍光強度変化を調べた。各化合物1 μMの蛍光強度を100 mM HEPES緩衝液（pH 7.4）中で測定した。結果を図１に示す。縦軸の蛍光強度は亜鉛を加えたときの最大の蛍光強度変化量を1としたときの蛍光強度変化を数値で表したものである。これらの化合物はいずれもZnAF-2（国際公開WO 01/62755の化合物12）より低濃度領域で蛍光強度が変化することが示された。さらにこれら５種類の化合物を組み合わせることにより、10-10 Mから10-3 Mにわたる極めて広範囲な濃度領域で亜鉛イオンの濃度変化を捉えられることが示された。 Example 7
Using Compound 8, Compound 13, Compound 17, and Compound 22 obtained in Examples 1 to 4, changes in fluorescence intensity due to zinc ions were examined. The fluorescence intensity of 1 μM of each compound was measured in 100 mM HEPES buffer (pH 7.4). The results are shown in FIG. The fluorescence intensity on the vertical axis is a numerical value representing the change in fluorescence intensity when the maximum change in fluorescence intensity when zinc is added is set to 1. All of these compounds were shown to change in fluorescence intensity in a lower concentration region than ZnAF-2 (compound 12 of International Publication WO 01/62755). Furthermore, it was shown that by combining these five types of compounds, a change in zinc ion concentration can be captured in an extremely wide concentration range from 10 −10 M to 10 −3 M.

例８
化合物８，化合物１３、化合物１７、及び化合物２２を用いて、亜鉛イオンに対する選択性を評価した。種々の金属イオン（1 μM又は5 mM）を含む100 mM HEPES緩衝液（pH 7.5）中に1 μMの化合物を加え、化合物８、化合物１７、及び化合物２２については励起波長492 nm、蛍光波長514 nmとし、化合物１３については励起波長492 nm、蛍光波長521 nmとして蛍光強度を測定した。結果を図２に示す。図中、縦軸の蛍光強度は、金属イオンを加えていないときの蛍光強度を１として、各金属イオンを加えたときの蛍光強度を数値で示したものである。化合物８，化合物１３、化合物１７、及び化合物２２が亜鉛イオンに対して極めて高い選択性を有しており、生体内に存在するナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオンが高濃度（5 mM）に存在する条件下でも全く蛍光強度が増加しないことが明らかである。またこれらの金属イオンが亜鉛イオンによる蛍光強度の増大に影響を与えないことも明らかである。 Example 8
Using Compound 8, Compound 13, Compound 17, and Compound 22, the selectivity for zinc ions was evaluated. 1 μM of the compound was added to 100 mM HEPES buffer (pH 7.5) containing various metal ions (1 μM or 5 mM), and the excitation wavelength of 492 nm and the emission wavelength of 514 nm were obtained for Compounds 8, 17 and 22. The fluorescence intensity of Compound 13 was measured at an excitation wavelength of 492 nm and a fluorescence wavelength of 521 nm. FIG. 2 shows the results. In the figure, the fluorescence intensity on the vertical axis represents the fluorescence intensity when each metal ion is added, assuming that the fluorescence intensity when no metal ion is added is 1. Compound 8, compound 13, compound 17, and compound 22 have extremely high selectivity for zinc ions, and sodium ions, potassium ions, calcium ions, and magnesium ions existing in the living body are in high concentrations (5 mM). It is clear that the fluorescence intensity does not increase at all under the conditions present in (1). It is also clear that these metal ions do not affect the increase in fluorescence intensity due to zinc ions.

