JP2014115271A

JP2014115271A - アミロイドの検出方法及びアミロイド結合性化合物固定化半導体センシングデバイス

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Publication number: JP2014115271A
Application number: JP2013175464A
Authority: JP
Inventors: Tetsuya Aisaka; 哲彌逢坂; Sho Hideshima; 翔秀島; Ayumi Koike; あゆみ小池; Toru Asahi; 透朝日; Naoya Sawamura; 直哉澤村; Shigeki Kuroiwa; 繁樹黒岩
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Current assignee: Individual
Priority date: 2012-11-15
Filing date: 2013-08-27
Publication date: 2014-06-26
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Abstract

【課題】アミロイドを生理的条件下で簡便かつ高感度に検出するための方法、及びそのような検出を可能にするアミロイド結合性化合物固定化半導体センシングデバイスを提供する。
【解決手段】アミロイド結合性化合物固定化半導体センシングデバイス上に固定化されたアミロイド結合性化合物とアミロイドとを相互作用させる工程と、該相互作用によるゲート電極上の表面電位変化を検出する工程とを含むことを特徴とするアミロイドの検出方法。
【選択図】図９

Description

本発明は、アミロイドの検出方法及びアミロイド結合性化合物固定化半導体センシングデバイスに関する。

アミロイドは、ある特定の構造を有する不溶性の線維状のタンパク質の凝集体である。アミロイドは、アミロイドーシスや、アルツハイマー病、パーキンソン病等の神経変性疾患の患者の組織や器官に蓄積していることが知られており、これらの原因又はこれらに関係があると言われている。これらの疾患は治療が困難であり、そのため、これらの診断、早期発見が非常に重要である。

これまで、アミロイドの検出には色素や蛍光物質を用いた組織染色法が広く用いられてきた。また、偏光分析法、円二色性分光法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等の方法もアミロイドの検出に用いられてきた。しかし、これらの方法は、試料の調製や測定に時間、費用、技術を要する等の問題があった。

電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）は、生体分子の検出に非常に有望なツールである。ＦＥＴを用いると、生体分子の吸着に伴うゲート表面の電荷密度変化を電気信号として直接検出するため、ラベルフリー検出が可能であり、低コストで迅速な生体分子の検出が可能である。それゆえ、ＦＥＴを用いた生体分子の検出に関する研究が広く行われている。

ＦＥＴバイオセンサーの臨床応用に関して、生体分子の検出は、生物活性が高く、リアルタイムで計測可能であるという観点から、生理的条件下にて行われることが理想的である。

しかし、生理的条件下においては溶液中のカウンターイオンによる高い遮蔽効果によって生体分子が有する電荷が遮蔽されるため、生理的条件下におけるＦＥＴによるタンパク質の検出は非常に困難であるという問題があった。また、従来のタンパク質を検出するためのバイオセンサーは、抗体等のタンパク質をプローブとして使用するため、その変性に伴って感度が低下するという問題があった。また、抗体等のタンパク質は分子サイズが大きいので、固定化密度にも限界があった。

ＦＥＴによるタンパク質検出は、デバイ長内に存在するタンパク質由来の電荷を検出することで可能となるため、デバイ長の外の領域に存在する電荷は原理上検出が困難である。生理的条件下においては、デバイ長は１ｎｍ以下であり、検出可能範囲が狭い。抗体等のタンパク質は分子サイズが大きく、抗原との結合部位が界面から離れてしまうため、生理的条件下における検出を原理的に困難にしていた。

このような問題を解決するため、小さなレセプター分子として、Ｆａｂフラグメントのような抗体フラグメントを固定化する方法が提案されている。しかし、このような方法では、手順が煩雑になったり、大量の試薬を必要としたりする等の問題があった。

特開２００４−４００７号公報

J. Biol. Chem. vol. 276, pp. 35227-35230, 2001

本発明は、上記事情に鑑みなされたもので、アミロイドを生理的条件下で簡便かつ高感度に検出するための方法、及び上記方法において用いられるアミロイド結合性化合物固定化半導体センシングデバイスを提供することを目的とする。

本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究を行った結果、プローブとしてタンパク質に比べて分子サイズの小さなアミロイド結合性化合物を用いた、アミロイド結合性化合物／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部として備えるアミロイド結合性化合物固定化半導体センシングデバイスにより、生理的条件下においてアミロイドの検出が簡便かつ高感度に可能であることを見出し、本発明をなすに至った。

