JP2014039499A - 細胞分離チップの製造方法及び細胞分離チップ - Google Patents

Abstract

【課題】製造が容易で、かつ信頼性の高い診断が可能な細胞分離チップの製造方法及び細胞分離チップを提供する。
【解決手段】まず、ウエハ上に微細流路のパターンを形成する（ステップＳ１１）。続いて、流路パターンが形成されたウエハ上に、スピンコート法を用いて、すなわちスピンコータを用いて、磁性粒子を含有するＰＤＭＳを塗布する（ステップＳ１２）。続いて、ウエハ上に塗布された磁性粒子を含有するＰＤＭＳを固化する（ステップＳ１３）。続いて、固化した磁性粒子を含有するＰＤＭＳの上にＰＤＭＳ層を追加形成する（ステップＳ１４）。続いて、固化した２層のＰＤＭＳ、すなわち部材をウエハから取り外す（ステップＳ１５）。続いて、微細流路が形成されるように、部材２にガラス基板を貼り合わせる（ステップＳ１６）。
【選択図】図３

Description

本発明は、測定対象の細胞を他の細胞から分離する細胞分離チップの製造方法及び細胞分離チップに関する。

近年、食物アレルギー等の即時型アレルギーが社会問題化している。即時型アレルギーは、社会生活を妨げ、場合によっては命に関わるものとなる。そこで、即時型アレルギーの診断の簡略化や、信頼性の向上が望まれている。

当初、即時型アレルギー診断では、原因食物の摂取等により、症状の誘発を確認する負荷試験や、患者の血液や皮膚を用いた検査が行われるのが一般的であった。しかしながら、これらの方法は、被験者への負担が大きかったり、多くの血液が必要となったり、偽陽性、偽陰性の割合が高いなどの不都合があった。

最近では、細胞レベルでの分析により、即時型アレルギー診断が行われるようになってきている。細胞レベルでの即時型アレルギー診断では、遠心分離やフィルタ分離などによって、血液サンプルの中から、測定対象となる細胞を抽出する必要がある。そこで、血液サンプル中における測定に不必要な細胞（例えば、測定対象をＩ型アレルギーの原因細胞である好塩基球細胞とするならば、好塩基球細胞以外の細胞）を磁気修飾し、磁気ビーズ法を用いて除去する装置等が開示されている（例えば、特許文献１参照）。磁気ビーズは、測定対象の細胞又はそれ以外の細胞に特異的な抗体を結合させ、細胞を磁気標識するものである。

また、カラムの中に、直径約５００μｍの磁性粒子を敷き詰め、そのカラム内に血液を流すことにより、磁気修飾細胞を除去する装置も開示されている。このような装置で分離された好塩基球細胞は、抗原で刺激され、細胞から分泌されるヒスタミンの測定等に用いられる。

上述した装置で血液から細胞を取り出すには、多くの血液サンプル、例えば１検査に数ｍｌ（例えば２〜３ｍｌ以上）程度の血液サンプルが必要となるため、検査回数が増えると患者の負担も大きくなる。また、上述した装置は、何度も使用されるので、コンタミネーションにより診断の信頼性が低下するおそれがある。

そこで、サンプル量を少なくしつつ、信頼性の高い診断が可能となる細胞分離チップが開発されている。この細胞分離チップは、基板にＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）を貼りあわせることによって形成される。この細胞分離チップでは、基板とＰＤＭＳとの間に設けられたマイクロリッターオーダの容積を有する微細流路が設けられている。微細流路の内壁を構成するＰＤＭＳには、磁気修飾細胞の流れを妨げる磁場勾配を発生させる磁性粒子を含有している。

特開２００６−００６１６６号公報

しかしながら、磁性粒子を含有するＰＤＭＳは、焼き固める際に反りかえる性質がある。このため、上記細胞分離チップを製造するのが困難になる。

本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、製造が容易で、かつ信頼性の高い診断が可能な細胞分離チップの製造方法及び細胞分離チップを提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明の第１の観点に係る細胞分離チップの製造方法は、
微細流路を有する細胞分離チップの製造方法であって、
基板上に流路パターンを形成する第１の工程と、
流路パターンが形成された基板上に、スピンコート法を用いて、磁性粒子を含有する部材の原液を塗布する第２の工程と、
前記基板上に塗布された原液を固化する第３の工程と、
形成された部材の上に、磁性粒子を含有しない部材の原液を塗布して固化する第４の工程と、
固化した部材を前記基板から取り外す第５の工程と、
前記微細流路が形成されるように、固化した部材にガラス基板を貼り合わせる第６の工程と、
を含む。

