JP2014088402A

JP2014088402A - Ｃ末端におけるポリペプチドの結合

Info

Publication number: JP2014088402A
Application number: JP2013258445A
Authority: JP
Inventors: Bernd Peschke; ベルントペシュケ，; Zundel Magali; マガリズンデル，
Original assignee: Novo Nordisk Health Care AG
Current assignee: Novo Nordisk Health Care AG
Priority date: 2006-02-14
Filing date: 2013-12-13
Publication date: 2014-05-15
Also published as: JP5486809B2; EP1986694A1; JP2009526812A; US20090082254A1; EP1986694B1; ES2546282T3; US20140045753A1; WO2007093594A1

Abstract

【課題】新規のポリペプチド、それらの合成方法、新規のポリペプチドを含有する医薬組成物、並びに治療用途の医薬におけるそれらの使用方法を提供する。
【解決手段】結合部分によりそれらのＣ末端を介して結合した２つのポリペプチドを含有するポリペプチド化合物であり、ここで結合部分が１,２,３-トリアゾール部分を有しているポリペプチド化合物。
【選択図】なし

Description

(発明の分野)
本発明は、タンパク質化学の分野、特に治療用ポリペプチドコンジュゲートに関する。

(発明の背景)
様々なヒト由来のポリペプチドが、過去８０年以上、種々の病気を処置するための治療剤として使用されている。例えば、クリアランス値があまりに高いため、治療剤として使用される場合、天然ポリペプチドの効能を高め、又は種々の欠点を改善するために、天然ポリペプチドを様々に修飾させることがテストされている。治療用ポリペプチドの分野においては、とりわけ、２つのポリペプチドを結合させることで、互いに有益な薬力学的又は薬物動態学的効果を付与し得るかどうかが研究されている。通常、これらのポリペプチドコンジュゲートは、第１ポリペプチドのＣ末端と第２のポリペプチドのＮ末端との間のペプチド結合により連結している二量体化化合物又は融合ポリペプチドである。

モノマーポリペプチドと比較した、二量体化ポリペプチドの改良された又は高められた生物学的効果の具体例は、文献に見出すことができる。
Albrechtら(Bioconjugate Chem. 15, 16-26(2004))は、ＳｃＦｖｓを二量体化しており、これはジチオ-架橋を介して二量体化している。
Gaoら(Bioorg. Med. Chem. Lett. 15, 1847-1850(2005))は、エンドモルフィン-２の新規で二価のＣ末端修飾類似体の構造活性相関を論議している。１０倍高い有効性は、このペプチドのＣ末端を二量体化することにより得られるとされる。Ｃ末端の二量体化は、ポリペプチドが結合される対称ジアミンの使用により達成された。この方略は制限された大きさの合成的に利用可能なペプチドについて使用され得る。しかしながら、生物系で生成されたより大きなポリペプチドについては、Ｃ末端へのジアミンの選択的結合は、Ｃ末端酸の選択的活性化が必要であるために、非常に困難であることが予期されるので、この方略は有用ではない。
Stewart(Peptides 25, 527-532(2004))は、生物活性における、ポリペプチドのＮ末端での二量体化の顕著な効果を報告している。ペプチドそれ自体は、ＰＣ-３癌細胞系のインビボでの成長阻害において何の効果も示さないが、二量体化したものは７８％阻害を示す。

２つの生体分子の共有結合のためのスペーサーとして使用される二官能性分子は、Ｌｉら(Bioorg. Med. Chem. Lett. 15, 5558-5561(2005))により記載されている。
欧州特許第２４３９２９号には、ポリペプチドのＣ末端に、ポリペプチド、レポーター基又は細胞傷害剤を導入するための、カルボキシペプチダーゼのある種の使用が開示されている。

例えばＰＥＧ化又は脂質付着による共有結合修飾は、いくつかのポリペプチドベースの薬剤学に成功裏に応用され、それらの薬物動態学的及び薬力学的プロフィールが改善されている。しかしながら実際、このアプローチは、常に、薬物動態学的及び薬力学的プロフィールの最適適合性、すなわち、高い活性、延長した循環半減期等を有するポリペプチド化合物を保証する。また、２つのポリペプチドを結合させるために利用可能な方法は、合成され、前臨床及び臨床テストにかけられるポリペプチドコンジュゲートの数を制限する。例えば、治療剤として有用であり得る多くのポリペプチドは、Ｎ末端の修飾に影響を受けた生物活性を示し得る。Ｎ末端を介した結合により、所望の生物活性が損なわれるので、このようなポリペプチドにとって、ポリペプチドコンジュゲートを生成することは困難であるおそれがある。成分ポリペプチドからある程度純粋な形態で、ポリペプチドコンジュゲートが生成することのできる、医薬、特に治療用化合物として使用される２つのポリペプチドを結合させるための方法が、安全面、調節法及び製造コスト等、全てから要求されている。

よって、商業的に意味のある収率で得られ、特定の高活性、延長した血漿半減期、及び／又は製造性、操作性及び処方性に関連して、許容可能な生化学的特性を示すポリペプチドコンジュゲートを生成するために、ポリペプチドを結合する改善された代替法が必要とされている。このような方法は、ここで提供される本発明の記述に記載されている、本発明の付加的な側面、特徴及び利点により提供される。これらの側面は十分に記載されており、本発明のさらなる側面、特徴及び利点は、ここに提供されている本発明の記載から明らかになるであろう。

(発明の要約)
例えば、いくつかの種類の２つのポリペプチドが互いに極めて近接している場合は、それらの生物活性を高めるために、２つの異なるポリペプチドが互いに結合している場合は、２つの異なる生物学的効果を組合せるために、及び／又は少なくとも一方の結合されたポリペプチドの薬物動態パラメータを高めるために、ポリペプチドを結合させることは有利である。
本発明は、とりわけ、Ｃ末端に修飾を有する２つのポリペプチドを、それぞれそれらのＣ末端で結合させ、Ｃ末端を反応させて、２つのポリペプチド間に共有結合を形成させる方法を提供する。
この方法は、高い収率及び純度でポリペプチドコンジュゲートを生成させるのに有用であり、構成ポリペプチドの双方がそのままのＮ末端を保持可能であることが示されている。

一実施態様において、本発明は、２つのポリペプチドをそれぞれのＣ末端で結合させる方法であって、
(ａ)結合されるポリペプチドのＣ末端を酵素触媒的に修飾し、それにより反応基を含む化学基を結合されるポリペプチドのＣ末端に導入し；
(ｂ)(ｉ)互いに、２つの化学基の反応基を反応させるか、又は
(ｉｉ)スペーサー分子の第１の反応基と第１の化学基の反応基を反応させ、スペーサー分子の第２の反応基と第２の化学基の反応基を反応させる；
ことを含む方法を提供するものである。

一実施態様において、本発明は、
(ａ)結合されるポリペプチドのＣ末端を酵素触媒的に修飾し、それにより反応基Ｗを含む化学基を、結合される第１のポリペプチドのＣ末端に導入し、反応基Ｚを含む化学基を、結合される第２のポリペプチドのＣ末端に導入し；
(ｂ)スペーサー分子の反応基Ｙと反応基Ｚとを反応させて、化学基Ｘを形成させ、
スペーサー分子の反応基Ｖと反応基Ｗとを反応させて、化学基Ｕを形成させる；
ことを含む方法を提供する。
一実施態様において、酵素触媒的修飾は、酵素カルボキシペプチダーゼＹにより実施される。

(本発明の詳細な記載)
上述したように、本発明は、２つのポリペプチドをそれぞれのＣ末端で結合させる方法であって、
(ａ)結合されるポリペプチドのＣ末端を酵素触媒的に修飾し、それにより反応基を含む化学基を結合されるポリペプチドのＣ末端に導入し；
(ｂ)(ｉ)互いに、２つの化学基の反応基を反応させるか、又は
(ｉｉ)スペーサー分子の第１の反応基と第１の化学基の反応基を反応させ、スペーサー分子の第２の反応基と第２の化学基の反応基を反応させる；
ことを含む方法を提供するものである。

一実施態様において、本発明は、
(ａ)結合されるポリペプチドのＣ末端を酵素触媒的に修飾し、それにより反応基Ｗを含む化学基を、結合される第１のポリペプチドのＣ末端に導入し、反応基Ｚを含む化学基を、結合される第２のポリペプチドのＣ末端に導入し；
(ｂ)スペーサー分子の反応基Ｙと反応基Ｚとを反応させて、化学基Ｘを形成させ、
スペーサー分子の反応基Ｖと反応基Ｗとを反応させて、化学基Ｕを形成させる；
ことを含む方法を提供する。

ポリペプチドのＣ末端の酵素触媒的修飾は、様々な酵素により実施され得る。一実施態様において、酵素はカルボキシペプチダーゼＹ(ＣＰＹ)である。一実施態様において、酵素はカルボキシペプチダーゼＹの変異体又は断片であり、変異体又は断片は、反応を触媒する能力を保持しており、それによりタンパク質又はペプチドのＣ末端アミノ酸は、種々の化学部分で置き換えられる。カルボキシペプチダーゼＹのいくつかの変異体は、当該技術で公知であり；例えば国際公開第９８／３８２８５号が参照される。

ここで使用される場合、「ポリペプチド」なる用語は、ペプチド結合により共有的に結合する少なくとも５つの構成アミノ酸残基を含有する化合物を意味する。一実施態様において、結合される少なくとも一のポリペプチドは、ペプチド結合により互いに共有的に結合する少なくとも約１０、例えば少なくとも約１５、例えば少なくとも約２０、例えば少なくとも約３０、例えば少なくとも約４０、例えば少なくとも約５０、例えば少なくとも約７５、例えば少なくとも約１００のアミノ酸残基を含有する、少なくとも一の鎖を含む。一実施態様において、結合される双方のポリペプチドは、ペプチド結合により互いに共有的に結合する少なくとも約１０、例えば少なくとも約１５、例えば少なくとも約２０、例えば少なくとも約３０、例えば少なくとも約４０、例えば少なくとも約５０、例えば少なくとも約７５、例えば少なくとも約１００のアミノ酸残基を含有する、少なくとも一の鎖を含む。

構成アミノ酸は、遺伝暗号によりコードされるアミノ酸の群からのものであってよく、またそれらは遺伝暗号によりコードされない天然アミノ酸、並びに合成アミノ酸であってもよい。遺伝暗号によりコードされない天然アミノ酸は、例えばヒドロキシプロリン、γ-カルボキシ-グルタミン酸、オルニチン、ホスホセリン、Ｄ-アラニン、Ｄ-グルタミン酸である。合成アミノ酸は、有機合成により製造されたアミノ酸、例えば遺伝暗号によりコードされたアミノ酸のＤ-異性体、及びＡｉｂ(α-アミノイソ酪酸)、Ａｂｕ(α-アミノ酪酸)、Ｔｌｅ(tert-ブチルグリシン)、及びβ-アラニンを含む。ポリペプチドは、ペプチド単鎖を含んでいてもよいし、又は１以上のポリペプチド鎖を含んでいてもよく、例えばヒト成長ホルモンは単鎖であり、ヒトインシュリンはジスルフィド結合により連結した２本鎖である。もちろん、ポリペプチドが、「第１のポリペプチド」(又はポリペプチドＡ)として、また「第２のポリペプチド」(又はポリペプチドＢ)として選択されるかは任意であり、よって本発明の範囲を何ら制限することを目的としているものではない。

反応基Ｚは、ＣＰＹ-媒介性反応を介して、ポリペプチドＡのＣ末端に導入されてよい。この反応基はスペーサー-分子の反応基Ｙと反応し、化学基Ｘが形成され、ポリペプチドＡに共有的にスペーサー-分子ＬＬが結合される。反応基Ｗは、ＣＰＹ-媒介性反応を介して、ポリペプチドＢのＣ末端に導入されてよい。この反応基はスペーサー-分子の第２の反応基Ｖと反応し、化学基Ｕが形成され、ポリペプチドＢに共有的にスペーサー-分子ＬＬが結合される。ポリペプチドＡとポリペプチドＢが同一であるならば、反応基Ｗは基Ｚと同一でも異なっていてもよく、スペーサー-分子ＬＬ上の反応基Ｖは、反応基Ｙと同一でも異なっていてもよい。

また、２つのポリペプチド間のスペーサーは、反応基ＺとＷが直接反応することにより形成される、化学基Ｔを有していてよい。

本発明の一実施態様において、ＸとＵは独立して、オキシム、ヒドラゾン、フェニルヒドラゾン、セミカルバゾン、トリアゾール、イソオキサゾリジン、アミド、３-チオピロリジンジオン及びアラルキンのジラジカルからなる群から選択される。
一実施態様において、２つのポリペプチド間のスペーサーは、少なくとも一のエチレングリコールジラジカルを有する。
本発明の一実施態様において、Ｖ、Ｗ、Ｙ及びＺは独立して、アルコキシルアミノ、アリールオキサミノ、オキソ、アジド、アルキニル、アルケニル、ハロアリール、メルカプト、Ｎ-マレイミド、及び２-(ジフェニルホスフィノ)フェノキシカルボニルからなる群から選択される。

一実施態様において、本発明は、
(ａ)結合されるポリペプチドのＣ末端を酵素触媒的に修飾し、それにより反応基Ｗを含む化学基を、結合される第１のポリペプチドのＣ末端に導入し、反応基Ｚを含む化学基を、結合される第２のポリペプチドのＣ末端に導入し；
(ｂ)反応基Ｚと反応基Ｗとを反応させて、化学基Ｔを形成させる；
ことを含む方法に関する。

一実施態様において、Ｔは、オキシム、ヒドラゾン、フェニルヒドラゾン、セミカルバゾン、トリアゾール、イソオキサゾリジン、アミド、３-チオピロリジンジオン及びアラルキンのジラジカルからなる群から選択される。
一実施態様において、Ｗ及びＺは、アルコキシルアミノ、アリールオキサミノ、オキソ、アジド、アルキニル、アルケニル、ハロアリール、メルカプト、Ｎ-マレイミド、及び２-(ジフェニルホスフィノ)フェノキシカルボニルからなる群から選択される。

本発明において、結合される２つのポリペプチドは同一であってよく、また互いに異なっていてもよい。一実施態様において、２つのポリペプチドは同一である。後者の実施態様において、生物活性の増加は、結合活性効果に起因している。
一実施態様において、２つのポリペプチドは互いに異なっている。このことは、結合される２つのポリペプチドの組織分布が同一であるため、治療用ポリペプチドの完全な新規分野を開く。これによって、結合されるポリペプチド化合物に含まれる一方のポリペプチドは、組織分布を決定するために供給可能であり、これに対し、他方のポリペプチドは、関連組織に所望される所定の生物活性を示すことができる。また、一方のポリペプチドは、結合されるポリペプチド化合物の血漿半減期を高める延長分子(protractor molecule)として供給されてよい。他の可能性は、不安定なポリペプチドのタンパク質分解を防止するために、一方のポリペプチドが、他方の不安定なポリペプチドを保護するために供給されることである。

一実施態様において、少なくとも一のポリペプチドは、ヒト成長ホルモン(ｈＧＨ)、ｈＧＨの誘導体、ｈＧＨの変異体、又はｈＧＨ変異体の誘導体である。
ここで使用される場合、「変異体」なる用語は、付与されたポリペプチドの天然に生じた変異、又は付与されたペプチド又はタンパク質の組換え的に調製された又はそうでなければ修飾された変異のいずれかを称し、ここで一又は複数のアミノ酸残基は、アミノ酸置換、付加、欠失、挿入又は転換により修飾されている。
ここで使用される場合、「誘導体」なる用語は、親ポリペプチドに対し、すなわち任意の種類の分子の共有結合により修飾された、好ましくは生物活性を有するポリペプチド又はその変異体又は断片を称する。

一実施態様において、少なくとも一のポリペプチドはｈＧＨ-Ｌｅｕ-Ａｌａである。
一実施態様において、化学基ＺはリンカーＡを介してポリペプチドに導入される。一実施態様において、リンカーＡは、オキソで置換されていてもよい、直鎖状、分枝状及び／又は環状のＣ_１−１０アルカン、Ｃ_２−１０アルケン、Ｃ_２-１０アルキン、Ｃ_１−１０ヘテロアルカン、Ｃ_２−１０ヘテロアルケン、及びＣ_２−１０ヘテロアルキンのビ-ラジカルからなる群から選択され、ここで一又は複数の同素環芳香族化合物のビラジカル(類)又は複素環芳香族化合物のビラジカル(類)が挿入されてもよい。
この明細書の目的において、ラジカル及び他の化学基又は分子に関して「環状」という用語は、環状／直鎖状の混合分子、すなわち直鎖状部分と環状部分の双方を有する分子を含む。

一実施態様において、化学基ＷはリンカーＢを介してポリペプチドに導入される。一実施態様において、リンカーＢは、オキソで置換されていてもよい、直鎖状、分枝状及び／又は環状のＣ_１−１０アルカン、Ｃ_２−１０アルケン、Ｃ_２-１０アルキン、Ｃ_１−１０ヘテロアルカン、Ｃ_２−１０ヘテロアルケン、Ｃ_２−１０ヘテロアルキンのビ-ラジカルからなる群から選択され、ここで一又は複数の同素環芳香族化合物のビラジカル(類)又は複素環芳香族化合物のビラジカル(類)が挿入されてもよい。

「Ｃ_１−１０アルカン」なる用語は、１〜１０の炭素原子を有する直鎖状又は分枝状の飽和した炭化水素残基を含むことを意図している。特定の例は、メタン、エタン、ｎ-プロパン、イソプロパン、ｎ-ブタン、イソブタン、sec-ブタン、tert-ブタン、ｎ-ペンタン、イソペンタン、ｎ-オクタン等である。
「Ｃ_１−１０アルキル」なる用語は、Ｃ_１−１０アルカンのモノラジカルを含むことを意図している。

「Ｃ_２−１０アルケン」なる用語は、２〜１０の炭素原子と少なくとも一の二重結合を有するオレフィン的に不飽和で分枝状又は直鎖状の炭化水素基を含むことを意図している。このような基の具体例には、限定されるものではないが、エチレン、１-プロペン、２-プロペン、イソプロペン、１,３-ブタジエン、１-ブテン、ヘキセン、ペンテン等が含まれる。
「Ｃ_２−１０アルケニル」なる用語は、Ｃ_２−１０アルケンのモノラジカルを含むことを意図している。
「Ｃ_２−１０アルキン」なる用語は、２〜１０の炭素原子と少なくとも一の三重結合を有する不飽和で分枝状又は直鎖状の炭化水素基を含むことを意図している。このような基の具体例には、限定されるものではないが、１-プロピン、２-プロピン１-ブチン、２-ブチン、１-ペンチン、２-ペンチン等が含まれる。
「Ｃ_２-１０アルキニル」なる用語は、Ｃ_２-１０アルキンのモノラジカルを含むことを意図している。

「ヘテロアレン」なる用語は、一又は複数のヘテロ原子(例えば、窒素、酸素、リン又は硫黄)を有する５-６員の単環式芳香族系又は９-１０員の二環式芳香族系の化合物、例えばフラン、チオフェン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、トリアゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、イソチアゾール、イソオキサゾール、オキサゾール、オキサジアゾール、チアジアゾール、キノリン、イソキノリン、キナゾリン、キノキサリン、インドール、ベンゾイミダゾール、ベンゾフラン、プテリジン及びプリン等を含むことを意図している。
「ヘテロアリール」なる用語は、ヘテロアレンのモノラジカルを含むことを意図している。

「Ｃ_１-１０ヘテロアルカン」なる用語は、１〜１０の炭素原子を有する直鎖状又は分枝状の飽和した炭素鎖を含むことを意図しており、ここで一又は複数の炭素原子は、ヘテロ原子(例えば、窒素、酸素、リン又は硫黄)により置換されている。このようなヘテロアルカンの具体例は、例えば：

である。
「Ｃ_１-１０ヘテロアルキル」なる用語は、Ｃ_１-１０ヘテロアルカンのモノラジカルを含むことを意図している。

「Ｃ_２-１０ヘテロアルケン」なる用語は、２〜１０の炭素原子と少なくとも一の二重結合を有するオレフィン的に不飽和で分枝状又は直鎖状の炭化水素基を含むことを意図しており、ここで一又は複数の炭素原子は、ヘテロ原子(例えば、窒素、酸素、リン又は硫黄)により置換されており、例えば：

である。
「Ｃ_２-１０ヘテロアルケニル」なる用語は、Ｃ_２-１０ヘテロアルケンのモノラジカルを含むことを意図している。

「Ｃ_２-１０ヘテロアルキン」は、２〜１０の炭素原子と少なくとも一の三重結合を有する不飽和で分枝状又は直鎖状の炭化水素基を含むことを意図しており、ここで一又は複数の炭素原子は、ヘテロ原子(例えば、窒素、酸素、リン又は硫黄)により置換されており、例えば：

である。
「Ｃ_２-１０ヘテロアルキニル」は、Ｃ_２-１０ヘテロアルキンのモノラジカルを含むことを意図している。

本発明の一実施態様において、リンカーＡ及びリンカーＢは独立して、次の式：

からなる群から選択される。
本発明の一実施態様において、リンカーＡ又はリンカーＢは、２つのポリペプチドの結合には使用されない、一又は複数の付加的な反応基を有する。

一実施態様において、本発明は、ペプチド又はタンパク質のＣ末端に２つの反応基を導入するための化合物の使用に関し、化合物は次の構造：

を有する。

一実施態様において、本発明は、化合物Ｎ,Ｎ'-ビス(２-(２-(２-(２-(４-((３-(Ｎ-((Ｓ)-５-(カルバモイル)-５-(ｈＧＨイルロイシニルアミノ)ペンチル)カルバモイル)ベンジルオキシ)イミノ)ブトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)オメガ−カルバモイル３．４ｋＤａＰＥＧ-カルボン酸アミドに関する。

一実施態様において、本発明は、本発明の方法に従い調製された結合したポリペプチド化合物を提供する。
一実施態様において、本発明は、Ｃ末端を介して結合した２つのポリペプチドを含有するポリペプチド化合物を提供するものであり、ここで、該ポリペプチド化合物は、上述した方法の任意の一つで定義された構造を有している。

一実施態様において、本発明は、それらのＣ末端を介して結合した２つのポリペプチドを含有するポリペプチド化合物を提供するものであり、ここで、結合部分は１,２,３-トリアゾール部分を有している。
ここで使用される場合、「結合部分」又は「最終生成物において２つのポリペプチドを結合させる部分」なる用語は、２つのポリペプチドを結合させる部分、すなわち元来のポリペプチドには存在しない全ての原子を有する部分を意味する。
ここで使用される場合、「１,２,３-トリアゾール部分」なる用語は、次の構造：

を有するジラジカルを意味する。

１,２,３-トリアゾール部分を有する結合部分の具体例は、次の式：

のものである。

一実施態様において、本発明は、それらのＣ末端を介して結合した２つのポリペプチドを含有するポリペプチド化合物を提供するものであり、ここで、結合部分は１,２,３-トリアゾール部分を有し、該ポリペプチド化合物は、本発明の方法を使用することにより得られた又は得られる。
一実施態様において、本発明は、それらのＣ末端を介して結合した２つのポリペプチドを含有するポリペプチド化合物を調製するための本発明の方法を提供するものであり、ここで、結合部分は１,２,３-トリアゾール部分を有する。
この明細書に開示される中間体は、それ自体、本発明の一態様である。