したがって、本発明は、下記アミロイドの検出方法及びアミロイド結合性化合物固定化半導体センシングデバイスを提供する。
請求項１：
アミロイド結合性化合物固定化半導体センシングデバイス上に固定化されたアミロイド結合性化合物とアミロイドとを相互作用させる工程と、
該相互作用によるゲート電極上の表面電位変化を検出する工程と
を含むことを特徴とするアミロイドの検出方法。
請求項２：
上記アミロイド結合性化合物固定化半導体センシングデバイスが、半導体上に反応ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む第１の絶縁層が形成された電界効果トランジスタの上記第１の絶縁層の上に、反応性官能基を有するアルコキシシランの単分子膜からなる第１の有機単分子膜を形成し、該第１の有機単分子膜にアミロイド結合性化合物を上記反応性官能基を介して直接又は架橋分子を用いて結合させてなる、アミロイド結合性化合物／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部として備えるものである請求項１記載のアミロイドの検出方法。
請求項３：
上記アミロイド結合性化合物が、コンゴーレッドである請求項１又は２記載のアミロイドの検出方法。
請求項４：
半導体上に反応ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む第１の絶縁層が形成された電界効果トランジスタの上記第１の絶縁層の上に、反応性官能基を有するアルコキシシランの単分子膜からなる第１の有機単分子膜を形成し、該第１の有機単分子膜にアミロイド結合性化合物を上記反応性官能基を介して直接又は架橋分子を用いて結合させてなる、アミロイド結合性化合物／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部として備えることを特徴とするアミロイド結合性化合物固定化半導体センシングデバイス。
請求項５：
上記反応性官能基を有するアルコキシシランが、下記式（１）で表される請求項４記載のアミロイド結合性化合物固定化半導体センシングデバイス。
（式中、Ｒは、アミノ基、アミノオキシ基、カルボキシル基又はチオール基である。Ｒ¹は、炭素数３〜２２の直鎖状のアルキレン基である。Ｒ²〜Ｒ⁴は、それぞれ独立に炭素数１〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基又は炭素数２〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルコキシアルキル基である。）
請求項６：
上記アミロイド結合性化合物が、コンゴーレッドである請求項４又は５記載のアミロイド結合性化合物固定化半導体センシングデバイス。

本発明によれば、タンパク質に比べて分子サイズが小さい化合物を有機単分子膜に固定化するため、高い固定化密度で固定化することが可能である。また、そのような化合物は分子構造が単純で化学的に安定であるため、変性がなく感度の維持が可能である。また、標的となる物質との結合部位が有機単分子膜界面から近くなるため、生理的条件下における検出が可能となる。

本発明のアミロイド結合性化合物固定化半導体センシングデバイスを示す断面図であり、（Ａ）は電界効果トランジスタ、（Ｂ）は電界効果トランジスタのゲート電極の絶縁層上に有機単分子膜を形成した状態、（Ｃ）は有機単分子膜にアミロイド結合性化合物が固定化された状態を示す。オンチップデバイスのユニット構成例を示し、（Ａ）は部分平面図、（Ｂ）はその拡大断面図である。本発明のアミロイド結合性化合物固定化半導体センシングデバイスを用いたアミロイド結合性化合物−アミロイド相互作用によるアミロイド検出の概念図である。実施例２及び比較例１で測定したゲート電圧シフト値を示すグラフである。Ｓｕｐ３５添加前のデバイス表面並びにＳｕｐ３５モノマー、オリゴマー、ファイバー及びプラーク添加後のデバイス表面のＡＦＭ画像である。実施例３で測定したゲート電圧シフト値を示すグラフである。ヒトアミロイドβ（１−４２）試料添加前のデバイス表面及び試料添加後のデバイス表面のＡＦＭ画像である。ヒトアミロイドβ（１−４０）試料添加後のデバイス表面のＡＦＭ画像である。実施例４及び比較例２で測定したゲート電圧シフト値を示すグラフである。

本発明のアミロイドの検出方法は、アミロイド結合性化合物固定化半導体センシングデバイス上に固定化されたアミロイド結合性化合物とアミロイドとを相互作用させる工程と、該相互作用によるゲート電極上の表面電位変化を検出する工程とを含む。

本発明において検出の対象となるアミロイドは、デバイスに固定化するアミロイド結合性化合物と相互作用をするものであれば、特に限定されず、また、アミロイドを形成するタンパク質の種類によっても限定されない。アミロイドを形成するタンパク質としては、例えば、アミロイドβ、プリオン、免疫グロブリン軽鎖、血清アミロイドＡ、α−シヌクレイン、β２−ミクログロブリン、酵母由来のＳｕｐ３５等が挙げられる。

図３に、本発明のアミロイド結合性化合物固定化半導体センシングデバイスを用いたアミロイドの検出方法の概念を示す。この検出方法では、有機単分子膜上に固定化されたアミロイド結合性化合物とアミロイドとを相互作用させ、この相互作用により生じる絶縁層の表面電位変化を電気信号として検出する。なお、図３中、１２はアミロイドである。他の構成についての詳細は後述する。

ここで、タンパク質にはその表面に電荷が存在するため、デバイス上に固定化されたアミロイド結合性化合物とアミロイドとが相互作用した場合、ゲート電極上の表面電位がシフトする。この場合、電流一定下においては電位シフトを、電圧一定下においては電流のシフトをシグナルとして検出することができる。なお、ｎ型の電界効果トランジスタを用いた場合とｐ型の電界効果トランジスタを用いた場合とでは、閾値電圧のシフトは互いに逆になる。

デバイス上に固定化されたアミロイド結合性化合物とアミロイドとを相互作用させるには、アミロイドを含む溶液を、必要に応じて希釈して、ゲート電極上に載せればよい。このとき、上記溶液としては、タンパク質の検出に用いられている一般的な溶液を用いることができるが、特に生理的条件を満たすものが好ましい。例えば、リン酸緩衝液、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ＭＥＳ緩衝生理食塩水、ＭＯＰＳ緩衝生理食塩水、ＰＩＰＥＳ緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水等が好ましく使用できる。上記溶液のｐＨは、５〜１０が好ましく、６〜８がより好ましく、６．５〜７．５が更に好ましい。ｐＨを調整するため、上記溶液に酸や塩基を添加してもよい。