本発明の第２の観点に係る細胞分離チップは、
本発明の第１の観点に係る製造方法を用いて製造されている。

この場合、磁性粒子を含有する部材とガラス基板とで形成された微細流路を流れる溶液が出力される溶液出力部を備え、
前記溶液出力部では、
測定対象の細胞がスポッティングされる金属薄膜が前記ガラス基板上に設けられている、
こととしてもよい。

また、前記金属薄膜が形成された前記ガラス基板の反対側の面から、全反射条件を満たす入射角でＰ偏光を前記金属薄膜に入射させる入射手段と、
前記金属薄膜に入射した前記Ｐ偏光の反射光の強度に関する情報を検出する検出手段と、
をさらに備える、
こととしてもよい。

また、前記検出手段は、
前記金属薄膜に入射した前記Ｐ偏光の反射光の２次元強度分布に相当する強度像を撮像する、
こととしてもよい。

また、付着した前記測定対象の細胞の変化に伴って変化する前記金属薄膜のインピーダンスの変化を検出する検出手段をさらに備える、
こととしてもよい。

また、前記金属薄膜への入射光と反射光との偏光状態の変化を検出する検出手段をさらに備える、
こととしてもよい。

本発明によれば、スピンコート法を用いて基板上に磁性粒子を含有する部材を薄く塗布することができるので、製造後の部材の反りを防止することができる。このため、製造が容易で、かつ信頼性の高い診断が可能な細胞分離チップを製造することができる。

図１（Ａ）は、本発明の実施の形態に係る細胞分離測定チップの斜視図である。図１（Ｂ）は、その細胞分離測定チップの側面図である。 微細流路に生じる磁界を模式的に示す図である。 細胞分離測定チップの製造方法のフローチャートである。 図４（Ａ）乃至図４（Ｅ）は、微細流路の製造過程を示す図である。 図５（Ａ）は、本実施の形態に係る細胞分離測定チップの微細流路における細胞の捕捉状況を示す図であり、図５（Ｂ）は、従来の方法で製造された微細流路における細胞の捕捉状況を示す図である。 図１（Ｂ）の光学測定部の詳細な構成を示す模式図である。 反射光の強度の入射角度依存性の一例を示すグラフである。 図８（Ａ）乃至図８（Ｃ）は、生細胞を刺激しない場合の反射強度像の画像の時間変化の一例である。 図９（Ａ）乃至図９（Ｃ）は、生細胞を刺激した場合の反射強度像の画像の時間変化の一例である。 図１（Ａ）の細胞分離測定チップを用いた細胞測定動作のフローチャートである。

この発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。

（実施の形態１）
まず、この発明の実施の形態１について説明する。

図１（Ａ）には、本実施形態に係る細胞分離チップとしての細胞分離測定チップ１００の斜視図が示され、図１（Ｂ）には、細胞分離測定チップ１００の側面図が示されている。

図１（Ａ）、図１（Ｂ）に示すように、細胞分離測定チップ１００は、基板１と、部材２とを貼りあわせることによって形成されている。

基板１は、ガラス基板（プレパラート）である。このガラス基板としては、例えば、Ｓ−ＬＡＬ−１０ガラスが採用される。このガラスの屈折率は１．７２である。

部材２は、例えば、シリコン樹脂としてのＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）で形成されている。基板１と部材２との間には、空隙が設けられている。この空隙は全体でも、マイクロリッターオーダの容積を有している。

この空隙は、溶液投入部３と、溶液出力部としての測定部４Ａ、４Ｂと、微細流路５とに分けることができる。

溶液投入部３は、測定対象の細胞とそれ以外の磁気修飾細胞とを含む溶液の投入口が部材２上に設けられている。溶液投入部３は、部材２の上面から下面を貫通している。溶液投入部３の最下部は、チャンバー構造となっており、そこに液溜りが形成されている。

測定部４Ａ、４Ｂは、溶液投入部３と、微細流路５を介して連通している。測定部４Ａ、４Ｂでは、測定対象の細胞がスポッティングされる金属薄膜６が、基板１上に設けられている。金属薄膜６については、後述する。