コンジュゲート
また、本発明の結合したポリペプチド化合物はコンジュゲート、すなわち非-ポリペプチド部分等の、化学基に結合(コンジュゲート)していてもよい。
よって、重要な一実施態様において、本方法は、化学基に、少なくとも一の構成ポリペプチドをコンジュゲートさせる、同時及び／又は後続工程をさらに含む。このようなコンジュゲートは、還元されたシステイン残基を介して実施されてよく、又はグルタミン酸残基を介して実施されてもよい。

コンジュゲートは、結合されたポリペプチド化合物の合成前に、構成ポリペプチドの一方で実施されてよく、又は結合されたポリペプチド化合物が合成された後に実施されてよいと理解される。
例えば、コンジュゲートは、国際公開第０２／０７７２１８号及び国際公開第０１／５８９３５号に開示されているように実施されてもよいし、そうでなければ当該技術で公知のようにされてもよい。

一実施態様において、コンジュゲートした化学基は延長基、すなわちポリペプチドへコンジュゲートして、未修飾のポリペプチドと比較した場合に、前記ポリペプチドの循環半減期を増加させる基である。延長効果の背後にある特定の原則は、サイズを増加させ、ペプチダーゼ又は抗体により認識可能なペプチド配列を保護し、又はマクロファージ、又は肝臓等に存在するグルカン特異性レセプターにより認識されないような方法でグルカンをマスキングし、クリアランスを防止又は低減させることに起因する可能性がある。また延長基の延長効果は、例えばアルブミン等の血液成分への結合、又は脈管組織への非特異的付着に起因する可能性もある。コンジュゲートされたポリペプチドは、その生物活性を実質的に保持している。

本発明の一実施態様において、延長基は：
(ａ)一又は複数のカルボン酸、アミン類、スルホン酸、ホスホン酸、又はその組合せを含んでいてよい、低分子の有機帯電ラジカル(１５-１０００Ｄａ)、
(ｂ)場合によっては分枝状であってもよいポリエチレン鎖、又はシクロデキストリン等、低分子(１５-１０００Ｄａ)の中性の親水性分子、
(ｃ)脂肪酸又はコール酸又はその誘導体等、低分子(１５-１０００Ｄａ)の疎水性分子、
(ｄ)２０００-６００００Ｄａの平均分子量を有するポリエチレングリコール、
(ｅ)７００〜２００００Ｄａ、好ましくは７００-１００００Ｄａの範囲の正確な分子量を有するデンドリマー等、十分に定義された正確なポリマー、
(ｆ)アルブミン、抗体又はその一部等、実質的に非免疫原生のポリペプチド、例えばアルブミン断片又は抗体断片で、場合によってはＦｃ-ドメインを有していてよいもの、及び
(ｇ)デキストラン等、高分子量の有機ポリマー、
からなる群から選択される。

本発明の一実施態様において、延長基は、デンドリマー、ポリアルキレングリコール(ＰＡＧ)、例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)及びポリプロピレングリコール(ＰＰＧ)を含むポリアルキレンオキシド(ＰＡＯ)、分枝状ＰＥＧ、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)、ポリカルボキシラート、ポリ-ビニルピロリドン、ポリエチレン-コ-マレイン酸無水物、ポリスチレン-コ-マレイン酸無水物、及びカルボキシメチルデキストランを含むデキストランからなる群から選択される。本発明の一実施態様において、延長基はＰＥＧ基である。
「分枝状ポリマー」、又は交換可能に「樹枝状ポリマー」、「デンドリマー」又は「樹枝状構造」なる用語は、そのいくつかが分枝状部を含む、モノマー構成ブロックから選択されて組立られる有機ポリマーを意味する。

本発明の一実施態様において、延長基は、血清タンパク質結合-リガンド、例えばアルブミンに結合した化合物、特に脂肪酸、Ｃ５-Ｃ２４脂肪酸、脂肪族二酸(例えばＣ５-Ｃ２４)等からなる群から選択される。延長基の他の例には、生理学的状態下で電荷特性に変化する部分を有する小有機分子、例えばカルボン酸又はアミン類、又はグリカン特異的認識を防止する中性置換基、例えばより小さいアルキル置換基(例えば、Ｃ１-Ｃ５アルキル)が含まれる。本発明の一実施態様において、延長基はアルブミンである。

一実施態様において、化学基は非-ポリペプチドである。
一実施態様において、化学基はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、特に５００-１０００００、例えば１０００-７５０００、又は２０００-６００００の範囲の平均分子量を有するものである。

「ポリエチレングリコール」又は「ＰＥＧ」なる用語は、カップリング剤、結合部分又は活性化部分を伴い又は伴わず(例えば、チオール、トリフラート、トレシラート(tresylate)、アジルジン(azirdine)、オキシラン、ピリジルジチオ、ビニルスルホンを伴う、又は好ましくはマレイミド部分を伴う)ポリエチレングリコール化合物又はその誘導体を意味する。マレイミドモノメトキシＰＥＧ等の化合物は、典型的な本発明の活性化ＰＥＧ化合物である。
ＰＥＧは、デキストラン等の多糖類と比較して、架橋可能なわずかな反応基しか有していないため、適切なポリマー分子である。特に、一置換ＰＥＧ、例えばメトキシポリエチレングリコール(ｍＰＥＧ)は、カップリング化学が比較的単純である(唯一の反応基が、ポリペプチド上の付着基とコンジュゲートするのに利用される)ため、関心がある。その結果、架橋の危険性が排除され、得られたポリペプチドコンジュゲートはより均質であり、ポリマー分子とポリペプチドとの反応が、より容易に制御される。

ポリペプチドへポリマー分子を共有結合させるために、ポリマー分子のヒドロキシル末端基を活性形態、すなわち反応性官能基を有する形態で提供する。適切な活性ポリマー分子は、例えばShearwater Corp., Huntsville, Ala., USA、又はPolyMASC Pharmaceuticals plc, UKから商業的に入手可能である。また、ポリマー分子は、国際公開第９０／１３５４０号に開示されているような、当該技術で公知の従来からの方法により活性化可能である。本発明で使用するための、活性化された直鎖状又は分枝状のポリマー分子の特定の例は、Shearwater Corp. 1997及び2000カタログ(参照としてここに導入される、Functionalized Biocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals, Polyethylene Glycol and Derivatives)に開示されている。活性化されたＰＥＧポリマーの特定の例には、次の直鎖状のＰＥＧ：ＮＨＳ-ＰＥＧ(例えば、ＳＰＡ-ＰＥＧ、ＳＳＰＡ-ＰＥＧ、ＳＢＡ-ＰＥＧ、ＳＳ-ＰＥＧ、ＳＳＡ-ＰＥＧ、ＳＣ-ＰＥＧ、ＳＧ-ＰＥＧ、及びＳＣＭ-ＰＥＧ)、及びＮＯＲ-ＰＥＧ)、ＢＴＣ-ＰＥＧ、ＥＰＯＸ-ＰＥＧ、ＮＣＯ-ＰＥＧ、ＮＰＣ-ＰＥＧ、ＣＤＩ-ＰＥＧ、ＡＬＤ-ＰＥＧ、ＴＲＥＳ-ＰＥＧ、ＶＳ-ＰＥＧ、ＩＯＤＯ-ＰＥＧ、及びＭＡＬ-ＰＥＧ、及び分枝状のＰＥＧ、例えばＰＥＧ２-ＮＨＳ、及び双方とも出典明記によりここに導入される米国特許第５９３２４６２号及び米国特許第５６４３５７５号に開示されているものが含まれる。さらに、出典明記によりここに導入される次の公報：米国特許第５８２４７７８号、米国特許第５４７６６５３号、国際公開第９７／３２６０７号、欧州特許第２２９１０８号、欧州特許第４０２３７８号、米国特許第４９０２５０２号、米国特許第５２８１６９８号、米国特許第５１２２６１４号、米国特許第５２１９５６４号、国際公開第９２／１６５５５号、国際公開第９４／０４１９３号、国際公開第９４／１４７５８号、国際公開第９４／１７０３９号、国際公開第９４／１８２４７号、国際公開第９４／２８０２４号、国際公開第９５／００１６２号、国際公開第９５／１１９２４号、国際公開第９５／１３０９０号、国際公開第９５／３３４９０号、国際公開第９６／０００８０号、国際公開第９７／１８８３２号、国際公開第９８／４１５６２号、国際公開第９８／４８８３７号、国際公開第９９／３２１３４号、国際公開第９９／３２１３９号、国際公開第９９／３２１４０号、国際公開第９６／４０７９１号、国際公開第９８／３２４６６号、国際公開第９５／０６０５８号、欧州特許第４３９５０８号、国際公開第９７／０３１０６号、国際公開第９６／２１４６９号、国際公開第９５／１３３１２号、欧州特許第９２１１３１号、米国特許第５７３６６２５号、国際公開第９８／０５３６３号、欧州特許第８０９９９６号、米国特許第５６２９３８４号、国際公開第９６／４１８１３号、国際公開第９６／０７６７０号、米国特許第５４７３０３４号、米国特許第５５１６６７３号、欧州特許第６０５９６３号、米国特許第５３８２６５７号、欧州特許第５１０３５６号、欧州特許第４００４７２号、欧州特許第１８３５０３号及び欧州特許第１５４３１６号に、有用なポリマー分子及び／又はＰＥＧ化化学が開示されている。

ポリペプチドと活性化されたポリマー分子とのコンジュゲートは、任意の従来からの方法を使用して、例えば次の参照(ポリマー分子の活性化についての適切な方法が開示されているもの)：R. F. Taylor, (1991), 「Protein immobilisation. Fundamental and applications」, Marcel Dekker, N.Y.; S. S. Wong, (1992), 「Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking」, CRC Press, Boca Raton：G. T. Hermansonら, (1993), 「Immobilized Affinity Ligand Techniques」, Academic Press, N.Y.)に記載されているように実施されてよい。当業者であれば、使用される活性化法及び／又はコンジュゲート化学が、ポリペプチドの結合基(類)(さらに上述にて付与された例)、並びにポリマーの官能基(例えば、アミン、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、スルフィドリル(sulfydryl)、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホン、又はハロアセタート)に依存することを気付いているであろう。ＰＥＧ化は、ポリペプチド上の全ての有用な結合基(すなわち、ポリペプチド表面に表れた結合基)へのコンジュゲートを指向するものであってもよいし、一又は複数の特異的な結合基、例えばＮ末端アミノ基(例えば、米国特許第５９８５２６５号)を指向するものであってもよい。さらに、コンジュゲートは単一工程又は段階的方式にて達成されてよい(例えば、国際公開第９９／５５３７７号に記載)。

ＰＥＧ化は、結合するＰＥＧ分子の数、このような分子の大きさ及び形態(例えば、それらが直鎖状又は分枝状であるかどうか)に関し、最適な分子が生成されるように設計されると理解され、ポリペプチドにおいては、このような分子が結合する。使用されるポリマーの分子量は、達成される所望の効果を考慮して選択されるであろう。例えば、コンジュゲートの主要な目的が、高分子量の大きなサイズを有するコンジュゲートを達成するため(例えば、腎クリアランスを低減させるため)のものであるならば、所望の効果を得るために、一方は、一又は少数の高分子量ポリマー分子、又はより小さな分子量を有する多数のポリマー分子のいずれかを、コンジュゲートのために選択してもよい。しかしながら、好ましくは、低分子量を有するいくつかのポリマー分子が使用されるであろう。また、このことは、高度なエピトープ保護が所望されているケースでもしかりである。またこのようなケースにおいては、例えば約５０００Ｄａの分子量を有する２-８ポリマー、例えば３-６のこのようなポリマーが使用されてもよい。以下に具体例を例証するように、コンジュゲートのインビボ半減期における機能を改善することに関しては、高分子量を有する少数(例えば、１２０００-２００００のＭＷを有する１-３)のポリマー分子と比較して、低分子量を有する多数(例えば、５０００のＭｗを有する４-６)のポリマー分子を有することが有利であり得、このことは、２つのケースで、結合したポリマー分子の全分子量が同一又は類似している場合であってもしかりである。多数の小さなポリマー分子が存在していると、少なくともポリマー分子がポリペプチド表面に比較的均質に分布している場合に、例えば単一のさらに大きなポリマー分子よりも、より大きな直径又は見かけサイズを有するポリペプチドが提供されると信じられる。

さらに有利な結果が、本発明のコンジュゲートの少なくとも一の主要部分の見かけサイズ(「見かけ分子量」又は「見かけ質量」とも称される)が、少なくとも約５０ｋＤａ、例えば少なくとも約５５ｋＤａ、例えば少なくとも約６０ｋＤａ、例えば少なくとも約６６ｋＤａである場合に得られることが見出された。これは、十分に大きな見かけサイズを有するコンジュゲートにとっては、腎クリアランスが実質的に無視されるという事実の故であると考えられている。本文中において、ポリペプチドの「見かけサイズ」は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ法により測定される。

さらに、過度のポリマーコンジュゲートが、化学基(例えば、非ポリペプチド部分)がコンジュゲートしているポリペプチドの活性損失に至らしめる可能性があることが報告されている(さらに以下を参照)。この問題は、例えば官能部位に位置する結合基を除去することにより、又はポリペプチドの官能部位がコンジュゲート化の間、ブロックされるように、コンジュゲートの前に官能部位を可逆的にブロックすることにより無視できる。特に、ポリペプチドと化学基(例えば、非ポリペプチド部分)との間のコンジュゲートは、ポリペプチドの官能部位がヘルパー分子によりブロックされる条件下で実施されてよい。好ましくは、ヘルパー分子は、ポリペプチドの官能部位を特異的に認識するものである。

ポリペプチドは、コンジュゲート化を行う前に、好ましくはヘルパー分子と相互作用される。(多くの場合、混合ジスルフィドが還元される工程で使用されるものと同じヘルパー分子(例えばインヒビター)が使用されることが有利である)、このことにより、確実に、ポリペプチドの官能部位は遮断又は保護され、従って、化学基(例えば、非ポリペプチド部分)、例えばポリマーによる誘導体化に利用できなくなる。
ヘルパー分子からの溶出に続き、化学基とタンパク質とのコンジュゲートは、少なくとも部分的に保存された官能部位で回収可能である。

以下、本発明を制限するとは見なされない実施態様を列挙する。
実施態様１：
２つのポリペプチドをそれぞれのＣ末端で結合させる方法であって、
(ａ)反応基を含む化学基を結合されるポリペプチドのＣ末端に導入することで、結合されるポリペプチドのＣ末端を酵素触媒的に修飾し；
(ｂ)(ｉ)互いに、２つの化学基の反応基を反応させるか、又は
(ｉｉ)スペーサー分子の第１の反応基と第１の化学基の反応基を反応させ、スペーサー分子の第２の反応基と第２の化学基の反応基を反応させる；
ことを含む方法。

実施態様２：酵素がカルボキシペプチダーゼＹ又はその変異体又は断片であり、変異体又は断片が、タンパク質又はペプチドのＣ末端アミノ酸が種々の化学部分で置き換えられる反応を触媒する能力を保持している、実施態様１の方法。
実施態様３：酵素がカルボキシペプチダーゼＹである、実施態様２の方法。

実施態様４：
(ａ)結合されるポリペプチドのＣ末端を酵素触媒的に修飾し、それにより反応基Ｗを含む化学基を、結合される第１のポリペプチドのＣ末端に導入し、反応基Ｚを含む化学基を、結合される第２のポリペプチドのＣ末端に導入し；
(ｂ)スペーサー分子の反応基Ｙと反応基Ｚとを反応させて、化学基Ｘを形成させ、
スペーサー分子の反応基Ｖと反応基Ｗとを反応させて、化学基Ｕを形成させる；
ことを含む、実施態様１から３のいずれかの方法。
実施態様５：ＸとＵが独立して、オキシム、ヒドラゾン、フェニルヒドラゾン、セミカルバゾン、トリアゾール、イソオキサゾリジン、アミド、３-チオピロリジンジオン及びアラルキンのジラジカルからなる群から選択される、実施態様４の方法。

実施態様６：工程(ｂ)で形成された２つのポリペプチド間のスペーサーが、少なくとも一のエチレングリコールジラジカルを有する、実施態様１から５のいずれか一つの方法。
実施態様７：Ｖ、Ｗ、Ｙ及びＺが独立して、アルコキシルアミノ、アリールオキサミノ、オキソ、アジド、アルキニル、アルケニル、ハロアリール、メルカプト、Ｎ-マレイミド、及び２-(ジフェニルホスフィノ)フェノキシカルボニルからなる群から選択される、実施態様４から６のいずれか一つの方法。

実施態様８：
(ａ)結合されるポリペプチドのＣ末端を酵素触媒的に修飾し、それにより反応基Ｗを含む化学基を、結合される第１のポリペプチドのＣ末端に導入し、反応基Ｚを含む化学基を、結合される第２のポリペプチドのＣ末端に導入し；
(ｂ)反応基Ｚと反応基Ｗとを反応させて、化学基Ｔを形成させる；
ことを含む、実施態様１から３のいずれかの方法。
実施態様９：Ｔが、オキシム、ヒドラゾン、フェニルヒドラゾン、セミカルバゾン、トリアゾール、イソオキサゾリジン、アミド、３-チオピロリジンジオン及びアラルキンのジラジカルからなる群から選択される、実施態様８の方法。
実施態様１０：Ｗ及びＺが、アルコキシルアミノ、アリールオキサミノ、オキソ、アジド、アルキニル、アルケニル、ハロアリール、メルカプト、Ｎ-マレイミド、及び２-(ジフェニルホスフィノ)フェノキシカルボニルからなる群から選択される、実施態様９の方法。

実施態様１１：２つのポリペプチドが同一である、実施態様１から１０のいずれか一つの方法。
実施態様１２：２つのポリペプチドが互いに異なっている、実施態様１から１０のいずれか一つの方法。

実施態様１３：少なくとも一のポリペプチドがヒト成長ホルモンである、実施態様１から１２のいずれか一つの方法。
実施態様１４：少なくとも一のポリペプチドがヒト成長ホルモンの誘導体である、実施態様１から１３のいずれか一つの方法。
実施態様１５：少なくとも一のポリペプチドがヒト成長ホルモンの変異体又はヒト成長ホルモンの変異体の誘導体である、実施態様１から１４のいずれか一つの方法。
実施態様１６：少なくとも一のポリペプチドがｈＧＨ-Ｌｅｕ-Ａｌａである、実施態様１から１５のいずれか一つの方法。

実施態様１７：化学基ＺがリンカーＡを介して導入される、実施態様４から１６のいずれか一つの方法。
実施態様１８：リンカーＡが、直鎖状、分枝状及び／又は環状のＣ_１−１０アルカン、Ｃ_２−１０アルケン、Ｃ_２-１０アルキン、Ｃ_１−１０ヘテロアルカン、Ｃ_２−１０ヘテロアルケン、Ｃ_２−１０ヘテロアルキンのビ-ラジカルからなる群から選択され、そのいずれもオキソで置換されていてよく、ここで一又は複数の同素環芳香族化合物のビラジカル(類)又は複素環芳香族化合物のビラジカル(類)が挿入されてもよい、実施態様１７の方法。

実施態様１９：化学基ＷがリンカーＢを介して導入される、実施態様４から１８のいずれか一つの方法。
実施態様２０：リンカーＢが、オキソで置換されていてもよい、直鎖状、分枝状及び／又は環状のＣ_１−１０アルカン、Ｃ_２−１０アルケン、Ｃ_２-１０アルキン、Ｃ_１−１０ヘテロアルカン、Ｃ_２−１０ヘテロアルケン、Ｃ_２−１０ヘテロアルキンのビ-ラジカルからなる群から選択され、ここで一又は複数の同素環芳香族化合物のビラジカル(類)又は複素環芳香族化合物のビラジカル(類)が挿入されてもよい、実施態様１９の方法。

実施態様２１：リンカーＡ及びリンカーＢが独立して、次の式：

からなる群から選択される、実施態様１７から２０のいずれか一つの方法。

実施態様２２：最終生成物において、２つのポリペプチドを結合させる部分が、１,２,３-トリアゾール部分を有する、実施態様１から２１のいずれかの方法。

実施態様２３：化合物Ｎ,Ｎ'-ビス(２-(２-(２-(２-(４-((３-(Ｎ-((Ｓ)-５-(カルバモイル)-５-(ｈＧＨイルロイシニルアミノ)ペンチル)カルバモイル)ベンジルオキシ)イミノ)ブトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)オメガ−カルバモイル３．４ｋＤａＰＥＧ-カルボン酸アミド。

実施態様２４：実施態様１から２１のいずれか一つの方法により生成された化合物。
実施態様２５：実施態様１から２１のいずれか一つの方法を使用することにより得られる化合物。
実施態様２６：結合部分によりそれらのＣ末端を介して結合した２つのポリペプチドを含有するポリペプチド化合物であり、ここで結合部分が１,２,３-トリアゾール部分を有しているポリペプチド化合物。
実施態様２７：前記結合部分が、次の式：

からなる群から選択される、実施態様２６のポリペプチド化合物。
実施態様２８：結合部分によりそれらのＣ末端を介して結合した２つのポリペプチドを含有するポリペプチド化合物であり、ここで結合部分が１,２,３-トリアゾール部分を有しており、該ポリペプチド化合物が、実施態様１から２１のいずれかの方法を使用することにより得られた又は得られるポリペプチド化合物。

実施態様２９：それらのＣ末端を介して結合した２つのポリペプチドを含有するポリペプチド化合物で、実施態様１から２１のいずれか一つに記載の構造を有するポリペプチド化合物。
実施態様３０：実施態様２３から２９のいずれかの化合物と、製薬的に許容可能な担体又は賦形剤を含有する医薬組成物。
実施態様３１：患者の疾病又は疾患を処置するための、実施態様２３から２９のいずれかの化合物の使用。
実施態様３２：患者の疾病又は疾患を処置する医薬を製造するための、実施態様２３から２９のいずれかの化合物の使用。

医薬組成物
本発明の結合したポリペプチド化合物は、患者の疾病又は疾患を処置するための医薬組成物として適用される。
一実施態様において、本発明は、その範疇に、製薬的に許容可能な担体又は希釈剤と共に、活性成分として結合されたポリペプチド化合物、又はその製薬的に許容可能な塩を含有する医薬組成物を含む。

本発明の化合物は、化合物及び製薬的に許容可能な担体又は希釈剤を含有する医薬組成物に処方され得る。このような担体には、水、生理的食塩水、エタノール、ポリオール類、例えばグリセロール又はプロピレングリコール、又は植物性油が含まれる。ここで使用される場合、「製薬的に許容可能な担体」には、任意の全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗真菌剤、防腐剤、等張剤等も含まれる。任意の従来からの媒体が活性成分及びその意図する使用と不適合でない限りは、本発明の組成物におけるその使用が考慮される。