例９
pHの変化に対する化合物８，化合物１３、化合物１７、及び化合物２２とそれらの亜鉛錯体の蛍光強度の変化を調べた。化合物８、化合物１７、及び化合物２２については励起波長492 nm、蛍光波長514 nmとし、化合物１３については励起波長492 nm、蛍光波長521 nmとして蛍光強度を測定した。結果を図３に示す。緩衝液は以下のものを用いた。
100 mM Cl2CHCOOH- Cl2CHCOONa 緩衝液（pH 2.0-2.5）
100 mM ClCH2COOH- ClCH2COONa 緩衝液（pH 3.0-3.5）
100 mM AcOH-AcONa 緩衝液（pH 4.0-5.0）
100 mM MES緩衝液（pH 5.5-6.5）
100 mM HEPES緩衝液（pH 7.0-8.0）
100 mM CHES緩衝液（pH 8.0-9.0）
いずれの化合物も細胞内のpHである7.4付近では蛍光強度が安定であることがわかる。 Example 9
The change in the fluorescence intensity of Compound 8, Compound 13, Compound 17, and Compound 22 and their zinc complexes with respect to the change in pH was examined. The fluorescence intensity was measured for Compound 8, Compound 17, and Compound 22 at an excitation wavelength of 492 nm and a fluorescence wavelength of 514 nm, and for Compound 13, an excitation wavelength of 492 nm and a fluorescence wavelength of 521 nm. The results are shown in FIG. The following buffer was used.
100 mM Cl 2 CHCOOH- Cl 2 CHCOONa buffer (pH 2.0-2.5)
100 mM ClCH 2 COOH- ClCH 2 COONa buffer (pH 3.0-3.5)
100 mM AcOH-AcONa buffer (pH 4.0-5.0)
100 mM MES buffer (pH 5.5-6.5)
100 mM HEPES buffer (pH 7.0-8.0)
100 mM CHES buffer (pH 8.0-9.0)
It can be seen that the fluorescence intensity of all compounds is stable around the intracellular pH of 7.4.

例１０
化合物８，化合物１３、化合物１７、及び化合物２２と亜鉛イオンの錯形成速度定数を調べた。25℃の100 mM HEPES緩衝液（pH 7.4）中で化合物の最終濃度が1μM、亜鉛イオンが50μMとなるように混合した後の蛍光強度の時間変化をストップドフローで測定した。このグラフより錯形成速度定数を算出すると化合物８では1.6×106M-1s-1、化合物１３では1.4×106M-1s-1、化合物１７では7.8×104M-1s-1、化合物２２では1.3×106M-1s-1となった。いずれの化合物も蛍光が瞬時に増大した。従って、これらの化合物を用いると亜鉛イオンを極めて短時間に検出することができ、亜鉛イオンの速い濃度変化を検出することも可能であることがわかる。 Example 10
The complex formation rate constants of compound 8, compound 13, compound 17, and compound 22 with zinc ions were examined. Time-dependent changes in the fluorescence intensity after mixing in a 100 mM HEPES buffer (pH 7.4) at 25 ° C. so that the final concentration of the compound was 1 μM and zinc ion was 50 μM were measured by a stopped flow. When the complexation rate constant is calculated from this graph, 1.6 × 10 6 M −1 s −1 for compound 8, 1.4 × 10 6 M −1 s −1 for compound 13, and 7.8 × 10 4 M −1 s − for compound 17. 1 , for Compound 22, 1.3 × 10 6 M −1 s −1 . All compounds showed an instantaneous increase in fluorescence. Therefore, it can be seen that when these compounds are used, zinc ions can be detected in a very short time, and a rapid change in the concentration of zinc ions can be detected.

例１１
CHO 細胞を用いて様々な濃度の亜鉛イオンを細胞内に導入したときの蛍光強度の変化を調べた。 CHO細胞に10 μMのZnAF-2DA（6-[N-[N',N'-ビス(2-ピリジニルメチル)-2-アミノエチル]アミノ-3',6'-ビス(アセチルオキシ)-スピロ[イソベンゾフラン-1(3H),9'-[9H]キサンテン]-3-オン：亜鉛イオンに対するKd値：2.7 nM）または化合物２８を含むPBS(-)で10分間、室温でインキュベーションした。PBS(-)で3回洗った後、以下の表１に示すように試薬を加え蛍光強度の変化を測定した。

