JP2014095696A

JP2014095696A - 反応性代謝物の検出方法

Info

Publication number: JP2014095696A
Application number: JP2013213770A
Authority: JP
Inventors: Shinji Nakayama; 慎司中山
Original assignee: Toyama Chemical Co Ltd
Current assignee: Toyama Chemical Co Ltd
Priority date: 2012-10-12
Filing date: 2013-10-11
Publication date: 2014-05-22
Anticipated expiration: 2033-10-11
Also published as: JP6284335B2

Abstract

【課題】被験化合物の放射標識体を用いず、定量性に優れ、ハイスループットで実施可能な反応性代謝物を検出する方法が求められている。
【解決手段】（１）［^３Ｈ］および［^１４Ｃ］、または、［^３Ｈ］および［^３５Ｓ］のいずれか１つの組み合わせとなるように放射標識されたソフトトラップ剤およびハードトラップ剤の存在下で、被験化合物の代謝反応を行う反応工程、（２）反応工程後に未反応のトラップ剤を取り除く前処理工程、および（３）前処理工程後に２種の付加体の放射線量を同時に測定する定量工程を含む反応性代謝物の検出方法。
【効果】２種の放射線量を分別同時定量が可能となり、測定や解析にかかる時間を短縮できるため、特に医薬品の探索初期段階において、反応性代謝物を検出する方法として有用である。
【選択図】なし

Description

本発明は、薬物の毒性の原因となる反応性代謝物の検出の方法に関する。

医薬品などの化合物が生体内に取り込まれると、代謝を受けることにより、反応性の高い中間体が生成することがある。このような中間体は、反応性代謝物と呼ばれ、これまで多くの研究がなされてきた。反応性代謝物は、細胞内の重要な機能を担っているタンパク質や核酸と共有結合することにより、細胞の機能障害、細胞ストレスおよび細胞死を引き起こすと考えられている。そのため、反応性代謝物を生成する薬物は、毒性、特に肝毒性を示す可能性が高いと考えられている。

反応性代謝物の検出方法として、低分子のトラップ剤を用いたトラッピング試験、シトクロムP450の時間依存的阻害試験、共有結合試験などが挙げられる。特に、ヒト肝臓ミクロゾームなどへの被験化合物の共有結合量は、被験化合物の代謝過程で生じる反応性代謝物の反応性の高さと量を反映しており、臨床における反応性代謝物が原因と考えられる毒性のリスク評価をする上で有用な指標と考えられている。しかしながら、共有結合試験は放射標識した被験化合物を必要とするため、放射標識した被験化合物の製造に時間がかかり、高コストであることから医薬品の探索初期段階に実施することは困難である。したがって、医薬品の探索初期段階では、トラッピング試験やシトクロムP450の時間依存的阻害試験が実施されている。また、肝毒性の予測精度はトラッピング試験のほうがより優れているという報告がある（非特許文献１）。

トラッピング試験とは、肝臓ミクロゾームなどを酵素源にして生成した反応性代謝物を低分子のトラップ剤で捕捉し、トラップ剤の標識を検出することにより、定性的または定量的に分析する試験である。また、反応性代謝物の反応中心は、主にソフトとハードに分類され、それぞれ捕捉するのに適したトラップ剤が異なることから、複数のトラップ剤を用いることが偽陰性を回避するために必要とされる（非特許文献２）。
たとえば、放射標識された［^３５Ｓ］システインおよび［^１４Ｃ］シアニドをトラップ剤として用い、肝臓ミクロゾームによって代謝された反応性代謝物とトラップ剤の付加体を検出する方法が開示されている（非特許文献３）。

ドラッグ・メタボリズム・アンド・ディスポジション（Drug Metab. Dispos.）、第39巻、第7号、第1247〜1254頁（2011年7月）ラピッド・コミュニケーションズ・イン・マススペクトロメトリー（Rapid Commun. Mass Spectrom.）、第23巻、第6号、第843〜855頁（2009年3月）ドラッグ・メタボリズム・アンド・ファーマコキネティクス（Drug Metab. Pharmacokinet.）、第24巻、第3号、第245〜254頁（2009年）ドラッグ・メタボリズム・アンド・ディスポジション（Drug Metab. Dispos.）、第37巻、第9号、第1970〜1977頁（2009年9月）ドラッグ・メタボリズム・アンド・ディスポジション（Drug Metab. Dispos.）、第37巻、第12号、第2383〜2392頁（2009年12月）