組成物は、従来からの技術により調製されてよく、従来からの形態、例えばカプセル、錠剤、溶液又は懸濁液であってよい。使用される製薬用担体は、従来からの固体状又は液状担体であってよい。固体状担体の例は、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、及びステアリン酸である。液状担体の例は、シロップ、ピーナッツ油、オリブ油及び水である。同様に、担体又は希釈液には、当該技術で公知の遅延化物質(delay material)、例えばモノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリル単独又はロウと混合したものがいつでも含まれる。また処方物は、さらに湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、防腐剤、甘味料、又は香味剤をさらに含有していてもよい。本発明の処方物は、当該技術でよく知られている手順を使用することにより、患者への投与後、活性成分の放出が迅速、持続又は遅延化される様に処方されてよい。

医薬組成物は、滅菌し、所望するならば、補助剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩、バッファー、及び／又は着色物質等で、活性化合物と有害な反応を生じないものと混合することができる。

投与経路は、作用の適切な所望する部位に活性化合物を効果的に輸送する任意の経路、例えば経口又は非経口、特に直腸、経皮、皮下、経鼻、筋肉内、局所、静脈内、尿道内、眼用の溶液又は軟膏であってよく、経口経路が好ましい。
経口投与用の固体状担体が使用される場合、調製物は、パウダー又はペレット形態の硬質ゼラチンカプセルに配されて錠剤化することもでき、トローチ又は薬用キャンデーの形態にすることもできる。固体状担体の量は広範囲で変えてもよいが、通常は約２５ｍｇ〜約１ｇである。液状担体を使用する場合、調製物は、シロップ、エマルション、軟質ゼラチンカプセル又は滅菌注入用液、例えば水性又は非水性の液状懸濁液又は溶液の形態であってよい。

経鼻投与用として、調製物は、エアゾール用途のために、液状担体、特に水性担体に溶解又は懸濁させて、式(Ｉ)の化合物を含有してよい。担体は添加剤、例えば可溶化剤、例えばプロピレングリコール、界面活性剤、吸収促進剤、例えばレシチン(ホスファチジルコリン)又はシクロデキストリン、又は防腐剤、例えばパラベンを含有していてよい。
非経口投与用として特に適切なのは、注入用溶液又は懸濁液、好ましくはポリヒドロキシル化ヒマシ油に溶解させた活性化合物を有する水溶液である。
タルク及び／又は炭水化物担体又はバインダー等を有する錠剤、糖衣錠又はカプセルが、経口投与には特に適している。錠剤、糖衣錠又はカプセル用に好ましい担体には、ラクトース、コーンスターチ、及び／又はジャガイモデンプンが含まれる。甘味ビヒクルが使用可能なケースでは、シロップ又はエリキシル剤を使用することができる。

従来からの錠剤化技術で調製され得る局所用錠剤は、
コア部：
活性化合物(遊離化合物又はその塩として) １０ｍｇ
コロイド状二酸化ケイ素(Areosil(登録商標)) １．５ｍｇ
セルロース、微結晶(Avicel(登録商標)) ７０ｍｇ
変性セルロースガム(Ac-Di-Sol(登録商標)) ７．５ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム
コーティング：
ＨＰＭＣ約９ｍｇ
＊Mywacett 9-40 T 約０．９ｍｇ
＊フィルムコーティング用の可塑剤として使用されるアシル化モノグリセリド

本発明の化合物は、種々の疾患又は疾病のこのような処置、予防、除去、緩和又は改善が必要とされている哺乳動物、特にヒトに投与され得る。このような哺乳動物には、家畜、例えば家庭用ペット、及び家畜ではない動物、例えば野生動物の双方の動物が含まれる。

通常、口、鼻、肺又は経皮投与に適した投与形態は、製薬的に許容可能な担体又は希釈液と混合して、約０．００１ｍｇ〜約１００ｍｇ、好ましくは約０．０１ｍｇ〜約５０ｍｇの式Ｉの化合物を含有する。
本化合物は、経口、直腸、又は非経口(皮下を含む)経路によろうがよるまいが、製薬的に許容可能な担体又は希釈液と同時に、一斉に、又は共に投与されてよい。本化合物は、しばしば、又は好ましくは、そのアルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩の形態をしている。
適切な投与範囲は、投与の正確な方式、投与形態、投与が指向する兆候、関連した被験者、関連した被験者の体重、及び担当の医師又は獣医の嗜好又は経験に応じて、上述したように変化する。

本発明の化合物及び／又は本発明の方法により調製された化合物は、成長ホルモンを用いて処置され得る疾患又は疾病、例えば成長ホルモン欠損症(ＧＨＤ)、特に成人におけるもの；ターナー症候群；プラダーウィリ症候群(ＰＷＳ)；ヌーナン症候群；ダウン症候群；慢性腎臓病；若年性関節リウマチ；嚢胞性線維症；子供が受けたＨＡＡＲＴ処置によるＨＩＶ感染(ＨＩＶ／ＨＡＬＳ小児)；妊娠期間に比べて小さい(ＳＧＡ)小児出生；かなりの出生時低体重(ＶＬＢＷ)を有する小児出生における低身長症；骨格形成異常；軟骨低形成症；軟骨形成不全；特発性低身長(ＩＳＳ)；脛骨、腓骨、大腿、上腕骨、橈骨、尺骨、鎖骨、中手骨、中足骨、及び指等、長骨又はその内部の骨折；頭蓋骨、手の基部、及び足の基部等、海綿様骨又はその内部の骨折；例えば手、膝又は肩等における、腱又は靱帯の手術後の患者術後処置；仮骨延長術を受けた患者の処置；腰又は円板置換、半月板修復、脊椎固定術、膝、臀部、肩、肘、手首又は顎のプロテーゼ固定術を受けた患者の術後処置；骨接合物質、例えば爪、ネジ及びプレートが固定化された患者の処置；骨折の癒着不能又は変形治癒；（例えば、脛骨又は第１つま先からの）骨切り術後の患者の処置；移植片植え込み後の患者の処置；外傷又は関節炎に起因する膝の関節軟骨変性；ターナー症候群を患っている患者の骨粗鬆症；男性における骨粗鬆症、慢性透析の成人患者(ＡＰＣＤ)の処置；慢性透析の高齢者患者の処置；ＡＰＣＤにおける循環器疾患；ＡＰＣＤにおける悪液質；ＡＰＣＤにおける癌；ＡＰＣＤにおける慢性的な閉塞性肺病；ＡＰＣＤにおけるＨＩＶ；ＡＰＣＤにおける慢性的な肝臓病；ＡＰＣＤにおける疲労症候群；クローン病；肝機能障害；ＨＩＶ感染した男性の処置；短腸症候群；中心性肥満；ＨＩＶ関連リポジストロフィ症候群(ＨＡＬＳ)：男性不妊；主として待機手術後の患者の処置；負の窒素バランスの患者の処置；アルコール／薬物解毒又は神経的トラウマ；加齢；虚弱な高齢者；骨関節炎；外傷性の損傷を受けた軟骨のある患者の処置；勃起障害；線維筋痛；記憶障害；鬱病；外傷性脳損傷；くも膜下出血；極小未熟児；メタボリックシンドローム；グルココルチコイドミオパシー；及び小児のグルココルチコイド処置による低身長症の処置に使用され得る。

本願明細書において引用される出版物、特許出願、特許を含む全ての文献は、他の場所で特定に文献が出典明示により別個に援用されているかにかかわらず、本願明細書にあたかも各文献が個々に特定に出典明示により援用されたかのように参照文献として組み込まれ、この全体がここに完全に（法律に準じる範囲で）効力を有する。

本発明で記載されて使用されている「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び類似指示対象なる用語は、ここで示され、文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、単数形及び複数形の双方をカバーすると解釈される。
特に明記しない限り、ここで提供される全ての正確な値は、対応する近似値の代表例である(例えば、特定の要因又は測定値に関して提供される全ての正確な例示的値は、適切な場合は、「約」により修飾される、対応する近似測定値を提供するとみなすことができる)。

特に明記せず、文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、成分又は成分類に関して、「含有する」、「有する」、「含む」又は「含める」等の用語を使用する、本発明の任意の側面又は実施態様のここでの記載は、特定の成分又は成分類「からなる」、「本質的になる」、又は「実施的に含有する」といった本発明の類似した側面又は実施態様を支持することを意図したものである(例えば、特定の成分を含有するここに記載の組成物は、特に明記しない又は文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、その成分からなる組成物を記載するものと理解すべきである)。
全ての表題及び副題は、ここでは便宜的にのみ使用されており、いかなる方法であっても、本発明を限定するものとは解釈されない。

ここで提供される任意の及び全ての実施例、又は例示的言語(例えば、「等」)の使用は、単に、本発明をより解明することを意図したものであり、特に示さない限りは、本発明の範囲を制限するものではない。明細書におけるいずれの言語も、本発明の実施に必須の任意の請求項に記載されていない要素を示すと解釈すべきものではない。
ここでの特許公報の引用及び導入は便宜上のものであって、このような特許公報の正当性、特許性及び／又は執行可能性についての見解を示すものではない。
この発明は、適応される法律により許容されるよう、ここに提案された態様及び／又は請求項に列挙された主題事項の全ての修正及び等価事項を含む。

本発明は、以下の実施例によりさらに例証されるが、それにより、本発明の範囲を限定するものとは解釈はされない。上述した記載及び以下の実施例に開示された特徴は、別々に、又は任意のそれらの組合せであってもよいが、その多様な形態において、本発明を実現するための構成要素である。

ＨＰＬＣ法０２-ｂ１-２：
ＲＰ-分析を、ウォーターズ(Waters)２４８７二重バンド検出器が取り付けられたアリアンス(Alliance)ウォーターズ２６９５システムを使用して実施した。２１４ｎｍ及び２５４ｎｍでのＵＶ検出を、シンメトリー(Symmetry)３００Ｃ１８、５ｕｍ、３．９ｍｍｘ１５０ｍｍカラム、４２℃を使用して収集した。流速１．０分／分で１５分以上かけて、０．０５％のトリフルオロ酢酸で緩衝させた、水に０-６０％のアセトニトリルが入った直線状勾配のもので、化合物を溶出させた。

ＨＰＬＣ法０２-ｂ４-４：
ＲＰ-分析を、ウォーターズ２４８７二重バンド検出器が取り付けられたアリアンス・ウォーターズ２６９５システムを使用して実施した。２１４ｎｍ及び２５４ｎｍでのＵＶ検出を、シンメトリー３００Ｃ１８、５ｕｍ、３．９ｍｍｘ１５０ｍｍカラム、４２℃を使用して収集した。流速１．０分／分で１５分以上かけて、０．０５％のトリフルオロ酢酸で緩衝させた、水に５-９５％のアセトニトリルが入った直線状勾配のもので、化合物を溶出させた。

ＨＰＬＣ法０３-ｂ１-１：
ＲＰ-分析を、ウォーターズ９９６ダイオードアレイ検出器が取り付けられたウォーターズ２６９０システムを使用して実施した。ＵＶ検出を、４２℃で０．５ｍｌ／分で溶出する、２１８ＴＰ５４４．６ｍｍｘ２５０ｍｍ５μ Ｃ-１８シリカカラム(The Seperations Group, Hesperia)において、２１４、２５４、２７６及び３０１ｎｍにて収集した。カラムを、０．１％のトリフルオロ酢酸で緩衝させた水を用いて平衡にした。注入後、サンプルを、５０分の間に、水にトリフルオロ酢酸が入った０．１％の水溶液において、０．１％のトリフルオロ酢酸で緩衝させた、０％〜６０％のアセトニトリルの勾配により溶出させた。

ＨＰＬＣ法０３ｂ６１：
ＨＰＬＣ(方法０３ｂ６１)：ＲＰ-分析を、ウォーターズ９９６ダイオードアレイ検出器が取り付けられたウォーターズ２６９０システムを使用して実施した。ＵＶ検出を、４２℃で０．５ｍｌ／分で溶出する、２１８ＴＰ５４４．６ｍｍｘ２５０ｍｍ５μ Ｃ-１８シリカカラム(The Seperations Group, Hesperia)において、２１４、２５４、２７６及び３０１ｎｍにて収集した。カラムを、水にＴＦＡが入った水溶液(０．１％)において５％のアセトニトリル(＋０．１％のＴＦＡ)で平衡にした。注入後、サンプルを、５０分の間に、水にＴＦＡが入った水溶液(０．１％)において、０％〜９０％のアセトニトリル(＋０．１％のＴＦＡ)の勾配により溶出させた。
ペプチドの質量スペクトルを、５００-１８００Ｄａの範囲ではアギレント(Agilent)１１００シリーズ、又は５００-２０００Ｄａの範囲ではパーキン・エルマー(Perkin Elmer)ＰＥＡＰＩ１００において得た。典型的には、ｍ／ｚについて見出されたシグナルは、ｚ＝１、２、３、４、５又は６の任意のシリーズに相当する。
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦスペクトルを、ブルカー・ダルトニックス・オートフレックス(Bruker Daltonix autoflex)において得た。

実施例１
(Ｓ)-２-(([Ｇｌｕ３,Ｌｅｕ１０]ＧＬＰ-２イル)ロイシルアミノ)-６-(３-(((１-(３-((２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(４-((４-((Ｓ)-２-(カルバモイル)-２-(([Ｇｌｕ１８０,Ａｓｐ１８２,Ｇｌｕ１８９]ｈＧＨ(１８０-１９１)イル)ロイシルアミノ)エチル)フェノキシ)メチル)１,２,３-トリアゾール-１-イル)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)フェニル)エチリデン)アミノキシ)メチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミド

工程１
[Ｇｌｕ^３,Ｌｅｕ^１０]ＧＬＰ-２イルロイシニルアラニン
[Ｇｌｕ^３,Ｌｅｕ^１０]ＧＬＰ-２イルロイシニルアラニンを、商業的に入手可能なＦｍｏｃ-Ａｌａ-Ｗａｎｇ樹脂から出発して、当業者に公知の標準的なＦｍｏｃ-方法により、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)４３３Ａペプチド合成器において調製した。次のアミノ酸誘導体を使用した：

トリフルオロ酢酸(１０ｍｌ)、水(０．２６５ｍｌ)及びトリイソプロピルシラン(０．２６５ｍｌ)の混合物を、樹脂に添加した。それを１．５時間振揺した。液体を収集した。トリフルオロ酢酸(１ｍｌ)で樹脂を洗浄した。液体を組合せた。溶液を窒素流下で濃縮した。エーテル(４０ｍｌ)を添加した。遠心分離により、沈殿物を単離した。溶離液として、０．１％のトリフルオロ酢酸バッファーにおいて、水に３７-６５％のアセトニトリル勾配のあるものを使用し、ＨＰＬＣにおける逆相Ｃ_１８-カラムにて、粗生成物を精製した。
ＨＰＬＣ：８．８１分(方法０２-Ｂ４-４)。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：ｍ／ｚ＝３９４６
ＭＳ：ｍ／ｚ＝１３１７．９８８、７９０。

工程２：
[１-カルバモイル-２-(４-ヒドロキシフェニル)エチル]-カルバミン酸-tert-ブチルエステル

０℃で、１-(３-ジメチルアミノプロピル)-３-エチルカルボジイミドヒドロクロリド(１７．０ｇ、８８．９ｍｍｏｌ)を、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(２５０ｍｌ)及びジクロロメタン(２５０ｍｌ)に、(Ｓ)-２-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-３-(４-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸(２５ｇ、８８．９ｍｍｏｌ)及び１-ヒドロキシベンゾトリアゾール(１２．０ｇ、８８．９ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。反応混合物を０℃で２０分攪拌した。水(９０ｍｌ)にアンモニアが入った２５％水溶液を添加した。反応混合物を室温で３日間攪拌した。酢酸エチル(５００ｍｌ)で希釈し、硫酸水素ナトリウムの１０％水溶液で酸性化させた。相分離させた。水相を酢酸エチル(３００ｍｌ)で抽出した。組合せた有機相を、炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液(２５０ｍｌ)と水(２５０ｍｌ)の混合物で洗浄した。それらを硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を真空で除去した。粗生成物を酢酸エチル／ヘプタンから結晶化させた。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝３０３(Ｍ＋Ｎａ)^＋。
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ_６)：δ１．３１(ｓ９Ｈ)；２．８０(ｄｄ、１Ｈ)；２．８３(ｄｄ、１Ｈ)；４．００(ｍ、１Ｈ)；６．６２(ｄ、２Ｈ)；６．７０(ｄ、１Ｈ)；６．９７(ｂｒ、１Ｈ)；７．０３(ｄ、２Ｈ)；７．３１(ｂｒ、１Ｈ)；９．１４(ｓ、１Ｈ)。

工程３：
[(Ｓ)-１-カルバモイル-２-(４-(プロプ-２-イニルオキシ)フェニル)エチル]カルバミン酸-tert-ブチルエステル

[(Ｓ)-１-カルバモイル-２-(４-ヒドロキシフェニル)エチル]-カルバミン酸-tert-ブチルエステル(１．０ｇ、３．５７ｍｍｏｌ)、テトラブチルアンモニウムヨージド(６５ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ)、炭酸カリウム(３．９４ｇ、２９ｍｍｏｌ)、臭化プロパルギル(０．３８ｍｌ、４．２８ｍｍｏｌ)及びＮ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(１５ｍｌ)の混合物を、６０℃で１６時間加熱した。それを室温まで冷却し、水(３０ｍｌ)で希釈し、硫酸水素ナトリウムの１０％水溶液で酸性化させた。混合物を酢酸エチル(２ｘ１００ｍｌ)で抽出した。組合せた有機相を、炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液(２００ｍｌ)で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を真空で除去した。溶離液として、ジクロロメタン／メタノール(１０：１)の混合物を使用し、シリカ(１００ｇ)におけるフラッシュクロマトグラフィーにより、粗生成物を精製したところ、９９８ｍｇの[(Ｓ)-１-カルバモイル-２-(４-(プロプ-２-イニルオキシ)フェニル)エチル]カルバミン酸-tert-ブチルエステルが付与された。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝３４１(Ｍ＋Ｎａ)^＋。
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ_６)δ１．３１(ｓ、９Ｈ)；２．５０(ｓ、１Ｈ)；２．６７(ｄｄ、１Ｈ)；２．９１(ｄｄ、１Ｈ)；４．０３(ｍ、１Ｈ)；４．７４(ｓ、２Ｈ)；６．７７(ｄ、１Ｈ)；６．８６(ｄ、２Ｈ)；６．９９(ｓ、１Ｈ)、７．１７(ｄ、２Ｈ)；７．３５(ｓ、１Ｈ)。

工程４：
(２Ｓ)-２-アミノ−３-(４-(プロプ-２-イニルオキシ)フェニル)プロピオンアミド

トリフルオロ酢酸(１０ｍｌ)を、ジクロロメタン(１０ｍｌ)に[(Ｓ)-１-カルバモイル-２-(４-(プロプ-２-イニルオキシ)フェニル)エチル]カルバミン酸-tert-ブチルエステル(９９８ｍｇ、３．１３ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。反応混合物を室温で１．５時間攪拌した。溶媒を蒸発させた。残留物をジクロロメタン(３０ｍｌ)に溶解させた。溶媒を除去した。後者の手順を２回繰り返したところ、１．５３ｇの(２Ｓ)-２-アミノ-３-(４-(プロプ-２-イニルオキシ)フェニル)プロピオンアミドのトリフルオロ酢酸塩が付与された。
ＨＰＬＣ(方法０２-Ｂ４-４)：Ｒ_ｆ＝５．６２分。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝２１９(Ｍ＋１)^＋。
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ_３)δ２．５１(ｓ、１Ｈ)；３．０２(ｍ、２Ｈ)；３．９０(ｍ、１Ｈ)；４．７８(ｓ、２Ｈ)；６．９５(ｄ、２Ｈ)；７．２０(ｄ、２Ｈ)；７．５６(ｓ、１Ｈ)；７．８７(ｓ、１Ｈ)；８．１０(ｂｒ、３Ｈ)。

工程５：
３-(((tert-ブトキシカルボニル)アミノキシ)メチル)安息香酸メチル

３-ブロモメチル安息香酸メチル(１０．０ｇ、４３．７ｍｍｏｌ)を、アセトニトリル(５０ｍｌ)に溶解した。tert-ブチル-Ｎ-ヒドロキシカルバマート(８．７２ｇ、６５．５ｍｍｏｌ)及び１,８-ジアザビシクロウンデセ-７-エン(ＤＢＵ、９．７９ｍｌ、６５．４８ｍｍｏｌ)を続いて添加した。反応混合物を５０℃で１６時間加熱した。それを室温まで冷却し、水(２００ｍｌ)及び濃塩酸(２５ｍｌ)で希釈した。酢酸エチル(３ｘ２００ｍｌ)で抽出した。組合せた有機相をブライン(２００ｍｌ)で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空で除去したところ、さらなる精製をすることなく使用される、１４．１５ｇの３-(((tert-ブトキシカルボニル)アミノキシ)メチル)安息香酸メチルが付与された。
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ_３)：δ１．４８(ｓ、９Ｈ)；３．９１(ｓ、３Ｈ)；４．９０(ｓ、２Ｈ)；７．４５(ｍ、２Ｈ)；７．６０(ｄ、１Ｈ)；８．００(ｄ、１Ｈ)；８．０５(ｓ、１Ｈ)。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝１８３。

工程６：
３-(((tert-ブトキシカルボニル)アミノキシ)メチル)安息香酸

粗３-(((tert-ブトキシカルボニル)アミノキシ)メチル)安息香酸メチル(１２．２８ｇ、４３．６ｍｍｏｌ)を、ジオキサン(５０ｍｌ)に溶解させた。水(５０ｍｌ)に水酸化リチウム(１．２６ｇ、５２．４ｍｍｏｌ)が入った溶液を添加した。透明な溶液が得られるまで、ジオキサンと水を添加した。室温で１６時間、反応混合物を攪拌した。水酸化ナトリウムの１Ｎ水溶液(２００ｍｌ)を添加した。tert-ブチルメチルエーテル(２ｘ２００ｍｌ)で水溶液を洗浄した。硫酸水素ナトリウムの１０％水溶液を添加することにより、水相を酸性化させた。酢酸エチル(２ｘ２００ｍｌ)で抽出した。組合せた酢酸エチル相を硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空で除去したところ、さらなる精製をすることなく次の工程で使用される、１２．２８ｇの粗３-(((tert-ブトキシカルボニル)アミノキシ)メチル)安息香酸が付与された。
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ_３)：δ１．４９(ｓ、９Ｈ)；４．９２(ｓ、２Ｈ)；７．５０(ｔ、１Ｈ)；７．６５(ｂｒ、１Ｈ)；７．６５(ｄ、１Ｈ)；８．０７(ｄ、１Ｈ)；８．１２(ｓ、１Ｈ)。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝１６９。

