JP2014126467A - 海生生物の付着防止方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本開示は、過酸化水素化合物を添加して海水冷却系への海生生物の付着を防止する方法であって、前記海水冷却系から採取したバイオフィルム中の細菌の検出を行うこと、及び前記検出された細菌の種類及び/又はその割合を指標とし、前記海水冷却系への過酸化水素化合物の添加量及び/又は添加頻度を制御することを含む海生生物の付着防止方法に関する。
【選択図】なし
Description
本開示は、一態様において、過酸化水素化合物を添加して海水冷却系への海生生物の付着を防止する方法であって、前記海水冷却系から採取したバイオフィルム中の細菌の検出を行うこと、及び前記検出された細菌の種類及び/又はその割合を指標とし、前記海水冷却系への過酸化水素化合物の添加量及び/又は添加頻度を制御することを含む海生生物の付着防止方法に関する(以下、「本開示の付着防止方法」ともいう)。
本開示は、その他の態様として、過酸化水素化合物を添加した海水冷却系における海生生物の付着防止効果を評価する方法であって、前記海水冷却系から採取したバイオフィルム中の細菌の検出を行うこと、及び硫黄酸化細菌又はその近縁種が検出された場合は、過酸化水素化合物によって前記海水冷却系における海生生物の付着が抑制されていると評価することを含む評価方法(以下、「本開示の評価方法」ともいう)に関する。細菌の検出及び評価は、本開示の付着防止方法と同様に行うことができる。
本開示は、さらにその他の態様として、本開示の評価方法を行うためのキットであって、本開示の評価方法における細菌を検出できるように設計されたプライマー及び試薬を含むキットに関する。
〔1〕 過酸化水素化合物を添加して海水冷却系への海生生物の付着を防止する方法であって、
前記海水冷却系から採取したバイオフィルム中の細菌の検出を行うこと、及び
前記検出された細菌の種類及び/又はその割合を指標とし、前記海水冷却系への過酸化水素化合物の添加量及び/又は添加頻度を制御すること、を含む、
海生生物の付着防止方法。
〔2〕 前記指標とする細菌は、硫黄酸化細菌又はその近縁種である、〔1〕記載の防止方法。
〔3〕 前記制御は、前記指標と前記海水冷却系への過酸化水素化合物の添加量及び/又は添加頻度とに基き、新たな添加量及び/又は添加頻度を決定することを含む、〔1〕又は〔2〕に記載の防止方法。
〔4〕 前記細菌の検出において硫黄酸化細菌又はその近縁種が検出されなかった場合には、過酸化水素化合物の添加量及び/又は添加頻度を増加させるように前記決定を行う、〔3〕記載の防止方法。
〔5〕 前記細菌の検出において検出された硫黄酸化細菌又はその近縁種が優占種である場合には、過酸化水素化合物の添加量及び/又は添加頻度を維持又は減少させるように前記決定を行う、〔3〕記載の防止方法。
〔6〕 前記制御は、前記決定された新たな添加量及び/又は添加頻度に基き、海水冷却系に過酸化水素化合物を添加することを含む、〔1〕から〔5〕のいずれかに記載の防止方法。
〔7〕 前記海生生物は、付着性海生生物である、〔1〕から〔6〕のいずれかに記載の防止方法。
〔8〕 前記海生生物は、フジツボ、ムラサキイガイ、カンザシゴカイ、イガイ、ミドリイガイ、ヒドロ虫、及びシマメノウフネガイからなる群から選択される少なくとも一つを含む、〔1〕から〔7〕のいずれかに記載の防止方法。
〔9〕 前記制御は、前記指標、ブルーム期の有無、ならびに前記海水冷却系への過酸化水素化合物の添加量及び/又は添加頻度に基き、新たな添加量及び/又は添加頻度を決定することを含む、〔1〕から〔8〕のいずれかに記載の防止方法。
〔10〕 前記硫黄酸化細菌又はその近縁種は、Thiotrichaceae Thiothrix disciformis、Thiotrichaceae Thiothrix sp、Tioalkalispiraceae Tioprofundum lithotrophica、及びTioalkalispiraceae Tioprofundum sp.からなる群から選択される、〔2〕から〔9〕のいずれかに記載の防止方法。
〔11〕 前記検出は、クローニング、PCR−DGGE法、PCR−TGGE法、T−RFLP法、及び次世代シークエンスからなる群から選択される方法を用いて行う、〔1〕から〔10〕のいずれかに記載の防止方法。