測定部４Ａ、４Ｂでは、微細流路５に連通する大気開放部が部材２上に形成されている。この大気開放部は、測定対象の細胞に対する刺激物質を投入する投入口である。大気開放部から投入された刺激物質は、そのまま金属薄膜６に付着した測定対象の細胞を刺激する。

微細流路５は、溶液投入部３と測定部４Ａ、４Ｂとを連通する。微細流路５は、測定対象の細胞と磁気修飾細胞とを分離する機能性流路である。この細胞分離測定チップ１００では、微細流路５が複数本設けられている。各微細流路５は、毛細管力により溶液を測定部４Ａ、４Ｂに送液するように形成されている。すなわち、溶液投入部３に溶液が投入されると、その溶液は、微細流路５の毛細管力により、微細流路５内を測定部４Ａ、４Ｂまで送液される。なお、各微細流路５の長さは同一である。このようにすれば、一方の測定部に早めに溶液が到達して、他方の測定部に溶液が送液されなくなるのを防ぐことができる。

部材２は、砂鉄やフェライト等の磁性粒子７を複数包含する。磁性粒子７の直径は、例えば５０μｍ程度となっている。磁性粒子７は、微細流路５の近傍に配置されている。

ここで、細胞分離測定チップ１００が、図２に示すように、微細流路５の流路方向に垂直な方向の磁石８による磁界の中に置かれた場合について考える。この状態で、微細流路５内を直径約５０ｎｍの磁気ビーズで修飾された磁気修飾細胞が流れると、その磁気修飾細胞は、その磁界の影響を受けて、流れを妨げられ、微細流路５内の内壁等に付着する。

この磁気修飾細胞が磁界より受ける力Ｆは、次式のようになる。

部材２内に包含される磁性粒子７は、上記式（１）のうち、次式で示される磁場勾配の部分を大きくする。

これにより、磁気修飾細胞が磁界から受ける力は大きくなる。

次に、細胞分離測定チップ１００の製造方法、特に、微細流路５の製造方法について説明する。図３には、この製造方法の処理の流れが示されている。

図３に示すように、まず、ウエハ２０上に微細流路５のパターンを形成する（ステップＳ１１）。より具体的には、露光装置を用いて、フォトレジストが塗布されたウエハに、レチクル上に形成された微細流路５の流路パターンを転写する。例えば、フォトレジストとしては、ＳＵ−８レジストが用いられる。フォトレジストの高さは、約３５μｍ程度とすることができ、幅は約５０μｍ〜３００μｍである。しかしながら、これらのサイズには限定されない。

流路パターンが転写されたウエハ２０はエッチングされる。これにより、図４（Ａ）に示すように、ウエハ２０上には微細流路５に相当する部分のフォトレジスト２１のみが残る。

続いて、流路パターンが形成されたウエハ２０上に、スピンコート法を用いて、すなわちスピンコータを用いて、磁性粒子７を含有するＰＤＭＳ２Ａを塗布する（ステップＳ１２）。ＰＤＭＳ２Ａと磁性粒子７との質量比は、１：１である。磁性粒子７は、３２５ｍｅｓｈを通る粒子であり、前述のとおり、例えば直径が５０μｍ程度の鉄粉である。なお、図４（Ｂ）乃至図４（Ｅ）では、図を分かり易くするために、実際よりも磁性粒子７の大きさを小さく描いている。

スピンコート法とは、ウエハ２０の表面の中央部に液状の磁性粒子７を含有する液状のＰＤＭＳ２Ａを滴下し、ウエハ２０を高速回転させることで生じる遠心力によって磁性粒子７を含有するＰＤＭＳ２Ａの原液をウエハ２０の外周部へ向けて広げる方法である。ウエハ２０の回転数は、例えば１５００ｒｐｍである。この回転塗布は４０秒ほど継続される。

スピンコート法を用いることにより、フォトレジストを基板１の表面全体に均一に薄く塗布することができる。図４（Ｂ）には、ウエハ２０上に形成された磁性粒子７を含有するＰＤＭＳ２Ａが示されている。磁性粒子７を含有するＰＤＭＳ２Ａの高さは、例えば５０μｍ程度である。