工程７：
２,５-ジオキソピロリジン-１イル-３-(((tert-ブトキシカルボニル)アミノキシ)メチル)ベンゾアート

２-スクシンイミド-１,１,３,３-テトラメチルウロニウム-テトラフルオロボラート(ＴＳＴＵ、１６．７１ｇ、５５．１３ｍｍｏｌ)を、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(７５ｍｌ)に粗３-(((tert-ブトキシカルボニル)アミノキシ)メチル)安息香酸(１２．２８ｇ、４５．９４ｍｍｏｌ)及びトリエチルアミン(７．６８ｍｌ、５５．１３ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。反応混合物を室温で１６時間攪拌した。それを酢酸エチル(３００ｍｌ)で希釈し、水(３ｘ１５０ｍｌ)で洗浄した。有機相を、炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液(２００ｍｌ)で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空で除去したところ、さらなる精製をすることなく使用される、１１．０４ｇの粗２,５-ジオキソピロリジン-１イル-３-(((tert-ブトキシカルボニル)アミノキシ)メチル)ベンゾアートが付与された。
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ_３)：δ１．４７(ｓ、９Ｈ)；２．９１(ｓ、４Ｈ)；４．９２(ｓ、２Ｈ)；７．２８(ｓ、１Ｈ)；７．５３(ｔ、１Ｈ)；７．７５(ｄ、１Ｈ)；８．１０(ｄ、１Ｈ)；８．１５(ｓ、１Ｈ)。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝２６５。

工程８：
((Ｓ)-５-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-５-(カルバモイル)ペンチル)カルバミン酸ベンジルエステル

２,５-ジオキソピロリジン-１-イル(Ｓ)-６-((ベンジルオキシカルボニル)アミノ)-２-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ヘキサノアート(例えばフルカ(Fluka)又はバシェム(Bachem)等、商業的に入手可能なもの、１５ｇ、３１ｍｍｏｌ)を、ジクロロメタン(５０ｍｌ)に溶解させた。水にアンモニアが入った２５％溶液を添加した。反応混合物を室温で１６時間激しく攪拌した。溶媒を真空で除去したところ、さらなる精製をすることなく次の工程に使用される、２１．２７ｇの粗((Ｓ)-５-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-５-(カルバモイル)ペンチル)カルバミン酸ベンジルエステルが生じた。
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ_６)：δ１．２-１．６(ｍ、６Ｈ)；１．３７(ｓ、９Ｈ)；２．９５(ｑ、２Ｈ)；３．８０(ｔｄ、１Ｈ)；５．００(ｓ、２Ｈ)；６．７０(ｄ、１Ｈ)；６．９０(ｓ、１Ｈ)；７．２０-７．４０(ｍ、７Ｈ)。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝２８０。

工程９：
((Ｓ)-５-アミノ-１-(カルバモイル)ペンチル)カルバミン酸-tert-ブチルエステル

粗((Ｓ)-５-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-５-(カルバモイル)ペンチル)カルバミン酸ベンジルエステル(１１．９２ｇ、３１．４１ｍｍｏｌ)を、メタノール(２５０ｍｌ)に懸濁させた。パラジウム炭(５０％湿気)１．６７ｇを添加した。圧力下で１６時間、混合物を水素化にかけた。セライトプラグを通して濾過した。溶媒を真空で除去したところ、さらなる精製をすることなく次の工程で使用される、１３．１３ｇの粗((Ｓ)-５-アミノ-１-(カルバモイル)ペンチル)カルバミン酸-tert-ブチルエステルが付与された。
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ_６)：δ１．３０-１．６０(ｍ、６Ｈ)；１．３７(ｓ、９Ｈ)；２．６５(ｔ、２Ｈ)；３．８０(ｄｔ、１Ｈ)；５．７０(ｂｒ、２Ｈ)；６．８０(ｄ、１Ｈ)；６．９５(ｓ、１Ｈ)；７．３０(ｓ、１Ｈ)。

工程１０：
Ｎ-((Ｓ)-５-アミノ-５-(カルバモイル)ペンチル)-３-(アミノオキシメチル)ベンズアミド

Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(１００ｍｌ)に、粗２,５-ジオキソピロリジン-１イル-３-(((tert-ブトキシカルボニル)アミノキシ)メチル)ベンゾアート(１１．４５ｇ、３１．４１ｍｍｏｌ)が入った溶液を、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(５０ｍｌ)に((Ｓ)-５-アミノ-１-(カルバモイル)ペンチル)カルバミン酸-tert-ブチルエステル(７．７１ｇ、３１．４１ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。エチルジイソプロピルアミン(１６．１３ｍｌ、９４．２３ｍｍｏｌ)を添加した。反応混合物を室温で１６時間攪拌した。溶媒を、７０℃にて真空で除去した。残留物をジクロロメタン(５０ｍｌ)に溶解させた。トリフルオロ酢酸(５０ｍｌ)を添加した。混合物を室温で１時間攪拌した。溶媒を真空で除去した。残留物をジクロロメタン(１００ｍｌ)に溶解させた。硫酸水素ナトリウムの１０％水溶液(５０ｍｌ)と水(２００ｍｌ)を続いて添加した。水相を、真空で約６０ｍｌまで濃縮した。この溶液を４つに分割した。それぞれを、０．１％のトリフルオロ酢酸バッファーにおいて、水にそれぞれ０-２０、０-１１、０-９又は０-２％のアセトニトリル勾配のあるものを使用し、Ｃ１８逆相カラムにおけるＨＰＬＣ-クロマトグラフィーにかけたところ、一緒にして４．３８ｇのＮ-((Ｓ)-５-アミノ-５-(カルバモイル)ペンチル)-３-(アミノオキシメチル)ベンズアミドが付与された。
ＨＰＬＣ：Ｒ_ｔ＝３．２４分(方法０２-Ｂ１-２)。
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ_６)：δ１．３５(ｍ、２Ｈ)；１．５５(ｍ、２Ｈ)；１．７５(ｍ、２Ｈ)；３．２５(ｍ、２Ｈ)；３．７２(ｍ、１Ｈ)；５．０５(ｓ、２Ｈ)；７．５４(ｍ、３Ｈ)；７．８８(ｍ、３Ｈ)；８．１２(ｂｒ、３Ｈ)；８．５５(ｔ、１Ｈ)。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝２９５。

工程１１：
６-(３-(アミノキシメチル)ベンゾイルアミノ)-２-(([Ｇｌｕ３,Ｌｅｕ１０]ＧＬＰ-２イル)ロイシルアミノ)ヘキサンアミド

ＣＰＹ(０．０９０ｍｌの水に１８Ｕ)の溶液を、１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を用いて、ｐＨ７．９３に調節された、２５０ｍＭのＨＥＰＥＳ／５ｍＭのＥＤＴＡバッファー(１．７１ｍｌ)に、[Ｇｌｕ^３,Ｌｅｕ^１０]ＧＬＰ-２イルロイシニルアラニン(７．１ｍｇ、１７９９ｎｍｏｌ)、Ｎ-((Ｓ)-５-アミノ-５-(カルバモイル)ペンチル)-３-(アミノオキシメチル)ベンズアミド(７．１ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ)及びベータ-ヒドロキシプロピルシクロデキストリン(７１ｍｇ)が入った溶液に添加した。反応混合物を室温で２．５時間放置した。水(１８ｍｌ)で希釈し、濾過し、溶離液として０．１％のトリフルオロ酢酸で緩衝させた、水に３５-６５％のアセトニロリル勾配のあるものを使用し、Ｃ_１８-逆相カラムにおけるＨＰＬＣ-精製にかけたところ、０．１１２ｍｇの６-(３-(アミノキシメチル)ベンゾイルアミノ)-２-(([Ｇｌｕ３,Ｌｅｕ１０]ＧＬＰ-２イル)ロイシルアミノ)ヘキサンアミドが付与された。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝１３８５、１０３９、８３１、６９３
ＨＰＬＣ：Ｒ_ｔ＝８．９７分(方法０２-Ｂ４-４)。

工程１２：
[Ｇｌｕ^１８０,Ａｓｐ^１８２,Ｇｌｕ^１８９]ｈＧＨ(１８０-１９１)イルロイシルアラニン
[Ｇｌｕ^１８０,Ａｓｐ^１８２,Ｇｌｕ^１８９]ｈＧＨ(１８０-１９１)イルロイシルアラニンを、商業的に入手可能なＦｍｏｃ-Ａｌａ-Ｗａｎｇ樹脂から出発して、当業者に公知の標準的なＦｍｏｃ-方法により、アプライド・バイオシステムズ４３３Ａペプチド合成器において調製した。次のアミノ酸誘導体を使用した：

トリフルオロ酢酸(１０ｍｌ)、水(０．２６５ｍｌ)及びトリイソプロピルシラン(０．２６５ｍｌ)の混合物を、樹脂に添加した。それを１．５時間振揺した。液体を収集した。トリフルオロ酢酸(１ｍｌ)で樹脂を洗浄した。液体を組合せた。溶液を窒素流下で濃縮した。エーテル(４０ｍｌ)を添加した。遠心分離により、沈殿物を単離した。溶離液として、０．１％のトリフルオロ酢酸バッファーにおいて、水に１０-４５％のアセトニトリル勾配のあるものを使用し、ＨＰＬＣにおける逆相Ｃ_１８-カラムにて、粗生成物を精製した。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝７６４、１５２３
ＨＰＬＣ：４．８４分(方法０２-Ｂ４-４)。

工程１３：
(Ｓ)-２-([Ｇｌｕ^１８０,Ａｓｐ^１８２,Ｇｌｕ^１８９]ｈＧＨ(１８０-１９１)イルロイシルアミノ)-３-(４-(プロプ-２-イニルオキシ)フェニル)プロピオンアミド

[Ｇｌｕ^１８０,Ａｓｐ^１８２,Ｇｌｕ^１８９]ｈＧＨ(１８０-１９１)イルロイシルアラニン(８ｍｇ、０．００５２５ｍｍｏｌ)及び(２Ｓ)-２-アミノ-３-(４-(プロプ-２-イニルオキシ)フェニル)プロピオンアミド(２６１ｍｇ、０．７８８ｍｍｏｌ)の溶液を、２５０ｍＭのＨＥＰＥＳ／５ｍＭのＥＤＴＡのバッファーにおいて調製し、１Ｎの水酸化ナトリウムでｐＨ７．９３に調節した。この溶液の全容量は５ｍｌであった。水(０．２６ｍｌ)にＣＰＹ(５２Ｕ)が入った溶液をそこに添加した。反応混合物を室温で２．５時間保持した。水(１５ｍｌ)で希釈し、濾過し、０．１％のトリフルオロ酢酸で緩衝させた、水に２２-５７％のアセトニトリル勾配のあるものを使用し、Ｃ_１８-逆相カラムにおいて、ＨＰＬＣ-クロマトグラフィーにより精製したところ、２．７５ｍｇの(Ｓ)-２-([Ｇｌｕ^１８０,Ａｓｐ^１８２,Ｇｌｕ^１８９]ｈＧＨ(１８０-１９１)イルロイシルアミノ)-３-(４-(プロプ-２-イニルオキシ)フェニル)プロピオンアミドが付与された。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝８２７(Ｍ^２＋)
ＨＰＬＣ：Ｒ_ｔ＝６．１０分(方法０２-Ｂ４-４)。

工程１４：
３-アセチル安息香酸-２,５-ジオキソピロリジン-１-イルエステル

Ｏ-(Ｎ-スクシンイミジル)-Ｎ,Ｎ-Ｎ',Ｎ'-tetrメチルウロニウム-テトラフルオロボラート(５．５０ｇ、１８．３ｍｍｏｌ)を、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(２５ｍｌ)に３-アセチル安息香酸(３．００ｇ、１８．３ｍｍｏｌ)及びトリエチルアミン(２．５５ｍｌ、１８．３ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。反応混合物を室温で１６時間攪拌した。水(３００ｍｌ)で希釈し、酢酸エチル(２ｘ１５０ｍｌ)で抽出した。組合せた有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を真空で除去した。酢酸エチル／ヘプタンから粗生成物を結晶化させたところ、３．２３ｇの３-アセチル安息香酸-２,５-ジオキソピロリジン-１-イルエステルが付与された。ｉｎ
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ_３)δ２．６７(ｓ、３Ｈ)；２．９４(ｓ、４Ｈ)；７．６６(ｔ、１Ｈ)；８．３２(ｍ、２Ｈ)；８．６９(ｓ、１Ｈ)。

工程１５：
３-アセチル-Ｎ-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[２-(２-アジドエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エチル]ベンズアミド

３-アセチル安息香酸-２,５-ジオキソピロリジン-１-イルエステル(２６０ｍｇ、０．９９７ｍｍｏｌ)を、ジクロロメタン(６ｍｌ)に、商業的に入手可能なＮ-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[２-(２-アジドエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エチル]アミン(フルカ、５００ｍｇ、０．９４９ｍｍｏｌ)及びエチルジイソプロピルアミン(０．３２５ｍｌ、１．９０ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。反応混合物を室温で３日間攪拌した。ジクロロメタン(３０ｍｌ)で希釈し、硫酸水素ナトリウムの１０％水溶液(３０ｍｌ)と炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液(３０ｍｌ)で逐次洗浄した。硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空で除去したところ、６０９ｍｇの３-アセチル-Ｎ-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[２-(２-アジドエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エチル]ベンズアミドが付与された。
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ_３)δ２．６７(ｓ、３Ｈ)；３．３９(ｔ、２Ｈ)；３．６５(ｍ、４２Ｈ)；７．３０(ｂｒ、１Ｈ)；７．５５(ｔ、１Ｈ)；８．０８(ｍ、２Ｈ)；８．４３(ｓ、１Ｈ)。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝６７３

工程１６：
(Ｓ)-３-(４-((１-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(４-(アセチル)ベンゾイルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)１,２,３-トリアゾール−４-イル)メトキシ)フェニル)-２-(([Ｇｌｕ^１８０,Ａｓｐ^１８２,Ｇｌｕ^１８９]ｈＧＨ(１８０-１９１)イル)ロイシルアミノ)プロピオンアミド

水(１ｍｌ)に硫酸銅(ＩＩ)五水和物(１０ｍｇ)が入った溶液を調製した。この溶液を、水(１ｍｌ)と２,６-ルチジン(０．０２５ｍｌ)にＬ-(＋)-アスコルビン酸(３６．７ｍｇ)が入った溶液に添加した。この溶液を５分放置した。その０．８３１ｍｌを、水(２．５５ｍｌ)に２％の２,６-ルチジンからなるバッファーに、(Ｓ)-２-([Ｇｌｕ^１８０,Ａｓｐ^１８２,Ｇｌｕ^１８９]ｈＧＨ(１８０-１９１)イルロイシルアミノ)-３-(４-(プロプ-２-イニルオキシ)フェニル)プロピオンアミド(２．７５ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ)及び３-アセチル-Ｎ-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[２-(２-アジドエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エチル]ベンズアミド(１１．２ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。反応混合物を室温で１６時間放置した。水(１０ｍｌ)で希釈した。(Ｓ)-３-(４-((１-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(４-(アセチル)ベンゾイルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)１,２,３-トリアゾール-４-イル)メトキシ)フェニル)-２-(([Ｇｌｕ^１８０,Ａｓｐ^１８２,Ｇｌｕ^１８９]ｈＧＨ(１８０-１９１)イル)ロイシルアミノ)プロピオンアミド(２．４４ｍｇ)を、溶離液として、０．１％のトリフルオロ酢酸で緩衝させた、水に２２-５６％のアセトニトリル勾配のあるものを使用し、Ｃ_１８-逆相カラムにおいて、ＨＰＬＣ-クロマトグラフィーにより単離した。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝１１６３、７７６、５８２。
ＨＰＬＣ：Ｒ_ｔ＝６．６６分(方法０２-Ｂ４-４)。

工程１７：
ＭＥＳ-バッファー(０．０５４ｍｌ)に、(Ｓ)-３-(４-((１-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(４-(アセチル)ベンゾイルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)１,２,３-トリアゾール-４-イル)メトキシ)フェニル)-２-(([Ｇｌｕ^１８０,Ａｓｐ^１８２,Ｇｌｕ^１８９]ｈＧＨ(１８０-１９１)イル)ロイシルアミノ)プロピオンアミド(０．６３ｍｇ、２７０ｎｍｏｌ)が入った溶液を、ｐＨ５．７に調節した。この溶液を、６-(３-(アミノキシメチル)ベンゾイルアミノ)-２-(([Ｇｌｕ３,Ｌｅｕ１０]ＧＬＰ-２イル)ロイシルアミノ)ヘキサンアミド(０．１１２ｍｇ、２７ｎｍｏｌ)に添加した。ｐＨ５．７に調節されたＭＥＳバッファー(０．０５ｍｌ)を反応混合物に添加した。反応混合物を室温で１６時間放置した。０．１％のトリフルオロ酢酸で緩衝させた、水に３５-６７％のアセトニトリル勾配のあるものを使用し、Ｃ_１８-逆相カラムにおいて、ＨＰＬＣ-クロマトグラフィーにより、(Ｓ)-２-(([Ｇｌｕ^３,Ｌｅｕ^１０]ＧＬＰ-２イル)ロイシルアミノ)-６-(３-(((１-(３-((２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(４-((４-((Ｓ)-２-(カルバモイル)-２-(([Ｇｌｕ１８０,Ａｓｐ１８２,Ｇｌｕ１８９]ｈＧＨ(１８０-１９１)イル)ロイシルアミノ)エチル)フェノキシ)メチル)１,２,３-トリアゾール-１-イル)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)フェニル)エチリデン)アミノキシ)メチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミドが単離され反応まで、−１８℃で保持した。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝７１９、８０６、９２３、１０７８、１２９３
ＨＰＬＣ：Ｒ_ｔ＝８．７２分(方法０２-Ｂ４-４)。

実施例２
(Ｓ)-２-(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギニル)グルタミル)フェニルアラニル)ロイシル)ロイシルアミノ)-６-(３-((４-((３-((２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(４-(１-((３-(((Ｓ)-５-カルバモイル-５-(((((((グルタミル)アスパルチル)アルパラギニル(arparaginyl))グルタミル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシルアミノ)ペンチル)カルバモイル)ベンジルオキシ)イミノ)エチル)ベンゾイルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)フェノキシ)メチル)１,２,３-トリアゾール-１-イル)メチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミド

工程１：
(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギニル)グルタミル)フェニルアラニル)ロイシル)ロイシル)アラニン
(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギニル)グルタミル)フェニルアラニル)ロイシル)ロイシル)アラニンを、商業的に入手可能なＦｍｏｃ-Ａｌａ-Ｗａｎｇ樹脂から出発して、当業者に公知の標準的なＦｍｏｃ-方法により、アプライド・バイオシステムズ４３３Ａペプチド合成器において調製した。次のアミノ酸誘導体を使用した：

トリフルオロ酢酸(１０．６ｍｌ)、水(０．２６５ｍｌ)及びトリイソプロピルシラン(０．２６５ｍｌ)の混合物を、樹脂に添加した。それを１．５時間振揺した。液体を収集した。トリフルオロ酢酸(１ｍｌ)で樹脂を洗浄した。液体を組合せた。溶液を窒素流下で濃縮した。エーテル(４０ｍｌ)を添加した。遠心分離により、沈殿物を単離した。溶離液として、０．１％のトリフルオロ酢酸バッファーにおいて、水に１８-３８％のアセトニトリル勾配のあるものを使用し、ＨＰＬＣにおける逆相Ｃ_１８-カラムにて、粗生成物を精製した。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝９５０
ＨＰＬＣ：Ｒ_ｔ＝１８．７９分(方法０２-Ｂ６-１)。

工程２：
(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギニル)グルタミル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシル)アラニン
(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギニル)グルタミル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシル)アラニンを、商業的に入手可能なＦｍｏｃ-Ａｌａ-Ｗａｎｇ樹脂から出発して、当業者に公知の標準的なＦｍｏｃ-方法により、アプライド・バイオシステムズ４３３Ａペプチド合成器において調製した。次のアミノ酸誘導体を使用した：

トリフルオロ酢酸(１０．６ｍｌ)、水(０．２６５ｍｌ)及びトリイソプロピルシラン(０．２６５ｍｌ)の混合物を、樹脂に添加した。それを１．５時間振揺した。液体を収集した。トリフルオロ酢酸(１ｍｌ)で樹脂を洗浄した。液体を組合せた。溶液を窒素流下で濃縮した。エーテル(４０ｍｌ)を添加した。遠心分離により、沈殿物を単離した。溶離液として、０．１％のトリフルオロ酢酸バッファーにおいて、水に２-３０％のアセトニトリル勾配のあるものを使用し、ＨＰＬＣにおける逆相Ｃ_１８-カラムにて、粗生成物を精製した。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝９８４
ＨＰＬＣ：Ｒ_ｔ＝１９．４０分(方法０３-Ｂ６-１)。

工程３：
３-(アジドメチル)安息香酸メチル

アジ化ナトリウム(５．６８ｇ、８７ｍｍｏｌ)を、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(５０ｍｌ)に３-(ブロモメチル)安息香酸メチル(５．００ｇ、２２ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。テトラブチルアンモニウムヨージド(８１ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ)を添加した。反応混合物を６０℃で１６時間加熱した。それを室温まで冷却し、水(２００ｍｌ)に付与した。この混合物を酢酸エチル(４００ｍｌ)で抽出した。有機相を水(３ｘ２００ｍｌ)で洗浄し、続いて硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空で除去したところ、さらなる精製をすることなく使用される、４．１１ｇの粗３-(アジドメチル)安息香酸メチルが付与された。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝１９２。
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ_３)：δ３．９２(ｓ、３Ｈ)；４．４０(ｓ、２Ｈ)；７．５０(ｍ、２Ｈ)；８．００(ｍ、２Ｈ)。

工程４：
３-(アジドメチル)安息香酸

水(２５ｍｌ)に水酸化リチウム(３．８１ｇ、２１．５ｍｍｏｌ)が入った溶液を、１,４-ジオキサン(２５ｍｌ)に粗３-(アジドメチル)安息香酸メチル(４．１１ｇ、２１．５ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。透明な溶液が得られるまで、水と１,４-ジオキサンを添加した。反応混合物を室温で１６時間攪拌した。水酸化ナトリウムの１Ｎ水溶液(１００ｍｌ)を添加した。tert-ブチルメチルエーテル(２ｘ２００ｍｌ)で反応混合物を洗浄した。硫酸水素ナトリウムの１０％水溶液を用いて、水相を酸性化させた。酢酸エチル(２ｘ２００ｍｌ)で抽出した。組合せた酢酸エチル相を硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空で除去したところ、さらなる精製をすることなく使用される、３．６８ｇの粗３-(アジドメチル)安息香酸が付与された。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝１５０
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ_３)：δ４．５７(ｓ、３Ｈ)；７．５５(ｍ、２Ｈ)；８．００(ｍ、２Ｈ)；１３．１０(ｂｒ、１Ｈ)。