しかしながら、複数のトラップ剤を用いてトラッピング試験を行った場合、引き続いて実施されることが一般的な、各付加体の構造解析工程への移行が難しかった。なぜなら、たとえば、非特許文献３に記載の方法では、［^３５Ｓ］と［^１４Ｃ］は放射線のエネルギーが同程度であるため、各放射線量を同時に分別して定量することが困難であり、混在する各付加体の絶対量がわからず、構造解析時の質量分析装置の検出条件が煩雑になるからである。また、構造解析に使用が推奨される高額な安定同位体を浪費する可能性を含むからである。
また、複数のトラップ剤を用いたトラッピング試験は、複数のトラップ剤の分別同時定量が不可能であるため、測定および解析が長時間にわたり、特に探索初期段階に必要とされるスループット性が損なわれる。
被験化合物の放射標識体を用いず、定量性に優れ、ハイスループットで実施可能な反応性代謝物を検出する方法が求められている。

このような状況下、本発明者は、［^３Ｈ］の放射線のエネルギーが［^１４Ｃ］および［^３５Ｓ］の放射線のエネルギーに比べて小さいため、複数のエネルギー幅で区切って放射線量測定すれば、各放射線量を同時に分別して定量することが可能であることに着目した。そして、本発明者は鋭意研究を行った結果、トラッピング試験において、［^３Ｈ］および［^１４Ｃ］、または、［^３Ｈ］および［^３５Ｓ］のいずれか１つの組み合わせで放射標識された２種のトラップ剤を用いることによって、２種の付加体の分別同時定量が可能となり、測定や解析にかかる時間の短縮を達成することができることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、（１）［^３Ｈ］および［^１４Ｃ］、または、［^３Ｈ］および［^３５Ｓ］のいずれか１つの組み合わせとなるように放射標識されたソフトトラップ剤およびハードトラップ剤の存在下で、被験化合物の代謝反応を行う反応工程、（２）反応工程後に未反応のトラップ剤を取り除く前処理工程、および（３）前処理工程後に２種の付加体の放射線量を同時に測定する定量工程を含むことを特徴とする、ハイスループットで実施可能な反応性代謝物の検出方法を提供するものである。

本発明は、［^３Ｈ］および［^１４Ｃ］、または、［^３Ｈ］および［^３５Ｓ］のいずれか１つの組み合わせで放射標識された２種のトラップ剤を用いることで両者の放射線量を分別同時定量が可能となり、測定や解析にかかる時間を短縮できるため、特に医薬品の探索初期段階において、反応性代謝物を検出する方法として有用である。
また、医薬品開発の探索初期において、反応性代謝物生成を回避した化合物を取得するには反応部位を推定することが好ましいため、本発明のようなトラッピング試験に引き続いて付加体の構造解析が行われる場合がある。本発明は、性質の異なる２種のトラップ剤との付加体を分別して検出することが可能なため、分別せずに検出する方法と比較して、構造解析工程に移行しやすい。さらに、放射線量測定の際に必要な液体シンチレーションカクテルの使用量が削減できる。

本明細書において、特にことわらない限り、各用語は、次の意味を有する。
反応性代謝物とは、被験化合物が体内で代謝されることによって生じる、反応性を有する代謝物を意味する。

付加体とは、反応性代謝物とトラップ剤の結合体を意味する。
トラップ剤とは、反応性代謝物の求電子部位との結合に適した求核性を有する低分子化合物を意味する。
ソフトおよびハードとは、Hard and soft acids and bases則におけるソフトおよびハードを指し、ルイス酸およびルイス塩基について、ソフトな酸はソフトな塩基と、ハードな酸はハードな塩基と反応しやすいことを示す原理に基づく用語である。

次に、本発明の検出方法について説明する。
本発明の方法は、（１）［^３Ｈ］および［^１４Ｃ］、または、［^３Ｈ］および［^３５Ｓ］のいずれか１つの組み合わせとなるように放射標識されたソフトトラップ剤およびハードトラップ剤の存在下で、被験化合物の代謝反応を行う反応工程、（２）反応工程後に未反応のトラップ剤を取り除く前処理工程、および（３）前処理工程後に２種の付加体の放射線量を同時に測定する定量工程、を含む。