続いて、ウエハ２０上に塗布された磁性粒子７を含有するＰＤＭＳ２Ａを固化する（ステップＳ１３）。ＰＤＭＳ２Ａは８０℃ほどに加熱され、焼固められる。

続いて、磁性粒子７を含有するＰＤＭＳ２Ａの上にＰＤＭＳ層２Ｂを追加形成する（ステップＳ１４）。以下では、ＰＤＭＳ層２Ｂを単にＰＤＭＳ２Ｂと呼ぶ。ＰＤＭＳ２Ｂの高さは、例えば５ｍｍ程度とすることができる。ＰＤＭＳ２Ｂは、スピンコート法以外の方法で塗布され、ＰＤＭＳ２Ｂは８０℃ほどに加熱され焼固められる。図４（Ｃ）には、磁性粒子７を含有するＰＤＭＳ２Ａとその上層のＰＤＭＳ２Ｂから成る部材２が示されている。スピンコート法以外の方法で塗布するのは、細胞分離測定チップ１００の強度を考慮して、ＰＤＭＳ２Ｂを厚く形成する必要があるためである。

続いて、図４（Ｄ）に示すように、固化したＰＤＭＳ２Ａ、２Ｂ、すなわち部材２をウエハ２０から取り外す（ステップＳ１５）。このとき、ウエハ２０上のフォトレジストもウエハ２０と同じように取り外される。

続いて、微細流路５が形成されるように、固化したＰＤＭＳ２Ａ、２Ｂ、すなわち部材２にガラス基板（プレパラート）を貼り合わせる（ステップＳ１６）。これにより、図４（Ｅ）に示すように、微細流路５が形成される。

このように、本実施の形態によれば、磁性粒子７を含有するＰＤＭＳ２Ａを、薄く形成することができる。これにより、部材２の反りを少なくすることができる。また、スピンコート法により、磁性粒子７を微細流路５の周辺に均一に配置することができる。

図５（Ａ）には、上述の製造方法により製造された微細流路５における細胞の捕捉状況が示されている。また、図５（Ｂ）には、従来のランダムな手法で、磁性粒子７を部材２に混入させることにより生成された微細流路５における細胞の捕捉状況が示されている。図５（Ａ）と図５（Ｂ）とを比較するとわかるように、上述の製造方法により製造された微細流路５では、磁性粒子７が微細流路５の周辺に均一に分散しているので、細胞が均等に捕捉されているのがわかる。このように磁性粒子７を均等に配置することにより、捕捉可能な細胞の数を１倍〜１０倍とすることができる。

このように製造された部材２では、微細流路５の近傍に磁性粒子７が配置され、流れるサンプルに磁場勾配の影響が生じやすくなっている。

磁性粒子７としては、現在直径５０μｍ程度のものを用いているが、異なるサイズであっても機能を十分に発揮することが予想される。磁性粒子７のサイズは、微細流路５の断面積や長さなどに応じて適宜調整することができる。

図１（Ｂ）に示すように、この細胞分離測定チップ１００は、光学測定部１０をさらに備える。光学測定部１０は、光源１１と、偏光板１２と、プリズム１３と、対物レンズ１４と、撮像部１５と、を備える。

この光学測定部１０は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象を利用したセンサである。ＳＰＲ現象は、金属薄膜６に全反射条件で光を入射すると、ある角度（共鳴角）でその光が金属表面のプラズモンと共鳴現象を起こし、反射光の減衰が起きる現象をいう。共鳴角は、金属薄膜６上の物質の屈折率に非常に敏感であり、共鳴角の変化を検出することで、金属薄膜６上の屈折率の変化を知ることが可能となる。

図６には、光学測定部１０の詳細な構成が示されている。

光源１１は、例えば半導体レーザである。この半導体レーザは、例えば波長が６３０ｎｍのレーザ光を発振出力する。光源１１から出力されたレーザ光は、不図示のコリメータレンズ等により平行光束に変換されて、偏光板１２に入射する。なお、光源１１として、赤色、白色ＬＥＤ（Light Emitting Diode）等を用いてもよい。

偏光板１２は、入射したレーザ光を直線偏光の平行光束に変換して出射する。この直線偏光は、後述する基板１と金属薄膜６との間の界面Ｆに対してＰ偏光となる。この光源１１と偏光板１２とが、入射手段に対応する。

プリズム１３は、偏光板１２によりＰ偏光となった平行光束を入射する。プリズム１３としては、基板１と同様に、例えばＳ−ＬＡＬ−１０ガラスが採用される。すなわち、基板１とプリズム１３とは、屈折率が同じである。基板１とプリズム１３は、当接しているため、プリズム１３に入射したレーザ光（Ｐ偏光）は、基板１に入射し、そのまま直進する。