工程５：
(Ｓ)-２-アミノ-６-(３-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミド

リンク(Rink)アミド-樹脂(ノババイオケム(Novabiochem)０１-６４-００１３、充填、０．７０ｍｍｏｌ／ｇ、０．６５２ｇ、２．７ｍｍｏｌ)を、ジクロロメタン(５０ｍｌ)で膨張させた。溶媒を除去した。Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(５０ｍｌ)にピペリジンが入った２０％溶液を添加した。混合物を室温で２０分振揺した。溶媒を除去した。樹脂をＮ-メチルピロリジノン(３ｘ５０ｍｌ)及びジクロロメタン(５ｘ５０ｍｌ)で洗浄した。Ｎ-メチルピロリジノン(１２．５ｍｌ)にＢｏｃ-Ｌｙｓ(ＦＭＯＣ)-ＯＨ(５．００ｇ、１０．７ｍｍｏｌ)が入った溶液と、１-ヒドロキシベンゾトリアゾール(１．６３ｇ、１０．７ｍｍｏｌ)の溶液を、逐次、樹脂に添加した。ジクロロメタン(２５ｍｌ)にジイソプロピルカルボジイミド(１．６７ｍｌ、１０．７ｍｍｏｌ)が入った溶液を添加した。エチルジイソプロピルアミン(１．８３ｍｌ、１０．７ｍｍｏｌ)を添加した。反応混合物を室温で２日間振揺した。液体を除去した。樹脂をＮ-メチルピロリジノン(３ｘ５０ｍｌ)及びジクロロメタン(５ｘ５０ｍｌ)で洗浄した。Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(５０ｍｌ)にピペリジンの２０％溶液を添加した。混合物を室温で２０分振揺した。溶媒を除去した。樹脂をＮ-メチルピロリジノン(３ｘ５０ｍｌ)及びジクロロメタン(５ｘ５０ｍｌ)で洗浄した。Ｎ-メチルピロリジノン(１２．５ｍｌ)及びジクロロメタン(１２．５ｍｌ)に、粗３-(アジドメチル)安息香酸(１．８９ｇ、１０．７ｍｍｏｌ)が入った溶液、続いてＮ-メチルピロリジノン(１２．５ｍｌ)に１-ヒドロキシベンゾトリアゾール(１．６３ｇ、１０．７ｍｍｏｌ)が入った溶液を添加した。ジクロロメタン(１２．５ｍｌ)にジイソプロピルカルボジイミド(１．６７ｍｌ、１０．７ｍｍｏｌ)が入った溶液を添加した。エチジイソプロピルアミン(１．８３ｍｌ、１０．７ｍｍｏｌ)を添加した。反応混合物を室温で１６時間振揺した。液体を除去した。樹脂を、Ｎ-メチルピロリジノン(３ｘ５０ｍｌ)及びジクロロメタン(５ｘ５０ｍｌ)で洗浄した。ジクロロメタン(２０ｍｌ)にトリフルオロ酢酸が入った５０％溶液を樹脂に添加した。トリイソプロピルシラン(５ｍｌ)を添加した。反応混合物を室温で１時間振揺した。液体を収集した。樹脂をジクロロメタン(３０ｍｌ)で洗浄した。これら後者の２つの液体を組合せた。溶媒を真空で除去した。０．１％のトリフルオロ酢酸を添加することにより酸性化された、水に１３-３３％のアセトニトリル勾配のあるものを使用し、Ｃ_１８-逆相カラムにおけるＨＰＬＣ-クロマトグラフィーにより、粗生成物を精製したところ、３００ｍｇの(Ｓ)-２-アミノ-６-(３-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミドのトリフルオロ酢酸塩が付与された。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝３０５
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ_６、トリフルオロ酢酸塩)：δ１．３７(ｍ、２Ｈ)；１．５５(ｍ、２Ｈ)；１．７７(ｍ、２Ｈ)；３．２８(ｍ、２Ｈ)；３．７１(ｔ、１Ｈ)；４．５３(ｓ、２Ｈ)；７．５１(ｍ、３Ｈ)；７．８４(ｍ、３Ｈ)；８．１０(ｂｒ、３Ｈ)；８．５４(ｔ、１Ｈ)。

工程６：
(Ｓ)-６-(３-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)-２-(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギニル)グルタミル)フェニルアラニル)ロイシル)ロイシルアミノ)ヘキサンアミド

水(０．５ｍｌ)にＣＰＹ(１００Ｕ)が入った溶液を、１Ｎの塩酸と１Ｎの含水水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７．９９に調節された、２５０ｍＭのＨＥＰＥＳ／５ｍＭのＥＤＴＡバッファー(４．５０ｍｌ)に、(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギニル)グルタミル)フェニルアラニル)ロイシル)ロイシル)アラニン(１４ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ)及び(Ｓ)-２-アミノ-６-(３-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミド(５２０ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。反応混合物を３０℃で１６時間放置した。水(１０ｍｌ)で希釈した。(Ｓ)-６-(３-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)-２-(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギニル)グルタミル)フェニルアラニル)ロイシル)ロイシルアミノ)ヘキサンアミド(４．６ｍｇ)を、０．１％のトリフルオロ酢酸で緩衝させた、水に０-５０％のアセトニロリル勾配のあるものを使用し、Ｃ_１８-カラムにおける逆ＨＰＬＣ-クロマトグラフィーにより単離した。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝１１６６
ＨＰＬＣ：Ｒ_ｔ＝３３．３９分(方法０３-Ｂ１-１)。

工程７：
(Ｓ)-６-(３-(アミノキシメチル)ベンゾイルアミノ)-２-(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギニル)グルタミル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシルアミノ)ヘキサンアミド

水(０．４００ｍｌ)にＣＰＹ(８０Ｕ)が入った溶液を、１Ｎの塩酸と１Ｎの含水水酸化ナトリウムを用いてｐＨ８．２４に調節された、２５０ｍＭのＨＥＰＥＳ／５ｍＭのＥＤＴＡバッファー(７．１０ｍｌ)に、(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギニル)グルタミル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシル)アラニン(２５ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ)及びＮ-((Ｓ)-５-アミノ-５-(カルバモイル)ペンチル)-３-(アミノオキシメチル)ベンズアミド(９７９ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。反応混合物を３０℃で２時間放置した。水(１０ｍｌ)で希釈した。(Ｓ)-６-(３-(アミノキシメチル)ベンゾイルアミノ)-２-(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギニル)グルタミル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシルアミノ)ヘキサンアミド(２．８９ｍｇ)を、０．１％のトリフルオロ酢酸で緩衝させた、水に０-４０％のアセトニロリル勾配のあるものを使用し、逆ＨＰＬＣ-クロマトグラフィーＣ_１８-カラムにより単離した。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝１１８９
ＨＰＬＣ：Ｒ_ｔ＝２０．２０分(方法０３-Ｂ６-１)。

工程８
３-(プロプ-２-イニルオキシ)安息香酸エチルエステル

３-ブロモプロプ-１-イン(４．４９ｍｌ、５０．５ｍｍｏｌ)を、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミドに炭酸カリウム(４６．５８ｇ、３３６ｍｍｏｌ)及び３-ヒドロキシ安息香酸エチル(７ｇ、４２ｍｍｏｌ)の混合物が入ったものに添加した。混合物を６０℃で１５分加熱した。テトラブチルアンモニウムヨージド(０．７８ｇ、２．１ｍｍｏｌ)を添加した。混合物を６０℃で１６時間加熱し、室温まで冷却した。硫酸水素ナトリウムの１０％水溶液(１ｌ)で酸性化させ、酢酸エチル(２ｘ１５０ｍｌ)で抽出した。組合せた有機相を炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液(３００ｍｌ)で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を真空で除去した。溶離液として、酢酸エチル／ヘプタンの１：４混合物を使用し、シリカ(１２０ｇ)におけるフラッシュ-クロマトグラフィーにより、粗生成物を精製したところ、７．３ｇの３-(プロプ-２-イニルオキシ)安息香酸エチルエステルが付与された。
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ_３)δ１．４０(ｔ、３Ｈ)；２．５５(ｓ１Ｈ)；４．４０(ｑ、２Ｈ)；４．７５(ｓ、２Ｈ)；７．１７(ｄ、１Ｈ)；７．３７(ｔ、１Ｈ)；７．６６(ｓ、１Ｈ)；７．７０(ｄ、１Ｈ)。

工程９
３-(プロプ-２-イニルオキシ)安息香酸

水(２５ｍｌ)に水酸化リチウム(１．６５ｇ、３９．４ｍｍｏｌ)が入った溶液を、ジオキサン(２５ｍｌ)に３-(プロプ-２-イニルオキシ)安息香酸エチルエステル(７．３０ｇ、３５．８ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。透明な溶液が得られるまで、水とジオキサンを添加した。反応混合物を室温で１６時間攪拌した。水酸化ナトリウムの１Ｎ水溶液(５０ｍｌ)を添加した。この混合物をtert-ブチルメチルエーテル(２ｘ１２０ｍｌ)で洗浄した。硫酸水素ナトリウムの１０％水溶液を用いて、水相をｐＨ２に酸性化させた。酢酸エチル(２ｘ２００ｍｌ)で抽出した。組合せた酢酸エチル相を硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空で除去したところ、５．９ｇの３-(プロプ-２-イニルオキシ)安息香酸が付与された。
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ_３)δ２．５５(ｓ、１Ｈ)；４．７７(ｓ、２Ｈ)；７．２５(ｄ、１Ｈ)；７．４２(ｔ、１Ｈ)；７．７１(ｓ、１Ｈ)；７．７７(ｄ、１Ｈ)。

工程１０
３-プロプ-２-イニルオキシ-安息香酸-２,５-ジオキソピロリジン-１-イルエステル

２-スクシンイミド-１,１,３,３-テトラメチルウロニウム-テトラフルオロボラート(ＴＳＴＵ、４．７５ｇ、１５．６７ｍｍｏｌ)を、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミドに３-(プロプ-２-イニルオキシ)安息香酸(２．３０ｇ、１３．０６ｍｍｏｌ)及びトリエチルアミン(２．１８ｍｌ、１５．６７ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。反応混合物を室温で１６時間攪拌した。酢酸エチル(５００ｍｌ)で希釈し、水(３ｘ２００ｍｌ)及び炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液(２００ｍｌ)で洗浄した。硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空で除去したところ、３．２２ｇの３-プロプ-２-イニルオキシ-安息香酸-２,５-ジオキソピロリジン-１-イルエステルが付与された。
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ_３)δ２．５５ｓ、１Ｈ；２．９１(ｓ、４Ｈ)；４．７５(ｓ、２Ｈ)；７．３０(ｄ、１Ｈ)；７．４５(ｔ、１Ｈ)；７．７０(ｓ、１Ｈ)；７．８０(ｄ、１Ｈ)。
ＭＳ；ｍ／ｚ＝２９７(Ｍ＋Ｎａ)^＋

工程１１
Ｎ-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)-３-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンゼンアミド

２-{２-[２-(２-{２-[２-(２-{２-[２-(２-アミノエトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]エトキシ}エチル)カルバミン酸-tert-ブチルエステル(フルカから商業的に入手可能、１．０ｇ、１．５５ｍｍｏｌ)及びエチルジイソプロピルアミン(０．８８ｍｌ、５．２ｍｍｏｌ)を、ジクロロメタン(３０ｍｌ)に３-プロプ-２-イニルオキシ-安息香酸-２,５-ジオキソピロリジン-１-イルエステル(４７０ｍｇ、１．７２ｍｍｏｌ)が入った溶液に、逐次添加した。反応混合物を室温で１６時間攪拌した。溶媒を真空で除去した。残留物をジクロロメタン(５０ｍｌ)に溶解させ、炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液(２０ｍｌ)で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空で除去した。
アンバーリスト(Amberlyst)１５(０．５ｇ)をジクロロメタン(１０ｍｌ)に溶解させた。エタノール(１ｍｌ)を添加した。混合物を穏やかに１０分攪拌した。濾過により溶媒を除去した。樹脂をジクロロメタン(１０ｍｌ)で洗浄した。
反応混合物からの粗生成物を、ジクロロメタン(１０ｍｌ)とエタノール(１ｍｌ)に溶解させた。アンバーリスト１５樹脂を添加した。混合物を穏やかに３０分攪拌した。濾過により樹脂を除去した。真空にて、濾液から溶媒を除去したところ、１．２１ｇのＮ-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)-３-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンゼンアミドが付与された。

工程１２
Ｎ-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-アミノエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)-３-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンゼンアミド

トリフルオロ酢酸(１０ｍｌ)を、ジクロロメタン(１０ｍｌ)にＮ-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)-３-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンゼンアミド(１．０１ｇ、１．４１ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。反応混合物を室温で０．５時間攪拌した。溶媒を真空で除去したところ、１．５９ｇのＮ-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-アミノエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)-３-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンゼンアミドが付与された。

工程１３
４-アセチル安息香酸-２,５-ジオキソピロリジン-１-イルエステル

２-スクシンイミド-１,１,３,３-テトラメチルウロニウム-テトラフルオロボラート(ＴＳＴＵ、１８．５ｇ、６０．９ｍｍｏｌ)を、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(５０ｍｌ)に、４-アセチル安息香酸(１０．０ｇ、６０．９ｍｍｏｌ)及びトリエチルアミン(８．４９ｍｌ、６０．９ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。反応混合物を室温で２時間攪拌した。酢酸エチル(４００ｍｌ)で希釈し、水(３ｘ２００ｍｌ)で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空で除去したところ、１３．３８ｇの４-アセチル安息香酸-２,５-ジオキソピロリジン-１-イルエステルが付与された。
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ_３)：δ２．６７(ｓ、３Ｈ)；２．９３(ｓ、４Ｈ)；８．０５(ｄ、２Ｈ)；８．２０(ｄ、２Ｈ)。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝２８４(Ｍ＋Ｎａ)^＋

工程１４
Ｎ-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(４-アセチルベンゾイルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)-３-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンゼンアミド

４-アセチル安息香酸-２,５-ジオキソピロリジン-１-イルエステル(１１８ｍｇ、０．４５３ｍｍｏｌ)及びエチルジイソプロピルアミン(１．０６ｍｌ、６．１７ｍｍｏｌ)を、ジクロロメタン(１０ｍｌ)に粗Ｎ-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-アミノエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)-３-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンゼンアミドが入った溶液に、逐次添加した。反応混合物を室温で１６時間攪拌した。ジクロロメタン(２０ｍｌ)で希釈し、続いて、硫酸水素ナトリウムの１０％水溶液(５０ｍｌ)及び炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液(５０ｍｌ)で洗浄した。溶媒を真空で除去したところ、２９０ｍｇの粗Ｎ-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(４-アセチルベンゾイルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)-３-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンゼンアミドが付与された。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝７６１、３８１(Ｍ^２＋)。

工程１５
(Ｓ)-６-(３-((４-((３-((２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(４-(アセチル)ベンゾイルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)フェノキシ)メチル)１,２,３-トリアゾール-１-イル)メチル)ベンゾイルアミノ)-２-(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギニル)グルタミル)フェニルアラニル)ロイシル)ロイシルアミノ)ヘキサンアミド

水(１０．９７ｍｌ)に硫酸銅(ＩＩ)五水和物(４９．３ｍｇ)が入った溶液を、水(１０．７５ｍｌ)と２,６-ルチジン(０．２１９ｍｌ)の混合物にアスコルビン酸(１７３．８１ｍｇ)が入った溶液に添加した。混合物を室温で５分保持した。この溶液から２．２０ｍｌを、水(１．７３ｍｌ)及び２,６-ルチジン(０．０２ｍｌ)の混合物に、(Ｓ)-６-(３-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)-２-(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギニル)グルタミル)フェニルアラニル)ロイシル)ロイシルアミノ)ヘキサンアミド(２．３ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ)及び粗Ｎ-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(４-アセチルベンゾイルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)-３-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンゼンアミド(１５ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。反応混合物を室温で１６時間、穏やかに振揺した。水(１２ｍｌ)で希釈した。(Ｓ)-６-(３-((４-((３-((２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(４-(アセチル)ベンゾイルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)フェノキシ)メチル)１,２,３-トリアゾール-１-イル)メチル)ベンゾイルアミノ)-２-(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギニル)グルタミル)フェニルアラニル)ロイシル)ロイシルアミノ)ヘキサンアミド(０．７８ｍｇ)を、溶離液として、０．１％のトリフルオロ酢酸で緩衝させた、水に１０-５０％のアセトニトリル勾配のあるものを使用し、Ｃ_１８-カラムにおける逆相ＨＰＬＣにより単離した。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝９６３(Ｍ^２＋)
ＨＰＬＣ：Ｒ_ｔ＝２６．４７(方法０３-Ｂ６-１)。

工程１６
(Ｓ)-６-(３-((４-((３-((２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(４-(アセチル)ベンゾイルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)フェノキシ)メチル)１,２,３-トリアゾール-１-イル)メチル)ベンゾイルアミノ)-２-(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギニル)グルタミル)フェニルアラニル)ロイシル)ロイシルアミノ)ヘキサンアミド(０．７８ｍｇ、４０５ｎｍｏｌ)を、水(０．４０ｍｌ)及びエチルジイソプロピルアミン(０．００１ｍｌ)に溶解させた。この溶液を、水(０．４０ｍｌ)及びエチルジイソプロピルアミン(０．００２ｍｌ)に、(Ｓ)-６-(３-(アミノキシメチル)ベンゾイルアミノ)-２-(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギニル)グルタミル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシルアミノ)ヘキサンアミド(１．２ｍｇ、１０１２ｎｍｏｌ)が入った溶液に添加した。ｐＨ４．３が得られるまで、酢酸を添加した。エチルジイソプロピルアミン(０．００５ｍｌ)及び水酸化ナトリウム(０．０１５ｍｌ)の４Ｍ水溶液を添加し、ｐＨ１０．７４を得た。反応混合物を３０℃で１．５時間、穏やかに振揺した。水(２．５ｍｌ)を添加した。さらに０．５時間後、(Ｓ)-２-(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギニル)グルタミル)フェニルアラニル)ロイシル)ロイシルアミノ)-６-(３-((４-((３-((２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(４-(１-((３-(((Ｓ)-５-カルバモイル−５-(((((((グルタミル)アスパルチル)アルパラギニル)グルタミル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシルアミノ)ペンチル)カルバモイル)ベンジルオキシ)イミノ)エチル)ベンゾイルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)フェノキシ)メチル)１,２,３-トリアゾール-１-イル)メチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミド(０．３ｍｇ)を、溶離液として、０．１％のＴＦＡで緩衝させた、水に２５-６５％のアセトニトリル勾配のあるものを使用し、Ｃ_１８-カラムにおける逆相ＨＰＬＣにより単離した。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝１０３３(Ｍ^３＋)、７７５(Ｍ^４＋)
ＨＰＬＣ：Ｒ_ｔ＝２８．１２(方法０３-Ｂ６-１)。

実施例３
(Ｓ)-２-アミノ-６-(３-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミドの代替生成法

工程１：
ピロリジン-２,５-ジオン-１-イル-３-(アジドメチル)ベノゾイック(benozoic)エステル

２-スクシンイミド-１,１,３,３-テトラメチルウロニウム-テトラフルオロボラート(ＴＳＴＵ、３２．５２ｇ、１０７ｍｍｏｌ)を、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(５０ｍｌ)に３-(アジドメチル)安息香酸(１９．０１ｇ、１０７ｍｍｏｌ)及びトリエチルアミン(１４．９６ｍｌ、１０７ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。反応混合物を室温で１６時間攪拌した。酢酸エチル(２５０ｍｌ)で希釈し、水(３ｘ１２０ｍｌ)で洗浄した。有機相を、炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液(１５０ｍｌ)で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空で除去したところ、２５．２２ｇのピロリジン-２,５-ジオン-１-イル-３-(アジドメチル)ベノゾイックエステルが付与された。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ_３)δ２．９２(ｍ、４Ｈ)；４,４５(ｓ、２Ｈ)；７．５５(ｔ、１Ｈ)、７．６５(ｄ、２Ｈ)；８．１０(ｍ、２Ｈ)。

工程２：
(Ｓ)-６-(３-(アミノメチル)ベンゾイルアミノ)２-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサンアミド

粗(Ｓ)-５-アミノ-１-(カルバモイル)ペンチル)カルバミン酸-tert-ブチルエステル(１０．２６ｇ、４１．８２ｍｍｏｌ)を、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(１５０ｍｌ)に溶解させた。ピロリジン-２,５-ジオン-１-イル-３-(アジドメチル)ベノゾイックエステル(１１．４７ｇ、４１．８２２ｍｍｏｌ)及びエチルジイソプロピルアミン(２１．４８ｍｌ、１２５．５ｍｍｏｌ)を、逐次添加した。反応混合物を室温で１６時間攪拌した。酢酸エチル(５００ｍｌ)で希釈し、まず硫酸水素ナトリウムの１０％水溶液(２００ｍｌ)、水(３ｘ２５０ｍｌ)及び炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液(２００ｍｌ)で洗浄した。硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空で除去したところ、６．０５ｇの(Ｓ)-６-(３-(アミノメチル)ベンゾイルアミノ)２-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサンアミドが付与された。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ_３)δ１．４０(ｓ、９Ｈ)；１．６３(ｍ、４Ｈ)；１．８３(ｍ、２Ｈ)；３．４３(ｑ、２Ｈ)；４．１５(ｍ、１Ｈ)；４．３７(ｓ、２Ｈ)；５．５６(ｄ、１Ｈ)；６．０８(ｓ、１Ｈ)；６．７５(ｓ、１Ｈ)；７．００(ｓ、１Ｈ)；７．４３(ｍ、２Ｈ)；７．７７(ｍ、２Ｈ)。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝４２７(Ｍ＋Ｎａ)^＋、３０５(Ｍ−Ｂｏｃ)^＋。

工程３：
ガス状の塩化水素を、酢酸エチル(７５ｍｌ)に(Ｓ)-６-(３-(アミノメチル)ベンゾイルアミノ)２-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサンアミド(６．０５ｇ、１４．９６ｍｍｏｌ)の懸濁液を通して、２回、それぞれ１５分バブリングした。溶媒を真空で除去した。粗生成物を、０．１％のトリフルオロ酢酸で緩衝された、水に８-２８％のアセトニトリル勾配のあるものを使用し、Ｃ１８-逆相カラムにおいて、ＨＰＬＣ-クロマトグラフィーを９回実施することにより精製したところ、５．０３ｇの(Ｓ)-２-アミノ-６-(３-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミドのトリフルオロ酢酸が、共に付与された。ＨＰＬＣ：６．５３分(方法０２-ｂ１-２)。
１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ_６)δ１．３６(ｍ、２Ｈ)；１．５５(ｍ、２Ｈ)；１．７５(ｍ、２Ｈ)；３．２６(ｑ、２Ｈ)；３．７０(ｍ、１Ｈ)；４．５３(ｓ、２Ｈ)；７．５２(ｍ、３Ｈ)；７．８４(ｍ、３Ｈ)；８．０６(ｂｒ、３Ｈ)；８．５４(ｔ、１Ｈ)。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝３０５(Ｍ＋１)^＋

実施例４
(Ｓ)-２-(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギル)グルタミル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシルアミノ)-６-(３-((４-((３-((２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(((３-(((Ｓ)-５-(カルバモイル)-５-(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギル)グルタミル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシルアミノ)ペンチル)カルバモイル)ベンジルオキシ)イミノ)アセチルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)フェノキシ)メチル)-１,２,３-トリアゾール-１-イル)メチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミド

工程１
(Ｓ)-６-(３-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)-２-(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギル)グルタミル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシルアミノ)ヘキサンアミド