また、上記溶液に、Ｃａ²⁺、Ｍｇ²⁺、ＮＨ⁴⁺等のイオン、グアニジン、尿素等の変性剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）等のキレート剤、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０等の界面活性剤等を加えてもよい。上記イオンを加える場合、その濃度は、０．１〜１０ｍＭが好ましく、０．５〜５ｍＭがより好ましい。上記キレート剤を加える場合、その濃度は、０．１〜１０ｍＭが好ましく、０．５〜５ｍＭがより好ましい。界面活性剤を加える場合、その濃度は、０．００１〜１０体積％が好ましく、０．０５〜５体積％がより好ましい。

デバイス上に固定化されたアミロイド結合性化合物とアミロイドとを相互作用させるときの温度は、０〜５０℃が好ましく、２０〜４５℃がより好ましく、室温（２０〜２５℃）〜体温（３５〜３７℃）が更に好ましい。反応時間は、３０秒間〜１時間が好ましく、１〜３０分間がより好ましく、５〜１５分間が更に好ましい。

また、デバイス上に固定化されたアミロイド結合性化合物とアミロイドとを相互作用させる工程と、該相互作用によるゲート電極上の表面電位変化を検出する工程との間に、洗浄工程を設けてもよい。上記洗浄工程において使用する洗浄液は、上述したデバイス上に固定化されたアミロイド結合性化合物とアミロイドとを相互作用させるときに用いる生理的条件を満たす溶液が好ましい。また、上記洗浄液には、更に上述したイオン、キレート剤、界面活性剤等を加えてもよい。この場合、上述した濃度になるように添加することが好ましい。

本発明のアミロイドの検出方法は、タンパク質モノマーよりも、モノマーが凝集したオリゴマー、更にモノマーが凝集した線維状アミロイド、線維状アミロイドが凝集したプラーク状アミロイドの検出に有効である。凝集体を構成するアミロイドのモノマー数は、２以上であり、３以上が好ましく、４以上が更に好ましい。モノマー数の上限は特に限定されない。

検出可能なアミロイドの濃度は、タンパク質モノマー換算濃度で１ｆＭ〜１００ｍＭが好ましく、１０ｆＭ〜１ｍＭがより好ましく、１００ｆＭ〜１０μＭが更に好ましい。なお、ここでタンパク質モノマー換算濃度とは、溶液中のアミロイドを形成する全モノマーが、全てモノマーとして存在しているとした場合の溶液の濃度である。

本発明のアミロイド結合性化合物固定化半導体センシングデバイスは、半導体上に反応ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む第１の絶縁層が形成された電界効果トランジスタの上記第１の絶縁層の上に、反応性官能基を有するアルコキシシランの単分子膜からなる第１の有機単分子膜を形成し、該第１の有機単分子膜にアミロイド結合性化合物を上記反応性官能基を介して直接又は架橋分子を用いて結合させてなる、アミロイド結合性化合物／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部として備えるものである。

上記検出部のうち、絶縁層／半導体構造部分は、半導体上に反応ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む絶縁層が形成された電界効果トランジスタを利用することができ、その構成は、従来公知のものを利用することができる。上記絶縁層は、シリコン酸化物であることが好ましい。電界効果トランジスタは、ｎ型でもｐ型でもよい。この電界効果トランジスタとしては、例えば、図１（Ａ）に示されるようなものが例示される。なお、図１中、１はシリコン基板、２はシリコン酸化物又は無機酸化物（ガラス、アルミナ等）を含む絶縁層、４はゲート電極、５はソース電極、６はドレイン電極、７はドープ領域を示す。

そして、図１（Ｂ）に示されるように、絶縁層２上に第１の有機単分子膜３が形成される。ここで、本発明においては、基本原理として、絶縁層表面上のアミロイド結合性化合物とアミロイドの結合反応に伴う表面電位変化を電気信号として検出する構成とする。なお、上記絶縁層の厚さは、１０〜１００ｎｍ、特に１０〜５０ｎｍが好ましい。

上記第１の有機単分子膜は、反応性官能基を有するアルコキシシランの単分子膜からなる。上記反応性官能基を有するアルコキシシランは、下記式（１）で表されるものであることが好ましい。
（式中、Ｒは、アミノ基、アミノオキシ基、カルボキシル基又はチオール基である。Ｒ¹は、炭素数３〜２２の直鎖状のアルキレン基である。Ｒ²〜Ｒ⁴は、それぞれ独立に炭素数１〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基又は炭素数２〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルコキシアルキル基である。）

上記Ｒとしては、アミノ基又はカルボキシル基が好ましく、アミノ基がより好ましい。

上記Ｒ¹で示される直鎖状のアルキレン基は、炭素数が３〜２２であり、炭素数が３〜１８であることが好ましく、炭素数が３〜８であることがより好ましい。炭素鎖が短い方が、有機単分子膜の有する疎水性が弱くなり、ターゲットタンパク質の疎水性相互作用に起因する非特異的吸着を抑制することができるため好ましい。

上記Ｒ¹の具体例としては、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、ヘプタメチレン基、オクタメチレン基、ノナメチレン基、デカメチレン基、ウンデカメチレン基、ドデカメチレン基、トリデカメチレン基、テトラデカメチレン基、ペンタデカメチレン基、ヘキサデカメチレン基、ヘプタデカメチレン基、オクタデカメチレン基、ノナデカメチレン基、エイコサメチレン基、ヘンエイコサメチレン基、ドコサメチレン基が挙げられる。これらのうち、炭素数３〜１８のものが好ましく、炭素数３〜８のものがより好ましい。

