JP2014032134A - 液体クロマトグラフ装置用分離カラム及びフィルター - Google Patents

Abstract

【課題】液体クロマトグラフ装置に用いられる分離カラムであって、充填剤にかかる圧力を低下させることにより充填剤が潰れることを防止し、カラム内のフィルター枚数が増えても、HETP（理論段高さ）を悪化させることなく高速・高分離分析を行うことが可能な分離カラムを提供する。
【解決手段】多段分離カラムであって、複数の分離カラムが接続され、分離カラム間にフィルターを設け、フィルターは、薄膜フィルターと、機械的剛性を保つ支持部材から構成されていることを特徴とする多段分離カラム。
【選択図】図１

Description

本発明は、液体クロマトグラフ装置用分離カラムおよびそれに使用するフィルターに関する。

液体クロマトグラフィー（HPLC）の高速化は、分離カラム充填剤の微粒子化により実現されてきた。充填剤粒子径が小さいほど、線速度を上げても理論段高さ（HETP）（μｍ）が悪化しにくいためである。しかし、充填剤粒子径が小さいとカラムにおける圧力損失が大きくなる（非特許文献１）。機械的強度の強いシリカゲルでは装置の耐圧性向上に伴い、高速化が実現されてきた。しかし有機ポリマー系充填剤は、線速度を上げ圧力が上昇すると、充填剤粒子が潰されてしまい分離能が低下する。潰れた充填剤粒子はフィルターを目詰まりさせ、さらにカラム圧力を上昇させてしまうため安定した分析ができなくなる。

有機ポリマー充填剤における上記課題を解決する手段に、積層カラムがある（特許文献１）。これは、一端にフィルタ押さえ部とねじ部、他端にフィルター支持部とねじ部が形成され、内部に充填部が形成されたカラムユニットの複数をフィルターを介して多段に接続することにより、カラムにかかる圧力を分散させ、充填剤粒子の潰れなくするものである。しかし、フィルター部分には充填剤が存在しないため拡散が起こり、多段にすればするほどフィルター枚数が多くなるため、段数に比例して分離能が低下する。そこで、なるべく薄くて耐圧性のあるフィルターを使用することになるが、現在市販されているフィルターでは、3段以上のカラムではフィルター部での拡散が無視できずHETPが悪化してしまう。

特開平９−７２８９０号公報

Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７７，４０５８−４０７０ （２００５）

高速分析を行うために線速度を上げると、カラムが最高許容圧力に達してしまい充填剤が破壊される。また、高分離分析のためにカラム長さをより長くしたり、充填剤の粒子径をより細かくすると、カラム圧力が上昇してしまい限界がある。特に有機ポリマー系充填剤は三次元網目構造を有し、溶媒や金属イオンの変化などにより膨潤・収縮などを生じやすいため、シリカゲル充填剤に比べると、圧力が高くなると壊れやすい。

本発明の目的は、充填剤にかかる圧力を低下させることにより充填剤を潰すことを防止し、カラム内のフィルター枚数が増えても、HETPを悪化させることなく高速・高分離分析を行うことが可能な分離カラムを提供することである。

上記課題に鑑み、本発明は、以下の構成を有する。液体クロマトグラフ装置に用いられる多段分離カラムであって、複数の分離カラムが接続され、前記分離カラム間にフィルターを設け、当該フィルターは、薄膜フィルターと、機械的剛性を保つ支持部材から構成されていることを特徴とする多段分離カラム。

液体クロマトグラフ装置に用いられる多段の分離カラムであって、複数の分離カラムが接続され、前記分離カラム間にフィルターを設け、当該フィルターは、板状部材に複数の微細な穴部を有し、当該穴部に分離カラムの充填剤が充填されていることを特徴とする多段分離カラム。

液体クロマトグラフ装置に用いられる多段分離カラムであって、複数の分離カラムが接続され、前記分離カラム間にフィルターを設け、当該フィルターは、金属粒子と当該金属粒子の隙間に充填した分離カラムの充填剤から構成されていることを特徴とする多段分離カラム。