本発明において、反応工程の条件は、被験化合物の代謝反応が生じる条件であれば特に制限はないが、生体内の条件を反映していることが好ましい。たとえば、pH6.0〜8.0、35〜40℃の緩衝液を反応液として用いることができ、pH7.4、37℃の緩衝液を反応液として用いることが好ましい。この反応は前記の溶液に被験化合物および代謝酵素を添加して行うが、適宜試薬を添加してもよい。また、ここで使用される代謝酵素は、試験目的に応じて精製または粗精製された薬物代謝酵素を使用してもよく、代謝酵素を含む生体抽出物を使用してもよい。
本発明で用いられる２種のトラップ剤は、一方はソフトトラップ剤、他方はハードトラップ剤である。
ソフトトラップ剤としては、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステインまたはシステインが挙げられ、グルタチオンが好ましい。
ハードトラップ剤としては、シアニド、セミカルバジド、メトキシアミンまたはリシンが挙げられ、シアニドが好ましい。
トラップ剤としては、たとえば、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン、システイン、セミカルバジド、メトキシルアミンもしくはリシンなどの［^３Ｈ］で放射標識可能な化合物；グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン、システイン、シアニド、セミカルバジド、メトキシルアミンもしくはリシンなどの［^１４Ｃ］で放射標識可能な化合物；またはグルタチオン、Ｎ−アセチルシステインもしくはシステインなどの［^３５Ｓ］で放射標識可能な化合物が挙げられる。
分別同時定量を可能にするため、２種のトラップ剤の放射核種の組み合わせは、［^３Ｈ］および［^１４Ｃ］、または、［^３Ｈ］および［^３５Ｓ］のいずれか１つの組み合わせであり、［^３Ｈ］および［^１４Ｃ］の組み合わせが好ましい。
放射標識された２種のトラップ剤としては、［^３Ｈ］グルタチオンおよび［^１４Ｃ］シアニドの組み合わせが好ましい。
緩衝液としては、たとえば、リン酸緩衝液またはトリス塩酸緩衝液などが挙げられる。
薬物代謝酵素としては、たとえば、シトクロムP450、エステラーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、エポキシド加水分解酵素、グルクロン酸転移酵素、硫酸転移酵素、グルタチオン転移酵素、アセチル転移酵素またはメチル転移酵素などが挙げられる。
代謝酵素を含む生体抽出物としては、たとえば、肝臓ミクロゾーム、肝臓サイトゾル、肝臓S9または特定の酵素を発現させた昆虫細胞膜画分などが挙げられる。
反応液に添加される試薬としては、たとえば、塩化マグネシウムまたはアラメチシンなどが挙げられる。
代謝反応の時間に特に制限はなく、試験の目的に応じて適宜決定すればよい。
所望の反応時間が経過した後、反応を停止させるが、反応を停止させる方法としては、特に制限はなく、たとえば、有機溶媒の添加、pHの変更または反応温度の変更を挙げることができる。

本発明において、前処理工程の方法は、未反応のトラップ剤を取り除くことができれば特に制限されないが、たとえば、固相抽出法または液液抽出法などが挙げられ、固相抽出法が好ましい。固相抽出法で用いられる固相抽出カラムの担体量は、未反応のトラップ剤を取り除くことができるように適宜決定すればよい。また、固相抽出法における分配の原理は、たとえば、逆相やイオン交換などが挙げられるが、適宜決定すればよい。
洗浄液の種類は、適宜決定すればよく、たとえば、精製水または非放射標識トラップ剤水溶液などを挙げることができる。
洗浄液の量は、測定時に十分なシグナル・ノイズ比が確保でき、かつ、２種の放射核種のうち、一方の放射線量が他方の放射線量の測定に影響を及ぼさない範囲内におさめることができるように、適宜決定すればよい。
測定時間に特に制限はなく、適宜決定すればよいが、たとえば、5〜30分間測定すればよく、5〜10分間が好ましい。

本発明において、定量工程で用いる機器としては、シンチレーション法により測定できれば特に制限されないが、たとえば、液体シンチレーションカウンターまたは高速液体クロマトグラフィー／放射能検出器などが挙げられ、液体シンチレーションカウンターが好ましい。