水(０．５０ｍｌ)にＣＰＹ(１００Ｕ)が入った溶液を、１Ｎの塩酸と水酸化ナトリウムの４Ｍ水溶液を用いてｐＨ７．９４に調節された、２５０ｍＭのＨＥＰＥＳ／５ｍＭのＥＤＴＡ溶液(７．２０ｍｌ)に、(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギニル)グルタミル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシル)アラニン(２５ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ)及び(Ｓ)-２-アミノ-６-(３-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミド(５２３ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。反応混合物を３０℃で１日保持した。水(１０ｍｌ)で希釈した。(Ｓ)-６-(３-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)-２-(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギル)グルタミル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシルアミノ)ヘキサンアミド(５．５７ｍｇ)を、溶離液として、０．１％のトリフルオロ酢酸で緩衝させた、水に５-５０％のアセトニロリル勾配のあるものを使用し、Ｃ_１８-カラムにおける逆相ＨＰＬＣ-クロマトグラフィーにより単離した。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝１２００
ＨＰＬＣ：Ｒ_ｔ＝２５．４０分(方法０３-Ｂ６-１)。

工程２：
(Ｓ)-３-tert-ブトキシ-２-tert-ブトキシカルボニルアミノプロピオン酸-２,５-ジオキソ-ピロリジン-１-イルエステル

２-スクシンイミド-１,１,３,３-テトラメチルウロニウム-テトラフルオロボラート(ＴＳＴＵ、５．８０ｇ、１９．１３ｍｍｏｌ)を、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミドに(Ｓ)-３-tert-ブトキシ-２-tert-ブトキシカルボニルアミノプロピオン酸(５．００ｇ、１９．１３ｍｍｏｌ)及びトリエチルアミン(２．６７ｍｌ、１９．１３ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。反応混合物を室温で１６時間攪拌した。酢酸エチル(１００ｍｌ)で希釈し、水(３ｘ５０ｍｌ)及び炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液(１５０ｍｌ)で洗浄した。それを硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空で除去したところ、５．９３ｇの(Ｓ)-３-tert-ブトキシ-２-tert-ブトキシカルボニルアミノプロピオン酸-２,５-ジオキソ-ピロリジン-１-イルエステルが付与された。
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ_３)δ１．２０(ｓ、９Ｈ)；１．４６(ｓ、９Ｈ)；２．８３(ｓ、４Ｈ)；３．６６(broadｄ、１Ｈ)、３．９３(broadｄ、１Ｈ)；４．７９(broadｄ、１Ｈ)；５．４２(broadｄ、１Ｈ)。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝３８１(Ｍ＋Ｎａ)^＋、２０４(Ｍ−Ｂｏｃ)^＋。

工程３：
Ｎ-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-((Ｓ)-３-tert-ブトキシ-２-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)プロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)-３-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンゼンアミド

(Ｓ)-３-tert-ブトキシ-２-tert-ブトキシカルボニルアミノプロピオン酸-２,５-ジオキソ-ピロリジン-１-イルエステル(１３８ｍｇ、０．３８４ｍｍｏｌ)及びエチルジイソプロピルアミン(０．９９ｍｌ、５．７６ｍｍｏｌ)を、Ｎ-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-アミノエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)-３-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンゼンアミド(２８０ｍｇ、０．３８４ｍｍｏｌ)のトリフルオロ酢酸塩の水溶液に、逐次添加した。反応混合物を室温で３日間攪拌した。ジクロロメタン(２０ｍｌ)で希釈し、硫酸水素ナトリウムの１０％水溶液及び炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液で、逐次洗浄した。溶媒を真空で除去したところ、３００ｍｇのＮ-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-((Ｓ)-３-tert-ブトキシ-２-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)プロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)-３-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンゼンアミドが付与された。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝８５８。

工程４：
Ｎ-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-((Ｓ)-２-アミノ-３-ヒドロキシプロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)-３-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンゼンアミド

トリフルオロ酢酸(１０ｍｌ)を、ジクロロメタン(１０ｍｌ)にＮ-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-((Ｓ)-３-tert-ブトキシ-２-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)プロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)-３-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンゼンアミド(３００ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。反応混合物を３０分攪拌した。溶媒を真空で除去した。残留物を真空で乾燥させたところ、３９０ｍｇのＮ-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-((Ｓ)-２-アミノ-３-ヒドロキシプロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)-３-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンゼンアミドのトリフルオロ酢酸塩が付与された。

工程５：
(Ｓ)-６-(３-((４-((３-((２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-((Ｓ)-２-アミノ-３-ヒドロキシプロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)フェノキシ)メチル)１,２,３-トリアゾール-１-イル)メチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミド

水(５．４９ｍｌ)に硫酸銅(ＩＩ)五水和物(２４．７ｍｇ)が入った溶液を、水(５．３８ｍｌ)と２,６-ルチジン(０．１１ｍｌ)の混合物にアスコルビン酸(８７ｍｇ)が入った溶液に添加した。溶液を室温で５分放置した。この溶液から５．２ｍｌを、水(３．４６ｍｌ)及び２,６-ルチジン(０．０４０ｍｌ)の混合物に、(Ｓ)-６-(３-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)-２-(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギル)グルタミル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシルアミノ)ヘキサンアミド(５．５７ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ)及びＮ-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-((Ｓ)-２-アミノ-３-ヒドロキシプロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)-３-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンゼンアミド(７６ｍｇ、０．０９３ｍｍｏｌ)のトリフルオロ酢酸塩が入った溶液に付加した。反応混合物を室温で１６時間放置した。水(１０ｍｌ)で希釈した。(Ｓ)-６-(３-((４-((３-((２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-((Ｓ)-２-アミノ-３-ヒドロキシプロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)フェノキシ)メチル)１,２,３-トリアゾール-１-イル)メチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミド(２．８９ｍｇ)を、溶離液として、０．１％のトリフルオロ酢酸で緩衝させた、水に２０-４０％のアセトニトリル勾配のあるものを使用し、Ｃ_１８-カラムにおける逆相ＨＰＬＣ-クロマトグラフィーにより単離した。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝９５１(Ｍ^２＋)。
ＨＰＬＣ：Ｒ_ｔ＝２３．４９分(方法０３-Ｂ６-１)。

工程６：
(Ｓ)-６-(３-((４-((３-((２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-((Ｓ)-２-アミノ-３-ヒドロキシプロピオニルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)フェノキシ)メチル)１,２,３-トリアゾール-１-イル)メチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミド(２．８９ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ)を、水(０．２００ｍｌ)とトリエタノールアミン(０．０００４ｍｌ)の混合物に溶解させた。水(０．０１１ｍｌ)に２-ヒドロキシエチルメチルスルフィド(０．００２４ｍｌ)が入った溶液を添加した。水(０．０２０ｍｌ)に過ヨウ素酸ナトリウム(２．４ｍｇ)が入った溶液を添加した。反応混合物を室温で３０分放置した。この溶液を、水(０．６００ｍｌ)、トリエタノールアミン(０．００１２ｍｌ)、及びエチルジイソプロピルアミン(０．００２ｍｌ)の混合物に、(Ｓ)-６-(３-(アミノキシメチル)ベンゾイルアミノ)-２-(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギニル)グルタミル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシルアミノ)ヘキサンアミド(２．８６ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。酢酸(０．００４ｍｌ)を添加した。沈殿物が生じた。ｐＨ７．０７が得られるまで、４Ｍの含水水酸化ナトリウム(０．０２０ｍｌ)を添加した。この溶液を室温で１６時間放置した。水(５ｍｌ)で希釈した。(Ｓ)-２-(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギル)グルタミル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシルアミノ)-６-(３-((４-((３-((２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(２-(((３-(((Ｓ)-５-(カルバモイル)-５-(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギル)グルタミル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシルアミノ)ペンチル)カルバモイル)ベンジルオキシ)イミノ)アセチルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)カルバモイル)フェノキシ)メチル)-１,２,３-トリアゾール-１-イル)メチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミド(０．８３ｍｇ)を、溶離液として、０．１％のトリフルオロ酢酸で緩衝させた、水に２０-４５％のアセトニトリル勾配のあるものを使用し、Ｃ１８-カラムにおける逆相ＨＰＬＣにより単離した。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝１０１５(Ｍ^３＋)。
ＨＰＬＣ：Ｒ_ｔ＝２６．７３分(方法０３-Ｂ６-１)。

実施例５
(Ｓ)-２-(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギル)グルタミル)フェニルアラニル)ロイシル)アミノ)-６-(３-((４-((４-(((Ｓ)-５-カルバモイル-５-(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギル)グルタミル)フェニルアラニル)ロイシル)アミノ)ペンチル)カルバモイル)フェノキシ)メチル)１,２,３-トリアゾール-１-イル)メチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミド

工程１：
４-(プロプ-２-イニルオキシ)安息香酸メチルエステル

臭化プロパルギル(１５．０ｍｌ、１６４ｍｍｏｌ)を、アセトン(５００ｍｌ)に、商業的に入手可能な４-ヒドロキシ安息香酸メチル(２０ｇ、１３１ｍｍｏｌ)及び炭酸カリウム(３６．３ｇ、２６３ｍｍｏｌ)の混合物が入ったものに添加した。混合物を室温で２日間攪拌した。濾過により固形物を除去した。溶媒を濾液から除去したところ、さらなる精製をすることなく次の工程で使用される、２５．１ｇの粗４-(プロプ-２-イニルオキシ)安息香酸メチルエステルが付与された。
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ_３)：δ２．５５(ｔ、１Ｈ)；３．８９(ｓ、３Ｈ)；４．７５(ｄ、２Ｈ)；７．００(ｄ、２Ｈ)；８．０１(ｄ、２Ｈ)。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝１９１(Ｍ＋１)^＋。

工程２：
４-(プロプ-２-イニルオキシ)安息香酸

４-(プロプ-２-イニルオキシ)安息香酸メチルエステル(１０ｇ、５２．６ｍｍｏｌ)をエタノール(１５０ｍｌ)に溶解させた。水に水酸化ナトリウムが入った１Ｎ溶液(６０ｍｌ、６０ｍｍｏｌ)を添加した。反応混合物を室温で１６時間攪拌した。溶媒を真空で除去した。残留物を酢酸エチル(１００ｍｌ)とクエン酸の５％水溶液(１００ｍｌ)の混合物に溶解させた。相分離させた。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を真空で除去したところ、さらなる精製をすることなく次の工程で使用される、９．４ｇの４-(プロプ-２-イニルオキシ)安息香酸が付与された。
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ_６)：δ２．５１(ｔ、１Ｈ)；４．８９(ｄ、２Ｈ)；７．０８(ｄ、２Ｈ)；７．８１(ｄ、２Ｈ)。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝１７７(Ｍ＋１)^＋

工程３：
Ｎ-((Ｓ)-５-アミノ-５-カルバモイルペンチル)-４-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンズアミド

Ｆｍｏｃ-保護されたリンク-樹脂(ノババイオケムから商業的に入手可能、充填、０．７０ｍｍｏｌ／ｇ、３．８１ｇ、２．６６ｍｍｏｌ)を、ジクロロメタン(１００ｍｌ)で洗浄した。Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(１００ｍｌ)にピペリジンが入った２０％溶液を添加した。反応器を室温で２０分振揺した。液体を除去した。Ｎ-メチルピロリジノン(３ｘ１００ｍｌ)及びジクロロメタン(５ｘ１００ｍｌ)を用いて、樹脂を洗浄した。Ｎ-メチルピロリジノン(４０ｍｌ)にＢｏｃ-Ｌｙｓ(Ｆｍｏｃ)-ＯＨ(５．０ｇ、１０．６７ｍｍｏｌ)が入った溶液を添加した。Ｎ-メチルピロリジノン(１０ｍｌ)に１-ヒドロキシベンゾトリアゾール(１．６３ｇ、１０．６７ｍｍｏｌ)が入った溶液を添加した。ジクロロメタン(２５ｍｌ)にジイソプロピルカルボジイミド(１．６７ｍｌ、１０．６７ｍｍｏｌ)が入った溶液、及びエチルジイソプロピルアミン(１．８３ｍｌ、１０．６７ｍｍｏｌ)の溶液を、逐次添加した。反応器を室温で１６時間振揺した。液体を除去した。Ｎ-メチルピロリジノン(３ｘ１００ｍｌ)及びジクロロメタン(５ｘ１００ｍｌ)を用いて、樹脂を洗浄した。Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(１００ｍｌ)にピペリジンが入った２０％溶液を添加した。反応器を室温で２０分振揺した。液体を除去した。Ｎ-メチルピロリジノン(３ｘ１００ｍｌ)及びジクロロメタン(５ｘ１００ｍｌ)を用いて、樹脂を洗浄した。Ｎ-メチルピロリジノン(５０ｍｌ)に４-(プロプ-２-イニルオキシ)安息香酸(１．８８ｇ、１０．６７ｍｍｏｌ)及び１-ヒドロキシベンゾトリアゾール(１．６３ｇ、１０．６７ｍｍｏｌ)の混合物が入ったもの、及びジクロロメタン(５０ｍｌ)にジイソプロピルカルボジイミド(１．６７ｍｌ、１０．６７ｍｍｏｌ)及びエチルジイソプロピルアミン(１．８３ｍｌ、１０．６７ｍｍｏｌ)が入った溶液を、逐次添加した。反応器を室温で１６時間振揺した。液体を除去した。Ｎ-メチルピロリジノン(３ｘ１００ｍｌ)及びジクロロメタン(５ｘ１００ｍｌ)を用いて、樹脂を洗浄した。トリイソプロピルシラン(１０ｍｌ)が添加されたトリフルオロ酢酸の５０％溶液を、樹脂に添加した。トリイソプロピルシランをさらに１５ｍｌ添加した。反応器を室温で１時間振揺した。液体を収集した。溶媒を真空で除去した。残留物をトルエン(１００ｍｌ)に溶解させた。再度、溶媒を真空で除去した。溶離液として、０．１％のトリフルオロ酢酸で緩衝させた、水に１３-３３％のアセトニトリル勾配のあるものを使用し、Ｃ_１８-逆相カラムにおいて、ＨＰＬＣ-クロマトグラフィーにより、粗生成物を精製したところ、３１０ｍｇのＮ-((Ｓ)-５-アミノ-５-カルバモイルペンチル)-４-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンズアミドのトリフルオロ酢酸塩が付与された。
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ_６)：δ１．３４(ｍ、２Ｈ)；１．５３(ｍ、２Ｈ)；１．７５(ｍ、２Ｈ)；３．２４(ｑ、２Ｈ)；３．６１(ｓ、１Ｈ)；３．７０(ｂｒ、１Ｈ)；４．８７(ｓ、２Ｈ)；７．０４(ｄ、２Ｈ)；７．５７(ｂｒ、１Ｈ)、７．８１(ｄ、２Ｈ)；７．８４(ｂｒ、１Ｈ)；８．０７(ｂｒ、３Ｈ)；８．３４(ｔ、１Ｈ)。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝３０４(Ｍ＋１)^＋。
ＨＰＬＣ：Ｒ_ｔ＝６．４８分(方法０２-ｂ１-２)。

工程４：
(Ｓ)-２-(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギル)グルタミル)フェニルアラニル)ロイシル)アミノ)-６-(４-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミド

(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギニル)グルタミル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシル)アラニン(１４．４ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ)を、水(０．５００ｍｌ)と水酸化ナトリウムの４Ｎ水溶液(０．００２ｍｌ)に溶解させた。この溶液を、１Ｎの塩酸でｐＨ８に調節された、０．２５ＭのＨＥＰＥＳ及び５ｍＭのＥＤＴＡのバッファー(１．００ｍｌ)に、Ｎ-((Ｓ)-５-アミノ-５-カルバモイルペンチル)-４-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンズアミド(３００ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。水酸化ナトリウムの４Ｎ水溶液及び１Ｎの塩酸を添加することにより、溶液をｐＨ７．７５に調節した。この混合物を３０℃に温めた。１Ｎの塩酸でｐＨ８に調節された、０．２５ＭのＨＥＰＥＳ及び５ｍＭのＥＤＴＡ(１．００ｍｌ)からなるバッファー(０．６７７ｍｌ)を、全容量が２．６７ｍｌになるように添加した。水(０．２５０ｍｌ)にＣＰＹ(５０Ｕ)が入った溶液を添加した。反応器を３０℃で２．５時間、穏やかに振揺した。反応混合物を水(５ｍｌ)で希釈し、濾過した。０．１％のトリフルオロ酢酸で緩衝させた、水に１０-５０％のアセトニトリル勾配のあるものを使用し、Ｃ_１８-逆相カラムにおいて、ＨＰＬＣ-クロマトグラフィーにかけたところ、０．５ｍｇの(Ｓ)-２-(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギル)グルタミル)フェニルアラニル)ロイシル)アミノ)-６-(４-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミドが付与された。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝１１９９(Ｍ＋１)^＋
ＨＰＬＣ：Ｒ_ｔ＝２４．８８分(方法０３-ｂ６-１)

工程５：
水(２．３４ｍｌ)に硫酸銅五水和物(１０．５ｍｇ)が入った溶液を、水(２．２９ｍｌ)と２,６-ルチジン(０．０４７ｍｌ)にアスコルビン酸(３７ｍｇ)が入った溶液に添加した。この混合物を室温で５分攪拌した。この溶液から２．２１ｍｌを、水(１．９６ｍｌ)に２,６-ルチジンが入った２％溶液に、(Ｓ)-６-(３-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)-２-(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギニル)グルタミル)フェニルアラニル)ロイシル)ロイシルアミノ)ヘキサンアミド(２．３ｍｇ、２０００ｎｍｏｌ)及び(Ｓ)-２-(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギル)グルタミル)フェニルアラニル)ロイシル)アミノ)-６-(４-(プロプ-２-イニルオキシ)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミド(０．５０ｍｇ、４１７ｎｍｏｌ)が入った溶液に添加した。反応混合物を室温で２時間、穏やかに振揺した。０．１％のトリフルオロ酢酸で緩衝させた、水に１０-６０％のアセトニトリル勾配のあるものを使用し、Ｃ_１８-逆相カラムにおけるＨＰＬＣ-クロマトグラフィーにかけたところ、０．１ｍｇの(Ｓ)-２-(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギル)グルタミル)フェニルアラニル)ロイシル)アミノ)-６-(３-((４-((４-(((Ｓ)-５-カルバモイル-５-(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギル)グルタミル)フェニルアラニル)ロイシル)アミノ)ペンチル)カルバモイル)フェノキシ)メチル)１,２,３-トリアゾール-１-イル)メチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミドが付与された。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝１１８３(Ｍ^２＋＋１)、７８９(Ｍ^３＋＋１)。
ＨＰＬＣ：Ｒ_ｔ＝２４．７８分(方法０３-ｂ６-１)。

実施例６
(Ｓ)-２-((((((((アルギニル)リシル)アスパルギル)リシル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシル)アミノ)-６-(３-(((１-((((Ｓ)-５-カルバモイル-５-((((((((アルギニル)リシル)アスパルギル)リシル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシル)アミノ)ペンチル)カルバモイル)フェニル)エチリデン)アミノキシ)メチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミド

工程１：
(((((((アルギニル)リシル)アスパルギル)リシル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシル)アラニン
(((((((アルギニル)リシル)アスパルギル)リシル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシル)アラニンを、商業的に入手可能なＦｍｏｃ-Ａｌａ-Ｗａｎｇ樹脂から出発して、当業者に公知の標準的なＦｍｏｃ-方法により、アプライド・バイオシステムズ４３３Ａペプチド合成器において調製した。次のアミノ酸誘導体を使用した：

トリフルオロ酢酸(１０．６ｍｌ)、水(０．２６５ｍｌ)及びトリイソプロピルシラン(０．２６５ｍｌ)の混合物を、樹脂に添加した。それを１．５時間振揺した。液体を収集した。トリフルオロ酢酸(１ｍｌ)で樹脂を洗浄した。液体を組合せた。溶液を窒素流下で濃縮した。エーテル(４０ｍｌ)を添加した。遠心分離により、沈殿物を単離した。空気乾燥させた。溶離液として、０．１％のトリフルオロ酢酸バッファーにおいて、水に１５-４５％のアセトニトリル勾配のあるものを使用し、ＨＰＬＣにおける逆相Ｃ_１８-カラムにて、粗生成物を精製した。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝１０２３(Ｍ^＋)
ＨＰＬＣ：Ｒ_ｔ＝１６．１８分(方法０２-ｂ６-１)。

工程２：
(Ｓ)-２-((((((((アルギニル)リシル)アスパルギル)リシル)フェニルアラニニル)フェニルアラニニル)ロイシル)アミノ)-６-(３-(アミノキシメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミド

(((((((アルギニル)リシル)アスパルギル)リシル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシル)アラニン(２７．３ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ)を水(５００ｍｌ)に溶解させた。この溶液を、１Ｎの塩酸でｐＨ８に調節された、０．２５ＭのＨＥＰＥＳ及び５ｍＭのＥＤＴＡからなるバッファー(２．１０ｍｌ)にＮ-((Ｓ)-５-アミノ-５-(カルバモイル)ペンチル)-３-(アミノオキシメチル)ベンズアミド(５４４ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。水酸化ナトリウムの４Ｎ水溶液(０．１７５ｍｌ)を添加することにより、ｐＨをｐＨ８．０７に調節した。１Ｎの塩酸でｐＨ８に調節された、０．２５ＭのＨＥＰＥＳ及び５ｍＭのＥＤＴＡからなるバッファー(２．１８ｍｌ)を添加した。水(０．３７５ｍｌ)にＣＰＹ(７５Ｕ)が入った溶液を添加した。反応混合物を３０℃で３．５時間、穏やかに振揺した。水(１０ｍｌ)で希釈し、濾過した。０．１％のトリフルオロ酢酸で緩衝させた、水に５-５５％のアセトニトリル勾配のあるものを使用し、Ｃ_１８-逆相カラムにおいて、ＨＰＬＣ-クロマトグラフィーにより濾液を精製したところ、凍結乾燥後、１．６ｍｇの(Ｓ)-２-((((((((アルギニル)リシル)アスパルギル)リシル)フェニルアラニニル)フェニルａｌａｎｉｎｌｙ)ロイシル)アミノ)-６-(３-(アミノキシメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミドが付与された。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝１２２９(Ｍ^＋)
ＨＰＬＣ：Ｒ_ｔ＝１８．４１分(方法０３-ｂ６-１)。

工程３：
４-アセチル安息香酸-２,５-ジオキソピロリジン-１-イルエステル

２-スクシンイミド-１,１,３,３-テトラメチルウロニウム-テトラフルオロボラート(ＴＳＴＵ、１８．５ｇ、６０．９ｍｍｏｌ)を、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(５０ｍｌ)に４-アセチル安息香酸(１０．０ｇ、６０．９ｍｍｏｌ)及びトリエチルアミン(８．４９ｍｌ、６０．９ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。反応混合物を室温で２時間攪拌した。酢酸エチル(４００ｍｌ)で希釈し、水(３ｘ２００ｍｌ)で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空で除去したところ、１３．３８ｇの４-アセチル安息香酸-２,５-ジオキソピロリジン-１-イルエステルが付与された。
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ_３)：δ２．６７(ｓ、３Ｈ)；２．９３(ｓ、４Ｈ)；８．０５(ｄ、２Ｈ)；８．２０(ｄ、２Ｈ)。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝２８４(Ｍ＋Ｎａ)^＋