金属薄膜６は、例えば金膜である。この他、Ａｇ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ａｌ、Ｋなどの薄膜も、金属薄膜６として用いることができる。金属薄膜６の厚みは、例えば５０ｎｍであり、センシングサイズは、例えば約１ｍｍ角である。金属薄膜６は、基板１上に例えば蒸着により成膜されている。基板１に入射したレーザ光は、基板１と金属薄膜６との間の界面Ｆに、例えば、全反射条件を満たし表面プラズモン共鳴現象を発生させる入射角θ＝５６°で入射する。仮に金属薄膜６が設置されていない状態であれば、このレーザ光は、界面Ｆで全反射する。

界面Ｆで反射したレーザ光は、基板１及びプリズム１３から出射して、対物レンズ１４に入射する。対物レンズ１４は、レーザ光を屈折させて出射する。対物レンズ１４では、前側焦点距離よりも後側焦点距離の方が長いものが使用されている。したがって、この対物レンズ１４は、物体像を所定の倍率で拡大して像面上に結像させる。対物レンズ１４から出射されたレーザ光は、撮像部１５の撮像面に到達する。

撮像部１５は、例えばＣＣＤ（Charge Coupled Device）イメージセンサ又はＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）イメージセンサである。撮像部１５は、界面Ｆで反射されたレーザ光を受光する。撮像部１５の撮像面と界面Ｆとは共役の関係にある。したがって、撮像部１５の撮像面に、プリズム１３の界面Ｆに入射した平行光束の反射光の２次元強度分布に相当する強度像、すなわち反射強度像が結像する。

この反射強度像は、対物レンズ１４により、例えば、２倍乃至４０倍に拡大されている。撮像部１５は、その反射強度像を撮像する。撮像部１５は、その反射強度像に相当する画像信号を出力する。

撮像部１５から出力された画像信号は、コンピュータ（不図示）に入力される。コンピュータは、画像信号を表示し、又は画像信号に基づいて細胞の解析を行う。

光学測定部１０は、屈折率の異なる物質ごとの共鳴角の違いを利用して、金属薄膜６上の屈折率の相対的な強度分布を可視化する。金属薄膜６上で生細胞Ｃ１、Ｃ２を培養すると、生細胞Ｃ１、Ｃ２が接着している部分としていない部分とでは、屈折率が異なる。

図７のグラフには、撮像部１５で受光される反射光の強度の入射角依存性の一例が示されている。このグラフでは、横軸が界面Ｆへの平行光束の入射角θを示しており、縦軸が、その入射角θにおける反射光の強度を示している。図７には、３本の特性曲線（ａ）乃至（ｃ）が示されている。

特性曲線（ａ）は、金属薄膜６に何も置かれていない状態（生細胞Ｃ１、Ｃ２がない状態）での反射光の強度の入射角依存性を示す曲線である。これによれば、表面プラズモン共鳴現象により、入射角５６°において反射光の強度が最も減衰している。この入射角５６°を、共鳴角という。本実施形態では、生細胞Ｃ１、Ｃ２が接していない場合の反射光の強度が最も暗くなるように、界面Ｆへのレーザ光の入射角度を５６°に設定している。

特性曲線（ｂ）は、生細胞Ｃ１、Ｃ２が金属薄膜６にセットされ、生細胞Ｃ１、Ｃ２がまだ刺激されていない状態での反射光強度の入射角依存性を示す曲線である。生細胞Ｃ１、Ｃ２は、誘電体であるため、生細胞Ｃ１、Ｃ２が当接する金属薄膜６の周辺では、誘電率（屈折率）が変化し、反射光強度の入射角依存性が特性曲線（ａ）から特性曲線（ｂ）へシフトし、共鳴角も５６°からθ１へシフトする。

特性曲線（ｃ）は、生細胞Ｃ１、Ｃ２が、金属薄膜６にセットされ、測定部４Ａ、４Ｂに到達した液体に含まれる抗原等により、生細胞Ｃ１、Ｃ２が刺激され、その刺激に反応した状態での反射光強度の入射角依存性を示す曲線である。生細胞Ｃ１、Ｃ２が刺激され、その刺激に反応すると、生細胞Ｃ１、Ｃ２の誘電率（屈折率）はさらに変化するため、反射光の強度の入射角依存性が特性曲線（ｂ）から特性曲線（ｃ）へシフトし、共鳴角もθ１からθ２へシフトする。