また、上記Ｒ²〜Ｒ⁴は、それぞれ独立に炭素数１〜５、好ましくは１〜２の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基又は炭素数２〜５、好ましくは炭素数２〜３の直鎖状若しくは分岐状のアルコキシアルキル基である。上記Ｒ²〜Ｒ⁴の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、メトキシメチル基、エトキシメチル基、２−メトキシエチル基、２−エトキシエチル基等が挙げられる。これらのうち、特にメチル基、エチル基、２−メトキシエチル基等が好ましい。

上記Ｒがアミノ基、カルボキシル基又はチオール基であるアルコキシシランとしては、市販品を使用し得る。また、上記Ｒがアミノオキシ基であるアルコキシシランは、下記スキームにしたがって合成できる。
（式中、Ｒ¹〜Ｒ⁴は、上記と同じ。Ｒ⁵は、Ｒ¹から炭素数が２減少した直鎖状のアルキレン基である。）

上記Ｒがアミノオキシ基であるアルコキシシランは、トリアルコキシヒドロシランとＯ−アルケニルヒドロキシルアミンとを白金系触媒で処理することによって調製することができる。例えば、窒素雰囲気下、トリアルコキシヒドロシランとＯ−アルケニルヒドロキシルアミンとの混合物に、ヘキサクロロ白金(ＩＶ)酸等の白金系触媒を加え、１０〜２００℃で１〜１，２００時間、より好ましくは６０〜１２０℃で１２〜４８時間反応させることにより調製できる。成膜操作には、過剰のトリアルコキシヒドロシランを例えば蒸留等の操作により除去したものを使用することが好ましい。

第１の有機単分子膜は、上記アルコキシシランを気相化学反応又は液相反応によって絶縁層上に形成し、その最適化、例えば、有機分子の自己集積化機能によって単分子が最密パッキングされた膜が形成される。気相化学反応によって単分子膜を成膜する場合は、例えば、容器に基板及びアルコキシシランを封入し、ドライルーム中で好ましくは８０〜２００℃で１〜２４時間、より好ましくは１００〜１３０℃で２〜５時間反応させることで成膜できる。液相反応によって単分子膜を成膜する場合は、例えば、アルコキシシランを含む有機溶媒中に基板を浸漬し、好ましくは２０〜８０℃で１分間〜２４時間、より好ましくは５５〜６５℃で１５〜２０分間静置することで成膜できる。

上記有機溶媒としては、トルエン、メタノール、エタノール等が挙げられ、特にトルエン、メタノール等が好ましい。

上記電界効果トランジスタの半導体上には、更に、参照ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む第２の絶縁層を形成することができる。この第２の絶縁層の上には、第２の有機単分子膜として、アミロイド結合性化合物及びアミロイドのいずれとも反応しない有機分子で構成された単分子膜を形成し、この単分子膜／絶縁層／半導体構造を参照部とすることができる。なお、反応ゲート絶縁部と参照ゲート絶縁部とを、電位変化測定において互いに影響を与えない程度に離間させれば、反応ゲート絶縁部の第１の絶縁層と参照ゲート絶縁部の第２の絶縁層とを同一層内に設けることもできる。

図２は有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部９及び参照部８に適用したオンチップデバイスのユニット構成例を示す。なお、図２中、１はシリコン基板、２は絶縁層、１０はテンプレート部である。このデバイスのユニット構成は図示した構成に限定されず、検出部と参照部とは必ずしも１対１の関係で配置する必要はなく、必要に応じて検出部及び参照部の数及び組合せを適宜変更して配置することができる。また、検出部及び参照部は各々数〜数十μｍのサイズで形成可能である。

上記第２の有機単分子膜としては、フッ素化されていてもよい炭素数８〜２２の直鎖状アルキル基を有するアルコキシシランの単分子膜が好ましい。なお、有機単分子膜としてアルコキシシランの単分子膜を用いる場合、上記第２の絶縁層はシリコン酸化物で形成されたものが好ましい。

第２の有機単分子膜は、絶縁層上に均一な膜を形成させるため、自己集積化膜であることが望ましい。具体的には、下記式（２）
（式中、Ｒ⁶は炭素数８〜２２、好ましくは炭素数１０〜１８の直鎖状アルキル基であり、水素原子の一部又は全部がフッ素原子で置換されていてもよい。Ｒ⁷〜Ｒ⁹は、それぞれ独立に炭素数１〜５、好ましくは炭素数１〜２の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基又は炭素数２〜５、好ましくは炭素数２〜３の直鎖状若しくは分岐状のアルコキシアルキル基である。）
で表されるトリアルコキシシランの単分子膜であることが好ましい。

上記Ｒ⁶として具体的には、ｎ−オクチル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基、ｎ−ウンデシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−トリデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ペンタデシル基、ｎ−ヘキサデシル基、ｎ−ヘプタデシル基、ｎ−オクタデシル基、ｎ−ノナデシル基、ｎ−エイコシル基、ｎ−ヘンエイコシル基、ｎ−ドコシル基が挙げられる。

上記Ｒ⁷〜Ｒ⁹として具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、メトキシメチル基、エトキシメチル基、２−メトキシエチル基、２−エトキシエチル基等が挙げられる。