本発明によれば、カラムを多連または多段にすることにより、カラムIN側とOUT側にかかる圧力差を分散させることができ、分離カラム全体にかかる圧力は同等であるが充填剤にかかる圧力は低くなる。結果として耐高圧カラムを作製できる。これを使用することにより、前述のとおり耐圧性が劣るポリマー充填剤を高圧で使用したときの溶出時間の再現性不良を改善することができる。また、分析時のカラム圧力を上げられるので、より高流量の分析が可能となるため、分析を高速化することができる。さらに耐高圧であるためカラム長さを伸ばせるため、より理論段数を向上させ、高分離分析が可能となり、より高精度な結果を得ることができる。

本発明は、ポリマー充填剤のみならずシリカゲルなどの無機系充填剤にも応用できる。逆相カラムを２層フィルターを使用した多段・多連カラムとすることにより、逆相クロマトグラフィーをさらに高速・高精度にできる。

本発明が適用されるカラムに使用されるフィルター例。 本発明が適用されるカラムに使用されるフィルター例。 本発明が適用される高速液体クロマトグラフ用多連カラム構成図。 本発明が適用される高速液体クロマトグラフ用多段カラムＡ構成図。 本発明が適用される高速液体クロマトグラフ用多段カラムＢ構成図。 アミノ酸の高速・高精度分析例。 本発明が適用される高速液体クロマトグラフ用多段カラムＣ構成図。

図３は、本発明が適用される高速液体クロマトグラフ用多連カラム１の1例を示したものである。ここには、２連カラムを示すが、連数・カラム長さは、充填剤の耐圧性と線速度に伴う圧力上昇を考慮して決定し、この限りではない。多連カラムユニット２は、耐圧性を考慮してSUSやPEEK製であり、内部に適当な内径の筒状の穴をあけた構造である。この穴に充填剤３を充填する。穴の内径と長さにより多連カラムユニット２にかかる圧力が変化する。多連カラムユニット２の両端には、充填剤が流路に流れ出ないようにフィルター４が固定されたエンドフィッティングA５がねじ止めされている。フィルター４はエンドフィッティング内でフィルター押さえ６により固定され、数百MPaの高圧がかかっても動かない。充填された多連カラムユニット２同士を継ぎ手７で接続して多連カラムとする。

上記の多連カラム１の場合、各カラムユニット２の両端にフィルターが入るため、（連数×２）枚のフィルターがカラム内に存在する。フィルターは充填剤が詰まったカラム内においては、分離効果のない空間であるため試料中の成分が拡散し、HETPが悪化する原因となる。そこで、カラムユニット連結部分のフィルターを１枚とし、フィルター数を減じたものが多段カラムである。その例として図４に多段カラムＡ８、図５（ｂ）に多段カラムＢ９を記す。

多段カラムＡ８は、実施例１の多連カラムユニット２同士をミドルフィッティング１０によりねじ止めして接続する。ミドルフィッティング１０はフィルター１枚がフィルター押さえ６により固定され動かない構造となっている。ここに多連カラムユニット２をねじ止めすることにより、充填された充填剤とフィルターを密着させることができる。

次に多段カラムＢ９について説明する。多連カラムユニット２は、両端のねじ形状が雄ねじであるが、図５（ａ）のように、多段カラムユニット１１のように、片端が雄ねじで他端が雌ねじの構造でもよい。雄ねじの末端にはエンドフィッティングＡ５をねじ止めし、雌ねじの末端にはエンドフィッティングＢ１２をねじ止めする。図５（ａ）の、多段カラムユニット１１を複数組合わせたものが図５（ｂ）となる。

図１に本発明が適用されるカラムに使用されるフィルター例Ｘ１３を示す。充填剤を通過させない孔径の薄膜フィルター１４と薄膜フィルター１４の機械的強度を補うための支持部材である補強フィルター１５を重ねた２層構造である。これらのフィルターの周囲をＰＥＥＫなどの樹脂製パッキン１６で囲みシール材とすることによりフィルター押さえ６部分に固定され、高圧下においてもフィルターが動くことなく圧力を吸収することができる。

薄膜フィルター１４の孔径は、使用する充填剤の粒径分布の最小値以下のものを使用する。厚さは０．５ｍｍ以下のなるべく薄いものが望ましい。材質は金属、樹脂、繊維など薄膜にできるものはなんでも良いが、分析する成分の吸着や分解などが起こらないものを採用する。薄膜フィルター１４が充填剤を漏らさず、薄いので試料成分を拡散させることもない。