本実施形態では、平行光束の界面Ｆへの入射角が５６°に固定されている。そこで、入射角５６°に着目すると、金属薄膜６に生細胞Ｃ１、Ｃ２が接していない状態では、反射光の強度はＩ１となり最も暗くなっている。また、生細胞Ｃ１、Ｃ２が金属薄膜６に付着すると反射光の強度はＩ２となり、Ｉ１よりもΔＩ１だけ強くなっている。さらに、金属薄膜６に付着した生細胞Ｃ１、Ｃ２が抗原等により刺激され、その刺激に反応すると、反射光の強度はＩ２からΔＩ２だけ増えてＩ３となり、さらに強くなる。

このように、撮像部１５によって撮像される反射強度像の画像では、生細胞Ｃ１、Ｃ２が存在していない場所は暗くなり、細胞が存在している場所は明るくなり、生細胞Ｃ１、Ｃ２が活性化している場所は、さらに明るくなる。

なお、生細胞Ｃ１、Ｃ２が存在している箇所と生細胞Ｃ１、Ｃ２が存在していない箇所とのコントラストが最も大きいのは、入射角θ＝５６°となる。このことは、図７において、生細胞Ｃ１、Ｃ２が存在していないときの共鳴角が５６°で、反射光が最も減衰していることからも明らかである。すなわち、入射角を共鳴角と同じθ＝５６°とすると、Δｌ１を最大とすることができるので、画像のコントラストが増すのである。

図８（Ａ）乃至図８（Ｃ）には、生細胞Ｃ１、Ｃ２を抗原で刺激していない状態における０分後、１０分後、２０分後の反射強度像の画像の変化が示されている。また、図９（Ａ）乃至図９（Ｃ）には、生細胞Ｃ１、Ｃ２を抗原で刺激した後における０分後、１０分後、２０分後の反射強度像の画像の変化が示されている。図８（Ａ）乃至図８（Ｃ）と図９（Ａ）乃至図９（Ｃ）を比較すると明らかなように、外部刺激に対して生細胞Ｃ１、Ｃ２が反応すると、生細胞Ｃ１、Ｃ２に相当する箇所の輝度が変化しているのがわかる。

この光学測定部１０を用いれば、細胞１つ１つの刺激応答（屈折率変化）を観察することができる。

なお、光学測定部１０は、測定部４Ａ、４Ｂにそれぞれ対応して、２つ設けられていることとしてもよい。

次に、本実施形態に係る細胞分離測定チップ１００の動作について説明する。ここでは、好塩基球細胞を測定対象の細胞とする場合の動作について説明する。好塩基球細胞は、ヒト白血球に、０．５％前後含まれている。その直径は１０μｍ程度である。

図１０には、この細胞分離測定チップ１００を用いた細胞測定動作のフローチャートが示されている。

まず、血液サンプルに対する前処理を行う（ステップＳ１）。より具体的には、血液サンプルから赤血球を分離除去した後、血液サンプル中の好塩基球細胞以外の白血球細胞を磁気ビーズで修飾する（ステップＳ１）。ここでは、好塩基球細胞になく、血液中の他の細胞に存在する表面抗原に結びつく磁気ビーズが用いられる。

続いて、細胞分離測定チップ１００を所定の位置に設置する（ステップＳ２）。これにより、図２に示すように、微細流路５内には、下向きの磁界が発生するようになり、光学測定部１０が、図１（Ｂ）に示すような位置に設定される。磁性粒子７により、微細流路５内の磁場勾配はより大きくなっている。

この状態で、溶液投入部３の投入口から、ステップＳ１で磁気修飾された血液サンプルを、ピペット等を用いて投入する（ステップＳ３）。溶液投入部３へ投入された血液サンプルは、溶液投入部３の液溜りを経て微細流路５に進入し、微細流路５に生じる毛細管力により、微細流路５を進む。

微細流路５を進む間、血液サンプルは、図２に示す磁場を受ける。これにより、好塩基球細胞以外の磁気修飾細胞は、上向きの力を受け、微細流路５上面の磁性粒子７の下に留まるようになり、好塩基球細胞だけが、測定部４Ａ、４Ｂに到達する。測定部４Ａ、４Ｂに到達した好塩基球細胞は毛細管力から開放されて沈下し、金属薄膜６上に付着する。この結果、金属薄膜６に固定される細胞の大部分（望ましくは８０％以上）は、好塩基球細胞となる。

