JP2014083000A - 目的細胞の分離方法およびその目的細胞の分離装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】目的細胞5の直径よりも小さいフィルタリングサイズを有するマイクロフィルター3と、このマイクロフィルターの一部を構成する基板1表面に、目的細胞の表面に特異的に発現しているたんぱく質と特異的に結合する生体高分子2Aの修飾表面2を形成する、目的細胞の分離装置。および、前記細胞分離装置に、前記目的細胞および夾雑物となる非目的細胞5’が懸濁された溶液を導入し、前記修飾表面の生体高分子と前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞4,4’を反応させ、前記基板の修飾表面上に捕捉することにより、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞を前記非目的細胞から分離する、目的細胞の分離方法。
【選択図】図2
Description
〔1〕目的細胞の分離方法において、目的細胞の直径よりも小さいフィルタリングサイズを有するマイクロフィルターと、このマイクロフィルターの一部を構成する基板表面に目的細胞の表面に特異的に発現しているたんぱく質と特異的に結合する生体高分子の修飾表面とを形成し、そこに特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞および特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより大きい目的細胞と夾雑物としての特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより小さい非目的細胞が懸濁された溶液を導入し、前記修飾表面の生体高分子と前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞の表面に特異的に発現しているたんぱく質を反応させるための静置や送液を行い、前記マイクロフィルターの下流に陰圧、もしくは前記細胞が懸濁された溶液に陽圧を印加させて、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たず前記マイクロフィルターのフィルタリングサイズより小さい非目的細胞を除去・回収することで、前記非目的細胞と前記目的細胞を分離し、さらにリンス液を導入し、前記リンス液を攪拌する操作を行い、前記マイクロフィルターのフィルタリングサイズより大きい目的細胞を回収することで、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより大きい目的細胞を分離することを可能とし、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞のみを前記基板の修飾表面上に捕捉することにより、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞を前記非目的細胞から分離することを特徴とする。
〔3〕目的細胞の分離方法において、目的細胞の直径よりも小さいフィルタリングサイズを有するマイクロフィルターとしての微細構造を有する貫通穴フィルターを構成する基板表面に目的細胞表面に特異的に発現しているたんぱく質と特異的に結合する生体高分子の修飾表面とを形成し、そこに特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞および特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより大きい目的細胞と夾雑物としての特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより小さい非目的細胞が懸濁された溶液を導入し、前記修飾表面の生体高分子と前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞の表面の特異的に発現しているたんぱく質を反応させるための静置や送液を行い、続いて前記貫通穴フィルターの下流に陰圧、もしくは前記細胞が懸濁された溶液に陽圧を印加することで、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たず前記貫通穴フィルターのサイズより小さい非目的細胞を除去・回収し、さらにリンス液を導入し、前記リンス液を攪拌する操作を行い、前記貫通穴フィルターのフィルタリングサイズより大きい目的細胞を回収することで、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより大きい目的細胞を分離することを可能とし、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞のみを前記基板の修飾表面上に捕捉することにより、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞を前記非目的細胞から分離することを特徴とする。
〔5〕上記〔1〕又は〔3〕記載の目的細胞の分離方法において、前記生体高分子が抗体、核酸アプタマー又はペプチドアプタマーであることを特徴とする。
〔8〕上記〔6〕記載の目的細胞の分離装置において、前記マイクロフィルターのフィルタリングサイズが3〜50μmであることを特徴とする。
本発明の目的細胞の分離方法によれば、サイズとアフィニティの両方を考慮した細胞分離が可能であるという特徴を有しており、従来装置(FACS)と比較すると、ポピュレーションの小さい希少な細胞の分離に利用可能で、また分離の際の細胞懸濁液の送液条件を適切にすることで、細胞に対するダメージを減らし、分離細胞の生存率を高く保つことが可能である点が重要である。加えて、細胞懸濁液の導入後の静置操作による細胞沈降や懸濁液の水位を減少させるための送液操作によって、積極的もしくは強制的に高分子の修飾表面に細胞を接触させることができることから、特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞を従来法と比較して高効率に回収可能である。
図1は本発明の第1実施例を示す目的細胞の分離装置の模式図、図2はそれを用いた目的細胞の分離方法を示す概念図である。