Figure 2004315501
Example 11
Using CHO cells, changes in fluorescence intensity when various concentrations of zinc ions were introduced into the cells were examined. 10 μM ZnAF-2DA (6- [N- [N ′, N′-bis (2-pyridinylmethyl) -2-aminoethyl] amino-3 ′, 6′-bis (acetyloxy) -spiro [ Isobenzofuran-1 (3H), 9 '-[9H] xanthen] -3-one: Kd value for zinc ion: 2.7 nM) or PBS (-) containing compound 28 for 10 minutes at room temperature. After washing three times with PBS (-), reagents were added as shown in Table 1 below, and the change in fluorescence intensity was measured.
Figure 2004315501

結果を図１に示す。その結果、ZnAF-2DAで染色した細胞では3 μM の亜鉛イオンを導入した時点で蛍光強度がプラトーに達した。それに対して化合物２８で染色した細胞の蛍光強度は、導入する亜鉛イオンの上昇とともに段階的に上昇した。つまりKd値の違いが、実際に細胞内の蛍光強度の違いとなって現れている。化合物２８はZnAF-2DAよりも、高濃度の亜鉛イオン濃度範囲で使用可能だとわかった。 The results are shown in FIG. As a result, in the cells stained with ZnAF-2DA, the fluorescence intensity reached a plateau when 3 μM of zinc ions were introduced. On the other hand, the fluorescence intensity of the cells stained with compound 28 gradually increased with the increase of the zinc ions to be introduced. That is, the difference in the Kd value actually appears as a difference in the fluorescence intensity in the cell. Compound 28 was found to be usable at a higher zinc ion concentration range than ZnAF-2DA.

亜鉛イオンの濃度変化に対する各被験化合物の蛍光強度変化を示した図である。FIG. 3 is a diagram showing a change in fluorescence intensity of each test compound with respect to a change in zinc ion concentration. 各種金属イオンの存在下における各被験化合物の蛍光強度変化を示した図である。FIG. 3 is a diagram showing changes in fluorescence intensity of each test compound in the presence of various metal ions. pHの変化に対する各被験化合物の蛍光強度変化を示した図である。FIG. 3 is a diagram showing a change in fluorescence intensity of each test compound with respect to a change in pH. 各被験化合物と亜鉛イオンとの間での亜鉛錯体形成速度を示した図である。FIG. 3 is a view showing a zinc complex formation rate between each test compound and zinc ions. CHO 細胞を用いて様々な濃度の亜鉛イオンを細胞内に導入したときの蛍光強度の変化を示した図である。FIG. 3 is a diagram showing changes in fluorescence intensity when various concentrations of zinc ions are introduced into cells using CHO cells.

Claims (10)