上記トリアルコキシシランとして具体的には、
ＣＨ₃(ＣＨ₂)₇Ｓｉ(ＯＣＨ₃)₃、ＣＨ₃(ＣＨ₂)₇Ｓｉ(ＯＣ₂Ｈ₅)₃、
ＣＨ₃(ＣＨ₂)₈Ｓｉ(ＯＣＨ₃)₃、ＣＨ₃(ＣＨ₂)₈Ｓｉ(ＯＣ₂Ｈ₅)₃、
ＣＨ₃(ＣＨ₂)₉Ｓｉ(ＯＣＨ₃)₃、ＣＨ₃(ＣＨ₂)₉Ｓｉ(ＯＣ₂Ｈ₅)₃、
ＣＨ₃(ＣＨ₂)₁₀Ｓｉ(ＯＣＨ₃)₃、ＣＨ₃(ＣＨ₂)₁₀Ｓｉ(ＯＣ₂Ｈ₅)₃、
ＣＨ₃(ＣＨ₂)₁₁Ｓｉ(ＯＣＨ₃)₃、ＣＨ₃(ＣＨ₂)₁₁Ｓｉ(ＯＣ₂Ｈ₅)₃、
ＣＨ₃(ＣＨ₂)₁₂Ｓｉ(ＯＣＨ₃)₃、ＣＨ₃(ＣＨ₂)₁₂Ｓｉ(ＯＣ₂Ｈ₅)₃、
ＣＨ₃(ＣＨ₂)₁₃Ｓｉ(ＯＣＨ₃)₃、ＣＨ₃(ＣＨ₂)₁₃Ｓｉ(ＯＣ₂Ｈ₅)₃、
ＣＨ₃(ＣＨ₂)₁₄Ｓｉ(ＯＣＨ₃)₃、ＣＨ₃(ＣＨ₂)₁₄Ｓｉ(ＯＣ₂Ｈ₅)₃、
ＣＨ₃(ＣＨ₂)₁₅Ｓｉ(ＯＣＨ₃)₃、ＣＨ₃(ＣＨ₂)₁₅Ｓｉ(ＯＣ₂Ｈ₅)₃、
ＣＨ₃(ＣＨ₂)₁₆Ｓｉ(ＯＣＨ₃)₃、ＣＨ₃(ＣＨ₂)₁₆Ｓｉ(ＯＣ₂Ｈ₅)₃、
ＣＨ₃(ＣＨ₂)₁₇Ｓｉ(ＯＣＨ₃)₃、ＣＨ₃(ＣＨ₂)₁₇Ｓｉ(ＯＣ₂Ｈ₅)₃、
ＣＨ₃(ＣＨ₂)₁₈Ｓｉ(ＯＣＨ₃)₃、ＣＨ₃(ＣＨ₂)₁₈Ｓｉ(ＯＣ₂Ｈ₅)₃、
ＣＨ₃(ＣＨ₂)₁₉Ｓｉ(ＯＣＨ₃)₃、ＣＨ₃(ＣＨ₂)₁₉Ｓｉ(ＯＣ₂Ｈ₅)₃、
ＣＨ₃(ＣＨ₂)₂₀Ｓｉ(ＯＣＨ₃)₃、ＣＨ₃(ＣＨ₂)₂₀Ｓｉ(ＯＣ₂Ｈ₅)₃、
ＣＨ₃(ＣＨ₂)₂₁Ｓｉ(ＯＣＨ₃)₃、ＣＨ₃(ＣＨ₂)₂₁Ｓｉ(ＯＣ₂Ｈ₅)₃、
ＣＦ₃(ＣＦ₂)₅(ＣＨ₂)₂Ｓｉ(ＯＣＨ₃)₃、ＣＦ₃(ＣＦ₂)₅(ＣＨ₂)₂Ｓｉ(ＯＣ₂Ｈ₅)₃、
ＣＦ₃(ＣＦ₂)₆(ＣＨ₂)₂Ｓｉ(ＯＣＨ₃)₃、ＣＦ₃(ＣＦ₂)₆(ＣＨ₂)₂Ｓｉ(ＯＣ₂Ｈ₅)₃、
ＣＦ₃(ＣＦ₂)₇(ＣＨ₂)₂Ｓｉ(ＯＣＨ₃)₃、ＣＦ₃(ＣＦ₂)₇(ＣＨ₂)₂Ｓｉ(ＯＣ₂Ｈ₅)₃、
ＣＦ₃(ＣＦ₂)₈(ＣＨ₂)₂Ｓｉ(ＯＣＨ₃)₃、ＣＦ₃(ＣＦ₂)₈(ＣＨ₂)₂Ｓｉ(ＯＣ₂Ｈ₅)₃、
ＣＦ₃(ＣＦ₂)₉(ＣＨ₂)₂Ｓｉ(ＯＣＨ₃)₃、ＣＦ₃(ＣＦ₂)₉(ＣＨ₂)₂Ｓｉ(ＯＣ₂Ｈ₅)₃、
ＣＦ₃(ＣＦ₂)₁₀(ＣＨ₂)₂Ｓｉ(ＯＣＨ₃)₃、ＣＦ₃(ＣＦ₂)₁₀(ＣＨ₂)₂Ｓｉ(ＯＣ₂Ｈ₅)₃、
ＣＦ₃(ＣＦ₂)₁₁(ＣＨ₂)₂Ｓｉ(ＯＣＨ₃)₃、ＣＦ₃(ＣＦ₂)₁₁(ＣＨ₂)₂Ｓｉ(ＯＣ₂Ｈ₅)₃、
ＣＦ₃(ＣＦ₂)₁₂(ＣＨ₂)₂Ｓｉ(ＯＣＨ₃)₃、ＣＦ₃(ＣＦ₂)₁₂(ＣＨ₂)₂Ｓｉ(ＯＣ₂Ｈ₅)₃、
ＣＦ₃(ＣＦ₂)₁₃(ＣＨ₂)₂Ｓｉ(ＯＣＨ₃)₃、ＣＦ₃(ＣＦ₂)₁₃(ＣＨ₂)₂Ｓｉ(ＯＣ₂Ｈ₅)₃、
ＣＦ₃(ＣＦ₂)₁₄(ＣＨ₂)₂Ｓｉ(ＯＣＨ₃)₃、ＣＦ₃(ＣＦ₂)₁₄(ＣＨ₂)₂Ｓｉ(ＯＣ₂Ｈ₅)₃、
ＣＦ₃(ＣＦ₂)₁₅(ＣＨ₂)₂Ｓｉ(ＯＣＨ₃)₃、ＣＦ₃(ＣＦ₂)₁₅(ＣＨ₂)₂Ｓｉ(ＯＣ₂Ｈ₅)₃、
ＣＦ₃(ＣＦ₂)₁₆(ＣＨ₂)₂Ｓｉ(ＯＣＨ₃)₃、ＣＦ₃(ＣＦ₂)₁₆(ＣＨ₂)₂Ｓｉ(ＯＣ₂Ｈ₅)₃、
ＣＦ₃(ＣＦ₂)₁₇(ＣＨ₂)₂Ｓｉ(ＯＣＨ₃)₃、ＣＦ₃(ＣＦ₂)₁₇(ＣＨ₂)₂Ｓｉ(ＯＣ₂Ｈ₅)₃、
ＣＦ₃(ＣＦ₂)₁₈(ＣＨ₂)₂Ｓｉ(ＯＣＨ₃)₃、ＣＦ₃(ＣＦ₂)₁₈(ＣＨ₂)₂Ｓｉ(ＯＣ₂Ｈ₅)₃、
ＣＦ₃(ＣＦ₂)₁₉(ＣＨ₂)₂Ｓｉ(ＯＣＨ₃)₃、ＣＦ₃(ＣＦ₂)₁₉(ＣＨ₂)₂Ｓｉ(ＯＣ₂Ｈ₅)₃
等が挙げられる。