これらの図において、1は基板(底面基板、側面基板、マイクロフィルターを形成する基板を含む)、2は基板1の目的細胞表面に特異的に発現しているたんぱく質と特異的に結合する生体高分子の修飾表面、2Aは生体高分子、3はマイクロフィルター、4,4′は特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ細胞(目的細胞)、5は特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずマイクロフィルター3のフィルタリングサイズより大きい細胞(目的細胞)、5′は特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずマイクロフィルター3のフィルタリングサイズより小さい細胞(非目的細胞)、6は特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ細胞4,4′や特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たない細胞5,5′を含む溶液である。
このようにして、サイズによる細胞分離とイムノアフィニティを考慮した細胞分離を組み合わせた細胞分離を行う。
これらの図において、11は基板(底面基板、側面基板を含む)、12は基板11に形成された後述する目的細胞の直径よりも小さい寸法の穴(マイクロフィルターとしての貫通穴フィルター)、13は貫通穴フィルター12が形成された基板11の表面に形成される目的細胞の表面に特異的に発現しているたんぱく質と特異的に結合する生体高分子の修飾表面、13Aは生体高分子(抗体、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー)、14,14′は特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ細胞(目的細胞)、15は特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たず貫通穴フィルターのフィルタリングサイズよりも大きい細胞(目的細胞),15′は特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たず貫通穴フィルターのフィルタリングサイズよりも小さい細胞(非目的細胞)、16は特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ細胞(目的細胞)14,14′および特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たず貫通穴フィルターのフィルタリングサイズよりも大きい細胞(目的細胞)15や特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たず貫通穴フィルターのフィルタリングサイズよりも小さい細胞(非目的細胞)15′が懸濁された溶液である。
また、本実施例のマイクロフィルターは、図3に示すような貫通穴フィルター12形式の構造としたので、よりコンパクトなデバイスとすることができる。
図5は本発明の第3実施例を示す目的細胞分離装置における目的細胞の培養増殖を示す模式図である。
この図は実装の一例であり、図6(A)に示すように、本発明の細胞分離装置を構成する微小流体チップ33は、2mLピペットチップ32(血清用ピペット、Nunc)を介して電動ピペット(BDバイオサイエンス)31に接続することができる。この微小流体チップ33は、図6(B)に示すように、ピペットチップ32と接続するためのキャップ部分33Aと、マイクロフィルター層33B〔いずれもシリコーンゴムの一種であるPDMS(ポリジメチルシロキサン)〕と、このマイクロフィルター層33Bのマイクロフィルター構造を封止するガラス基板(直径10mm)33Cからなる。3.5mmのポートを備えるキャップ部分33Aはピペットチップ32とマイクロフィルター層33B間のコネクタとして働く。マイクロフィルター層33Bには、図6(C)に示すように、直径2mmの溶液リザーバーポートがキャップ部分33Aのポートに接続されるように作製されている。図6(D)は微小流体図6(c)の黒点線で囲んだ部分の拡大図であり、チップ33上のマイクロフィルター層33B(幅25μm、深さ7.6μm)を示している。この図6(D)に示されるように、10μmと16.5μmの蛍光ビーズをマイクロフィルター層33Bで捕捉することに成功した。また、図6(E)に示すように、微小流体チップ33内の液体の交換は、所望の溶液を入れた遠心分離管34に微小流体チップ33を浸し、続けてピペッティング操作によって陰圧もしくは陽圧を印加することで行われる。
2 基板の生体高分子の修飾表面
2A,13A 生体高分子
3 マイクロフィルター
4,4′,14,14′ 特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ細胞(目的細胞)
5, 15 特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより大きい細胞(目的細胞)
5′,15′ 特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより小さい細胞(非目的細胞)
6,16 特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ細胞や特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たない細胞を含む溶液
7,17 リンス液
8,18 細胞剥離液
12 基板に形成された目的細胞の直径よりも小さい寸法の穴(マイクロフィルターとしての貫通穴フィルター)
13 貫通穴フィルターが形成された基板の表面に形成される生体高分子の修飾表面
21 分離後の目的細胞(特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ、もしくは細胞サイズがフィルタリングサイズより大きい細胞)
22 培溶液
31 電動ピペット
32 ピペットチップ
33 微小流体チップ
33A キャップ部分
33B マイクロフィルター層
33C ガラス基板
34 遠心分離管
Claims (9)
- (a)目的細胞の直径よりも小さいフィルタリングサイズを有するマイクロフィルターと、該マイクロフィルターの一部を構成する基板表面に目的細胞の表面に特異的に発現しているたんぱく質と特異的に結合する生体高分子の修飾表面とを形成し、