工程４：
４-アセチル-Ｎ-((５Ｓ)-５-アミノ-５-カルバモイルペンチル)ベンズアミド

４-アセチル安息香酸-２,５-ジオキソピロリジン-１-イルエステル(８．２１ｇ、３１．４ｍｍｏｌ)を、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(２００ｍｌ)に粗((Ｓ)-５-アミノ-１-(カルバモイル)ペンチル)カルバミン酸-tert-ブチルエステル(７．７１ｇ、３１．４ｍｍｏｌ)が入った懸濁液に添加した。エチルジイソプロピルアミン(１６．１４ｍｌ、９４．３ｍｍｏｌ)を添加した。反応混合物を室温で３日間攪拌した。溶媒を７０℃で真空にて除去した。残留物をジクロロメタン(５０ｍｌ)に溶解させた。トリフルオロ酢酸(５０ｍｌ)を添加した。反応混合物を室温で１時間攪拌した。溶媒を真空で除去した。残留物をジクロロメタン(２００ｍｌ)に溶解させた。硫酸水素ナトリウムの１０％水溶液(５０ｍｌ)を添加した。混合物を水(２００ｍｌ)で抽出した。水相を真空で、約６０ｍｌまで濃縮した。それを３の部分に分割した。各部分を、０．１％のトリフルオロ酢酸で緩衝させた、水に０-２０％のアセトニトリル勾配のあるものを使用し、Ｃ１８逆相カラムにおいて、ＨＰＬＣ-クロマトグラフィーにより精製したところ、８．００ｇの４-アセチル-Ｎ-((５Ｓ)-５-アミノ-５-カルバモイルペンチル)ベンズアミドのトリフルオロ酢酸塩が共に付与された。

工程５：
(Ｓ)-２-((((((((アルギニル)リシル)アスパラギル)リシル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシル)アミノ)-６-(４-アセチルベンゾイルアミノ)ヘキサンアミド

(((((((アルギニル)リシル)アスパルギル)リシル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシル)アラニン(２７．３ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ)を水(０．５００ｍｌ)に溶解させた。それを、１Ｎの塩酸でｐＨ８に調節された、０．２５ＭのＨＥＰＥＳ及び５ｍＭのＥＤＴＡからなるバッファー(１．１０ｍｌ)に４-アセチル-Ｎ-((５Ｓ)-５-アミノ-５-カルバモイルペンチル)ベンズアミド(１１０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。水酸化ナトリウムの４Ｎ水溶液(０．０４０ｍｌ)を用いて、ｐＨをｐＨ７．９４に調節した。１Ｎの塩酸でｐＨ８に調節された、０．２５ＭのＨＥＰＥＳ及び５ｍＭのＥＤＴＡからなるバッファー(０．７７８ｍｌ)を添加した。水(０．２５０ｍｌ)にＣＰＹ(５０Ｕ)が入った溶液を添加した。反応器を３０℃で１．５時間、穏やかに振揺した。反応混合物を水(５ｍｌ)で希釈し、濾過した。０．１％のトリフルオロ酢酸で緩衝させた、水に５-６５％のアセトニトリル勾配のあるものを使用し、Ｃ_１８-逆相カラムにおいて、濾液をＨＰＬＣ-クロマトグラフィーにかけたところ、３．０９ｍｇの(Ｓ)-２-((((((((アルギニル)リシル)アスパラギル)リシル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシル)アミノ)-６-(４-アセチルベンゾイルアミノ)ヘキサンアミドが付与された。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝１２２６(Ｍ^＋)。
ＨＰＬＣ：Ｒ_ｔ＝２１．２５分(方法０３-ｂ６-１)。

工程６：
水(０．４０ｍｌ)に(Ｓ)-２-((((((((アルギニル)リシル)アスパラギル)リシル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシル)アミノ)-６-(４-アセチルベンゾイルアミノ)ヘキサンアミド(３．０９ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ)が入った溶液を、水(０．４０ｍｌ)に(Ｓ)-２-((((((((アルギニル)リシル)アスパルギル)リシル)フェニルアラニニル)フェニルアラニニル)ロイシル)アミノ)-６-(３-(アミノキシメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミド(１．６１ｍｇ、０．００１ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。ｐＨが、ｐＨ２．６６であることが見出された。反応器を室温で穏やかに振揺した。２時間後、反応混合物を水(５ｍｌ)で希釈した。それを濾過した。０．１％のトリフルオロ酢酸で緩衝させた、水に１０-６０％のアセトニトリル勾配のあるものを使用し、Ｃ_１８-逆相カラムにおいて、濾液をＨＰＬＣ-精製にかけたところ、０．１ｍｇの(Ｓ)-２-((((((((アルギニル)リシル)アスパルギル)リシル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシル)アミノ)-６-(３-(((１-((((Ｓ)-５-カルバモイル-５-((((((((アルギニル)リシル)アスパルギル)リシル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシル)アミノ)ペンチル)カルバモイル)フェニル)エチリデン)アミノキシ)メチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサンアミドが付与された。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝８１３(Ｍ^３＋)、１２１９(Ｍ^２＋)。
ＨＰＬＣ：Ｒ_ｔ＝２３．７７分(方法０３-ｂ６-１)。

実施例７
Ｎ,Ｎ'-ビス(２-(２-(２-(２-(４-((３-(Ｎ-((Ｓ)-５-(カルバモイル)-５-(ｈＧＨイルロイシニルアミノ)ペンチル)カルバモイル)ベンジルオキシ)イミノ)ブトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)オメガ−カルバモイル３．４ｋＤａＰＥＧ−カルボン酸アミド
工程１：
Ｎ-((Ｓ)-５-アミノ-５-(カルバモイル)ペンチル)-３-(アミノオキシメチル)ベンズアミドを用いた、ｈＧＨ-Ｌｅｕ-ＡｌａのＣＰＹ-触媒ペプチド転移

Ｈ_２Ｏ：ジイソプロピルアミン(１００：１ｖ／ｖ、０．９ｍｌ)にｈＧＨ-Ｌｅｕ-Ａｌａ(３０ｍｇ、最終濃度０．５ｍＭ)が入った溶液に、５ｍＭのＥＤＴＡ(１．４６ｍｌ)を含有する、ｐＨ８．５のＨＥＰＥＳバッファー２５０ｍＭの溶液にＮ-((Ｓ)-５-アミノ-５-(カルバモイル)ペンチル)-３-(アミノオキシメチル)ヌズアミド(nzamide)(２８８ｍｇ、最終濃度２００ｍＭ)が入ったものを添加した。水酸化ナトリウム(水に１０Ｍ)を添加することにより、ｐＨを８．２に調節した。５ｍＭのＥＤＴＡを含有する、ｐＨ８．５のＨＥＰＥＳバッファー２５０ｍＭを添加することにより、反応容量を２．６５ｍｌに調節した。水に酵素(フルカ＃２１９４３)が入った溶液(最終濃度１１Ｕ／ｍｌ)を添加することによって、反応を開始させた。反応混合物を３０℃でインキュベートした。

ＣＥ分析法１
ダイオードアレイ検出器を具備するヒューレット・パッカード(Hewlett Packard)３ＤＣＥシステムを使用し、キャピラリー電気泳動を実施した。
使用した溶融石英キャピラリー(アギレント)は、全長６４．５、有効長５６ｃｍ、ＩＤ５０μｍであった。５０ｍｂａｒの圧力で４秒間、サンプルを注入した。電解液として、ｐＨ７のリン酸バッファー５０ｍＭを使用し、＋２５ｋＶの電圧下、３０℃で分離を実施した。２００ｎｍで分析をモニターした。走行中、酸性及び塩基性洗浄を実施し；キャピラリーを水で２分、ついで０．１Ｍのリン酸で２分、ついで水で２分すすぎ；その後、電解液でキャピラリーを平衡にする前に、０．１Ｍの水酸化ナトリウムで３分、水で２分すすいだ。
反応をキャピラリー電気泳動、ＣＥ分析法１によりモニターした。

ペプチド転移した生成物の収率が５４％に達した時(反応時間１．５時間後)、ＰＭＳＦ(無水イソプロパノールに入った１００ｍＭ溶液、最終濃度２ｍＭ)を用いて酵素を不活性化することにより、反応を停止させた。
トリエタノールアミン(４５ｍＭ)、３-メチルチオ-１-プロパノール(０．１４Ｍ)及びＰＭＳＦ(０．２ｍＭ)を含有するバッファーの反応混合物を添加した後、ミリポア・アミコン・ウルトラ(Millipore Amicon Ultra)カットオフ１０ｋＤにおける限外濾過(２回)により、過度の試薬を除去した。３-メチルチオ-１-プロパノール(０．１４Ｍ)(バッファーＢ(トリス５０ｍＭ、ｐＨ８．５、０．２ＭのＮａＣｌ))とＰＭＳＦ(０．２ｍＭ)を含有する溶液を添加した後に、再度、残存したタンパク質溶液を限外濾過した(２回)。
最後に、得られたタンパク質溶液を脱塩カラムに流した(アメルシャム(Amersham)ハイプレップ(HiPrep) ２６／１０脱塩、溶離液：トリス５０ｍＭ、ｐＨ８．５、１０ｍｌ／分)。ついで、３-メチルチオ-１-プロパノール(０．１４Ｍ)へのバッファーシフトを実施した。最終的なタンパク質濃度は１０ｍｇ／ｍｌ(２．３ｍｌ)であった。
得られた溶液をさらなる精製をすることなく、次の工程で使用した。

工程２：
ブチルＡＬＤ-ＰＥＧ-ブチルＡＬＤ-３４００を用いたオキシム化：

３-メチルチオ-１-プロパノール０．１４Ｍ(０．４ｍｌ)にブチルアルデヒド-ポリ(エチレングリコール)-ブチルアルデヒド(平均分子量：３４００)(ネクター(Nektar)のカタログ番号０８０８Ｆ０２)(０．９５ｍｇ(０．４５当量)が入った溶液を、上述したタンパク質溶液(１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質、２．１ｍｌ)に添加した。反応混合物を３０℃でインキュベートした。工程１で得られたヒドロキシルアミン誘導体が消失した後、キャピラリー電気泳動の方法２を実施した。

ＣＥ分析法２：
電解液は、ｐＨ２．５のリン酸バッファー５０ｍＭである。実施中、キャピラリーの酸洗浄は実施しなかった。他の全ての条件は上述したＣＥ分析１と同様にした。
アギレント２１００バイオアナライザーにおける分析を４８時間後に実施すると、約２０％の収率を有するダイマーについて、予期される質量の生成物が形成されるのが示された。
イオン交換において、生成物を精製した(アメルシャム・モノＱ１０／１００ＧＬ、Ａバッファー；トリス５０ｍＭ、ｐＨ８．５、Ｂバッファー：Ａ＋０．２ＭのＮａＣｌ、３カラム容量を超えて０〜３０％のＢ、２０カラム容量を越えて３０〜８０％Ｂ、３カラム容量を超えて８０〜１００％、４ｍｌ／分)。
生成物を含有するプールしたフラクションを水で希釈し、同様の精製手順に再度かけた。しかしながら、ダイマーとモノマーは厳密には分離しなかった。
よって、さらなる精製工程をゲル濾過カラム(ハイプレップ・スーパーデックス(Superdex)２００、トリス５０ｍＭ、ｐＨ８．５、２．５ｍｌ／分)において実施した。ダイマーを単離することができたが、幾ばくかの分解産物を含有しており、第１の精製工程と類似した、最後のイオン交換精製により、部分的に除去した。収率：０１１ｍｇの生成物が得られた(全体的に約３％超)。

実施例８
(Ｓ)-６-(５-(アセチル)２-(３-(４-((４-((Ｓ)-２-カルバモイル-２-((((((((グルタミル)アスパルチル)アスパラギニル)グルタミル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシル)アミノ)エチル)フェノキシ)メチル)トリアゾール-１-イル)プロポキシ)ベンゾイルアミノ)２-((ｈＧＨイル)ロイシルアミノ)ヘキサンアミド

工程１：
５-アセチル-２-(３-ブロモ−プロポキシ)安息香酸メチルエステル

５-アセチルサリチル酸メチル(２０ｇ、１０３ｍｍｏｌ)、炭酸カリウム(４２．７ｇ、３０９ｍｍｏｌ)、テトラブチルアンモニウムヨージド(１．９０ｇ、５．１５ｍｍｏｌ)、及びＮ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(１５０ｍｌ)の混合物を、１,３-ジブロモプロパン(４２ｍｌ、４１２ｍｍｏｌ)の溶液に添加した。反応混合物を６０℃で１６時間加熱した。それを室温まで冷却した。全ての炭酸カリウムが溶解するまで、水を添加した。酢酸エチル(３００ｍｌ)で抽出した。有機相を水(３ｘ２００ｍｌ)及び炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液(２００ｍｌ)で洗浄した。それを硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空で除去した。溶離液として酢酸エチル／ヘプタン／ジクロロメタン(１：２：１)の混合物を使用し、シリカ(４００ｇ)におけるフラッシュクロマトグラフィーにより、粗生成物を精製したところ、１０．７７ｇの５-アセチル-２-(３-ブロモ-プロポキシ)安息香酸メチルエステルが付与された。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝３１５(Ｍ＋１)
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ_３)：δ２．３８(quintett、２Ｈ)；２．５９(ｓ、３Ｈ)；３．７１(ｔ、２Ｈ)；３．９１(ｓ、３Ｈ)；４．２７(ｔ、２Ｈ)；７．０５(ｄ、１Ｈ)；８．０９(ｄ、１Ｈ)；８．４２(ｓ、１Ｈ)。

工程２：
５-アセチル-２-(３-アジドプロポキシ)安息香酸メチルエステル

５-アセチル-２-(３-ブロモ-プロポキシ)安息香酸メチルエステル(１０．７７ｇ、３４．２ｍｍｏｌ)を、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(２００ｍｌ)に溶解させた。アジ化ナトリウム(４．４４ｇ、６８．３ｍｍｏｌ)及びテトラブチルアンモニウムヨージド(０．１２６ｇ、０．３４２ｍｍｏｌ)を逐次添加した。反応混合物を６０℃で１６時間攪拌した。それを室温まで冷却し、水(２００ｍｌ)で希釈した。酢酸エチル(３００ｍｌ)で抽出した。有機相を水(３ｘ２００ｍｌ)で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空で除去したところ、粗生成物が生じた。過度のアジドを除去するため、文献(Lunn、G. SansoneE. B. Destruction of hazardous chemicals in the laboratory, 第2版, John Wiley & Sons, New York)に従い処理した。粗生成物を溶解させるために酢酸エチル／ヘプタン／ジクロロメタン(３：２：１)の混合物、さらに溶離液として酢酸エチル／ヘプタン(３：２)の混合物を使用し、シリカ(９０ｇ)におけるフラッシュクロマトグラフィーにより、粗生成物を精製したところ、５．１５ｇの５-アセチル-２-(３-アジドプロポキシ)安息香酸メチルエステルが付与された。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝２７８(Ｍ＋１)、３００(Ｍ＋Ｎａ)、２４９(Ｍ-２８)。
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ_３)：δ２．１２(quintett、２Ｈ)；２．５８(ｓ、３Ｈ)；３．６２(ｔ、２Ｈ)；３．９１(ｓ、３Ｈ)；４．２１(ｔ、２Ｈ)；７．０３(ｄ、１Ｈ)；８．１０(ｄ、１Ｈ)；８．４２(ｓ、１Ｈ)。

工程３：
５-アセチル-２-(３-アジドプロポキシ)安息香酸

５-アセチル-２-(３-アジドプロポキシ)安息香酸メチルエステル(５．１５ｇ、１８．６ｍｍｏｌ)を１,４-ジオキサン(２００ｍｌ)に溶解させた。水(２００ｍｌ)に水酸化リチウム(０．５３４ｇ、２２．３ｍｍｏｌ)が入った溶液を添加した。反応混合物を室温で４日間攪拌した。水酸化ナトリウムの１Ｎ水溶液を添加して、ｐＨ１３-１４の溶液を得た。それをtert-ブチルメチルエーテル(３ｘ２００ｍｌ)で洗浄した。硫酸水素ナトリウムの１０％水溶液を用い、水相をｐＨ３に酸性化した。酢酸エチル(３ｘ２００ｍｌ)で抽出した。組合せた酢酸エチル相を硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空で除去したところ、さらなる精製をすることなく使用される、粗５-アセチル-２-(３-アジドプロポキシ)安息香酸が付与された。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝２３６(Ｍ-２８)、２８６(Ｍ＋２３)
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ_３)：δ２．１９(quintett、２Ｈ)；２．６３(ｓ、３Ｈ)；３．６４(ｔ、２Ｈ)；４．３７(ｔ、２Ｈ)；７．１２(ｄ、１Ｈ)；８．２２(ｄ、１Ｈ)；８．７０(ｓ、１Ｈ)；１０-１２(broad １Ｈ)。
ＨＰＬＣ：Ｒ_ｔ＝６．７０分(方法０２-ｂ４-４)

工程４：
５-アセチル-２-(３-アジドプロポキシ)安息香酸-２,５-ジオキソ-ピロリジン-１-イルエステル

２-スクシンイミド-１,１,３,３-テトラメチルウロニウム-テトラフルオロボラート(ＴＳＴＵ、４．５１ｇ、１５．０ｍｍｏｌ)を、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(１００ｍｌ)に５-アセチル-２-(３-アジドプロポキシ)安息香酸(３．９４、１５．０ｍｍｏｌ)及びトリエチルアミン(２．０９ｍｌ、１５．０ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。反応混合物を室温で２４時間攪拌した。硫酸水素ナトリウムの１０％水溶液(４００ｍｌ)を添加した。混合物を酢酸エチル(２ｘ２００ｍｌ)で抽出した。組合せた有機相をブライン(２００ｍｌ)で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空で除去した。それを酢酸エチル／ヘプタン(２：１、１０ｍｌ)の混合物で処理した。形成された沈殿物を濾過により単離し、酢酸エチル／ヘプタンの混合物(２：１、１０ｍｌ)で洗浄し、真空で乾燥させたところ、２．９ｇの５-アセチル-２-(３-アジドプロポキシ)安息香酸-２,５-ジオキソ-ピロリジン-１-イルエステルが付与された。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝３８３(Ｍ＋Ｎａ)、３３３(Ｍ＋１-Ｎ_２)。
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ_３)：δ２．１２(quintett、２Ｈ)；２．６１(ｓ、３Ｈ)；２．９２(broad、４Ｈ)；３．６１(ｔ、２Ｈ)；４．２４(ｔ、２Ｈ)；７．０９(ｄ、１Ｈ)；８．２３(ｄ、１Ｈ)；８．５９(ｓ、１Ｈ)。

工程５：
{(Ｓ)-５-[５-アセチル-２-(３-アジドプロポキシ)ベンゾイルアミノ]-１-[カルバモイル]ペンチル}カルバミン酸-tert-ブチルエステル

粗(Ｓ)-５-アミノ-１-(カルバモイル)ペンチル)カルバミン酸-tert-ブチルエステル(１．９７ｇ、８．０５ｍｍｏｌ)を、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(２００ｍｌ)に５-アセチル-２-(３-アジドプロポキシ)安息香酸-２,５-ジオキソ-ピロリジン-１-イルエステル(２．９０ｇ、８．０５ｍｍｏｌ)及びエチルジイソプロピルアミン(４．１３ｍｌ、２４．１４ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。反応混合物を室温で１６時間攪拌した。それを硫酸水素ナトリウムの１０％水溶液(４００ｍｌ)で希釈し、酢酸エチル(２ｘ３００ｍｌ)で抽出した。組合せた有機相を炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液(３００ｍｌ)で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空で除去したところ、さらなる精製をすることなく次の工程で使用される、３．０１ｇの粗{(Ｓ)-５-[５-アセチル-２-(３-アジドプロポキシ)ベンゾイルアミノ]-１-[カルバモイル]ペンチル}カルバミン酸-tert-ブチルエステルが付与された。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝３９１(Ｍ＋１-Ｂｏｃ)。
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ_６)：δ１．２９-１．６５(ｍ、６Ｈ)；１．３６(ｓ、９Ｈ)；２．０５(quintett、２Ｈ)；２．５５(ｓ、３Ｈ)；３．２６(ｑ、２Ｈ)；３．５５(ｔ、２Ｈ)；３．８４(ｑ、１Ｈ)；４．２３(ｔ、２Ｈ)；６．７０(ｄ、１Ｈ)；６．９３(ｓ、１Ｈ)；７．２４(ｍ、２Ｈ)；８．０２(ｄ、１Ｈ)；８．１０(ｔ、１Ｈ)；８．１８(ｓ、１Ｈ)。
ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝７．８３分(方法０２-ｂ４-４)。

工程６：
５-アセチル−Ｎ-((Ｓ)-５-アミノ-５-カルバモイルペンチル)-２-(３-アジドプロポキシ)ベンズアミド

トリフルオロ酢酸(１００ｍｌ)を、{(Ｓ)-５-[５-アセチル-２-(３-アジドプロポキシ)ベンゾイルアミノ]-１-[カルバモイル]ペンチル}カルバミン酸-tert-ブチルエステル(３．０１ｇ、６ｍｍｏｌ)及びジクロロメタン(１００ｍｌ)の混合物に添加した。反応混合物を室温で１．５時間攪拌した。溶媒を真空で除去した。残留物をジクロロメタン(１００ｍｌ)に溶解させた。溶媒を真空で除去した。この後者の手順を２回繰り返した。溶離液として、０．１％のトリフルオロ酢酸で緩衝させた、水に０-４０％のアセトニトリル勾配のあるものを使用し、ＨＰＬＣ逆相Ｃ_１８-カラムにおいて、粗生成物を精製したところ、１．４０ｇの５-アセチル-Ｎ-((Ｓ)-５-アミノ-５-カルバモイルペンチル)-２-(３-アジドプロポキシ)ベンズアミドのトリフルオロ酢酸塩が付与された。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝３９１(Ｍ＋１)。
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ_６)：δ１．３６(ｍ、２Ｈ)；１．５２(ｍ、２Ｈ)；１．７３(ｍ、２Ｈ)；２．０５(quintett、２Ｈ)；２．５５(ｓ、３Ｈ)；３．２７(ｑ、２Ｈ)；３．５５(ｔ、２Ｈ)；３．６９(ｍ、１Ｈ)；４．２４(ｔ、２Ｈ)；７．２５(ｄ、１Ｈ)；７．５７(ｓ、１Ｈ)；７．８３(ｓ、１Ｈ)；８．０３(ｍ、４Ｈ)；８．１８(ｍ、２Ｈ)。
ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝５．０２(方法０２-ｂ４-４)。