なお、第１及び第２の有機単分子膜は、パターニングにより所望の位置に形成することができる。特に、オンチップでの集積化デバイスを形成するためには、有機単分子膜のパターニングが有効である。例えば、検出部の絶縁層表面には、アミロイド結合性化合物固定化のために反応性官能基を有する有機分子で構成された第１の単分子膜を、一方で、参照部、更には非ゲート部（テンプレート部）においては、アミロイドの非特異的な吸着を避けるために、アミロイド結合性化合物及びアミロイドのいずれとも反応しない有機分子で構成された第２の有機単分子膜をパターニングにより位置選択的に形成する。

参照部としては、第２の有機単分子膜として第１の有機単分子膜と同様の単分子膜に、測定対象のアミロイドと相互作用しない化合物を固定化したものを利用することも可能である。すなわち、測定対象のアミロイドと相互作用しない化合物／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を参照部とすることもできる。この場合、参照部は、上述した検出部における有機単分子膜形成方法及び後述する化合物固定化方法と同じ方法にしたがって形成することができる。

本発明のアミロイド結合性化合物固定化半導体センシングデバイスには、上記検出部の第１の有機単分子膜にアミロイド結合性化合物が固定化される。例えば、図１（Ｃ）に示されるように、第１の有機単分子膜３にアミロイド結合性化合物１１が結合される。

固定化するアミロイド結合性化合物としては、コンゴーレッド及びその誘導体、チオフラビンＴ及びその誘導体等が挙げられる。これらのうち、上記デバイスへの固定化の容易さから、特にコンゴーレッドが好ましい。アミロイド結合性化合物は、市販品を使用し得る。

上記アミロイド結合性化合物は、直接又は架橋分子を介して上記有機単分子膜に固定化される。架橋分子としては、例えば、グルタルアルデヒド等が挙げられる。この場合、上記有機単分子膜をグルタルアルデヒド修飾する方法は、特に限定されないが、例えば０．０１〜２５質量％のグルタルアルデヒドを含むリン酸緩衝生理食塩水（１３７ｍＭＮａＣｌ、２．７ｍＭＫＣｌ、８．１ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ、１．５ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７．４、以下１×ＰＢＳと称する。）中で、１０〜５０℃で１分〜２４時間反応させればよい。

次に、アミロイド結合性化合物中のアミノ基等の反応性官能基をグルタルアルデヒドと反応させることでアミロイド結合性化合物を固定化する。具体的には、例えば、アミロイド結合性化合物を含む溶液（溶媒は超純水又は１×ＰＢＳ）中で、１０〜５０℃で１分〜２４時間反応させればよい。好ましくは、１０〜３５℃で１分〜６０分間反応させればよい。上記アミロイド結合性化合物の濃度は、１ｐｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬが好ましく、１ｎｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬがより好ましい。

本発明の方法によれば、簡便かつ高感度にアミロイドを検出することが可能である。
本発明のデバイスは、アミロイド結合性化合物を高密度に固定できるため、アミロイドを高感度に検出することが可能である。また、アミロイドとの結合部位が有機単分子膜界面から近くなるため、生理的条件下におけるアミロイドの検出が可能となる。

以下、実施例、調製例及び比較例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。

［１］コンゴーレッド固定化半導体センシングデバイスの構築
［実施例１］
コンゴーレッド／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部として備えるデバイスを構築した。絶縁層としてはシリコン酸化物を用いた。検出部の第１の有機単分子膜として、アミノプロピルトリエトキシシランを用いて単分子膜を形成した。以下にデバイス作製方法について記載する。