補強フィルター１５の孔径は、使用する充填剤の粒径分布の最大値以上のものを使用する。１ｍｍ以上の厚さで良く、機械強度が必要なため金属が良い。補強フィルター１５の内部には充填剤が入り込むため試料成分の拡散を防げる。薄膜フィルター１４ではカラムユニットにかかる圧力を受け止めることは不可能であるが、補強フィルター１５により圧力を受け止めることができる。

図２（ａ）にフィルター例Ｙ１７を示す。機械的強度が充分な数ｍｍの厚さで、フィルターの厚さ方向に内部に微細な穴を開け、穴の内部に充填剤３が入り込む構造のものである。本構成では、穴以外の部分が機械強度を生んでいる。

図２（ｂ）フィルター例Ｚ１８は、フィルターを構成する部分に金属粒子１９を入れ、金属粒子１９の間隙に充填剤３を入り込ませることにより、フィルター１８体積の一部を充填剤３に置き換えて体積を減らし、試料成分の拡散を抑制するものである。本構成では、金属粒子の部分が機械強度を生んでいる。

図７に示すフィルター例Ｗ２０のような形態も考えられる。これは、図１のフィルター例Ｘ１３の変形である。薄膜フィルター１４の周囲にもパッキン１６を設ける。パッキン１６を薄くして、薄膜フィルター１４と補強フィルター１５を密着させる。これは、高圧下において薄膜フィルター１４が歪み破損したり、パッキン１６と薄膜フィルター１４の間に隙間ができて充填剤が漏れ出さないようにするためである。

アミノ酸分析に使用されるカラムは、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体にスルホン基を導入したイオン交換樹脂を充填している。三次元網目構造を有する樹脂の細孔表面にスルホン基が存在し、膨潤・収縮しやすく耐圧性が劣る。そのため線速度を上げると最大許容圧力に達し、高速分析を行いにくい。

図６に本発明が適用される３連カラムを用いて得られたアミノ酸の高速・高精度分析例を示す。分析時間は従来の1連カラムでは１１５分（サイクル時間は１４８分）であったが、本発明のカラムを使用すると４０分（サイクル時間は４９．３分）に短縮された。これまでのフィルターを使用すると、充填剤が潰れてフィルターを目詰まりさせてしまい、分析時カラム圧力を１連カラムのときの１／３にすることができなかった。また各成分の分離も悪化していた。しかし本発明の２層フィルターを使用した３連カラムを使用すると、図６に示すとおり分離を損なわずに分析時間を約１／３に短縮できた。

プラスチックや生体成分など高分子の平均分子量及び分子量分布を求めるためには、分子の流体力学的体積に基づいて分離する液体クロマトグラフィーであるサイズ排除クロマトグラフィー（Size-exclusion chromatography: SEC）を用いる。分離カラムには、分離する分子と同様の大きさの細孔をもつ非吸着性の多孔質担体を充填している。逆相系充填剤として広く使用されているシリカゲルは、表面の残存シラノール基の影響により試料成分が吸着されることがあるため、充填剤には、有機系のポリスチレン系カラムなどポリマー充填剤を使用することが多い。シリカゲルに比べポリマー系充填剤は機械的強度が弱いため線速度を上げることができない。これらの理由から高分子の平均分子量及び分子量分布測定は高速化が行われていないのが現状である。

上記アミノ酸分析の実施例と同様に、本発明が適用される多連・多段カラムおよびフィルターを用いることにより、分子量測定精度を悪化させることなく高速化することが可能である。

食品試料や生体試料は夾雑成分が多く、試料精製を十分に行い分析しないと精度を確保することができない。そこで、精製効果の高い前処理技術として液体クロマトグラフィーの１つであるゲル浸透クロマトグラフィー（Gel permeation chromatography:GPC）を用いることが多い。夾雑成分中のppm,ppbオーダーの目的成分を分取するには、試料中の各成分のカラム溶出時間再現性が安定していなければならない。そのためには液体クロマトグラフ用ポンプの流量精度と、カラム圧力が安定していることが必要である。しかし、多検体の実試料を処理するとGPCカラムに充填されているポリマー系充填剤が潰され次第に圧力が上昇してくる。すると目的成分の溶出時間が変化してしまい分取精度を保つことができなくなってくる。その度に標準試料による溶出時間の確認を行わなければならない。また、カラム圧が上昇するため高速処理もできない。