(b)そこに特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞および特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより大きい目的細胞と夾雑物としての特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより小さい非目的細胞が懸濁された溶液を導入し、
(c)前記修飾表面の生体高分子と前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞の表面に特異的に発現しているたんぱく質を反応させるための静置や送液を行い、
(d)前記マイクロフィルターの下流に陰圧、もしくは前記細胞が懸濁された溶液に陽圧を印加させて、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たず前記マイクロフィルターのフィルタリングサイズより小さい非目的細胞を除去・回収することで、前記非目的細胞と前記目的細胞を分離し、
(e)さらにリンス液を導入し、
(f)前記リンス液を攪拌する操作を行い、前記マイクロフィルターのフィルタリングサイズより大きい目的細胞を回収することで、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより大きい目的細胞を分離することを可能とし、
(g)前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞のみを前記基板の修飾表面上に捕捉することにより、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞を前記非目的細胞から分離することを特徴とする目的細胞の分離方法。 - 請求項1記載の目的細胞の分離方法において、細胞剥離液を用いて前記修飾表面上から前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞を離脱させ、その後に、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞をサイズ毎に回収することを特徴とする目的細胞の分離方法。
- (a)目的細胞の直径よりも小さいフィルタリングサイズを有するマイクロフィルターとしての微細構造を有する貫通穴フィルターを構成する基板表面に目的細胞の表面に特異的に発現しているたんぱく質と特異的に結合する生体高分子の修飾表面とを形成し、
(b)そこに特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞および特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより大きい目的細胞と夾雑物としての特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより小さい非目的細胞が懸濁された溶液を導入し、
(c)前記修飾表面の生体高分子と前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞の表面に特異的に発現しているたんぱく質を反応させるための静置や送液を行い、
(d)続いて前記貫通穴フィルターの下流に陰圧、もしくは前記細胞が懸濁された溶液に陽圧を印加することで、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たず前記貫通穴フィルターのサイズより小さい非目的細胞を除去・回収し、
(e)さらにリンス液を導入し、
(f)前記リンス液を攪拌する操作を行い、前記貫通穴フィルターのフィルタリングサイズより大きい目的細胞を回収することで、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより大きい目的細胞を分離することを可能とし、
(g)前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞のみを前記基板の修飾表面上に捕捉することにより、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞を前記非目的細胞から分離することを特徴とする目的細胞の分離方法。 - 請求項3記載の目的細胞の分離方法において、細胞剥離液を用いて前記基板の修飾表面上から前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞を離脱させ、その後に、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ目的細胞をサイズ毎に回収することを特徴とする目的細胞の分離方法。
- 請求項1又は3記載の目的細胞の分離方法において、前記生体高分子が抗体、核酸アプタマー又はペプチドアプタマーであることを特徴とする目的細胞の分離方法。
- 目的細胞の表面に特異的に発現しているたんぱく質と特異的に結合する生体高分子の修飾表面を形成した基板とマイクロフィルターとが一体的に形成され、特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ細胞および特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たず前記マイクロフィルターのフィルタリングサイズより大きい細胞と特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより小さい細胞を含む溶液を導入し、前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持つ細胞および前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たず前記マイクロフィルターのフィルタリングサイズより大きい細胞を前記特異的に発現しているたんぱく質を表面に持たずフィルタリングサイズより小さい細胞と分離することを特徴とする目的細胞の分離装置。
- 請求項6記載の目的細胞の分離装置において、前記生体高分子が固定化された基板が底面に配置され、該底面上に前記マイクロフィルターが形成されることを特徴とする目的細胞の分離装置。
- 請求項6記載の目的細胞の分離装置において、前記マイクロフィルターのフィルタリングサイズが3〜50μmであることを特徴とする目的細胞の分離装置。
- 請求項6記載の目的細胞の分離装置において、前記生体高分子が抗体、核酸アプタマー又はペプチドアプタマーであることを特徴とする目的細胞の分離装置。
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