凸版印刷（株）製の１０μｍ長、１，０００μｍ幅のｎ型ＦＥＴからアセトンを用いて超音波処理することでフォトレジストを除去した。ゲート表面にヒドロキシ基を導入して活性部位を作製するため、プラズマリアクターＰＲ３０１（ヤマト科学（株）製）を用いて、２００ＷのＯ₂プラズマに１分間暴露した。
アミノプロピルトリエトキシシラン（シグマアルドリッチ社製）を１質量％含むトルエン中にデバイスを浸漬し、アルゴン雰囲気下、６０℃で７分間静置することで、ゲート上へ単分子膜を成膜した。単分子膜を形成したＦＥＴをメタノール／トルエン混合溶媒（質量比１：１）を用いて超音波洗浄し、エタノールでリンスした。
次に、コンゴーレッド（東京化成工業（株）製）を単分子膜に固定化するために、上記ＦＥＴを２．５質量％グルタルアルデヒド含有１×ＰＢＳ中に浸漬し、室温で３０分間反応させ、単分子膜をグルタルアルデヒド修飾した。グルタルアルデヒド修飾したＦＥＴを１０ｎｇ／ｍＬコンゴーレッド水溶液中に浸漬し、室温で１時間反応させることでコンゴーレッドを単分子膜に固定化した。

［２］酵母由来アミロイド形成性タンパク質Ｓｕｐ３５の検出
［調製例１］アミロイド試料の調製
酵母由来のアミロイド形成性タンパク質であるＳｕｐ３５（線維形成に必要とされているＮＭドメインのみ）は、非特許文献１（J. Biol. Chem. vol. 276, pp. 35227-35230, 2001）記載の方法にしたがって調製した。Ｓｕｐ３５モノマーを８Ｍ塩酸グアニジンに溶かして１１０μＭモノマー溶液を調製し、超音波処理（１５分、３〜６回）した。次いで、該モノマー溶液を１５０ｍＭＮａＣｌ及び５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む５ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）で１００倍希釈し、容器を４℃で１晩ローテーターにてゆっくり回転させ、ｓｅｅｄを形成させた。ｓｅｅｄと８Ｍ塩酸グアニジンに溶かしたモノマーを１００倍量の上記バッファーに加え、４℃にて１日、４日、５日、８日、１１日、１４日間保存し、Ｓｕｐ３５がオリゴマー化、ファイバー化及びプラーク化した試料を調製した。

［実施例２］アミロイド試料の検出
実施例１で作製したコンゴーレッド固定化半導体センシングデバイスをホルダーに設置し、デバイスの検出部を０．０１×ＰＢＳ０．３ｍＬに１０分間浸漬した。浸漬後、室温で、アミロイド結合性化合物固定化デバイスの電流−電圧曲線を、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極を用い、デジタルソースメータ（ケースレー社製、２６１２）で測定した。測定条件はゲート電圧−３Ｖ〜１Ｖ、ドレイン電圧０．５Ｖとした。更に、ゲート表面上に調製例１で調製した試料を添加し、３０分間静置した後、１×ＰＢＳ１０ｍＬで洗浄し、次いで０．０１×ＰＢＳ３ｍＬを用いてリンスを行った。その後、ゲート表面上に０．０１×ＰＢＳを０．５ｍＬ添加して１０分間静置した後、タンパク質吸着デバイスの電流−電圧曲線を測定し、アミロイド試料添加前後でのゲート電圧シフトΔＶ_gを評価した。

［比較例１］
比較例として、調製例１で調製した試料の代わりにコンゴーレッドに結合活性を示さないタンパク質である１５０ｎＭヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む１×ＰＢＳを用いた以外は、実施例２と同じ方法でＨＳＡ添加前後でのゲート電圧シフトΔＶ_gを評価した。

結果を表１及び図４に示す。また、図５にＳｕｐ３５試料添加前のデバイス表面並びにＳｕｐ３５モノマー、オリゴマー、ファイバー及びプラーク添加後のデバイス表面のＡＦＭ画像を示す。なお、表１、図４及び図５中、日数はＳｕｐ３５試料調製後４℃で保存した期間を示す。

表１及び図４に示すように、本発明の方法によってオリゴマー化、ファイバー化及びプラーク化したアミロイドを検出できた。

［３］ヒトアミロイドβファイバーの特異的検出
［調製例２］ヒトアミロイドβ試料の調製
ヒトアミロイドβ（１−４２）及びヒトアミロイドβ（１−４０）モノマー（（株）ペプチド研究所製）をそれぞれ１００μＭになるように０．０１質量％アンモニア含有１×ＰＢＳに溶解した後、３７℃で１、２、３、５、７日間インキュベートし、試料を調製した。

［実施例３］ヒトアミロイドβ試料の検出
実施例１で作製したコンゴーレッド固定化半導体センシングデバイスをホルダーに設置し、デバイスの検出部を０．０１×ＰＢＳ０．５ｍＬに１０分間浸漬した。浸漬後、室温で、アミロイド結合性化合物固定化デバイスの電流−電圧曲線を、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極を用い、デジタルソースメータ（ケースレー社製、２６１２）で測定した。測定条件はゲート電圧−３Ｖ〜１Ｖ、ドレイン電圧０．５Ｖとした。更に、ゲート表面上に調製例２で調製した試料を添加し、３０分間静置した後、１×ＰＢＳ３ｍＬで洗浄し、次いで０．０１×ＰＢＳ３ｍＬを用いてリンスを行った。その後、ゲート表面上に０．０１×ＰＢＳを０．５ｍＬ添加して１０分間静置した後、タンパク質吸着デバイスの電流−電圧曲線を測定し、試料添加前後でのゲート電圧シフトΔＶ_gを評価した。