続いて、測定部４Ａ、４Ｂの大気開放部から、刺激物質、すなわち抗原を投入する（ステップＳ４）。これにより、投入された抗原は、金属薄膜６に付着した好塩基球細胞の表面抗体と結びついて、抗原抗体反応を起こす。

続いて、光学測定部１０を用いて、測定を行う（ステップＳ５）。測定は、ステップＳ４で抗原を投入する前から開始するようにしてもよい。光源１１からレーザ光の照射が開始され、撮像部１５で、界面Ｆでの反射光に基づく金属薄膜６に付着した生細胞の２次元画像が撮像される。この２次元画像は、不図示のコンピュータで表示され、あるいは、解析され、その解析結果に基づいて、好塩基球細胞の特性を解析することが可能となる。

このように、本実施の形態に係る細胞分離測定チップ１００を用いれば、血液サンプルが微細流路５を送液される間に、測定対象となる好塩基球細胞を他の磁気修飾細胞から分離抽出することができるので、小量の血液サンプルから測定対象の細胞を抽出することができる。本発明者は、５μｌの血液中に含まれる好塩基球細胞を使っても十分に診断可能であることを確認している。

また、この細胞分離測定チップ１００を用いれば、細胞の分離→固定→測定までを同一のチップ内で行うことができるので、その間のコンタミネーションを防止して、信頼性の高い計測を行うことができる。また、細胞分離測定チップ１００自体を使い捨てとすることができるので、コンタミネーションを防止して、信頼性の高い診断を行うことができる。

また、本実施の形態によれば、測定部４Ａ、４Ｂには、微細流路５に連通する大気開放部が部材２上に形成されている。また、微細流路５は、毛細管力により血液サンプルを測定部４Ａ、４Ｂに送液するように形成されている。このようにすれば、細胞を分離抽出してスポッティングするための外部ポンプが不要となるので、短時間な測定が可能となるうえ、アレルギー診断などに要するコストを低減することができるようになる。

また、本実施の形態によれば、２次元ＳＰＲ測定装置を用いて測定を行うので、信頼性が高く、かつ、迅速な診断が可能となる。

このような細胞分離測定チップ１００は、小型であるうえ、血液サンプルを滴下するだけで、細胞の分離から測定まで行えるので、簡便で使いやすくなるため、臨床現場での実用が容易になる。

また、本実施の形態によれば、磁場勾配発生手段として、部材２内に含有され外部磁場の磁場勾配を大きくする磁性粒子７が用いられる。磁性粒子７として、例えば、砂鉄やフェライト等を用いることができるので、細胞分離測定チップ１００の製造コストを低減することができる。

また、本実施の形態によれば、同一の長さを有する微細流路５が複数設けられている。また、１つの溶液投入部３と、各微細流路５を介して連通する測定部４Ａ、４Ｂが複数設けられている。このようにすれば、同一の測定対象の細胞に対して、異なる刺激を同時に与えることができるようになるので、診断に要する時間を短くすることができる。

以上詳細に説明したように、本実施の形態によれば、スピンコート法を用いて磁性粒子７を含有するＰＤＭＳ２Ａを薄く形成することができるので、部材２の反りを防止することができる。このため、製造が容易で、かつ信頼性の高い診断が可能な細胞分離測定チップ１００を製造することができる。

測定部の数は、３個以上であってもよい。測定部の数は、多ければ多いほどよい。このように、微細加工技術を用いることで、測定部を複数設けるなど、マルチチャンネル化が容易となる。

なお、上記実施の形態では、部材２がＰＤＭＳで形成されているものとしたが、本発明はこれには限られない。例えば、アクリル樹脂等の樹脂やガラスで部材２を形成するようにしてもよい。要は、磁性粒子７等を含有することができる物質であればよい。

また、上記実施の形態では、光学測定部１０が、細胞の２次元画像を撮像したが、本発明はこれには限られない。例えば、界面Ｆへの反射光の強度を検出するだけでもよい。

また、上記実施の形態では、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）現象を利用して、測定対象の細胞の特性を検出したが、本発明はこれには限られない。例えば、細胞の変化に伴って変化する金属薄膜６のインピーダンスの変化を検出するようにしてもよいし、細胞の変化に伴って変化する金属薄膜６の屈折率を、金属薄膜６への入射光と反射光との偏光状態の変化を検出するエリプソメトリを用いて測定するようにしてもよい。