工程７：
ｈＧＨ-Ｌｅｕ-Ａｌａ
ｐＮＮＣ１３をベースにしたクローニング法では、Ｚｂａｓｉｃ２ｍｔ-Ｄ４Ｋ-ｈＧＨを既に含有する、ｐＥＴ１１ａ誘導ベクターが利用される。テンプレートとしてｐＮＮＣ１３を使用し、ＰＣＲプライマーをＳａｃＩＩ及びＢａｍＨＩ制限部位に隣接してセットし、ｈＧＨのＣ末端における２つの付加的なアミノ酸(ロイシン及びアラニン)をコードする６２８ｂｐの単位複製配列が生じる。ついで、このＰＣＲ単位複製配列を、存在するＳａｃＩＩ及びＢａｍＨＩを使用してｐＮＮＣ１３にクローンバックさせ、Ｚｂａｓｉｃ２ｍｔ-Ｄ４Ｋ-ｈＧＨ-Ｌｅｕ-ＡｌａをコードするｐＮＮＣ１３．４を生じさせた。得られたクローンの完全性を、コード領域のＤＮＡ配列決定により確認した。
ｐＥＴ１１ａ-Ｚｂａｓｉｃ２ｍｔ-Ｄ４Ｋ-ｈＧＨ-Ｌｅｕ-Ａｌａを用い、大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)を形質転換させた。単一コロニーを１００μｇ／ｍｌのＡｍｐを含有する１００ｍｌのＬＢ培地に接種し、ＯＤ６００が０．６に達するまで３７℃で成長させた。細胞培養温度を２０℃まで低下させ、２０℃で６時間、１ｍＭのＩＰＴＧを用い、細胞を誘発させた。３０００ｇで１５分間遠心分離することにより、細胞を収集した。

細胞ペレットを細胞溶解バッファー(２５ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、２５ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のトリトンＸ-１００)に再懸濁させ、細胞を３０ｋｐｓｉの細胞破壊(コンスタント・セル・ディスラプション・システムズ(Constant Cell Disruption Systems))により破壊した。１００００ｇで３５分間遠心分離することにより、溶解物を浄化し、精製のために上清を使用した。
ステップ勾配溶出(バッファーＡ：２５ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、２５ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７；バッファーＢ：２５ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、２５ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７、１ＭのＮａＣｌ)を使用し、ＳＰセファロースＦＦにおいてＺｂａｓｉｃ２ｍｔ-Ｄ４Ｋ-ｈＧＨ-Ｌｅｕ-Ａｌａを精製した。その後、ｈＧＨ-Ｌｅｕ-Ａｌａを放出させるために、エンテロペプチダーゼを使用し、タンパク質を切断した。消化後、ブチル-セファロース４ＦＦカラムにおいて、ｈＧＨ-Ｌｅｕ-Ａｌａをさらに精製し、Ｚｂａｓｉｃ２ｍｔ-Ｄ４Ｋドメイン及びエンテロペプチダーゼ(バッファーＡ：１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、２ＭのＮａＣｌ；バッファーＢ：１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、直線状勾配を使用)から、生成物を分離した。

消化が不完全である場合、残ったＺｂａｓｉｃ２ｍｔ-Ｄ４Ｋ-ｈＧＨ-Ｌｅｕ-ＡｌａをｈＧＨ-Ｌｅｕ-Ａｌａから分離させ、ＳＰセファロースＦＦカラムに、再度タンパク質を充填することによりこれをなした。ＳＰセファロースＦＦカラムにおいて精製する前に、２５ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４及び２５ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４(ｐＨ７)からなる溶液におけるバッファー交換を、セファデックス(Sephadex)Ｇ-２５培地カラムにおいて実施する。Ｚｂａｓｉｃ２ｍｔ-Ｄ４Ｋ-ｈＧＨ-Ｌｅｕ-ＡｌａはＳＰセファロースＦＦに結合するが、これに対し、タンパク質ｈＧＨ-Ｌｅｕ-Ａｌａは、流れてしまうことが見出された。
タンパク質ｈＧＨ-Ｌｅｕ-Ａｌａの溶液のバッファーを、５０ｍＭのＮＨ_４ＨＣＯ_３と交換した。溶液を凍結乾燥させた。

工程８：
(Ｓ)-６-(２-(３-アジドプロポキシ)-５-アセチルベンゾイルアミノ)-２-(ｈＧＨイルロイシルアミノ)ヘキサンアミド

ｈＧＨ-Ｌｅｕ-Ａｌａ(１５ｍｇ、６７２ｎｍｏｌ)を、水(０．５１ｍｌ)とエチルジイソプロピルアミン(０．００４ｍｌ)に溶解させた。ｐＨ８に調節された、０．２５ＭのＨＥＰＥＳ及び５ｍＭのＥＤＴＡからなるバッファーに、５-アセチル-Ｎ-((Ｓ)-５-アミノ-５-カルバモイルペンチル)-２-(３-アジドプロポキシ)ベンズアミド(９９ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ)を溶解させることにより、第２の溶液を調製した。２つの溶液を組合せ、水酸化ナトリウムの１Ｎ水溶液を添加することにより、ｐＨ８．０１に調節した。水にＣＰＹが入った溶液(２００Ｕ／ｍｌ、０．０７５ｍｌ)を添加した。反応混合物を室温で１６時間、穏やかに振揺した。新たに調製された、イソプロパノール(０．０１３５ｍｌ)にフェニルメタンスルホニルフルオリドが入った１００ｍＭ溶液を添加した。反応混合物を０．５時間、穏やかに攪拌した。それを濾過した。ハイプレップ２６／１０脱塩カラムにおけるゲル-クロマトグラフィーにより、バッファーを５０ｍＭの炭酸水素アンモニウムバッファーと交換した。新たに調製された、イソプロパノール(０．００４５ｍｌ)にフェニルメタンスルホニルフルオリドが入った１００ｍＭ溶液を、タンパク質を含有するフラクションに即座に添加した。これらのフラクションを組合せ、ｐＨ８．５に調節された、２５ｍＭのトリスバッファーと、ハイプレップ２６／１０脱塩カラムを使用するバッファー-交換クロマトグラフィーにかけた。タンパク質を含有するフラクションを組合せ、４ｍｌ／分の流速で、１２０カラム容量を超えて、ｐＨ８．５、２５ｍＭのトリスからなるバッファーにおいて、ｐＨ８．５、０．２の塩化ナトリウムと２５ｍＭのトリスからなるバッファーの０-１００％勾配を使用し、モノＱ１０／１００ＧＬカラムにおいて、イオン-交換-クロマトグラフィーにかけた。(Ｓ)-６-(２-(３-アジドプロポキシ)-５-アセチルベンゾイルアミノ)-２-(ｈＧＨイルロイシルアミノ)ヘキサンアミドを含有するフラクションを、ＭＡＬＤＩ-ＭＳにより同定した。それらを組合せた。ハイプレップ２６／１０脱塩カラムを使用し、ゲル-クロマトグラフィーにより、バッファーを５０ｍＭの炭酸水素アンモニウムバッファーに交換したところ、３．９１ｍｇの(Ｓ)-６-(２-(３-アジドプロポキシ)-５-アセチルベンゾイルアミノ)-２-(ｈＧＨイルロイシルアミノ)ヘキサンアミドが生じた。０．７３１の吸収係数を使用し、２８０ｎｍで定量することにより、収率を測定した。ＩＥＦ-ゲルには、出発タンパク質ｈＧＨ-Ｌｅｕ-Ａｌａと比較して、タンパク質のｐＫａの予期された変化が示された。
ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ(ＣＨＣＡ(アルファ-シアノ-４-ヒドロキシケイ皮酸)、未訂正)：実測：ｍ／ｚ＝２２５８６(Ｍ^＋)、１１２９５(Ｍ^２＋)；必須：２２７２７(Ｍ^＋)、１１３６３．５(Ｍ^２＋)。

工程９：
[１-カルバモイル-２-(４-ヒドロキシフェニル)エチル]-カルバミン酸-tert-ブチルエステル

１-ヒドロキシベンゾトリアゾール(５．４４ｇ、３５．５５ｍｍｏｌ)及び１-(３-ジメチルアミノプロピル)-３-エチルカルボジイミドヒドロクロリド(６．８２ｇ、３５．５５ｍｍｏｌ)を、Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(７０ｍｌ)及びジクロロメタン(７０ｍｌ)にＢｏｃ-Ｔｙｒ-ＯＨ(１０ｇ、３５．５５ｍｍｏｌ)が入った溶液に、逐次添加した。反応混合物を室温で２０分攪拌した。アンモニアの２５％水溶液(２６．５６ｍｌ、３５５ｍｍｏｌ)を添加した。反応混合物を室温で１６時間攪拌した。それを酢酸エチル(３００ｍｌ)で希釈し、水(３ｘ１００ｍｌ)、続いて炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液(１００ｍｌ)で洗浄した。溶媒を真空で除去したところ、４．２４ｇの粗[１-カルバモイル-２-(４-ヒドロキシフェニル)エチル]カルバミン酸-tert-ブチルエステルが付与された。
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ_６)：δ１．３１(ｓ９Ｈ)；２．８０(ｄｄ、１Ｈ)；２．８３(ｄｄ、１Ｈ)；４．００(ｍ、１Ｈ)；６．６２(ｄ、２Ｈ)；６．７０(ｄ、１Ｈ)；６．９７(ｂｒ、１Ｈ)；７．０３(ｄ、２Ｈ)；７．３１(ｂｒ、１Ｈ)；９．１４(ｓ、１Ｈ)。

工程１０：
[(Ｓ)-１-カルバモイル-２-(４-(プロプ-２-イニルオキシ)フェニル)エチル]カルバミン酸-tert-ブチルエステル

[(Ｓ)-１-カルバモイル-２-(４-ヒドロキシフェニル)エチル]-カルバミン酸-tert-ブチルエステル(１．０ｇ、３．５７ｍｍｏｌ)、テトラブチルアンモニウムヨージド(６５ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ)、炭酸カリウム(３．９４ｇ、２９ｍｍｏｌ)、臭化プロパルギル(０．３８ｍｌ、４．２８ｍｍｏｌ)及びＮ,Ｎ-ジメチルホルムアミド(１５ｍｌ)の混合物を、６０℃で１６時間加熱した。それを室温まで冷却し、水(３０ｍｌ)で希釈し、硫酸水素ナトリウムの１０％水溶液で酸性化させた。混合物を酢酸エチル(２ｘ１００ｍｌ)で抽出した。組合せた有機相を炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液(２００ｍｌ)で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を真空で除去した。溶離液としてジクロロメタン／メタノールの混合物(１０：１)を使用し、シリカ(１００ｇ)におけるフラッシュクロマトグラフィーにより粗生成物を精製したところ、９９８ｍｇの[(Ｓ)-１-カルバモイル-２-(４-(プロプ-２-イニルオキシ)フェニル)エチル]カルバミン酸-tert-ブチルエステルが付与された。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝３４１(Ｍ＋Ｎａ)^＋。
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＤＭＳＯ-ｄ_６)δ１．３１(ｓ、９Ｈ)；２．５０(ｓ、１Ｈ)；２．６７(ｄｄ、１Ｈ)；２．９１(ｄｄ、１Ｈ)；４．０３(ｍ、１Ｈ)；４．７４(ｓ、２Ｈ)；６．７７(ｄ、１Ｈ)；６．８６(ｄ、２Ｈ)；６．９９(ｓ、１Ｈ)、７．１７(ｄ、２Ｈ)；７．３５(ｓ、１Ｈ)。

工程１１：
(２Ｓ)-２-アミノ-３-(４-(プロプ-２-イニルオキシ)フェニル)プロピオンアミド

トリフルオロ酢酸(１０ｍｌ)を、ジクロロメタン(１０ｍｌ)に[(Ｓ)-１-カルバモイル-２-(４-(プロプ-２-イニルオキシ)フェニル)エチル]カルバミン酸-tert-ブチルエステル(９９８ｍｇ、３．１３ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。反応混合物を室温で１．５時間攪拌した。溶媒を除去した。残留物をジクロロメタン(３０ｍｌ)に溶解させた。溶媒を除去した。後者の手順を２回繰り返したところ、１．５３ｇの(２Ｓ)-２-アミノ-３-(４-(プロプ-２-イニルオキシ)フェニル)プロピオンアミドのトリフルオロ酢酸塩が付与された。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝２１９(Ｍ＋１)^＋。
^１Ｈ-ＮＭＲ(ＣＤＣｌ_３)δ２．５１(ｓ、１Ｈ)；３．０２(ｍ、２Ｈ)；３．９０(ｍ、１Ｈ)；４．７８(ｓ、２Ｈ)；６．９５(ｄ、２Ｈ)；７．２０(ｄ、２Ｈ)；７．５６(ｓ、１Ｈ)；７．８７(ｓ、１Ｈ)；８．１０(ｂｒ、３Ｈ)。
ＨＰＬＣ(方法０２-Ｂ４-４)：Ｒ_ｆ＝５．６２分。

工程１２：
(Ｓ)-２-(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパルギニル)グルタミル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシルアミノ)-３-(４-(プロパルギルオキシ)フェニル)プロピオンアミド

ｐＨ７．５に調節された、２５０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び５ｍＭのＥＤＴＡからなるバッファー(４ｍｌ)に、(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパルギル)グルタミル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシル)アラニン(１１ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ)が入った溶液を、ｐＨ７．５に調節された、２５０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び５ｍＭのＥＤＴＡからなるバッファー(３ｍｌ)に、(２Ｓ)-２-アミノ-３-(４-(プロプ-２-イニルオキシ)フェニル)プロピオンアミドのトリフルオロ酢酸塩(９２８ｍｇ、２．８０ｍｍｏｌ)が入った溶液に添加した。ベータ-ヒドロキシプロピルシクロデキストリン(２２０ｍｇ)を添加した。水酸化ナトリウムの１Ｎ水溶液(３．００ｍｌ)を添加することにより、ｐＨを、ｐＨ８．０９に調節した。ｐＨ７．５に調節された、２５０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び５ｍＭのＥＤＴＡからなるバッファー(０．９６ｍｌ)を添加し、全体容量が１０．９６ｍｌになるようにした。ｐＨはｐＨ８．０６であることが見出された。ＣＰＹ溶液(２００Ｕ／ｍｌ、０．２２ｍｌ)を添加した。反応混合物を１５分、穏やかに振揺した。それを水(２０ｍｌ)で希釈し、０．１％のトリフルオロ酢酸で双方とも緩衝させた、水に１０-５０％のアセトニトリル勾配のあるものを使用し、逆相Ｃ_１８-カラムにおいてＨＰＬＣ-クロマトグラフィーにかけた。所望の生成物を含有するフラクションを組合せ、凍結乾燥したところ、３．８ｍｇの(Ｓ)-２-(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパルギニル)グルタミル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシルアミノ)-３-(４-(プロパルギルオキシ)フェニル)プロピオンアミドが付与された。
ＭＳ：ｍ／ｚ＝１１１４。
ＨＰＬＣ：Ｒ_ｔ＝７．２８分(０２-ｂ４-４)。

工程１３：
２,６-ルチジンの２％溶液(０．１０ｍｌ)に(Ｓ)-２-(((((((グルタミル)アスパルチル)アスパルギニル)グルタミル)フェニルアラニル)フェニルアラニル)ロイシルアミノ)-３-(４-(プロパルギルオキシ)フェニル)プロピオンアミド(０．１９２ｍｇ、１７３ｎｍｏｌ)が入った溶液を、２,６-ルチジンの２％溶液(０．２５０ｍｌ)に(Ｓ)-６-(２-(３-アジドプロポキシ)-５-アセチルベンゾイルアミノ)-２-(ｈＧＨイルロイシルアミノ)ヘキサンアミド(１．９５ｍｇ、８６ｎｍｏｌ)が入った溶液に添加した。銅(Ｉ)の溶液を、２,６-ルチジンの２％水溶液(０．０２１５ｍｌ)にアスコルビン酸(０．７６０ｍｇ、４３１６ｎｍｏｌ)が入った溶液に、硫酸銅(ＩＩ)五水和物(０．２１６ｍｇ、８６３ｎｍｏｌ)の水溶液(０．０２１５ｍｌ)を添加することにより調製した。この銅(Ｉ)溶液を１分放置し、タンパク質及びペプチドの上述した溶液に添加した。反応混合物を室温で１時間、穏やかに振揺した。ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ(未訂正)では、出発タンパク質に相当する、ｍ／ｚ＝２２５８２での小さなピークに隣接して、所望の生成物について予期される、ｍ／ｚ＝２３７２４でのピークが示された。反応混合物のＳＤＳゲルは、予期される結果に従い、出発物質より約１ｋＤａ多い分子量を有する生成物として示した。同様の結果がアギレントバイオアナライザー実験で得られ、予期されるように、出発物質の分子量より約１．２ｋＤａ多い分子量を有する生成物が存在するタンパク質のみが示された。

Claims

２つのポリペプチドをそれぞれのＣ末端で結合させる方法であって、
(ａ)反応基を含む化学基を結合されるポリペプチドのＣ末端に導入することで、結合されるポリペプチドのＣ末端を酵素触媒的に修飾し；
(ｂ)(ｉ)互いに、２つの化学基の反応基を反応させるか、又は
(ｉｉ)スペーサー分子の第１の反応基と第１の化学基の反応基を反応させ、スペーサー分子の第２の反応基と第２の化学基の反応基を反応させる；
ことを含む方法。
酵素がカルボキシペプチダーゼＹ又はその変異体又は断片であり、変異体又は断片が、タンパク質又はペプチドのＣ末端アミノ酸が、種々の化学部分で置き換えられることにより反応を触媒する能力を保持している、請求項１に記載の方法。
酵素がカルボキシペプチダーゼＹである、請求項２に記載の方法。
(ａ)反応基Ｗを含む化学基を、結合される第１のポリペプチドのＣ末端に導入し、反応基Ｚを含む化学基を、結合される第２のポリペプチドのＣ末端に導入することにより、結合されるポリペプチドのＣ末端を酵素触媒的に修飾し；
(ｂ)スペーサー分子の反応基Ｙと反応基Ｚとを反応させて、化学基Ｘを形成させ、
スペーサー分子の反応基Ｖと反応基Ｗとを反応させて、化学基Ｕを形成させる；
ことを含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
ＸとＵが独立して、オキシム、ヒドラゾン、フェニルヒドラゾン、セミカルバゾン、トリアゾール、イソオキサゾリジン、アミド、３-チオピロリジンジオン及びアラルキンのジラジカルからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
工程(ｂ)で形成された２つのポリペプチド間のスペーサーが、少なくとも一のエチレングリコールジラジカルを有する、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
Ｖ、Ｗ、Ｙ及びＺが独立して、アルコキシルアミノ、アリールオキサミノ、オキソ、アジド、アルキニル、アルケニル、ハロアリール、メルカプト、Ｎ-マレイミド、及び２-(ジフェニルホスフィノ)フェノキシカルボニルからなる群から選択される、請求項４から６のいずれか１項に記載の方法。
(ａ)反応基Ｗを含む化学基を、結合される第１のポリペプチドのＣ末端に導入し、反応基Ｚを含む化学基を、結合される第２のポリペプチドのＣ末端に導入することにより、結合されるポリペプチドのＣ末端を酵素触媒的に修飾し；
(ｂ)反応基Ｚと反応基Ｗとを反応させて、化学基Ｔを形成させる；
ことを含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
Ｔが、オキシム、ヒドラゾン、フェニルヒドラゾン、セミカルバゾン、トリアゾール、イソオキサゾリジン、アミド、３-チオピロリジンジオン及びアラルキンのジラジカルからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
Ｗ及びＺが、アルコキシルアミノ、アリールオキサミノ、オキソ、アジド、アルキニル、アルケニル、ハロアリール、メルカプト、Ｎ-マレイミド、及び２-(ジフェニルホスフィノ)フェノキシカルボニルからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
２つのポリペプチドが同一である、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
２つのポリペプチドが互いに異なっている、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも一のポリペプチドがヒト成長ホルモンである、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも一のポリペプチドがヒト成長ホルモンの誘導体である、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも一のポリペプチドがヒト成長ホルモンの変異体又はヒト成長ホルモンの変異体の誘導体である、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも一のポリペプチドがｈＧＨ-Ｌｅｕ-Ａｌａである、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
化学基ＺがリンカーＡを介して導入される、請求項４から１６のいずれか１項に記載の方法。
リンカーＡが、直鎖状、分枝状及び／又は環状のＣ_１-１０アルカン、Ｃ_２-１０アルケン、Ｃ_２-１０アルキン、Ｃ_１-１０ヘテロアルカン、Ｃ_２-１０ヘテロアルケン、Ｃ_２-１０ヘテロアルキンのビ-ラジカルからなる群から選択され、そのいずれもオキソで置換されていてよく、ここで一又は複数の同素環芳香族化合物のビラジカル(類)又は複素環芳香族化合物のビラジカル(類)が挿入されてもよい、請求項１７に記載の方法。
化学基ＷがリンカーＢを介して導入される、請求項４から１８のいずれか１項に記載の方法。
リンカーＢが、オキソで置換されていてもよい、直鎖状、分枝状及び／又は環状のＣ_１-１０アルカン、Ｃ_２-１０アルケン、Ｃ_２-１０アルキン、Ｃ_１-１０ヘテロアルカン、Ｃ_２-１０ヘテロアルケン、Ｃ_２-１０ヘテロアルキンのビ-ラジカルからなる群から選択され、ここで一又は複数の同素環芳香族化合物のビラジカル(類)又は複素環芳香族化合物のビラジカル(類)が挿入されてもよい、請求項１９に記載の方法。
リンカーＡ及びリンカーＢが独立して、次の式：

からなる群から選択される、請求項１７から２０のいずれか１項に記載の方法。
最終生成物において、２つのポリペプチドを結合させる部分が、１,２,３-トリアゾール部分を有する、請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法。
化合物Ｎ,Ｎ'-ビス(２-(２-(２-(２-(４-((３-(Ｎ-((Ｓ)-５-(カルバモイル)-５-(ｈＧＨイルロイシニルアミノ)ペンチル)カルバモイル)ベンジルオキシ)イミノ)ブトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)オメガ-カルバモイル３．４ｋＤａＰＥＧ-カルボン酸アミド。
請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法により生成された化合物。
請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法を使用することにより得られる化合物。
結合部分によりそれらのＣ末端を介して結合した２つのポリペプチドを含有するポリペプチド化合物であり、ここで結合部分が１,２,３-トリアゾール部分を有しているポリペプチド化合物。
前記結合部分が、次の式：

からなる群から選択される、請求項２６に記載のポリペプチド化合物。
結合部分によりそれらのＣ末端を介して結合した２つのポリペプチドを含有するポリペプチド化合物であり、ここで結合部分が１,２,３-トリアゾール部分を有しており、該ポリペプチド化合物が、請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法を使用することにより得られた又は得られるポリペプチド化合物。
それらのＣ末端を介して結合した２つのポリペプチドを含有するポリペプチド化合物で、請求項１から２１のいずれか１項に記載の構造を有するポリペプチド化合物。
請求項２３から２９のいずれか１項に記載の化合物と、製薬的に許容可能な担体又は賦形剤を含有する医薬組成物。
患者の疾病又は疾患を処置するための、請求項２３から２９のいずれか１項に記載の化合物。
患者の疾病又は疾患を処置する医薬を製造するための、請求項２３から２９のいずれか１項に記載の化合物の使用。