下記の一般式(IA)又は(IB)：
Figure 2004315501
 〔式中、R1及びR2はそれぞれ独立に水素原子又は下記の式(A)：
Figure 2004315501
 （式中、X1、X2、X3、及びX4はそれぞれ独立に水素原子、2-ピリジルメチル基、2-ピリジルエチル基、2-メチル-6-ピリジルメチル基、又は2-メチル-6-ピリジルエチル基を示すが、X1、X2、X3、及びX4からなる群から選ばれる基のうち少なくとも１つは2-ピリジルエチル基、2-メチル-6-ピリジルメチル基、及び2-メチル-6-ピリジルエチル基からなる群から選ばれる基を示し；m及びnはそれぞれ独立に0又は1を示すが、m及びnが同時に0となることはない）で表される基を示すが、R1及びR2が同時に水素原子であることはなく；R3及びR4はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子を示し；R5及びR6はそれぞれ独立に水素原子、アルキルカルボニル基、又はアルキルカルボニルオキシメチル基を示し、R7は水素原子又はアルキル基を示す〕で表される化合物又はその塩。 The following general formula (IA) or (IB):
Figure 2004315501
 Wherein R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom or the following formula (A):
Figure 2004315501
 (Wherein X 1 , X 2 , X 3 , and X 4 are each independently a hydrogen atom, a 2-pyridylmethyl group, a 2-pyridylethyl group, a 2-methyl-6-pyridylmethyl group, or a 2-methyl- Shows a 6-pyridylethyl group, X 1 , X 2 , X 3 , and at least one of the groups selected from the group consisting of X 4 is a 2-pyridylethyl group, a 2-methyl-6-pyridylmethyl group, And a group selected from the group consisting of 2-methyl-6-pyridylethyl group; m and n each independently represent 0 or 1, but m and n are not simultaneously 0) R 1 and R 2 are not a hydrogen atom at the same time; R 3 and R 4 are each independently a hydrogen atom or a halogen atom; R 5 and R 6 are each independently a hydrogen atom, an alkyl indicates a carbonyl group, or an alkylcarbonyloxymethyl group, represented by R 7 represents a hydrogen atom or an alkyl group] Compound or a salt thereof. 下記の一般式(IIA)又は(IIB)：
Figure 2004315501
 （式中、R11及びR12はそれぞれ独立に水素原子、アルキルカルボニル基、又はアルキルカルボニルオキシメチル基を示し；R13及びR14はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子を示し；R15及びR16はそれぞれ独立に水素原子又はメチル基を示し；R17は水素原子又はアルキル基を示し；p及びqはそれぞれ独立に１又は２を示し、rは０又は１を示すが、
rが１である場合には、R15及びR16が同時に水素原子であり、かつp及びqが同時に１であることはなく、
rが０である場合にはqは２である）で表される化合物又はその塩。 The following general formula (IIA) or (IIB):
Figure 2004315501
 (Wherein, R 11 and R 12 each independently represent a hydrogen atom, an alkylcarbonyl group, or an alkylcarbonyloxymethyl group; R 13 and R 14 each independently represent a hydrogen atom or a halogen atom; R 15 and R 15 16 independently represents a hydrogen atom or a methyl group; R 17 represents a hydrogen atom or an alkyl group; p and q each independently represent 1 or 2, r represents 0 or 1,
When r is 1, R 15 and R 16 are simultaneously hydrogen atoms, and p and q are not simultaneously 1;
and when r is 0, q is 2) or a salt thereof. R13及びR14が水素原子である請求項２に記載の化合物又はその塩。 3. The compound according to claim 2, wherein R 13 and R 14 are a hydrogen atom, or a salt thereof. R17が水素原子である請求項２又は３に記載の化合物又はその塩。 4. The compound according to claim 2, wherein R 17 is a hydrogen atom, or a salt thereof. 請求項１に記載の一般式(IA)又は(IB)で表される化合物又はその塩を含む亜鉛蛍光プローブ。 A zinc fluorescent probe comprising the compound represented by formula (IA) or (IB) according to claim 1 or a salt thereof. 請求項１に記載の一般式(IA)若しくは(IB)又はその塩と亜鉛イオンとから形成される亜鉛錯体。 A zinc complex formed from the formula (IA) or (IB) according to claim 1 or a salt thereof and zinc ions. 亜鉛イオンの測定方法であって、下記の工程：
(a)請求項１に記載の一般式(IA)若しくは(IB)で表される化合物又はその塩と亜鉛イオンとを反応させる工程、及び
(b)上記工程(a)で生成した亜鉛錯体の蛍光強度を測定する工程
を含む方法。 A method for measuring zinc ions, comprising:
(a) reacting the compound represented by the general formula (IA) or (IB) according to claim 1 or a salt thereof with zinc ions; and
(b) a method comprising the step of measuring the fluorescence intensity of the zinc complex generated in the step (a). 亜鉛イオンの測定方法であって、下記の一般式(IIIA)又は(IIIB)：