〔12〕 前記バイオフィルムは、前記海水冷却系又は前記海水冷却系から分岐させた分岐路から採取する、〔1〕から〔11〕のいずれかに記載の防止方法。
〔13〕 前記バイオフィルムは、前記海水冷却系又は分岐路に配置された確認板及びカラムに形成されるバイオフィルムである、〔11〕又は〔12〕に記載の防止方法。
〔14〕 前記確認板及びカラムは、樹脂、無機類、金属類、及びスレートからなる群から選択されるいずれかで形成される、〔13〕記載の防止方法。
〔15〕 前記海水冷却系は、熱交換器、復水器、及びボイラーからなる群から選択される少なくとも一つを含む、〔1〕から〔15〕のいずれかに記載の防止方法。
〔16〕 過酸化水素化合物を添加した海水冷却系における海生生物の付着防止効果を評価する方法であって、
前記海水冷却系から採取したバイオフィルム中の細菌の検出を行うこと、及び
硫黄酸化細菌又はその近縁種が検出された場合は、過酸化水素化合物によって前記海水冷却系における海生生物の付着が抑制されていると評価することを含む、評価方法。
[バイオフィルム形成]
太平洋に面する和歌山県沿岸で、水中ポンプを用い揚水した海水を2系統に分岐する水路試験装置を組み立て、試験を実施した。水路試験装置内にはバイオフィルム形成用のアクリル板が浸漬できる箇所を設けた。試験区は、過酸化水素無添加と過酸化水素添加(測定濃度:1.75mg/L)との2区を設けた。なお、過酸化水素としては35重量%過酸化水素水溶液を使用した。アクリル板の浸漬は、2011年3月16日に開始し、浸漬後3、4、5、6、8及び10週間でアクリル板を取り出し、バイオフィルムを採取した。
取り出したアクリル板から、歯ブラシを用いてバイオフィルムを擦りとり、滅菌人工海水に懸濁させることによってバイオフィルムをサンプリングした。得られた懸濁液は、解析を行うまで冷凍保存した。また、アクリル板の取り出しと同時に、海水を採取し、PCR-DGGEに供した。
PCR-DGGE及び菌種同定は、Microbes Environ. Vol. 24, No. 1, 43-51, 2009及びMicrobes Environ. Vol. 26, No. 2, 113-119, 2011に準拠して行った。すなわち、まず、凍結したバイオフィルム懸濁液1.5mlを、VD-31(製品番号、Taitec製)を用いて約12時間減圧下で凍結乾燥させた。乾燥バイオフィルム及び採取した海水について、Quick Gene(商品名:Quick Gene 8000、富士フィルム社製)を用いてDNAの抽出及び精製を行った。PCRは、プライマーセット25f-1401rと341fGC-907rによるNested-PCRを採用し、Go-Taq(Promega製)及びthermal cyclerを用いて行った。増幅条件は、95℃30秒、52℃30秒、72℃1分の30サイクルとした。DGGEは、BioRad 社製DCodeシステム(微生物群集解析 基本システム)を用いた。具体的には、勾配35-65%の変性剤(100%変性剤:7M尿素、40%[w/v]ホルムアミド)を含むアクリルアミドを用い、60℃、75Vで14時間泳動することによって行った。ゲルは、SYBR Gold (インビトロジェン社製色素)で30分染色した。DGGEゲルからDGGEバンドを切り出し、凍結融解によってDNAを回収した。回収したDNAを上記と同じ条件で増幅させ、DGGEゲルでの移動を確認した後、ゲルからバンドを切り出し、凍結融解によってDNAを回収した。回収したDNAを341f-907rでPCRを行い、単一のDNAを得た。907rからのサイクルシーケンス及びシーケンスは、外注した。シーケンス結果から、DDBJのBLASTによって菌種同定を行った。DGGEの結果の一例を図1A及びBに示す。図1Aにおいて、レーン1〜6が海水、レーン7〜10が過酸化水素無添加のバイオフィルム、レーン11〜16が過酸化水素添加(濃度:1.75mg/L)のバイオフィルムを示し、矢印で硫黄酸化細菌の近縁種のバンドを示す。図1Bに、図1Aにおけるレーン2、4、8、10、12及び14において菌種同定したバンドを示し、各バンドのシーケンス結果から得られた近縁種を下記表1〜3に示す。表1は海水のシーケンス結果から得られた近縁種、表2は過酸化水素無添加の試験区から採取したバイオフィルムのシーケンス結果、表3は過酸化水素添加の試験区から採取したバイオフィルムのシーケンス結果である。