結果を表２及び図６に示す。また、図７及び図８にヒトアミロイドβ試料添加前のデバイス表面及び添加後のデバイス表面のＡＦＭ画像を示す。なお、図６、図７及び図８中、日数はヒトアミロイドβモノマーを３７℃でインキュベートした期間（以下、成長日数と称する。）を示す。また、図６中、ｂｌａｎｋは溶媒（０．０１質量％アンモニア含有１×ＰＢＳ）添加時の応答を示し、そのΔＶ_gは７．４５ｍＶであった。

図７に示すように、ヒトアミロイドβ（１−４２）の成長日数３日目の試料が、はっきりとファイバーを形成していることが確認された。
表２及び図６に示すように、十分なファイバー形成がされたヒトアミロイドβ（１−４２）の成長日数３日目の試料において、強いＦＥＴ応答が観測された。一方、ヒトアミロイドβ（１−４２）の成長日数が１、２、５、７日目の試料においては、十分にファイバーが形成されなかったため、ＦＥＴ応答は成長日数３日目の試料に比べて弱いものとなった。
また、ヒトアミロイドβ（１−４２）とヒトアミロイドβ（１−４０）に対する応答を比較したところ、ヒトアミロイドβ（１−４２）検出が可能な成長日数であっても、凝集能の低いヒトアミロイドβ（１−４０）においてはＦＥＴ応答は観測されなかった。
よって、本実験からコンゴーレッド修飾ＦＥＴのヒトアミロイドβファイバーへの特異的な応答が示された。

［４］濃度依存的なヒトアミロイドβファイバーの検出
［調製例３］ヒトアミロイドβ試料の調製
ヒトアミロイドβ（１−４２）（（株）ペプチド研究所製）を１００μＭになるように０．０１質量％アンモニア含有１×ＰＢＳに溶解した後、３７℃で３日間インキュベートし、０．０１質量％アンモニア含有１×ＰＢＳで希釈して下記表２に示す希釈系列を作製し、試料を調製した。

［実施例４］ヒトアミロイドβ試料の検出
調製例２で調製したヒトアミロイドβ試料の代わりに調製例３で調製したヒトアミロイドβ試料を用いた以外は、実施例３と同じ方法でヒトアミロイドβ試料添加前後におけるゲート電圧シフトΔＶ_gを評価した。

［比較例２］
比較例として、調製例２で調製した試料の代わりにコンゴーレッドに結合活性を示さないタンパク質である１００μＭＨＳＡを含む０．０１質量％アンモニア含有１×ＰＢＳを用いた以外は、実施例３と同じ方法でＨＳＡ添加前後でのゲート電圧シフトΔＶ_gを評価した。

結果を表３及び図９に示す。

表３及び図９に示すように、本発明の方法によって、ヒトアミロイドβファイバーを濃度依存的に検出できた。

１シリコン基板
２絶縁層
３第１の有機単分子膜
４ゲート電極
５ソース電極
６ドレイン電極
７ドープ領域
８参照部
９検出部
１０テンプレート部
１１アミロイド結合性化合物
１２アミロイド

Claims

アミロイド結合性化合物固定化半導体センシングデバイス上に固定化されたアミロイド結合性化合物とアミロイドとを相互作用させる工程と、
該相互作用によるゲート電極上の表面電位変化を検出する工程と
を含むことを特徴とするアミロイドの検出方法。
上記アミロイド結合性化合物固定化半導体センシングデバイスが、半導体上に反応ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む第１の絶縁層が形成された電界効果トランジスタの上記第１の絶縁層の上に、反応性官能基を有するアルコキシシランの単分子膜からなる第１の有機単分子膜を形成し、該第１の有機単分子膜にアミロイド結合性化合物を上記反応性官能基を介して直接又は架橋分子を用いて結合させてなる、アミロイド結合性化合物／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部として備えるものである請求項１記載のアミロイドの検出方法。
上記アミロイド結合性化合物が、コンゴーレッドである請求項１又は２記載のアミロイドの検出方法。
半導体上に反応ゲート絶縁部としてシリコン酸化物又は無機酸化物を含む第１の絶縁層が形成された電界効果トランジスタの上記第１の絶縁層の上に、反応性官能基を有するアルコキシシランの単分子膜からなる第１の有機単分子膜を形成し、該第１の有機単分子膜にアミロイド結合性化合物を上記反応性官能基を介して直接又は架橋分子を用いて結合させてなる、アミロイド結合性化合物／有機単分子膜／絶縁層／半導体構造を検出部として備えることを特徴とするアミロイド結合性化合物固定化半導体センシングデバイス。
上記反応性官能基を有するアルコキシシランが、下記式（１）で表される請求項４記載のアミロイド結合性化合物固定化半導体センシングデバイス。
（式中、Ｒは、アミノ基、アミノオキシ基、カルボキシル基又はチオール基である。Ｒ¹は、炭素数３〜２２の直鎖状のアルキレン基である。Ｒ²〜Ｒ⁴は、それぞれ独立に炭素数１〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基又は炭素数２〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルコキシアルキル基である。）
上記アミロイド結合性化合物が、コンゴーレッドである請求項４又は５記載のアミロイド結合性化合物固定化半導体センシングデバイス。