次に、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１
（１）反応工程
ヒト肝臓ミクロゾーム（1mg/mL）、β-NADPH（1mmol/L）、塩化マグネシウム（3.3mmol/L）、［^３Ｈ］グルタチオン（約40kBq/100nmol/mL）および［^１４Ｃ］シアン化カリウム（約4kBq/40nmol/mL）を含有する0.1mol/Lリン酸緩衝液（pH7.4）を予め37℃に加温した。この溶液に、ジメチルスルホキシドに溶解した被験化合物を添加し、反応を開始した。反応液容量は0.15mLとし、反応液中の被験化合物の濃度は50μmol/L、ジメチルスルホキシドの濃度は1％とした。被験化合物として、ベンズブロマロン、カルバマゼピン、クロザピン、フルタミド、ネファゾドン、ネビラピン、チクロピジン、チエニル酸、トログリタゾン、アセトアミノフェン、アトルバスタチン、ジクロフェナク、エリスロマイシン、イミプラミン、インドメタシン、プロカインアミド、プロプラノロール、タクリン、タモキシフェン、ベラパミル、アムロジピン、デキサメタゾン、エチニルエストラジオール、レボフロキサシン、オランザピン、ピオグリタゾン、プラバスタチンおよびロシグリタゾンを用いた。反応開始1時間後、予め氷冷した0.1mol/Lリン酸緩衝液（pH7.4）0.4mLを添加し、氷上に静置することで反応を停止した。
（２）前処理工程
次に、予めメタノール2mLおよび精製水2mLでコンディショニングした固相抽出カラム（Oasis・HLB：粒子径60μm、担体量60mg、Waters社製）に上記（１）で得た液を添加し、液が完全にカラムを通過するまで自然に滴下させた。続いて精製水9mLをカラムに通過させ、未反応のトラップ剤を除去した後にメタノール/アセトニトリル等量混液1.5mLをカラムに通過させ、付加体を溶出した。
（３）定量工程
上記（２）で得た溶出液全量と液体シンチレーションカクテルHionic fluor（PerkinElmer社製）約8mLを混合し、液体シンチレーションカウンターTri-Carb・3110TRの［^３Ｈ］［^１４Ｃ］同時測定モードで、10分間、放射線量を測定した。

実施例１で測定結果から算出されたグルタチオン（ＧＳＨ）付加体およびシアニド（ＣＮ）付加体の総和ならびに非特許文献４および５を参照したヒト肝臓ミクロゾームへの共有結合量には、良好な正の相関傾向が認められた（図１）。
この結果は、本発明の測定結果から算出された付加体の総和が、反応性代謝物による毒性リスクを評価する上で有用な指標となり得ることを示している。
また、本発明は、共有結合試験とは異なり、放射標識した被験化合物を必要としないことから、探索初期より実施可能である。

実施例１では、１サンプルあたりの測定を10分間で行った。一方、たとえば、非特許文献３では、１サンプルあたりの測定を75分間で行っている。本発明は、従来技術に比べて、スループットの改善を達成できた。

また、実施例１では、［^３Ｈ］および［^１４Ｃ］の各々の放射線量を区別して同時測定した。一方、たとえば、非特許文献３では、［^３５Ｓ］および［^１４Ｃ］の放射線量を別々に測定するか、または分けずに同時に定量している。本発明は、２種類の付加体の分別同時定量が可能であり、２種類の付加体の絶対量が明らかであることから、引き続いて実施される構造解析時の質量分析装置の検出条件を簡便にできる。また、構造解析に使用が推奨される安定同位体の使用量を必要最小限におさえることができ、低コスト化が可能となる。本発明は、従来技術に比べて、引き続いて実施される構造解析工程へ移行しやすい。

上記のとおり、本発明は、医薬品の探索初期より反応性代謝物による毒性リスクの低い被験化合物を選択することを可能とし、効率的な医薬品開発に貢献できる。

本発明により得たＧＳＨ付加体とＣＮ付加体量の総和とヒト肝臓ミクロゾームへの共有結合量（非特許文献４および５）の相関図である。

本発明は、被験化合物の放射標識体を必要としない点で、特に医薬品開発の探索初期から応用可能である。性質の異なる複数のトラップ剤との付加体を分別同時定量可能であることから、引き続く構造解析過程へ移行しやすいなどのメリットを有し、かつ、測定時間の短縮により、ハイスループットで実施可能であり、反応性代謝物の検出方法として有用である。

Claims

（１）［^３Ｈ］および［^１４Ｃ］、または、［^３Ｈ］および［^３５Ｓ］のいずれか１つの組み合わせとなるように放射標識されたソフトトラップ剤およびハードトラップ剤の存在下で、被験化合物の代謝反応を行う反応工程、
（２）反応工程後に未反応のトラップ剤を取り除く前処理工程、および
（３）前処理工程後に２種の付加体の放射線量を同時に測定する定量工程を含む反応性代謝物の検出方法。
ソフトトラップ剤およびハードトラップ剤が［^３Ｈ］および［^１４Ｃ］の組み合わせとなるように放射標識された、請求項１に記載の反応性代謝物の検出方法。
ソフトトラップ剤が［^３Ｈ］グルタチオンである請求項１または２に記載の反応性代謝物の検出方法。
ハードトラップ剤が［^１４Ｃ］シアニドである請求項１〜３のいずれか一項に記載の反応性代謝物の検出方法。