Figure 2004315501
 （式中、R21及びR22はそれぞれ独立に水素原子、アルキルカルボニル基、又はアルキルカルボニルオキシメチル基を示し；R23及びR24はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子を示し；R25及びR26はそれぞれ独立に水素原子又はメチル基を示し；R27は水素原子又はアルキル基を示し；s及びtはそれぞれ独立に１又は２を示し、uは０又は１を示す）において、下記の(1)から(14)：
(1)s及びtが１であり、uが１であり、R25及びR26が水素原子である化合物又はその塩
(2)s及びtが１であり、uが１であり、R25が水素原子であり、R26がメチル基である化合物又はその塩
(3)s及びtが１であり、uが１であり、R25及びR26がメチル基である化合物又はその塩
(4)sが１であり、tが２であり、uが１であり、R25及びR26が水素原子である化合物又はその塩
(5)sが１であり、tが２であり、uが１であり、R25が水素原子であり、R26がメチル基である化合物又はその塩
(6)sが１であり、tが２であり、uが１であり、R25がメチル基であり、R26が水素原子である化合物又はその塩
(7)sが１であり、tが２であり、uが１であり、R25及びR26がメチル基である化合物又はその塩
(8)s及びtが２であり、uが１であり、R25及びR26が水素原子である化合物又はその塩
(9)s及びtが２であり、uが１であり、R25が水素原子であり、R26がメチル基である化合物又はその塩
(10)s及びtが２であり、uが１であり、R25及びR26がメチル基である化合物又はその塩
(11)tが１であり、uが０であり、R26が水素原子である化合物又はその塩
(12)tが１であり、uが０であり、R26がメチル基である化合物又はその塩
(13)tが２であり、uが０であり、R26が水素原子である化合物又はその塩
(14)tが２であり、uが０であり、R26がメチル基である化合物又はその塩
からなる群から選択される２個以上の化合物又はその塩を用いて亜鉛イオンを測定する工程を含む方法。 A method for measuring zinc ion, comprising the following general formula (IIIA) or (IIIB):
Figure 2004315501
 (Wherein, R 21 and R 22 each independently represent a hydrogen atom, an alkylcarbonyl group, or an alkylcarbonyloxymethyl group; R 23 and R 24 each independently represent a hydrogen atom or a halogen atom; R 25 and R 22 26 independently represents a hydrogen atom or a methyl group; R 27 represents a hydrogen atom or an alkyl group; s and t each independently represent 1 or 2; u represents 0 or 1); 1) to (14):
(1) A compound or a salt thereof, wherein s and t are 1, u is 1, and R 25 and R 26 are hydrogen atoms.
(2) A compound or salt thereof, wherein s and t are 1, u is 1, R 25 is a hydrogen atom, and R 26 is a methyl group.
(3) A compound or a salt thereof, wherein s and t are 1, u is 1, and R 25 and R 26 are methyl groups.
(4) A compound or salt thereof in which s is 1, t is 2, u is 1, and R 25 and R 26 are hydrogen atoms.
(5) A compound or salt thereof in which s is 1, t is 2, u is 1, R 25 is a hydrogen atom, and R 26 is a methyl group.
(6) A compound or salt thereof in which s is 1, t is 2, u is 1, R 25 is a methyl group, and R 26 is a hydrogen atom.
(7) A compound or salt thereof wherein s is 1, t is 2, u is 1, and R 25 and R 26 are methyl groups.
(8) A compound or salt thereof wherein s and t are 2, u is 1 and R 25 and R 26 are hydrogen atoms.
(9) A compound or salt thereof wherein s and t are 2, u is 1, R 25 is a hydrogen atom, and R 26 is a methyl group.
(10) A compound or a salt thereof, wherein s and t are 2, u is 1, and R 25 and R 26 are methyl groups.
(11) A compound or salt thereof wherein t is 1, u is 0, and R 26 is a hydrogen atom
(12) A compound or salt thereof wherein t is 1, u is 0, and R 26 is a methyl group
(13) A compound or salt thereof wherein t is 2, u is 0, and R 26 is a hydrogen atom
(14) a step of measuring zinc ion using two or more compounds or salts thereof selected from the group consisting of compounds or salts thereof, wherein t is 2, u is 0, and R 26 is a methyl group; A method that includes R23、R24、及びR27が水素原子である請求項８に記載の方法。 The method of claim 8 R 23, R 24, and R 27 is a hydrogen atom. 請求項８に記載の(1)から(14)の化合物又はその塩からなる群から選ばれる２個以上の化合物又はその塩を含む亜鉛イオン測定用のキット。 A kit for measuring zinc ions, comprising two or more compounds selected from the group consisting of the compounds (1) to (14) or salts thereof according to claim 8, or a salt thereof.
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