本発明のカラムとフィルターを使用することにより圧力上昇を防ぐことができ、高流量を流すことができるため短時間で試料精製を終了できるようになる。

上記の実施例はポリマー系充填剤を使用する場合であるが、シリカゲル充填剤を使用した逆相系カラムによる高速分析、高分離化を実施することもできる。シリカゲルは機械的強度があり潰れにくいため、ポリマー系充填剤に比べると高速・高分離分析が可能となってきている。液体クロマトグラフ装置がさらに高耐圧となれば、本発明のカラムとフィルターを使用することで、より内径が細くより長いカラムを使用することができるようになり、分析精度を向上させることができる。

１…多連カラム、２…多連カラムユニット、３…充填剤、４…フィルター、５…エンドフィッティングＡ、６…フィルター押さえ、７…継ぎ手、８…多段カラムＡ、９…多段カラムＢ、１０…ミドルフィッティング、１１…多段カラムユニット、１２…エンドフィッティングＢ、１３…フィルター例Ｘ、１４…薄膜フィルター、１５…補強フィルター、１６…パッキン、１７…フィルター例Ｙ、１８…フィルター例Ｚ、１９…金属粒子、２０…フィルター例Ｗ

Claims (13)

1. 液体クロマトグラフ装置に用いられる多段分離カラムであって、
   複数の分離カラムが接続され、前記分離カラム間にフィルターを設け、当該フィルターは、薄膜フィルターと、機械的剛性を保つ支持部材から構成されていることを特徴とする多段分離カラム。
2. 請求項１の分離カラムであって、
   前記薄膜フィルター及び前記支持部材の周囲にパッキンを設けることを特徴とする多段分離カラム。
3. 請求項１の多段分離カラムであって、
   前記複数の分離カラムの前段と後段に前記フィルターを配置し、前記複数の分離カラムと前記フィルターを固定するフィッティング部材を有することを特徴とする多段分離カラム。
4. 請求項１の多段分離カラムであって、
   前記分離カラム内の充填剤は、ポリマー充填剤又はシリカゲル充填剤であることを特徴とする多段分離カラム。
5. 請求項１の多段分離カラムを備えた液体クロマトグラフ装置。
   
6. 液体クロマトグラフ装置に用いられる多段の分離カラムであって、
   複数の分離カラムが接続され、前記分離カラム間にフィルターを設け、当該フィルターは、板状部材に複数の微細な穴部を有し、当該穴部に分離カラムの充填剤が充填されていることを特徴とする多段分離カラム。
7. 請求項６の多段分離カラムであって、
   前記複数の分離カラムの前段と後段に前記フィルターを配置し、前記複数の分離カラムと前記フィルターを固定するフィッティング部材を有することを特徴とする多段分離カラム。
8. 請求項６の多段分離カラムであって、
   前記分離カラム内の充填剤は、ポリマー充填剤又はシリカゲル充填剤であることを特徴とする多段分離カラム。
9. 請求項６の多段分離カラムを備えた液体クロマトグラフ装置。
10. 液体クロマトグラフ装置に用いられる多段分離カラムであって、
    複数の分離カラムが接続され、前記分離カラム間にフィルターを設け、当該フィルターは、金属粒子と当該金属粒子の隙間に充填した分離カラムの充填剤から構成されていることを特徴とする多段分離カラム。
11. 請求項１０の多段分離カラムであって、
    前記複数の分離カラムの前段と後段に前記フィルターを配置し、前記複数の分離カラムと前記フィルターを固定するフィッティング部材を有することを特徴とする多段分離カラム。
12. 請求項１０の多段分離カラムであって、
    前記分離カラム内の充填剤は、ポリマー充填剤又はシリカゲル充填剤であることを特徴とする多段分離カラム。
13. 請求項１０の多段分離カラムを備えた液体クロマトグラフ装置。