東京湾に面した製鐵所及び瀬戸内海に面した化学工場において、海水放流ピット内に塩ビ板を浸漬してバイオフィルムを形成させた。なお、同製鐵所及び化学工場では、過酸化水素を添加して熱交換器の生物付着防止を行い、海水放流ピットにおける過酸化水素濃度はともに0.6mg/Lであった。塩ビ板の浸漬は2011年12月21日に開始し、浸漬後4週間でバイオフィルムを採取した。また、同時期に、実施例1で使用した水路試験装置を用いて試験を行い、3系統に分岐し、試験区は、過酸化水素無添加及び過酸化水素添加(濃度:0.6mg/L、1.75mg/L)の3区を設けた。バイオフィルムのサンプリング及びPCR-DGGE・菌種同定は実施例1と同様に行った。DGGEの結果の一例を図2A及びBに示す。図2Aにおいて、レーンA〜Cが海水、レーンD〜Iが採取したバイオフィルムを示し、矢印で硫黄酸化細菌の近縁種のバンドを示す。図2Bに、菌種同定したバンドを示し、各バンドのシーケンス結果から得られた近縁種を下記表4〜7に示す。表4は海水(A:東京湾、B:瀬戸内海、C:和歌山)のシーケンス結果から得られた近縁種、表5は東京湾に面した製鐵所から採取したバイオフィルムのシーケンス結果、表6は瀬戸内海に面した化学工場から採取したバイオフィルムのシーケンス結果、表7は水路試験装置から採取したバイオフィルムのシーケンス結果である。
実施例1で使用した水路試験装置を用いて試験を行った。3系統に分岐し、試験区は、過酸化水素無添加及び過酸化水素添加(濃度:0.6mg/L、1.75mg/L)の3区を設けた。アクリル板の浸漬は2012年5月14日及び2012年6月13日に開始し、浸漬開始後1又は2週間でバイオフィルムを採取した。バイオフィルムのサンプリング及びPCR-DGGE・菌種同定は実施例1と同様に行った。DGGEの結果の一例を図3A及びBに示す。図3Aにおいて、レーンA〜Bが海水、レーンC〜Kが採取したバイオフィルムを示し、矢印で硫黄酸化細菌の近縁種のバンドを示す。図3Bに、菌種同定したバンドを示し、各バンドのシーケンス結果から得られた近縁種を下記表8〜10に示す。表8は海水のシーケンス結果から得られた近縁種、表9は2012年5月22日又は30日に採取したバイオフィルムのシーケンス結果、表10は浸漬を2012年6月26日に採取したバイオフィルムのシーケンス結果である。
実施例1で使用した水路試験装置を用いて試験を行った。5系統に分岐し、試験区は、過酸化水素無添加及び過酸化水素添加(濃度:0.07mg/L、0.175mg/L、0.35mg/L、0.525mg/L)の5区を設けた。アクリル板の浸漬は2012年5月14日及び2012年2月2日に開始し、浸漬開始後2週間でバイオフィルムを採取した。バイオフィルムのサンプリング及びPCR-DGGE・菌種同定は実施例1と同様に行った。DGGEの結果の一例を図4に示す。図4において、レーンAが海水、レーンB〜Fが採取したバイオフィルムを示し、矢印で硫黄酸化細菌の近縁種のバンドを示す。
Claims (4)
- 過酸化水素化合物を添加して海水冷却系への海生生物の付着を防止する方法であって、
前記海水冷却系から採取したバイオフィルム中の細菌の検出を行うこと、及び
前記検出された細菌の種類及び/又はその割合を指標とし、前記海水冷却系への過酸化水素化合物の添加量及び/又は添加頻度を制御すること、を含む、
海生生物の付着防止方法。 - 前記指標とする細菌は、硫黄酸化細菌又はその近縁種である、請求項1記載の防止方法。
- 前記制御は、前記指標と前記海水冷却系への過酸化水素化合物の添加量及び/又は添加頻度とに基き、新たな添加量及び/又は添加頻度を決定することを含む、請求項1又は2に記載の防止方法。
- 過酸化水素化合物を添加した海水冷却系における海生生物の付着防止効果を評価する方法であって、
前記海水冷却系から採取したバイオフィルム中の細菌の検出を行うこと、及び
硫黄酸化細菌又はその近縁種が検出された場合は、過酸化水素化合物によって前記海水冷却系における海生生物の付着が抑制されていると評価することを含む、評価方法。
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