また、測定対象の細胞も、好塩基球細胞に限られない。例えば、単球、リンパ球、好中球、好酸球など、血液中の他の細胞であってもよいし、血液以外に存在する細胞であってもよい。

また、溶液投入部３の数も、複数設けることができる。このように、微細加工技術より、１つのチップに、溶液投入部や測定部を複数設けることができるので、マルチチャンネル化が容易となり、複数検体の同時検査も可能となる。通常、人体の主たるアレルギーは１０種類程度であり、１０個の測定部を設ければ、１０種類のアレルギーを一度に調べることが可能となり、診断時間が著しく短縮される。

また、上記実施の形態では、微細流路５が、毛細管力により溶液を測定部４Ａ、４Ｂに送液したが、本発明はこれには限られない。溶液投入部３に外部ポンプを接続して、外部ポンプを動作させて、溶液を測定部４Ａ、４Ｂに送液するようにしてもよい。

なお、本明細書において使用される「細胞」とは、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、どのような種類・動物の細胞でも構わない。また、天然に存在する細胞であっても、人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞または遺伝子改変細胞）であってもよい。「生細胞」とは、このうち生きた細胞を示す。最も好ましくは、ヒト（Homo sapience）由来の生細胞を示す。

また、「刺激」とは、細胞表面の受容体に対するリガンドの結合、温度もしくはｐＨ等の環境変化、機械的刺激または電気的刺激等を意味し、細胞の活性（例えば、細胞内の情報伝達系の賦活等）に対して作用する全ての刺激を包含している。

要は、本発明は、即時型アレルギー診断だけでなく、広く細胞の解析に有用である。

また、「磁性粒子」とは、磁場中に置く事で磁化され磁石の性質を持つ鉄や砂鉄のような物質を指す。

本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。

本発明は、即時型アレルギー診断を行う細胞分離チップの製造に好適である。

１ 基板
２ 部材
２Ａ ＰＤＭＳ
２Ｂ ＰＤＭＳ（層）
３ 溶液投入部
４Ａ、４Ｂ 測定部
５ 微細流路
６ 金属薄膜
７ 磁性粒子
８ 磁石
１０ 光学測定部
１１ 光源
１２ 偏光板
１３ プリズム
１４ 対物レンズ
１５ 撮像部
２０ ウエハ
２１ フォトレジスト
１００ 細胞分離測定チップ
Ｃ１、Ｃ２ 生細胞

Claims (7)

1. 微細流路を有する細胞分離チップの製造方法であって、
   基板上に流路パターンを形成する第１の工程と、
   流路パターンが形成された基板上に、スピンコート法を用いて、磁性粒子を含有する部材の原液を塗布する第２の工程と、
   前記基板上に塗布された原液を固化する第３の工程と、
   形成された部材の上に、磁性粒子を含有しない部材の原液を塗布して固化する第４の工程と、
   固化した部材を前記基板から取り外す第５の工程と、
   前記微細流路が形成されるように、固化した部材にガラス基板を貼り合わせる第６の工程と、
   を含む細胞分離チップの製造方法。
2. 請求項１に記載の製造方法を用いて製造された細胞分離チップ。
3. 磁性粒子を含有する部材とガラス基板とで形成された微細流路を流れる溶液が出力される溶液出力部を備え、
   前記溶液出力部では、
   測定対象の細胞がスポッティングされる金属薄膜が前記ガラス基板上に設けられている、
   ことを特徴とする請求項２に記載の細胞分離チップ。
4. 前記金属薄膜が形成された前記ガラス基板の反対側の面から、全反射条件を満たす入射角でＰ偏光を前記金属薄膜に入射させる入射手段と、
   前記金属薄膜に入射した前記Ｐ偏光の反射光の強度に関する情報を検出する検出手段と、
   をさらに備える、
   ことを特徴とする請求項３に記載の細胞分離チップ。
5. 前記検出手段は、
   前記金属薄膜に入射した前記Ｐ偏光の反射光の２次元強度分布に相当する強度像を撮像する、
   ことを特徴とする請求項４に記載の細胞分離チップ。
6. 付着した前記測定対象の細胞の変化に伴って変化する前記金属薄膜のインピーダンスの変化を検出する検出手段をさらに備える、
   ことを特徴とする請求項３に記載の細胞分離チップ。
7. 前記金属薄膜への入射光と反射光との偏光状態の変化を検出する検出手段をさらに備える、
   ことを特徴とする請求項３に記載の細胞分離チップ。